ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМ. В.Н. КАРАЗІНА

ГОРОБЧЕНКО ОЛЬГА ОЛЕКСАНДРІВНА

УДК 577.346:543.556

Вплив ?-опромінення і температури на конформацію білків крові

03.00.02 – біофізика

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фізико-математичних наук

Харків – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському національному університеті імені
В.Н.Каразіна Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник кандидат біологічних наук,

доцент Гаташ Сергій Васильович,

Харківський національний університет,

доцент кафедри біологічної і

медичної фізики.

Офіційні опоненти:

доктор фізико-математичних наук, старший науковий співробітник

Косевич Марина Вадимівна, Фізико-технічний інститут низьких температур
ім. Б.І. Вєркіна НАН України, провідний науковий співробітник відділу
молекулярної біофізики (м. Харків);

кандидат фізико-математичний наук, старший науковий співробітник Кашпур
Всеволод Андрійович, Інститут радіофізики та електроніки НАН України,
старший науковий співробітник відділу біофізики (м. Харків).

Провідна установа:

Київський національний університет ім. Тараса Шевченка,

кафедра біофізики.

Захист відбудеться 22.04. 2005 р. о 13-30 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському національному
університеті ім. В.Н. Каразіна за адресою

61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. ______ .

З дисертацією можна ознайомитися у Центральній науковій бібліотеці
Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна за адресою:
61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий 21.03.2005 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Гаташ С.В. ЗАГАЛЬНА
ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У сучасній біофізиці проведення фундаментальних
досліджень впливу таких фізичних факторів як іонізуюче випромінювання та
температура на конформацію білків крові становить надзвичайно важливу і
актуальну задачу у зв’язку з використанням ?-опромінення, а також
високих і низьких температур у різних галузях медицини і біології.
Дослідження на молекулярному рівні дадуть можливість розширити розуміння
процесів, що відбуваються при дії цих фізичних факторів на біооб’єкти,
та дозволять розробити надійні науково обґрунтовані технології
стерилізації та кріоконсервування біотерапевтичних препаратів, отриманих
з донорської та кордової крові, з максимальним збереженням їх нативних
властивостей. Розробка таких технологій у теперішній час є складною
задачею, яка має високий пріоритет і знаходиться під пильною увагою
дослідників, оскільки дозволить створювати безпечні стратегічні запаси
біопрепаратів у кріобанках і ефективно їх використовувати в клінічних
цілях.

Здатність до конформаційних переходів і можливість змінювати просторову
структуру є важливою властивістю макромолекул, що визначає їх
функціонування. Структурні зміни білків супроводжуються зміною їх
гідратації. Структурний стан макромолекул та ступінь їх гідратації в
значній мірі обумовлюють функціональну активність білків і можуть
змінюватися залежно від впливу опромінення, температури і концентрації
білка. У зв’язку з цим важливим є вивчення конформаційного стану
макромолекул та їх гідратації під впливом радіації в широкому інтервалі
концентрацій та температур.

Складність визначення ступеня гідратації макромолекул білків потребує
подальшої розробки адекватних моделей розрахунку кількості зв’язаної
білком води. При цьому дуже важливо враховувати реальну форму
макромолекул. У роботі зроблено спробу розрахунку коефіцієнтів
деполяризації об’єктів складної форми і використання отриманих даних для
розрахунку ступеня гідратації сироваткового альбуміну.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота
виконувалась згідно з держбюджетними темами МОН України “Дослідження
впливу гідратації і біологічно активних речовин на макромолекули й
клітини в умовах дії іонізуючого опромінення” (№ 0100U003334) і “Фізичні
механізми впливу іонізуючого випромінювання, температури і гідратації на
макромолекули і біомембрани” (№ 0103U004236) на кафедрі біологічної і
медичної фізики Харківського національного університету ім. В.Н.
Каразіна.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було визначення впливу
?-опромінення і температури на конформацію, гідратацію та діелектричні
властивості сироваткового альбуміну (СА) та фібриногену, а також на
властивості сироватки кордової крові (СКК).

Для досягнення мети було поставлено і вирішено наступні задачі:

Розробити систему терморегулювання вимірювальної комірки
НВЧ-діелектрометрі та методику вимірювання діелектричних параметрів
водних розчинів в інтервалі температур 4-70 °C.

Отримати значення комплексної діелектричної проникності водних розчинів
сироваткового альбуміну і фібриногену людини в залежності від дози
?-опромінення в діапазоні від 5 до 200 Гр і температури в інтервалі
4-70 °С при різних концентраціях білків у розчині. Визначити характер
впливу іонізуючого випромінювання і температури на конформацію,
гідратацію білків і час діелектричної релаксації молекул води в
розчинах.

Одержати ЕПР-спектри спінових міток, ковалентно приєднаних до молекул
сироваткового альбуміну. Встановити залежність рухливості зондів від
дози ?-опромінення та виявити характер впливу ?–опромінення на структуру
сироваткового альбуміну.

Вивчити вплив ?–опромінення та режимів заморожування на діелектричні
властивості сироватки кордової крові людини.

Розробити алгоритм розрахунку коефіцієнтів деполяризації частинок
складної форми та розрахувати ефективну діелектричну проникність водного
розчину сироваткового альбуміну.

Об’єкт дослідження: конформаційні й структурні зміни білків.

Предмет дослідження: конформаційні й структурні зміни білків крові під
впливом ?-опромінення, високих та низьких температур; діелектричні й
гідратаційні властивості водних розчинів білків крові та СКК.

Методи дослідження: НВЧ-діелектрометрія, ЕПР-спектроскопія, методи
дискретного наближення й теоретичного розрахунку діелектричної
проникності дисперсних систем.

