.

Токсикодинаміка та терапія гострих інгаляційних отруєнь епоксид-ними смолами (експериментальне дослідження) (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 6306
Скачать документ

АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ДЕРЖАВНА УСТАНОВА

“ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ”

ВИСОЦЬКИЙ Ігор Юрійович

УДК 616-099-022.855:547-311:615

Токсикодинаміка та терапія гострих інгаляційних отруєнь епоксидними
смолами (експериментальне дослідження)

14.03.06 – токсикологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Сумському державному університеті Міністерства освіти
і науки України.

Науковий консультант – доктор медичних наук, професор,

заслужений діяч науки і
техніки України

Лук`янчук Віктор Дмитрович,

Луганський державний медичний університет

МОЗ України, м. Луганськ,

завідувач кафедри фармакології.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук Серединська Наталія Миколаївна, Державна установа
“Інститут фармакології та токсикології” АМН України, м. Київ, головний
науковий співробітник відділу фармакології серцево-судинних засобів;

доктор медичних наук, професор Горчакова Надія Олександрівна,
Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця МОЗ України, м.
Київ, професор кафедри фармакології з курсом клінічної фармакології;

доктор медичних наук Жирнов Віктор Валентинович, Інститут біоорганічної
хімії та нафтохімії НАН України, м. Київ, завідувач відділу сигнальних
систем клітини.

Захист відбудеться 20 лютого 2008 р. о 1300 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 при Державній установі “Інститут
фармакології та токсикології” АМН України (03057, м. Київ, вул. Ежена
Потьє, 14).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Державної установи
“Інститут фармакології та токсикології” АМН України (03057, м. Київ,
вул. Ежена Потьє, 14).

Автореферат розісланий 10 січня 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук
І.В. Данова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Епоксидні смоли (ЕС), завдяки своїм універсальним
властивостям, використовуються в наш час у багатьох галузях
промисловості і сферах життєдіяльності людини. Постійно відбувається
розроблення і впровадження нових технологій їх синтезу, перероблення,
збільшується виробництво полімерних матеріалів на основі ЕС,
розширюються галузі їх застосування

(И.М. Трахтенберг, 2000; L. Calzado et al., 2005; J.S. Seo et al., 2007;
M.Ambroziak et al., 2007). Особливо широко застосовуються як
зв`язувальні при виробництві виробів із склопластиків діанові ЕС, які
відрізняються високою біологічною активністю і становлять більше ніж 90%
від загального випуску (А.М. Шевченко, А.П. Яворовский, 1985; Л.П.
Запривода, 2005).

При синтезі ЕС та їх використанні у виробництві для виготовлення
склопластику та інших полімерних матеріалів робітники зазнають
постійного інтенсивного впливу переважно летких хімічних речовин
(епіхлоргідрин, толуол, дифенілол-пропан та ін.), вміст яких у повітрі
робочої зони значно перевищує гранично допустимі концентрації (ГДК)
(В.В. Манфановский и др., 1987; А.М. Шевченко и др., 1988; В.Я.
Витрищак, 1990; А.П. Яворовский и др., 2004, 2005), що створює умови для
гострих і хронічних професійних інтоксикацій (М.А. Гайворонская, И.А.
Парпалей, 1998; Ю.О. Паустовский, 1999; T.J. Cheng et al., 1999; K.
Rasmussen et al., 2005). У разі порушення герметичності в технологічному
циклі або виникнення аварійних ситуацій концентрація летких компонентів
може збільшуватися до смертельно небезпечного рівня для осіб, що
перебувають в цих умовах. Так, смертність серед робітників, які зазнали
впливу епіхлоргідрину (ЕХГ), на хімічних заводах США за 1948-1983 рр.
становила 93 випадки на 863 робітники, тобто приблизно 11% (P.E.
Enterline et al., 1990). Шкідливий вплив летких компонентів ЕС
посилюється позмінним режимом праці, який сприяє виникненню явищ
хронічного десинхронозу і зниженню адаптаційних резервів організму.
Епоксисполуки можуть також виділятися в повітря, харчові продукти і воду
із ряду синтетичних полімерів і у звичайних побутових умовах (M. Радева,
М. Ставрева, 1989; M.R. Philo et al., 1997; A. Poole et al., 2004; A.K.
Mаненко та ін., 2006). Вони також утворюються в організмі при
метаболізмі багатьох хімічних сполук, які містять ненасичений подвійний
зв`язок, і є природними проміжними метаболітами різних ендогенних сполук
(И.Е. Ковалева, О.Ю. Полевая, 1985; J.L. Мaggs et al., 1997; L. Ryan et
al., 2006; B. Marczynski et al., 2007; D. Ai et al., 2007).

