ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УН(ВЕРСИТЕТ

імені В.Н. КАРАЗІНА

ФЕДОРКО НАТАЛІЯ ЛЕОНІДІВНА

УДК 577.16:591.3:599.324.2

Вікові особливості вітамінної і коферментної регуляції
2-оксоглутаратдегідрогеназного комплекса в печінці і дванадцятипалій
кишці щурів

03.00.04 — біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Одеському національному університеті імені (. (.
Мечникова Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Петров Сергій Анатолійович,

Одеський національний університет імені І. І. Мечникова,

професор кафедри біохімії, м. Одеса.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Войціцький Володимир Михайлович,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка

професор кафедри біохімії, м. Київ.

доктор медичних наук, старший науковий співробітник

Пахомова Вікторія Олексіївна,

Інститут стоматології АМН України,

керівник лабораторії біохімії, м. Одеса.

Провідна установа: Інститут геронтології АМН України (відділ регуляції
метаболізму), м. Київ

Захист відбудеться “17” травня 2006 р. о 16.30 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного
університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України
(61077, м. Харків, пл. Свободи 4, ауд. 3-15).

З дисертацією можна ознайомитися у Центральній науковій бібліотеці
Харківського національного університету імені В.Н.Каразіна Міністерства
освіти і науки України (61077, м. Харків, пл. Свободи 4, ауд.
3-15).

Автореферат розісланий “13” квітня 2006 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Падалко В.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема взаємодії вітамінів досліджується протягом
декількох десятиліть. Однак, до теперішнього часу не створена єдина
концепція взаєморегуляції міжвітамінних відносин в органах і тканинах
тваринного організму. Накопичені численні дані по впливу вітамінів,
зокрема тіаміну, на активність дегідрогеназ 2-оксокислот не враховують
забезпеченість тканин іншими вітамінами, а тому відмічені
різноспрямовані зміни активності цих мультиензимних комплексів [Розанов
А.Я. и др., 1968; Розанов А.Я. и др., 1971]. Оскільки коферментні форми
багатьох вітамінів беруть участь у каталізі великої кількості реакцій,
їх вплив на окремі ферменти може бути як прямим, так і опосередкованим
[Розанов А.Я., 1967, 1972, 1987].

До складу комплексів дегідрогеназ 2-оксокислот входять коферменти: ТПФ,
КоА, НАД+, ФАД і ліпоєва кислота, зміни вмісту яких в органах і тканинах
впливають на активність комплексів [Кочетов Г.А., 1978; Ленинджер А.,
1985].

Головну роль у процесах регуляції на рівні коферментів числена
дослідників приділяють ТПФ завдяки його участі в лімітуючій реакції
окиснювального декарбоксилювання 2-оксокислот у складі декарбоксилюючого
компонента комплексу.

Велика кількість робіт вітчизняних і зарубіжних авторів присвячена
регуляторним властивостям ТПФ, тіаміну і його аналогів, а також
відмічена його регуляторна роль у функціонуванні комплексів дегідрогеназ
2-оксокислот [Розанов А.Я., 1972, 1981; Пархоменко Ю.М. и др., 1987;
Петров С.А., 1992].

Вивчення особливостей дії коферментів на окиснення пірувату і
2-оксоглутарату показало їх нерівнозначність [Пархоменко Ю.М. и др.,
1987; Карпов Л.М., 1994; Карпов Л.М. и др., 1998]. У проблемі регуляції
активності дегідрогеназ 2-оксокислот особливе місце займає питання про
взаємодію їх коферментів і апоферментів, що при наявності їх певних
співвідношень веде до самозбирання мультиензимних комплексів.

Ця залежність не існує в “чистому вигляді”, оскільки неможливо уникнути
гормональних, вікових та інших факторів [Богацкая Л.Н., Ступина А.С.,
Калиман П.А., 1985; Пидручна С.Р., 1998].

Подібних досліджень порівняно небагато, а тому вивчення цього питання в
онтогенезі є актуальним.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконувалася в рамках держбюджетних тем кафедри біохімії
Одеського національного університету імені І. І. Мечникова: “Біохімічні
та фармакологічні механізми дії та обміну метаболітів вітамінів в
організмі за умов різних експериментальних патологій” (номер
держреєстрації 0104U002661) та “Механізми реалізації активності
вітамінів як інтегральної системи регуляторів метаболізму” (номер
реєстрації 0897V00898).

Мета i задачі дослідження. Метою роботи є визначення вікових
особливостей взаємодії вітамінів і відповідних коферментів при
функціонуванні 2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу у печінці і
дванадцятипалій кишці щурів на тканинному, субклітинному рівнях, на
рівні очищеного мультиферментного комплексу.

Для виконання цієї мети були поставлені наступні задачі:

Виявити особливості розподілу тіаміну в тканинах і мітохондріях печінки
і дванадцятипалої кишці у щурів різного віку після його введення окремо
та з сумішшю вітамінів.

Провести порівняльний аналіз оновлюваності тіаміну в досліджених
тканинах і мітохондріях.

Визначити особливості окиснення 2-оксоглутарату у печінці та
мітохондріях її клітин у щурів різного віку після введення тіаміну та
суміші вітамінів.

Дослідити вплив окремих коферментів, які входять до складу
2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу, та їх суміші на окиснення
2-оксоглутарату в мітохондріях печінки і дванадцятипалої кишці in vitro
та на рівні очищеного поліферментного комплексу.

Визначити можливу реасоціацію мультиензимного
2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу на мітохондріальних мембранах
при наявності коферментів і апоферментів цього комплексу.

Об’єкт дослідження. Коферментна регуляція 2-оксоглутаратдегідрогеназного
комплексу в печінці і дванадцятипалої кишці щурів.

Предмет дослідження. Активність 2-оксоглутаратдегідрогеназного
комплексу та накопичення тіаміну в печінці і дванадцятипалій кишці
щурів.

