.

Участь тромбоксану в загибелі гепатоцитів щурів в культурі (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 3437
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

ГРУШКА Наталія Георгіївна

УДК 612.35:612.014.3:615.015.44

Участь тромбоксану в загибелі гепатоцитів щурів в культурі

03.00.13. – Фізіологія людини і тварин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі імунології та цитотоксичних сироваток

Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук

Алексєєва Ірина Миколаївна,

Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України,

завідувач відділу імунології та цитотоксичних сироваток

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Матишевська Ольга Павлівна,

Київський національний

університет імені Тараса Шевченка,

професор кафедри біохімії

кандидат біологічних наук

Розова Катерина Всеволодівна,

Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України,

старший науковий співробітник

відділу з вивчення гіпоксичних станів

Провідна установа: Національний медичний університет ім. О.О.
Богомольця

Захист відбудеться “_15_” _травня_” 2007р. о _14_годині на

засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті
фізіології

ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, м.Київ, вул. Бого-

мольця,4.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології

ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, м.Київ, вул. Бого-

мольця, 4.

Автореферат розісланий “_14_” _квітня_ 2007р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01

доктор біологічних наук
Сорокіна-Маріна З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Ейкозаноїди, похідні арахідонової кислоти за
циклооксигеназним та ліпоксигеназним шляхами її метаболізму, є
молекулами-посередниками міжклітинної взаємодії. Вони активно
синтезуються та метаболізуються в печінці і відіграють суттєву роль в
регуляції її функцій за фізіологічних умов. При патології змінюється
кількість і спектр ейкозаноїдів. В експериментах in vivo показана
гепатопротективна дія одних ейкозаноїдів (простагландинів – ПГЕ2, Е1,
простацикліну) і ушкоджуюча інших (лейкотриєнів, тромбоксанів – Тх)
[Quiniou C. et al., 2006, Yokoyama Y. et al., 2003, Beauchamp M.H. et
al., 2001, Nanji A.A. et al., 1997]. Ця дія може бути обумовлена як
змінами кровотоку, так і безпосереднім впливом на клітини печінки, тим
більше, що на гепатоцитах знайдені рецептори до ряду похідних
арахідонової кислоти. Тому важливим є вивчення впливу ейкозаноїдів на
життєдіяльність і загибель гепатоцитів в культурі. Особливий інтерес
представляє вивчення впливу тромбоксанів (ТхА2 та ТхВ2, який швидко
утворюється при гідроксилюванні ТхА2) на шляхи загибелі клітин печінки
(апоптоз або некроз). Відомо, що тромбоксан А2 відіграє суттєву роль у
регуляції гомеостазу крові. Відомо також, що тромбоксани синтезуються у
клітинах печінки – гепатоцитах і клітинах Купфера і можуть бути
аутокринними та паракринними регулятороми їх функцій [Xu H. et al.,
2005, Yokoyama Y. et al., 2005, Pestel S. et al., 2003, Victorov A.V. et
al., 1995]. Встановлено, що за деяких патологічних умов, при
безпосередньому ураженні гепатоцитів в культурі чотирихлористим вуглецем
(CCl4) утворення ТхВ2 в гепатоцитах значно посилюється [Marinovich M. et
al., 1989, Nagai H., et al., 1989]. Є дані про те, що тромбоксани мають
ушкоджуючу дію на печінку, а блокатори їх синтезу чинять протективний
ефект при ураженні цього органу, однак безпосередній вплив ТхВ2 на
життєздатність гепатоцитів і їх загибелі практично не вивчений.

