АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ ІМ. І.І. МЕЧНИКОВА

Тимченко Олена Миколаївна

УДК: 579.256: [579.842.1/.2 + 579.861]

Удосконалення молекулярно-генетичних методів внутрішньовидового
епідеміологічного типування клінічно-значущих мікроорганізмів різних
таксономічних груп

03.00.07 – мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

Харків – 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті мікробіології та імунології ім. І.І.
Мечникова АМН України

Науковий керівник доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки
і техніки України

Волянський Юрій Леонідович,

директор Інституту мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН
України

Офіційні опоненти доктор медичних наук, професор

Мінухін Валерій Володимирович,

професор кафедри мікробіології, вірусології та імунології Харківського
державного медичного університету МОЗ України

доктор біологічних наук, професор

Руденко Адель Вікторівна,

завідувач відділом мікробіології Інституту урології АМН України,

Провідна установа Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В.
Громашевського АМН України, м. Київ

Захист дисертації відбудеться “ 3 ” лютого 2005 р. об 11.00 годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.618.01 в Інституті
мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України (61057, м.
Харків, вул. Пушкінська, 14).

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту мікробіології та
імунології ім. І.І. Мечникова АМН України (61057, м. Харків, вул.
Пушкінська, 14).

Автореферат розісланий “ 29 ” грудня 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 64.618.01

к.м.н., с.н.с. Бруснік С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Мікробіологічні дослідження в сучасній системі
боротьби з інфекційними захворюваннями (ІЗ) продовжують відігравати одну
із провідних ролей. Необхідним елементом здійснення дієвого
епідеміологічного нагляду за інфекціями є вивчення ареалу розповсюдження
збудників, виділення їх із біотичних і абіотичних об’єктів на території
підконтрольних регіонів, дослідження широкого кола біологічних
властивостей цих мікроорганізмів та проведення внутрішньовидового
епідеміологічного типування (ЕТ) штамів збудника (Беляков В.Д. и др.,
1990; Яфаев Р.Х. и др., 1989). Результати таких досліджень окрім
великого теоретичного значення (Черкасский Б.Д., 1991; Литвин В.Ю. и
др., 1994), знаходять активне прикладне використання, допомагаючи
визначити джерело інфекції, механізми і фактори передачі збудника, ареал
його циркуляції та рівень мікробної контамінації об’єктів оточуючого
середовища, тощо (Ramos S.M. et al., 1996; Tenover F.C. et al., 1994;
Grimont P.A.D., 1992). Відповіді на ці питання є необхідною передумовою
при розробці системи заходів боротьби з ІЗ, в т. ч. гнійно-запальними їх
нозоформами.

Стрімкий розвиток автоматизованих технологій та визначні фундаментальні
досягнення в молекулярній біології за останні декілька десятиріч
ознаменувались створенням нових методичних підступів щодо вирішення
актуальних завдань медичної мікробіології, епідеміології та інфектології
(Grimont F. et al., 1989; Ichiyma S. et al., 1991; Гинцбург А.Л. и др.,
1999). Нагальною є необхідність розробки та широкого практичного
використання універсальних методів молекулярно-генетичних досліджень для
внутрішньовидового типування мікроорганізмів різних таксономічних груп з
метою розв’язання складних завдань молекулярної епідеміології (Шагинян
И.А., 2000; Hopkin S.M. et al., 1990; Leganis N., 1991).

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота
виконувалась в рамках НДР за темою: “Розробка нових методів
епідеміологічного типування збудників інфекційних захворювань”
(галузевий шифр ЦФ.4.22.99, № держреєстрації 0199U003175, термін
виконання 01.1999-12.2002 рр.). НДР розроблювалась в лабораторії нових
та маловивчених інфекційних захворювань (ЛНМІЗ) ІМІ ім. І.І. Мечникова
АМН України і фінансувалась із бюджету МОЗ та АМН України. Дисертант
виконавець теми.

Мета роботи. На основі використання сучасних молекулярно-генетичних
технологій удосконалити методи внутрішньовидового епідеміологічного
типування клінічно-значущих мікроорганізмів різних таксономічних груп.

Завдання дослідження.

1. Провести аналітичну оцінку методів генотипування збудників
інфекційних захворювань, які широко використовуються на сучасному етапі.
Удосконалити технології найбільш перспективних із них, розробити
уніфіковані протоколи молекулярно-генетичних досліджень для
внутрішньовидового генотипування мікроорганізмів різних таксономічних
груп.

2. Вивчити біологічні властивості (морфологічні, тінкторіальні,
культуральні, біохімічні, антигенні) штамів бактерій видів S. aureus
subsp. aureus i Salmonella choleraesuis subsp. choleraesuis, ізольованих
в умовах різних епідеміологічних ситуацій.

3. Провести внутрішньовидове епідеміологічне фенотипування штамів
стафілококів і сальмонел з використанням традиційних (класичних)
методів: серо-, біо-, фаго-, антибіотикорезистенстипування.

4. Провести внутрішньовидове епідеміологічне генотипування штамів видів
S. aureus subsp. aureus i S. choleraesuis subsp. choleraesuis з
використанням удосконалених методів визначення плазмідного профілю (ПП)
і аналізу поліморфізму довжини фрагментів ендонуклеазної рестрикції
хромосомної ДНК (АПДФЕР ХрДНК).

5. Оцінити рівень уніфікованості, дискримінантності і відтворюваності
традиційних – фенотипічних, та нових — генотипічних методів
внутрішньовидового ЕТ штамів клінічно-значущих мікроорганізмів різних
таксономічних груп.

Об’єкт дослідження – типові і клінічні штами бактерій видів
Staphylococcus aureus subsp. aureus та Salmonella choleraesuis subsp.
choleraesuis.

Предмет дослідження — біологічні властивості мікроорганізмів, їх
фенотипічні та генотипічні характеристики: морфологія клітин,
тінкторіальні і культуральні властивості, ферментативна активність,
антигенна структура, чутливість до бактеріофагів та антибіотиків;
наявність плазмід і їх характеристика (розмір, сайт-специфічна
ендонуклеазна характеристика), сайти специфічної ендонуклеазної
рестрикції і поліморфізм рестрикційних фрагментів ХрДНК, закономірності
зв’язку між результатами типування мікроорганізмів з використанням
традиційних (фенотипічних) та нових (молекулярно-генетичних) методів.

Методи дослідження. Мікробіологічні — мікроскопічні, тінкторіальні,
культуральні, біохімічні, серологічні, визначення чутливості до
бактеріофагів і антибіотиків. Молекулярно-генетичні – аналіз плазмідного
профілю (ПП) штамів з визначенням наближеного розміру і
сайт-специфічного рестрикційного аналізу (РА) плазмідної ДНК (ПлДНК),
аналіз поліморфізму довжини фрагментів ендонуклеазної рестрикції
хромосомної ДНК (АПДФЕР ХрДНК).

Наукова новизна одержаних результатів. Робота відноситься до прикладної
(медичної) мікробіології, епідеміології, інфектології. Вперше на Україні
при внутрішньовидовому ЕТ збудників інфекційних захворювань (ЗІЗ)
(бактерій родів Staphylococcus i Salmonella) паралельно з традиційними
методами внутрішньовидового фенотипування (біо-, серо-, фаго-,
антибіотикорезистенстипування) застосовані нові молекулярно-генетичні
методи – визначення ПП і АПДФЕР ХрДНК. Вказані методи генотипування
суттєво удосконалені автором: уніфіковано протоколи проведення
досліджень та критерії оцінки отриманих результатів. Визначено рівень
чутливості, дискримінантності і відтворюваності кожного із них.
Обґрунтовано доцільність доповнення традиційних методів фенотипування
методами генотипування з використанням сучасних молекулярно-генетичних
технологій, що дозволяє підвищити ефективність внутрішньовидового ЕТ
клінічно-значущих мікроорганізмів різних таксономічних груп і створює
перспективи для вирішення актуальних питань молекулярної епідеміології.

Практичне значення одержаних результатів. Впровадження удосконалених
методів генотипування на основі визначення ПП та АПДФЕР ХрДНК дозволить
здійснювати внутрішньовидове епідеміологічне типування клінічно-значущих
мікроорганізмів різних таксономічних груп за допомогою уніфікованих
технологій досліджень, з більш високим рівнем чутливості,
дискримінантності і відтворюваності результатів. Застосування методів
генотипування підвищує точність формулювання висновків щодо
спорідненості (ідентичності) протипованих штамів мікроорганізмів.

Результати роботи рекомендується впровадити в діяльність
бактеріологічних лабораторій закладів (установ, організацій) служби
державного санітарно-епідеміологічного нагляду системи МОЗ України,
науково-дослідних інститутів протиепідемічного профілю МОЗ та АМН
України.

Впровадження в практику. Одержані автором дані склали основу матеріалів
методичних рекомендацій: “Епідеміологічне, внутрішньовидове
генотипування ентеробактерій – збудників інфекційних захворювань”, -МОЗ,
АМН України, УкрЦНМІПЛР. –Харків, 2003. -43 с.

