АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ ІМ. І.І. МЕЧНИКОВА

ЖДАМАРОВА ЛАРИСА АНАТОЛІЇВНА

УДК 579.61 + 57.042: 579. 871.1 (043)

Вплив біотичних та абіотичних факторів на персистенцію та біологічні
властивості збудника дифтерії

03.00.07 — мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового

ступеня кандидата медичних наук

Харків — 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті мікробіології та імунології ім.
І.І.Мечникова

АМН України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Бабич Євген
Михайлович, завідувач лабораторії специфічної профілактики краплинних
інфекцій, Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН
України

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Дикий Ігор Леонідович,
завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології, Національний
фармацевтичний університет МОЗ України

доктор медичних наук, професор Кременчуцький Геннадій Миколайович,
завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології,
Дніпропетровська державна медична академія МОЗ України

I?ia?aeia onoaiiaa: ?inoeooo ai?aeai?ieia?? oa ?ioaeoe?eieo oai?ia

ім Л.В. Громашевського АМН України

Захист відбудеться “ 19 ” лютого 2004 р. о 13.00 годині на засіданні
Спеціалізованої вченої ради Д 64.618.01 при Інституті мікробіології та
імунології ім. І.І.Мечникова АМН України (61057, м. Харків, вул.
Пушкінська, 14).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології та
імунології ім. І.І. Мечникова АМН України (61057, м. Харків, вул.
Пушкінська, 14).

Автореферат розісланий “ 15 ” січня 2004 р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради Д 64.618.01 Бруснік С.В.

Актуальність теми. Остання епідемія дифтерії на території України
визначила ряд питань, що вимагають з’ясування причин інтенсивного
поширення даної інфекції (Деміховська О.В., Чудна Л.М., 1999). До
факторів, що спричинили погіршення епідситуації насамперед відносять
зниження напруженості колективного імунітету проти збудника дифтерії.
Проте підвищення рівня захворюваності в 1991 – 2001рр. проходило на тлі
значних показників щепленості та високої частки вакцинованих серед
захворівших, а саме: дітей 74,68 %, підлітків – 86,61 %, а дорослих –
43,61 %. Навіть особи, які щеплені повноцінно, хворіли на клінічно
виражені та токсичні форми дифтерії. Більш того, за період розвитку
епідемії зареєстровано 690 летальних випадків від дифтерійної інфекції,
серед яких 196 дорослих і 97 дітей були щеплені (Колесников М.М.,
Петрусевич Т.В., 2002).

Аналіз даних літератури свідчить, що захворюваність на дифтерію
обумовлена не тільки зниженням напруженості протидифтерійного
колективного імунітету, а в значній мірі і адаптаційною мінливістю
дифтерійного мікроба, що пов’язано, очевидно, з процесами циркуляції
патогенних коринебактерій серед вакцинованого населення (Педенко
А.И.,1965; Онищенко Т.Є., Мірошниченко В.П., 2002).

До уваги слід прийняти, що реалізація епідемічного процесу дифтерійної
інфекції проходить в основному у вигляді бактеріоносійства, яке мало
регулюється антитоксичним імунітетом (Гоц Ю.Д., Колесников М.М. та ін.,
2002; Крамарів С.О., Тріскова Л.О. та ін., 1995). В значній мірі
носійство коринебактерій залежить від неспецифічних факторів захисту
організму людини та особливостей формування гетерогенних (по
токсиноутворенню) популяцій C. diphtheriae (Біляков В.Д., 1987).

До основних питань резистентності людей відносно заселення збудником
біологічної ніші відносять також мікробіоценози верхніх дихальних
шляхів. Саме вони, згідно даним літератури, часто визначають тривалість
перебування збудника на слизових оболонках (Крамарів С.О., Тріскова
Л.О., та ін.,1995). Асоціативні міжмікробні зв’язки при дифтерійній
інфекції майже не вивчені. Так, не визначені особливості персистенції
збудника в умовах взаємодії його з різними представниками мікрофлори
верхніх дихальних шляхів, відсутні дані відносно позитивних симбіонтів
та активних природних конкурентів, що має важливе прикладне значення.

Актуальним напрямком дослідження залишається мінливість збудника
дифтерії під впливом факторів зовнішнього середовища. Із них в останні
роки все більше уваги приділяють фізичним чинникам, які широко
застосовуються в медицині, зокрема дії електромагнітних хвиль на
мікробний світ (Бецкий О.В., Девятков Н.Д. та ін., 2000). Наявність у C.
diphtheriae біологічних ознак, що міняються в залежності від умов
зовнішнього середовища (окремі біохімічні властивості, чутливість до
антибіотиків, та тощо), диктує необхідність вивчення ролі абіотичних
факторів у формуванні популяцій патогенних коринебактерій з вираженими
селективними властивостями (Бірюкова С.В., Маніна Ж.М. та ін.,1999).

Захворюваність на дифтерію та летальність серед повноцінно щеплених осіб
вимагає звернутися до уточнення деяких антигенних властивостей збудника.
На сьогоднішній день все частіше відстоюється точка зору, що поширення
інфекції регулюється не тільки антитоксичним, а і протибактеріальним
імунітетом (Шмельова Е.А., 1989; Щетиніна В.М., Верезуб Л.Г. та ін.,
1999). Проте визначення його та характеристика по кількісним параметрам
у інфікованих осіб ускладнюється відсутністю специфічних інформативних
діагностичних препаратів. Внаслідок вказаного, нині діюча система
імунологічного нагляду за дифтерійною інфекцією обмежена визначенням
лише напруженості антитоксичного імунітету у вакцинованих і не надає
надійної інформації щодо інтенсивності циркуляції збудника серед
населення.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана
згідно рекомендацій МОЗ України по проведенню науково – дослідних робіт
за програмою “Тактика та стратегія боротьби з дифтерією в Україні”; НДР
ХНДІМІ ім. І.І. Мечникова МОЗ України ЦФ 7.5.96 № держреєстрації
0197U014757 “Регулятори формування гетерогенних популяцій за
токсигенною, ферментативною та серологічною ознаками коринебактерій
дифтерії та бордетелла пертусіс”; НДР ХНДІМІ ім. І.І. Мечникова МОЗ
України ЦФ 20.97 № держреєстрації 0197U019330 “Вивчення властивостей
соматичних антигенів збудників дифтерії, кашлюку та менінгіту з метою
подальшого використання для удосконалення вакцинних та діагностичних
препаратів”; НДР ХНДІМІ ім. І.І. Мечникова МОЗ України ЦФ 4.32.99 №
держреєстрації 0199U003173 “Розробка імуногенних ентеральних форм
анатоксинів та соматичних антигенів для створення непарентеральних
вакцин проти дифтерії, кашлюку і менінгококової інфекції”. Дисертант є
виконавцем окремих фрагментів вказаних науково–дослідних робіт.

