МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ІВАНА ФРАНКА

НАЛИВАЙКО НАТАЛІЯ ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 612.014.46:577.352.4

Властивості і функціональна роль систем Na+-залежного і Na+-незалежного
виходу Са2+ з мітохондрій печінки і міокарда

03.00.13 – фізіологія людини і тварин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському національному університеті імені Івана
Франка Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, доцент

Дубицький Леонід Олександрович

Львівський національний університет імені Івана Франка,

доцент кафедри фізіології людини і тварин

Офіційні опоненти: член-кореспондент НАН України,

доктор біологічних наук, професор

Костерін Сергій Олексійович,

заступник директора з наукової роботи, завідувач відділу біохімії
м’язів,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна

НАН України

Доктор біологічних наук

Янчій Роман Іванович,

провідний науковий співробітник відділу імунології та цитотоксичних
сироваток, Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця

НАН України

Захист відбудеться “28” вересня 2007 р. о 1400 год. на засіданні
спеціалізованої вченої ради К 35.051.14 Львівського національного
університету імені Івана Франка за адресою: 79005, м. Львів, вул.
Грушевського, 4, біологічний факультет Львівського національного
університету імені Івана Франка, ауд. 333.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Львівського національного
університету імені Івана Франка за адресою: 79005 Львів, вул.
Драгоманова, 17.

Автореферат розісланий “11” cерпня 2007 р.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради, кандидат біологічних наук
В.В. Манько

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У кальцієвій регуляції функціональної активності
різних видів клітин важливе місце посідають мітохондрії, які
характеризуються великою кальцієвою ємністю та швидкістю накопичення
іонів цього металу (Костерин С. А., 1990; Дубицький Л. О., Вовканич
Л. С., 2000). Акумуляція Са2+ мітохондріями забезпечується, в основному,
Са2+-уніпортером, який локалізований у внутрішній мембрані цих органел
(Lehninger A. L., 1971). В останнє десятиріччя отримано ряд доказів
існування в мітохондріях міокарда, м’язів, печінки і інших тканин поряд
з Са2+-уніпортером систем Na+-залежного і Na+-незалежного
(H+-стимульованого) виходу Са2+ з цих органел (Gunter Т. Е. et al.,
1994; Bernardi Р., 1999; Rizzuto R. et al., 2000; Дубицький Л. О.,
Вовканич Л. С., 2001). Функціонування таких систем у мітохондріальній
мембрані має важливе значення у забезпеченні Са2+-акумулювальної функції
мітохондрій, попереджуючи перевантаження цих органел іонами кальцію та
перехід їх у стан високої неспецифічної проникності. Наявність таких
систем у мембрані мітохондрій передбачає також можливість Na+- і
H+-залежної регуляції кальцієвого гомеостазу клітини та енергетики цих
органел (Gunter T. E., 1994; McCormak J. G., Denton R. M., 1984; 1990;
Babsky A. et al., 2002). Разом з тим неконтрольовані зміни
внутрішньоклітинної концентрації Na+, а також стани ацидозу і алкалозу
(Kjeldsen K. et al., 1987; Lagadis-Grossmann D., 1991; Babsky A., 1998)
можуть призводити до суттєвих порушень кальцієвого гомеостазу і
енергетики клітини та до її загибелі, як це, наприклад, показано у
випадку клітин міокарда у тварин з експериментальною формою цукрового
діабету (Doliba N. et al., 2000; Savchenko A. et al., 2001). Подібні
стани можуть виникати також під впливом негативних чинників
навколишнього середовища, зокрема за умов інтоксикацій катіонами металів
(Kapoor S. C., Van Rossum G. D. V., 1984; Fullmer C. S., 1992; Goyer
R. A., 1995; Дубицький Л. О., Вовканич Л. С., 2001). Тим не менше
функціональне значення, властивості і механізми функціонування цих
іон-транспортувальних систем мітохондрій залишаються мало вивченими.
Недостатньо висвітлені питання, які стосуються властивостей систем
Na+-залежного і Na+-незалежного, або Н+-стимульованого, виходу Са2+ з
мітохондрій різних тканин. Практично відсутні роботи, присвячені
системним дослідженням специфічності цих Са2+-транспортувальних систем
до катіонів одно- та двовалентних металів. Разом з тим аналіз
властивостей систем Na+-залежного і Н+-стимульованого виходу Са2+ з
мітохондрій є важливим етапом у з’ясуванні молекулярних механізмів
Са2+-акумулювальної функції мітохондрій, функціонування цих
іон-транспортувальних систем та внутрішньоклітинних механізмів токсичної
дії катіонів металів.

