.

Ультраструктурні та гістологічні особливості реакції надниркових залоз птахів на стрес (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 3296
Скачать документ

Київський національний університет імені Тараса Шевченка

ВОРОНІНА ОЛЕНА КОСТЯНТИНІВНА

УДК 612.451[57.012.4+591.8]591.445:598.26

Ультраструктурні та гістологічні особливості реакції надниркових залоз
птахів на стрес

03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2004

Дисертація є рукописом

Робота виконана в Київському національному

університеті імені Тараса Шевченка

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Дзержинський Микола Едуардович

Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

завідувач кафедри цитології, гістології та біології розвитку

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Богданова Тетяна Іванівна,

Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П.Комісаренка

АМН України, завідувач лабораторії морфології ендокринної системи

доктор біологічних наук

Квітницька-Рижова Тетяна Юріївна,

Інститут геронтології АМН України,

завідувач лабораторії морфології та цитології

Провідна установа: Національний аграрний університет

Кабінету Міністрів України, м.Київ

Захист дисертації відбудеться 26 січня 2005 року о 14 годині на
засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 у Київському національному

університеті імені Тараса Шевченка за адресою:

03022, Київ, проспект академіка Глушкова, 2/12,

біологічний факультет, ауд.215.

Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул.Володимирська, 64, біологічний
факультет,

Спецрада Д 26.001.38, біологічний факультет

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного

університету імені Тараса Шевченка за адресою: 01033, Київ, вул.
Володимирська, 58.

Автореферат розісланий 24 грудня 2004 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Цимбалюк О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Стрес-реакція являє собою важливе еволюційне надбання
та складає необхідну ланку у процесі адаптації до змін довкілля (Селье,
1960). Механізми підтримки гомеостазу та пристосування до оточуючого
середовища мають загальнобіологічне значення, а також являють собою
важливу проблему клінічної практики, адже надто інтенсивний стрес може
приводити до патологічних змін, і розробка методів запобігання
стресорним пошкодженням системи і органів організму є обов’язковою
задачею фізіології та медицини (Меєрсон, 1988).

Адаптаційні реакції виявляються на всіх рівнях організації, включаючи
всі системи та органи, але провідне місце у розвитку стресорної
відповіді належить симпато-адреналовій і гіпоталамо-адренокортикальній
системам, основним структурним компонентом яких є надниркові залози.

Уявлення про механізми розвитку стресорної реакції складені переважно
роботами на ссавцях, однак, відомо, що компоненти гіпоталамо-адреналової
системи (ГАС) птахів характеризуються деякими морфологічними та
фізіологічними особливостями (Soest et al., 1973; Knight et al., 1981;
Sharp et al., 1984; Kiss, Peczely, 1987; Moons et al., 1994; Montagnese,
Csillag, 1996), тому вивчення особливостей адаптації у птахів являє
очевидний науковий інтерес.

Класична, описана Гансом Сельє адаптація до стресових ситуацій включає
комплекс неспецифічних реакцій (загальний адаптаційний синдром, ЗАС),
серед яких обов’язковими є гіперсекреція адреналових глюкокортикоїдних і
катехоламінових гормонів, що вважають основним принципом реагування
організму на стрес (Селье, 1960; Филаретов, Данилова, 1994; Murakami et
al., 1997; Mc Cann et al., 2000; Moestl, Palme, 2003). Останнім часом
з’явились роботи, в яких намагаються охарактеризувати специфічні
особливості протікання стрес-реакцій, ініційованих стресорами різної
природи (Li et al., 1996; Pacak, Palkovits, 2001; Marquez et al., 2002;
Dunn, 2004). Але слід зазначити, що систематичні дослідження у цьому
напрямку нечисленні, недостатньо розроблена проблема стандартизації
оцінки ефектів стресу, оцінки функціональної активності компонентів
тканини наднирників птахів, а зпівставлення результатів проблематичне
через різноманітність використаних моделей, видових, вікових і статевих
особливостей тварин.

Враховуючи недостатність детальних і комплексних порівняльних досліджень
фізіологічних особливостей розвитку адаптаційних реакцій, викликаних
різними стресорами, актуальність систематичних досліджень у цьому
напрямку безсумнівна.