Методи дослідження. Були використані методи диференціального
центрифугування, ультрацентрифугування, електронної мікроскопії,
спектрофотометричні, флуориметричні, ізотопні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше отримані дані про
особливості впливу суміші вітамінів узятих в
„2-оксоглутаратдегідрогеназному” співвідношенні на динаміку розподілу
тіаміну в тканинах печінки і дванадцятипалої кишки щурів різного віку.
Оцінено оновлення тіаміну в тканинах тварин різного віку. Досліджено
взаємодію коферментів 2-оксоглутаратдегідрогеназного
комплексу в мітохондріях при фіксації тіамінфосфатів. Вперше оцінено
вікові особливості окиснення 2-оксоглутарату в тканинах печінки і
дванадцятипалої кишки щурів. Вперше досліджено ефекти дії суміші
коферментів на активність
2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу в мітохондріях печінки і
дванадцятипалій кишці щурів. Зроблено порівняльну оцінку взаємодії
суміші вітамінів при окисненні 2-оксоглутарату в печінці і
дванадцятипалій кишці, а також мітохондріях, виділених з цих тканин.
Отримано дані, що підтверджують існування реасоціації мультиензимного
2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу на мітохондріальних мембранах.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати та їх
узагальнення розширюють сучасні уявлення про вікові особливості
функціонування
2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу. Результати досліджень вказують
на особливу роль вітамінів, коферменти яких входять до складу
мультиензимного комплексу та поширюють уявлення про його коферментну
регуляцію. В роботі вперше проведено і доказано можливість реасоціації
2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу із апоферментів і відповідних
коферментів на мітохондріальних мембранах. Досліджена суміш вітамінів
може бути рекомендована для підтримання вітамінного балансу і загального
енергетичного рівня в організмі. Отримані результати використовуються на
кафедрі біохімії Одеського національного університету імені І. І.
Мечникова при читанні лекцій для студентів зі спеціальних курсів:
“Методи сучасної біохімії”, “Медична біохімія”, “Ензимологія”,
“Механізми регуляції біокаталізу”, “Механізми каталітичної дії
коферментів”, а також при проведенні лабораторних робіт зі спеціального
практикуму та загального курсу “Ензимологія”.

Особистий внесок здобувача. В процесі виконання дисертаційної роботи
автор особисто проаналізував сучасну наукову літературу по темі
дослідження, підібрав методи до вирішення поставлених задач і самостійно
провів усі експериментальні дослідження. Планування етапів досліджень і
інтерпретація отриманих результатів проведені сумісно з науковим
керівником. Електронномікроскопічні дослідження
2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу було виконано сумісно з
інженером Інституту очних хвороб і тканинної терапії імені В.П.Філатова
– Орелкіним Г. І.

Апробація результатів дисертації. По темі дисертації були представлені
доповіді на IV Українському біохімічному з’їзді (1982), IV Всесоюзному
з’їзді геронтологів і геріатрів (1982), на конференціях молодих вчених
Одеського державного університету (1982, 1985). Результати досліджень
доповідалися на V Українському біохімічному з’їзді (Івано-Франківськ,
1987), 14-му міжнародному біохімічному конгресі в м. Празі (1988), 19-ї
зустрічі FEBS у м. Римі (1989), VІ Українському біохімічному з’їзді
(Київ, 1992), на конференції “Геропротектори у попередженні прискореного
старіння” (Одеса, 1996) та симпозіумі “Біологічні механізми старіння”
(Харків, 1996), а також на V міжнародному симпозіумі “Биологические
механизмы старения” (Харьков, 2002) і на Всеукраїнській конференції
молодих вчених “Актуальные проблемы естествознания – 2003” (Симферополь,
2003).

Публiкацiї. За матеріалами дисертаційної роботи надруковано 5 статей в
періодичних наукових спеціалізованих виданнях України, які включені в
перелік, затверджений ВАК України, та 13 тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі
вступу, огляду літератури по проблемі (три розділи), експериментальної
частини (вісім розділів), узагальнення, висновків та списку використаних
літературних джерел наукової літературі з 115 робіт вітчизняних і 173 –
зарубіжних авторів. Робота викладена на 124 сторінках друкованого тексту
та містить 4 таблиці і 24 рисунки.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури висвітлені сучасні дані щодо
структури та каталітичної дії дегідрогеназ 2-оксокислот, механізмів
вітамінної та коферментної їх регуляції, а також вітамінної
забезпеченості тваринних організмів різного віку.

Матеріали та методи дослідження. При виконанні роботи використовували
щурів-самців лінії Wistar трьох вікових груп: молодi (1-1,5 міс.),
статевозрiлi (6-8 міс.) або старі (22-24 міс.). Всі тварини утримувалися
у стандартних умовах віварія Одеського національного університету імені
І. І. Мечникова. Всі маніпуляції з тваринами проводили згідно до
Європейської Конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються
для експериментальних наукових цілей (Страсбург, 1986).

Взаємодію вітамінів, коферментні форми яких входять до складу
дегідрогеназ 2-оксокислот, з тіаміном при його фіксації в тканинах
печінки, дванадцятипалої кишки і мітохондріях виконані на двох вікових
групах щурів: молодих (1-1,5 міс.) і старих (22-24 міс.).

Тваринам вводили 35S-тіамін у дозі 1,5 мкмоль/кг і сумісно з вітамінами.
Співвідношення в суміші вітамінів в мкмоль/кг були такими: тіамін – 1,5,
ФМН – 7,5, пантотенат-Са – 37,5, ЛК – 22,5, НА – 60. Експеримент
проводили в динаміці: 15, 30, 60, 120, 240 хв. і 24 год. Підрахунок
?-радіоактивності міченого тіаміну проводили в імпульсах за 100 секунд
на газопроточній установці типу “Протока”.

Методом диференціального центрифугування виділяли загальну фракцію
мітохондрій за Джонсоном і Ларді [Jonson D., Lardy H., 1967] за
модифікацією Кравченко Н.А. (1990).

Визначення вільного і загального тіаміну проводили флуориметрично за
методом Янсена в модифікації Єлісєєвої Г.Д. [Островский Ю.М., 1979] і
Розанова А.Я. (1989).

Взаємодію коферментів 2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу на рівні
мітохондрій і очищеного комплексу було досліджено на молодих,
статевозрілих і старих щурах. Суміш коферментів додавали in vitro в
мікромолярному співвідношенні, характерному для дегідрогеназ
2-оксокислот: ТПФ – 0,015, НАД – 0,6, КоА – 0,375, ЛК – 0,225, ФМН –
0,075.

Виділення і очищення 2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу
здійснювали методом Roche J.E., Cate R.J. (1977).

Ферментативну активність визначали фериціанідним методом [Kiessling K.-
H., Lunquist C.G., 1962] за модифікацією Карпова Л.М. (1994) і тестом
Варбурга [Островский Ю.М., 1979]. Відповідно зазначених методів
визначали активність поліферментного комплексу в нмолях відновленого
фериціаніду / хв·мг білку та нмолях НАДН / хв·мг білку.

Вміст білку в тканинах визначали за методом Лоурі [Lowry O. et al.,
1951].

Розрахунок вмісту тіаміну (в мкг/г) і оновлюваності тіаміну (в %)
проводили за формулами:

;

Для виконання дисертаційної роботи було використано всього 210
різновікових щурів-самців лінії Wistar.

Для обчислення отриманих результатів застосовували методи статистичного
аналізу з використанням параметричних критеріїв оцінки розбіжності між
вибірками. Достовірно різними вважалися результати при Р ? 0,05.