Наукова новизна одержаних результатів.

Вперше виявлено, що при температурах 30-34 °С і 44-47 °С для
сироваткового альбуміну та при температурах 25-33, 45-53 і 63 °C для
фібриногену ступінь гідратації білків зростає, що може бути результатом
конформаційних змін макромолекул. Показано, що ?–опромінення
сироваткового альбуміну призводить до розрихлення поверхні макромолекули
білка і зростанню кількості зв’язаної білком води, а також до наступної
агрегації макромолекул.

Вперше досліджено діелектричні властивості СКК при різних режимах
заморожування й при ?–опроміненні. Виявлено зменшення ?’ СКК після
повільного заморожування у порівнянні з контролем і швидким
заморожування, а також після ??опромінення дозами 50 і 100 Гр, що можна
пояснити зростанням ступеня гідратації молекул СКК.

Вперше розроблено алгоритм розрахунку коефіцієнтів деполяризації
частинок складної форми. Отримано теоретичні значення коефіцієнтів
деполяризації для моделі макромолекули сироваткового альбуміну,
наближеної до реальної форми. Показано, що розраховані за такою моделлю
значення ефективної діелектричної проникності більш близькі до
експериментальних результатів, ніж у випадку апроксимації макромолекул
еліпсоїдом обертання.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані у дисертації
результати важливі для розуміння механізмів впливу іонізуючого
опромінення та температури на структуру та гідратацію білків крові.
Результати роботи можуть знайти застосування при розробці технологій
стерилізації біомедичних препаратів, отриманих з донорської та кордової
крові, оскільки ?-опромінення та високотемпературна обробка
використовуються для інактивації таких патогенів, як ВІЛ, В-19
парвовірус, вірус гепатиту та інші. Отримані дані можуть також
використовуватись у медицині при лікуванні хвороб, обумовлених
радіаційним ураженням, а також у радіаційній терапії.

Отримані результати зміни діелектричних властивостей СКК при різних
режимах заморожування можуть практично застосовуватися в розробці
методів створення банків препаратів крові тривалого зберігання з метою
подальшого клінічного застосування. Отримані в роботі дані були
використані при розробці методик кріоконсервування СКК у Інституті
проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, м. Харків.

Розроблений у роботі метод розрахунку коефіцієнтів деполяризації
об’єктів складної форми може використовуватися для визначення ступеня
гідратації макромолекул в розчині.

Особистий внесок здобувача. В опублікованих разом зі співавторами
наукових працях особистий внесок здобувача полягає в наступному:

– в працях [1, 4, 5, 11, 12] – проведення пошуку й аналізу літературних
джерел, розробка методики діелектричних вимірів у широкому інтервалі
температур, отримання й статистична обробка всіх експериментальних
даних, участь в обговоренні результатів.

– в працях [2, 7, 10, 14, 18] – участь у формулюванні й обґрунтуванні
актуальності дослідження, плануванні експерименту, участь в
експерименті.

– в працях [3, 19] – розробка теорії й алгоритму розрахунку коефіцієнтів
деполяризації геометричних об’єктів довільної форми, проведення
розрахунків коефіцієнтів деполяризації, розрахунок ефективної
діелектричної проникності.

– в працях [6, 8, 9, 13, 15-17] – участь у постановці задач, аналізі й
обговоренні результатів, формулюванні висновків досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертації
доповідалися й обговорювалися на: 6th International Conference
“Dielectric and Related Phenomena” (DRP 2000), Spala, Poland, 2000; IV
съезде Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков,
Минск, Беларусь, 2000; First International Young Scientists Conference
on Applied Physics, Kyiv, Ukraine, 2001; 6-ой Пущинской
школе-конференции молодых ученых “Биология – наука XXI века”, Пущино,
Россия, 2002; 2nd International Conference “Broadband Dielectric
Spectroscopy and its Applications” (IDS & DRP 2002), Leipzig, Germany,
2002; Interdisciplinary School on Protein Aggregation, Les Houches,
France, 2002; Конференции “От современной фундаментальной биологии к
новым наукоемким технологиям”, Пущино, Россия, 2002; III-му З’їзді
українського біофізичного товариства, Львів, Україна, 2002 р; 7-ой
Пущинской школе-конференции молодых ученых “Биология – наука XXI века”,
Пущино, Россия, 2003; IV European Biophysics Congress, Alicante, Spain,
2003; I-ій Українській науковій конференції “Проблеми біологічної і
медичної фізики”, Харків, Україна, 2004; Конференции молодых ученых
“Физика низких температур-2004”, Харьков, Украина, 2004; Міжнародній
науковій конференції “Каразінські природознавчі студії”, Харків,
Україна, 2004; IV Международном симпозиуме “Актуальные проблемы
биофизической медицины”, Киев, Украина, 2004; Семінарі Харківського
відділення Українського біофізичного товариства, Харків, Україна, 15
жовтня 2004.

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 19 наукових праць, у
тому числі 5 статей у фахових наукових журналах і 14 тез доповідей на
національних і міжнародних наукових конференціях, з’їздах.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, 6
розділів, висновків, списку використаних джерел. Повний обсяг дисертації
складає 150 сторінок, містить 3 таблиці й 45 рисунків, з них 25 займають
окремі аркуші. Список використаних літературних джерел, 176 найменувань,
займає 21 сторінку.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність теми дисертації, викладено мету й
задачі дослідження, визначено наукову новизну отриманих результатів, їх
наукове та практичне значення, зазначено особистий внесок здобувача.