Мета і завдання дослідження. Мета — визначити підходи до створення
препаратів, направлених проти персистенції збудника дифтерії на слизових
оболонках інфікованих осіб та організації серологічного контролю за
циркуляцією патогенних коринебактерій.

Для досягнення мети поставлені такі завдання:

Охарактеризувати взаємовідносини коринебактерій дифтерії з домінуючими
представниками мікробіоценозу мигдаликів.

Вивчити вплив лазерного, ультрафіолетового та електронного опромінення
на біологічні властивості патогенних коринебактерій.

Вдосконалити схему виділення соматичних антигенів, вивчити їх хімічний
склад та токсичні властивості клітинних компонентів, одержаних із
неопромінених штамів і мікробної маси після дії електронним пучком.

Вивчити чутливість та специфічність еритроцитарних діагностикумів,
приготовлених на основі одержаних антигенів.

Об’єкт дослідження: збудник дифтерії, представники мікробіоценозу,
лабораторні тварини, соматичні антигени.

Предмет дослідження: міжмікробні взаємовідносини, ферментативна
активність Corynebacterium diphtheriae, продукція токсину, чутливість до
антибіотиків, імуногенні властивості антигенів.

Методи дослідження: мікробіологічні, біохімічні, фізичні,
математико-статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Визначено представників
мікробіоценозів, що впливають на тривалість перебування збудника
дифтерії на слизових оболонках мигдаликів; встановлено режими
опромінення лазерним та ультрафіолетовим променями, при яких
відбувається стимуляція чи пригнічення токсиносинтезуючої функції tox+
штамів C. diphtheriae, і спостерігається зміна чутливості патогенних
коринебактерій до протимікробних препаратів.

Показано, що електронний пучок порівняно з іншими досліджуваними
фізичними чинниками спричиняє найбільш виражене пригнічення продукції
дифтерійного екзотоксину. Доведено залежність між дозою опромінення та
ознакою токсиноутворення; визначено режими дії електронного пучка в
процесі вилучення соматичних антигенів патогенних коринебактерій, при
яких знижується вихід екзотоксину.

Практичне значення отриманих результатів. Розроблено схему послідовної
екстракції та виділення соматичних антигенів, на основі яких
запропоновано спосіб приготування еритроцитарного діагностикуму для
оцінки антибактеріального протидифтерійного імунітету у інфікованих
осіб.

Результати досліджень використовуються в лекційних матеріалах на
кафедрах клінічної імунології і мікробіології Харківської медичної
академії післядипломної освіти; імунології, алергології та
ендокринології Буковинської державної медичної академії МОЗ України;
біотехнології та аналітичної хімії Національного Технічного Університету
“ХПІ”

Експериментальні дані роботи відносно одержання соматичних антигенів та
впливу фізичних факторів на біологічні властивості збудника дифтерії
стали вихідними для подальшого планування двох нових наукових тем: АМН
50/02 “Вивчення імуногенних властивостей захищених полімерними сполуками
мікробних клітин, полісахаридних та поліпептидних антигенів збудників
кашлюку, дифтерії при парентеральному, ентеральному та трансдермальному
шляху їх введення” та ІН 54/2003 “Вплив електромагнітних полів (ЕМП) в
широкому діапазоні частот на біологічні властивості збудників дифтерії
та кашлюку”.

Особистий внесок здобувача. У закінченій дисертаційній роботі особисто
здобувачеві належить: дослідження міжмікробних взаємовідносин патогенних
коринебактерій з представниками мікробіоценозів, вивчення ознак
токсигенності та резистентності до протимікробних препаратів, вивчення
чутливості та специфічності діагностичної системи,
математико-статистична обробка результатів експериментів та оформлення
дисертації.

Розділи роботи пов’язані з вивченням впливу фізичних факторів на збудник
дифтерії виконані здобувачем на базах Харківського Національного
Університету ім. В.Н. Каразіна та Національного Наукового Центру
Харківського інституту фізики і технології.

Розробка схеми послідовної екстракції соматичних антигенів та визначення
їх хімічного складу проведена в лабораторії біохімії Інституту
мікробіології і імунології

ім. І.І. Мечникова АМН України (під керівництвом к.б.н., с.н.с.
Щетиніної В.М.)

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації
доповідались на: науково – практичній конференції “Актуальні питання
мікробіології, епідеміології, та імунології інфекційних хвороб” (м.
Харків, 1993); Х111 Українському з’їзді наукового товариства
мікробіологів, епідеміологів та паразитологів ім. Д.К. Заболотного (Київ
– Вінниця, 1996); Міжнародній науковій конференції “Актуальні питання
боротьби з інфекційними захворюваннями” (м. Харків, 2003).

Публікації. Результати дисертаційної роботи опубліковано в 13 наукових
працях, (3 праці без співавторів), з них 5 статей в провідних наукових
фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, одержано 2 деклараційні
патенти України.

Обсяг і структура дисертації. Робота викладена на 144 сторінках
машинописного тексту, вміщує в собі вступ, огляд літератури, три розділи
власних досліджень, аналіз і узагальнення результатів досліджень,
висновки. Список літератури нараховує 236 вітчизняних та зарубіжних
джерел. Робота ілюстрована 24 таблицями та 10 малюнками.