Крім того, результати досліджень автора впроваджено у формі двох
галузевих (медико-біологічних) нововведень:

— Технологія визначення плазмідного профілю у культур бактерій –
сучасний метод епідеміологічного типування збудників гострих кишкових
інфекцій (ГКІ)/ Похил С.І., Тимченко О.М., Бондаренко А.В., Волянська
Н.П. // Реєстр галузевих нововведень. — МОЗ України, УкрЦНМІПЛР.- Київ,
2000. – Вип. 12-13. –Реєстр. № 118/13/00. – С. 62-63;

— Спосіб епідеміологічного (внутрішньовидового) генотипування збудників
інфекційних захворювань за допомогою аналізу поліморфізму довжини
фрагментів ендонуклеазної рестрикції хромосомної ДНК / Похил С.І.,
Лиманський О.П., Тимченко О.М., Юдін І.П., Волянська Н.П. //
Інформаційний бюлетень (додаток до Журналу Академії медичних наук
України). –АМН України. –Київ, 2002. — Випуск 15. – С. 30.

Особистий внесок здобувача. Основна частина експериментального
матеріалу, викладеного в дисертації, виконана автором самостійно.
Дослідження в рамках планової НДР, в межах наукової тематики якої
виконана дисертаційна робота, проводились за особистою участю пошукача.
Пошукач оволодів методами мікробіологічних, імунологічних,
молекулярно-генетичних, епідеміологічних та статистичних досліджень,
використаних в роботі. Дисертант безпосередньо здійснював розробку
методичних підходів щодо виконання поставлених завдань,
експериментальному їх обґрунтуванню, удосконалив і уніфікував
молекулярно-генетичні методи внутрішньовидового ЕТ мікроорганізмів
різних таксономічних груп, критично проаналізував матеріали літературних
джерел, узагальнив і провів статистичну обробку отриманих даних.
Постановка завдань та обговорення отриманих результатів проводились
спільно з науковим керівником. Автор самостійно написав дві роботи,
опубліковані у фахових наукових виданнях, які рекомендовані ВАК України.
В інших 8-ми публікаціях частка автора в загальному об’ємі робіт
складала від 60% до 90%. Автор висловлює подяку своїм колегам –
співробітникам ЛНМІЗ ІМІ ім. І.І. Мечникова АМН України (АМНУ),
лікарям-бактеріологам баклабораторій Харківської обласної
санітарно-епідеміологічної станції МОЗ України, СЕС на Південній
залізниці МОЗ України (м. Харків) та Обласної клінічної інфекційної
лікарні № 22 (м. Харків) МОЗ України за плідне співробітництво та
люб’язно надані для проведення досліджень штами мікроорганізмів
(бактерій родів Staphylococcus та Salmonella).

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи були
представлені у формі доповідей на Міжнародних наукових конференціях:
“Стратегія і тактика боротьби з інфекційними захворюваннями”,
присвяченій пам’яті академіка РАМН М.В. Васильєва і Шарля Мер’є (м.
Харків, 23-24 жовтня 2001 р.), “Актуальні питання боротьби з
інфекційними захворюваннями”, присвяченій пам’яті В.В. Смирнова і В.М.
Гиріна (м. Харків, 23-24 жовтня 2003 р.) та у формі тез на
міжрегіональній науково-практичній конференції, присвяченій 115-річниці
з дня народження академіка М.М. Соловйова (Харківський державний
медичний університет МОЗ України, 10 вересня 2001р.).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 10 наукових праць, в
тому числі 5 статей у фахових виданнях, визначених ВАК України, із них 2
самостійно. Тимченко О.М. співавтор 1-х методичних рекомендацій та 2-х
галузевих медико-біологічних нововведень.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 199
сторінках машинописного тексту, ілюстрована 21-єю таблицею і 8-ма
рисунками. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, основної
частини, яка включає опис матеріалів і методів дослідження, трьох
розділів власних досліджень, обговорення отриманих результатів,
висновків та списку використаної літератури. Список використаних джерел
містить 250 посилань, серед яких 138 українською та російською мовами
та 112 робіт іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури включає три підрозділи, в яких відображено значення і
загальну характеристику методів ЕТ бактерій – ЗІЗ, детально
проаналізовано молекулярно-генетичні методи внутрішньовидового
маркування штамів мікроорганізмів, відомості щодо біологічних
властивостей та методів внутрішньовидового ЕТ мікроорганізмів родів
Staphylococcus i Salmonella.

Матеріали і методи дослідження. Об’єктом дослідження були 69 штамів
мікроорганізмів різних таксономічних груп у відповідності із 9-м
виданням “Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology” (1994 р.):
грампозитивні коки (представники групи 17) – 18 штамів Staphylococcus
aureus subsp. aureus; факультативно анаеробні грамнегативні палички
(представники групи 5) – 51 штам Salmonella choleraesuis subsp.
choleraesuis. Взяті в експеримент культури мали таке походження: 17
клінічних штамів стафілококів було ізольовано в січні 1998 р. від хворих
людей і медичних працівників в період спалаху (групового захворювання)
шпитальної гнійно-септичної інфекції (ГСІ) в Лозівській районній лікарні
(Харківська обл.) МОЗ України (9 штамів ізольовані в пологовому
відділенні, 3 – в ЛОР відділенні, 5 – у відділенні анестезії і
реанімації). Культури сальмонел – 15 штамів (група А) ізольовано в
червні-серпні 1998 р. від хворих людей при спорадичній захворюваності на
гостру кишкову інфекцію (ГКІ), 35 штамів (група Б) виділено від хворих
та об’єктів оточуючого середовища під час спалаху (групового
захворювання) харчової токсикоінфекції – сальмонельозу в дитячому
оздоровчому таборі “Берізка” (Золочевський р-н., Харківська обл.) в
червні 2003 р. (в т. ч. 27 штамів сальмонел, підгрупа Б1 – від хворих
дітей та обслуговуючого персоналу і 8 штамів, підгрупа Б2 – із об’єктів
оточуючого середовища: продуктів харчування, обладнання харчоблоку,
стічної води). Типові штами S. aureus subsp. aureus ATCC 25923 та
типовий штам Salmonella choleraesuis subsp. choleraesuis АТСС 13076
отримані із музею мікроорганізмів ІМІ ім. І.І. Мечникова АМНУ.

При виконанні досліджень використовувався широкий спектр звичайних і
спеціального призначення поживних середовищ: МПА, МПБ, агар Ендо, ВСА,
МЖСА, АГВ виробництва НАН України ІБОНХ державного експериментального
заводу медичних препаратів (м. Київ), НВО “Питательные среды” (м.
Махачкала, РФ), агарові основи фірм “Difco” (США), “Oxoid”
(Великобританія), цукри, спирти, амінокислоти, інші хімреактиви і
біопрепарати Шосткінського заводу хімреактивів “РЕАХИМ”, Київського
заводу “РИАП”, фірми “СИНБИАС” (Україна), Славногорського хімзаводу ім.
Г.С. Верещагіна (РФ), ДП “Аллергон” (РФ), НВЦ “BIOPOL” (РФ), Центру
хімічних досліджень “САН” (Словакія), фірми “Raanal” (Угорщина), ВО
“LaChema” (Чехія), фірм “Sigma Chemical Co.” (США), “Pharmacia”
(Австрія), “Serva-Feinbiochemia heldelberg” (США).

Вивчення біологічних властивостей (морфологічних, тінкторіальних,
культуральних, біохі-мічних, серологічних) штамів стафілококів і
сальмонел здійснювали загальноприйнятими метода-ми як викладено в НД:
“Методические указания по применению унифицированных микробиоло-гических
(бактериологических) методов исследования в клинико-диагностических
лабораториях” (-М.: 1985), “Методические указания по микробиологической
диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями” (- М.: 1984),
“Энтеробактерии. Руководство” (- М.: 1985) та ін.

Внутрішньовидове епідеміологічне фенотипування штамів стафілококів
проводили методами фаго- і антибіотикорезистенстипування, а штамів
сальмонел – серо-, біо- та антибіотико-резистенстипування. Для цього
відповідно до інструкції підприємства-виробника застосовували
міжнародний набір (Англія) бактеріофагів стафілококових типових
діагностичних сухих ПВБ НДІ епідеміології та мікробіології ім. М.Ф.
Гамалеї АМН РФ, стандартні диски з антибіотиками для визначення
чутливості мікроорганізмів методом дифузії в агар ВО “Мосмедпрепараты”
ім. Л.Я. Карпова (РФ), сироватки сальмонельозні адсорбовані
монорецепторні сухі О і Н (за схемою Kauffman-White) виробництва РАТ
“Биопрепарат” (РФ). Диференційні середовища з гліцерином по Штерну,
L-арабінозою, дульцитом і L-рамнозою для біотипування культур сальмонел
виготовляли у відповідності із вимогами нормативних документів в ЛНМІЗ
ІМІ ім. І.І. Мечникова АМНУ.