На сьогоднішній день виділяють три основні типи клітинної смерті –
апоптоз, аутофагічна загибель клітин і некроз, які розрізняють за
морфологічною картиною, механізмами і наслідками для організму.
Механізми апоптозу, які складаються з цілого каскаду процесів в клітині,
завершуються активацією каспаз і ендонуклеаз, що призводить до
конденсації і фрагментації хроматину і ядра, ущільнення цитоплазми,
утворення апоптотичних тілець з їх наступним фагоцитозом. Аутофагічна
загибель – самоперетравлювання клітини за допомогою утворення
аутофагосом – вакуолей з клітинними органелами і/або білковим
матеріалом, які зливаються з лізосомами. Для некротичної загибелі
характерні перш за все втрата цілості плазматичної мембрани, яка
призводить до виходу клітинного вмісту в навколишні тканини та розвитку
запального і імунного процесів. Таким чином, апоптоз являє собою більш
фізіологічну форму загибелі клітин і є механізмом підтримання клітинного
гомеостазу. Однак, при порушенні регуляції апоптозу, при його
неконтрольованому збільшенні апоптоз є патологічним чинником. Порушення
регуляції апоптозу в печінці призводить до виникнення різних
захворювань, пов”язаних з посиленням чи, навпаки, пригніченням апоптозу.
Так, індукція апоптозу була показана при аутоімунному гепатиті,
вірусному гепатиті С та В, ішемії-реперфузії, ендотоксичному ураженні,
холестазі та інших захворюваннях печінки; пригнічення апоптозу сприяє
онкологічним захворюванням [Yan X.B. et al., 2005, Дмитреева и др. 2003,
Higuchi H. et al., 2003, Neuman M.G., 2001, Бабак О.Я., 1999]. Механізми
загибелі клітин знаходяться в центрі уваги сучасної біології, як і
розробка нових терапевтичних засобів, що здатні коригувати ці процеси. В
дослідженні ураження органів і клітин, зокрема гепатоцитів, доцільно
розрізняти морфологічні ознаки, що характеризують стадію апоптотичної
загибелі, а також прояви некрозу, що важливо для встановлення механізмів
деструкції печінки при різних типах її ушкодження. Відомо, що
морфологічні та біохімічні риси окремих типів клітинної смерті
перекриваються. Два загальновизнані типи загибелі клітин – апоптоз та
некроз – довгий час розглядалися як фундаментально різні процеси, але
останнім часом встановлено, що риси апоптотичної, аутофагічної та
некротичної загибелі часто співіснують.

Все це призводить до необхідності детального вивчення участі
простаноїдів, зокрема ТхВ2, в регуляції життєздатності клітин та балансу
процесів некрозу і апоптозу гепатоцитів за нормальних та патологічних
умов. Важливо також встановити механізми його впливу на загибель клітин,
з метою корекції цього процесу. Адекватною експериментальною моделлю для
вивчення безпосередньої дії простаноїдів та блокаторів їх синтезу на
процеси апоптозу, аутофагії та некрозу є первинна культура гепатоцитів.
Такі клітини є нетрансформованими, ця модель дозволяє вивчати зміни в
гепатоцитах, не опосередковані процесами, що відбуваються на органному
та організменному рівнях.

Метою дослідження було оцінити вплив ТхВ2 на шляхи загибелі
культивованих гепатоцитів щурів (апоптоз, некроз, аутофагія) в нормі та
при їх ушкодженні чотирихлористим вуглецем та хенодезоксихолевою
кислотою. Для дослідження цієї мети були поставленні наступні завдання.

1. Одержати і охарактеризувати первинну культуру гепатоцитів щурів,
оцінити спонтанну клітинну загибель в ній за даними подвійного
флуоресцентного забарвлення ядер гепатоцитів та електронної мікроскопії.

2. Вивчити кількість гепатоцитів, що мають прояви апоптотичної,
некротичної і аутофагічної загибелі за умов дії різних доз екзогенного
ТхВ2 в динаміці.

3. Оцінити активність каспаз 3 та 8 при дії екзогенного ТхВ2, та вплив
циклоспорину А на розвиток апоптозу гепатоцитів.

4. Оцінити вміст апоптотичних та некротичних гепатоцитів у культурі, на
двох моделях ушкодження клітин: 1) токсичного – при дії CCl4 та 2)
індукованого хенодезоксихолевою кислотою (ХДХК).

5. На двох моделях ураження гепатоцитів дослідити вплив екзогенного ТхВ2
на загибель клітин в порівнянні з дією ПГЕ2 і ПГF2a.

6. Вивчити дію блокатора циклооксигенази ацетилсаліцилової кислоти та
блокатора тромбоксансинтази бензилімідазолу на апоптотичну і некротичну
загибель гепатоцитів, ушкоджених CCl4 та ХДХК.