Зв’язок роботи з науково-дослідною тематикою кафедри. Робота виконана в
рамках науково-дослідних тем “Механізми Са2+- і NO-залежної регуляції
функціонування секреторних клітин”, 2002-2005 рр. (№ держреєстрації
0103U001872), “Взаємодія катіонів металів з Na+/Ca2+- і
Ca2+/H+-обмінниками мітохондрій печінки”, 2004-2006 рр. (№
держреєстрації 0104U010109).

Мета і завдання дослідження. Дослідити функціональне значення і
властивості систем Na+- і Н+-залежного виходу Са2+ з мітохондрій печінки
і міокарда та з’ясувати механізми взаємодії цих систем з катіонами
одно- та двовалентних

металів.

Для досягнення мети роботи було поставлено такі завдання:

з’ясувати функціональне значення і кінетичні властивості систем Na+- і
Н+-залежного виходу Са2+ з мітохондрій печінки і міокарда щурів;

дослідити залежність швидкості Na+- і Н+-залежного виходу Са2+ з
мітохондрій печінки від температури;

дослідити вплив катіонів одновалентних металів (Tl+, Li+, Rb+, K+ і Cs+)
на системи Na+- і Н+-залежного виходу Са2+ з мітохондрій печінки і
міокарда;

дослідити вплив катіонів двовалентних металів (Ba2+, Sr2+, Mg2+ і Mn2+)
на системи Na+- і Н+-залежного виходу Са2+ з мітохондрій печінки і
міокарда;

з’ясувати залежність ефективності інгібування систем Na+- і Н+-залежного
виходу Са2+ з мітохондрій катіонами одно- та двовалентних металів від
їхніх фізико-хімічних параметрів.

Об’єкт дослідження: Са2+-акумулювальна функція мітохондрій.

Предмет дослідження: властивості і функціональне значення систем
Na+-залежного і Na+-незалежного виходу Са2+ з мітохондрій.

Методи досліджень: фізіологічні, електрометричні, полярографічні,
спектрофотометричні, методи біохімічної кінетики, дисперсійний,
кореляційний і регресійний аналіз.

Наукова новизна одержаних результатів. Показано, що Na+- і Н+-залежний
вихід Са2+ з мітохондрій печінки і міокарда опосередковується іонними
обмінниками внутрішньомітохондріальної мембрани із стехіометрією
транспортування не менше – 1Са2+ : 2Na+ або 1Ca2+: 2H+. Встановлено, що
Na+/Ca2+- і Ca2+/H+-обмінники мітохондрій за фізіологічних рівнів
концентрації Na+ і Н+ функціонують у режимі виходу Са2+ з цих органел.
Вперше проведено порівняльний аналіз кінетичних властивостей
Na+-залежного і Na+-незалежного (Н+-стимульованого) виходу Са2+ з
мітохондрій печінки і міокарда. За даними аналізу температурної
залежності Na+- і Н+-залежного виходу Са2+ з мітохондрій розраховано
енергії активації цих іон-транспортувальних процесів та встановлено
залежність їхньої активності від в’язкості фосфоліпідного бішару
внутрішньої мембрани цих органел. З’ясовано, що ефективність інгібування
Na+/Са2+- і Са2+/Н+-обмінників мітохондрій іонами одно- і двовалентних
металів (I50) позитивно корелює із спорідненістю їх до кисневмісних груп
лігандів (ЕDТА, глутамат), а також з величинами потенціалу іонізації та
електронегативності атомів цих металів. Встановлено також позитивний
кореляційний зв’язок ефективності інгібування (I50) мітохондріальних
обмінників катіонами металів з ентальпією їхньої гідратації та
негативний кореляційний зв’язок ефективності цього інгібування з
величинами кристалографічного радіуса іонів цих металів. Показано, що
одним із механізмів інгібування мітохондріальних обмінників катіонами
одновалентних металів є модифікація ними кооперативних взаємодій іонів
металів з іон-зв’язувальними центрами цих іон-транспортувальних систем.
Отримані результати засвідчують, що транслокація Ca2+, H+ і Na+
мітохондріальними обмінниками та інгібування її катіонами одно- та
двовалентних металів пов’язані із взаємодією їх з кисневмісними групами
іон-транспортувальних центрів обмінників і супроводжуються процесами
дегідратації іонів.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати
по-глиблюють знання про функціональне значення мітохондрій у підтриманні
кальцієвого гомеостазу клітини та механізми цієї функції. Результати
досліджень можуть бути використані для обґрунтування субклітинних
механізмів патологічних станів, пов’язаних із гіпо- і гіпернатрієміями,
ацидозами і алкалозами, інтоксикаціями солями металів, а також для
оцінки токсичності катіонів металів та обгрунтування
санітарно-гігієнічних та екологічних нормативів забруднення середовища
катіонами металів. Результати досліджень впроваджені у навчальний процес
у Львівському національному медичному університеті імені Данила
Галицького і використовуються при викладанні загального курсу
“Фізіологія” (розділи “Загальна фізіологія”, “Фізіологія вісцеральних
систем”), а також впроваджені у навчальний процес у Львівському
національному уні-верситеті імені Івана Франка і використовуються при
викладанні загального курсу “Фізіологія людини і тварин”, та спецкурсів
“Біоенергетичні основи фізіологічних процесів”, “Мембранний транспорт
іонів”. Вони можуть бути використані для підготовки спеціалістів
медико-біологічного профілю в інших навчальних закладах України.