Для руйнування клітин мікроорганізмів (РКМ) нами експериментально
випробувано сім методів: гуанідін-тіоционатний метод (ГТМ) в модифікації
A.M. Hossai і співав. (1997); К-протеїназний метод (КПМ) за N. Blin i
D.W. Stafford (1976); ультразвуковий метод (УЗМ) при робочих частотах
генератора і випромінювачів 22 і 44 кГц, вихідній електричній потужності
400 Вт, тривалості режимів дезінтеграції 30 сек., 60 сек., 120 сек., 240
сек., 360 сек., 480 сек.; метод швидкого міні-лізису (МШМЛ) за R.D.
Klein i співав. (1980) в авторській модифікації технології відтворення;
метод лужного лізису (МЛЛ) за H.C. Birnboin i J. Doly (1979); метод
тритонового лізису (МТЛ) за Р. Девіс і співав. (1984); метод лізису в
агарозних блоках (МЛАБ) в авторській модифікації технології C.L. Smith і
співав. (1986). В попередніх дослідженнях на 3-х штамах стафілококів і
3-х штамах сальмонел оцінена ефективність кожного методу РКМ за такими
критеріями: відсоток зруйнованих клітин бактерій (% ЗКБ), концентрація
звільненої ДНК у рідкій фазі суміші після РКМ (КЗ ДНК в мкг/мл), рівень
цілісності полімерних молекул плазмідної і хромосомної ДНК (РЦ ПлДНК і
ХрДНК) за умовною трьоххрестовою шкалою. В подальших дослідженнях всієї
колекції стафілококів і сальмонел з метою генотипування для РКМ
застосовували МШМЛ, МТЛ, МЛАБ, при цьому, при руйнуванні клітин
стафілококів (за авторською модифікацією) до складу літичних розчинів
замість лізоциму додавали лізостафін.

Внутрішньовидове епідеміологічне типування штамів стафілококів і
сальмонел здійснювали шляхом визначення плазмідного профілю (ПП) і за
допомогою аналізу поліморфізму довжини фрагментів ендонуклеазної
рестрикції хромосомної ДНК (АПДФЕР ХрДНК). Протокол визначення ПП у
штамів мікроорганізмів в авторській модифікації включає два етапи: I-й
етап (попереднє визначення ПП) – накопичення біомаси шляхом вирощування
на МПА, МПБ, проведення РКМ з допомогою МШМЛ, виявлення плазмід методом
електрофорезу лізатів в агарозному гелі, візуалізація електрофоретичних
профілів (ЕФП) і оцінка результатів; II-й етап (остаточне визначення ПП)
– накопичення біомаси на середовищах Луріа-Бертані (ЛББ, ЛБА), виділення
очищених препаратів плазмід з допомогою МТЛ, сайт-специфічний гідроліз
плазмід з допомогою ендонуклеаз рестрикції II-го типу, розділення
фрагментів ПлДНК в агарозному гелі, візуалізація ЕФП і оцінка
результату.

Протокол проведення АПДФЕР ХрДНК штамів мікроорганізмів в авторській
модифікації включає п’ять послідовних етапів: накопичення біомаси
культур на ЛББ, ЛБА, виділення, очищення і іммобілізація ХрДНК з
допомогою МЛАБ, сайт-специфічний рестрикційний аналіз (РА) ХрДНК в
агарозних блоках, розділення рестриктних фрагментів ХрДНК за допомогою
електрофорезу в пульсуючому полі з використанням вітчизняного приладу
“ПУЛЬС-ГЭФ1” (С. Похил, Р. Савин, 1997), візуалізація ЕФП і аналіз
отриманих результатів.

Номенклатура фенотипів, тобто, внутрішньовидових варіантів (фаготипів –
ФагоТ, біоварів – БіоТ, сероварів – СероТ, антибіотикорезистенсварів –
АнтрТ) штамів S. aureus subsp. aureus i S. choleraesuis subsp.
choleraesuis представлена у формі переліку умовних скорочень
оригінальних назв маркуючих ознак та у формі мнемонічних кодів за J.
Farmer (1970). Номенклатура генотипів (ПП і ПДФЕР ХрДНК) представлена у
формі послідовного запису плазмід за їх розміром в тисячах пар
нуклеотидів (т.п.н.), переліку розмірів фрагментів ПлДНК і ХрДНК, які
утворюються внаслідок сайт-специфічного гідролізу, при цьому, запис
здійснюється в числовій (табличній) та графічній (схематичній) формах
(О.М. Тимченко і співав., 2001; 2003).

При вивченні рівня відтворюваності результатів експериментів фено- і
генотипування штамів стафілококів і сальмонел здійснювали паралельні
дослідження в трьох відтворюваннях та в повторних дослідженнях після 3-6
місяців зберігання культур в лабораторних умовах.

Результати досліджень піддавали статистичній обробці (Г.Ф. Лакин, 1990;
П.Н. Рокицкий, 1973).

Біологічні властивості збудників стафілококової та сальмонельозної
інфекції подано в розділі 3. Взяті в експеримент 17 клінічних культур
стафілококів за результатами дослідження біологічних властивостей
віднесені до виду (підвиду) S. aureus subsp. aureus. Всі штами цієї
колекції за біологічними характеристиками були подібними до типового
штаму АТСС 25293. У препаратах, пофарбованих за Грамом, ці
мікроорганізми виглядали у формі грампозитивних скупчень неправильної
форми, пар або поодиноких сферичних клітин розмірами в діаметрі 0,5-3,5
мкм. На середовищах МЖСА, ЖСА через 18 годин інкубування при 37(0,5 оС
досліджені штами утворювали типові макроколонії в S-формі, 0,5-2,5 мм в
діаметрі, правильної округлої форми з випуклою, гладкою поверхнею
білого, жовтого, лимонно-жовтого або помаранчевого кольору. Всі культури
стафілококів ферментували глюкозу в анаеробних умовах на середовищі
Хью-Лейфсона (у 11,8% штамів цей тест був чітко позитивним після 5-ти
діб інкубування), лецитовітелазною активністю (ЛЕЦ) володіли 88,2%
культур, плазмокоагулазною (КОА) – 94,1%, дезоксирибонуклеазною
(ДНК-аза) – 82,4%, фосфатазною (ФОС) – 82,4%, гемолітичною (ГЕМ) –
76,5%, ферментували маніт в анаеробних умовах (МАН) – 76,5%, були
резистентними до новобіоцину (НОВ) – 17,6%. Лише 5 штамів із дослідженої
нами колекції в усіх вказаних тестах давали позитивний результат, тобто,
повністю відповідали типовим характеристикам S. aureus subsp. aureus.
Відрізнялись від цих характеристик за однією ознакою (тестом) – 41,2%
штамів, за двома – 29,4% культур. Між парами основних вищезазначених
біологічних властивостей визна-чено наявність прямого чи зворотнього (із
знаком “+” або “-“, відповідно) кореляційного зв’язку (шляхом обчислення
коефіцієнта rф Г. Фехнера). Лише між МАН, ГЕМ і НОВ означено зв’язок з
коефіцієнтом 0,34 (в першому випадку прямий, в другому зворотній), та
між ЛЕЦ і НОВ — + 0,35.

Досліджені 50 клінічних культур сальмонел за результатами вивчення їх
біологічних властивостей віднесено до виду (підвиду) S. choleraesuis
subsp. choleraesuis. Всі штами цієї колекції за основними біологічними
характеристиками були подібними до типового штаму цього виду АТСС 13076.
При вивченні морфології методом світлової мікроскопії з масляною
імерсією в препаратах, пофарбованих за Грамом, виявляли грамнегативні,
безсистемно розташовані, поліморфні палички розміром близько 1-3(1,5-0,8
мкм. Всі штами добре росли на простих поживних середовищах – МПБ, МПА з
типовими для цих бактерій ознаками росту. На середовищі Ендо через 18-20
годин в умовах інкубації при t=37(0,5 оС вони утворювали блідо-рожеві
колонії в S-формі розміром 0,5-1,5 мм, правильної округлої форми, гладкі
з рівним краєм. На ВСА через 36-48 годин при подібних умовах росту
формувались S-форми макроколоній розміром 1,0-2,5 мм, чорного кольору з
металевим відблиском (у 60% штамів), з гладкою поверхнею і рівнем краєм.
Всі досліджені сальмонели були цитохромоксидазонегативними,
каталазопозитивними, володіли нітратредуктазною активністю, в О/F тесті
на середовищі Хью-Лейфсона ферментували глюкозу. На середовищі Кліглера
утворювали сірководень, кислоту і газ із глюкози, не розщеплювали
лактозу і сечовину, були рухливими при температурі +25 і +37 оС, не
росли на середовищі із KCN, не утворювали індол, не утилізували малонат
Na (96% штамів), не володіли фенілаланіндезаміназ-ною,
желатингідролазною, (-галактозидазною та ліпазною активністю, при
глибокому розщепленні глюкози не утворювали ацетилметилкарбінол, не
ферментували ескулін, інозит, крохмаль, сахарозу. Більше 95% взятих в
експеримент культур утилізували ацетат Na, володіли
лізиндекарбоксилазною активністю, ферментували гліцерин, мелібіозу,
мальтозу (94% штамів). У 82-84% культур сальмонел виявлена
аргіниндигідролазна активність і здатність ферментувати L,D-тартрат. Між
парами переважної більшості вказаних біохімічних властивостей
встановлено існування сильного (rф від 0,8 до 1,0) прямого або
зворотнього кореляційного зв’язку. Чутливими до специфічної літичної дії
сальмонельозного індикаторного О-фагу були 94% штамів сальмонел, а до
полікомпонентоного бактеріофагу сальмонельозного груп А, В, С, D, E –
80% культур. Всі ізоляти бактерій аглютинувались сальмонельозною
О-сироваткою полівалентною груп А, В, С, Д, Е. Антигенна структура всіх
досліджених 50-ти культур сальмонел була однаковою: виявлено О-антигени
– 1, 9, 12; Н-антигенні комплекси фази 1 – g, m, фази 2 “-”. При
порівнянні біологічних властивостей різних за походженням штамів
сальмонел відмічено більш високий рівень гетерогенності біохімічних
властивостей у культур групи А, а саме, за аргініндигідролазною
активністю, ферментацією мальтози, мелібіози, L,D-тартрату. Крім того,
штами групи А, на відміну від штамів групи Б, не ферментували арабінозу,
відрізнялись більш низьким (p(0,05) рівнем розщеплення L, D-тартрату та
більш низькою чутливістю (p(0,05) до специфічної літичної дії
сальмонельозного індикаторного О-фагу та полікомпонентного лікувального
сальмонельозного фагу груп А, В, С, D, Е.