Основний зміст дисертації

Матеріал і методи досліджень. Обстежено 2211 осіб, серед яких виявлено
247 носіїв коринебактерій дифтерії. Проведено вивчення міжмікробних
взаємовідносин C.diphtheriae в природних та експериментально створених
120 однокомпонентних, 270 двохкомпонентних та 130 трьохкомпонентних
асоціаціях, в яких було використано 395 штамів умовно – патогенних
бактерій (стафілококи, стрептококи, ентерококи, псевдодифтерійна
паличка, анаеробні мікроби) і 15 штамів збудника дифтерії.

Вплив фізичних факторів (лазерні та ультрафіолетові промені, електронний
пучок) на ростові властивості, токсиноутворюючу функцію, чутливість до
протимікробних препаратів визначено за допомогою 17 штамів C.
diphtheriae. Проведено вивчення хімічного складу та імуногенних
властивостей 10 серій соматичних дифтерійних антигенів. Токсичність
виділених клітинних компонентів C. diphtheriae встановлено на 146
морських свинках.

Дослідження специфічності та чутливості еритроцитарного діагностикуму
проведено в 49 експериментах.

Виділення та ідентифікацію мікробів проводили у відповідності наказів
№192 від 03.08.1999 МОЗ України, №535 від 22.04.1985 МОЗ СРСР, та ГОСТу
10.444. 1 – 84 (СТСЄВ 3833 — 82).

Міжмікробні взаємовідносини вивчено за допомогою загальноприйнятих
методів відстроченого антагонізму, теста серійних розведень, визначення
кількості колонієутворюючих бактерій та наукових праць (Ваксман З.А.
1947, Єгоров Н.С., 1965).

Чутливість тест–культур до протимікробних препаратів вивчали згідно
методичним вказівкам “Антибіотикограма: диско – дифузійний метод.
Інтерпретація результатів”, Київ, 1999 р.

Визначення токсигенних властивостей збудника дифтерії проводили з
врахуванням Методичних рекомендацій Ю.Г.Фельдмана та співавт. (1988 р.)
та за допомогою живильного середовища, розробленого в співавторстві
(Патент 20495 А Україна. МКИ С12 №1/20.)

При визначенні антибактеріальних та антитоксичних антитіл проти збудника
дифтерії керувались Інструкцією по застосуванню дифтерійного
еритроцитарного діагностикуму від 29. 12. 1989 МОЗ СРСР.

Отриманий цифровий матеріал оброблено методом варіаційної статистики на
ІВМ РС PENTIUM з використанням пакету програм “Excel – 97”, вірогідність
розходження визначали за t-критерієм Ст’юдента.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕНЬ

В третьому розділі власних досліджень показано, що безсимптомна
циркуляція штамів патогенних коринебактерій серед населення визначає
інтенсивність розвитку епідемічного процесу дифтерії. З одного боку
носії коринебактерій дифтерії є основним резервуаром даної інфекції, а з
другого – на сьогодні медицина не має високоефективних препаратів для
санації інфікованих осіб та профілактики повторних заражень.

Можна припустити, що персистенція збудника на слизових оболонках
мигдаликів в певній мірі залежить від впливу співчленів мікробних
суспільств носоглотки, в яких мешкає дифтерійний патоген. Вони можуть
діяти як інгібітори або як стимулятори на розвиток коринебактерій
дифтерії, регулюючи тим самим чисельність популяції.

Вищевикладене підтверджується даними бактеріологічного дослідження 247
інфікованих осіб. Встановлено, що у транзиторних коринебактеріоносіїв в
більшості випадків (95,6 %) перебування коринебактерій дифтерії на
слизових оболонках мигдаликів спостерігалось сумісно з одним або двома
видами супутньої мікрофлори. Дещо іншою була структура мікробних
суспільств при обстеженні осіб з короткочасним та з середньою тривалістю
бактеріоносійством. У них мікроценози частіше складались із
двохкомпонентних асоціацій, а трьохкомпонентні, як і монокультури,
зустрічались з однаковою частотою.

Показано, що характер формування мікроценозів за участю коринебактерій
дифтерії багато в чому залежить від конкурентних властивостей мікрофлори
носоглотки.

Так, у осіб з транзиторним перебуванням збудника при співставленні їх з
короткочасними та тривалими носіями на слизових мигдаликів в 2,1 рази
частіше виділялась псевдодифтерійна паличка (р >95) та в 4,5 рази ? –
гемолітичний стрептокок та Str. pyogenes (р > 95). Короткочасна та більш
тривала персистенція C. diphtheriae відмічена в 52,5 % випадків (проти
6,7 % при транзиторному перебуванні патогену) в асоціаціяї з
епідермальним стафілококом. Решта вивчених асоціантів (S. aureus, ? –
гемолітичний стрептокок, E.faecium) виділялись у інфікованих осіб обох
груп з однаковою частотою.

При вивченні взаємовідносин C. diphtheriae з представниками мікроценозу
було встановлено, що інгібіція росту тест–культур збудника
спостерігалась тільки в присутності популяцій певних видів бактерій. При
цьому активність конкурентів суттєво відрізнялась у відношенні різних
штамів патогену (табл.1).

Таблиця 1

Частота виявлення антагоністичних властивостей у асоціантів мікроценозу
мигдаликів щодо штамів C. diphtheriae.

Штами Кількість

штамів З них проявили антагоністичну активність щодо коринебактерій
дифтерії біоваріантів

gravis mitis

абс. М ± m абс. М ± m

C.pseudodiрhtheriticum 44 37 84,0±5,5 7 16,0±5,5

E.faecium 21 3 14,3±7,6 5 23,8±9,3

Str.pyogenes 28 14 50,0±9,4 6 21,4±7,8

S.aureus 45 10 22,2±6,2 9 20,0±5,9

S.epidermidis 109 7 6,4±2,3 3 2,8±1,6

Анаеробні коки 18 18 100 18 100

Так, анаеробні коки в усіх випадках були спроможні пригнічувати
життєздатність тест – культур, а псевдодифтерійна паличка в 5,3 рази
частіше проявляла антагоністичну активність у відношенні культур
біоваріанту гравіс, ніж проти коринебактерій біоваріанту мітіс. Зниження
чисельності популяцій збудника дифтерії відмічено також при сумісному
вирощуванні їх з представниками стрептококів. При цьому 50,0 % штамів
стрептококів інгібували ріст тест – культур біоваріанту гравіс та в 2,3
рази з меншою частотою — біоваріанту мітіс. Антагоністичні властивості
стафілококів проявлялись з однаковою частотою до біоваріантів мітіс та
гравіс. Водночас штами S. epidermidis володіли антагоністичними
властивостями по відношенню до штамів C. diphtheriae лише в окремих
випадках.