У розділі 1 наведено стислий огляд експериментальних і теоретичних
робіт, присвячених дослідженню будови, властивостей і функцій таких
білків плазми крові як фібриноген і сироватковий альбумін. Розглядаються
фактори, що визначають конформаційну стабільність макромолекул і вплив
на неї температури й ?-опромінення. Теоретичний розгляд діелектричних
властивостей дисперсних систем представлено в останньому підрозділі, у
якому описано існуючі методи розрахунку ефективної діелектричної
проникності дисперсних систем і ступеня гідратації макромолекул. На
основі літературного огляду сформульовані основні задачі дисертації.

У розділі 2 розглянуто основи методу НВЧ-діелектрометрії. Описано
установку для виміру дійсної (?’) і уявної (?») частин комплексної
діелектричної проникності (КДП) на частоті 9,3 ГГц і розроблену автором
методику виміру КДП в інтервалі температур 4-70 °С. Похибка відносних
вимірів ?’ складає 0,1 %, ?» близько 0,5 %.

Величини статичної діелектричної проникності (?s) і часу діелектричної
релаксації молекул води (?) в досліджуваних системах обчислено з
використанням рівнянь Дебая.

Виходячи з формули для діелектричної проникності двокомпонентної
дисперсної системи та експериментально отриманих значень діелектричної
проникності розчинів білків, обчислювали їх ступінь гідратації:

де ??0 – статична діелектрична проникність води, ??s — статична
діелектрична проникність розчину досліджуваної речовини, С –
концентрація розчиненої речовини у грамах на 100 мл розчину, ???p?
і????w??– високочастотні діелектричні проникності розчиненої речовини й
води, v???парціальний питомий об’єм розчиненої речовини, ????кількість
зв’язаної води у грамах, що приходиться на 1 г розчиненої речовини,
????фактор форми молекул розчиненої речовини.

Розглянуто метод спінових міток – стабільних нітроксильних радикалів, що
ковалентно приєднуються до макромолекул. Обертальна і трансляційна
рухливість таких радикалів, що визначається за допомогою методу
ЕПР-спектроскопії, чутлива до найменших змін біологічних структур і
дозволяє отримати інформацію про конформацію, мікрорельєф і топологію
біооб’єктів.

Спектри ЕПР реєстрували на радіоспектрометрі Jeol-3x, робоча частота
9700 МГц. Виміри проводилися при 20±1 °С з використанням циліндричного
Н01n-резонатора. Як емпіричний параметр для оцінки змін форми ЕПР
спектрів обрана величина відносної інтенсивності центрального компонента
спектра до інтенсивностей крайніх компонентів похідної лінії поглинання.

В експерименті досліджувалися водні розчини фібриногену (препарат
Харківської обласної станції переливання крові, що містить 87 % білка,
який осаджується тромбіном), сироватковий альбумін людини (САЛ)
(“Reanal”, Угорщина) і сироватковий альбумін бика (САБ) (“Діа М”, США),
сироватка кордової крові (СКК) (Спеціалізований клінічний пологовий
будинок № 5, м. Харків). В якості спінових міток використовували радикал
2,2,6,6 — тетраметил-4-дихлоразин амінопіпередил-1-оксил
(цианілхлоридний радикал), який було синтезовано в Інституті хімічної
фізики РАН. Зразки опромінювали при кімнатній температурі дозами
5-200 Гр джерелом 60Co на установці типу «Исследователь». СКК
заморожували в полімерних ампулах об’ємом 1,5 мл за двома режимами:
повільне заморожування до –20 °C зі швидкістю 1-2 °C/хв, і швидке
заморожування – зі швидкістю 300-400 °C/хв до температури рідкого азоту
(-196 °C). Відтавання проводили на водяній бані при 40-42 °С.
Контрольними зразками в усіх експериментах були нативні зразки розчинів
білків і СКК.

У розділі 3 викладаються результати власних досліджень впливу
?-опромінення на сироватковий альбумін у водяному розчині за допомогою
методу спінових міток. Результати порівнюються з даними методу
НВЧ-діелектрометрії.

Спектри спін міченого САБ (САБ-R) у 10 мМ Трис·HCl буфері при рН 7,0 і
рН 8,3 при 20 °С являють собою накладення спектрів двох сигналів:
сигналу А, що відповідає сильно загальмованому радикалу з часом
обертальної кореляції ?с=2?10-8 сек і сигналу Б з ?с=5?10-9 сек, що
відповідає слабко загальмованому радикалу. На рис. 1 представлені
залежності відносних інтенсивностей сигналів низькопольових компонентів
А і Б Н+1 до центрального компонента Н0 (Н+1/Н0) від дози ?-опромінення
при рН 7,0 і 8,3. З графіків видно, що з дозою опромінення інтенсивності
компоненти А в межах похибки не змінюються, з чого можна зробити
висновок, що сильно загальмований радикал знаходиться в області, мало
доступній для розчинника та вільних радикалів, ймовірно у гідрофобній
кишені. Параметр, що характеризує компоненту Б, має іншу залежність від
дози опромінення, а саме: спектр САБ-R помітно змінюється в області доз
100 Гр у такому напрямку, що відношення інтенсивностей залежності
проходить через максимум. При збільшенні інтенсивності компоненти Б
спостерігається також звуження сигналу й тенденція до його зсуву до
центрального компоненту.

Збільшення інтенсивності компоненти Б при дозі опромінення 100 Гр
свідчить про збільшення обертальної рухливості й ефективному
розгальмовуванні радикалів. Виходячи з цього, можна зробити висновок, що
при опроміненні дозою 100 Гр відбувається розпушення макромолекули САБ в
області приєднання слабко загальмованого радикала, що знаходиться,
очевидно, на поверхні макромолекули. Розпушення поверхні макромолекули
може призводити до збільшення кількості зв’язаної білком води, що й
спостерігається методом НВЧ-діелектрометрії. Зі збільшенням дози
опромінення до 100 Гр спостерігається тенденція до зростання ?різниці
між діелектричною проникність води й розчину (???), що пропорційна
кількості зв’язаної білком води.