Результати внутрішньовидового фенотипування збудників стафілококової та
сальмонельозної інфекції наведено в розділі 4. При фенотипуванні 17-ти
культур S. aureus subsp. aureus методами фаго- і
антибіотикорезистенстипування встановлено, що при використанні
міжнародного набору стафілококових типових фагів в робочому розведенні 1
ТР вдалося типувати 70,6% цих штамів, а при застосуванні фагів в
розведенні 100 ТР – 82,3%. Лише 11,8% культур були чутливими до дії
одного фагу, а 70,6% — до двох і більшої кількості фагів, що і
сформувало характерну фагомозаїку протипованих штамів. Аналіз
результатів фаготипування показав приналежність всіх культур
стафілококів до I-ї і (або) III-ї групи, а в 52,9% випадків одночасно і
до фагогруп II, V та фагів “поза групою.” До недоліків методу
внутрішньовидового фаготипування слід віднести можливість зміни
фагомозаїки штаму від концентрації фагових корпускул у робочому
розведенні та можливість зміни фаговару в результаті їх тривалого
зберігання. В наших експериментах при використанні фагів в робочому
розведенні 100 ТР, в порівнянні з результатами типування в розведенні 1
ТР, фагомозаїка змінилась у 58,8%, а приналежність до фагогрупи у 48,1%.
Повторне тестування цієї колекції після трьохмісячного зберігання в
лабораторних умовах виявило зміну фагомозаїки у 78,6% штамів. При цьому,
зникла лізабельність до 1-12 фагів у 35,3% культур, а вперше виявлена до
2-4-х фагів у 17,6% культур, 11,8% штамів паралельно з втратою
чутливості до 2-х фагів, набули її до 1-го, іншого фагу. Зміна
фагомозаїки призвела до зміни фагогрупи у 50% культур стафілококів,
серед яких 2 штами повністю втратили лізабельність і перейшли в групу
непротипованих.

Результати дослідження чутливості 17-ти культур стафілококів до
антибіотиків показали, що більше 94% із них були резистентними
(стійкими, помірно-стійкими) до бензилпеніциліну, ампіциліну,
поліміксину, а 65-88% культур – до карбеніциліну, левоміцетину,
рістоміцину. До цефалексину, мономіцину, тетрацикліну, доксицикліну,
олеандоміцину виявились резистентними 5,9-17,6% штамів. Всі штами
сальмонел були чутливими до метициліну, оксациліну, стрептоміцину,
канаміцину, еритроміцину, лінкоміцину, рифампіцину, фузидину.
Співставлення визначених антибіотикорезистенсграм дозволило згрупувати
17 культур стафілококів у групи з рівнем подібності АнтрТ не нижче 90%.
Між АнтрТ штамів №№ 276, 291 і 295 рівень подібності складає 91,3%, у
штамів №№ 543, 548, 553, 569, 751 і 758 – 100%, у культур №№ 658, 733 і
744 –100%. Оригінальними є АнтрТ у культур №№ 555, 568, 579, 581 і 743,
рівень відмінності між спектрами чутливості до антибіотиків у них
перевищує 10%.

При повторному тестуванні культур через 3 місяці зберігання in vitro
відмічено, що попередній АнтрТ змінився у 58,9% культур, при цьому, в
переважній більшості випадків у 52,9% встановлено додаткову
резистентність до 1-3-х антибіотиків. Крім того, близько 10% визначень
чутливості штамів стафілококів до антибіотиків методом дифузії в агар з
використанням стандартних дисків давали нечіткі результати, тобто, були
неоднозначними. В таких випадках культура може бути одночасно віднесена
до чутливих або до помірно-стійких, тобто, антибіотикорезистентних. В
наших дослідженнях рівень співпадання результатів групування 17-ти
культур S. aureus subsp. aureus в ФагоТ і АнтрТ складає 35,3%.

За результатами фенотипування (серо-, біо-,
антибіотикорезистенстипування) 50-ти штамів S. choleraesuis subsp.
choleraesuis, встановлено, що як для культур, ізольованих при
спорадичній захворюваності людей на ГКІ (група А), так і культур,
виділених із осередку групової захворюваності на сальмонельозну харчову
токсикоінфекцію (група Б), характерна серо- і біомонотипність. Всі штами
належали до серовару Enteritidis. При першому біотипуванні 98% із них не
були здатні гідролізувати гліцерин на середовищі Штерна впродовж 8-ми
діб (однокомпонентна схема біотипування) і тому віднесені до БіоТ
“ratin”, а при повторному тестуванні цієї ж колекції 100% штамів дали
позитивну реакцію в цьому тесті і були віднесені до БіоТ “jena”.
Аналогічні результати біотипування отримані при застосуванні
чотирьохкомпонентної схеми за здатністю ферментувати: L-арабінозу,
дульцит, L-рамнозу, гліцерин в бульйонному середовищі Штерна (И.В.
Голубева и соавт., 1985) з тією лише різницею, що 98% культур при
першому тестуванні було віднесено до БіоТ “danysz”, а при повторному –
100% штамів до БіоТ “essen”. Це підтверджує і висновки інших авторів
(А.М. Зарицкий, 1988) щодо ненадійності вказаного тесту з гліцерином на
середовищі Штерна та необхідності удосконалення схеми суббіотипування
сальмонел серотипу Enteritidis. Для підвищення дискримінантності
вищезазначеного методу нами запропонована удосконалена схема визначення
БіоТ, яка полягає у виключенні тесту на здатність ферментувати L-рамнозу
та додаткової диференціації культур за результатами ферментування
L-арабінози. В удосконаленій нами трьохкомпонентній схемі біотипування
кожний включений раніше БіоТ (“enteritidis”, “danysz”, “essen”, “chaco”)
запропоновано розділити на два біосубвари — 1 і 2 (перший і другий) в
залежності від здатності ферментувати L-арабінозу. Така пропозиція не
змінює попередніх назв БіоТ, не ускладнює проведення досліджень,
забезпечує співставлення результатів, підвищує рівень дискримінантності
методу. Використання удосконаленої трьохкомпонентної схеми дозволило
суббіотипувати 50 штамів сальмонел серотипу Enteritidis на два БіоТ
“danysz (1)” і “danysz (2)”. При цьому, “danysz (1)” з негативною
реакцією в тесті щодо ферментування L-арабінози був визначений в усіх
штамів групи А, а біосубвар “danysz (2)” – в усіх штамів групи Б.

Досліджені штами сальмонел характеризувались високим рівнем
антибіотико-резистентності: одночасно до 5-ти препаратів різних хімічних
груп резистентними були 8% культур, до 6-ти – 20%, до 7-ми – 2%, до 8-ми
– 22%, до 9-ти – 46%, до 10-ти – 2%. Переважна більшість колекції (90% і
більше) була резистентною до (-лактамів (за винятком карбеніциліну, до
якого 70% штамів були чутливими), тетрациклінів, макролідів, стероїдів,
похідних рифампіцину. Лише до антибіотиків 2-х хімічних груп –
аміноглікозидів (гентаміцину) і нітробензолів (левоміцетину) всі
культури були чутливими, а близько половини (40-72% штамів) – виявились
чутливими до стрептоміцину, цефалексину, канаміцину, поліміксину. Всього
виявлено 22 варіанти АнтрТ, в т. ч. 12 варіантів у штамів групи А і 10
варіантів в групі Б. Статистично достовірною (p(0,05) була відмінність
між штамами цих груп стосовно частоти виявлення резистентності до
стрептоміцину і цефалексину (штами групи Б були більш резистентними). В
межах групи Б виявлено більше полірезистентних культур в підгрупі Б1, в
порівнянні із підгрупою Б2 (p(0,05). Найвищий показник варіабельності
АнтрТ був характерний для культур групи А, найнижчий для штамів підгрупи
Б2. Повторне визначення АнтрТ через три місяці зберігання культур в
лабораторних умовах показало зміну антибіотикорезистенсграм у 28%
штамів, що суттєво ускладнює аналіз АнтрТ для визначення спорідненості
культур. Між результатами фенотипування (СероТ, БіоТ, АнтрТ) не виявлено
чіткого кореляційного зв’язку.

N

P

P

R

T

V

X

Z

v

x

¦

T V X |

D

a

a

?a

ae

N P®S°S//oo?ooeeeoooo?o?oo?oeTHTH?

¤

¦

?

?