Несприятливі умови праці на виробництві склопластиків і синтезі
епокси-сполук підтверджуються результатами клінічного обстеження стану
здоров`я робітників і аналізом захворюваності з тимчасовою втратою
працездатності, яка значно вища, ніж у осіб, що не зазнавали впливу
летких компонентів ЕС (В.Я. Витрищак, 1990). Останні відрізняються
високою токсичністю і політропністю шкідливого впливу на організм
працюючого, що проявляється ураженням органів дихання,
шлунково-кишкового тракту, опорно-рухового апарату, шкіри, нирок, а
також порушеннями в імунній і нервовій системах (А.М. Шевченко, А.П.
Яворовский, 1985; Я.Б. Ли, 2001; Т.П. Гречишкіна, 2004; T. Speе et al.,
2006; L. Mei et al., 2006; D.H. Lee et al., 2006). Необхідно особливо
підкреслити, що у робітників, які контактують з ЕС, у 20-57% випадків
розвиваються токсичні гепатопатії. Особливостями останніх є те, що вони
протікають у тяжких формах і після проведеного лікування, при
відновленні контакту з ЕС, рецидивують (В.Я. Витрищак, 1990; В.О.
Шефтель, 1991; T.H. Hunag et al., 2001).

Лікування гострих отруєнь леткими компонентами ЕС проводиться шляхом
застосування тільки симптоматичних засобів, які не виявляють необхідного
терапевтичного ефекту. Будь-які достатньо обґрунтовані засоби антидотної
і патогенетичної терапії, а також профілактики інтоксикацій леткими
компонентами ЕС на сьогодні відсутні, що і визначає актуальність таких
досліджень.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана
у рамках теми НДР кафедри фармакології ЛДМУ “Фармакологічна регуляція
природних шляхів захисту організму при дії несприятливих факторів
зовнішнього середовища” (№ держреєстрації 01900004544, 1990-1994 рр.);
теми НДР ЦНДЛ ЛДМУ “Вплив екологічно несприятливих факторів на організм
в умовах промислового регіону і розробка методів корекції метаболізму і
інтенсивної терапії” (№ держреєстрації 01910033409, 1991-1995 рр.), а
також на прохання адміністрації Сіверськодонецького виробничого
об`єднання “Склопластик” Луганської області (лист №14-12-5911 від
4.04.1991 р.); згідно з планом Всесоюзного науково-дослідного інституту
гігієни і токсикології пестицидів, полімерів і пластичних мас в рамках
Всесоюзної проблеми “Наукові основи гігієни і токсикології пестицидів,
полімерних і пластичних мас (шифр проблеми 14.03.01.69, 1990-1995 рр.);
пріоритетного конкурсного фінансування МОЗ України у сфері
фундаментальних досліджень “Молекулярні механізми мембранопротекторної
дії, біотранспорту і біотрансформації кверцетину при використанні його в
екстремальних умовах (гіпоксія, гіпертермія, інтоксикація)” (1992-1994
рр.); теми НДР медичного факультету СумДУ “Вивчення стану здоров`я
населення Сумської області в умовах впливу несприятливих соціальних,
економічних і екологічних факторів” (№ держреєстрації 0101U002098,
1999-2004 рр.).

Мета роботи. На основі експериментальних досліджень встановити
токсикометричні параметри епоксидних смол, вивчити характер і механізми
формування порушень в організмі при гострій інгаляційній інтоксикації їх
леткими компонентами та обґрунтувати шляхи фармакологічної ко-рекції.