У роботі застосовувалися хімічно чисті реагенти фірм Amersham, Sigma,
Serva, Reanal, Xenon, Ferak, Реахим.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛIДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Включення міченого тіаміну до тканин печінки і дванадцятипалої кишки
щурів різного віку. Після введення 35S-тіаміну в дозі 1,5 мкМ/кг у
молодих щурів максимальне накопичення метаболітів вітаміну в тканинах
дванадцятипалої кишки спостерігався через 1 год. Високий рівень мітки
утримувався до 4-х год., з наступним падінням до 24-х годинного строку
дослідження (рис. 1). У старих тварин процес включення міченого тіаміну
в оболонки дванадцятипалої кишки більш тривалий, причому мітка
утримувалася на відносно низькому рівні, але більш тривалий час.

При дослідженні проникнення 35S-тіаміну в мітохондрії дванадцятипалої
кишки виявлено приблизно 30 і 40 % міченого тіаміну від загальної мітки
в тканинах дванадцятипалої кишки, відповідно у молодих і старих щурів
(рис. 2).

Фазність динаміки процесу включення мітки більш виражена у молодих
тварин. Отримані результати свідчать про послаблення потужності
вітамінметаболізуючих і вітамінутримуючих систем в онтогенезі.

Рис. 1. Включення міченого тіаміну в тканини дванадцятипалої кишки у
молодих (1-1,5 міс.)

і старих (22-24 міс.) щурів після внутрішньом’язового введення
35S-тіаміну.

Примітка: 1 – молоді щури, 2 – старі щури Рис. 2. Включення міченого
тіаміну в мітохондрії дванадцятипалої кишки у молодих (1-1,5 міс.) і
старих (22-24 міс.) щурів після внутрішньом’язового введення
35S-тіаміну.

Примітка: 1 – молоді щури, 2 – старі щури

Включення 35S-тіаміну в гепатоцити характеризується двофазною динамікою
як у молодих, так і у старих щурів (рис. 3), а максимальні накопичення
тіаміну в мітохондріях печінки синхронні з такими в цілому органі як у
молодих, так і у старих тварин (рис. 4). Аналіз цих даних свідчить про
послаблення з віком механізмів утримування тіаміну, який у старих щурів
після потрапляння до організму значної його кількості виділяється у
кишці, минаючи печінку. Підтвердженням цього є менш виражений другий
максимум накопичення тіаміну в печінці старих щурів порівняно з
молодими. Транспорт тіаміну крізь субклітинні мембрани супроводжується
його фосфорилюванням [Чаговец Р. В. и др., 1976; Рыбина А.А. и др.,
Чаговец Р. В. и др., 1978]. Існує гіпотеза [Розанов А.Я. 1972; 1989], що
провідну роль в проникненості мембран мітохондрій відіграє взаємодія
апоферментів органел, зокрема дегідрогеназ 2-оксокислот з комплексом
відповідних коферментів або їх попередників. Тобто, ферменти біологічних
мембран розглядаються як складова частина транспортних систем вітаміну.
Інші автори [Розанов А.Я. и др., 1971; Халмурадов А.Г. и др., 1982;
Розанов А.Я. и др., 1985] також вказували на певну кореляцію між
швидкістю транспорту тіаміну в мітохондрії і ефективністю ТПФ-кіназної
реакції. Взаємозв’язок між транспортом і метаболізмом тіаміну
здебільшого визначається характером мембран, у яких відбувається
транспорт.

Рис. 3. Включення міченого тіаміну в тканини печінки у молодих (1-1,5
міс.) і старих (22-24 міс.) щурів після внутрішньом’язового введення
35S-тіаміну.

Примітка: 1 – молоді щури, 2 – старі щури Рис. 4. Включення міченого
тіаміну в мітохондрії печінки у молодих (1-1,5 міс.) і старих (22-24
міс.) щурів після внутрішньом’язового введення 35S-тіаміну.

Примітка: 1 – молоді щури, 2 – старі щури

Включення міченого тіаміну в тканини печінки і дванадцятипалої кишки
щурів різного віку після його ін’єкції сумісно з сумішшю вітамінів.
Велика кількість робіт присвячена взаємодії і взаємному впливу
вітамінів, але як правило вони віддзеркалюють сам факт наявності такого
впливу, а не його відповідні механізми. В цій серії експериментів ми
намагалися з’ясувати можливі причини посилення накопичення тіаміну за
сумісного його введення з сумішшю вітамінів у деяких тканинах травної
системи щурів різного віку. Вітаміни були взяті у мілімолярному
співвідношенні, характерному для дегідрогеназ 2-оксокислот: тіамін :
ліпоат : пантотенат : нікотинат : рибофлавін = 1,5 : 22,5 : 37,5 : 60 :
7,5. Вітаміни ін’єкувалися сумісно з 35S-тіаміном у терапевтичних дозах.
Відмічено двофазну динаміку накопичення тіаміну в гепатоцитах щурів
різного віку, причому в більшій мірі – у молодих тварин: через 15 хвилин
і 4 години (рис. 5). Перший пік накопичення тіаміну може бути
результатом транспорту вітаміну крізь біомембрани, що спряжений з
процесом фосфорилювання [Новикова З.Ф.. 1972; Розанов А.Я., 1976;
Розанов А.Я., Карпов Л.М., 1981; Розанов А.Я. и др., 1989; Карпов Л.М.,
1994].

Другий пік накопичення тіаміну в печінці характеризує інтенсивність його
включення в білки, яке в значній мірі відбувається в мітохондріях, де
знаходяться тіамін-залежні ферменти [Розанов А.Я. и др., 1971; Розанов
А.Я., 1976; Розанов А.Я., Карпов Л.М., 1981]. Відмічено також
двофазність динаміки накопичення мічених метаболітів тіаміну в
мітохондріях печінки щурів різного віку (рис. 6), але відсотковий вміст
мітки в мітохондріях печінки порівняно з тканиною печінки вищий у старих
тварин, ніж у молодих.

Рис. 5. Включення міченого тіаміну в тканини печінки у молодих (1-1,5
міс.) і старих (22-24 міс.) щурів після внутрішньом’язового введення
35S-тіаміну сумісно з сумішшю вітамінів.

Примітка: 1 – молоді щури, 2 – старі щури Рис. 6. Включення міченого
тіаміну в мітохондрії печінки у молодих (1-1,5 міс.) і старих (22-24
міс.) щурів після внутрішньом’язового введення 35S-тіаміну сумісно з
сумішшю вітамінів.

Примітка: 1 – молоді щури, 2 – старі щури

За сумісного введення 35S-тіаміну з сумішшю вітамінів в тканинах
дванадцятипалої кишки і її мітохондріях, також спостерігалася фазність
включення мітки, але більшою мірою у молодих щурів (рис. 7, 8).