A

AE

O

o

o

oe

>начення ПП і АПДФЕР ХрДНК. Удосконалення вказаних методів базувалось на
експериментальному визначенні найбільш перспективних методів руйнування
клітин мікроорганізмів (РКМ), виділення ПлДНК і ХрДНК, придатних для
молекулярно-генетичних досліджень. Створено уніфіковані технології
генотипування з використанням найбільш ефективних методів РКМ з
авторською модифікацією деяких технічних прийомів на різних етапах
досліджень, а також з використанням уніфікованих критеріїв при
визначенні генетичної спорідненості штамів. В технології виділення і
очищення зразків інтактних молекул ДНК найбільш складним залишається
етап РКМ (Р. Девис и соавт., 1984, П. Берквист и соавт., 1989).
Експериментальне випробовування 7-ми різних методів РКМ на 3-х штамах
стафілококів і 3-х штамах сальмонел показало: УЗМ має низьку
ефективність стосовно руйнування стінок стафілококів та призводить до
значної дезінтеграції звільненої ПлДНК і ХрДНК; ГТМ і КПМ мають низьку
ефективність при руйнуванні клітин стафілококів (цими методами
руйнується менше 8% клітин в суспензіях цих мікробів) і сальмонел
(близько 34-37% клітин їх суспензій), крім того, ці методи РКМ не
запобігають “самовільним” розривам молекул ХрДНК; МШМЛ, МЛЛ, МЛАБ і МТЛ
при відтворенні за традиційною технологією виявились достатньо
ефективними щодо руйнування клітин сальмонел (показник ЗКМ від 88% до
99%), забезпечували високу концентрацію звільненої ДНК (1-2 мкг/мл),
достатній рівень цілісності ПлДНК, однак, всі вищезазначені методи РКМ
були неефективними для руйнування клітин стафілококів і призводили (за
винятком МЛАБ) до “самовільної” дезінтеграції ХрДНК. Заміна лізоциму на
лізостафін в складі літичних сумішей супроводжувалась різким зростанням
ефективності МШМЛ, МЛЛ, МЛАБ і МТЛ (ЗКМ(99,9%, КЗ ДНК= 0,75-1,0 мкг/мл)
при руйнуванні клітин стафілококів. Лише МЛАБ давав можливість
отримувати очищені, цілі (стабілізовані) молекули ХрДНК для їх
наступного сайт-специфічного рестрикційного аналізу (РА). Уніфікована
технологія внутрішньовидового епідеміологічного генотипування
мікроорганізмів методом визначення ПП включає визначення факту наявності
плазмід та їх наближеного розміру за допомогою модифікованого варіанту
МШМЛ (I-й етап визначення ПП) та наступне встановлення ідентичності
плазмід за допомогою їх сайт-специфічної рестрикції (II-й етап). При
формулюванні висновків стосовно ідентичності або відмінності ПП у
порівнюваних культур запропоновано такі критерії: відмінність двох ПП
вважається “слабкою” при умові, коли їх електрофоретичні профілі (ЕФП)
відрізняються тільки інтенсивністю, “потужністю” 2-х або більшої
кількості гомологічних (однакових за розміром) смуг; різниця в
інтенсивності лише однієї смуги не є достатньою для визнання відмінності
між порівнюваними ПП; “сильною” вважається відмінність між ПП при умові,
коли фінгерпринти штамів відрізняються за кількістю візуалізованих на
треках смуг, навіть, на одну; ідентичними є ПП, які мають фінгерпринти
із однаковою кількістю, розташуванням та інтенсивністю гомологічних
смуг.

Уніфікована автором технологія внутрішньовидового генотипування
мікроорганізмів методом АПДФЕР ХрДНК включає п’ять основних етапів
дослідження: накопичення біомаси мікробів шляхом їх вирощування на
стандартних поживних середовищах; виділення та очищення ХрДНК за
допомогою модифікованого варіанту МЛАБ; проведення сайт-специфічної
рестрикції ХрДНК ендонуклеазами з оптимально підібраними послідовностями
нуклеотидів в сайтах впізнавання; розділення рестриктних фрагментів
ХрДНК за допомогою електрофорезу в пульсуючому полі з використанням
вітчизняного приладу “ПУЛЬС-ГЭФ1”; візуалізація фінгерпринтів і
визначення генетичної спорідненості штамів з використанням уніфікованих
критеріїв оцінки ідентичності (відмінності) їх фінгерпринтів.
Запропоновано такі критерії для оцінки ЕФП: відмінність порівнюваних
фінгерпринтів вважається “слабкою”, коли вони відрізняються за
інтенсивністю 2-х або більшої кількості гомологічних смуг; різниця в
інтенсивності однієї смуги не є достатньою для встановлення факту
відмінності порівнюваних ЕФП; відмінність між фінгерпринтами вважається
“сильною”, коли вони відрізняються за кількістю (навіть на одну) смуг,
візуалізованих на треках; ідентичними є ЕФП, які характеризуються
однаковою кількістю, розташуванням та інтенсивністю гомологічних смуг
(можлива наявність відмінності за “потужністю” не більше, ніж однієї
смуги).

При внутрішньовидовому епідеміологічному генотипуванні 17-ти штамів
стафілококів методом визначення ПП встановлено, що 88,2% культур містять
плазміди з розміром 32, 4,5, 4,1 та 2,4 т.п.н. При цьому, один тип
плазмід (за розміром) був ідентифікований у 7-ми культур (41,2%), у
такої ж кількості мікробів одночасно виявлено два типи плазмід, а у
одного штаму (5,9%) одночасно – три різні за розміром плазміди. Найбільш
поширеною серед культур нашої колекції була плазміда розміром 32 т.п.н.,
а плазміди з розміром 4,5, 4,1 та 2,4 т.п.н. ідентифіковано у 11,8%,
23,5% та 17,6% штамів, відповідно. За спектром виявлених плазмід штами
стафілококів згруповані у п’ять ПП-типів (1-5). Оскільки плазміди
однакового розміру виявлялись у культур, що ізольовані в різних
відділеннях Лозівської районної лікарні, проведено їх сайт-специфічний
рестрикційний аналіз (РА) з використанням ендонуклеаз EcoR I, Hind III,
BamH I, Sma I. Результати РА показали: відмінність плазмід з розміром 32
т.п.н., які виділені від штамів №№ 276, 543, 555, 743 та із культури
№291; ідентичність плазмід з розміром 2,4 т.п.н., виділених із штамів №№
276, 291; ідентичність плазмід із розміром 4,1 т.п.н., ізольованих від
штамів №№ 579, 733, ідентичність плазмід з розміром 4,5 т.п.н.,
ізольованих від культур №№ 291, 555 (рис. 1). При повторному тестуванні
культур стафілококів через 3 місяці зберігання in vitro встановлено, що
у 17,6% штамів змінився вихідний ПП-тип – зафіксована втрата однієї із
плазмід.

Попереднє проведення АПДФЕР ХрДНК 3-х штамів стафілококів з
використанням 4-х різних ендонуклеаз показало, що при рестрикції ХрДНК
ферментами EcoR I, Hind III, BamH I утворюються складні для простого
візуального обліку фінгерпринти з більш ніж 30-ма смугами на треку. В
умовах відсутності відповідного технічного оснащення для
автоматизованого зчитування ЕФП для 17-ти штамів стафілококів проведений
АПДФЕР ХрДНК за допомогою ендонуклеази Sma I, гідроліз якою призводив до
утворення більш простих фінгерпринтів, зручних для “ручної” обробки. У
культур нашої колекції виявлено 5 різних ЕФП-типів (I-V) з 15-21-им
рестриктним фрагментом ХрДНК з розмірами від 320 т.п.н. до 0,1 т.п.н.,
що дозволило чітко протипувати як групи штамів різного походження, так і
штами в межах цих груп. При цьому, 11 рестрикційних фрагментів ХрДНК
спостерігались в ЕФП усіх 17-ти штамів, — вони, очевидно, є видотиповими
або родотиповими, а 4-10 інших “додаткових” фрагментів можна вважати
штамотиповими.

Рис. 1. Приклад ЕФП рестрикційного розщеплення ендонуклеазою EcoR I
плазмід розміром 32 т.п.н., виявлених у штамах S. aureus subsp. aureus:
1 – №276; 2 – №291; 3 – №543; 4 – №555; 5 – №733; 6 – фрагменти Hind
III ендонуклеазної рестрикції ДНК фага (.

Повторний (через 3 місяці) АПДФЕР ХрДНК хоч і виявив деяку зміну
попередніх фінгерпринтів у формі відмінності потужності смуг на треках у
11-ти культур, однак не було встановлено змін інших важливих
характеристик фінгерпринтів, що не дозволило констатувати зміну
попереднього генотипу (ЕФП-типу).

Співставлення результатів внутрішньовидового ЕТ 17-ти штамів S. aureus
subsp. aureus методами фено- (фаго-, антибіотикорезистенстипування) і
генотипування (визначення ПП і АПДФЕР ХрДНК) підтверджує висновки інших
авторів про відсутність чіткої кореляційної залежності як між самими
фенотипами (ФагоТ і АнтрТ), так і між фено- і генотипами (табл. 1). На
противагу цьому, рівень збіжності ПП-типів і ЕФП-типів в нашій колекції
стафілококів складає 73,3% (без урахування штамів №№ 568, 569, в яких ПП
не було визначено). Використання методу АПДФЕР ХрДНК дозволило
генотипувати 100% культур, тоді як методом аналізу ПП – 88,2% штамів.

Підводячи підсумок проведеного внутрішньовидового епідеміологічного
фено- та генотипування культур S. aureus subsp. aureus, ізольованих в
період ускладнення епідемічної ситуації з захворюваності ГСІ в
Лозівській районній лікарні в січні 1998 р., можна аргументовано
констатувати висновок: не встановлено формування і циркуляції єдиного
(домінуючого) для цього ЛЗ внутрішньошпитального штаму.

