НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ФІЗИКО-ХІМІЧНИЙ ІНСТИТУТ ім. О.В. БОГАТСЬКОГО

СОБОЛЄВ-БУТОВЧЕНКО

Євген Олександрович

УДК 547.918:543.422:582.5/.9

Тритерпеновi глiкозиди фатсії японської FATSIA JAPONICA

02.00.10 — біоорганічна хімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата хімічних наук

Одеса – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі органічної хімії Таврійського національного
університету ім. В.І. Вернадського Міністерства освіти та науки України.

Науковий керівник:

доктор хімічних наук, доцент

Гришковець Володимир Іванович,

Таврійський національний університет

ім. В.І. Вернадського, завідувач кафедри фізичної та аналітичної хімії

Офіційні опоненти:

доктор хімічних наук, професор

Іванов Едуард Іванович,

Фізико-хімічний інститут

ім. О. В. Богатського НАН України, провідний науковий співробітник

кандидат хімічних наук, старший

науковий співробітник

Данилова Олена Іванівна,

Одеська національна харчова академія,

начальник відділу комерціалізації об’єктів інтелектуальної власності

Провідна установа: Державний науковий центр лікарських засобів НАН
та МОЗ України, лабораторія хімії та технології фенольних препаратів, м.
Харків.

Захист відбудеться 7 липня 2005 р. о 12 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 41.219.02 при Фізико-хімічному інституті
ім. О.В. Богатського НАН України за адресою: 65080, м. Одеса,
Люстдорфська дорога, 86.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Фізико-хімічного інституту
ім. О.В. Богатського НАН України.

Автореферат розісланий 4 червня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

к.х.н, с.н.с.
Литвинова Л.О. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Відомо, що більшість представників родини Araliaceae
широко використовується як в народній медицині, так і в комерційних
лікарських засобах. Є дані літератури щодо застосування екстрактів з
фатсії японської в традиційній японській медицині. Також виконана значна
дослідницька робота з вивчення біологічної активності екстрактів та
індивідуальних очищених сапонінів з багатьох інших видів рослин цієї
родини, в яких розглянуто різноманітні види активності – фунгіцидна,
іхтіотоксична, антивірусна, цитотоксична та антиракова, антимутагенна та
ряд інших.

1975-1987 рр. декілька груп японських і грузинських вчених неодноразово
проводили вивчення глікозидного складу фатсії японської. Але отримані
ними результати не зовсім надійні, а ряд запропонованих структур є
сумнівними. Тому в дисертації на основі сучасних ефективних методів
структурного аналізу – різноманітних варіантів спектроскопії ЯМР дано
точне підтвердження структур глікозидів.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Вивчення
глікозидного складу фатсії японської проведено в рамках
науково-дослідної роботи кафедри органічної хімії Таврійського
національного університету ім. В.І. Вернадського за програмою “Вивчення
будови і біологічних властивостей вуглеводів та вуглеводовмісних сполук
та біополімерів” (№ держ. реєстрації 0197U001964 – 1996–2000 рр.), а
також за темою: “Отримання нових біологічно активних сполук на основі
мурамоїлдипептиду та природних тритерпеноїдів” (№ держ. реєстрації
0197U000423 – 1997–1999 рр.). У зазначених працях автор був співавтором,
його особистий внесок полягав у вилученні окремих тритерпенових
глікозидів, вивченні їх будови та біологичної активності.

Мета і завдання дослідження. Виділення індивідуальних тритерпенових
глікозидів з різних органів фатсії японської, встановлення повної будови
глікозидів, вивчення їх гемолітичної активності та гіперполяризуючої дії
на ізольовані нейрони.

Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:

— Виділення, очищення та поділ тритерпенових глікозидів з листя,
насіння, перикарпію плодів та квіткових бутонів фатсії японської.

— Визначення будови виділених тритерпенових глікозидів з використанням
хімічних, біохімічних методів та різноманітних варіантів одно- та
двовимірної спектроскопії ЯМР.

— Якісний та кількісний аналіз вмісту тритерпенових глікозидів в
різноманітних органах фатсії японської.

— Виявлення особливостей глікозидного складу фатсії японської у
порівнянні з іншими представниками родини аралієвих.

— Виявлення найбільш активних глікозидів з гемолітичною активністю та
гіперполярізуючою дією на ізольовані нейрони молюска.

Об’єкт дослідження — листя, насіння, перикарпій плодів та квіткові
бутони фатсії японської.

Предмет дослідження — тритерпенови глікозиди.

Методи дослідження – хімічні та спектральні методи, хроматографія.

Наукова новизна отриманих результатів:

Вперше проведено комплексне вивчення глікозидного складу різних органів
фатсії японської – листя, насіння, перикарпію плодів та квіткових
бутонів. Вилучено і визначено будову 41 тритерпенового глікозиду, 32 з
яких дотепер не були знайдені у фатсії японської, а 14 глікозидів є
новими сполуками. Доведено наявність у фатсії японській значної
кількості раніше невідомих ацетильованих глікозидів. Доведено, що у
фатсії є 11 глікозидів, етерифікованих одним або кількома залишками
оцтової кислоти. З квіткових бутонів фатсії японскої виділено два нові
ацетильовані глікозиди ехіноцистової кислоти:
3-O-(3-O-ацетил-б-L-арабінопіранозил)- і
3-O-(4-O-ацетил-б-L-арабінопіранозил)-28-О-б-L-рамнопіранозил-(1?4)-О-(6
-О-ацетил-в-D-глюкопіранозил)-6-О-в-D-глюкопіранозилові естери
ехіноцистової кислоти.