Рис. 7. Включення міченого тіаміну в тканини дванадцятипалої кишки у
молодих (1-1,5 міс.) і старих (22-24 міс.) щурів після
внутрішньом’язового введення 35S-тіаміну сумісно з сумішшю вітамінів.

Примітка: 1 – молоді щури, 2 – старі щури Рис. 8. Включення міченого
тіаміну в мітохондрії дванадцятипалої кишки у молодих (1-1,5 міс.) і
старих (22-24 міс.) щурів після внутрішньом’язового введення 35S-тіаміну
сумісно з сумішшю вітамінів.

Примітка: 1 – молоді щури, 2 – старі щури

Таким чином, введення суміші вітамінів одночасно з 35S-тіаміном
супроводжується суттєвим збільшенням фіксації мітки в мітохондріях
печінки і дванадцятипалій кишці в обох вікових групах. Необхідно
зазначити, що для молодих щурів збільшення фіксації мітки тільки в перші
півгодини корелює з процесами оновлюваності тіаміну. Для старих тварин
процес оновлюваності тіаміну, очевидно, є визначним у мітохондріях
дванадцятипалої кишки.

Одним з найважливіших метаболічних показників ефективності використання
тіаміну, як й інших вітамінів, у клітинах є співвідношення кількостей
його різних метаболітів і швидкість оновлюваності в організмі. Ці
показники можуть лягти в основу оцінки онтогенетичних особливостей
використання того чи іншого вітаміну в організмі.

Оновлюваність тіаміну в печінці і дванадцятипалій кишці щурів різного
віку. Аналіз відносної оновлюваності тіаміну в тканинах печінки і
дванадцятипалої кишки (рис. 9, 10) і мітохондріях печінки щурів (рис.
11) свідчить, що цей процес також характеризується двофазною динамікою.

Рис. 9. Динаміка відносної оновлюваності (масова доля, %) тіаміну в
тканинах дванадцятипалої кишки молодих (1-1,5 міс.) і старих (22-24
міс.) щурів.

Примітка: 1 – молоді щури, 2 – старі щури Рис. 10. Динаміка відносної
оновлюваності (масова доля, %) тіаміну в тканинах печінки молодих (1-1,5
міс.) і старих (22-24 міс.) щурів.

Примітка: 1 – молоді щури, 2 – старі щури

Як у молодих, так і у старих щурів найбільшою оновлюваністю
характеризувалися мітохондрії печінки, потім – дванадцятипала кишка, і
найменшою – печінка.

Слід відмітити, що час, в який спостерігаються максимуми накопичення
тіаміну (рис. 1-4) в більшості випадків співпадає з періодами
максимальної відносної оновлюваності. Це дозволяє вважати природу
виникнення перших максимумів накопичення тіаміну пов’язаною зі
збільшенням швидкості його оновлення в органі, тобто з інтенсифікацією
метаболізму вітаміну.

Рис. 11. Динаміка відносної оновлюваності (масова доля, %) тіаміну в
мітохондріях печінки молодих (1-1,5 міс.) і старих (22-24 міс.) щурів.

Примітка: 1 – молоді щури, 2 – старі щури

Зв’язків між другими максимумами накопичення і оновлюваності тіаміну не
виявлено, що свідчить про наявність інших механізмів фіксації вітаміну в
органах у пізні строки після введення.

Окиснення 2-оксоглутарату в печінці та мітохондріях її клітин у щурів
різного віку після введення тіаміну з сумішшю вітамінів. Отримавши дані
про взаємодію суміші вітамінів при фіксації міченого тіаміну в тканинах
печінки та дванадцятипалої кишки, ми вирішили з’ясувати наявність такої
взаємодії на рівні функціонування мультиензимного
2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу, до якого вони входять.
Отримані дані, що представлені в табл. 1, свідчать про те, що у молодих
щурів швидкість окиснення 2-оксоглутарату збільшувалася в першу годину
дослідження після введення тіаміну, а у старих щурів – через 2-4 години.
Цей факт може бути пов’язаним з дефіцитом вітаміну В1 в організмі старих
щурів і з ослабленням енергетичних процесів і активного транспорту
тіаміну крізь біомембрани, що позначається на ефективності самозбирання
комплексу [Розанов А.Я. и др., 1968; Розанов А.Я. и др., 1969; Науменко
В.Ф., 1971; Литошенко А.Я., 1986; Розанов А.Я., 1987; Донцов В.И. и др.,
1998].

В мітохондріях клітин печінки контрольних щурів швидкість окиснення
2-оксоглутарату була вищою за таку в гомогенаті печінки майже в 3 рази,
як у молодих, так і у старих тварин (табл. 1).

Після внутрішньом’язового введення тіаміну відмічено різке збільшення
швидкості окиснення 2-оксоглутарату в мітохондріях печінки молодих і
старих щурів в 2 рази відповідно через 1 годину і 4 години.

Введення суміші вітамінів у біохімічно збалансованих співвідношеннях, що
характерні для дегідрогеназ 2-оксокислот, призвело до найбільшого
стимулюючого впливу на окиснення 2-оксоглутарату в печінці обох вікових
груп тварин через 2 години, але в більшій мірі – у старих щурів (табл.
2).

Таблиця 1

Окиснення 2-оксоглутарату в тканинах та мітохондріях печінки молодих
(1-1,5 міс.)

і старих (22-24 міс.) щурів після введення 35S-тіаміну в дозі 1,5 мкМ/кг

(нмоль відновленого ферицианіду / хв · мг білку) (M ± m, n=7)

Вікова група Досліджувані зразки Контроль Час, який минув після введення
тіаміну

1/4 год 1 год 2 год 4 год

Молоді щури Гомогенат 0,96±0,02 1,19±0,07* 1,60±0,12* 1,44±0,04*
1,21±0,09*

Мітохондрії 2,61±0,09 3,17±0,11* 4,19±0,27* 3,58±0,21* 3,23±0,30*

Старі щури Гомогенат 1,10±0,05 1,03±0,04 1,21±0,09 1,66±0,12 1,75±0,15*

Мітохондрії 2,92±0,10 3,25±0,30 4,96±0,25* 4,19±0,28* 5,90±0,16*

Примітка: * – Р?0,05 відносно контролю.