Таблиця 1

Результати фено- та генотипування штамів S. aureus subsp. aureus

№ штаму Фенотип

(мнемонічний код за J. Farmer, 1970) Генотип

код ФагоТ код АнтрТ ПП-тип ЕФП-тип

276 5828788D 188485B 1 I

291 5858758D 188865A 2 II

295 5828788D 188485B 1 I

543 5136146C 188885A 3 III

548 5186146C 188885A 3 III

553 8878468D 188885A 3 III

555 8888888D 287485A 4 III

568 8888888D 888868A — IV

569 8888888D 188885A — IV

579 8888878D 178885A 5 IV

581 8888878D 188888B 3 III

658 1241111A 188888A 3 III

733 4718567B 188888A 5 V

743 8738875D 288888A 5 V

744 4286518D 188888A 5 V

751 5888878D 188885A 3 V

758 1111111A 188885A 3 V

Виділені із різних профільних відділень (ЛОР-, пологового, анестезії і
реанімації) культури стафілококів являють собою окремі (відмінні) клони,
які “закріпились” в екобіологічних ареалах циркуляції, кордони яких, як
правило, визначаються функціонально-територіальним принципом діяльності
підрозділів ЛЗ; протиепідемічний бар’єрний режим у відділеннях і між
ними не є абсолютним, про це свідчать активні процеси обміну генофондом
між штамами — виявлення ідентичних плазмід у культур S. aureus subsp.
aureus, ізольованих в різних відділеннях. Найбільшого поширення в
популяціях стафілококів набули плазміди з розміром близько 32 т.п.н.,
подібні до тих, з якими пов’язують резистентність цих мікроорганізмів до
групи ?-лактамних антибіотиків, що поряд з фенотипічними проявами
підвищеної стійкості до дії цих антибіотиків робить актуальною розробку
стратегії запобігання формування і обмеження циркуляції
антибіотикорезистентних популяцій стафілококів в цьому ЛЗ.

При генотипуванні 50-ти штамів S. choleraesuis subsp. choleraesuis,
серовар Enteritidis методом визначення ПП було встановлено, що 100% цих
мікроорганізмів є господарями плазмід. У 8% штамів криптичні,
низькокопійні плазміди вдалося виділити лише при застосуванні
великомасштабної технології. У кожного штаму ідентифіковано 2-4 плазміди
з розміром від 160 т.п.н. до 1,5 т.п.н. Всього виявлено 13 різних типів
плазмід із розмірами 160, 150, 120, 85, 65, 55, 24, 8, 4,5, 4,1, 2,1
1,7, 1,5 т.п.н. Найбільш поширеними серед культур сальмонел були
плазміди із розміром 55, 24, 4,1 т.п.н., які виявлені у 86%, 80, 76%
штамів, відповідно. Значно рідше виділяли плазміди з розміром 150 і 120
т.п.н. (у 10% культур), 1,7 і 1,5 т.п.н (у 8%), 160 т.п.н (у 6%), 8 і
4,5 т.п.н. (у 4% культур). У окремих штамів знайдено плазміди з
розмірами 85, 65 і 2,1 т.п.н. Взагалі, за результатами I-го етапу
визначення ПП встановлено 12 різних ПП-типів. Штами сальмонел груп А і Б
відрізнялись за своїми ПП-типами. Культури групи А характеризувались
більш високим різноманіттям ПП (у них визначено 10 відмінних ПП-типів),
в порівнянні із групою Б (у штамів цієї групи виявлено лише 2 ПП-типа).
Оригінальними для сальмонел групи А були плазміди великого розміру –
160, 150, 120 і 85 т.п.н., тоді як плазміди меншого розміру – 55, 24,
4,1 т.п.н. (за винятком плазміди із розміром 1,5 т.п.н.), які характерні
для культур групи Б, в тому чи іншому поєднанні з іншими плазмідами,
виявлено і у штамів групи А. РА з використанням ендонуклеаз EcoR I і
Hind III плазмід з розміром 55 т.п.н. показав їх гетерогенність: за
особливостями їх рестрикційних фінгерпринтів виявлено три типи цієї
плазміди. При цьому, в культурах групи А ідентифіковано два різних типи
ЕФП, які відрізнялись як за кількістю смуг на треках, так і за
інтенсивністю деяких із них. В групі Б плазміда цього розміру була
монотипною, але її фінгерпринт відрізнявся від фінгерпринтів плазмід
культур груп А. При повторному визначенні ПП-типу у всієї колекції
(після трьохмісячного зберігання сальмонел в лабораторних умовах) тільки
у 6-ти штамів групи А (12%) спостерігали зміну попереднього ПП-типу, що
пов’язано із втратою однієї плазміди: втрачались плазміди з розміром 150
т.п.н. або 160 т.п.н.; зміна ПП-типу у культур групи Б не була
зафіксована.

Методом АПДФЕР ХрДНК проведено генотипування 25-ти культур сальмонел
(15-ти штамів групи А і по 5 штамів із підгруп Б1 і Б2). Для
сайт-специфічного РА використовували едонуклеази EcoR I, Hind III, Sma
I. При застосуванні EcoR I і Hind III спостерігали утворення
високодискримінантних, складних для “ручної” обробки фінгерпринтів з
більш ніж 60-ма смугами на треках. Ендонуклеазна Sma I рестрикція давала
більш прості ЕФП, саме цей фермент ми використовували для дослідження
вищезазначених 25 культур сальмонел. При цьому було виявлено 5 (I-V)
відмінних ЕФП-типів (рис. 2) з 14-19-ма смугами. Близько 55% цих
рестриктних фрагментів були видотиповими або, навіть, родотиповими, —
вони присутні у фінгерпринтах всіх культур, а фрагменти з розмірами 36,
30, 25, 19, 17, 12, 9,2, 7,0, 5,0, 4,4, 2,0, 1,8, 1,0, 0,6, 0,5 т.п.н.
були штамотиповими. Близько 18% смуг, що спостерігались на треках,
суттєво відрізнялись за потужністю, що було нами додатково використано
для диференціації ЕФП-типів. Культури групи А виявились генетично
гетерогенними, у них виявлено 4 відмінних ЕФП-типи (I-IV), а штамам
групи Б був притаманний один ЕФП-тип (V).

Повторний АПДФЕР ХрДНК, який був проведений через 6 місяців зберігання
культур в лабораторних умовах, не виявив у них зміни ЕФП-типів.
Зіставлення результатів внутрішньовидового епідеміологічного фено- і
генотипування сальмонел показало відсутність кореляційної залежності між
фенотипами і генотипами (табл. 2).

Рис. 2. Приклад ЕФП фрагментів Sma I ендонуклеазної макрорестрикції
ХрДНК штамів S. choleraesuis subsp. choleraesuis серовар Enteritidis: 1
– ЕФП типу I, штам № 1905; 2 – ЕФП типу II, штам № 1984; 3 – ЕФП типу I,
штам № 2520; 4 – ЕФП типу III, штам № 2651; 5 – ЕФП типу IV, штам №
2918; 6 – ЕФП типу V, штам № 125; 7 – ЕФП типу V, штам № 1829; 8 –
фінгерпринт фрагментів Hind III ендонуклеазної рестрикції ДНК фага (.

Аналіз результатів внутрішньовидового епідеміологічного фено- і
генотипування сальмонел свідчить, що в період спорадичної захворюваності
на сальмонельозну інфекцію в 1998 р. в Харківській обл. домінував
серовар Enteritidis виду (підвиду) S. choleraesuis subsp. choleraesuis.
Фенотипування цих штамів показало їх однотипність за результатами
біотипування і виражену гетеротипність за визначенням у них
антибіотикорезистенсграм. Генотипування цих культур методами оцінки ПП
та АПДФЕР ХрДНК показало їх генетичну різноманітність. Це свідчить про
активні процеси змін на генетичному рівні в популяції збудника, які
часто не вдається виявити традиційними методами фенотипування (в нашому
випадку – методами серо- і біотипування). Про наявність динамічного
генетичного обміну між штамами сальмонел в зазначений період
епідемічного процесу вказує наявність у них ідентичних за розміром і
даними РА плазмід. Всі ж досліджені культури групи Б, ізольовані під час
спалаху групової захворюваності на харчову токсикоінфекцію в дитячому
оздоровчому таборі “Берізка” в 2003 р., були генетично однотипними, мали
ЕФП-тип V, відмінний від усіх інших ЕФП-типів (I-IV), які були визначені
у штамів сальмонел, ізольованих від хворих людей п’ятьма роками раніше.
Можна припустити, що ЕФП-тип V сформувався в популяції збудника в період
1998-2003 рр.

Застосування методів визначення ПП і АПДФЕР ХрДНК дозволило провести
внутрішньовидове типування груп штамів S. aureus subsp. aureus і S.
choleraesuis subsp. choleraesuis серовар Enteritidis в різні періоди
розвитку епідемічного процесу в якісно відмінних епідеміологічних
ситуаціях: в період передепідемічного підйому спорадичної захворюваності
та під час спалаху групової захворюваності. За допомогою удосконалених
методів генотипування, які характеризувались достатнім рівнем
дискримінантності, уніфікованості технології проведення досліджень і
більш високим рівнем відтворюваності результатів, в порівнянні із
використаними методами фенотипування, вдалося виявити клональні
генетичні маркери у досліджених штамів та згрупувати останні за їх
генетичною спорідненістю. Показано, що клони збудників інфекційних
захворювань із осередків групових захворювань характеризуються
особливостями генотипів, які відмінні від генотипів інших клонів в
популяції цих мікроорганізмів.