З насіння фатсії японської виділено 4 глікозиди гіпсогеніну, які раніше
були невідомі: 3-О-в-D-глюкопіранозил-(1?2)-О-в-D-глюкопіранозид
гіпсогеніну і 3-О-в-D-галактопіранозил-(1?2)-О-в-D-глюкопіранозид
гіпсогеніну та їх 28-О-в-D-(1?6)-О-в-D-глюкопіранозилові естери.
Глікозиди гіпсогеніну вперше знайдені у фатсії японській.

Вперше вивчено гіперполяризуючу дію тритерпенових глікозидів на нейрони
молюска Helix pomatia.

Практичне значення одержаних результатів полягає у тім, що на базі
комплексного вивчення глікозидного складу різних органів фатсії,
показано що ця рослина є доступним джерелом для одержання тритерпенових
глікозидів як відомих раніше, так і виділених уперше.

Були запропоновані і опрацьовані методики виділення тритерпенових
глікозидів, що дозволило отримати 41 глікозид, 32 з яких раніше не були
виявлені в фатсії, а 14 виявилися новими сполуками.

Показано, що тритерпенови глікозіди мають гемолітичну активність та
виявляють гіперполяризуючу дію на нейрони молюска Helix pomatia. Це є
підставою для пошуку нових фізіологічно активних речовин у ряді
тритерпенових глікозидів.

Особистий внесок здобувача полягає у самостійній роботі з постановки
завдань і вибору методів дослідження. Автор самостійно спланував і
провів експериментальну роботу зі збору і підготовці сировини,
виділенню, поділу, очищенню тритерпенових глікозидів і наступному
встановленню будови отриманих індивідуальних глікозидів з використанням
хімічних методів. Інтерпретація ЯМР-спектрів здійснювалася разом з
науковим керівником.

Вивчення гіперполяризуючої дії було проведено разом з д.б.н. Коренюком
І.І. і аспіранткою Костюченко О.В. (Таврійський національний
університет, м. Сімферополь). Гемолітична активність вивчалась разом з
науковим керівником.

ЯМР-спектри глікозидів були отримані співробітниками Інституту
органічної хімії РАН (м. Москва) д.х.н., професором Шашковим О.С. та
м.н.с., к.х.н.

Качалою В.В.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були
представлені: на Міжнародному симпозіумі “Сапоніни у їжі, кормах та
лікарських рослинах” (Пулаві, Польща, 1999); на I республіканській
конференції молодих вчених Криму (Сімферополь, Україна, 2000); на XX
Міжнародному симпозіуму з вуглеводів (Гамбург, Німеччина, 2000); на XIX
Українській конференції з органічної хімії (Львів, 2001); на IV
Міжнародному симпозіуму з хімії природних сполук (Іспарта, Туреччина,
2001); на XI Європейському симпозіумі з вуглеводів (Лісабон, Португалія,
2001); на XVI Міжнародному симпозіумі з глікокон’югатів (Гаага,
Нідерланди, 2001); на Науково-практичних семінарах «Пошук та розробка
серцево-судинних засобів» (Алушта, Україна, 2001); на Міжнародній
науково-практичній конференції «Нові технології отримання та
використання биологічно активних речовин (Алушта, Україна, 2002); на II
Українській конференції з прикладної фізичної хімії (Алушта, Україна,
2004).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 7 статей у наукових
фахових виданнях, 1 публікація у матеріалах симпозіуму, 13 тез доповідей
на симпозіумах та конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, чотирьох
розділів, висновків та списку використаної літератури та двох додатків.
Загальний обсяг роботи нараховує 146 сторінок машинописного тексту, 9
таблиць, 13 рисунків. Бібліографія включає 177 джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У першому розділі проведено критичний огляд попередніх робіт японських і
грузинських дослідників, що присвячені вивченню глікозидного складу
Fatsia japonica. Показано, що результати деяких досліджень не
узгоджуються з роботами інших груп вчених, а методи, які використано для
визначення будови ізольованих глікозидів, є не зовсім надійними.

Подано огляд публікацій з ацільованих глікозидів рослин родини
араліевих.

Наведені дані літератури з біологічної активності тритерпенових
глікозидів, розглянуті вивчені види їх біологічної дії.

У другому розділі описані використані в ході дослідження методи,
методика дослідження.

У третьому розділі наведено результати досліджень та їх обговорення.

1. Виділення, поділ та очищення тритерпенових глікозидів. Для виділення
суміші гликозидів використовували вичерпну екстракцію знежиреної
сировини водним ізопропиловим спиртом. Після випарювання спиртових
екстрактів, залишок розчиняли у водному бутанолі і бутанольний прошарок
промивали водою для вилучення супровідних фенольних глікозидів, вільних
цукрів, солей та інших сильно полярних сполук.

Одержавши очищені суми глікозидів, поділяли їх препаративною
хроматографією на силікагелі. Використання цього методу засноване на
його високій ефективності у поділі складних сумішей природних продуктів.
Для елюювання використовували нейтральні системи розчинників
хлороформ–етанол–вода, які дозволяють уникнути дезацилювання під час
поділу. У більшості випадків при первинному поділі очищеної суми
тритерпенових глікозидів такий підхід дозволяв одержати окремі глікозиди
або вузькі фракції близьких до хроматографічної рухомості сполук.
Рехроматографія цих фракцій на мікросферичному силікагелі зі значним
співвідношенням адсорбент/адсорбат найчастіше дозволяла розділити їх на
окремі глікозиди. Для очищення тритерпенових глікозидів від супровідних
фенольних сполук використовували додаткову хроматографічну очистку
глікозидів на силікагелі.

В результаті з насіння фатсії японської було виділено 16 тритерпенових
глікозидів, із перикарпію плодів отримали у чистому вигляді 10
тритерпенових глікозидів, із квіткових бутонів та листя також виділили
по 15 глікозидів.

