НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна

МІЩУК ДАР’Я ОЛЕГІВНА

УДК 577.152.361

Вплив етанолу на властивості Na+,K+-АТР-ази кори головного мозку щурів

03.00.04 – біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ — 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Науковий керівник – доктор біологічних наук

КАПЛЯ Олександр Андрійович,

старший науковий співробітник

відділу біохімії м’язів

Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий
співробітник

ПАРХОМЕНКО Юлія Михайлівна,

провідний науковий співробітник відділу біохімії коферментів

Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України;

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

ВАВІЛОВА Галина Леонідівна,

старший науковий співробітник відділу фізіології кровообігу Інституту
фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України.

Провідна установа – Київський національний університет імені Тараса
Шевченка,

кафедра біохімії.

Захист відбудеться «24» січня 2005 року о 14 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В.
Палладіна НАН України за адресою: 01601, Київ — 30, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту біохімії

ім. О.В. Палладіна НАН України (Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат дисертації розісланий «22» грудня 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук
КІРСЕНКО О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Na+,K+-AТР-аза (АТР-фосфогідролаза, КФ 3.6.1.37) –
інтегральний білок плазматичних мембран клітин, який здійснює
енергозалежне протилежно спрямоване перенесення іонів Na та K. Відомо,
що функціонування та активність Na+,K+-AТР-ази, як і інших інтегральних
білків, забезпечується при тісній взаємодії з ліпідним оточенням в
мембрані [Дергунов А.Д. и др., 1984; Кравцов А.В., Алексеенко И.Р.,
1990; Болдырев А.А., 2001]. Так, структурні перебудови в мембрані
обумовлюють функціональні зміни цієї ферментної системи, а ізоформи
каталітичної субодиниці Na+,K+-AТР-ази мозку відрізняються за
структурно-функціональними властивостями та відносною стійкістю до
мембранотропних впливів in vitro [Капля А.А. и др., 1996; Капля А.А.,
1998 (а)].

Na+,K+-AТР-аза залучена до численних клітинних функцій і процесів,
пов’язаних з існуванням іонних градієнтів, зокрема до забезпечення
електричної збудливості нервової та м’язової тканин [Болдырев А.А.,
Мельгунов В.И., 1985; Lingrel J.B., Kuntzweiler T., 1994; Лопина О.Д.,
2001; Scheiner-Bobis G., 2002]. В той же час продемонстровано, що при
різних патологічних станах нервово-м’язової системи спостерігається
інактивація Na+,K+-AТР-ази [Herrera V.L.M. et al., 1988; Thompson C.B.,
McDonough A.A., 1996; Gerbi A. et al., 1997; Jamme I. et al., 1999].
Причиною цього може бути або пряма дія на фермент, або структурні зміни
в мембрані (наприклад, внаслідок вільнорадикальних процесів при
церебральній ішемії, сублетальному іонізуючому опроміненні), або
багаторівневі порушення тканиноспецифічних клітинних механізмів
регуляції активності та експресії ізоферментів Na+,K+-AТР-ази при різних
хронічних патологічних станах [Болдырев А.А., Куклей М.Л., 1996; Капля
А.А., 1998 (б); Капля А.А., Мищук Д.О., 2001].

Одним із поширених факторів несприятливого впливу на організм є
алкоголь, а мозок – однією з основних мішеней його дії [сытинский И.А.,
1980; Буров Ю.В., Ведерникова Н.Н., 1985; Иванец Н.Н., Валентик Ю.В.,
1988]. Причиною порушення різноманітних біохімічних та фізико-хімічних
клітинних процесів за умов алкоголізації є як безпосередній вплив
етанолу на клітини органів-мішеней, перш за все їх плазматичні мембрани,
так і опосередкована його дія через продукти метаболічного перетворення.
В той же час тривала алкоголізація зумовлює адаптивні гомеостатичні
зміни у функціонуванні організму, зокрема на рівні клітинних мембран
різних типів тканин, які забезпечують розвиток толерантності до дії
спирту на фоні формування залежності від алкоголю [Chin J.H., Goldstein
D.B., 1985; Яровая Г.А., 1986; Шабанов П.Д., Калишевич С.Ю., 1998;
Сторожок С.А. и др., 2001].

В наш час актуальною проблемою є визначення біохімічних мішеней, що
обумовлюють, з одного боку, пошкоджуючий ефект етанолу, а з іншого –
пристосування організму до алкоголізації. Однією з таких мішеней є
Na+,K+-AТР-аза плазматичних мембран нервових клітин. При вивченні прямої
дії етанолу на Na+,K+-AТР-азу в дослідах in vitro продемонстровано
пригнічення активності цієї ферментної системи [Tabakoff B. et al.,
1987; Marques A., Guerri C., 1988; Omodeo-Sale F. et al., 1991]. Проте,
механізм дії етилового спирту на Na+,K+-AТР-азу з точки зору залежності
функціонування цього ферменту від структури його ліпідного оточення і
досі до кінця не з’ясований. Зокрема, потребує уточнення характер змін
поверхневих властивостей мембрани клітин нервової тканини при дії
аліфатичних спиртів та їх вплив на активність Na+,K+-AТР-ази. Такі
дослідження могли б поглибити розуміння закономірностей взаємозв’язку
структури та функціонування Na+,K+-AТР-ази в умовах модифікації етанолом
структурних властивостей мембрани.