Особистий внесок здобувача. Здобувач виконав весь обсяг
експериментальної частини дисертації, статистичне опрацювання
результатів, відбір і опрацювання літератури. Аналіз та інтерпретацію
отриманих результатів здійснено спільно з науковим керівником, а також
за участю співавторів публікацій.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень за темою
дисертації були представлені на установчому з’їзді Українського
товариства клітинної біології (Львів, 2004 р.), міжнародній конференції
“Клітинні і субклітинні механізми функціонування травної системи”
(Львів, 2004 р.), 1-ій Міжнародній конференції студентів та аспірантів
”Молодь і поступ у біології” (Львів, 2005 р.), 1-му з’їзді фізіологів
СНД (Сочі, 2005 р.), 17-му з’їзді Українського фізіологічного товариства
(Чернівці, 2006 р.), 2-ій Міжнародній конференції студентів та
аспірантів ”Молодь і поступ у біології” (Львів, 2006 р.), IX з’їзді
Українського біохімічного товариства (Харків, 2006 р.), IV з’їзді
Українського біофізичного товариства (Донецьк, 2006 р.), Міжнародній
науковій конференції “Механізми функціонування фізіологічних систем“,
приуроченій до 60-ліття новоствореної кафедри фізіології людини та
тварин Львівського університету (Львів, 2006 р.), щорічних наукових
конференціях Львівського національного університету імені Івана Франка
(Львів, 2004-2006 рр.).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 15 наукових праць, у тому
числі 6 статей у фахових наукових виданнях, затверджених ВАК України,
9 робіт – у матеріалах і тезах з’їздів, симпозіумів, конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається з вступу, огляду
літератури, експериментальної частини (матеріалів і методів досліджень,
результатів та їхнього обговорення), висновків та списку використаної
літератури (327 найменувань). Робота викладена на 174 сторінках
машинописного тексту та проілюстрована 48 рисунками та 34 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження кінетичних властивостей систем Na+- і Н+-залежного виходу
Ca2+

з мітохондрій печінки і міокарда і взаємодії катіонів одно- та
двовалентних металів із Na+/Са2+- та Са2+/Н+-обмінниками цих органел
проводили в умовах in vitro. Мітохондрії ізолювали з печінки і міокарда
білих щурів методом диференціального центрифугування (Shneider W.,
Hogeboom G.H., 1959; Кондрашова Н.М., Григоренко Е.В., 1985; Дубицький
Л.О., Вовканич Л.С., 1996). Дослідження на тваринах проводили з
дотриманням усіх вимог щодо роботи з лабораторними тваринами (міжнародна
конвенція, Страсбург, 1986). Середовище гомогенізації мітохондрій
печінки містило (ммоль/л): сахароза — 300, триоксиметиламінометан (тріс)
– 10, етиленглікольдиамінотетраацетат (ЕGТА) – 1 (рН 7,4). Виділення
мітохондрій з міокарда проводили з окремими модифікаціями. Зокрема,
середовище гомогенізації мітохондрій міокарда містило (ммоль/л): манітол
– 210, сахароза – 70, тріс – 10, етилендиамінотетраацетат (ЕDТА) – 3,
альбумін сироватки бика (БСА) – 0,1% (рН 7,4). Всі операції, пов’язані з
отриманням мітохондрій печінки і міокарда, проводили за температури 0 –
+2( С. Життєздатність ізольованих мітохондрій оцінювали за інтенсивністю
дихання та окисного фосфорилювання, яке реєстрували полярографічним
методом (Chance В., Williams G. 1955, 1956, Lardy H., 1955) з
використанням закритого електрода Кларка та кисеньвимірювального блоку
ГФ-012 виробництва експериментальної лабораторії при НДІ біологічних
досліджень РАН (Пущино, Росія). Середовище інкубації мітохондрій
містило (ммоль/л): сахароза – 150, KCl – 50, КН2РО4 – 1, тріс – 5 (рН
7,4, t 26 ?C).