2. Визначення будови виділених глікозидів. Глікозиди, що наведені у
табл. 2.1 і виділені у ході цього дослідження з різноманітних органів
фатсії японської, є раніш відомими тритерпеновими глікозидами. Попередні
дані про будову цих глікозидів були отримані на основі даних хімічних
методів, а остаточне підтвердження будови було зроблено з використанням
різноманітних методик ЯМР-спектроскопії. Перш за все віднесення сигналів
було зроблено шляхом порівняння з численними даними літератури про
хімічні зсуви.

Оскільки у попередніх роботах з вивчення глікозидного складу фатсії
японської для глікозидів з трисахаридним фрагментом у С-28 атома
аглікону (глікозиди 5-7) раніше було запропоновано 1?4-тип глікозидного
зв’язку між залишками глюкопіраноз, що знаходиться у суперечності зі
структурою цього трисахаридного фрагмента у глікозидах з інших
досліджених рослин родини аралієвих, ми провели точний та незаперечний
доказ 1?6-типу глікозидного зв’язку у цьому фрагменті на підставі
різноманітних методик ЯМР-спектроскопії на прикладі глікозиду 5. Повні
віднесення сигналів скелетних протонів моносахаридних залишків зроблені
на підставі даних двовимірних спектрів COSY і TOCSY, починаючи від
сигналів аномерних протонів моносахаридних фрагментів. Після цього на
основі спектру HSQC (рис. 2.1) виконані повні та однозначні віднесення
сигналів С-атомів моносахаридних залишків. Аналіз величин хімічних
зсувів сигналів С-атомів в порівнянні з хімічними зсувами для
незаміщених моносахаридних залишків показав, що спостерігається
позитивний ?-ефект (біля 8 м.д.) сигналу С-6 глюкози, яка зв’язана з
агліконом ацилглікозидним зв’язком. Для іншої глюкози знаходимо близький
за величиною позитивний ?-ефект на атомі С-4, а на С-атомах залишків
рамнози і арабінози ефекти заміщення відсутні. У двовимірному спектрі
ROESY глікозиду 5 (рис. 2.2) вдалося ідентифікувати структурно
інформативні крос-піки між протонами різних моносахаридних залишків,
тобто між Н-1 залишку глюкопіранози, що зв’язаний з кінцевою
рамнопіранозою, і протонами Н-6 глюкопіранози, зв’язаним з агліконом
ацилглікозидним зв’язком. Ці результати однозначно підтверджують 1?6-тип
зв’язку між залишками глюкоз у трисахаридному фрагменті глікозиду 5.

Таблиця 2.1

Раніше відомі глікозиди, що виділені з фатсії японської

Глікозид Замінник біля С-3 атома аглікону (R1) Аглікон Замінник біля
С-28 атома аглікону (R2)

1 Ara? 3 Olean.A 28 ?H

2 Ara? 3 Echin.A 28 ?H

3 Ara? 3 Hed 28 ?H

4 Ara? 3 Hed 28 ?Glc6?Glc

5 Ara? 3 Olean.A28 ?Glc6?Glc4?Rha

6 Ara? 3 Echin.A 28 ?Glc6?Glc4?Rha

7 Ara? 3 Hed 28 ?Glc6?Glc4?Rha

8 Ara? 3 Olean.A 28 ?Glc6?(Glc6?OAc)4?Rha

9 Ara? 3 Echin.A 28 ?Glc6?(Glc6?OAc)4?Rha

10 Ara? 3 Hed 28 ?Glc6?(Glc6?OAc)4?Rha

11 Glc?2Ara? 3 Olean.A 28 ?H

12 Glc?2Ara? 3 Hed 28 ?H

13 Glc?2Ara? 3 Hed 28 ?Glc6?Glc

14 Glc?2Ara? 3 Olean.A 28 ?Glc6?Glc4?Rha

15 Glc?2Ara? 3 Hed 28 ?Glc6?Glc4?Rha

16 Glc?2Glc? 3 Hed 28 ?H

17 Glc?2Glc? 3 Olean.A 28 ?Glc6?Glc

18 Glc?2Glc? 3 Hed 28 ?Glc6?Glc

Оскільки для моно- та бісдесмозидних глікозидів, що виділені раніше з
різноманітних органів фатсії японської і мають дисахаридний фрагмент
глюкоза?арабіноза біля С-3 атому агликонів, були запропоновані структури
як з 1?2, так і головним чином, з 1?4-типами глікозидних зв’язків між
глюкозою і арабінозою та, використовуючи лише хімічні методи, ми
доказали тип зв’язку у цьому дисахаридному фрагменті на основі усіх
необхідних одно- і двовимірних методик ЯМР.

Віднесення сигналів протонів моносахаридних залишків у спектрах 1Н-ЯМР
(глікозид 11) були виконані з використанням комбінації методів COSY і
TOCSY, а віднесення сигналів у спектрі 13С-ЯМР – з використанням
двовимірної методики HSQC. При цьому, для залишку арабінопіранози
знайдено значний позитивний б-ефект заміщення на атомі С-2 (біля 7-8
м.д.) та невеликі негативні в-ефекти на атомах С-3 та С-1 (біля 2
м.д.). Такі величини хімічних зсувів однозначно доводять 1?2-тип
глікозидного зв’язку між залишками глюкози і арабінози. Додатково цей
тип зв’язку підтверджено ідентифікацією кросс-піків у спектрі ROESY
(рис. 2.3) між аномерним протоном Н-1 залишку глюкопіранози та Н-2
залишку арабінопіранози. Таким чином, можна зробити висновок, що
запропонований раніше низкою авторів 1?4-тип глікозидного зв’язку у
цьому дисахаридному фрагменті слід вважати помилковим, оскільки ніяких
інших моно- чи бісдесмозидних глікозидів не було нами виділено.