Для дослідження опосередкованого впливу етанолу на організм широко
використовують численні моделі алкоголізації. Це дозволяє вивчати
біохімічні механізми патогенного впливу етанолу на організм, який
розвивається і функціонує в умовах алкогольного навантаження. Аналіз
даних літератури свідчить, що зміни активності Na+,K+-AТР-ази за умов
різних моделей алкоголізації мають неоднозначний характер [Guerri C.,
Crisolia S., 1983; Wescott J.Y., Weiner, H., 1983; Aloia R.C. et al.,
1985; Замай Т.Н. и др., 2002]. Найбільш суттєвими в цьому напрямку є
дослідження онтогенетичної динаміки активності Na+,K+-AТР-ази за умов
пренатальної та ранньої постнатальної алкоголізації, особливо
враховуючи, що рівень експресії ізоформного комплексу Na+,K+-AТР-ази в
онтогенезі може бути показником функціонального розвитку нейрональних
мембран [Druse M.J., Kelly J.M., 1985; Rudeen P.K., Guerri C., 1985;
Kojima H. et al., 1994; Капля А.А., 1998].

Отже, для подальшого поглиблення сучасних уявлень щодо механізмів
прямого мембранотропного та опосередкованого впливу етанолу на мозок
актуальним є як порівняльне вивчення структурних змін в мембрані та
ефективності дестабілізації ізоформного білок-ліпідного комплексу
Na+,K+-AТР-ази кори головного мозку при дії етанолу in vitro, так і
характеристика активності цієї ферментної системи за умов пренатальної,
ранньої постнатальної та довготривалої алкоголізації.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація
відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу біохімії
м’язів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (проблема
«Біохімія тварин та людини»): тема № 5 0199И000270 «Вивчення біохімічних
механізмів електро- та фармакомеханічного спряження у гладеньких м’язах
та ролі систем енергозалежного транспорту Са2+ у забезпеченні цього
процесу» (І кв. 1999 – ІV кв. 2003 р.).

Мета та завдання дослідження. Мета роботи полягала в з’ясуванні
характеру мембранотропного впливу етанолу in vitro на Na+,K+-ATP-азу
кори головного мозку щурів та визначенні активності цієї ферментної
системи плазматичних мембран за умов хронічного споживання етанолу.

Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:

Дослідити чутливість Na+,K+-АТР-азної (різних рецепторних субтипів
ізоформ каталітичної субодиниці ферменту) та Mg2+-АТР-азної активностей
до дії етанолу in vitro в нативних мембранах та за умов дестабілізації
мембранного комплексу ферменту під дією різних чинників (DS-Na,
фосфоліпаза А2).

Охарактеризувати поверхневі властивості мембран при дії етанолу in vitro
за допомогою флуоресцентних методів дослідження.

Провести порівняльне дослідження мембранних ефектів при дії бутанолу
відносно дії етанолу.

Охарактеризувати активності Na+,K+-АТР-ази та рецепторних субтипів її
ізоформ за умов пренатального, раннього постнатального та довготривалого
(на протязі 4 та 15 місяців) споживання етанолу.

Об’єкт дослідження – збагачена плазматичними мембранами мікросомна
фракція кори головного мозку щурів.

Предмет дослідження – активність Na+,K+-ATP-ази плазматичних мембран
кори головного мозку щурів при дії алкоголю.

Для досягнення поставленої мети були використані методи препаративної
біохімії, біохімічної мембранології, спектрофотометрії та
спектрофлуориметрії, а також статистичного аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено систематичне
дослідження впливу спиртів (етанолу та бутанолу) на активність
рецепторних форм каталітичної субодиниці Na+,K+-АТР-ази за умов
дестабілізації їх білково-ліпідних комплексів при мембранотропних
впливах та оцінено функціональний стан цієї ферментної системи у
фізіологічно важливі періоди розвитку тварин за умов споживання етанолу.

Вперше встановлено, що чутливість Na+,K+-АТР-ази до інгібування етанолом
підвищується в умовах дезорганізації мембранного оточення ферменту
детергентом DS-Na та фосфоліпазою А2. Виявлено відмінності в чутливості
рецепторних форм Na+,K+-АТР-ази до дії етанолу, що залежать від
інтенсивності інактивуючого впливу детергента.

Виявлено загальні ефекти дії коротколанцюгових нерозгалужених
аліфатичних спиртів (етанолу та бутанолу) на АТР-азні активності:
чутливість до інгібування спиртом підвищується з довжиною ланцюга,
Mg2+-АТР-аза більш стійка до інактивації, ніж Na+,K+-АТР-аза,
(1-ізоформа Na+,K+-АТР-ази більш резистентна, ніж уабаїнчутливі ізоформи
ферменту.

Показано, що в концентраційному діапазоні інгібування Na+,K+-АТР-ази
етанолом відбувається зменшення інтенсивності флуоресценції
1-анілінонафталін-8-сульфонату (АНС) в мембранах, що свідчить про
розрідження поверхні мембрани. Дія бутанолу на мембрани в концентраціях,
що інгібують Na+,K+-АТР-азу, супроводжується значним підсиленням гасіння
власної триптофанової флуоресценції мембранних білків на тлі незмінності
флуоресценції АНС, а в концентраційному режимі інгібування Mg2+-АТР-ази
( супроводжується зростанням флуоресценції АНС внаслідок підвищення
ригідності поверхні мембран.