При збільшенні дози опромінення до 150 і 200 Гр величина ??? (а, отже, і
гідратація САБ) зменшується, при цьому відбувається також зниження
пікової інтенсивності сигналу Б (рис. 1). Імовірніше всього, ці ефекти
обумовлені процесами агрегації макромолекул САБ, що часто мають місце
при опроміненні водних розчинів білків.

Дослідження діелектричних параметрів розчинів САБ у дистильованій воді в
інтервалі концентрацій 5-100 мг/мл показало, що із зростанням
концентрації білка діелектрична проникність ?? і діелектричні втрати ???
зменшуються лінійно. При цьому ступінь гідратації макромолекул САБ не
змінюється і складає 0,2 г/г. При опроміненні розчинів САБ дозами 15 і
30 Гр концентраційна залежність діелектричної проникності ?? стає
нелінійною і має складний характер. В інтервалі концентрацій приблизно
до 20 мг/мл величина ?? опромінених зразків менше контролю, що свідчить
про збільшення кількості зв’язаної білком води. При подальшому
збільшенні концентрації величина ?? починає зростати й в інтервалі
20-100 мг/мл перевищує контроль приблизно на одну одиницю ?? при дозі
15 Гр і 0,5 одиниці ?? при 30 Гр.

Дослідження впливу опромінення дозами 50 і 100 Гр на термоіндуковані
зміни конформації САЛ концентрації 5 мг/мл, показало, що дія радіації
особливо сильно виявляється в області високих температур – від 35 до
60 °C і пов’язана зі значним збільшенням гідратації САЛ з ростом дози
опромінення.

Концентрація макромолекул САБ у розчині істотно впливає на зміни
діелектричних параметрів, а також ступеня гідратації білка в залежності
від температури (рис. 2). За абсолютним значенням отримані величини
ступеня гідратації САБ при температурі 20 °C складають 0,25 і 0,2 г/г
при концентраціях 50 і 100 мг/мл відповідно. З рис. 2 видно, що із
зростанням температури ступінь гідратації САБ у цілому зменшується.
Однак в інтервалах температур 25-35 °C, 38-55 °C і 55-62 °C відбувається
збільшення ступеня гідратації білка, що досягає екстремальних значень
при 30 і 47 °C для концентрації 50 мг/мл і 34, 44 і 57 °C для
концентрації 100 мг/мл. Ці зміни обумовлені, очевидно, конформаційними
перебудовами САБ. Ступінь гідратації САБ при концентрації білка 50 мг/мл
вище, ніж при 100 мг/мол практично на всьому дослідженому інтервалі
температур.

Концентрація білка також впливає на час діелектричної релаксації диполів
води, однак це виявляється тільки при температурах вище 40 °C (рис. 3).
У цій області температур спостерігається збільшення рухливості молекул
об’ємної води. Це визначається, очевидно, різним структурним станом води
в розчинах: із збільшенням концентрації білка структура вільної води
стає більш розвпорядкованою, що може бути обумовлено руйнуванням стійких
асоціатів і водяних кластерів при розчиненні білка.

У розділі 4 представлено результати дослідження впливу ?-опромінення й
температури на конформацію і гідратацію фібриногену людини в розчині
методом НВЧ-діелектрометрії. Встановлено вплив концентрації білка на
радіаційно-індуковані зміни його структури. Приводяться результати
дослідження діелектричних характеристик неопроміненого й опромінених
дозами 20, 60 і 100 Гр розчинів фібриногену в області температур
4–70 °C, обчислені значення ступеня гідратації фібриногену й рухливості
молекул води в білкових розчинах. Виявлено конформаційні переходи
фібриногену при температурах 25-33, 45-53 °C. Встановлено, що вплив
?-опромінення призводить до розвпорядкування структури об’ємної води у
розчині в області плавлення термолабільних ділянок фібриногену, причиною
чого може бути відокремлення ?C-доменів.

В області концентрацій до 5 мг/мл величини ?s опромінених дозами 15 і
30 Гр розчинів білка збігаються з контрольними. При більш високих
концентраціях фібриногену ?s опромінених розчинів зменшується. Це
свідчить про збільшення в системі кількості зв’язаної води, що,
імовірно, обумовлено зростанням ступеня гідратації фібриногену.

Для контрольних зразків у межах похибки залежності ?’ і ?», а також ?s
в інтервалі концентрацій до 16 мг/мл мають лінійний характер. Цей факт
свідчить про те, що діелектричні властивості об’ємної води не залежать
від концентрації білка, а діелектрична проникність розчину визначається
співвідношенням розчинника і розчиненої речовини.

Для з’ясування впливу ?-опромінення на структурні зміни молекули
фібриногену досліджували залежність гідратації від дози опромінення в
інтервалі доз 5-200 Гр (рис. 4). Особливості зміни гідратації від дози,
очевидно, обумовлені структурними переходами в макромолекулі білка. В
області доз до 35 Гр ступінь гідратації зростає і при дозі 35 Гр досягає
максимуму. Оскільки молекули асоційованої води утворюють водневі зв’язки
в основному з полярними центрами молекули білка, то можна припустити, що
збільшення кількості гідратної води пов’язано зі збільшенням кількості
доступних для молекул розчинника ділянок зв’язування в результаті
розпушення поверхні білка та фрагментації макромолекули.