< ? ? 3/4 A " $ H ? I ’ ¶ u ue : < " $ ? I D ’ ue ???????ue ?????? ції тіаміну у старих тварин і уповільнення з віком печінково-кішкової рециркуляції. Після внутрішньом’язового введення 35S-тіаміну окремо і сумісного його введення з сумішшю вітамінів (табл. 1, 2) спостерігалося збільшення активності 2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу в мітохондріях печінки як у молодих, так і у старих щурів через 1 годину, а потім через 2 години і 4 години – у старих тварин. Ці дослідження підтвердили факт взаємодії суміші вітамінів, коферментні форми яких входять до складу дегідрогеназ 2-оксокислот, на рівні функціонування активності 2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу в тканинах. Окиснення 2-оксоглутарату в мітохондріях клітин печінки щурів різного віку під впливом коферментів in vitro. Результати дослідження цієї серії експериментів, що представлені в табл. 3, показали, що максимальна активність 2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу спостерігалася у старих щурів. Таблиця 2 Окиснення 2-оксоглутарату в тканинах та мітохондріях печінки молодих (1-1,5 міс.) і старих (22-24 міс.) щурів після введення 35S-тіаміну сумісно з сумішшю вітамінів (нмоль відновленого ферицианіду / хв · мг білку) (M ± m, n=7) Вікова група Досліджувані зразки Контроль Час, який минув після введення тіаміну з сумішшю вітамінів 1/4 год 1 год 2 год 4 год Молоді щури Гомогенат 0,96±0,02 1,07±0,08* 1,10±0,13* 1,62±0,17* 1,60±0,17* Мітохондрії 2,61±0,09 4,02±0,09* 5,58±0,42* 4,98±0,18* 3,65±0,28* Старі щури Гомогенат 1,10±0,05 1,30±0,11 1,60±0,12* 2,01±0,19* 1,35±0,21* Мітохондрії 2,92±0,10 4,29±0,27* 6,81±0,25* 7,74±0,26* 7,34±0,28* Примітка: * – Р?0,05 відносно контролю. При додаванні in vitro до мітохондрій окремих коферментів та їх суміші у співвідношенні, характерному для дегідрогеназ 2-оксокислот, ми відмітили, що ефект добавок коферментів був найбільш виразний у старих тварин (табл. 3), хоча збільшення швидкості окиснення 2-оксоглутарату в мітохондріях печінки мало місце як у молодих, так і у статевозрілих тварин. Необхідно зазначити, що при додаванні in vitro окремих коферментів до мітохондрій печінки щурів різного віку, тільки ліпоєва кислота і КоА суттєво впливали на швидкість окиснення 2-оксоглутарату. Таблиця 3 Окиснення 2-оксоглутарату в мітохондріях печінки щурів різного віку після внесення коферментів in vitro (нмоль відновленого ферицианіду / хв · мг білку) (M ± m, n=8) Вікова група Варіант досліду ЛК КоА НАД ТПФ ФМН Суміш коферментів Молоді (1-1,5 міс.) контроль 2,95±0,24 3,00±0,27 2,84±0,26 2,98±0,27 3,09±0,28 3,12±0,29 дослід 5,33±0,41* 5,87±0,46* 3,01±0,30 3,20±0,29 3,11±0,30 6,93±0,61* Статевозрілі (6-8 міс.) контроль 3,12±0,27 3,64±0,31 3,40±0,35 3,68±0,34 3,29±0,30 3,97±0,32 дослід 6,97±0,44* 6,44±0,43* 3,83±0,22 4,02±0,33 3,41±0,16 6,74±0,34* Старі (22-24 міс.) контроль 3,87±0,35 4,06±0,38 4,42±0,43 4,28±0,38 3,95±0,36 4,45±0,42 дослід 8,00±0,75* 7,74±0,69* 5,34±0,48 4,51±0,39 4,12±0,40 8,38±0,77* Примітка: * – Р?0,05 відносно контролю. Подальші дослідження впливу окремих коферментів та їх комплекса на окиснення 2-оксоглутарату ми провели на частково очищеному препараті 2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу, а також досліджували особливості включення мічених метаболітів тіаміну в 2-оксоглутаратдегідрогеназний комплекс після введення щурам 14С-тіаміну, як окремо так і сумісно з сумішшю вітамінів. Включення мічених метаболітів тіаміну в 2-оксоглутаратдегідрогеназний комплекс після введення щурам 14С-тіаміну і з сумішшю вітамінів. Якщо порівнювати питому активність ферменту за стадіями виділення, то є очевидним факт її збільшення. Так, у субкомплексі: (ПДК+2-ОГДК) – в середньому на 110 %, а в частково очищеному препараті – 228 % порівняно з мітохондріальною фракцією (табл. 4). Таблиця 4 Активність 2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу на різних етапах виділення (M ± m, n = 50) Фракції Введення 14С-тіаміну (контроль) Введення 14С-тіаміну з сумішшю вітамінів Активність, нмоль НАДН/ хв мг білку Вміст 14С-тіаміну, нг/мг білку Активність, нмоль НАДН / хв мг білку Вміст 14С-тіаміну нг/мг білку Гомогенат 0,94±0,05 1,80±0,07 1,32±0,07* 5,15±0,21* Мітохондрії 4,00±0,18 115,39±5,20 6,32±0,29* 173,08±7,80* Комплекс ПДК+ 2-ОГДК 8,40±0,42 240,39±10,80 13,2±0,60* 288,50±14,40* 2-ОГДК 13,13±0,53 288,46±11,55 16,2±0,81* 384,61±15,35* Примітка: * – Р?0,05 відносно контролю. Встановлено синхронне збільшення вмісту мічених метаболітів тіаміну на мг білку і збільшення активності фермента по мірі очищення. Так, у субкомплексі: (ПДК+2-ОГДК) мічених метаболітів тіаміну містилося в середньому на 108 % більше, а в очищеному 2-ОГДК – на 150 % більше в порівнянні з мітохондріальною фракцією. Отримані результати, на наш погляд, не тільки віддзеркалюють особливості механізмів транспорту і метаболізму тіаміну при проходженні його крізь мітохондріальні мембрани, але і включення його в тіамін-залежні ферменти: транскетолазу, декарбоксилазний компонент 2-ОГДК і таке інше. Після введення тваринам 14С-тіаміну сумісно з сумішшю вітамінів ми також констатували збільшення активності 2-ОГДК по ходу виділення у фракціях: субкомплекс (ПДК+2-ОГДК) і 2-ОГДК – в середньому на 109 % і 157 %, відповідно, в порівнянні з мітохондріальною фракцією (табл. 4). Сумарний вміст мічених метаболітів тіаміну при цьому також підвищувався: у субкомплексі (ПДК+2-ОГДК) – на 66 %, а в 2-ОГДК – на 122 % у порівнянні з мітохондріальною фракцією. Сумісне введення 14С-тіаміну з сумішшю вітамінів сприяло підвищенню активності ферменту в мітохондріях, субкомплексі (ПДК+2-ОГДК) і очищеному 2-ОГДК на 58 %, 57 % і 23 % відповідно, порівняно з введенням самого 14С-тіаміну. Вміст мічених метаболітів тіаміну також збільшувався в ході очищення препарату: на 50 % - у мітохондріальній фракції, на 20 % - у субкомплексі (ПДК+2-ОГДК) і на 33 % – у 2-ОГДК. На цьому етапі дослідження активності ферментного ансамблю був доведений факт взаємодії вітамінів на рівні їх коферментних форм, що призводить, в решті решт, до збільшення активності 2-ОГДК у більшій мірі у випадку введення суміші вітамінів, ніж після введення 14С-тіаміну самого. Вплив коферментів на активність очищеного 2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу. 2-оксоглутаратдегідрогеназний комплекс був виділений за методом Роше і Кейт [Roche I.E., Cate R.J., 1977] з питомою активністю 315 нмоль / хв · мг білку із 50 статевозрілих щурів лінії Wistar. Вимірювання активності ферментного комплексу проводили за тестом Варбурга [Островский Ю.