Характеризуючи взаємовідносини в мікробних суспільствах важливо знати
не тільки як часто проявляють представники нормоценозу конкурентні
властивості, але й брати до уваги питому вагу штамів патогенних
коринебактерій, які проявляють чутливість в мікробних суспільствах до
вивчаємих асоціантів. Такі дослідження проведено по відношенню до
виявлених антагоністів C. pseudodiphtheriticum. Одержані результати
свідчать про те, що серед штамів–антагоністів псевдодифтерійної палички
частіше зустрічались інгібітори з вузьким спектром дії. Із вивчених
антагоністів тільки один штам пригнічував ріст 5 із 12 тест-культур C.
diphtheriae, решта – не більше трьох представників.

Вивчення швидкості розвитку конкурентно направлених процесів показало,
що представники псевдодифтерійної палички, стрептококів, ентерококів
частіше (64,6 %) проявляли антагоністичні властивості по закінченню 24
годин сумісного культивування з тест–культурами, а стафілококи
пригнічували життєздатність C. diphtheriae в 65,9 % дослідів через 48
годин, анаеробні бактерії проявляли активність в усіх експериментах
тільки після 2–х добового сумісного культивування вказаних асоціацій.

Вивчення антибактеріальної активності в двох — та трьохкомпонентних
мікробних суспільствах дозволило встановити, що характер взаємовідносин
співчленів в двохкомпонентних мікробних суспільствах з C. diphtheriae,
залежав від концентрації кожного агенту. При домінуванні антагоністів із
числа псевдодифтерійної палички відмічено інгібуючий ефект впродовж 24
годин інкубації, культивування тих же асоціантів, взятих в рівних
співвідношеннях, також приводило до гибелі патогенних коринебактерій,
але лише через 48 годин. Десятикратне збільшення концентрації збудника
дифтерії після першої доби сумісної інкубації сприяло взаємному
пригніченню росту всіх тест-культур, а по закінченню 48–72 годин на тлі
зниження щільності мікробних клітин антагоністів відмічено повну втрату
мікробними клітинами тест–культур здатності утворювати колонії.

Конкурентні взаємовідносини виявлені при вказаному співвідношенні
(1:10) в двохкомпонентній асоціації з S. aureus. На відміну від
вищезгаданих результатів, домінування C. diphtheriae в асоціації з
антагоністом–стафілококом привело тільки до взаємного зниження густини
співчленів, тоді як життєздатні клітини тест–культури виявлялись навіть
через 72 години від початку постановки експерименту.

При дослідженні характеру взаємовідносин нейтральних симбіонтів, було
встановлено, що асоціанти, питома вага яких була більшою в таких
суспільствах, при тривалому культивуванні займали домінуюче місце в
змішаних популяціях або ж повністю пригнічували ріст підпорядкованих
співчленів.

Показано, що підвищення концентрації в трьохкомпонентних суспільствах
стафілококів (S. aureus та S. epidermidis) сприяло пригніченню росту (на
відміну від двохкомпонентних асоціацій) патогенних коринебактерій через
24–48 годин сумісної культивації. При однаковій щільності або взятих в
менших концентраціях по відношенню до популяції збудника дифтерії
складових, антагоністичний вплив на тест – культуру не проявлявся навіть
по закінченню 48 годин інкубації. Слід відмітити більш виражену
інгібуючу дію культури S. aureus в комбінації з мікробними клітинами
псевдодифтерійної палички. В таких суспільствах патогенні коринебактерії
гинули на третю добу навіть при рівних співвідношеннях асоціантів.
Популяція епідермального стафілококу в одному мікробному суспільстві з
псевдодифтерійною паличкою за умов однакового утримання мікробних клітин
всіх співчленів такою інгібуючою активністю не володіла.

Найбільш виражені конкурентні властивості відмічені в суспільствах, де
домінувала C. pseudodiphtheriticum. Дана культура проявила бактерицидні
властивості не тільки по відношенню до патогену, а також пригнічуючи
впливала на розвиток популяції другого представника мікрофлори –
епідермального стафілококу.

В четвертому розділі власних досліджень відзначено, що абіотичні
фактори зовнішнього середовища часто спричиняють мінливість біологічних
властивостей патогенних бактерій. Серед них по частоті впливу на
організм людини виділено лазерне, ультрафіолетове та електронне
випромінювання.

Вивчення впливу лазерного променю з довжиною хвилі 515 нм (потужність
15–36 МВт) та 630 нм (потужність 15 МВт) на тест–культури патогенних
коринебактерій показало, що вказані чинники обумовлюють, як правило,
різноспрямовані ефекти.

e

N z ’

?

oe

< e ? ’ ? ????l =o=e>[email protected]

&

„Ae`„Ae

cLcNcofoeeeaaOOOO?AeO3/4O¶±±Y

„Ae`„Ae

„Ae`„Ae

&

Однозначні результати були одержані тільки при визначенні кількості
життєздатних бактерій після опромінення тест–культур. Так, встановлено,
що обробка даними чинниками бактеріальних клітин впродовж 15–30 хвилин
не приводить до змін ростових властивостей популяції, тоді як тривале
опромінення (8–24 години) при культивуванні патогенних мікробів сприяло
зниженню в 1,7 разів кількості колонієутворюючих клітин.

Як видно з табл. 2, вивчення токсиноутворюючої функції в 170 ізолятів
показало, що тридцятихвилинне застосування лазерних променів привело в
33,3 % до більш інтенсивного синтезу екзотоксину у опромінених
тест–культур, у 16,7 % випадків спостерігалося, навпаки, пригнічення
даної функції, решта ж ізолятів (50,0 %) виявилась не чутливою до дії
абіотичного фактору.