Na+- і Н+-залежний вихід Са2+ з мітохондрій печінки і міокарда
реєстрували електрометричним методом з використанням установки, зібраної
на основі Са2+-селективного електрода фірми Orion (модель 9320). Для
мітохондрій печінки середовище інкубації містило (ммоль/л): сахароза –
150, KCl – 50, КН2РО4 – 0,1, тріс – 5 (рН 7,4, 26 °С). Для
мітохондрій міокарда використовували середовище інкубації дещо
зміненого складу (ммоль/л): сахароза – 180, KCl – 50, KH2PO4 – 0, 1,
тріс – 10 (рН 7,4, 26°С). У середовище інкубації вносили Са2+ (10-50
мкмоль/л), мітохондрії (3-4 мг білка), сукцинат (0,35 ммоль/л).
Реєстрацію виходу Са2+ з мітохондрій розпочинали після внесення у
середовище інкубації блокатора Са2+-уніпортера цих органел – рутенію
червоного (Vasington F.D., et al., 1972) у концентрації 5 мкмоль/л. Na+-
і Н+-залежний вихід Са2+ з мітохондрій ініціювали шляхом внесення NaCl i
HCl у середовище інкубації цих органел. Для вивчення впливу катіонів
одно- та двовалентних металів на функціонування Na+/Ca2+- і
Ca2+/H+-обмінників мітохондрій у середовище інкубації цих органел
додатково вносили хлориди одновалентних металів (1 – 40 ммоль/л), за
винятком іонів Tl, який був у формі нітрату (0,1 – 1,0 ммоль/л), а також
хлориди двовалентних металів (5 – 50 мкмоль/л). Вихід Са2+ з мітохондрій
у середовище інкубації розраховували за калібрувальною кривою із
врахуванням зв’язування кальцію компонентами середовища інкубації шляхом
його титрування СаCl2. Вміст білка у суспензії мітохондрій визначали за
методом Лоурі (Lowry O. H. et al., 1951).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Кінетичний аналіз Na+-залежного виходу Са2+ з мітохондрій печінки і
міокарда. Встановлено, що у мітохондріях серця, мозку, скелетних м’язів
вихід Са2+ активується Na+ (Gunter T. E., et al., 1994). У мітохондріях
печінки, нирки, гладеньких м’язів ідентифіковано Na+-незалежний вихід
Са2+, який активується Н+ (Gunter T. E., Pfeiffer D. R., 1990; Костерин
С. А., 1990; Gunter T. E., et al., 1994; Шинлова О. П. и др., 1996;
Дубицький Л. О., Вовканич Л. С. 2001; Дубицький Л., та ін., 2003).
Виявлено також H+-стимульований вихід Са2+ у мітохондріях серця
(Crompton M., et al., 1977) та Na+-залежний вихід Са2+ у мітохондріях
печінки (Goldstone T. P., Crompton M., 1982). Проте ряд питань, що
стосуються властивостей і механізмів Na+- і Н+-залежного транспортування
Са2+ через внутрішньо-мітохондріальну мембрану залишаються дискусійними
(Bernardi P., 1999; Gunter T. E., et al., 2000).