Завдання дослідження:

1. Визначити параметри токсикометрії при дії на організм ЕС (ЕД-20,
Е-40), ЕХГ і його метаболіту 3-хлор-1,2-пропандіолу і встановити роль
біологічних ритмів в їх реалізації.

2. Встановити можливість комплексоутворення ЕХГ з білками сироватки
крові і вплив на цей процес кверцетину.

3. Дослідити вплив летких компонентів ЕС на
прооксидантно-антиокси-дантний і енергетичний гомеостаз, а також
детоксикуючу систему печінки щурів.

4. Оцінити вплив летких компонентів ЕС на метаболізм арахідонової
кислоти (АК) і окремі ланки передачі внутрішньоклітинного сигналу по
аденілат- і гуанілатциклазному шляхах.

5. Теоретично обґрунтувати вибір потенційних детоксикуючих засобів при
дії летких компонентів ЕС і провести їх цілеспрямований скринінг.

6. На моделях гострої інтоксикації леткими компонентами ЕС і ЕХГ
провести пошук антидотно-лікувальних засобів хімічного і
фізико-хімічного типів дії серед синтетичних полімерів, що містять
третинні аміногрупи, і ентеросорбентів.

7. Встановити основні механізми реалізації лікувально-профілактичної дії
найбільш ефективних препаратів при гострому інгаляційному отруєнні ЕС і
на основі цього розробити їх раціональні комбінації.

Об`єкт дослідження – гострі інгаляційні отруєння, викликані ЕС і ЕХГ.

Предмет дослідження – показники токсичності, комплексоутворення з
білками, вільнорадикального, мікросомального та енергозабезпечувального
окислення, метаболізму АК, активності клітинних сигнальних систем у
тварин на тлі гострого інгаляційного впливу ЕС і його фармакологічної
корекції.

Методи дослідження – токсикологічні, фармакологічні, біохімічні,
біофізичні, радіоімунні, гістологічні, електронно-мікроскопічні і
статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. У роботі вперше встановлено, що
ЕС ЕД-20 і Е-40 при інгаляційному шляху надходження в організм є
високотоксичними сполуками для теплокровних тварин, становлять
потенційну і реальну небезпеку розвитку гострого смертельного отруєння,
мають гепатотоксичну дію, яка залежить від добових і сезонних
біологічних ритмів.

Вивчені молекулярні механізми розвитку гострої інтоксикації ЕС, основу
патогенезу якої складає поширена мембранопатія, що формується в
результаті порушення прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу,
функціонування основних компонентів мітохондріального (асоційований
комплекс залізосірчані білки – флавінаденіндинуклеотид, довгоіснуючі
вільні радикали) і мікросомального (цитохром Р-450, Мо5+-вмісні
парамагнітні комплекси, епоксидгідролаза, глутатіон-S-трансфераза)
електрон-транспортних ланцюгів. Вперше встановлені порушення
біоенергетичних процесів в організмі при токсичній дії ЕС (зменшення
АТФ/АДФ·Фн), що пов`язано з гальмуванням дихання і окисного
фосфорилювання і зниженням вмісту окислених форм нікотин-амідних
коферментів.

В умовах змодельованої патології хімічної етіології одержані нові дані
про значні порушення в механізмі передачі внутрішньоклітинного сигналу
по аденілат- і гуанілатциклазному шляхах, що проявляється фазовими
змінами рівня адренокортикотропного гормону (АКТГ) в крові, а також
циклічного аденозинмонофосфату (цАМФ) і циклічного гуанозинмонофосфату
(цГМФ) в печінці.

Вперше виявлено, що під впливом летких компонентів ЕС розвивається
дисбаланс в метаболізмі АК як по ліпоксигеназному, так і по
циклооксигеназному шляхах за рахунок збільшення продукції
високоагресивних ейкозаноїдів – лейкотрієну В4 (ЛТВ4), простагландину
F2( (ПГF2(), тромбоксану В2 (ТХВ2) – і зменшення простагландину Е2
(ПГЕ2) і простацикліну (ПГІ2), які проявляють гепатозахисні властивості.