Таблиця 2

Вплив лазерного опромінення на токсиноутворення тест-культур
Corynebacterium diphtheriae.

Кількість

опромі-

нень Режим

опромі-нення Кіль-кість

колоній Функція токсиноутворення

знижена стимуляція без змін

абс. М±m абс. М±m абс. М±m

один раз 30′ 60 10 16,7±4,8 20 33,3±6,0 30 50,0±6,4

два рази 30′ 50 20 40,0±6,9 10 20±5,6 20 40,0±6,9

три рази 30′ 60 44 73,4±5,7 0 0 16 26,6±5,7

контроль

110 7 6,4±2,3 4 3,6±1,7 99 90,0±2,8

Зміна режимів обробки штамів в сторону трьохразового опромінення з
тривалістю кожного до півгодини та інтервалом між ними 15 хвилин
спричинила в 73,4 % ізолятів уповільнення продукції екзотоксину, тоді як
у 26,6 % досліджених культур час прояви та інтенсивність ліній
преципітації у контрольних та опромінених продуцентів була однакова.

Режими опромінення впливали також на чутливість тест-культур до
антибактеріальних препаратів. Показано, що при короткочасній (15–30′)
дії лазерним променем тест–культури зберігали вихідні властивості
реагування відносно протимікробних препаратів. Збільшення експозиції
опромінення до 24 годин привело до підвищення питомої ваги ізолятів з
високою антибіотикочутливістю. Якщо при короткочасній обробці бактерій
чутливість до препаратів підвищувалась у 43 із 168 тест–культур (25,5 ±
3,4) %, то тривале опромінення сприяло формуванню таких популяцій у
(47,6 ± 5,4)% випадках (р ( 0,05).

Важливо відмітити, що застосування лазерних променів, наряду з
позитивними змінами, обумовлюють появу субпопуляцій тест–культур (7,1 ±
3,5)%, які відзначаються низькими показниками чутливості до
протимікробних препаратів.

Застосування ультрафіолетового опромінення дало більш однозначні
результати. Даний вид променів також не стимулював процеси росту
C.diphtheriae, проте значно активніше порівняно з лазерним фактором
впливав на токсиноутворюючу функцію продуцентів табл.3.

Встановлено, що опромінення тест–культур за допомогою п’яти
короткохвильових імпульсів з енергією кожного 60 Дж сприяло збільшенню
проти контрольних зразків токсинсинтезуючих клонів через 24 години в 7,2
рази, а через 48 годин культивування в 1,6 рази (р ( 0,05).

Таблиця 3

Вивчення впливу ультрафіолетового опромінення на утворення екзотоксину
коринебактеріями дифтерії.

Біова-ріант Режими опроміне-

ння Кіль-кість

вивчених

ізолятів Питома вага токсиноутворюючих

колоній Всього

вивчених

клонів

через 24 години через 48 годин

абс. М±m абс. М±m

gravis

mitis контроль 117

78 1

1 0,8±0,8

1,2±1,2 37

64 31,6±4,3

82,0±4,3 195

gravis

mitis 5 імпульсів 78

35 18

3 23,0±4,8

8,6±4,7 60

32 76,9±4,7

91,4±4,7 113

gravis

mitis 10 імпульсів 113

88 2

13 1,8±1,3

14,8±3,8 89

62 78,8±3,8

70,5±4,9 201

Опромінення штамів патогенної коринебактерії в режимі 10 імпульсів
спричиняло стимулюючий вплив тільки на біовари gravis. Із 113 вивчених
ізолятів здатність утворювати екзотоксин проявили через дві доби росту
78,8 %, в той час як серед неопромінених варіантів таких клонів
продуцентів було менше 31,6 % (р ( 0,05).

Електронний пучок відноситься до найбільш потужних фізичних факторів.
Опромінення ним, навіть в малих поглинаючих дозах, приводило до
пригнічення росту тест–культур та часткового бактерицидного ефекту. Під
впливом даного чинника концентрація колонієутворюючих клітин
зменшувалась з вихідної lg 9,2 КУО/ мл до lg 2,2 КУО/мл, а при
збільшенні потужності опромінення до 2,2 кГр кількість життєздатних
бактерій була в 2,7 рази нижчою порівняно з першою дозою опромінення.
Опромінення тест-культур в режимі 3,0 кГр привело до гибелі 6 із 7
взятих в досліди штамів та знизило в 19 разів кількість життєздатних
клітин.

Показано, що електронний пучок в дозі 1,0 кГр спричиняв у 297 із 350
(84,9 ± 1,9) % мікробних клітин повне пригнічення здатності синтезувати
екзотоксин, а решта клонів характеризувалась зниженням інтенсивності
даної функції (рис. 1).

Опромінення в режимі 2,2 кГр приводить до формування нетоксигених
ізолятів коринебактерій, що очевидно, пов’язано зі здатністю
електронного пучка блокувати ген tox + на досить тривалий час (кількість
щодобових пересівів – 10).

Рис. 1. Зміна функції токсиноутворення в залежності від доз опромінення
електронним пучком.

Із особливостей дії електронного пучка на біооб’єкти слід відзначити
дозозалежні зміни чутливості до протимікробних препаратів коринебактерій
при різних режимах їх опромінення.

Так, застосування даного фізичного фактору в дозі 1,0 кГр приводило до
підвищення резистентності у (44,4 ± 4,0) % клітин, (36,4 ± 3,8) %
ізолятів виявились більш чутливими до антибіотиків, а у решти (19,2 ±
3,1) % дана ознака не змінилася. Підвищення дози електронного пучка до
2,2 кГр сприяло збільшенню питомої ваги ізолятів (63,6±3,8) % чутливих
до протимікробних препаратів.

Здатність фізичних факторів впливати на продукцію токсину відкриває
перспективу використання їх в технологіях одержання соматичних
антигенів. Така можливість була вивчена в послідуючих дослідах.