З ростом температури гідратація фібриногену в цілому зменшується. Однак
для нативного білка ці зміни немонотонні, вони характеризуються
наявністю декількох температурних інтервалів де гідратація збільшується:
10, 25-33, 45-53 і 63 °C. При цих температурах відбуваються
конформаційні зміни молекули фібриногену. Це пояснюється наявністю у
молекули багато доменної структури і Ії великою рухливістю. Крім того,
відомо, що молекула фібриногену має 12 кооперативних ділянок з різною
температурою плавлення.

f h p ? c ? i

th

, ? †

U

U

h17C

U

в опромінених зразках менше контролю. Це свідчить про розвпорядкування
об’ємної води і зміну її структурного стану в розчинах фібриногену, що
може бути наслідком руйнування сітки водневих зв’язків, утворених
молекулами води в чистому розчиннику, макромолекулами білка. До ще
більшого розвпорядкування структури води призводить опромінення розчинів
білка. Таким чином, очевидно, зміна структурного стану фібриногену
впливає і на розчинник.

Розділ 5 присвячено дослідженню впливу режимів заморожування й
?-опромінення на діелектричну проникність сироватки кордової крові
методом НВЧ-діелектрометрії. Зразки СКК отримували з кордової
(плацентарної) крові жінок під час пологів.

Проведені дослідження показали, що значення ?’ сироватки після
повільного заморожування усіх досліджених жінок в області кімнатних
температур нижче контролю (рис. 5). Це свідчить про зменшення кількості
вільної води в системі, що може бути результатом підвищення ступеня
гідратації макромолекул СКК. При повільному заморожуванні ушкодження
біоструктур, насамперед, викликано дією підвищених концентрацій солей і
метаболітів, що утворяться при поступовому переході води з рідкої у
тверду фазу. Такі ушкодження погіршують збереження сироватки при
температурі -20 °C, що близька до евтектичної для присутніх іонів. При
цій температурі вимерзає тільки вільна вода, зв’язана ж і жорстко
зв’язана вода (температури замерзання від — 35 °C до -50 °C і від
-120 °C до -130 °C, відповідно) залишається в рідкому стані. Такі умови
можуть призводити до порушення структури ліпопротеїнів і
біомакромолекул, що виявляються в розпушенні поверхневих поліпептидних
ланцюгів. У результаті цього відбувається звільнення додаткових ділянок
зв’язування для молекул води, що призводить до збільшення ступеня
гідратації молекул СКК.

Вплив швидкого заморожування СКК на значення ?’ має протилежну стосовно
повільно заморожених зразків спрямованість у порівнянні з контролем, або
не відрізняються від нативних зразків. Імовірно, у цьому випадку
порушення, викликані заморожуванням сироватки, незначні. В інших
випадках значення ?’ сироватки після швидкого заморожування вірогідно
перевищують контрольні. Це свідчить про збільшення в системі кількості
вільної води, що може бути наслідком кріоагрегації молекул СКК.

При дослідженні впливу охолодження на структурний стан молекул СКК в
інтервалі температур від +40 °C до +5 °C, тобто на початковому етапі
кріоконсервування, було встановлено, що температурна залежність
діелектричної проникності має складний характер. В усьому дослідженому
інтервалі температур залежності діелектричної проникності
характеризуються немонотонними змінами ?’ при температурах 26-32 °C і
15-20 °C як для нативних зразків, так і для заморожених. При цих же
температурах спостерігаються немонотонні зміни діелектричних втрат ?» і
статичної діелектричної проникності ?s.

Практично на всьому дослідженому інтервалі температур для зразків СКК,
опромінених дозами 50 і 100 Гр, значення статичної діелектричної
проникності ?s нижче контролю (рис. 6 а), що свідчить про збільшення в
опромінених зразках кількості зв’язаної води. Значення діелектричних
втрат на температурному інтервалі 20-50 °C також нижче контрольних.
Ефекти, що спостерігаються, корелюють з результатами, отриманими для
водяних розчинів САБ і фібриногену, опромінених цими ж дозами. Тому
зниження діелектричних параметрів СКК можна пояснити розпушенням
поверхні білків сироватки, що призводить до збільшення їхньої ступені
гідратації.

На рис. 6 б приведені арреніусові залежності часу діелектричної
релаксації молекул води ? у СКК. Видно, що при температурах до 40 °C
час релаксації об’ємної води ??в СКК більше, ніж ? чистої води. Отже, в
СКК молекули води більш загальмовані. Однак, починаючи з 40 °C, величина
? у СКК знижується, що свідчить про розпорядковування молекул об’ємної
води.

Відмінності в температурних інтервалах, у яких спостерігаються
особливості в зміні діелектричних параметрів, пов’язані з
індивідуальними особливостями СКК жінок. Однак при цьому загальний
характер температурних залежностей діелектричних параметрів СКК різних
жінок зберігається незмінним.

У розділі 6 запропоновано метод розрахунку коефіцієнтів деполяризації
часток довільної форми методом дискретного наближення. Він не накладає
ніяких обмежень на форму й структуру тіла, оскільки досліджуване тіло
замінюється дискретною системою досить малих об’єктів, що рівномірно
заповнюють об’єм.

Використовуючи розроблений метод обчислення коефіцієнтів деполяризації
геометричних об’єктів довільної форми були розраховані коефіцієнти
деполяризації реальної структури САЛ (рис. 7). На рис. 8 представлені
залежності теоретичних значень ефективної діелектричної проникності
водяних систем із частками включеннями у формі еліпсоїдів (модель
сигари) і реальної форми САЛ від об’ємної частки включень ?. Розрахунок
проводився для випадку ?0=80 и ?1=2,5; ? варіюється від 0,01 до 0,1. Для
порівняння приведені експериментально отримані значення статичної
діелектричної проникності водяних розчинів САБ.