Виявлено, що споживання етанолу самицями щурів в період лактації
призводить до затримки розвитку потомства відповідно до зниження вагових
показників (маси тіла, мозку та кори мозку) порівняно з контрольними
тваринами, а також супроводжується зниженням Na+,K+-АТР-азної активності
плазматичних мембран клітин кори (однаковим для ізоформ) на 10-й день
після пологів та подальшою її нормалізацією на 20-30-й постнатальний
день.

Для дорослого мозку виявлено зменшення Na+,K+-АТР-азної активності після
15 місяців алкоголізації щурів за рахунок зниження уабаїнчутливого
компонента ферментативної активності. Фізико-хімічні характеристики
клітин кори (параметри флуоресценції білкових триптофанових залишків та
АНС в мембранах, вміст загальних SH-груп та рівень ендогенного та
індукованого в системі Fe2+/аскорбат МДА у постмітохондріальному
супернатанті) не змінюються. У вихідному гомогенаті зменшується
відносний до білків вміст SH-груп, підвищується чутливість кори мозку до
індукованої пероксидації.

Отримані результати дозволяють глибше зрозуміти механізми
мембранотропного впливу спиртів на Na+,K+-АТР-азу та клітинної адаптації
за умов споживання етанолу.

Практичне значення одержаних результатів. Результати досліджень мають
загальнотеоретичне значення для біохімії, конкретизують методичні
підходи для адекватної оцінки патофізіологічних та фармакологічних
мембранотропних ефектів етанолу. Вони можуть бути основою для подальших
цілеспрямованих фундаментальних та прикладних досліджень при вивченні та
корекції нейронального метаболізму в умовах хронічних інтоксикацій
організму, зокрема алкоголізації.

Окремі положення роботи можуть бути корисними при викладанні спеціальних
курсів лекцій з біохімії нервової системи, нервово-м’язової фізіології,
мембранології, що читаються на біологічних факультетах університетів та
в медичних вищих учбових закладах.

Особистий внесок здобувача. Здобувач особисто виконав експериментальну
частину на всіх етапах. Дисертанткою самостійно здійснено аналіз та
узагальнення відповідних даних літератури. Пропозиція основної ідеї та
задач дослідження, їх поточне коректування здійснено науковим
керівником, доктором біологічних наук Каплею О.А. Аналіз
експериментальних даних, їх узагальнення, інтерпретацію та формулювання
основних положень і висновків роботи проведено спільно з науковим
керівником.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що викладено в
дисертації, були заслухані, апробовані та обговорені на таких наукових
конференціях: конкурсі молодих вчених Інституту біохімії ім. О.В.
Палладіна НАН України у 2002р.; VIII Українському біохімічному з’їзді,
2002 р., м. Чернівці, Україна; ІІІ з’їзді Українського біофізичного
товариства, 2002 р., Львів, Україна; 6-ій Пущинській школі-конференції
молодих вчених, 2002 р., Пущино, Росія; ІІ та III Львівсько-Люблінській
конференції з експериментальної та клінічної біохімії, 2002 р., Люблін,
Польща; 2004 р., Львів, Україна. Результати експериментів доповідались
на наукових семінарах відділу біохімії м’язів, загальноінститутському
семінарі та засіданнях Вченої Ради Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна
НАН України.

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 4 статті у фахових
наукових журналах та 4 тези доповідей у матеріалах міжнародних та
українських наукових з’їздів і конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 127
сторінках машинописного тексту і складається з таких розділів: «Вступ»,
«Огляд літератури», «Методи досліджень», «Результати досліджень та їх
обговорення», «Заключний розділ», «Висновки», «Список використаних
джерел», який містить 179 посилань. Робота ілюстрована – 26 рисунками та
8 таблицями.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Огляд літератури складається з двох підрозділів. Перший підрозділ
присвячено загальним уявленням щодо структури та функціонування
Na+,K+-АТР-ази в нормі та при патологічних станах організму. У другому
підрозділі розглянуто такі складові патогенного впливу етанолу на
організм, як нейротропна та мембранотропна дія цього спирту, а також
процеси адаптації організму, зокрема на рівні плазматичних мембран (ПМ)
клітин різних тканин, до хронічного споживання алкоголю.

МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Щурів утримували на стандартному раціоні віварію та забивали за
допомогою декапітації. Примусову алкоголізацію самок щурів здійснювали в
умовах вільного доступу до їжи та розчину етанолу як єдиного джерела
рідини. Моделі алкоголізації: споживання 20 % (об/об) етанолу в
останньому триместрі вагітності (пренатальна алкоголізація) або з
першого дня лактації до 40 — 44 днів післяпологового періоду
(постнатальна алкоголізація) [Трофимов С.С., 1999; Tran T.D. et al.,
2000], та 15 % (об/об) етанолу за умов довготривалої алкоголізації
протягом 4 або 15 місяців [Буров Ю.В., Ведерникова Н.Н., 1985].

Мікросомну фракцію (МС) одержували з сірої речовини головного мозку
щурів методом диференційного центрифугування згідно з
Йоргенсеном-Свіднер [Jorgensen P.L., 1974; Sweadner K.J., 1978]. Вміст
білка визначали за модифікованим методом Лоурі з використанням 1%
розчину DS-Na для солюбілізації мембран [Cadman E. et al., 1979].