Об’єкт дослідження: культура гепатоцитів щурів.

Предмет дослідження: загибель інтактних та ушкодженних CCl4 і ХДХК
гепатоцитів за апоптотичним, некротичним та аутофагічним шляхами під
впливом ТхВ2.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тема дисертації
пов’язана з дослідженнями, які виконуються відділом імунології і
цитотоксичних сироваток Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН
України “Вивчення ролі оксиду азоту і ейкозаноїдів в механізмах розвитку
гуморальних імунних реакцій та змін функціональної активності клітин під
впливом антитіл“ (2001-2004рр.), та “Вивчення механізмів розвитку
імунної патології печінки і жіночої репродуктивної системи та шляхів її
корекції“ (2005-2007рр.).

Наукова новизна одержаних результатів: Вперше показано, що під дією ТхВ2
у культурі гепатоцитів підвищується кількість клітин з морфологічними
ознаками апоптозу та відбувається активація каспази 3. Вперше
встановлено, що внесення інгібітора утворення мітохондріальних пор
циклоспорину А в культури гепатоцитів призводило до зменшення кількості
апоптотичних клітин в порівнянні з дією ТхВ2, що свідчить про участь
мітохондріального шляху в проапоптотичній дії ТхВ2. Вперше показано, що
ТхВ2 посилює апоптоз гепатоцитів за умов їх токсичного ушкодження (ССl4)
або ушкодження жовчними кислотами (ХДХК). Вперше охарактеризовано
морфологічні форми апоптозу гепатоцитів за умов дії ТхВ2 в нормі та при
ушкодженні ССl4 або ХДХК.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Результати
дослідження мають фундаментальне значення для з’ясування механізмів
регуляції апоптотичної та некротичної загибелі клітин, зокрема
гепатоцитів, в нормі та при патології. Їх практичне значення полягає в
обгрунтуванні необхідності диференційованного вивчення апоптотичної і
некротичної загибелі клітин при захворюванні печінки різної етіології, а
також в обгрунтуванні можливості корекції цих процесів за допомогою
впливу на синтез тромбоксану.

Особистий внесок здобувача. При виконанні роботи здобувачем проведено
науковий пошук і обгрунтування вибраного напрямку досліджень. Виконані
експерименти по вивченню впливу екзогенних ТхВ2, ПГЕ2, ПГF2a та
блокаторів їх синтезу на загибель інтактних і ушкодженних гепатоцитів.
Досліджено вплив циклоспорину А на загибель клітин; вивчено зміни
активності каспаз у культуральному середовищі гепатоцитів. Проведено
статистичну обробку і аналіз одержаних результатів, підготовлено до
публікації матеріали стосовно основних положень експериментальних
досліджень. Експериментальна робота по одержанню і культивуванню
гепатоцитів проведена спільно з співробітниками відділу іммунології та
цитотоксичних сироваток Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН
України.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації
доповідалися на Пленумі наукового товариства патофізіологів України
(Одеса, 19-21 вересня 2002р.); на конференції молодих учених Інституту
фізіології ім.О.О.Богомольця НАНУ (Київ, листопад 2003р); на конференції
студентів та молодих вчених по молекулярній біології та генетиці з
міжнародною участю, (Інститут молекулярної біології та генетики, Київ,
25-27 вересня, 2003р); на 17 з’їзді фізіологів України (Чернівці, 18-20
травня 2006р).

Публікації. Результати дисертації викладені в 16 публікаціях: статті –
6, тези конференцій, симпозіумів, з’їздів, пленумів – 10.

Структура та обсяг дисертації: Дисертація викладена на 135 сторінках
друкованого тексту та ілюстрована 15 рисунками і 14 таблицями. Робота
складається зі вступу, огляду літератури, розділу опису матеріалів і
методів дослідження, 5 розділів результатів власних досліджень, розділу
аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, списку
використаної літератури, що нараховує 164 найменування.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження.