Вперше доведена висока лікувально-профілактична ефективність при
досліджуваній формі токсичного процесу препаратів метаболітного і
антиоксидантного типів дії (кверцетин, ліпін, флавінат), синтетичних
антиоксидантів ([2-(3(-сульфоланілокси)етил]триметиламоній йодид),
SH-вмісних препаратів (ацетилцистеїн), індукторів епоксидгідролази
(клофібрат, омепразол), синтетичних високомолекулярних сполук
(співполімер N-вінілпіролідону, N,N-диметил-аміноетилметакрилату та
вінілбутилового ефіру) і ентеросорбентів (карбовіт, карбовіт-М).

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати
поглиблюють існуючі уявлення про ключові механізми порушення гомеостазу
організму на фоні гострого отруєння леткими компонентами ЕС.

Встановлений зв`язок біологічної дії ЕС і ЕХГ з наявністю в їх структурі
епоксигруп дозволяє виявити спільну ланку в механізмі токсичної дії
даного класу ксенобіотиків, що має визначальне значення у плані
розроблення заходів патогенетично обґрунтованої профілактики і лікування
інтоксикацій цими сполуками.

На основі встановлених механізмів токсичної дії ЕС теоретично і
експериментально доведена доцільність використання для профілактики та
лікування викликаних ними отруєнь кверцетину, флавінату, ліпіну та
ацетилцистеїну. Обґрунтовано застосування омепразолу і клофібрату як
істинних індукторів епоксидгідролази з метою профілактики отруєнь ЕС.
Показана ефективність ентеросорбції як доступного патогенетичного методу
в лікуванні гострих інтоксикацій ЕС, поєднаного застосування
ацетилцистеїну з флавінатом, ацетилцистеїну з ліпіном або кверцетину з
ліпіном, які діють на різні ланки патогенезу отруєнь. Встановлено
недоцільність застосування з лікувальною метою препаратів, що індукують
МОС, знижують активність епоксидгідролази і зменшують рівень SH-груп
біосубстратів.

За результатами експериментальних досліджень опубліковані методичні
рекомендації: “Патогенетична терапія токсичних пошкоджень печінки”
(Київ-Луганськ, 1993); “Комбінована фармакотерапія токсичних уражень
печінки леткими компонентами епоксидних смол” (Київ, 1993, реєстр. №
96/2/3) та інформаційний лист “Способ лечения токсических гепатопатий”
(Київ, 1991). За матеріалами дисертації одержано авторське свідоцтво
СРСР на винахід “(-(Пиридин-2-ил)-(-(3,4-диоксинафтил-1) ацетонитрил,
обладающий антиоксидантной активностью” (№ 1624954) і 2 патенти України
на винаходи: “Сополімер N-вінілпірролідону,
N,N-ди-метиламіноетилметакрилату та вінілбутилового ефіру, що проявляє
детоксикуючу активність по відношенню до алкілюючих агентів” (№0031641А)
і “Сполука, що має антиоксидантну та детоксикуючу активність” (№52658).