Визначення Na+,K+-АТР-азної активності проводили після попередньої
пермеабілізації везикульованих препаратів МС (1,4 — 2 мг білка/мл)
аніонним детергентом DS-Na (0,2 мг DS-Na/мг білка) в середовищі
Йоргенсена-Свіднер [Капля А.А. и др., 1997]. В окремій серії дослідів
обробку препаратів фосфоліпазою А2 (ФЛ А2) з отрути Naja naja oxiana
проводили в середовищі, яке містило 25 мМ імідазол (рН 7,5), 1 мМ СаСl2,
10 мкг/мл ФЛ А2, при 37°С протягом 30 хв. Реакцію зупиняли 10-кратним
розведенням розчином ЕГТА (кінцева концентрація 5 мМ) [Капля А.А. и др.,
1996]. Розведення середовища попередньої обробки МС при внесенні білка в
середовище для визначення АТР-азної реакції складало 100-200 разів.

Загальну АТР-азну активність визначали за приростом неорганічного
фосфату під час інкубації препаратів МС при 370С у середовищі (кінцевий
об’єм 1 мл), яке містило 30 мМ трис-HCl (рН 7,4), 130 мМ NaCl, 20 мМ
KCl, 3 мМ MgCl2, 3 мМ АТР, 0,1-0,2 мМ ЕДТА, 1,25 мМ дитіотреітол. Час
інкубації складав 10 хв. Реакцію зупиняли додаванням 0,5 мл 1% розчину
DS-Na. Неорганічний фосфат визначали методом Фіске-Суббароу з
аскорбіновою кислотою в якості відновника [Chen P.S. et al., 1956].
Сумарну Na+,K+-АТР-азну активність розраховували з різниці між
величинами загальної АТР-азної (Na+,K+-АТР-аза + Mg2+-АТР-аза) та
Mg2+-АТР-азної активностей. Останню визначали у присутності 3 мМ
уабаїну, і оцінювали за різницею до проби без білка. Питомі
Na+,K+-АТР-азна та Mg2+-АТР-азна активності МС при [DS-Na]opt складали
відповідно ~110 та ~25 мкмолей Рi/год на 1мг білка.

Активності рецепторних субтипів ізоформ каталітичної субодиниці
Na+,K+-АТР-ази визначали як компоненти сумарної Na+,K+-АТР-азної
активності за чутливістю до інгібування уабаїном. Час інкубації в
середовищі АТР-азної реакції при 370С складав 30 хв. Уабаїнчутливий
компонент Na+,K+-АТР-азної активності, який відповідає активності
ізоформ з високою спорідненістю до уабаїну ((2 та (3), розраховували з
різниці між величинами АТР-азної активності у відсутності цього
інгібітора та за його присутності в концентрації 5 мкМ.
Уабаїнрезистентний компонент Na+,K+-АТР-азної активності (активність
(1-ізоформи ферменту з низькою спорідненістю до уабаїну) розраховували з
різниці між величинами АТР-азної активності за присутності 5 мкМ та 3 мМ
уабаїну [Капля А.А., Кравцов А.В., 1992].

Чутливість Na+,K+-АТР-ази, рецепторних субтипів ізоформ її каталітичної
субодиниці та Mg2+-АТР-ази до спирту в середовищі АТР-азної реакції
оцінювали за величиною коефіцієнта інгібування І50 [Костерін С.О.,
1999].

Вимірювання флуоресценції триптофанових залишків білків та зонда
1-анілінонафталін-8-сульфонату (АНС) проводили в середовищі (об’єм 2
мл), яке містило 10мМ трис-НСl буфер (рН 7,5), 0,2 мМ ЕДТА та 0,1 мг
білка/мл ((=0,01), на флуоресцентному спектрофотометрі “Hitachi MPF-4”
(Японія) у термостатованих кюветах при 250С. Інтенсивність флуоресценції
(F) триптофанових залишків мембранних білків вимірювали при (зб = 296
нм, (ем = 340 нм. Константу Штерна-Фольмера (Кsv) та частку
флуоресценції, що гаситься (fa) розраховували за допомогою
модифікованого рівняння Штерна-Фольмера. Інтенсивність флуоресценції АНС
реєстрували при концентрації зонда 20 мкМ, (зб = 365 нм, (ем = 480 нм.
За умов “іонного удару” до середовища додатково вносили 0,25 М NaCl
((=0,25) [Демченко А.П., 1988; Добрецов Г.Е., 1989].

Визначали ендогенний вміст та індуковане в системі Fe/аскорбат
накопичення малонового діальдегіду (МДА) з використанням
2-тіобарбітурової кислоти (ТБК) [Болдырев А.А. и др.,1992] та вміст
загальних SH-груп за допомогою 5,5’-дитіо-біс(2-нітробензойної) кислоти
(ДТНБ) [Riddles P.W. et al., 1979].

Експериментальні дані обробляли загальноприйнятими методами статистики
[Кокунин В.А., 1975]. Для розрахунків та графічної презентації отриманих
результатів були використані компьютерні програми Microsoft Excel та
Microcal Origin.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

1. Визначення чутливості Na+,K+-АТР-ази мікросомної фракції кори
головного мозку щурів до етанолу та бутанолу in vitro було проведене,
по-перше, за умов присутності етанолу в середовищі екстракції при різних
режимах обробки препаратів МС DS-Na та, по-друге, за умов присутності
етанолу та бутанолу в середовищі АТР-азної реакції.

Для з’ясування мембранотропного ефекту етанолу на Na+,K+-ATP-азу його
вносили в концентраціях від 0,1 до 2 М лише в середовище попередньої
обробки мембран детергентом з наступним значним зниженням вмісту етанолу
в середовищі АТР-азної реакції – до 0,5-10 мМ.