ВИСНОВКИ

1. Із семи експериментально апробованих технологій руйнування клітин
мікроорганізмів найбільш ефективними (за показниками: % зруйнованих
клітин бактерій, концентрація звільненої ДНК, рівень цілісності молекул
плазмідної та хромосомної ДНК) для застосування з метою генотипування є
методи швидкого міні-лізису (МШМЛ), тритонового лізису (МТЛ) та лізису в
агарозних блоках (МЛАБ).

2. За результатами досліджень удосконалено методи генотипування
мікроорганізмів — визначення плазмідного профілю (ПП) і аналізу
поліморфізму довжини фрагментів ендонуклеазної рестрикції хромосомної
ДНК (АПДФЕР ХрДНК), які доцільно використовувати для внутрішньовидового
епідеміологічного типування мікроорганізмів різних таксономічних груп.

3. Уніфікована нами технологія генотипування збудників інфекційних
захворювань методом визначення ПП включає проведення поетапних
досліджень для встановлення факту наявності у штамів плазмід і їх
наближеного розміру з допомогою модифікованого варіанту МШМЛ (перший
етап визначення ПП) та наступне визначення ідентичності плазмід за
результатами їх сайт-специфічної ендонуклеазної рестрикції (другий етап
визначення ПП).

4. Технологія генотипування збудників методом АПДФЕР ХрДНК включає
п’ять послідовних уніфікованих етапів дослідження: накопичення біомаси
мікроорганізмів шляхом їх вирощування на стандартних поживних
середовищах; вилучення, очищення та іммобілізацію ХрДНК з допомогою
модифікованого варіанту МЛАБ; проведення сайт-специфічної рестрикції
ХрДНК ендонуклеазами з оптимально підібраними сайтами впізнавання;
розділення рестрикційних фрагментів ХрДНК за допомогою електрофорезу в
пульсуючому полі; візуалізація електрофоретичних профілів (ЕФП) і
визначення генетичної спорідненості штамів з використанням уніфікованих
критеріїв оцінки ідентичності (відмінності) фінгерпринтів.

5. За результатами вивчення біологічних властивостей (морфологічних,
тінкторіальних, культуральних, біохімічних) 17 штамів стафілококів,
ізольованих в осередку шпитальної ГСІ, віднесено до виду S. aureus
subsp. aureus. Між парами основних біологічних властивостей
(лецитовітелазною, коагулазною, ДНК-азною, фосфатазною, гемолітичною
активністю, ферментацією маніта в анаеробних умовах, резистентністю до
новобіоцину) виявлено слабкий кореляційний зв’язок (із значенням rф від
–0,06 до 0,35). Вказане підтверджує доцільність застосування при
дослідженні біологічних властивостей стафілококів принципу поєднання
декількох позитивних результатів тестів для їх ідентифікації або
міжвидової диференціації.

6. Культури сальмонел, ізольовані від хворих людей при спорадичній
захворюваності на гостру кишкову інфекцію (15 штамів) та в осередку
групової захворюваності на сальмонельозну харчову токсикоінфекцію (35
штамів), за вивченням морфологічних, тінкторіальних, культуральних,
біохімічних, серологічних властивостей віднесено до виду S. choleraesuis
subsp. choleraesuis серовар Enteritidis. Всі 50 штамів характеризувались
високим рівнем монотипності біохімічних властивостей, 95% із них були
однотипними в тестах ферментації цукрів, спиртів, амінокислот. Культури
сальмонел різного походження відрізнялись за здатністю ферментувати
арабінозу, L,D-тартрат, чутливістю до сальмонельозного індикаторного
О-фагу та полікомпонентного лікувального сальмонельозного бактеріофагу
груп А, В, С, D, Е.

7. Застосування для внутрішньовидового епідеміологічного типування
клінічно-значущих мікроорганізмів різних таксономічних груп методів
фенотипування (фаго-, антибіотикорезистенстипування для стафілококів, та
біо- і антибіотикорезистенстипування для сальмонел), а також
генотипування (визначення ПП і АПДФЕР ХрДНК) дозволяє диференціювати
штами і групувати їх за подібністю фено- та генотипу, визначати
епідемічно-домінуючі клони та взаємозв’язки між ними. Між фено- і
генотипами, що були визначені у штамів стафілококів і у штамів
сальмонел, не виявлено чіткого кореляційного зв’язку.

8. На теперішній час співвідношення між методами фено- і генотипування
слід оцінювати в площині взаємодоповнення, а не протиставлення.
Удосконалені методи генотипування (визначення ПП, АПДФЕР ХрДНК) при
порівнянні із традиційними методами фенотипування характеризуються вищою
уніфікованістю технології проведення досліджень, достатнім рівнем
чутливості, дискримінантності, більш високим рівнем відтворюваності
результату.

9. Широкомасштабне прикладне застосування методів генотипування для
тестування клінічно-значущих мікроорганізмів, що ізольовані в різні
періоди перебігу епідемічного процесу, дозволить виявити особливу групу
генетичних ознак – маркерів формування епідемічних варіантів збудників
інфекційних захворювань.

Перелік робіт, які опубліковано за темою дисертації

1. Тимченко О.М. Фено- та генотипування шпитальних штамів Staphylococcus
aureus // Вісник СумДУ. –2001. -№1. –С. 143-147.

2. Тимченко О.М. Генотипування госпітальних штамів Staphylococcus aureus
subsp. aureus за допомогою аналізу поліморфізму довжини фрагментів
рестрикції хромосомної ДНК // Експериментальна і клінічна
медиц.–2004.-№2. –С. 72-75.

3. Тимченко О.М., Похил С.І., Федоров Е.І., Деркач С.А., Подаваленко
А.П., Волянська Н.П., Мішукова Т.А., Осолодченко Т.П. “Епідеміологічне,
внутрішньовидове генотипування енте-робактерій – збудників інфекційних
захворювань” (методичні рекомендації) –Харків, 2003. –43 с. (Здобувач –
відповідальний за видання цієї роботи. Удосконалив і уніфікував
молекулярно-гене-тичні методи ЕТ мікроорганізмів (МШМЛ, ВТВП, МЛАБ та
ін.), розробив критерії оцінки результатів ЕТ з використанням методів
АПП і АПДФЕР ХрДНК. Підготував матеріали до друку).

4. Тимченко Е.Н., Волянский Ю.Л., Похил С.И. Анализ рестрикционного
картирования ДНК как метод современного типирования возбудителей
инфекционных заболеваний // Вісник проблем біології та медицини.– 1997.
– Вип. 32. –С. 78-86. (Тимченко О.М. проаналізувала і узагальнила дані
наукової літератури щодо внутрішньовидового ЕТ мікроорганізмів методом
АПДФЕР ХрДНК, обґрунтувала уніфікований протокол досліджень та
запропонувала критерій для вибору ендонуклеаз для сайт-специфічного РА
ХрДНК).

5. Цыганенко А.Я., Тимченко Е.Н., Похил С.И. Рестрикционное картирование
ДНК — как современный метод классификации бактерий // Вісник проблем
біолог. та медицини. –1998. –Вип. 2. –С. 16-26. (Здобувач вивчив і
систематизував дані наукової літератури стосовно існуючих принципів
класифікації бактерій, в т. ч. методів геносистематики. Обґрунтував
доцільність використання для ідентифікації та типування мікроорганізмів
порівняльного аналізу їх геномів методом сайт-специфічної рестрикції
ХрДНК).

6. Федорова Л.Г., Ліман Н.Г., Яковлева З.І., Тищенко Т.В., Тонкошкур
Т.І., Бондаренко А.В., Тимченко О.М., Похил С.І., Козюпа С.М. Фено- та
генотипування клінічних штамів Salmonella choleraesuis subsp.
choleraesuis (Salmonella Enteritidis) // Сб. матер. 6-ой итоговой
региональной науч.-практ. конф. посвящ. 80-летию санэпидслужбы МОЗ
Украины. – Харьков, 2003. – Часть I. –С. 137-145. (Здобувач виконав
експериментальну роботу – вивчив біологічні властивості та провів фено-
і генотипування клінічних ізолятів сальмонел, підготовив матеріали до
публікації).

7. Циганенко А.Я., Тимченко О.М., Похил С.І. Завдання і шляхи
подальшого удосконалення генотипування збудників інфекційних захворювань
за допомогою аналізу поліморфізму довжини фрагментів ендонуклеазної
рестрикції хромосомної ДНК // Експеримент. і клінічна медиц. –2002.
-.№3. –С. 79-83. (Здобувач провів підбір і аналіз наукової літератури з
даної проблеми, обґрунтував напрямки досліджень для подальшого
удосконалення методу АПДФЕР ХрДНК з метою визначення генетичної
спорідненості мікроорганізмів, підготовив матеріали до публікації).

8. Похил С.И., Красовский В.В., Тимченко Е.Н. Определение объема (веса)
инокулята, наносимого с использованием репликатора Семенихиной // Клин.
лаб. диагн. (Москва). — 1998. — №7. -С. 34-36. (Здобувач виконав
експериментальну частину роботи та провів статистичну обробку
результатів досліджень).