Проведеними нами дослідженнями встановлено, що залежність швидкості
Na+-залежного виходу Са2+ з мітохондрій печінки і міокарда від
концентрації Na+ у середовищі інкубації має сигмоподібний
характер (рис. 1). Це свідчить про кооперативні взаємодії Na+ з
Na+-зв’язувальними центрами обмінника. Кінетичним аналізом у системі
координат Хілла показано, що значення коефіцієнта Хілла (1,85 –1,94)
близьке до двох. Це вказує на те, що транспортування одного Са2+
Na+/Са2+-обмінником здійснюється в обмін не менше ніж на два Na+.
Величини констант напівнасичення цього транспортувального процесу для
Na+ у мітохондріях печінки і міокарда є близькими (К0,5(Na+) = 8,41 –
11,21 ммоль/л). Разом з тим Vmax(Na+) Na+-залежного виходу Са2+ з
мітохондрій міокарда становить 16,51 нмоль Са2+/хв · мг білка, а з
мітохондрій печінки – 1,92 нмоль Са2+/хв · мг білка. Це свідчить про
більш високу потенційну здатність мітохондрій міокарда до Na+-залежної
регуляції виходу Са2+ з цих органел порівняно з мітохондріями печінки. В
цілому це співпадає з уявленнями про важливу роль Са2+ у регуляції
діяльності міокарда (Babcock, D. F., et al., 1997; Horikawa Y, et al.,
1998; Trollinger D. R. et al., 2000; Gunter T. E., 2000). Субмаксимальні
швидкості Na+-залежного виходу Са2+ з мітохондрій печінки і міокарда
спостерігаються в діапазоні концентрації Na+ (5,0 – 20,0
ммоль/л). Це

свідчить, що Na+/Са2+-обмінник мітохондрій ефективно функціонує в режимі
виходу Са2+ з цих органел за фізіологічних рівнів концентрації Na+ у
цитозолі клітини.

Швидкість Na+-залежного виходу Са2+ з мітохондрій печінки і
міокарда

збільшується із збільшенням вмісту кальцію в цих органелах за
гіперболічною кінетикою (рис. 2). Кінетичні параметри
Na+- залежного виходу Са2+ з мітохондрій печінки і міокарда,
розраховані за кальцієм, дещо відрізняються. Так, Vmax(Са2+) цього
транспортувального процесу у мітохондріях печінки і міокарда складає
відповідно 1,96 і 35,58 нмоль Са2+/хв · мг білка, а величини К0,5(Са2+)
є близькими і становлять відповідно 22,03 і 20,46 нмоль/мг білка. Судячи
із величин K0,5 спорідненість Na+/Са2+-обмінника до Са2+ у мітохондріях
міокарда і печінки, є близькою. Проте Vmax цієї іон-транспортувальної
системи у мітохондріях міокарда є значно вищою. Ці результати
узгоджуються із даними кінетичного аналізу Na+-залежного виходу Са2+ з
мітохондрій цих тканин, які було розраховано для Na+.

Таким чином, мітохондрії міокарда характеризуються більш високою
потенційною здатністю до Na+-залежної регуляції виходу Са2+ з цих
органел порівняно з мітохондріями печінки. Вірогідно, це пов’язано з
різним ступенем кальцієвої регуляції функціональної активності клітин
цих тканин.

Кінетичний аналіз Н+-залежного виходу Са2+ з мітохондрій печінки і
міокарда. Швидкість виходу Са2+ з мітохондрій печінки і міокарда
збільшується також після закислення середовища інкубації цих органел.
Залежність швидкості Н+-залежного виходу Са2+ з мітохондрій печінки і
міокарда від позамітохондріальної концентрації Н+, як і у випадку з
Na+ -залежним виходом Са2+ з мітохондрій цих тканин має сигмоподібний
характер (рис. 3). Сигмоподібна залежність Н+-залежного виходу Са2+ з
мітохондрій печінки і міокарда від концентрації Н+ та коефіцієнт Хілла,
близький до двох (1,6 – 1,65), вказують на те, що цей вихід
опосередковується обмінником, що здійснює вихід із мітохондрій
одного Са2+ в обмін не менше ніж на два Н+, як і у випадку з
Na+/Са2+-обмінником. З’ясовано також основні кінетичні властивості
цього транспортувального процесу. Зокрема встановлено, що Vmax(Н+)
Н+-залежного виходу Са2+ з матриксу мітохондрій печінки і міокарда
складає відповідно 1,67 і 13,52 нмоль Са2+/хв · мг білка. Величини
K0,5 цього виходу Ca2+ з мітохондрій печінки і міокарда для Н+
становлять 13,29 – 14,24 нмоль/л. Субмаксимальне збільшення швидкості
Н+-залежного виходу Са2+ з мітохондрій печінки і міокарда
спостерігається в діапазоні концентрацій Н+ 40 – 60 нмоль/л, що
відповідає фізіологічним межам концентрацій цих іонів у клітині (рН 7,2
– 7,4). Це свідчить, що Ca2+/H+-обмінник мітохондрій ефективно
функціонує в режимі виходу Са2+ з цих органел за фізіологічних рівнів
концентрації Н+ у цитозолі клітини.