2.1. Доказ будови ацетильованих глікозидів з квіткових бутонів 19а, 19b,
20a, 20b, 21a і 22b. Глікозиди ехіноцистовї кислоти 19–21 за результами
обробки розчином аміаку містять ацетильні групи. Глікозид 19 є
монодесмозидним глікозидом. З ним також ідентичні і прогеніни
бісдесмозидних глікозидів 20 і 21, які отримані розщепленням у них
ацилглікозидного зв’язку ферментним препаратом з плюща, що зберігає
нативні ацетильні групи. Обробка глікозиду 19 розчином аміаку привела до
арабінопіранозіду ехіноцистовї кислоти, що доказує присутність у складі
19 та прогенінів 20 і 21 ацетильної групи.

Аналіз величин хімічних зсувів сигналів С-атомів вуглеводної частини
глікозиду 19 (та прогенінів глікозидів 20 та 21) у порівнянні з
незміщеним залишком арабінопіранози показав, що у цих випадках є суміш
двох ізомерних 3- та 4-О-ацетильних похідних.

У ферментативному гідролізаті 20 окрім прогеніну з відомим зразком було
ідентифіковано трисахаридний фрагмент – Rha?4Glc?6Glc?, а ТШХ-аналіз
продуктів ферментолізу 21 дозволив поряд з прогеніном 19 ідентифікувати
моноацетильований трисахаридний фрагмент Rha?4(6-О-Ас-Glc)?6Glc?, що
було додатково підтверджено і аналізом спектрів 13С-ЯМР. Діацетильовані
глікозиди 21а та 21b є новими тритерпеновими глікозидами.

Таблиця 2.2

Хімічні зсуви (?, м.д., C5D5N) атомів 13С 3-O-(3’-O-ацетил- и
4’-O-ацетил-)-?-L-арабінопіранозильних залишків в ізомерних глікозидах
19а, 19b і 3-O-?-L-арабінопіранозильного фрагмента глікозиду 2

13С-атом Положення ацильної групи у залишку арабінози

3-OAc

4-OAc

1 107,1 106,8 107,4

2 72,8 69,6 73,1

3 74,5 76,9 72,3

4 69,3 69,9 72,3

5 66,4 66,0

64,2

2.2. Глікозиди 22 і 23. Ще пара нативних ацетильованих глікозидів
олеаноловї кислоти 22 та хедерагеніну 23 було виділено з листя фатсії і
у них нами встановлено наявність дисахаридного фрагмента Glc?2Ara? у
С-3 атомів агліконів та ацетильованого трисахаридного фрагмента
Rha?4(6-О-Ас-Glc)?6Glc? у С-28 атомів агліконів. Ці глікозиди є новими
тритерпеновими глікозидами.

2.3. Глікозиди 24 та 25. У складі монодесмозидного глікозиду 24 та
ідентичного йому прогеніну глікозиду 25 знайдені аглікон – хедерагенін
та цукри — галактоза і арабіноза. У продуктах часткового кислотного
гідролізу 24 та прогеніну 25 ідентифіковано галактозу і арабінопиранозид
хедерагеніну. Це визначило послідовність з’єднання моносахаридних
залишків галактози і арабінози та місце локалізації вуглеводного ланцюга
у агліконі.

Повні віднесення сигналів у спектрі 1Н-ЯМР були виконані, як завжди,
сумісним аналізом спектрів COSY і TOCSY. Аналіз констант спін-спінової
взаємодії та величин хімічних зсувів дозволив підтвердити присутність
залишку ?-арабінопіранози та встановити природу другого моносахаридного
залишку такого як в-галактопіраноза. Аналіз двовимірного спектру HSQC
та найдених величин хімічних зсувів сигналів С-атомів дозволив
встановити 1?2-тип зв’язку між залишками галактози та арабінози. Таким
чином, глікозид 24 та прогенін глікозиду 25 є
3-О-в-D-галактопіранозил-(1?2)-О-б-L-арабінопіранозидом хедерагеніну та
новим тритерпеновим глікозидом. У глікозиді 25 на підставі даних
ферментативного гідролізу препаратом з насіння плюща та аналізу спектра
13С-ЯМР у порівнянні з 24 додатково знайдено залишок в-генціобіози, що
зв’язана з агліконом ацилглікозидним зв’язком. Глікозид 22 також є новим
тритерпеновим глікозидом.

2.4. Глікозиди 26a, 26b, 27a і 27b. У складі глікозиду 26 з листя було
знайдено глюкозу та хедерагенін. Він не змінювався в умовах лужного
гідролізу, що підтверджує його монодесмозидний характер. Цей глікозид
також є і прогеніном глікозиду 27 з листя фатсії.

Аналіз одновимірних спектрів (рис. 2.4) ЯМР показав, що глікозид 26 є
сумішшю двох ізомерних глікозидів. За величинами КССВ у спектрах ПМР та
за хімічними зсувами сигналів С-атомів ці моносахаридні залишки є
незаміщеними залишками в-D-глюкопіранози. На рис. 2.5 приведено фрагмент
спектра HSQC глікозиду 27.

* N ? AE ¦

I

yyyy

O

EH

O

$

O

O

$

O

O

?раноз у ізомерних глікозидах були підтверджені аналізом спектра ROESY,
у якому для аномерного протона мінорного глікозиду 26а спостерігається
крос-пік з Н-3 аглікону, а для переважаючого 26b – з одним із протонів
біля С-23 аглікону. Таким чином, ізомерні глікозиди 26а,b є 3-О- і
23-О-в-глюкопіранозидами хедерагеніну.