9. Похил С.І., Лиманський О.П., Тимченко О.М., Юдін І.П., Волянська Н.П.
Спосіб епідеміологічного, внутрішньовидового генотипування збудників
інфекційних захворювань за допомогою аналізу поліморфізма довжини
фрагментів ендонуклеазної рестрикції хромосомної ДНК // Інформаційний
бюлетень (Додаток до “Журналу Академії медичних наук України”). –Київ,
2002. –Випуск 15. –С. 30. (Здобувач розробив уніфікований протокол
проведення АПДФЕР ХрДНК для ЕТ ЗІЗ, обґрунтував критерії оцінки
результатів їх генотипування).

10. Технологія визначення плазмідного профілю у культур бактерій —
сучасний метод епідеміологічного типування збудників гострих кишкових
інфекцій (ГКІ)/ Похил С.І., Тимченко О.М., Бондаренко А.В., Волянська
Н.П. // Реєстр галузевих нововведень. – МОЗ України, УкрЦНМІПЛР. –Київ,
2000. –Вип. 12-13. –Реєстр. № 118/13/00. –С. 62-63. (Здобувач
удосконалив технологію визначення ПП у мікроорганізмів різних
таксономічних груп та провів експеримен-тальне випробовування цього
методу генотипування при ЕТ ентеробактерій – збудників ГКІ).

Тимченко О.М. Удосконалення молекулярно-генетичних методів
внутрішньовидового епідеміологічного типування клінічно-значущих
мікроорганізмів різних таксономічних груп. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за
спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Інститут мікробіології та
імунології ім. І.І. Мечникова АМН України. –Харків, 2004.

В роботі представлені результати досліджень з удосконалення та
прикладного застосування методів внутрішньовидового епідеміологічного
генотипування збудників інфекційних захворювань за допомогою визначення
у них плазмідного профілю (ПП) та аналізу поліморфізму довжини
фрагментів ендонуклеазної рестрикції хромосомної ДНК (АПДФЕР ХрДНК).

Вперше, на основі експериментально-апробованих, ефективних методів
руйнування клітин мікроорганізмів різних таксономічних груп створено
уніфіковані технології внутрішньовидового генотипування методом
визначення ПП і АПДФЕР ХрДНК та розроблені стандартизовані критерії
оцінки ідентичності електрофоретичних профілів для визначення генетичної
спорідненості штамів.

Вивчено біологічні властивості 17-ти штамів S. aureus subsp. aureus,
ізольованих в осередку шпитальної гнійно-септичної інфекції і 50-ти
штамів S. choleraesuis subsp. choleraesuis серовар Enteritidis,
виділених при спорадичній та груповій захворюваності людей на
сальмонельоз. Проведено внутрішньовидове епідеміологічне фено- і
генотипування (визначення ПП і АПДФЕР ХрДНК) штамів стафілококів і
сальмонел. Підтверджено, що між визначеними фено- і генотипами
мікроорганізмів немає чіткої кореляційної залежності.

Ключові слова: плазмідний профіль, аналіз поліморфізму довжини
фрагментів ендонуклеазної рестрикції хромосомної ДНК, стафілококи,
сальмонели, біологічні властивості, внутрішньовидове епідеміологічне
фено- та генотипування.

Тимченко Е.Н. Усовершенствование молекулярно-генетических методов
внутривидового эпидемиологического типирования клинически-значимых
микроорганизмов различных таксономических групп. — Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по
специальности 03.00.07 – микробиология. – Институт микробиологии и
иммунологии им. И.И. Мечникова АМН Украины. – Харьков, 2004.

В работе представлены результаты исследований, касающиеся
усовершенствования и прикладного использования методов внутривидового
эпидемиологического генотипирования возбудителей инфекционных
заболеваний путем определения у них плазмидного профиля (ПП) и анализа
полиморфизма длинны фрагментов эндонуклеазной рестрикции хромосомной ДНК
(АПДФЭР ХрДНК).

Впервые, с использованием экспериментально-апробированных, эффективных
методов разрушения клеток микроорганизмов различных таксономических
групп созданы унифицированные технологии их внутривидового
генотипирования путем определения ПП и АПДФЭР ХрДНК, разработаны
стандартные критерии оценки идентичности электрофоретических профилей с
целью определения генетического родства штаммов.

Изучены биологические свойства 17-ти штаммов S. aureus subsp. aureus,
изолированных в очаге госпитальной гнойно-септической инфекции и 50-ти
штаммов S. choleraesuis subsp. choleraesuis серовар Enteritidis,
выделенных при спорадической и групповой заболеваемости людей на
сальмонеллёз. Проведено внутривидовое эпидемиологическое фено- и
генотипирование (определение ПП и АПДФЭР ХрДНК) штаммов стафилококков и
сальмонелл. Подтверждено, что между определёнными фено- и генотипами
микроорганизмов нет четкой корреляционной зависимости. При испытании
усовершенствованых методов генотипирования с целью внутривидового
эпидемиологического типирования (ЭТ) клинически-значимых микроорганизмов
разных таксономических групп продемонстрирована эффективность и ряд
преимуществ этих методов (унифицирование технологии проведения
исследований, достаточный уровень дискриминантности, более высокий
уровень воспроизводимости результатов) по сравнению с методами
фенотипирования. ЭТ на основе использования молекулярно-генетических
технологий позволяет определять клональные генотипы возбудителей на
разных этапах развития эпидемического процесса, а также особые группы
генетических признаков – маркеры формирования эпидемических вариантов
возбудителей инфекционных заболеваний.

Ключевые слова: плазмидный профиль, анализ полиморфизма длинны
фрагментов эндонуклеазной рестрикции хромосомной ДНК, стафилококки,
сальмонеллы, биологические свойства, внутривидовое эпидемиологическое
типирование.

Timchenko O.M. An improvement of molecular-genetic methods of
intraspecific epidemiological typing of clinically significant
microorganisms from different taxonomic groups. – The manuscript.

The dissertation for the degree of candidate of medical sciences on
speciality 03.00.07 – microbiology. – I. Mechnikov Institute of
microbiology and immunology of Ukrainian MSA. – Kharkiv, 2004.

In the dissertation, results on improvement and applied use of the
methods of intraspecific genotyping of infectious pathogen agents by
determination of their plasmid profile (PP) and analysis of chromosome
DNA endonuclease restriction fragment length polymorphism (AChrDNA
ERFLP) are presented.

Based on experimentally tested effective methods of microorganisms cells
destroying, unified technologies of intraspecific genotyping by
determination of PP and AChrDNA ERFLP and developed standardized
criteria of estimation of electrophoretic profile identity to determine
genetic relationships between strains are created for the first time.

Biological properties of 17 strains of S. aureus subsp. aureus isolated
in outbreak of hospital suppurative septic infection and 50 strains of
S. choleraesuis subsp. choleraesuis serovar Enteriditis isolated from
patients with salmonellosis at sporadic and group morbidity were
studied. Intraspecific epidemiological pheno- and genotyping
(determination of PP and AChrDNA ERFLP) of staphylococcus and salmonella
strains were carried out. Absence of clear correlative dependence
between pheno- and genotyping is confirmed.

Key words: plasmid profile, analysis of chromosome DNA endonuclease
restriction fragment length polymorphism, staphylococcus, salmonella,
biological properties, intraspecific epidemiological pheno- and
genotyping.

Таблиця 2

Результати фено- і генотипування культур S. choleraesuis subsp.
choleraesuis серовар Enteritidis

Група А

№ штаму

Фенотип

Генотип

Група Б

№ штаму

Фенотип

Генотип

БіоТ АнтрТ * ПП-тип ЕФП-тип

БіоТ АнтрТ * ПП-тип ЕФП-тип

1905, 1956, 2192

danysz

(ratin)** 888486В 1

I

1829 essen (jena)** 473486D

11

V

2520

684486В 4

125, 127, 129, 131

danysz

(ratin) ** 481468В

2909

687486В 7

133, 135, 137, 139,

141, 143, 159, 161, 163

671486B

2861

484486В 10

1915

danysz

(ratin)** 885486В

2

II

145, 147, 1803, 169, 171

474486B

2525, 2646

684486В

153, 1805, 1806

671486D

1984

887486В 3

155, 157

471486D

2631

484486В 5

165, 167, 1802

681486B

2651 danysz

(ratin)** 481486В 6 III

102, 115, 117, 121, 123, 209

683486D

2942-I danysz

(ratin)** 678788В 1

IV

2918

674486D 8

119

673486D

2942-II

684486B 9

106

683486D 12

Примітка: “*” – мнемонічний код за J. Farmer, 1970
антибіотикорезистенстипу (АнтрТ);

“**” – біотип в дужках, визначений за однокомпонентною схемою (здатністю
ферментувати гліцерин в середовищі Штерна), біотип без дужок –
визначений за чотирьохкомпонентною схемою (здатністю ферментувати
L-арабінозу, L-рамнозу, дульцит, гліцерин на середовищі Штерна).

0,1

0,6

2,0

2,2

4,4

6,6

9,4

23,1

(лунки

т.п.н.

1 2 3 4
5 6

0,1

0,6

2,0

2,3

4,4

6,6

9,4

23,1

(лункки

т.п.н

Похожие записи