Таким чином, використання в розрахунках моделей еліпсоїдів дає занижені
величини діелектричної проникності. Використання коефіцієнтів
деполяризації реальної форми макромолекул наближає розраховані значення
діелектричної проникності до отриманих експериментально.

ВИСНОВКИ

1. Використання високочутливих експериментальних методів
НВЧ-діелектрометрії і ЕПР-спектроскопії та теорії діелектричної
проникності дисперсних систем і метода дискретного наближення дозволило
з’ясувати залежність структурного стану білків крові від дози
?-опромінення, температури, концентрації і режимів заморожування, що
дозволяє використовувати отримані результати при розробці технологій
стерилізації і кріоконсервування біопродуктів, які отримують з плазми
крові, а також у радіаційній терапії.

2. Встановлено, що характер термотропних конформаційних змін
сироваткового альбуміну і фібриногену, а також час діелектричної
релаксації молекул води у розчинах залежать від концентрації білків та
дози ?-опромінення.

3. Визначено, що при температурах 30-34 °С і 44-47 °С для сироваткового
альбуміну та при температурах 25-33, 45-53 і 63 °C для фібриногену
відбуваються зміни ступеня гідратації білків, що може бути викликано
конформаційними переходами макромолекул.

4. Виявлено, що ??опромінення сироваткового альбуміну у розчині
призводить до розпушення поверхні макромолекул білка та збільшенню
ступеня його гідратації, а також до подальшої агрегації макромолекул.

5. Вперше визначені діелектричні властивості СКК у широкому інтервалі
температур при ?-опроміненні та різних режимах заморожування. Виявлено
зниження величини дійсної частини діелектричної проникності ?’ СКК після
повільного заморожування у порівнянні з нативною та швидко замороженою
сироваткою, а також при ?-опроміненні дозами 50 і 100 Гр, що свідчить
про збільшення ступеня гідратації макромолекул СКК.

6. За допомогою розробленого алгоритму розрахунку коефіцієнтів
деполяризації частинок складної форми отримані теоретичні значення
коефіцієнтів деполяризації для моделі молекули сироваткового альбуміну,
наближеної до реальної форми. Розраховані величини ефективної
діелектричної проникності дисперсної системи вода-альбумін більш близькі
до експериментальних даних, ніж у випадку апроксимації макромолекули
альбуміну еліпсоїдом обертання.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАННИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Горобченко О.А., Николов О.Т., Берест В.П., Гаташ С.В. Зависимость
гидратации фибриногена от дозы ?-облучения по данным
СВЧ-диэлектрометрии. // Вісн. Харк. ун-ту. — 2000. — № 488. –
Біофізичний вісник. — Вип. 1(6). — C. 108-111.

2. Горобченко О.А., Николов О.Т., Нардид О.А. Исследование влияния
?–облучения на структуру бычьего сывороточного альбумина методом
спиновых меток. // Прикладная радиоэлектроника. – 2004. – Т.3, №3. –
C. 102-104.

3. Горобченко О.А. Метод вычисления коэффициентов деполяризации
геометрических объектов и биологических структур произвольной формы. //
Вісн. Харк. ун-ту. — 2003. — № 606. – Біофізичний вісник. – Вип. 2. —
С. 92-96.

4. Горобченко О.А., Мошко Ю.А., Николов О.Т., Нардид О.А., Липина О.В.,
Гаташ С.В. Влияние режимов замораживания на диэлектрические свойства
сыворотки кордовой крови. // Проблемы криобиологии. – 2004. – № 2. –
C. 4-10.

5. Горобченко О.А., Николов О.Т., Гаташ С.В. Влияние ?-облучения на
температурные переходы фибриногена. // Вісн. Харк. ун-ту. — 2004. — №
637. Біофізичний вісник. — Вип. 1-2(14). — С. 102-104.

6. Gorobchenko O.A., Nikolov O.T., Berest V.P., Gatash S.V. The effect
of gamma-irradiation on fibrinogen structure in solution // 6th
International Conference “Dielectric and Related Phenomena”(DRP 2000). —
Spala (Poland). — 2000. — P. 128.

7. Горобченко О.О., Ніколов О.Т., Нардід О.А., Гаташ С.В. Вплив
температури й ?–опромінення на сироватку кордової та венозної крові за
даними НВЧ-діелектрометрії. // Тези доповідей ІІІ Зїзду українського
біофізичного товариства. – Львів (Україна). — 2002. — C. 299.

8. Горобченко О.А., Николов О.Т., Гаташ С.В. Динамика молекул воды в
сыворотке и плазме крови под действием температуры и ?-облучения. // 6-я
Пущинская школа-конференция молодых ученых “Биология – наука XXI века”.
– Пущино (Россия). – 2002. – C. 9.

9. Горобченко О.А., Мошко Ю.А., Николов О.Т., Нардид О.А., Гаташ С.В.
Влияние режима криоконсервирования на сыворотку кордовой крови по данным
СВЧ-диэлектрометрии. // Труды конференции “От современной
фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям”. – Пущино
(Россия). – 2002. – C. 63.

10. Горобченко О.А., Николов О.Т., Берест В.П. Диэлектрические свойства
гамма-облученных растворов фибриногена // Тезисы докладов IV съезда
Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков. –
Минск (Беларусь). — 2000. – C. 173.

11. Gorobchenko O.A., Nikolov O.T., Berest V.P., Gatash S.V. Influence
of gamma-irradiation and temperature on blood proteins on microwave
dielectric method // First International Young Scientists Conference on
Applied Physics. – Kyiv (Ukraine). – 2001. — P. 138-139.