Глікозиди з вуглеводними фрагментами по гідроксильній групі біля С-23
атома залишку хедерагеніну вперше знайдені у рослинах родини аралієвих,
а глікозид 27b є новим.

2.5. Глікозиди 28 і 29. Нами було встановлено структури ще двох нових
глікозидів з насіння фатсії японської. Гликозид 28 є прогеніном
глікозиду 29. При цьому доведено 1?2-тип глікозидного зв’язку між
залишками галактопіранози та глюкопіранози у вуглеводних фрагментах у
С-3 атома аглікону в обох глікозидах.

2.6. Глікозиди 30a, 30b, 31a, 31b. У глікозидах 30 і 31 також з насіння
фатсії в якості аглікону було ідентифіковано гіпсогенін. Додаткове
підтвердження природи аглікону, який не є характерним для глікозидів
цієї родини, було зроблено шляхом борогідридного відновлення 30 та 31.
При цьому альдегідну групу (С-23) перевели у первинноспиртову та
отримали відповідні глікозиди хедерагеніну. Остаточний доказ природи
аглікону у глікозидах 30 і 31 виконано із використанням
ЯМР-спектроскопії та у порівнянні з численними даними літератури.

Наступне визначення будови 30 зроблено з використанням хімічних методів
та ЯМР-спектроскопії. При цьому доведено, що 30 є сумішшю двох ізомерних
глікозидів 30а та 30b з дисахаридними залишками Glс?2Glc? та Gal?2Glc?
по гідроксильній групі у С-3 атома аглікону.

Аналіз ЯМР спектрів глікозиду 31 у порівнянні з 30 довів присутність у
31 додаткового залишку в-генціобіози у С-28 атома аглікону. Глікозиди
30а, 30b, 31a і 31b – є новими тритерпеновими глікозидами.

3. Поділ тритерпенових глікозидів у вивчених органах фатсії японської.
Нами було виконано порівняльну оцінку вмісту глікозидів у різних органах
фатсії. В листі фатсії японської переважають глікозиди олеанолової
кислоти, у меньшій кількості — глікозиди хедерагеніну та у незначній
кількості — глікозиди ехіноцистової кислоти (див. табл. 3.1). У складі
вуглеводних залишків гідроксильної групи у С-3 атома агліконів в
переважаючих глікозидах олеанолової кислоти та хедерагеніну знайдені
насамперед дисахаридний фрагмент Glc?2Ara? і незаміщений залишок
арабінопиранози. У глікозидах ехіноцистової кислоти гідроксильної групи
у С-3 атому аглікону знайдено тільки залишок арабінопіранози.
Вуглеводний ланцюг карбоксильної групи агліконів у глікозидах з листя
фатсії представлений як трисахаридним фрагментом ?Glc6?Glc4?Rha, так і
його моноацетильним похідним ?Glc6?(Glc6?OAc)4?Rha. При цьому вміст
глікозидів з ацетильованим вуглеводним ланцюгом та аналогічних
неацетильованих глікозидів приблизно однаковий. У квіткових бутонах
фатсії японської на відміну від листя переважають глікозиди
хедерагеніну, а глікозидів олеанолової та ехіноцистової кислот, що
присутні приблизно у рівному співвідношенні, менше.

Таблиця 3.1.

Розподіл вуглеводних залишків і агліконів у вивчених органах фатсії
японської

Структурний фрагмент Насіння Перикарпій Листя Квиткові бутони

Ara?Agl + + + + + + + +

Glc1?2Ara?Agl + + + + + + + +

Glc1?2Glc?Agl + – – –

Gal?2Glc? ++ – – –

Gal?2Ara? + + – – –

Agl?Glc6?1Glc4?1Rha + + + + + + + + + +

Agl?Glc6?Glc + + + – – –

OAc- – + + + + + + +

Olean. A + + + + + +

Echin. A – + + + + + +

Hed + + + ++ + + + +

Gyps + – – –

+++ — Високий вміст; ++ — присутній у значій кількісті; + — присутній у
незначній кількості; – — відсутній

Глікозидний склад насіння фатсії японської значно відрізняється від
глікозидного складу перикарпію та інших органів. Притаманною особливістю
глікозидного складу насіння фатсії є присутність залишку генціобіози у
С-28 атома аглікону, а не трисахаридного фрагмента, як у глікозидах
інших органів фатсії, окрім того, у насінні є й глікозиди гіпсогеніну,
що не знайдені в інших органах цієї рослини.

4. Біологічна активність тритерпенових глікозидів з фатсії японської.
Нами було проведено вивчення впливу in vitro низки тритерпенових
глікозидів на електричну активність нейронів виноградного слимака Helix
pomatia. Для більш глибокого аналізу отриманих результатів та можливості
порівняння гіперполяризуючої дії тритерпенових глікозидів з іншими
видами біологічної активності вивчена також і їх гемолітична активність.
У експериментах використовувалися монодесмозидні та бісдесмозидні
глікозиди. У табл. 4.1 наведено порогові концентрації глікозидів, які
викликають короткочасний гіперполяризуючий ефект, та концентрації
глікозидів, що викликають 50% гемоліз (НС50, моль/л).

При дослідженні гіперполяризуючої дії глікозидів встановлено, що при
аплікації бісдесмозидних глікозидів у концентраціях 10-3-10-2 М не
спостерігались які-небудь зміни в електричній активності нейронів. Таким
чином очевидно, що глікозиди з заміщеною карбоксильною групою аглікону
не впливають на активність нейронів.

Навпаки, аплікація монодесмозидних глікозидів у концентрації 10-3 М мала
яскраво виражений вплив на електричну активність нейронів. Ефект від
введення цих сполук тривав протягом 1-2 хвилин з моменту аплікації та
виражався у стійкій гіперполяризації мембрани нейрону.