Зв’язок роботи з науковими програмами. Робота виконана на кафедрі
цитології, гістології та біології розвитку в рамках комплексної наукової
програми Київського національного університету імені Тараса Шевченка
“Здоров’я людини”. Назва науково-дослідної теми: “Дослідження первинних
процесів цитофізіологічних ефектів пестицидів як шкідливих факторів
довкілля”. Назва підрозділу: “Роль моноамінергічних систем головного
мозку в гіпоталамічному контролі стресорних реакцій у наднирковій і
щитовидній залозах та епіфізарної регуляції гонад в онтогенезі” (№ теми
01БФ033-02, № держреєстрації 0102 U 001161).

Мета та задачі дослідження. З’ясувати хронологію та оцінити особливості
фізіологічних подій та участь інтерренального та хромафінного
компонентів надниркових залоз птахів у розвитку стрес-реакції.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі задачі:

1. Провести моніторинг фізіологічних подій, що мають місце у розвитку
стрес-реакції, викликаної разовим охолодженням тіла у птахів.

2. Дослідити динаміку фізіологічних подій, які відбуваються при розвитку
стрес-реакції, спричиненої разовою іммобілізацією тіла птахів.

3. Проаналізувати відмінності протікання стресорних відповідей організму
птахів на охолодження та іммобілізацію тіла.

4. Шляхом гістологічного та ультраструктурного аналізу ефектів
фармаколо-гічної стимуляції або блокади функціональної активності
глюкокортикоїд-, мінералокортикоїд-продукуючих клітин інтерренальної
тканини та катехоламін-секретуючих клітин хромафінної тканини наднирника
птахів оцінити участь їх у розвитку стрес-реакції.

Об’єкт дослідження: закономірності розвитку стрес-реакції у птахів.

Предмет дослідження: перебіг фізіологічних подій у ході розвитку
стрес-реакції та фармакологічна їх модуляція, аналіз специфічності дії
різних стресорів.

Методи дослідження: гістологічні, морфометричні,
електронномікроскопічні, біохімічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Використані експериментальні
моделі дозволили проаналізувати та порівняти перебіг фізіологічних подій
при дії різних стресорних ситуацій. Результати аналізу морфологічних і
функціональних характеристик ГАС птахів дозволяють припустити існування
особливостей у розвитку стрес-реакцій, викликаних гострими холодовим та
іммобілізаційним стресорами, що доповнює попередні роботи (наприклад, Li
et al., 1996; Chrousos, 1998; Dubrovsky, 2000; Pacak, Palkovits, 2001;
Marquez et al., 2002). Відмінності між стрес-реакціями, спричиненими
охолодженням та іммобілізацією, полягають у особливостях динаміки та
ступеню вираженості адаптивних змін. Крім того, вперше проведено
порівняльне гістологічне, ультраструктурне та біохімічне дослідження
ефектів фармакологічної стимуляції або пригнічення активності
кортикостероїд (КС)- та катехоламін (КА)-продукуючих клітин наднирників
птахів. Отримані нові дані про ультраструктурні особливості реакції
адреналових клітин птахів на холодовий стрес, а також ефекти
фармакологічної модуляції активності КС- і КА-продукуючих клітин
наднирників. Вперше показана роль хронічних ін’єкцій спіронолактону,
еналаприлу, цититону та метилдопа на функції клітин наднирників птахів у
нормі та при холодовому стресі. Зроблено припущення про те, що у тих
самих адренокортикоцитах птахів залежно від потреб можуть продукуватись
глюкокортикоїди або мінералокортикоїди, на відміну від ссавців.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Представлені
результати дисертаційної роботи мають теоретичне значення, оскільки
поглиблюють сучасні уявлення про фундаментальне питання про участь
гіпоталамо-адреналової ланки нейроендокринної системи птахів у розвитку
стрес-реакції, про особливості фізіологічних подій у ході адаптивної
відповіді організму птахів, а також практичне застосування – насамперед,
як теоретична підстава для розробки схем використання фармакологічних
препаратів у медичній або ветеринарній практиці, а також як передумова
для розробки схем безстресового утримання сільськогосподарських птахів.