М., 1979]. Додання in vitro окремих коферментів в інкубаційне середовище до очищеного 2-ОГДК призводило до помітного збільшення активності ферменту тільки у випадку ліпоєвої кислоти (50 %), а ТПФ, НАД і особливо ФМН навіть пригнічували активність 2-ОГДК (рис. 12). Рис. 12. Активність 2-ОГДК, виділеного з печінки статевозрілих (6-8 міс.) щурів, після додання коферментів in vitro. Рис. 13. Активність 2-ОГДК, виділеного з печінки статевозрілих (6-8 міс.) щурів, після додання попарно поєднаних коферментів і загальної суміші коферментів in vitro При додаванні до середовища інкубації коферментів попарно у різних сполученнях найбільш ефективними були: (КоА+ТПФ), (КоА+ЛК), (КоА+НАД) – відповідно збільшення активності ферменту відносно контролю в середньому складало: 204 %, 108 % і 30 % (рис. 13). ФМН у сполученні з ТПФ і навіть з ЛК пригнічував активність ферменту на 52 % і 11 %, відповідно. Суміш коферментів, які додавали у сполученні, характерному для дегідрогеназ 2-оксокислот, збільшувала активність 2-ОГДК більш ніж у 10 разів. Отримані дані демонструють, на наш погляд, різноспрямованість дії окремих коферментів на активність очищеного комплексу і можуть свідчити, з одного боку, про часткову їх втрату в більшій чи меншій мірі по ходу виділення ферментного комплексу, з іншого боку, ТПФ, НАД, ФАД – міцно зв’язані із субодиницями ферментного комплексу, і додаткове внесення їх до комплексу призводить до дисбалансу і, як наслідок, до зниження активності 2-ОГДК. Особливої уваги заслуговує ЛК, стимулюючий ефект якої не можна пояснити тільки з позиції втрачання коферменту при виділенні ферментного комплексу. Очевидно, через її специфічне розташування і функціонування на рівні трансацетилазного і ліпоїлдегідрогеназного компонентів у комплексі визначається найважливіша роль ЛК у особливому – коферментному типі регуляції досліджуваного мультиензимного ансамблю. Суміш усіх коферментів, які додавали у співвідношеннях, що характерні для 2-ОГДК, характеризувалася найбільшим ефектом. Цей факт свідчить не тільки про коферментну регуляцію мультиензимного комплексу, але й демонструє можливість реасоціації субодиниць з відповідними коферментами в активний поліферментний 2-оксоглутаратдегідрогеназний комплекс. Роль мітохондріальних мембран у реасоціації субодиниць 2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу в функціональний поліферментний комплекс. Для вивчення ролі мітохондріальних мембран у процесах взаємодії субодиниць 2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу з відповідними коферментами застосовували очищений препарат 2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу. Поліферментеий комплекс обробляли сухим KBr до 0,5 М насичення, потім розділяли його на субодиниці фракціонуванням сульфатом амонію. Отримані субкомплекс (Е1+Е2) і компонент Е3 діалізували для видалення KBr. Для з’ясування ролі мітохондріальних мембран у процесах самозбирання 2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу і взаємодії субодиниць і коферментів визначали активність 2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу в присутності “виснажених” мембран мітохондрій, отриманих з печінки щурів шляхом холодної одногодинної інкубації в K-Na-фосфатному буфері, і без них. Ферментативну активність визначали після 60-хвилинної інкубації субодиниць сумісно з коферментами і “виснаженими” мітохондріями тестом Варбурга. Рис. 14. Активність 2-ОГДК при інкубації з коферментами і мітохондріальними мембранами (нмоль НАДН /хв · мг білку) Примітка: 1 – 2-ОГДК (до розділення) + суміш коферментів; 2 – (Е1 + Е2) + Е3 + суміш коферментів; 3 – (Е1 + Е2) + Е3 + суміш коферментів + мембрани “виснажених” мітохондрій. Ці дані свідчать про взаємодію субодиниць 2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу, відповідних коферментів на мітохондріальних мембранах і реасоциацію мультиензимного комплексу. ВИСНОВКИ Дослідження взаємодії тіаміну з сумішшю вітамінів реалізуються in vivo та in vitro на тканинному, субклітинному рівнях, а також на рівні очищеного 2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу. В основі цих взаємодій полягають різні міжвітамінні взаємовідносини, але особливе місце серед них належить самосборці мультиензимних комплексів з коферментів і апоферментних білків. Фазність динаміки включення 35S-тіаміну у тканини дванадцятипалої кишки і печінки характерна для молодих (1-1,5 міс.) і старих (22-24 міс.) щурів, причому строки настання максимумів співпадають з такими у мітохондріях. Відмічено суттєве збільшення вмісту мічених метаболітів тіаміну в гепатоцитах, клітинах дванадцятипалої кишки і мітохондріях з них після сумісного введення 35S-тіаміну з вітамінами у молодих (1-1,5 міс.) і старих (22-24 міс.) щурів. Найбільшою швидкістю оновлюваності тіаміну характеризувались у порядку зменшення: мітохондрії печінки, дванадцятипала кишка, печінка як у молодих (1-1,5 міс.), так і старих (22-24 міс.) щурів. Максимуми накопичення 35S-тіаміну у тканинах печінки та дванадцятипалої кишки щурів співпадають з періодами максимальної його відносної оновлюваності. Збільшення швидкості окиснення 2-оксоглутарату в гепатоцитах і мітохондріях печінки відмічено в обох вікових групах тварин як після введення 35S-тіаміну, так і, особливо, після його сумісного застосування з вітамінами. Виражений стимулюючий ефект на окиснення 2-оксоглутарату в мітохондріях печінки і на рівні очищеного фермента спричиняли ліпоєва кислота, коензим ацилювання і особливо суміш всіх коферментів у щурів усіх вікових груп. Реасоціація мультиензимного 2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу потребує присутності як усіх коферментів, що входять до його складу, так і фрагментів мітохондріальних мембран. Збільшення вмісту мічених метаболітів тіаміну і активності 2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу при його виділенні та очищенні, а також стимулюючий ефект введених вітамінів in vivo і добавлених in vitro у відповідному 2-оксоглутаратдегідрогеназному співвідношенні відповідних коферментів до очищеного ферментного комплексу, вказує на існування реасоціації субодиниць у функціональний поліферментний комплекс. СПИСОК ОПУБЛ(КОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦ(Ї Розанов А.