Аналіз результатів досліджень показав, що найменший вплив на
функціональний стан нейронів, над якими велись спостереження, мають
глікозиди 1 і 2.

Таблиця 4.1

Гіперполяризуюча і гемолітична активність

тритерпенових глікозидів

Глікозид Структура Порогові концентрації гіперполяризую-чого ефекту,
моль/л Гемолітична активність, моль/л

1 Glc?3Hed28?Н 1×10-3 1.2×10-5

2 Glc-(1?2)-Glc?3Hed28?Н 2×10-3 5.6×10-5

3 Ara?3Hed28?Н 1×10-4 1.2×10-5

4 Rha-(1?2)-Ara?3Hed28?Н 1×10-5 6.0×10-6

5 Glc-(1?2)-Ara?3Olean.A28?Н 1×10-4 1.0×10-5

6 Glc-(1?2)-Ara?3Hed28?Н 1×10-4 2.0×10-5

7 [Rha-(1?2)]-[Glc-(1?4)]-Ara?3Olean.A28?Н 2×10-6 2.0×10-6

8 [Rha-(1?2)]-[Glc-(1?4)]-Ara?3Hed28?Н 2×10-6 4.0×10-6

9 Xyl-(1?3)-Rha-(1?2)-Ara?3Hed28?Н 1×10-5 6.0×10-6

Глікозиди 3, 5 і 6 мали на порядок вищу активність. Очевидно, наявність
залишку арабінози у С-3 атома аглікону в вуглеводному ланцюгу збільшує
гіперполяризучий ефект глікозиду. Однак приєднання залишку глюкози до
гідроксильної групи у С-2 атома залишку арабінози (глікозиди 5 і 6) не
викликає значних змін в активності глікозиду. Найбільш активними
виявилися глікозиди з трьома вуглеводними залишками, що утворюють
розгалужений ланцюг (глікозиди 7 і 8). Гікозид 9 з трьома вуглеводними
залишками за активностю виявився таким же, як і біозидний глікозид 4.

Висновки експериментів відсовують на другий план вплив природи аглікону
та довжини вуглеводного ланцюга на електричну активність нейронів, тоді
як природа моносахаридних залишків у С-3 атома аглікону відіграє головну
роль у впливі на активність глікозиду. Крім того, спостерігається
зв’язок між ступенем впливу глікозидів на електричну активність нейронів
та їх гемолітичною активністю.

ВИСНОВКИ

1. З листя, квіткових бутонів, перикарпію плодів та насіння Fatsia
japonicа виділено і визначено будову 41 глікозиду ?-аміринового ряду, 14
з них є новими сполуками.

2. У різних органах Fatsia japonica знайдені моно- та діацетильовані
тритерпенові глікозиди.

3. Глікозиди хедерагеніну з вуглеводними залишками по гідроксильнії
групі біля С-23 атома аглікону вперше знайдено у листі та насінні Fatsia
japonica і взагалі у родині Araliaceae.

4. Глікозиди з кінцевим залишком галактопіранози поряд із ізомерними
глікозидами з кінцевим залишком глюкопіранози у вуглеводних ланцюгах
біля С-3 атома агліконів вперше знайдені в насінні Fatsia japonica.

5. Вперше у Fatsia japonica знайдено глікозиди гіпсогеніну.

6. Вивчено вплив низки тритерпенових глікозидів із родини Araliaceae на
електричну активність ізольованих нейронів Helix pomatia і знайдено
деякі структурні фактори, що відповідають за прояв активності.

Список опублікованих праць за темою дисертації

Гришковец В.И., Соболев Е.А., Шашков А.С., Чирва В.Я. Тритерпеновые
гликозиды Fatsia japonica I. Выделение и установление строения
гликозидов из семян Fatsia japonica // Химия природ. соедин. — 2000. — №
2. — С. 131-133. (Участь в виділені суми глікозидів, ії хроматографічний
поділ та очищення, участь в встановленні будови виділених глікозидів).

Гришковец В.И., Соболев Е.А., Шашков А.С., Чирва В.Я. Тритерпеновые
гликозиды Fatsia japonica II. Выделение и установление строения
гликозидов из листьев фатсии японской // Химия природ. соедин. — 2000. —
№ 5. — С. 395-398. (Участь в виділені суми глікозидів, ії
хроматографічний поділ та очищення, проведення гідролізів та ТШХ, участь
в інтерпретації спектральних даних).

Соболев Е.А., Гришковец В.И., Шашков А.С., Толкачева Н.В., Чирва В.Я.
Тритерпеновые гликозиды Fatsia japonica III. Выделение и установление
строения гликозидов из перикарпия плодов фатсии японской // Химия
природ. соедин. — 2000. — № 5. — С. 426-427. (Виділення глікозидів, їх
хроматографічний поділ та очищення, проведення гідролізів та ТШХ, участь
в інтерпретації спектральних даних).

Костюченко О.В., Гришковец В.И., Соболев Е.А., Коренюк И.И. Влияние
тритерпеновых гликозидов на изменение электрической активности
идентифицированных нейронов моллюска // Химия природ. соедин. — 2001. —
№ 1. — С. 39-42. (Підготовка зразків глікозидів для проведення
біологічних випробувань, участь в аналізу отриманих результатів).

Соболев Е.А., Качала В.В., Гришковец В.И., Шашков А.С., Чирва В.Я.
Тритерпеновые гликозиды Fatsia japonica IV. Установление строения
гликозидов D1 и D2 из семян фатсии японской // Химия природ. соедин. —
2001. — № 3. — С. 221-222. (Хроматографічний поділ фракцій глікозидів,
проведення гідролізів та ТШХ, участь в інтерпретації спектральних
даних).