В п’ятому розділі представлені результати застосування розробленої в
співавторстві схеми одержання антигенів за допомогою застосованих
методів екстракції клітинних структур. Використаний принцип екстракції
дає можливість виділити різноструктурні соматичні антигени: при
застосуванні етанолу хімічний склад остатку характеризувався високим
вмістом вуглеводів (98,9%), при подальших екстракціях фізіологічним
розчином та етилендіамінтетраацетатом-Na2 (ЕДТА) були одержані клітинні
компоненти, які мали повну відповідність по лініям преципітації зі
стандартною дифтерійною сироваткою, мали в складі (80,1 – 85,4) %
білків, але відрізнялися по концентрації вуглеводів (відповідно 10 —
50,0 % і 5 – 23,0 % від маси білка), а обробка мікробної маси
додецилсульфатом натрію дозволяла одержувати суміш, що містить на 1
одиницю білка 16 – 37,0 % вуглеводів та 12 – 22,0 % ліпідів (табл. 4).

Таблиця 4

Хімічний склад клітинних антигенів, одержаних різними способами.

Хімічний склад одержаних антигенів

Екстракт етанолом Екстракт фізіологіч-

ним розчином Екстракт ЕДТА Екстракт ДСН

вугле-

води,

мг/мл ліпіди,

мг/мл білки,мг/мл вугле-

води,

мг/мл ліпіди

мг/мл білки,мг/мл вугле-

води,

мг/мл ліпіди,

мг/мл білки,мг/мл вугле-

води,

мг/мл ліпіди,

мг/мл

4,8 0,036 5,1 2,9 0,03 8,2 1,72 0,09 11,1 1,8 1,3

7,3 0,09 16,0 1,2 0,13 8,3 0,44 0.105 10,0 2,4 1,8

3,04 0,035 7,65 3,95 0,060 8,0 1,88 0,05 7,3 1,5 1,45

4,2 0,043 9,2 1,12 0,02 7,7 1,22 0,01 7,1 1,92 1,123

Показано, що до складу одержаних клітинних антигенів C. diphtheriae
входять також субстанції екзотоксину. Це підтверджено в реакції
преципітації з антитоксичною сироваткою. Найбільш високі концентрації
його виявлені в екстрактах ЕДТА: мінімальна преципітаційна доза з
антитоксичною сироваткою дорівнювала 28 мкг, тоді як у витяжках
фізіологічним розчином 51 мкг антигену, а додецилсульфатом натрія – 60,0
мкг. Запропонована технологія одержання антигенів має практичне
значення, оскільки дозволяє виділяти комплекси, що утримують наряду з
поверхневими структурами стінок бактерій такий фактор патогенності як
екзотоксин.

Виділення таких комплексів являється обов’язковою передумовою
визначення підходів для розробки нового класу вакцинних препаратів, що
можуть забезпечити розвиток як антитоксичного, так і протимікробного
імунітету.

Проте, що застосована технологія дозволяє виділяти наряду із
структурними компонентами бактеріальної клітини і сам продукт її
життєдіяльності – екзотоксин, свідчать дані порівняльної характеристики
антигенів, які одержували до і після опромінення мікробів в дозі (1,0
кГр) пригнічення токсиносинтезуючої функції продуцента. Екстракція за
допомогою ЕДТА антигенів із опроміненої культури привела до зниження
концентрації білків в 1,2 рази, що обумовило підвищення мінімальної
преципітуючої дози в 2,2 рази (р ( 0,05). Виявлена тенденція зменшення
питомої ваги екзотоксину в антигенах при застосуванні електронного пучка
підтверджена експериментальними дослідженнями на морських свинках.
Показано, що клітинні компоненти коринебактерій введенні в дозі 0,05 мг
визивали гибель 50,0% лабораторних тварин, тоді як соматичні антигени,
одержані без впливу абіотичного фактору обумовлювали у вказаній
концентрації летальні результати в 100,0% випадків.

Розробка технологій одержання соматичних антигенів є однією з передумов
на шлях до створення клітинних вакцин – кандидатів проти збудника
дифтерії. Для вивчення їх імуногенних властивостей необхідні також
відповідні діагностичні препарати. В цьому напрямку проведені
дослідження гемосенсибілізуючих властивостей одержаних структурних
компонентів бактерій.

Встановлено, що найбільш виражена активність продукту, яка визначалась
по мінімальній преципітуючій дозі, спостерігалася при проведенні
екстракції (0,3 – 0,8) % розчинами ЕДТА, що послужило основою для
розробки способу одержання гемосенситину (Патент 31284 А Україна. МКИ
А61К 39/05, 2000 р).

Вивчення чутливості та специфічності еритроцитарного діагностикума з
ЕДТА – антигеном показало, що даний препарат не реагує зі специфічними
сироватками проти збудника ботулізму, протейної палички, E. coli,
проявляє більш високу чутливість в (2 – 4 рази) в порівнянні з
прототипом, приготовленим по відомій методиці (Stanizki), як з
антитоксичною, так і дифтерійною аглютинуючою неадсорбованою
сироватками.

Застосування його для дослідження сироваток крові донорів дозволило
визначити антитіла в (92,0 ± 4,8) % випадків проти (37,0 ± 8,1) % і в
більш високих (в 2 рази) титрах порівняно з діагностикумом прототипом.

ВИСНОВКИ

1. У дисертації наведене нове розв’язання наукових питань, що
виявляється у визначенні представників мікробіоценозів, які впливають на
тривалість персистенції збудника дифтерії, у встановлені режимів
опромінення фізичними факторами, при яких спостерігається стимулювання
чи пригнічення токсиноутворюючої функції та зміна чутливості до
протимікробних препаратів у патогенних коринебактерій, а також в
розробці схеми одержання клітинних антигенів C. diphtheriae, що
дозволило запропонувати нові підходи до створення засобів підвищення
резистентності до заселення збудником слизових оболонок верхніх
дихальних шляхів, та розробити технологію приготування еритроцитарного
діагностикуму для серологічного контролю за циркуляцією штамів C.
diphtheriae серед населення.

2. При обстеженні 247 інфікованих осіб показано, що у транзиторних
бактеріоносіїв із місць заселення патогену в 2,1 рази частіше виділялась
псевдодифтерійна паличка, та в 4,5 рази – гемолітичні стрептококи.
Короткочасне та тривале (до одного місяця) перебування C. diphtheriae на
слизових оболонках відмічено в (52,5 ± 3,4) % випадків проти (6,7 ± 2,1)
% при транзиторному заселенні в разі сумісного находження їх в
асоціаціях з епідермальним стафілококом.