За оптимальних умов попередньої обробки МС кори головного мозку щурів
(20°С та співвідношення DS-Na/білок (0,2 мг/мг)) етанол має слабку
інактивуючу дію на Na+,K+-ATP-азу (до 10 % інактивації) лише в
концентраціях, які перевищують 1 М (рис. 1, крива 1). Підсилення
інактивації ферменту (рис. 1, крива 2) за умов попередньої обробки МС
оптимальним співвідношенням DS-Na/білок (0,2 мг/мг) при 37°С
спостерігається лише за високих концентрацій етанолу (> 1 М). Більш
виражений ефект спирту (рис. 1, крива 3), вже починаючи з концентрації
0,5 М і вище, відмічений при 20°С у присутності таких концентрацій
детергента в середовищі попередньої обробки МС, які значно інактивують
Na+,K+-ATP-азу (0,6 мг DS-Na /мг білка).

Дані про підсилення дії інактивуючих Na+,K+-ATP-азу концентрацій DS-Na
(детергент/білок > 0,5 мг/мг) за присутності 1М етанолу в середовищі
попередньої обробки препаратів детергентом представлено на рис. 2.

Таким чином, відповідно до механізму дії аніонного детергента на
Na+,K+-ATP-азу [Helenius A., Simons K., 1975; Sweadner K.J., 1978; Капля
А.А. и др., 1997], етанол у високих концентраціях посилює її інактивацію
у препаратах МС кори головного мозку щурів за температурної модифікації
мембранного матриксу та/або дезорганізації мембранного оточення
ферменту. Для забезпечення аналогічного ефекту (див. рис. 1, криві 2 та
3) за оптимальної концентрації DS-Na, яка не впливає безпосередньо на
мембранне оточення Na+,K+-ATP-ази, потрібні значно більш високі
концентрації етанолу (> 1 М) та підвищення температури, ніж за
інактивуючих концентрацій детергента, що обумовлюють дезорганізацію
нативної конформації ферменту в присутності 0,5 М етанолу. Отримані
результати характеризують закономірності впливу етанолу на інактивуючу
та солюбілізуючу здатність використаного аніонного детергента та можуть
відображати структурний стан в мембрані білок-ліпідних комплексів
ізоформ каталітичної субодиниці Na+,K+-ATP-ази нейрональних мембран.

При дослідженні чутливості Na+,K+-ATP-ази до дії етанолу останній
вносили в середовище АТР-азної реакції. В діапазоні використаних
концентрацій етанолу (0,1 — 2,0 М) відбувається дозозалежне інгібування
Na+,K+-ATP-азної активності мембран, пермеабілізованих оптимальною
концентрацією DS-Na (0,2 мг/мг білка). У присутності 0,1 — 0,3 М
етилового спирту відмічений невисокий (до 20%) рівень інгібування
ферменту (рис. 3, крива 2). В той же час чутливість ферменту до етанолу
в нативних (рис. 3, крива 5) та пермеабілізованих оптимальними
концентраціями DS-Na мембранах (рис. 3, крива 2) є однаковою. Попередня
інактивація препаратів високими концентраціями DS-Na супроводжується
підвищенням чутливості Na+,K+-ATP-ази до етанолу, про що свідчить
достовірне зниження величин І50 (рис. 3, криві 3 та 4, табл. 1).
Mg2+-ATP-аза виявляється значно більш резистентною, ніж Na+,K+-ATP-аза,
до дії етанолу і 50% інгібування її не досягається навіть у присутності
2 М спирту (рис. 3, крива 1).

При вивченні ефекту етанолу на ізоформи каталітичної субодиниці
Na+,K+-ATP-ази виявлено відмінності в його дії на уабаїнчутливий та
уабаїнрезистентний компоненти ферментативної активності МС кори
головного мозку щурів. Чутливість до етанолу різних субтипів ізоформ
Na+,K+-ATP-ази є різною (див. табл. 1). Ці результати відповідають
даним, отриманим іншими дослідниками [Marks M.J. et al., 1984; Nhamburo
P.T. et al., 1987], щодо переважної інактивації уабаїнчутливих ізоформ
Na+,K+-ATP-ази кори головного мозку миші у порівнянні з
уабаїнрезистентною ?1-ізоформою ферменту. При цьому, для окремих
субтипів ізоформ ферменту виявляються наступні закономірності. За
помірної інактивації Na+,K+-ATP-ази DS-Na (0,5 мг/мг білка) зберігається
відносна чутливість ізоформ ферменту до етанолу (див. табл. 1).

Переважне інгібування етанолом активності уабаїнрезистентного компонента
Na+,К+-АТР-ази спостерігається лише тоді, коли попередня модифікація
детергентом викликає більш високу його інактивацію у порівнянні з
уабаїнчутливим субтипом. В цьому випадку величина І50 за етанолом для
?1-ізоформи Na+,K+-ATP-ази максимально знижується (у 1,9 рази),
послідовно зменшуючись відповідно до ступеня інгібування детергентом
(див. табл. 1).

Також було виявлено зростання ефективності інгібування Na+,K+-ATP-ази
помірними концентраціями етанолу після попередньої дезорганізації
ліпідного оточення ферменту ФЛ А2 в немодифікованих детергентом МС (рис.
4), коли залишкова Na+, K+-АТР-азна активність препаратів складала ~30
%. В цьому випадку чутливість Na+,K+-ATP-ази до етанолу підвищується в
діапазоні концентрацій спирту від 0,2 до 0,5 М.