Результати дисертаційної роботи використовуються у науковій роботі і
навчальному процесі кафедр фармакології та клінічної фармакології
Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова,
Одеського, Луганського, Тернопільського, Кримського,
Івано-Франківського, Харківського медичних університетів, Сумського
державного університету, Ужгородського національного університету,
Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна і
Дніпропетровської державної медичної академії.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно розроблена програма
наукових досліджень, проведені токсикологічні, фармакологічні,
біохімічні експерименти. Визначення нікотинамідаденіндинуклеотидів і
аденілових нуклеотидів виконано за допомогою співробітників кафедри
фармакології з курсом клінічної фармакології НМУ ім. О.О. Богомольця
(зав. кафедри – професор, член-кор. НАН і АМН України І.С. Чекман).
Радіоімунологічні і морфологічні дослідження виконані з консультативною
допомогою співробітників ЦНДЛ ЛДМУ (зав. – професор І.О. Комаревцева).
Самостійно проведені статистична обробка, аналіз результатів досліджень,
сформульовані основні положення дисертаційної роботи і висновки.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи
оприлюднені на VI з`їзді фармакологів Української РСР “Фармакология:
состояние и перспективы исследований” (Харків, 1990), науково-практичній
конференції “Лекарственные средства Украины, синтез, научные
исследования, производство, реализация” (Харків, 1992),
симпозіумі-нараді за міжнародною участю “Експериментальна фармакологія –
клініці” (Вінниця-Київ, 1992), І Українській науковій конференції за
участю країн СНД “Актуальні проблеми клінічної фармакології” (Вінниця,
1993), ІІ науковій сесії “Актуальні проблеми екологічної та клінічної
імунології, алергології та генетики” (Київ-Луганськ, 1993), V і Х
конгресах світової федерації Українських лікарських товариств
(Дніпропетровськ, 1994; Чернівці, 2004), VI, VII і IX підсумкових
науково-практичних конференціях медичного факультету СумДУ “Современные
проблемы клинической и экспериментальной медицины” (Суми, 1998, 1999,
2001), І, ІІ з`їздах токсикологів України (Київ, 2001, 2004),
Всеукраїнській науково-практичній конференції “Актуальні питання
теоретичної та практичної медицини” (Суми, 2002), ІІІ Всеукраїнській
науково-практичній конференції “Сучасні проблеми клінічної та
теоретичної медицини” (Суми, 2004), IV Українській науково-практичній
конференції за міжнародною участю з клінічної фармакології (Вінниця,
2004), Міжнародній науково-практичній конференції “Сучасний стан і
проблеми експериментальної та клінічної медицини” (Тернопіль, 2004), VI
Міжнародній науково-практичній конференції “Актуальні проблеми
токсикології. Безпека життєдіяльності людини” (Київ, 2005), VI
Національному з`їзді фармацевтів України (Харків, 2005), Міжнародних
науково-практичних конференціях “Актуальні питання експериментальної та
клінічної медицини” (Суми, 2005, 2006, 2007), на конференції
“Токсикологічні проблеми безпеки середовища життєдіяльності людини та
безпеки харчових продуктів у Східній та Центральній Європі” (Київ,
2006), ІІІ Національному з`їзді фармакологів України (Одеса, 2006),
засіданні Сумського відділення товариства токсикологів України (Суми,
2003, 2004, 2005, 2006, 2007), засіданні регіонального відділення
Асоціації фармакологів України по Харківській, Сумській і Чернігівській
областях (Одеса, 2006).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 27 статей у профільних
фахових виданнях, затверджених ВАКом України, 1 авторське свідоцтво, 2
патенти України на винаходи, 7 праць у матеріалах і тезах з`їздів та
конференцій, 2 методичні рекомендації, 1 інформаційний лист.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу,
огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, 6 розділів власних
досліджень, обговорення отриманих результатів, висновків, списку
використаної літератури. Дисертація викладена на 373 сторінках,
ілюстрована 70 таблицями, 38 рисунками. Список літератури містить 494
джерела (з них 169 вітчизняних авторів).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. У роботі досліджувалися діанові ЕС
марок ЕД-20 (ГОСТ 10587-84) і Е-40 (ОСТ 6-10-416-77), їх найбільш
небезпечний в токсикологічному відношенні компонент – ЕХГ – і його
метаболіт – 3-хлор-1,2-пропандіол.

В експерименті використано 4147 тварин, у тому числі 1325 білих
нелінійних щурів, 2647 щурів лінії Вістар, 96 білих безпородних мишей і
79 мишей лінії BALВ/c. Всі тварини були статевозрілі, обох статей з
масою тіла 160-240 г – щурі і 19-28 г – миші. Для досліду тварин брали
після проходження карантину протягом 20-25 днів.

Інгаляційну затравку лабораторних тварин (білих щурів) леткими
компонентами ЕС здійснювали динамічним способом при 4-годинній
експозиції (И.В. Саноцкий, 1970; А.П. Яворовский, 1990) в нашій
модифікації (І.Ю. Висоцький, К.Г. Калікін, 1991) і статичним способом в
умовах 30-хвилинної експозиції ЕХГ за методикою В.Д. Лук`янчука (1979).
При вивченні порівняльної токсичності ЕХГ і його метаболіту
3-хлор-1,2-пропандіолу ці речовини вводили перорально у вигляді 1-5%
розчинів.