3. Встановлено, що короткочасне лазерне опромінення впродовж 15 – 30
хвилин (довжина хвилі 515 нм при потужності 15 – 36 МВт та 630 нм і 15
МВт) не впливало на кінетику росту та чисельність життєздатних бактерій
збудника, тоді як тривала дія фізичного чинника (8 – 24 години) сприяла
зниженню в 1,7 разів кількості колонієутворюючих клітин.

Вивчення токсиноутворюючої функції 170 ізолятів показало, що
тридцятихвилинне застосування променів привело в (33,3 ± 6,0) % випадків
до більш інтенсивного синтезу екзотоксину, а трьохразове опромінення по
30 хвилин з інтервалом 15 хвилин спричиняло у (73,4 ± 5,7) % тест –
культур уповільнення продукції даного фактора патогенності.

Визначено, що короткочасна дія лазерного чинника не впливала на вихідні
властивості реагування тест–культур відносно протимікробних препаратів,
а при експозиції опромінення до 24 годин питома вага чутливих варіантів
зростала в 1,8 разів (р ( 0,05).

4. Показано, що ультрафіолетове опромінення (в режимі п’яти
короткохвильових імпульсів з енергією розряду 60 Дж, середньою
потужністю 60 W) не змінювало кінетику росту C. diphtheriae, проте
стимулювало токсиноутворюючу функцію в (70,5 ± 4,9) % ізолятів проти
(31,6 ± 4,3) % вихідних субпопуляцій.

5. Показано, що електронний пучок при поглинаючих дозах 1,0 – 2,2 кГр
обумовлює пригнічення росту та зниження токсиносинтезуючої функції
тест–культур, також сприяє підвищенню в 1,7 рази питомої ваги чутливих
до протимікробних препаратів ізолятів, а опромінення в режимі 3,0 кГр
приводить до гибелі майже всієї популяції (зменшення життєздатних клітин
спостерігалося в 19 разів).

6. Показано, що послідовна екстракція фізіологічним розчином та ЕДТА-Na2
мікробної маси C.diphtheriae дозволяє одержувати білкові клітинні
компоненти, в склад яких входять також субстанції екзотоксину.

Включення в технологію вилучення клітинних структур опромінених
електронним пучком токсинсинтезуючих коринебактерій дає можливість
зменшити вихід білка за рахунок зниження питомої ваги екзотоксину.

7. Встановлено, що еритроцитарний діагностикум з антигеном одержаним за
допомогою ЕДТА-Na2 проявив більш високу чутливість (2 — 4рази) порівняно
з діагностикумом – прототипом, як з преципітуючою антитоксичною, так і з
дифтерійною аглютинуючою сироватками і дозволив визначати антитіла в
більш високих (2 рази) титрах.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Соматичний антиген корінебактерій дифтерії та його біологічна
активність / Щетиніна В.М., Верезуб Л.Г., Бабич Є.М., Колоколова О.Б.,
Мироненко Л.Г., Ждамарова Л.А., Гринь В.В. // Експериментальна і
клінічна медицина. – 1999. — №2. – С.92 — 95. (Ждамарова Л.А. – вивчала
токсичність соматичних антигенів та приймала участь в аналізі).

2. Ждамарова Л.А. Вплив електромагнітного випромінювання на біологічні
властивості збудника дифтерії // Дитячі інфекції, Укр. Міжвідомча
збірка. – Київ, 2001. – В. 28. – С.32-37. (Ждамарова Л.А. – провела
мікробіологічні дослідження та аналіз).

3. Вивчення токсинвмісних фільтратів із культуральних рідин клінічних
штамів Corynebacterium diphtheriae / Щетиніна В.М., Шинкаренко А.О.,
Москаленко В.М.,

Верезуб Л.Г., Маніна Ж.М., Мироненко Л.Г., Ждамарова Л.А. //
Мікробіологічний журнал. – 1997. – т. 59, №1. – С. 65 – 70. (Ждамарова
Л.А.- одержувала нативний токсин).

4. Антитоксический противодифтерийный иммунитет в коллективе с высокой
циркуляцией коринебактерий дифтерии / Мироненко Л.Г., Чумаченко Т.А.,
Верезуб Л.Г., Ждамарова Л.А., Малый В.П., Волянский Ю.Л. // Вестник
проблем современной медицины. – Харьков, 1994. — №2. – С.24 – 26.
(Ждамарова Л.А. – здійснювала серологічні дослідження протидифтерійного
та протиправцевого імунітету та участь в аналізі).

5. Изучение токсинообразования циркулирующих штаммов коринебактерий
дифтерии, выделенных в период обострения эпидситуации / Манина Ж.Н.,
Верезуб Л.Г., Федорова Л.Г., Лиман Н.Г, Мироненко Л.Г., Ждамарова Л.А.,
Яковлева З.И. // Актуальные вопросы микроб., эпидемиол. и иммунолог.
инфек. болезней. Тез. докл. научно – практ. конф. – Харьков, 1993. –
С.236. (Ждамарова Л.А. – одержувала нативний дифтерійний токсин та
визначала його специфічну активність).

6. Ждамарова Л.А. Нетрадиційні методи введення вакцинних препаратів //
Дитячі інфекції, Укр. Міжвідомча збірка. – Київ, 1999. – В.26. – С.
175-182.

7. Ждамарова Л.А Зміна біологічних властивостей Corynebacterium
diphtheriae під впливом електронного пучка // Тези допов. Міжнарод.
науково-практ. конф. “Актуальні питання боротьби з інфекційними
захворюваннями”. – Харків, — 2003. – С. 128 –129. (Ждамарова Л.А. –
проводила мікробіологічні дослідження).

8. Вплив електромагнітного поля НВЧ діапазону та електронного пучка на
патогенні коринебактерії / Бабич Є.М., Ждамарова Л.А., Катрич В.А.,
Кийко В.І., Калініченко С.В.,Скляр Н.І., Кисельов В.А. // Анали
Мечніковського інституту. – 2003. — №№ 4 –5. С. 69 – 72. (Ждамарова Л.А.
– здійснювала мікробіологічні дослідження та участь в аналізі).