Соболев Е.А., Гришковец В.И., Качала В.В., Шашков А.С., Чирва В.Я.
Тритерпеновые гликозиды Fatsia japonica V. Установление строения
гликозидов из цветочных бутонов фатсии японской // Химия природ. соедин.
— 2001. — № 3. — С. 248-249. (Виділення суми глікозидів, ії
хроматографічний поділ та очищення, проведення гідролізів та ТШХ, участь
в інтерпретації спектральних даних).

Гришковец В.И., Соболев Е.А., Качала В.В., Шашков А.С., Чирва В.Я.
Тритерпеновые гликозиды Fatsia japonica VI. Cтроение гликозидов D3а и
D3b // Химия природ. соедин. — 2002. — № 3. — С. 222-224.
(Хроматографічний поділ фракції глікозидів, проведення гідролізів та
ТШХ, участь в інтерпретації спектральних даних).

Гришковец В.И., Соболев Е.А., Костюченко О.В., Коренюк И.И., Чирва В.Я.
Влияние тритерпеновых гликозидов из растений семейства аралиевых на
электрическую активность изолированных нейронов моллюска // Материалы
научно-практического семинара «Поиск и разработка сердечно-сосудистых
средств» – Алушта (Украина), 2001. — С. 10-13. (Підготовка зразків
глікозидів для проведення біологічних випробувань, участь в аналізу
отриманих результатів).

Grishkovets V.I., Sobolev E.A., Kalyuzhnyi V.I. and S.V. Iksanova /
Triterpene Glycosides from Fatsia japonica Leaves // Saponins in Food
Feedstuffs and Medicinal Plants. — Pulawy (Poland), 1999.- P. 41.

Grishkovets V.I., Shkolin M.V., Sobolev E.A. and A.S. Shashkov /
Triterpene Glycosides from of Hedera colchica Leaves // Saponins in Food
Feedstuffs and Medicinal Plants. — Pulawy (Poland), 1999. — P. 43.

Соболев Е.А., Гришковец В.И., Шашков А.С., Чирва В.Я. Выделение и
установление строения тритерпеновых гликозидов из плодов фатсии японской
// I Республиканская конф. молодых ученных Крыма. — Сімферополь
(Украина), 2000. — С. 16-18.

Sobolev E.A., Grishkovets V.I., Chirva V.Ya., Shashkov A.S. Triterpene
glycosides from Fatsia japonica fruits // 20-th International
Carbohydrate Symposium. — Hamburg (Germany), 2000. — P. A-159.

Sobolev E.A., Grishkovets V.I., Chirva V.Ya., Shashkov A.S., Kachala
V.V. Тriterpene glycosides from Fatsia japonica seeds // 4-th
International Symposium on the Chemistry of Natural Compounds. — Isparta
(Turkey), 2001. – P. 93.

Sobolev E.A., Grishkovets V.I., Chirva V.Ya., Shashkov A.S., Kachala
V.V. Neuron hyperpolarisation action of plant triterpene glycosides //
4-th International Symposium on the Chemistry of Natural Compounds. —
Isparta (Turkey), 2001. – P. 24.

Соболєв Є.О., Гришковець В.I., Качала В.В., Шашков О.С., Чирва В.Я. Нові
тритерпеновi глікозиди гiпсогенiну з насіння фатсii японської // XIX
Українська конф з органічної хімії. — Львів (Україна),2001. — C. 316.

Sobolev E.A., Grishkovets V.I., Chirva V.Ya., Shashkov A.S., Kachala
V.V. Тriterpene glycosides from Fatsia japonica seeds //11-th European
Carbohydrate Symposium. — Lisboa (Portugal), 2001. — PB060.

Grishkovets V.I., Sobolev E.A., Kostychenco O.V. Neuron
hyperpolarisation action of plant triterpene glycosides // 11-th
European Carbohydraye Symposium. — Lisboa (Portugal), 2001. — PC034.

Sobolev E.A., Grishkovets V.I., Chirva V.Ya., Shashkov A.S., Kachala
V.V. New and known triterpene glycosides from Fatsia japonica seeds //
XVI International Symposium on Glycoconjugates. — Hague (Netherlands),
2001. — Glycoconjugate journal 1/2 (18), 2001.

Соболев Е.А., Гришковец В.И., Качала В.В., Шашков А.С. Чирва В.Я.
Тритерпеновые гликозиды из семян Fatsia japonica // Международная
научно-практическая конф. «Новые технологии получения и применения
биологически активных веществ». — Алушта (Украина), 2002. — C. 89-90.

Гришковец В.И., Соболев Е.А., Костюченко О.В., Коренюк И.И., Чирва В.Я.
Влияние тритерпеновых гликозидов из растений семейства аралиевых на
электрическую активность нейронов моллюска // Украинская конф.
«Прикладная физическая химия». — Алушта (Украина), 2004. — с. 135.

Соболев Е.А., Гришковец В.И., Качала В.В, Шашков А.С. Тритерпеновые
гликозиды из цветочных бутонов Fatsia japonica // Украинская конф.
«Прикладная физическая химия». — Алушта (Украина), 2004. — с. 140.

АННОТАЦИЯ

Соболев-Бутовченко Е.А. Тритерпеновые гликозиды фатсии японской Fatsia
japonica. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученной степени кандидата химических наук по
специальности 02.00.10 – биоорганическая химия. – Физико-химический
институт им. А.В. Богатского НАН Украины, Одесса, 2005.

Диссертация посвящена изучению гликозидного состава фатсии японской.
Впервые проведено комплексное изучение гликозидного состава различных
органов фатсии японской – листьев, семян, перикарпия плодов и цветочных
бутонов.