Одержання культури гепатоцитів щурів. Для отримання клітин печінки були
використані статевозрілі самці щурів лінії Вістар масою 170-180 г, що
утримувалися на стандартному раціоні віварію. При роботі з тваринами
дотримувались Міжнародних принципів Європейської конвенції про захист
хребетних тварин.

Виділення гепатоцитів проводили в стерильних умовах за методом Сеглена з
деякими модифікаціями [Ruan Z. et al, 2004]. Тварин наркотизували
нембуталом (40 мг/кг, внутрішньоочеревинно) та вводили гепарин (100 од.)
в хвостову вену. Далі здійснювали двохетапну перфузію печінки через
нижню полу вену спочатку безкальцієвим розчином Хенкса (7-10 хв.), що
містив 9 ммоль/л HEPES і 0,5 ммоль/л EГTA, після чого продовжували
перфузію 0,05 % розчином колагенази (Sigma, тип 1А) в розчині Хенкса з 9
ммоль/л HEPES і 5 ммоль/л CaCl2 (рН 7,4; 37оС) протягом 25-30 хвилин.
Капсулу печінки розривали, отриману суспензію клітин фільтрували та
паренхіматозні клітини осаджували двічі протягом 30 сек при 280 g.
Додатково гепатоцити очищали центрифугуванням в дискретному градієнті
густини Перколу (Sigma, USA) протягом 30 хвилин при 750 g (20оС).
Очищені гепатоцити збирали на межі розділу між 73 % і 57 % розчином
Перколу.

Культивування гепатоцитів проводили в середовищі культивування (RPMI
1640 (Sigma) з 15 ммоль/л HEPES та 10% ембріональної телячої сироватки
та антибіотиків) в 24-лункових планшетах для культур клітин (“Sigma”,
США) на покритому колагеном склі, або в 6-лункових планшетах, дно яких
покривали полі-L-лізіном, в залежності від схеми експерименту.
Гепатоцити вносили в кількості 1,5·105 клітин на лунку 24-лункового
планшета в 0,6 мл середовища культивування, або в кількості 2·106 клітин
на лунку 6-лункового планшета в 2 мл культурального середовища. Через 3
години після посадки культури відмивали від неприкріплених клітин. Після
18-годинного культивування моношар гепатоцитів відмивали, вносили
середовище інкубації та здійснювали відповідні для різних серій
експериментів впливи.

1 серія –екзогенний ТхВ2 (“Sigma”, США), вносили в культури двічі з
інтервалом 1 годину в кінцевих концентраціях – 0,001, 0,01, 0,1 і 1
мкмоль/л.

2 серія – СС14 (попередньо розчинений в диметилсульфоксиді –ДМСО),
вносили в культури в кінцевій концентрації 10 ммоль/л. Екзогенний ТхВ2
(0,1 мкмоль/л) і екзогенні ПГЕ2 та F2a (Pharmacia, Бельгія) (3 мкмоль/л)
вносили двічі, за 30 хвилин до ушкоджуючого впливу СС14 і через 30
хвилин після нього.

3 серія – ХДХК вносили в культури в кінцевій концентрації 100мкмоль/л;
екзогенний ТхВ2 (0,1 мкмоль/л) і екзогенні ПГЕ2 та F2a (Pharmacia,
Бельгія) (3 мкмоль/л) вносили двічі, за 30 хвилин до ушкоджуючого впливу
ХДХК і через 30 хвилин після нього.

4 серія – в культуральне середовище вносили блокатори: загальний
блокатор циклооксигенази – ацетилсаліцилову кислоту (АСК) в кінцевій
концентрації 200 мкмоль/л і блокатор тромбоксансинтетази –
бензилімідазол (БІА) в кінцевій концентрації 20 мкмоль/л. Через 15
хвилин додавали СС14 (10 ммоль/л) або ХДХК (100мкмоль/л).

5 серія – в культуральне середовище вносили блокатор утворення
мітохондріальних пор циклоспорин А в кінцевій концентрації 1 мкмоль/л,
через 15 хвилин після впливу – Тх В2 в кінцевій концентрації 0,1
мкмоль/л.

Контролем для кожної концентрації ТхВ2 слугували культури, оброблені
етанолом в концентрації, що дорівнювала такій в відповідному розчині
ТхВ2.