Я., Федорко Н.Л., Петров С.А. Онтогенетические особенности накопления и обновления тиамина в органах пищеварительной системы белых крыс. // Физиологич. журн. – 1989. – Т. 35, № 1. – С. 68-71. (Федорко Н.Л. Виконала експеримент щодо визначення тіаміну та оновлення його у тканинах та мітохондріях печінки білих щурів різного віку, частковий аналіз і узагальнення отриманих результатів, підготовка статті до друку) Петров С.А., Федорко Н.Л., Семерюк І.А. Вивчення зв’язування тіаміна та його метаболітів клітинами крові і мітохондріями печінки білих щурів. // Укр. біохім. журн. – 1991. – Т. 63, № 3. – С. 109-113. (Федорко Н.Л. провела експериментальну роботу по включенню тіаміну та його метаболітів в мітохондрії печінки білих щурів, частковий аналіз і узагальнення отриманих результатів, підготовка статті до друку) Абдулла Саммак Ахмед, Карпов Л.М., Федорко Н.Л., Васильева Т.В. Возрастные особенности протекторного действия комплекса витаминов при аллоксановом диабете крыс. // Вістник Одеського національного університету імені І. І. Мечникова. – 2002. – Т. 7, вип. 1. – С. 207-211. (Федорко Н.Л. проведено експериментальні роботи по визначенню активності дегідрогеназ 2-оксокислот: ПДК, 2-ОГДК, частковий аналіз і узагальнення отриманих результатів, підготовка статті до друку) Федорко Н.Л. Вітамінно-коферментна корекція активності піруватдегідрогеназного комплексу в органах щурів в онтогенезі. // Вісник Одеського національного університету імені І. І. Мечникова. – 2003. – Т. 8, вип. 1. – С. 28-33. Федорко Н.Л., Петров С.А. Взаємодія коферментів 2-оксоглутаратдегідрогенази на рівні мультиензимного комплексу та в мітохондріях печінки. // Вісник Одеського національного університету імені І. І. Мечникова. – 2004. – Т. 9, вип. 1. – С. 47-57. (Федорко Н.Л. проведено єксперименти по виділенню загальної фракції мітохондрій печінки статевозрілих щурів та 2-ОГДК, частковий аналіз і узагальнення отриманих результатів, підготовка статті до друку) Розанов А.Я., Гандірук Н.Г., Петров С.А., Шаталова Н.Л., Запорожченко О.В., Цепколенко В.О., Кравченко Н.О. Надходження і трансформація 35S-ліпоєвої кислоти у тканини та мітохондрії травної системи в геронтогенезі при гіпоксії та наркозі // Мат. ІV Українського біохім. з’їзду. – Київ: Наукова думка, 1982. – Ч. 2. – С. 160. Розанов А.Я., Федорко Н.Л. Транспорт, метаболизм и рецепция митохондриями в пищеварительной системе коферментных пируватдегидрогеназе витаминов в геронтогенезе // Мат. ІV Всесоюз. съезда геронтологов и гериатров. – Кишинев: Штиинца, 1982. – С. 33. Федорко Н.Л. Субклеточное распределение ?-кетоглутаратдегидрогеназы печени крысы. // Тр. Итоговой науч. конф. молодых ученых Одесского государственного университета имени И.И. Мечникова. – Одесса: Одесского государственного университета имени И.И. Мечникова, 1984. – С. 45 Федорко Н.Л. Взаимодействие 14С-тиамина с инъецированными функционально связанными витаминами при окислении 2-оксоглутарата митохондриями печени крыс в геронтогенезе. // Тр. XI отчетной науч. конф. профессорско-преподавательского состава Одесского государственного университета имени И.И. Мечникова. – Одесса: Одесский государственный университет имени И.И. Мечникова, 1985.– С.38. Розанов А.Я., Федорко Н.Л., Кравченко Н.О., Карпов Л.М. Активність 2-оксоглутаратдегідрогенази та піруватдегідрогенази у цитозолі, рибосомах та мітохондріях печінки щурів як показник можливої міграції їх субодиниць у клітини. // Мат. V Укр. біохім. з’їзду. – Київ: Інститут біохімії АН УССР, 1987. – Ч. 2. – С. 184. Rozanov A.Ya., Petrov S.A., Kravchenko N.A., Fedorko N.L. Reconstruction of ?-ketoacid dehydrogenase complexes as a regulation mechanism of the cells energy metabolism.// Proc. 14-th Intern. Congress of Bioch. – Prague (Chechoslovakia), 1988. – P. 187. Petrov S.A., Kravchenko N.A., Fedorko N.L. Coenzymic and noncoenzymic regulation of pyruvate metabolism by thiamine metabolites // Proc. FEBS’89. 19th meeting. – Rome (Italia), 1989. – Abstract Book. – TU. – Р. 218. Кравченко Н.А., Федорко Н.Л., Хотько А.И., Петров С.А. Применение комплекса витаминов и их метаболитов для коррекции нарушений энергетики клетки при старении // Тр. Всесоюз. конф. “Продолжительность жизни: механизмы, прогнозы, пути увеличения”. – Киев: Институт геронтологии АМН СССР, 1991. – С. 66. Розанов А.Я., Петров С.А., Запорожченко О.В., Кравченко Н.О., Федорко Н.Л., Елькіна В.О., Погба С., Абу Асалі І.І. Транспорт у головний мозок і біохімічні функції в нейроструктурах вітамінно-метаболітних препаратів при екстремальних умовах. // Мат. VI Укр. біохім. з’їзду. – Київ: вид. УСГА, 1992. – Ч. 1. – С. 140. Карпов Л.М., Запорожченко О.В., Розанов А.Я., Тищенко Д.В., Савлучинська Л.Г., Федорко Н.Л. Вітаміни та їх похідні як потенційні геропротектори. // Пр. конф. “Геропротектори у попередженні прискореного старіння”. – Одеса: Астропрінт, 1996. – С. 2. Федорко Н.Л., Карпов Л.М., Кравченко Н.О., Савлучинська Л.Г. Структурно-функціональна перебудова мітохондрій з органів білих щурів за умов їх старіння. // Пр. Симп. “Біологічні механізми старіння”. – Харків: Харківський державний університет імені В. Н. Каразіна, 1996. – С. 133. Карпов Л.М., Савлучинская Л.Г., Федорко Н.Л., Сорокин А.В., Будняк А.К., Кокошкина О.А., Шландакова В.Г. Коферментзависимые ферменты и старение. // Тр. V междунар. симп. “Биологические механизмы старения”. – Харьков: Харьковский национальный университет имени В. Н. Каразина, 2002. – С. 32. Прокопчук Т.Г., Федорко Н.Л. Активность ПДК и 2-ОГДК из печени крыс разного возраста. // Тр. конф. молодых ученых “Актуальные проблемы естествознания – 2003”. – Симферополь: Крымский национальный университет, 2003. – С. 73. АНОТАЦІЯ Федорко Н.