9. Патент 31284 А Україна. МКИ А61К 39/05. Спосіб одержання антигену для
діагностики дифтерії / Шинкаренко А.О., Щетиніна В.М., Верезуб Л.Г.,
Бабич Є.М., Ждамарова Л.А. (Україна). — №98074153. Заявл. 29.07.1998;
Опубл. 15.12.2000. (Ждамарова Л.А. – серологічні дослідження та приймала
участь в аналізі).

10. Патент 20495 А Україна. МКИ С12 №1/20. Спосіб одержання живильного
середовища для визначення токсигенності дифтерійних бактерій /
Волянський Ю.Л., Шинкаренко А.О., Щетиніна В.М., Ніколаєнко В.М.,
Верезуб Л.Г., Маніна Ж.М., Мироненко Л.Г., Ждамарова Л.А. (Україна). —
№96041475. Заявл. 12.04.96; Опубл. 15.07.97. (Ждамарова Л.А. – проводила
мікробіологічні дослідження та приймала участь в аналізі).

11. Антагонистическая активность представителей анаеробного ценоза в
монокультурах и ассоциациях в отношении возбудителей коклюша и дифтерии
/ Верезуб Л.Г., Мироненко Л.Г., Манина Ж.Н., Будко С.Е., Ждамарова Л.А.
// Тез. докл. научно – практ. конф ”Актуальные вопросы микроб.,
эпидемиол. и иммунолог. инфек. болезней”. – Харьков, 1993. – С. 74.
(Ждамарова Л.А. – мікробіологічне дослідження).

12. Тривалість протидифтерійного імунітету у декретованих груп населення
в залежності від кількості щеплень / Верезуб Л.Г., Маніна Ж.М.,
Колоколова О.Б., Ждамарова Л.А., Калашник Г.В., Федоріва Л.Г. // Мат.
ХІІІ з’їзду Укр. наук. товариства мікроб., епідеміол. та паразитол. ім.
Д.К. Заболотного “Актуальні проблеми мікроб., епідеміол., паразитол. та
профіл. інфек. хвороб”. — Київ – Вінниця, 1996. — С.92-93. (Ждамарова
Л.А. – здійснювала серологічні дослідження та приймала участь в
аналізі).

13. Стан колективного протидифтерійного та протиправцевого імунітету в
сучасних умовах / Мироненко Л.Г., Верезуб Л.Г., Ждамарова Л.А.,
Чумаченко Т.О. // Зб. наук. пр. “Мікробіологія, епідеміологія та клініка
інф. хвороб”. – Харків, 1994. – С. 5-9.( Ждамарова Л.А. – здійснювала
серологічні дослідження та приймала участь в аналізі).

АНОТАЦІЯ

Ждамарова Л.А. Вплив біотичних та абіотичних факторів на персистенцію
та біологічні властивості збудника дифтерії. – Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата медичних наук за
спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. Інститут мікробіології та
імунології ім. І.І.Мечникова АМН України, Харків, 2004.

Дисертацію присвячено визначенню біотичних та абіотичних факторів, що
викликають мінливість збудника дифтерії.

Вивчені взаємовідносини патогенних коринебактерій з представниками
мікрофлори мигдаликів інфікованих осіб.

Визначені режими опромінення лазерним, ультрафіолетовим променями та
електронним пучком, що впливають на токсиноутворюючу функцію і
чутливість до протимікробних препаратів збудника дифтерії.

Запропонована схема послідовного застосування екстрагуючих речовин для
одержання різних по хімічній структурі та антигенним властивостям
клітинних компонентів патогенних коринебактерій.

Ключові слова: коринебактерія дифтерії, мікрофлора, антагоністи,
симбіонти, лазерні і ультрафіолетові промені, електронний пучок,
токсиноутворююча функція, антибіотикочутливість, соматичні антигени.

АННОТАЦИЯ

Ждамарова Л.А. Влияние биотических и абиотических факторов на
персистенцию и биологические свойства возбудителя дифтерии. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по
специальности 03.00.07 – микробиология. – Институт микробиологии и
иммунологии им. И.И. Мечникова АМН Украины, Харьков, 2004.

Диссертация посвящена определению биотических и абиотических факторов,
которые вызывают мутации возбудителя дифтерии.

Изучены взаимоотношения патогенных коринебактерий с представителями
микрофлоры миндалин инфицированных.

Определены режимы облучения лазерным, ультрафиолетовым лучами и
електронным пучком, которые воздействуют на токсинсинтезирующую функцию
и чувствительность к противомикробным препаратам возбудителя дифтерии.

Предложена схема последовательного применения екстрагирующих веществ,
для получения разных по химической структуре и антигенным свойствам
клеточных компонентов патогенных коринебактерий.

Ключевые слова: коринебактерия дифтерии, микрофлора, антагонисты,
симбионты, лазерные и ультрафиолетовые лучи, електронный пучок,
токсинобразующая функция, антибиотикочувствительность, соматические
антигены.

THE SUMMARY

Zhdamarova L.A. The Influence of biological and physical factors on
persistens and biological properties of the diphtheriae activator. –
Manuscript.

Thesis for scientific degree of candidate of medical sciences by
specialty 03.00.07 – microbiology. Mechnikov Institute of Microbiology
and Immunology of Ukrainian MCA, Kharkiv, 2004.

The dissertation is devoted to biological and physical factors,
definition which cause changes of the diphtheriae activator.

The Corinebacteria diphtheria mutual relation with the representatives
of microflora of infectioned tonsil is investigated.

The modes of irradiation by laser, ultra – violet beams and electron
beam which influence on toxinforming function and sensitivity to
antimicrobial to preparations of the diphtheria activator are
determined.

The circus of dissolving substances consecutive application for
reception of Corinebacteria diphtheria different on chemical structure
and antigens gudlittes is offered.

Key words: Corinebacteria diphtheria, microflora, antagonists,
symbionts, laser and ultra-violet beams, electron beam, toxinoforming
function, antibioticsensitiviti, somatic antigens.

Похожие записи