Токсикометричні параметри досліджуваних речовин розраховували за
допомогою методу найменших квадратів для пробіт-аналізу кривих
летальності (В.Б. Прозоровский, 1962), а також експрес-методу (В.Б.
Прозоровский и др., 1978) і методу “однієї точки” за Van der Vaerden
(1970). Протягом 14 днів фіксували клінічну картину інтоксикації та
загибель тварин.

Вміст летких продуктів у повітрі затравної камери регулювали за рахунок
зміни наважки досліджуваної речовини, температури нагрівання і режиму
повітряного обміну. Як провідний і характерний компонент летких
компонентів ЕС ЕД-20 і Е-40 був взятий ЕХГ. Концентрацію парів ЕХГ у
повітрі затравної камери визначали за методом М.С. Биховської та ін.
(1966).

Для визначення порога гострої (Limac) і порога специфічної (Limsp)
загальнотоксичної дії ЕС у тварин після 4-годинної затравки реєстрували
ректальну температуру тіла за допомогою електротермометра ТПЕМ-1, вміст
SH-груп у крові (P.D. Boyer, 1954), відносну масу печінки, активність
аланін-амінотрансферази (АлАТ) в сироватці крові (S. Reitman, S.
Francel, 1977) і час виведення бромсульфалеїну (БСФ) з жовчю (Л.И.
Израйлет и др., 1976). Розраховували зони гострої (Zac) і специфічної
(Zsp) дії. Про функцію нирок робили висновок за величиною добового
діурезу, концентрацією сечовини у крові і хлоридів в сечі (ВІО-LA-TEST,
Чехія).

Вивчення впливу добових і сезонних біоритмів на токсичність ЕХГ і ЕС при
смертельних (ЛД50, ЛК50) і близьких до порогових (1/10 ЛД50, ЛК50)
рівнях впливу проводили на окремих групах тварин, яких утримували у
звукоізольованих з контрольованою температурою штучно освітлюваних
кімнатах при співвідношенні світлого і темного періодів 12:12.
Дослідження проводили з

4- (ЕХГ) і 12-годинними (ЕС) інтервалами, а також в середині зими,
весни, літа і осені о 12-й годині. ЕХГ вводили в організм перорально у
вигляді 5% олійного розчину, а леткі компоненти ЕС – інгаляційно
протягом 4 годин.

Дослідження процесів зв`язування ЕХГ сироваткою крові, а також окремими
білковими фракціями сироватки, такими, як альбумін (виробництва фірми
“Reanal”) і (-глобулін (виробництва INCSTAR Corporation), проводили
методом рівноважного діалізу у модифікованому А.І. Луйком і В.Д.
Лук`янчуком (1985) апараті С.І. Чегера (1975). Розрахунок кількісних
параметрів комплексоутворення (константа асоціації – Ка і число місць
зв`язування – N) здійснювали графічним методом Скетчарда (1984).
Визначення концентрації ЕХГ в сироватці крові і сечі проводили за
методикою Г.К. Гризунової та ін. (1993).

Скринінг потенціальних антиоксидантів проводили в дослідах in vitro на
моделі ініційованого окислення метилових ефірів ненасичених жирних
кислот (H. Fernandez, 1982), джерелом яких був “Лінетол”. Аліквоти
інкубаційного середовища відбирали в динаміці через 10, 20, 30 і 40
хвилин з моменту ініціювання перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) Fe2+.
Про інтенсивність пероксидації лінетолу робили висновок за вмістом
продуктів ПОЛ, які реагували з 2-тіобарбітуровою кислотою (ТБК) (H.
Okhawa, 1979).

Первинний фармакологічний скринінг потенційних детоксикуючих засобів
проводили на моделі гострої пероральної інтоксикації ЕХГ (ЛД50-ЛД100) як
серед відомих лікарських засобів з різними механізмами дії, так і
оригінальних органічних сполук різної будови. Ефективність препаратів
оцінювали за показниками виживання і термінів загибелі тварин.