Матеріали дисертації використовуються при читанні спецкурсів
“Спецгістологія” та “Гістофізіологія нейроендокринної системи” на
кафедрі цитології, гістології та біології розвитку біологічного
факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проаналізована спеціальна
література за темою дисертації, проведено планування експерименту,
гістологічний та морфометричний аналіз матеріалу, статистичну обробку та
аналіз отриманих даних, а також написана дисертаційна робота. Проведення
хронічного експерименту здійснено спільно з науковою групою кафедри
цитології, гістології та біології розвитку біологічного факультету
Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Визначення рівнів адреналових гормонів проведено на базі лабораторії
біохімії ендокринної системи Інституту ендокринології та обміну речовин
ім. В.П.Комісаренка АМНУ (керівник лабораторії – д.б.н. Т.М.Мішуніна).
Електронно-мікроскопічний аналіз матеріалу проведений на базі
лабораторії електронної мікроскопії Національного медичного університету
ім. О.О.Богомольця (керівник лабораторії – д.б.н., проф. Л.О.Стеченко).

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, включені до
дисертації, доповідались на 21-й конференції Європейського товариства
порівняльних ендокринологів (Бонн, Німеччина, 2002); Всеукраїнській
науковій конференції “Психофізіологічні та вісцеральні функції в нормі і
патології” (Київ, 2002); Х-й студентській науковій конференції
Української асоціації народної медицини (Київ, 2003); Міжнародній
конференції “Центральні та периферичні механізми вегетативної нервової
системи” (Донецьк, 2003); ІІІ-й Всеросійській конференції з міжнародною
участю “Механизмы функционирования висцеральных систем”
(Санкт-Петербург, Россия, 2003), конференції професорсько-викладацького
складу біологічного факультету Київського національного університету
імені Тараса Шевченка (Київ, 2004).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 8 робіт: 3 статті у
наукових фахових журналах, рекомендованих ВАК України, та збірниках
наукових праць і 5 тез доповідей на наукових конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду
літератури, опису матеріалів і методів дослідження, експериментальної
частини, підсумкового розділу, висновків та списку використаних джерел.
Основний текст дисертації складає 143 сторінки, робота ілюстрована 65
рисунками, серед яких 50 мікрофотографій, і 1 таблицею. Перелік посилань
включає 233 першоджерела, серед яких 62 роботи авторів України та країн
СНД і 171 роботу іноземних авторів.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Об’єкт дослідження. Відповідно до мети та задач дослідження експерименти
проводили на самцях курей (Gallus domesticus) породи білий легорн
14-денного віку постнатального розвитку. За даними літератури, птахи
такого віку є нестатевозрілими та характеризуються оформленими
морфологічно та фізіологічно компонентами
гіпоталамо-аденогіпофізарно-адреналової системи. Крім того, відомо, що
саме у цей ранній період постнатального розвитку встановлюються
регуляторні взаємозв’язки між центральними та периферичними ланками
системи (Прошлякова, 1976; Fellmann et al., 1984; Антонова, Козлов,
1985; Cronshaw et al., 1989; Угрюмов, 1989, 1999; Hutchison, 1991;
Allaerts et al., 1999).

З першого дня після народження усіх птахів утримували разом в умовах
віварію, при мінімальних стресорних умовах, на стандартному раціоні з
вільним доступом до комбікорму та води, при постійному освітленні та
температурі приміщення +25оС. Птахів випадково відбирали з загальної
зграї безпосередньо перед початком експерименту. Експеримент проводили у
ранкові години. У дослідах використовували виключно самців, щоб
виключити можливий вплив статевих циклів, властивих самицям, на
регуляторні взаємодії між досліджуваними ланками системи (Patchev,
Almeida, 1996; Almeida et al., 1997). Усього було використано 172 птахи
– по 3-5 птахів у кожній експериментальній групі.

Для вирішення поставлених у роботі задач були застосовані такі
експериментальні моделі: 1) окремі моделі гострого охолодженням та
іммобілізації птахів; 2) модель розвитку стрес-реакції на фоні
фармакологічної модуляції секреторної активності клітин інтерренальної
та хромафінної (ХА) тканини надниркової залози птахів.