Отримані результати свідчать, що чутливість Na+,K+-ATP-ази до інгібуючої
дії етанолу та специфіка його ефекту на ізоформи каталітичної субодиниці
цього ферменту визначається рівнем дезінтеграції їх білково-ліпідних
комплексів в мембрані, порушенням нативних білок-ліпідних взаємодій.

У присутності бутанолу в концентраціях 0,1 — 1 М в середовищі АТР-азної
реакції величини І50 ферментативних активностей знижуються майже на
порядок (табл. 2). Проте, зберігаються основні ефекти, що встановлені
для дії етанолу: Mg2+-АТР-аза більш резистентна, ніж Na+,K+-АТР-аза,
(1-ізоформа Na+,K+-АТР-ази – ніж уабаїнчутливі ізоформи ферменту.
Підсилення інактивації ферментів бутанолом у порівнянні з етанолом
відповідає більш ефективному розупорядкуванню серцевинної частини
мембрани при подовженні ланцюга в гомологічному ряду нерозгалужених
аліфатичних спиртів [Chin J.H., Goldstein D.B., 1985].

Отже, порівняльні дослідження чутливості Na+,K+-АТР-ази до дії спиртів
in vitro в умовах дезорганізації мембранної структури ферменту
дослідженими агентами (DS-Na, ФЛ А2) вказують на те, що порушення
нативних білок-ліпідних взаємодій, дестабілізація внутрішньомембранної
структури обумовлює ефективність їх мембранотропної дії.

Подальше дослідження впливу етилового та бутилового спиртів в
концентраційному діапазоні інгібування Na+,K+-АТР-ази на структурний
стан мембранних компонентів здійснено із застосуванням флуоресцентного
аналізу.

2. Дослідження структурних змін поверхневої ділянки мембран кори
головного мозку щурів при дії етанолу та бутанолу in vitro.

Структурний стан мембранних білків оцінювали за гасінням власної
триптофанової флуоресценції в препаратах МС кори головного мозку щурів.
Наявність етанолу та бутанолу в досліджуваному діапазоні концентрацій в
середовищі вимірювання флуоресценції не спричинює зсуву довжини хвилі
максимальної інтенсивності флуоресценції (?макс) триптофанових залишків,
що свідчить про незначні зміни діелектричної проникності та, відповідно,
полярності середовища, а також про відсутність змін у взаємодії
розчинника та флуорофора, полярності оточення флуорофора та
переорієнтації молекул розчинника [Лакович Дж., 1986; Демченко А.П.,
1988].

N

P

R

?

a

dh^„

R

t

?

6- N ? ¶ R

?

^„

dh^„

&

gd/2М, для бутанолу I50=0,23(0,01М) та уабаїнчутливі ізоформи
каталітичної субодиниці Na+,K+-АТР-ази, ніж (1-ізоформа. Переважна
інактивація етанолом (1-ізоформи Na+,K+-АТР-ази виявляється лише за умов
її більшої попередньої інактивації детергентом.

4. Показано, що зміни поверхневих властивостей мембран клітин кори
головного мозку в умовах дії етанолу та бутанолу є різнонаправленими. В
діапазоні концентрацій етанолу, що інгібують Na+,K+-АТР-азу,
відбувається розрідження поверхні мембрани, відповідно до гасіння
флуоресценції АНС. Бутанол в концентраціях (0,3М не змінює, а при вищих
концентраціях викликає зростання інтенсивності флуоресценції АНС,
імовірно, внаслідок підвищення ригідності поверхні мембран. Виявлено
більш виразне зниження інтенсивності власної триптофанової флуоресценції
мембранних білків у присутності бутанолу, порівняно з етанолом.

5. Пренатальна алкоголізація 20% етанолом протягом останнього триместру
вагітності не супроводжується зменшенням загальної Na+,K+-АТР-азної
активності кори головного мозку життєздатного потомства (через 1 день
після пологів). Проте на 10-й день постнатальної алкоголізації (час
найбільшої затримки розвитку кори) виявлено вірогідне зниження (на ~30%)
Na+,K+-AТР-азної активності (однакове для ізоформ) у порівнянні з
контрольними тваринами. Після 20-го постнатального дня відмінності між
величинами ферментативної активності не виявляються. Mg2+-АТР-азна
активність мікросомної фракції підвищується в онтогенезі незалежно від
Na+,K+-AТР-азної активності і нечутлива до постнатальної алкоголізації.

6. Довготривале споживання щурами 15% етанолу протягом 15 місяців
призводило до помірного (на 13%) зниження Na+,K+-АТР-азної активності
плазматичних мембран кори головного мозку за рахунок зниження, головним
чином, уабаїнчутливого компонента ферментативної активності (на 15%).
Структурні характеристики мембран (за параметрами флуоресценції білкових
триптофанових залишків та АНС), вміст SH-груп у постмітохондріальному
супернатанті та інтенсивність пероксидації ліпідів (МДА) не змінюються.
У вихідному гомогенаті зменшується відносний до білків вміст SH-груп,
підвищується чутливість кори мозку до індукованої пероксидації.

СПИСОК РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Мищук Д.О., Зимина В.П., Капля А.А. Чувствительность Na+,K+-АТР-азы
коры головного мозга крыс к этанолу при нарушении структуры
плазматической мембраны додецилсульфатом натрия // Укр. біохім. журн. –
2002. – Т. 74, № 5. – С. 55-61.