Л. Вікові особливості вітамінної і коферментної регуляції 2-оксоглутаратдегідрогеназного комплекса в печінці і дванадцятипалій кишці щурів. - Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за фахом 03.00.04 – біохімія. Харківський національний університет імені В. Н. Каразіна, Харків, 2005. Дисертацію присвячено вивченню механізмів взаємодії суміші вітамінів при фіксації тіаміну в тканинах, його фосфатів в мітохондріях і реасоціації мультиензимного 2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу на мітохондріальних мембранах. В результаті проведених досліджень вперше були отримані дані про онтогенетичні особливості впливу суміші вітамінів в “2-оксоглутаратдегідрогеназному співвідношенні” на динаміку розподілу тіаміну в тканинах і мітохондріях печінці та дванадцятипалої кишки. Оцінено оновлення тіаміну, що віддзеркалює особливості накопичення і утримування вітаміну в тканинах печінки і дванадцятипалої кишки щурів різного віку. Досліджено взаємодію коферментів дегідрогеназ 2-оксокислот у мітохондріях на рівні фіксації тіаміндифосфату і окиснення 2-оксоглутарату. Вперше отримано дані, які підтверджують існування реасоціації мультиензимного 2-оксоглутаратдегідрогеназного комплексу на мітохондріальних мембранах. Ключові слова: 2-оксоглутаратдегідрогеназа, коферменти, мітохондрії, тіамін, вітаміни. АННОТАЦИЯ Федорко Н.Л. Возрастные особенности витаминной и коферментной регуляции 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса в печени и двенадцатиперстной кишке крыс. - Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. Харьковский национальный университет имени В. Н. Каразина, Харьков, 2005. Диссертация посвящена изучению механизмов взаимодействия тиамина с витаминами, коферментные формы которых входят в состав 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса на уровне его фиксации в тканях печени и двенадцатиперстной кишки, его фосфатов в митохондриях и реасоциации ферментного комплекса на митохондриальных мембранах. Было показано, что включение 35S-тиамина в ткани и митохондрии печени и двенадцатиперстной кишки крыс разного возраста характеризуется двухфазной динамикой, но в большей степени это выражено у молодых крыс. В тканях двенадцатиперстной кишки меченый тиамин удерживался более продолжительно у старых крыс, вплоть до 24 часового срока исследования. Максимумы накопления 35S-тиамина в митохондриях печени и двенадцатиперстной кишки синхронны с таковыми в тканях у обеих возрастных групп крыс. Введение меченого тиамина совместно со смесью витаминов существенно увеличивало содержание меченых метаболитов тиамина как в тканях, так и в митохондриях печени и двенадцатиперстной кишки у обеих возрастных групп животных, но в большей мере у старых крыс. Расчет относительной обновляемости тиамина в исследуемых тканях и митохондриях показал, что она наибольшая в митохондриях печени, затем в двенадцатиперстной кишке и печени как у молодых, так и у старых крыс, но у молодых крыс этот процесс протекал интенсивнее. Эти результаты показали, что только первые максимумы накопления тиамина в исследуемых тканях и митохондриях совпадают с периодами его относительной обновляемости у обеих возрастных групп животных, что косвенно свидетельствует о том, что первый максимум накопления может быть связан с усиленной обновляемостью тиамина. Изучение окисления 2-оксоглутарата в исследуемых тканях и митохондриях подтвердило взаимосинергичные взаимоотношения витаминов. Исследование влияния отдельных коферментных форм витаминов и их смеси на окисление 2-оксоглутарата показало, что существенній стимулирующий эффект на 2-оксоглутаратдегидрогеназный комплекс in vitro оказывали КоА, ЛК и смесь коферментов, взятых в соотношении, характерном для 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса, для обеих возрастных групп животных, однако в большей мере - у старых крыс. Введение меченого тиамина и особенно совместно со смесью витаминов приводило к увеличению суммы меченых его метаболитов и увеличению активности 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса по этапам выделения ферментного ансамбля. На очищенном ферментном препарате показано увеличение его активности после добавления in vitro смеси коферментов с наибольшим вкладом липоевой кислоты. Показана реассоциация субъединиц 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса и смеси коферментов в присутствии “истощенных” митохондриальных мембран в активный ферментный ансамбль. Полученные результаты исследований свидетельствуют не только о витаминной и коферментной регуляции мультиэнзимного комплекса, но и возможной реассоциации 2- оксоглутаратдегидрогеназного комплекса из субъединиц в присутствии всех пяти необходимых коферментов на митохондриальных мембранах. Ключевые слова: 2-оксоглутаратдегидрогеназа, коферменты, митохондрии, тиамин, витамины. SUMMARY Fedorko N.L. Age features of vitamin and other coenzyme regulation of 2-oxoglutarate dehydrogenase complex in rat liver and duodenum. - Manuscript. The thesis for a degree of candidate of science in biology by speciality – 03.00.04 – biochemistry. Kharkov National University by V.N. Karazin. Kharkov, 2005. Thesis is devoted to investigation of interaction mechanisms of mixture of vitamins under fixation of thiamine in tissues and its phosphates in mitochondria and multienzyme 2-OGDH on mitochondrial membranes. As the result of prospected investigations there was first obtained data about age features of mixture of vitamins influence on dynamics of thiamine distribution in digestive system tissues. It was evaluated thiamine renewal that reflects character of accumulation and holding of the vitamin in tissues of digestive system of different age rats. It was researched the interaction of 2-oxoacid dehydrogenases coenzymes in mitochondria on the level of thiamindiphosphate fixation and 2-oxoglutarate oxidizing. It was first obtained data that affirm the reassociation of multienzyme 2-oxoglutarate dehydrogenase complex on mitochondrial membranes. Key words: 2-oxoglutarate dehydrogenase, coenzymes, mitochondria, thiamine, vitamins. PAGE 1 1 2 [35S-тіамін], мкг/г тканини [35S-тіамін], мкг/г тканини 2 1 2 1 [35S-тіамін], мкг/г тканини [35S-тіамін], мкг/г тканини 1 2 [35S-тіамін], мкг/г тканини 2 1 [35S-тіамін], мкг/г тканини 2 1 [35S-тіамін], мкг/г тканини [35S-тіамін], мкг/г тканини 2 2 1 1 масова доля, % 2 1 масова доля, % 2 1 1 2 масова доля, % * * * * * * * * * * * *

Похожие записи