Моделі гострого охолодженням та іммобілізації птахів. З метою
ініціювання у піддослідних птахів стрес-реакції та оцінки особливостей
її розвитку застосовували окремо два різних стресора:

охолодження птахів при –20оС, для чого птахів окремо поміщали у
морозильну камеру;

одноразова іммобілізація (примусове знерухомлення), для чого птахів
загортали у трубку з аркуша м’якого білого паперу та залишали у
згорнутому стані у горизонтальному положенні (Pacak, Palkovits, 2001).

В обох випадках перед початком експериментального впливу, через 5, 10,
30 та 60 хв. після його початку, а також через 60 хв. після припинення
60-хвилинного експерименту частину птахів декапітували, після чого
відбирали їх кров для аналізу рівнів гормонів і органи для
гістологічного дослідження. У рамках цього експерименту контрольними
вважали птахів, яких не піддавали експерименталь-ному впливу (інтактні,
тобто 0 хв. охолодження або іммобілізації).

Стрес-реакція на фоні фармакологічної модуляції секреторної активності
наднирника. У роботі представлено також результати дослідження впливів
фармакологічної стимуляції або пригнічення у наднирнику активності
глюкокортикоїд- або мінералокортикоїд-секретуючих клітин інтерренальної
тканини залози, а також катехоламін-секретуючих клітин хромафінної
тканини залози.

Починаючи з 7-го дня постнатального розвитку, птахи отримували ін’єкції
фармакологічних препаратів, здатних модулювати функціональну активність
надниркової залози (НЗ). Препарати розчиняли у 0,25 мл ізотонічного
(0,9%) розчину NaCl та вводили птахам внутришньом’язево (i.m.) або
перорально (p.o.). Піддослідні птахи отримували 1-2 ін’єкції на добу
(залежно від фармакокінетики препарату) протягом 1 тижня. Через 7 діб
досліджували ефекти фармакологічної модуляції функцій НЗ птахів у
безстресових умовах, а також в умовах холодового стресу. Для цього
птахів охолоджували протягом 10 хв. або 30 хв. як описано вище, після
чого декапітували та забирали кров і деякі органи для аналізу. Останні
ін’єкції фармакологічних препаратів птахи отримували за 1-2 год. до
початку охолодження. Для даного експерименту контрольну групу являли
птахи, які одержували ін’єкції 0,25 мл ізотонічного розчину NaCl
внутришньом’язево (i.m.) або перорально (p.o.) (далі – фізіологічний
розчин, ФР).

Для експериментальної стимуляції або пригнічення секреції
кортикостероїдів і катехоламінів у наднирковій залозі нами використані
такі фармакологічні препарати (табл.1):

Методи дослідження. Флюориметричне визначення гормонів. Після
декапітації усіх птахів кров збирали у попередньо гепаранізовані
центрифужні пробірки. Частину цільної крові швидко заморожували при
–20оС для подальшого визначення рівнів адреналіну (АДР) та норадреналіну
(НОР). Іншу частину крові центрифугували 15 хв. при 4-5 тис. об./хв. при
кімнатній температурі (центрифуга Janettzki, Угорщина), плазму крові
відбирали та швидко заморожували при –20оС для подальшого визначення
концентрації сумарних 11-оксикортикостероїдів (11-ОКС).

Визначення концентрації катехоламінів у крові птахів. Концентрації АДР і
НОР у крові птахів визначали за методом Jacobowitz та Richardson
(1979). Флюорісценцію АДР і НОР реєстрували, використовуючи флюориметр
MPF-2A (Hitachi, Японія). Довжина хвиль флюоресценції: для АДР – 410/500
нм, НОР – 380/480 нм.

Визначення концентрації 11-оксикортикостероїдів у плазмі крові.
Концентра-цію сумарних 11-оксикортикостероїдів (11-ОКС) визначали у
плазмі крові птахів флюориметричним методом De Moore у модифікаціїї
Балашова (1990). Визначення флюоресценції проводили за допомогою
спектрофлюориметра MPF-2A (Hitachi, Японія). Довжина хвиль збудження
флюоресценції для 11-ОКС – 470/524 нм.

Гістологічні методики. Для морфологічних досліджень гіпоталамічні
ділянки мозку та надниркові залози птахів фіксували у рідині Буена та
обробляли далі за традиційними гістологічними методиками. Виготовлені
фронтальні серійні парафінові зрізи гіпоталамусу завтовшки 5 мкм
забарвлювали метиленовим синім по Ніслю. Парафінові зрізи наднирників
завтовшки 5 мкм забарвлювали гематоксиліном Бьомера та дофарбовували
еозином. Гістологічні препарати аналізували на світлооптичному рівні
якісно та кількісно при збільшенні мікроскопа до х900.