Експериментальною моделлю гострого токсичного ураження печінки був
патологічний процес, що розвивався у тварин у результаті однократного
4-годинного інгаляційного динамічного впливу леткими компонентами ЕС
ЕД-20 в концентрації, що становила 1/3 ЛК50 за ЕХГ

(120-140 мг/м3) .

Препарати застосовували за лікувально-профілактичною схемою: кверцетин
внутрішньошлунково в дозі 350 мг/кг (ЕД50), флавінат – внутрішньом`язово
4 мг/кг (ЕД50), ліпін – внутрішньоочеревинно 0,8 ммоль/кг (ЕД30),
ацетилцистеїн – внутрішньоочеревинно 450 мг/кг (ЕД50), омепразол –
внутрішньоочеревинно 50 мг/кг відповідно за 3; 1; 5; 0,5; 0,5 і 1 годину
до початку затравки і через

5 хвилин після її закінчення. ЕД50, ЕД30 та індекс терапевтичної
ефективності (ІТЕ) досліджуваних лікарських засобів визначали в умовах
їх профілактичного введення за процентом виживання тварин на моделі
гострої інгаляційної статичної 30-хвилинної затравки білих щурів ЕХГ
(ЛК50-ЛК100) – за методикою Б.М. Штабського (1980). Крім ізольованого
введення речовин, застосовували такі їх комбінації: ацетилцистеїн +
кверцетин, ацетилцистеїн + ліпін, ацетилцистеїн + флавінат і кверцетин +
ліпін.

З метою вивчення індукції ферментів глутатіон-S-трансферази (Г-S-Т) і
епоксидгідролази (ЕГ) кверцетин тваринам вводили 1 раз на день
внутрішньошлунково по 100 мг/кг (5 днів); омепразол –
внутрішньоочеревинно по 50 мг/кг (7 днів) і клофібрат –
внутрішньошлунково по 200 мг/кг (2 дні).

Високомолекулярні сполуки (ВМС) вводили у вигляді 5-10% водних розчинів
по 300 мг/кг маси перорально або 100 мг/кг маси внутрішньоочеревинно за
30 хвилин до і через 5 хвилин після отруєння ЕХГ. Активність препаратів
оцінювали за виживанням, ІТЕ і термінами загибелі тварин.

Ентеросорбенти – карбовіт і карбовіт-М – вводили внутрішньошлунково за
допомогою зонда з розрахунку 100 мг/100 г маси тіла за 1 годину до
отруєння леткими компонентами ЕС. ІТЕ ентеросорбентів розраховували при
їх внутрішньошлунковому введенні в дозі 100 мг/100 г маси за 1 годину до
або через 1 годину після інтоксикації 5% олійним розчином ЕХГ в дозах,
необхідних для визначення ЛД50 ЕХГ.

Динаміку вмісту аденілових нуклеотидів (АТФ, АДФ, АМФ) у печінці
визначали методом T. Sato та ін. (1963). Неорганічний фосфат (Фн)
визначали за Delori в модифікації В.А. Григор`євої (1958), а рівень
нікотинамідних коферментів (НАД+НАДФ, НАДН2+НАДФН2) – флуориметрично (W.
Perlzweig, 1947).

Активність Г-S-Т у печінці визначали за утворенням комплексу глутатіону
з 1,2-дихлор-4-нітробензолом (Ю.В. Хмелевський та ін., 1986), ЕГ – за
рівнем фенілетиленгліколю (А.Е. Кранаускас, 1986), а
(-глутамілтрансферази ((-ГТ) – за вивільненням п-нітроаніліну (
BIO-LA-TEST, Чехія).

Стан процесів ПОЛ у тварин після гострої інтоксикації леткими
компонентами ЕС оцінювали за інтенсивністю спонтанної хемілюмінесценції
(ІСХ) і активованої хемілюмінесценції (ІАХ), які реєстрували на
хемілюмінометрі ІХЛ-1 (А.И. Журавлева, 1983), за вмістом у печінці рівня
первинних продуктів ліпопероксидації – дієнових кон`югатів (ДК) (И.Д.
Стальная, 1977) і кінцевого продукту ПОЛ, що реагує з ТБК, – малонового
діальдегіду (МДА) (Z. Placer, 1968).