Оцінка апоптозу та некрозу гепатоцитів за методом прижиттєвого
подвійного забарвлення флуоресцентними барвниками. Культури клітин
прижиттєво забарвлювали розчином барвників Хехст 33342 (“Sigma”, США) та
пропідіума йодид (“Sigma”, США) [Shimizu S. et al., 1996]. Йодид
пропідіума проникає тільки у клітини з ушкодженими мембранами і
забарвлює їх ядра в оранжевий колір. Барвник Хехст 33342 проникає і
через неушкоджені мембрани і забарвлює ядра живих клітин і клітин, що
гинуть за апоптотичним шляхом, у зелено-синій колір. Зв’язані з
хроматином барвники дають змогу оцінити морфологічні риси ядерного
матеріалу, притаманні апоптозу: периферичне розташування хроматину, його
конденсацію, фрагментацію ядер, а також розпад гепатоцитів на
апоптотичні тільця.

Підрахунок живих, некротичних та апоптотичних клітин здійснювали за
допомогою люмінесцентного мікроскопа (МЛ-2) з водно-імерсійним
об’єктивом х70 та окуляром х 5. В кожному експерименті оцінювали стан не
менш ніж 600 клітин. У випадку неоднорідної популяції, як при ушкодженні
СС14, підраховували в кожній культурі 800-1200 клітин на межі зони
ушкодження.

Електронно-мікроскопічні дослідження апоптотичної та некротичної
загибелі гепатоцитів.

Гепатоцити культивували за вищеописаною схемою в обробленних колагеном
8-ми лункових планшетах для електронної мікроскопії з відривним дном
(“Lab-Tek”) в 0,6 мл культурального середовища. Препарати готували за
загальноприйнятою методикою.

Визначення активності каспаз.

Активність каспаз в клітинному лізаті вивчали колориметричним методом
(Сaspase-3/CPP32 Colorimetric Assay Kit, FLICE/Сaspase-8 Colorimetric
Protease Assay Kits) за інструкцією фірми-виробника набору (BioVision
Research Products, USA). Метод базується на спектрофотометричному
визначенні кількості хромофора р-нітроаніліда (pNA), після його
відщеплення від міченого субстрата (для каспази-3 – DEVD-pNA і для
каспази 8 – IETD- pNA).

Забарвлення аутофагічних структур.

Оцінку активності процесів аутофагії в умовах дії ТхВ2 в концентрації
0,1 мкмоль/л проводили за допомогою флуоресцентного барвника
монодансилкадаверіна (МДК) фірми “Sigma” у кінцевій концентрації 50
мкмоль/л на протязі 10 хв у темряві за інструкцією виробника. ТхВ2
вносили в культури двічі з інтервалом в 1 год. Через 3 год інкубації з
ТхВ2 здійснювали забарвлення МДК. Після відмивання холодним ЗФР (чотири
рази), здійснювали прижиттєву оцінку процесів аутофагії, підраховуючи
кількість клітин з вираженою гранулярною флуоресценцією, оцінювали
забарвлення не менш ніж 200 клітин в кожній культурі. Підраховували
кількість клітин з сильним, слабим забарвленням, а також без забарвлення
і вираховували їх відсоток.

Представлені дані є результатом трьох-шести незалежних експериментів. В
кожному експерименті вплив досліджуваних речовин здійснювали паралельно
в триплікатах культур [Munafo D.B., 2001].

Статистична обробка матеріалу проведена з обчисленням критерію Стьюдента
[Лакин Г.Ф., 1990].

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Характеристика культури гепатоцитів.