2. Мищук Д.О., Капля А.А. Состояние Na+,K+-АТР-азной системы коры
головного мозга крыс в постнатальный период в условиях потребления
этанола самками при беременности и лактации // Укр. біохім. журн. –
2002. – Т. 74, № 6. – С. 58 — 64.

3. Мищук Д.О., Капля А.А. Влияние этанола на структурно-функциональные
характеристики мембран коры головного мозга крыс in vitro // Укр.
біохім. журн. – 2003. – Т. 75, № 2. – С. 55 — 61.

4. Мищук Д.О., Капля А.А. Структурно-функциональное состояние мембран в
микросомной фракции коры головного мозга крыс в условиях длительного
потребления этанола // Укр. біохім. журн. – 2003. – Т. 75, № 4. – С.
97-100.

5. Kaplya O., Mishchuk D. Effect of maternal ethanol consumption by
pregnant and lactating rats on Na+,K+-АТР-ase activity in the postnatal
brain // Annales universitatis Mariae Curie-Sclodowska. – Lublin,
Polonia. – 2002. – Vol. XV, № 39. – P. 435 — 437.

6. Мищук Д.О. Влияние этанола на Na+,K+-AТФазную активность коры
головного мозга в постнатальном онтогенезе крыс // Биология – наука
21-го века: Сборник тезисов. – Том. 1. – Пущино. – 2002. – С. 283-284.

7. Капля О.А., Мищук Д.О., Зиміна В.П. Особливості Na+,K+-AТР-азної
системи кори головного мозку в постнатальному онтогенезі щурів за умов
хронічного споживання етанолу самками під час вагітності та в період
лактації // Укр. біохім. журн. – 2002. – Т. 74, № 4а (додаток 1). – С.
136-137.

8. Міщук Д.О., Капля О.А., Зиміна В.П. Мембранотропна дія етанолу на
Na+,K+-AТФазу кори головного мозку щурів // Тези доповідей ІІІ з’їзду
біофізичного товариства. – Львів. – 2002. – С. 79.

АНОТАЦІЯ

Міщук Д.О. Вплив етанолу на властивості Na+,K+-АТР-ази кори головного
мозку щурів. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.04 – біохімія. Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна
НАН України, Київ, 2004.

Дисертація присвячена вивченню закономірностей мембранотропного впливу
етанолу in vitro на Na+,K+-ATP-азу мікросомної фракції кори головного
мозку щурів та характеристиці активності цієї ферментної системи
плазматичних мембран in vivo за умов хронічного споживання етанолу.

Встановлено, що ступінь інгібування Na+,K+-АТР-азної активності етанолом
підвищується за умов дезорганізації мембранного оточення ферменту
детергентом DS-Na та фосфоліпазою А2 з отрути кобри, а для субтипів (за
уабаїнчутливістю) ізоформ каталітичної субодиниці залежить від
інтенсивності інактивуючого впливу DS-Na.

Дія етанолу та бутанолу на АТР-азні активності є подібною за характером
і відмінною за ефективністю. Ці спирти також по-різному модифікують
структуру поверхневої ділянки мембрани (відповідно до змін власної
триптофанової флуоресценції мембранних білків та флуоресценції
1-анілінонафталін-8-сульфонату).

В умовах споживання 20% етанолу (об/об) самицями в період лактації
відбувається зниження Na+,K+-АТР-азної активності (однакове для ізоформ)
мікросомної фракції кори головного мозку щурів на 10-й день після
народження у відповідності з пригніченням розвитку кори мозку в цей
період. Довготривале споживання дорослими щурами 15% етанолу (об/об)
після 15 місяців призводило до пригнічення Na+,K+-АТР-азної активності
за рахунок її уабаїнчутливого компонента.

Ключові слова: Na+,K+-АТР-аза, мозок, мембранотропні агенти, етанол,
споживання етанолу.

АННОТАЦИЯ

Мищук Д.О. Влияние этанола на свойства Na+,K+-АТР-азы коры головного
мозга крыс. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.04 – биохимия. Институт биохимии им. О.В. Палладина
НАН Украины, Киев, 2004.

Диссертационная работа посвящена изучению закономерностей
мембранотропного влияния этанола in vitro на Na+,K+-АТР-азу коры
головного мозга крыс и характеристике активности этой ферментной системы
плазматических мембран in vivo в условиях хронического употребления
этанола.

В экспериментах на обогащенной плазматическими мембранами микросомной
фракции коры головного мозга крыс показано усиление инактивации фермента
при совместном действии детергента и высоких концентраций этанола, а
также чувствительности к ингибированию спиртом после предварительной
модификации мембран DS-Na и фосфолипазой А2 из яда кобры.
Na+,K+-АТР-азная активность нативных (I50=0,72(0,01М) и
пермеабилизированных оптимальными концентрациями DS-Na (I50=0,69(0,01М)
микросом коры головного мозга крыс намного более чувствительна к
действию этанола, чем Mg2+-АТР-азная активность (I50>2М).

Выявлены отличия в чувствительности изоформ Na+,K+-АТР-азы к действию
этанола, которые зависят от интенсивности инактивирующего влияния
детергента DS-Na. В условиях предварительной обработки оптимальными
концентрациями DS-Na активность уабаинчувствительных изоформ ((2 и (3)
сильнее ингибируется этанолом, чем активность (1-изоформы. Преобладающая
инактивация спиртом (1-изоформы Na+,K+-АТР-азы наблюдается только в
условиях ее большей инактивации детергентом.