12. Gorobchenko О.O, Nikolov O.T., Gatash S.V. Dynamics of water
molecules in protein solutions // 2nd International Conference
“Broadband Dielectric Spectroscopy and its Applications”(IDS & DRP
2002). – Leipzig (Germany). — 2002. — P. 52.

13. Горобченко О.А., Николов О.Т., Гаташ С.В. Диэлектрическая
проницаемость и гидратация бычьего сывороточного альбумина в растворе.
// 7-я Пущинская школа-конференция молодых ученых “Биология – наука XXI
века”. – Пущино (Россия). – 2003. – C. 58.

14. Gorobchenko O.A., Nikolov O.T., Gatash S.V. Water sate in protein
solutions under radiation. // Eur. Biophys. J. – V.32, № 3. – Abstracts
of IV European Biophysics Congress. – Alicante (Spain). – 2003. –
P. 248.

15. Gatash S.V., Gorobchenko O.A., Nikolov O.T., Tovstyak V.V. Protein
conformation, hydration and water molecules dynamics. Influence of
physical factors. // Eur. Biophys. J. – V.32, № 3. – Abstracts of IV
European Biophysics Congress. – Alicante (Spain). – 2003. – P. 258.

16. Дуркало Н.Т., Горобченко О.А., Николов О.Т., Гаташ С.В. Влияние
?-излучения на бычий сывороточный альбумин. // Конференция молодых
ученых “Физика низких температур-2004”. – Харьков (Украина). — 2004. –
C. 25.

17. Дуркало Н.Т., Горобченко О.А., Ніколов О.Т., Гаташ С.В. Вплив ?-
випромінювання на структуру фібриногену. // Матеріали міжнародної
наукової конференції “Каразінські природознавчі студії”. – Харків
(Україна). — 2004. – C. 274-275.

18. Горобченко О.А., Николов О.Т., Нардид О.А. Структура и гидратация
?-облученного САБ по данным ЭПР-спектроскопии и СВЧ-диэлектрометрии. //
I Українська наукова конференція “Проблеми біологічної і медичної
фізики”. – Харків. – 2004. – C. 67.

19. Горобченко О.А., Гаташ С.В. Диэлектрическая проницаемость растворов
белков. Теоретическое рассмотрение. // I Українська наукова конференція
“Проблеми біологічної і медичної фізики”. – Харків. – 2004. – C. 66.

АНОТАЦІЯ

Горобченко О.О. Вплив ?–опромінення і температури на конформацію білків
крові. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних
наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика. – Харківський національний
університет ім. В.Н. Каразіна, Харків, 2005.

В дисертаційний роботі визначено вплив ?-опромінення і температури на
конформацію альбуміну і фібриногену та на діелектричні властивості
сироватки кордової крові. Методом НВЧ-діелектрометрії отримані значення
комплексної діелектричної проникності водних розчинів сироваткового
альбуміну і фібриногену людини в залежності від дози ?-опромінення,
температури та концентрації білків у розчині. Визначено час
діелектричної релаксації молекул води в розчинах цих білків та у
сироватці кордової крові. Розраховано величини гідратації альбуміну і
фібриногену. За допомогою методу ЕПР отримано спектри спінових міток,
ковалентно приєднаних до молекул сироваткового альбуміну. Встановлено,
що при опроміненні дозою 100 Гр відбувається розпушення поверхні
макромолекули альбуміну в області приєднання слабко загальмованого
радикала.

З’ясовано вплив режимів заморожування та ?–опромінення на діелектричні
властивості сироватки кордової крові.

Розроблено алгоритм розрахунку коефіцієнтів деполяризації частинок
складної форми та розраховано ефективну діелектричну проникність системи
альбумін-вода.

Ключові слова: фібриноген, альбумін, гідратація, конформація, сироватка
кордової крові, ?-опромінення, заморожування, НВЧ-діелектрометрія,
діелектрична проникність, коефіцієнти деполяризації.

АННОТАЦИЯ

Горобченко О.А. Влияние ?-облучения и температуры на конформацию белков
крови. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических
наук по специальности 03.00.02 – биофизика. – Харьковский национальный
университет им. В.Н. Каразина, Харьков, 2005.

В диссертационной работе исследовано влияние ?-облучения и температуры
на конформацию альбумина и фибриногена и на диэлектрические свойства
сыворотки кордовой крови. Методом СВЧ-диэлектрометрии получены значения
комплексной диэлектрической проницаемости водных растворов сывороточного
альбумина и фибриногена в зависимости от дозы ?-облучения, температуры и
концентрации белков в растворе. Получены значения времени
диэлектрической релаксации молекул воды в растворах этих белков и в
сыворотке кордовой крови. Рассчитаны значения гидратации альбумина и
фибриногена. С помощью метода ЭПР получены спектры спиновых меток,
ковалентно присоединенных к молекуле сывороточного альбумина.
Установлено, что при облучении дозой 100 Гр происходит разрыхление
поверхности белка в области присоединения слабо заторможенного радикала.

Установлено влияние режимов замораживания и ?–облучения на
диэлектрические свойства сыворотки кордовой крови.

Разработан алгоритм расчета коэффициентов деполяризации частиц сложной
формы и рассчитана эффективная диэлектрическая проницаемость системы
вода-альбумин.

Ключевые слова: фибриноген, альбумин, гидратация, конформация,
сыворотка кордовой крови, ?-облучение, замораживание,
СВЧ-диэлектрометрия, диэлектрическая проницаемость, коэффициенты
деполяризации.

SUMMARY

Gorobchenko O.O. Influence of ?-irradiation and temperature on the
conformation of the blood proteins. — Manuscript.