За оцінкою методом включення барвника (трипанового синього) кількість
виділених живих гепатоцитів перед їх культивуванням складала 84,6±5,6%.
Домішок непаренхіматозних клітин (НПК) в суспензії гепатоцитів, оцінений
за морфологічними ознаками, складав при посадці 4,23%(1,68% від
загальної кількості клітин, тоді як кількість цих клітин у печінці
складає -30-40%. Через 18 год після посадки культури гепатоцитів мали
вигляд моношару полігональних клітин. Їх можна охарактеризувати, як
культури високої щільності, що приблизно відповідає щільності злиття
клітин. Гепатоцити розпластувалися та утворювали контакти з сусідніми
клітинами. Виявлялися одно-, дво- та багатоядерні гепатоцити. Домішок
НПК в культурах гепатоцитів після 18-42 годин культивування складав
0,92±0,07% від загальної кількості клітин, тобто в процесі прикріплення
клітин до колагенового субстрату, їх культивування та відмивання
відбувалося подальше очищення культур гепатоцитів від НПК.

Загибель культивованих гепатоцитів щурів та морфологічні ознаки
клітинної загибелі під впливом екзогенного ТхВ2 за даними люмінесцентної
та електронної мікроскопії.

Встановлено, що екзогенний ТхВ2 в кінцевих концентраціях 0,001, 0,01,
0,1 і 1 мкмоль/л за даними люмінесцентної мікроскопії зменшував
кількість живих гепатоцитів та підвищував кількість гепатоцитів з
морфологічними ознаками апоптозу відповідно в 2,8 (Pушкодженою мембраною (клітини, в яких процес апоптозу був перерваний на стадії конденсації ядер); 3) гепатоцити, дещо зменшені в розмірах, з сильноконденсованим і фрагментованим хроматином, зменшене у розмірах ядро зберігає цілісність, мембрана неушкоджена; 4) – гепатоцити з вираженими ознаками апоптозу, як і тип 3, однак з ушкодженою плазматичною мембраною. Ці клітини мають, таким чином, ознаки вторинного некрозу, що відбувся на фоні розвинутого апоптотичного процесу; 5) – гепатоцити, що розпались на апоптотичні тільця, які містять залишки ядерного матеріалу. Встановлено, що при додаванні в культуру інтактних гепатоцитів ТхВ2 в кінцевих концентраціях 1, 0,1, 0,01 і 0,001мкмоль/л через 4, 8 і 24 год збільшується кількость гепатоцитів з конденсованим хроматином (тип 1), не виявлено значних змін кількості клітин з морфологічними ознаками, що характеризують пізні стадії апоптозу (тип 3, 4 і 5), або постапоптотичного некрозу (тип 2, 4) (Таблиця 2). Ці дані підтверджуються електронно-мікроскопічними дослідженнями: морфологічні зміни, спричинені ТхВ2, виявлялися переважно у ядрі, частково у цитоплазмі, але не у органелах і свідчили про підсилення ранніх стадій апоптозу. Слід відмітити, що в широкому спектрі морфологічних змін за умов захворювань печінки є такі, що співпадають з відміченими нами: каріопікноз, фрагментація ядер, конденсація хроматину, його крайове розташування. Морфологічна форма ядер – “пісочні ядра гепатоцитів” є характерною для деяких видів патології печінки, особливо хронічного вірусного гепатиту [Бабак О.Я., 1999]. Це ядра з периферичним розташуванням конденсованого ядерного хроматину, що співпадає з основною морфологічною формою апоптозу гепатоцитів за умов дії ТхВ2. Як і в наших дослідах, при захворюваннях печінки апоптоз часто супроводжуються процесами вторинного некрозу. Електронномікроскопічні дослідження показали, що в культурах гепатоцитів, в які вносили ТхВ2 в кінцевих концентраціях 0,1 і 0,01 мкмоль/л протягом 4 год, підвищувалася кількість гепатоцитів із зміненими ядрами. Спостерігалася конденсація хроматину з крайовим його розташуванням (Рис 1б). Конденсований хроматин мав гомогенний вигляд; в його масі інколи