Залежність швидкості Н+-залежного виходу Са2+ з мітохондрій печінки і
міокарда від вмісту кальцію у цих органелах має гіперболічний характер
(рис. 4).

Максимальна швидкість (Vmax) цього транспортувального процесу у
мітохондріях печінки і міокарда для Са2+ становить відповідно 2,16 і
3,27 нмоль Са2+/хв · мг білка, а константа напівнасичення – 103,08 і
6,23 нмоль/мг білка. Це свідчить, що спорідненість Са2+/Н+-обмінника
мітохондрій міокарда до Са2+ є вищою, порівняно з обмінником
мітохондрій печінки.

Отримані результати свідчать, що в мітохондріях печінки і міокарда поряд
з Na+/Ca2+-обмінником функціонує Ca2+/Н+-обмінник. Обидва
мітохондріальні обмінники характеризуються подібними кінетичними
властивостями і за фізіологічних умов функціонують у режимі
Na+(Н+)-залежного виходу Са2+ з цих органел. Разом з тим виявлено, що
потенційна здатність цих систем до Na+- і Н+- залежного виходу Са2+ з
мітохондрій міокарда є вищою ніж з мітохондрій печінки.

Аналіз температурної залежності Na+- і Н+-залежного виходу Са2+ з
мітохондрій печінки. Одним із важливих методичних підходів у дослідженні
іон-транспортувальних систем клітини є аналіз залежності їхньої
функціональної активності від температури. Такий підхід дозволяє оцінити
енергетичні параметри транспортування іонів цими іон-транспортувальними
системами, а також вплив мембран на стан цих мембрано-зв’язаних
іон-транспортувальних білків (Болдырев А. А. 1981, Bernardi P., 1984).

Проведеними нами дослідженнями встановлено (рис.5), що збільшення
температури середовища інкубації мітохондрій печінки в діапазоні від 5
до 35 0С супроводжується суттєвим збільшенням швидкості Na+ і
Н+-залежного виходу Са2+ з матриксу цих органел. Так, за температури 50С
швидкість Н+-залежного виходу Са2+ з матриксу мітохондрій становила
0,30 ± 0,015 нмоль Са2+/хв · мг білка, а за температури 35 0С
– 5,05 ± 0,025 нмоль Са2+/хв·мг білка. Швидкість Na+-залежного виходу
Са2+ з матриксу мітохондрій становила за температури 50С 0,55 ± 0,009
нмоль Са2+/ хв·мг білка, а за температури 35 0С – 4,35 ± 0,012 нмоль
Са2+/ хв·мг білка.

За даними аналізу температурної залежності Na+- і Н+-залежного виходу
Са2+ з матриксу мітохондрій у системі координат Арреніуса розраховано
енергію активації цих іон-транспортувальних процесів. Значення енергії
активації Na+- і Н+- залежного виходу Са2+ з мітохондрій становили за
нашими даними відповідно 135,70 і 180,72 кДж/моль за температури нижче
200С та 76,57 і 120,54 кДж/моль – за температури вище 200С. Отже Na+- і
Н+-залежний вихід Са2+ з матриксу мітохондрій печінки характеризується
достатньо високими величинами енергії активації. Для порівняння енергія
активації уніпорту Са2+ в мітохондрії печінки за даними окремих авторів
складає біля 42 кДж/моль (Bragadin M., et al., 1979). При цьому
Н+-залежний вихід Са2+ з матриксу мітохондрій печінки характеризується
значно більшими величинами енергії активації порівняно з Na+-залежним
виходом Са2+ з цих органел.