Thesis for a candidate’s degree by speciality 03.00.02 — biophysics. –
V.N. Karazin Kharkov National University, Kharkiv, 2005.

In modern biophysics the performance of research on the influence of
such physical factors as ionizing radiation and temperature on blood
proteins conformation is an extremely important and urgent problem
because of the using of ?-irradiation, high and low temperatures in
various areas of medicine and biology. Such studies will enable to
expand our understanding of the processes that occur on the influence of
these physical factors on bioobjects. It will allow us to find out the
optimal technologies of sterilization and preservation of
biopreparations derived from human donor and cord blood with the maximum
activity storage. Such kind of technologies will enable to create the
strategic reserves of preparations and to use them for the clinical
purposes.

Ability to undergo of conformation transitions and opportunity to change
a three dimensional structure is an important property of macromolecules
that defines their functioning. A structural state of macromolecules and
their hydration extensively determine the function activity of protein
and can change under effect of the various physical factors. Therefore
the purpose of this work was the examination of the influence of
?-irradiation and temperature on conformation, hydration and dielectric
properties of blood proteins. The aqueous solutions of bovine serum
albumin (BSA), human serum albumin and human fibrinogen, and also cord
blood serum (CBS) have been studied. The samples were ?-irradiated by a
60Co source. The serum was frozen by two regimens: slow freezing down to
-20 °C at a rate of 1-2 °C/min and rapid freezing at a rate of
300-400 °C/min by immersion into liquid nitrogen (-196 °C). Thawing was
performed on water bath at 40-42 °C. The native samples were taken as a
control. In examination the high sensitive experimental methods of a
resonator microwave dielectrometry and EPR-spectroscopy have been used.
The calculation of protein hydration has been carried out by the method
of the disperse system dielectric permittivity theory and the method of
discrete approach.

The real ?’ and imaginary ?» parts of the complex dielectric
permittivity ?* = ?? — ???? of the serum albumin and fibrinogen in
aqueous solutions at various concentrations irradiated with doses
5-200 Gy were measured by the microwave dielectric method at a frequency
of 9,2 GHz within the temperature range of 4-70 °C. The corrections
based on measurements of conductivity contribution were made for
inorganic ions presence. It has been determined that the character of
the thermal conformation changes of albumin and fibrinogen and also the
water molecule dielectric relaxation time in solutions depend on protein
concentration and radiation dose. For the first time it was revealed
that at the temperatures 30-34 °C and 44-47 °C for serum albumin and at
the temperatures 24 °C and 32 °C for fibrinogen there is the increasing
of the protein hydration which can be caused by conformation transitions
of the macromolecules.

The EPR-spectra of spin traps that covalently associated to a serum
albumin molecule have been obtained. It has been found that irradiation
of BSA by a dose 100 Gy causes the loosening of protein structure on
macromolecule surface, which results in the increasing of BSA hydration.
At a dose increasing up to 150 Gy and 200 Gy one observes the decrease
of hydration and breaking of the radical that is on the surface of BSA
macromolecule, which can be caused by their aggregation.

The investigation of dielectric property of ?-irradiated fibrinogen
solutions shown that at the range of doses 5-200 Gy the value of ?’
varies in limits 1 % from quantity of ?’ of the control sample. The
dielectric permittivity of ?’ with a radiation dose rising was reduced.
However in the range of doses 30-60 Gy the nonmonotone magnification of
?’ was observed that can be caused by conformation transition of
macromolecules of fibrinogen.

The influence of freezing regimens and ?-irradiation on CBS dielectric
properties has been studied. The structural state of CBS macromolecules
was studied in the temperature range from +40 °C up to +5 °C, i.e. on
the initial stage of cooling. It was shown that the temperature
dependence of the dielectric permittivity has complicated character.
Nonmonotonous changes of ?’, ?» and water molecules dielectric
relaxation time at 7-9 °C, 16-20 °C, 26-28 °C and 36-38 °C for native
and frozen samples of CBS have been revealed. Water molecule dielectric
relaxation time is the parameter that characterizes the molecule
mobility in very high frequency field and, consequently, the degree of
their interaction with an environment. The structural disorders and
conformation changes in serum component result in the difference in the
free-bound water system ratio and are accompanied by the change in
dielectric parameters. So it is reasonably safe to suggest that the
observed changes in dielectric parameters values is associated with the
thermotropic conformational changes of CBS macromolecules, which
accompanied by an increase of hydration degree. The decrease of ?’
values was found at slow freezing down to -20 °C and after ?-irradiation
by doses 50 and 100 Gy in comparison with the control and rapid freezing
samples. It can be result in increasing of bound water amount in the
system that may be the cause of change in conformation in CBS
macromolecules.

The algorithm for calculation of the depolarization factors of the
arbitrary shape particles by the method of discrete approach has been
developed. The effective dielectric permittivity of the water-albumin
disperse system was calculated. Is was shown that using in calculations
of the depolarization factors of the real structure of serum albumin
molecule which was built on the base of X-ray data more close to the
experiment results than in case of approximating of a macromolecule by
an ellipsoid of rotation.

Key words: serum albumin, fibrinogen, hydration, conformation, cord
blood serum, ?-irradiation, microwave dielectrometry, dielectric
permittivity, depolarization factors.

Наукове видання

ГОРОБЧЕНКО Ольга Олександрівна

“Вплив ?–опромінення і температури на конформацію білків крові”

Підписано до друку 27.01.2005 р. Формат 60х90 1/16

Друк офсетний. Умовн.-др. арк.. 1.0. Тираж 100 прим. Зам. № 67

ТОВ “Рейтинг”

м. Харків, вул. Сумська, 37.

PAGE \* Arabic 1

Похожие записи