Для выделения суммы тритерпеновых гликозидов из растительного сырья
использовали экстракцию водным изопропиловым спиртом предварительно
обезжиренного сырья. Разделение суммы на индивидуальные тритерпеновые
гликозиды осуществляли перепаративной хроматографией на силикагеле.

Строение выделенных гликозидов было установлено с использованием
химических методов и комбинации различных одно- и двумерных методик ЯМР
спектроскопии (13С-, 1Н-, COSY, HSQC, TOCSY, ROESY).

В результате выделено и установлено строение 41 тритерпенового
гликозида, 32 из которых до сих пор не были обнаружены в фатсии
японской, а 14 гликозидов оказались новыми соединениями. Показано
присутствие в фатсии японской значительных количеств ранее не
обнаруживавшихся ацетилированных гликозидов. В ходе исследования
доказано наличие в фатсии 11-ти гликозидов, этерифицированных одним или
несколькими остатками уксусной кислоты. Из бутонов фатсии японской
выделено два новых диацетилированных гликозида эхиноцистовой кислоты:
3-O-(3-O-ацетил-б-L-арабинопиранозил)- и
3-O-(4-O-ацетил-б-L-арабинопиранозил)-28-О-б-L-рамнопиранозил-(1?4)-О-(6
-О-ацетил-в-D-глюкопиранозил)-6-О-в-D-глюкопиранозиловые эфиры
эхиноцистовой кислоты.

Из семян фатсии японской выделены 4 ранее неизвестных гликозида
гипсогенина: 3-О-в-D-глюкопиранозил-(1?2)-О-в-D-глюкопиранозид
гипсогенина, 3-О-в-D-галактопиранозил-(1?2)-О-в-D-глюкопиранозид
гипсогенина и их 28-О-в-D-глюкопиранозил-(1?6)-О-в-D-глюкопиранозиловые
эфиры. Гликозиды гипсогенина впервые обнаружены в фатсии японской.

Впервые изучено гиперполяризующее действие тритерпеновых гликозидов на
нейроны моллюска Helix pomatia (виноградная улитка). Для сопоставления
гиперполяризующего действия тритерпеновых гликозидов с другими видами
биологической активности была изучена так же и их гемолитическая
активность.

Ключевые слова: тритерпеновые гликозиды, хроматография,
ЯМР-спектроскопия, семейство Araliaceae, вид Fatsia japonica,
биологически активные соединения, гиперполяризующее действие гликозидов.

АНОТАЦІЯ

Соболєв-Бутовченко Є.О. Тритерпенові глікозиди фатсії японської Fatsia
japonica. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за
спеціальністю 02.00.10 – біоорганічна хімія. – Фізико-хімічний інститут
ім. О.В. Богатського НАН України, Одеса, 2005.

Дисертація присвячена виділенню індивідуальних тритерпенових глікозидів
з різних органів фатсії японської, встановленню повної будови, вивченню
їх гемолітичної активності та гіперполяризуючої дії на ізольовані
нейрони. У роботі вперше проведено комплексне вивчення глікозидного
складу різних органів фатсії японської – листя, насіння, перикарпію
плодів та квіткових бутонів. Виделено і встановлено будову 41
тритерпенового глікозиду, 32 з яких дотепер не було знайдено в фатсії
японській, а 14 є новими сполуками. Показано присутність у фатсії
японській значної кількості раніше невідомих ацетильованих глікозидів. У
процесі дослідження доказано присутність у фатсії 11 глікозидів, що
етерифіковані одним або двома залишками оцтової кислоти. З бутонів
фатсії японскої виділено два нові діацетильовані глікозиди ехіноцистової
кислоти. З насіння фатсії японської виділено 4 раніше невідомі глікозиди
гіпсогеніну. Глікозиди гіпсогеніну вперше знайдені у фатсії японській.

Вперше вивчено гіперполяризуючу дію тритерпенових глікозидів на нейрони
молюска Helix pomatia.

Ключові слова: тритерпенові глікозиди, хроматографія, ЯМР-спектроскопія,
родина Araliaceae, вид Fatsia japonica, біологічно активні речовини,
гіперполяризуюча дія глікозидів.

ANNOTATION

Sobolev-Butovchenco E.A. The triterpene glycosides of Fatsia japonica. –
Manuscript.

Thesis for a candidate’s degree by speciality 02.00.10 — bioorganic
chemistry. — A.V. Bogatsky Physico-Chemical Institute of National
Academy of Sciences of Ukraine, Odessa, 2005.

The dissertation is devoted to isolation and structural elucidation of
triterpene glycosides from different parts of Fatsia japonica. For the
first time complex studying of glycoside composition of various Fatsia
japonica parts — leaves, seeds, fruits and flower knops was carried out.
Chemical structures of 41 glycosides were determined and 32 of them have
not been found in Fatsia japonica till now, and 14 are new compounds.
The presence of 11 acetylated glycosides in Fatsia japonica was shown.
Two new diacetylated glycosides of echinocystic acid from flower knops
were isolated. Four new hypsogenin glycosides from Fatsia japonica seeds
were isolated. Hypsogenin glycosides were not found in Fatsia japonica
earlier.

For the first time a hyperpolarisating action of triterpene glycosides
on Helix pomatia (a grape snail) neurones was investigated.

Key words: triterpene glycosides, chromatography, NMR-spectroscopy,
Araliaceae family, Fatsia japonica, biologically active substances,
hyperpolarisating action of glycosides.

Підписано до друку 25.05.2005 Формат 60х84/16

Тираж 100 прим. Зам. № 218

Надруковано з оригінал-макету у видавничому відділі

Таврійського національного університету ім. В.І Вернадського

95007, м. Сімферополь, пр. Вернадського, 4

77

80

Похожие записи