Шляхом лінеаризації температурної залежності швидкості Na+- і
Н+-залежного виходу Са2+ з матриксу мітохондрій в координатах Арреніуса
встановлено також (див. рис. 5), що отримані лінії характеризуються
наявністю перегину в точках, що відповідають 19 – 21 0С. Відомо, що
наявність точок перегину на графіку Арреніуса біля 19 – 21 0С характерна
для температурної залежності плавлення фосфоліпідного бішару мембрани
мітохондрій (Болдырев А. А., 1981). Це свідчить, що активність систем
Na+- і Н+-залежного виходу Са2+ з мітохондрій залежить від в’язкості
фосфоліпідного бішару мембрани мітохондрій тканин. Результати
проведеного аналізу температурної залежності Na+- і Н+-залежного
виходу Са2+ з мітохондрій печінки перш за все є додатковим доказом
того, що ці іон-транспортувальні процеси здійснюються за участю
специфічних білків-переносників внутрішньо-мітохондріальної мембрани,
які забезпечують повільний вихід Са2+ з цих органел.

Інгібіторний аналіз взаємодії іонів одновалентних металів з Na+/Са2+- і
Са2+/Н+-обмінником мітохондрій. Одним із підходів у з’ясуванні
фізико-хімічних механізмів транслокації іонів натрію, водню і кальцію
Ca2+-транспортувальними системами мітохондрій та інгібування їх
катіонами інших металів є співставлення ефектів катіонів цих металів на
функціонування Са2+-транспортувальних систем з їхніми фізико-хімічними
властивостями (спорідненість до кисневмісних лігандів, ентальпія
гідратації, радіус іона тощо). Такий аналіз був успішно реалізований
стосовно кальцієвих помп та Na+-Ca2+-обмінника плазматичної мембрани
секреторних клітин шлункових залоз та Ca2+-уніпортера мітохондрій
(Дубицький Л. О., Вовканич Л. С., 2000, 2001, 2003). Цей аналіз дозволяє
виділити фізико-хімічні параметри катіонів металів, які лімітують
транслокацію іонів Ca2+-транспортувальними системами та їх інгібування,
що важливо для з’ясування молекулярних механізмів функціонування цих
систем та механізмів токсичної дії катіонів різних груп металів.

Проведеними дослідженнями встановлено, що катіони одновалентних металів
пригнічують функціонування Na+/Са2+- і Са2+/Н+-обмінників мітохондрій
печінки і міокарда. Так, після внесення у суспензію мітохондрій печінки
Cs+, Rb+ і Li+ у концентрації 40,0 ммоль/л швидкість Na+-залежного
виходу Ca2+ з цих органел зменшувалась відповідно на 22,62, 27,50 і
72,25%. Внесення Cs+, Rb+ і Li+ у суспензію мітохондрій міокарда також
супроводжувалось зменшенням швидкості Na+-залежного виходу Ca2+ з цих
органел відповідно на 10,69, 20,57 і 51,67%. Встановлено, що Cs+, Rb+ і
Li+ також суттєво пригнічують функціонування Са2+/Н+-обмінника
мітохондрій печінки на 14,32, 12,99 і 31,01%. Внесення катіонів цих
металів у суспензію мітохондрій міокарда також супроводжувалось
зменшенням швидкості Н+-залежного виходу Ca2+ з цих органел відповідно
на 11,56, 25,60, і 45,11%. Більш ефективним інгібітором Na+/Са2+- і
Са2+/Н+-обмінників мітохондрій цих тканин виявився Tl+. Так, іони цього
металу у концентрації 1 ммоль/л пригнічували активність систем Na+- і
Н+-залежного виходу Са2+ з мітохондрій печінки на 61,96 і 68,06%.
Швидкість Na+- і Н+-залежного виходу Са2+ з мітохондрій міокарда під
впливом Tl+ зменшувалась на 24,03 і 31,89%.

Методами кінетичного аналізу у системі координат Уебба (Келети Т., 1990)
показано (рис. 6, 7), що катіони одновалентних металів інгібують Nа+- і
Н+-залежний вихід Са2+ з мітохондрій переважно за конкурентним типом.
Отримані результати свідчать про безпосередню взаємодію катіонів
одновалентних металів з іон-транспортувальними центрами Са2+/Н+- і
Na+/Са2+-обмінників мітохондрій, що дозволило застосувати їх для
аналізу специфічності та механізмів функціонування іон-транспортувальних
систем.

»

,

H

J

E

I

o

»

$

$

&

(

*

,

.

J

x

z

v

E

I

/////icccccUUUIcUUUUUUUU

&

T’23/43e4J6Ae6A7
9:H

Похожие записи