Бутанол значительно эффективнее ингибирует ферментативные активности по
сравнению с этанолом. В присутствии бутанола сохраняются основные
эффекты, которые установлены для действия этанола: Mg2+-АТР-аза более
резистентна (I50=0,23(0,01М), чем Na+,K+-АТР-аза (I50=0,08(0,001М);
(1-изоформа Na+,K+-АТР-азы – чем ее уабаинчувствительные изоформы.

Использование флуоресцентного анализа позволило исследовать изменение
структурных свойств мембран микросомной фракции коры головного мозга
крыс при действии этанола и бутанола в диапазоне ингибирующих АТР-азные
активности концентраций. Более выраженное снижение интенсивности
собственной триптофановой флуоресценции мембранных белков в присутствии
бутанола, по сравнению с этанолом, соответствует более эффективному
разупорядочению мембраны бутанолом вследствие его большей гидрофобности.

С помощью экзогенного зонда АНС выявлено разнонаправленные изменения
поверхностных свойств мембран при действии этанола и бутанола. В
диапазоне концентраций спиртов, которые ингибируют Na+,K+-АТР-азу, в
присутствии этанола происходит гашение флуоресценции АНС, тогда как
бутанол в концентрациях (0,3М не изменяет, а при более высоких
концентрациях, которые полностью инактивируют Mg2+-АТР-азу, вызывает
увеличение интенсивности флуоресценции АНС.

В исследованиях in vivo при употребление этанола самками крыс в период
лактации наблюдалась снижение Na+,K+-АТР-азной активности микросомной
фракции коры головного мозга потомства (не специфично для изоформ) на
10-й день после родов на фоне снижения весовых показателей (маси тела,
мозга и коры). Это свидетельствует о замедлении процессов нейронального
развития под влиянием алкоголя. В период физиологического созревания
мозга (20-30-й постнатальный день) величины ферментативных активностей
при алкоголизации не отличались от контрольных.

В условиях моделей длительной алкоголизации умеренное (на 13%) снижение
Na+,K+-АТР-азной активности наблюдалось только после 15 месяцев
употребления крысами 15% этанола за счет снижения в основном
уабаинчувствительного компонента Na+,K+-АТР-азной активности (на 15%).
Отсутствие изменений структурных характеристик мембран (по параметрам
флуоресценции белковых триптофановых остатков и АНС), содержания
SH-групп и интенсивности пероксидации липидов (уровень эндогенного МДА),
по-видимому, могут свидетельствовать о стабильном функциональном статусе
в этих условиях систем антиоксидантной защиты и поддержания клеточного
гомеостаза.

Полученные экспериментальные результаты расширяют современные
представления о мембранотропных механизмах влияния алифатических спиртов
на Na+,K+-АТР-азу как один из ключевых мембранных ферментов, адаптивных
механизмах клеточного гомеостаза в условиях употребления этанола и имеют
общетеоретическое значение для биохимии.

Уточняя методические подходы для правильной оценки патофизиологических и
фармакологических мембранотропных эффектов, результаты данной работы
могут быть основой для дальнейших целенаправленных фундаментальных и
прикладных исследований при изучении и коррекции нейронального
метаболизма в условиях хронических интоксикаций организма, в том числе
при алкоголизме.

Ключевые слова: Na+,K+-АТР-аза, мозг, мембранотропные агенты, этанол,
употребление этанола.

SUMMARY

Mishchuk D.O. Ethanol influence on the properties of Na+,K+-АТРase of
rat brain cortex. – Manuscript.

Dissertation thesis on obtaining the scientific degree of PhD (Biology)
in the speciality 03.00.04 – biochemistry. O.V. Palladin Institute of
Biochemistry of NAS of Ukraine, Kyiv, 2004.

The dissertation is devoted to the elucidation of the mechanisms of
ethanol membrane-acting effect in vitro on rat brain cortex
Na+,K+-АТРаse and the characteristics of this enzyme system of plasma
membrane in vivo under conditions of chronic consumption of ethanol.

It is established that the inhibition intensity of the Na+,K+-АТРаse
activity by ethanol was increased under perturbation of enzyme membrane
microenvironment by DS-Na and phospholipase A2 from Naja naja oxiana
venom. Na+,K+-АТРаse isoforms have different sensitivity to ethanol
depending on the intensity of DS-Na inactivating effect.

The influence of ethanol and butanol on ATPase activities have similar
character but is different in efficiency. Also these alcohols modificate
the membrane surface area in dissimilar manner (according to the
intrinsic tryptophan fluorescence of the membrane proteins and
fluorescence of the probe 1-anilinonaphtalene-8-sulfonate).

Under consumption of 20% ethanol (v/v) by female rats during lactation
period the decrease of Na+,K+-АТРаse activity, similar for enzyme
isoforms, is revealed on 10th day after birth in brain cortex microsomal
preparations of the offspring that was in accordance with reduction of
rat brain cortex development in this period.

The long-term alcohol consumption for 15 months by adult rats causes
decrease in Na+,K+-АТРаse activity at the expense of reduction of its
ouabainsensitive component.

Key words: Na+,K+-АТРase, brain, membrane-acting agents, ethanol,
consumption of ethanol.

PAGE 1

Похожие записи