відмічалося утворення везикул. Ядра ущільнені, з інвагінаціями. Ядерна мембрана втрачала свою чітку двошарову структуру, однак конденсований хроматин лишався в межах зони ядра, як компактне утворення (Рис 1в). Описані зміни ядер можна віднести до апоптотичних, оскільки при некрозі ніколи не спостерігається пікноз ядер. Ядерця ущільнювалися та зливалися з конденсованим хроматином. Цитоплазма таких клітин ущільнена, осмиофільна, що свідчить про втрату води (Рис 1в). Цитоплазматичні органели таких клітин (мітохондрії, плазматичний ретикулум і комплекс Гольджі) переважно не піддавалися змінам і мали неушкоджений вигляд. Спостерігалося також утворення вип’ячувань цитоплазми (blebs) і відшнурування частин цитоплазми й утворення апоптотичних тілець (Рис 1г). Рис. 1. Ультраструктура інтактних гепатоцитів (а) та при дії екзогенного ТхВ2 (0,1 мкмоль/л) (б – початкова стадія конденсації хроматину, в – виражена стадія конденсації хроматину, г - утворення вип’ячувань цитоплазми та апоптотичних тілець) через 4 год культивування. (М – мітохондрії, X- хроматин, В - везикули в мaci хроматину, К.Х. - конденсований хроматин, ЯМ - ядерна мембрана, У.Ц. – ущільнена цитоплазма, А - апоптотичні тільця, b - blebs, Е.Р.- щільно упакований ендоплазматичний ретикулум, В – вакуолі). Дія циклоспорину А на викликану ТхВ2 загибель гепатоцитів. З метою встановлення механізмів проапоптотичної дії ТхВ2 ми використали циклоспорин А –антибіотик, що інгібує утворення мітохондріальних пор, які призводять до переходу мембрани мітохондрій в стан високої проникливості (MPT-mitochondrial permeability transition pores). Це попереджує вихід цитохрому c з мітохондрій і пов’язану з цим активацію каспази 3 і апоптотичні морфологічні зміни ядер. Внесення інгібітора МРТ в оброблені ТхВ2 культури (Таблиця 1) призводило до значного зменшення кількості клітин що гинули за апоптотичним шляхом в порівнянні з дією ТхВ2. Вірогідних змін кількості некротичних клітин при дії циклоспорину А виявлено не було. Дані про вплив циклоспорину А на склад гепатоцитів з різними морфологічними ознаками апоптозу при дії ТхВ2 (Таблиця 2) показали, що не відбулося змін у співвідношенні різних морфологічних стадій апоптозу, однак спостерігалось зменшення кількості гепатоцитів на стадії конденсації хроматину (тип 3). Дані про зниження індукованого ТхВ2 апоптозу в умовах застосування інгібітора МРТ циклоспорина А свідчать, що дія ТхВ2 опосередковується, принаймні частково, через утворення мітохондріальних пор. Відомо, що при відкриванні мітохондріальних пор з мітохондрії в цитозоль вивільнюється цитохром c, який викликає активацію каспази 9 й, в подальшому, ефекторної каспази 3. Нами показано, що внесення ТхВ2 в культуральне середовище вже через 4 год призводило до активації каспази 3 в 1,12 рази (Pnf ? a ` E E &ned f Ue ^„Ly D I ae @ B b ? | ? ¦$oaaUe*EEEEEEEEUeUeUeUeUe?? x‚z$|F}2?ue…?†??AE?$?l?oeaOOEEEEE1/4®®aaaca ?некро-тичних 4 год 8 год 24 год Контроль до ТхВ2 93,0 ±0,6 4,95 ±0,49 2,07 ±0,28 93,8 ±0,8 4,65 ±0,58 1,55 ±0,34 94,4 ±1,0 3,50 ±0,24 2,25 ±0,91 ТхВ2 89,3 ±1,1** 8,00 ±0,66** 2,75 ±0,88 88,9 ±0,9*** 8,86 ±0,75*** 2,20 ±0,54 92,4 ±0,8 6,37 ±0,71* 1,26 ±0,26 ЦспА+ТхВ2 90,6 ±1,06 5,70 ±0,67# 3,73 ±1,02 92,1 ±1,07# 4,22 ±0,70### 3,68 ±0,92 94,2 ±0,50 3,99 ±0,64# 1,78 ±0,48 *P Рис. 3. Вплив екзогенного ТхВ2 (0,1 мкмоль/л) на кількість культивованих гепатоцитів щурів з різними морфологічними рисами апоптозу (у % до загальної кількості клітин) через 4 год після обробки ССl4 (І) або ХДХК (ІІ). *P

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020