Електронномікроскопічна техніка. Електронномікроскопічне дослідження
надниркових залоз проводили: а) у птахів, яких піддавали охолодженню;
б) у птахів, яким вводили фармакологічні препарати (без охолодження).

Безпосередньо після розтину птахів правий наднирник негайно поміщали у
2,5% розчин глютарового альдегіду на какодилатному буфері (КБ) на 2 год.
для попередньої фіксації тканини. Потім залози фіксували в 1% розчині
чотириокису осмію на КБ протягом 1 год. Далі матеріал поступово
просочували епоксидною смолою, а після заливки матеріалу у смолу за
допомогою ультрамікротома UltraCut-R (Німеччина) виготовляли ультратонкі
зрізи завтовшки 70-80 нм, контрастували у водному 2,5% розчинах
ураніл-ацетату та цитрату свинцю. Ультратонкі зрізи розглядали в
трансмісійному електронному мікроскопі ПЕМ-У (ВАТ “Selmi”, Україна) при
робочому збільшенні х4000-х25000.

Морфометричні методики. Відомо, що зміни каріо-, цито- та гістологічних
характеристик можуть бути кваліфіковані як морфологічні еквіваленти
функціональних змін клітин, тканин, органів, тощо (Ташкэ, 1980; Исаков и
др., 1988; Автандилов, 1990; Виноградов, 1998). У наших дослідженнях про
зміни функціонального стану нейросекреторних нейронів гіпоталамусу та
клітин паренхіми надниркових залоз судили на підставі комплексного
аналізу їх каріо- та цитометричних характеристик на світло-оптичному
рівні. Морфометричний аналіз, який обов’язково базувався на даних
якісної оцінки морфологічного стану гіпоталамічної, інтерренальної та
хромафінної тканин, проводили за допомогою окуляр-мікрометра МОВ-1-15х.

Так, з метою оцінки функціонального стану нейроцитів ПВЯ гіпоталамусу
вимірювали площі зрізів клітинних ядер дрібноклітинних нейроцитів ПВЯ,
які легко відрізняються від великоклітинних нейроцитів ПВЯ за
відсутністю у перикаріоні паральдегід-фуксин-позитивної субстанції.
Оскільки імуноцитохімічні дослідження вказують на те, що тіла
кортиколіберин-вмісних нейронів містяться у латеральній частині ПВЯ
гіпоталамусу птахів (Jozsa et al., 1984; Panzica et al., 1986), то на
зрізах поле аналізу обмежували саме цією частиною ПВЯ. Морфометричною
ознакою посилення функціональної активності нейросекреторних нейронів
вважали збільшення вимірюваного параметра та збільшення відносної
кількості світлих нейроцитів у ПВЯ, ознакою пригнічення функцій –
зменшення цих величин.

Секреторну активність клітин інтерренальної частини надниркових залоз
піддослідних птахів оцінювали на підставі аналізу площі зрізів ядер
інтерренальних клітин, а також ширини клітинних тяжів інтерренальної
тканини як показника висоти секретуючих гландулоцитів, якими ці тяжі
утворені. Вважали, що морфологічно посилення синтетичних та секреторних
процесів у інтерренальній тканині наднирників виявляється, зокрема, у
збільшенні розмірів ядер інтерренальних клітин (ІК) і ширини
інтерренальних тяжів, а ознакою гіпофункції є зниження цих параметрів.

Дані морфометричного аналізу інтерренальних і хромафінних клітин
надниркових залоз, а також нейроцитів ПВЯ гіпоталамусу додавали до даних
візуальної якісної оцінки функціонального стану клітин, а також даних
біохімічного визначення адреналових гормонів у крові та розглядали
комплексно.

Статистичні методики. Статистичну обробку результатів вимірювань
здійснювали методами варіаційної статистики (W-критерію Шапіро-Уілка,
t-тест Ст’юдента, U-критерій Манн-Уітні). Статистично достовірними
вважали відмінності між середніми значенями порівнюваних показників при
рівні значущості p

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020