При вивченні функціонування окремих ланок антиоксидантної системи
захисту організму визначали активність одного із ключових ферментів –
каталази (КТ) – за методом М.А. Королюк (1988). Вміст феритину (ФР) у
сироватці крові визначали радіоімунним методом за допомогою комерційного
набору “ІРМО-Феритин” (Білорусія), SH- і -S-S-групи – за методом P.D.
Boyer (1954). Забезпеченість організму ендогенними антиоксидантами
оцінювали на основі стану перекисної резистентності еритроцитів (ПРЕ)
(О.Н. Воскресенский, 1982). Про стан монооксигеназної системи (МОС)
печінки робили висновок за інтен-сивністю деметилювання амідопірину
(О.Б. Леоненко, Т.А. Попов, 1981) і тривалістю гексеналового сну (В.Д.
Розанова, 1979).

Для з`ясування молекулярних механізмів функціонування енергетичної і
детоксикуючої систем печінки у досліджуваних умовах використовували
метод ЕПР-спектрометрії. ЕПР-спектри записували на спектрометрі марки
Е-109 фірми “Varian” (США) в умовах низькотемпературної стабілізації
(770К). Досліджували ЕПР-сигнали з g-факторами: 2,25 – цитохром Р-450;
2,17 – марганцевмісні парамагнітні комплекси; 2,03 – нітрозильні
комплекси заліза (НКЗ); 2,00 – вільні радикали (ВР); 1,94 –
залізосірчані білки, або FeS-білки (ЗСБ); 1,97 – молібденовмісні
парамагнітні комп-лекси (Я.И. Ажипа, 1983).

Вміст у плазмі крові основних метаболітів АК визначали радіоімунним
методом. Рівень ЛТВ4 вивчали з використанням комерційного набору
Leucotriene B4 assay system, ПГЕ2 – набору 125І-Prostaglandine E2 assay
system with magnetic separation (“Amersham”, Англія), ПГІ2 – за
допомогою системи 125I-6-keto-prostaglandin F1(, TXB2 – 125I-thromboxane
B2, ПГF2( – 125I-6-keto-prostaglan-din F2( (“Institute of isotopes”,
Угорщина). Дослідження концентрації АКТГ проводили з використанням
набору Adrenocorticotropic hormone radioimmunoassay kit фірми “Cis”
(Франція). Підрахунок радіоактивності проводили на сцинтиляційних
лічильниках “Гама-12” і “Бета-1”.

Визначення рівня вторинних месенджерів цАМФ і цГМФ у печінці проводили
радіоімунним методом з використанням наборів “Cyclic AMP [125I]RIA KIT”
і “Cyclic GMP [125I]RIA KIT” (Чехія). Вплив різних концентрацій ЕХГ на
ендогенний біосинтез тканиною печінки in vitro ПГІ2, ТХВ2, цАМФ і цГМФ,
а також можливості фармакологічної регуляції цих процесів у гепатоцитах
вивчали за методом E. Oliw (1980) у модифікації А.Г. Кучеренко (1986).
Для розрахунку досліджуваних продуктів ендогенного біосинтезу на 1 г
білка у тканині печінки визначали білок за O.H. Lowry et al. (1951).

Гістологічні і електронно-мікроскопічні дослідження проводили
за-гальноприйнятими методами. Ультратонкі зрізи для перегляду і
фотографування в електронних мікроскопах фірм “GEM-III” (Японія) і
“Philips” (Нідерланди) готували на ультратомі LKB-V (Швеція).

Визначення досліджуваних показників проводили протягом перших
трьох-п`яти діб після отруєння.

Результати досліджень обробляли статистично з використанням комп`ютерної
програми Microsoft Excel (США). Достовірність оцінювали на рівні
значущості не менше 95% (Р(0,05) з використанням критерію t Стьюдента
(А.В. Плохинский, 1970), а також точного методу Фішера для чотирипільної
таблиці (Е. В.Гублер, 1978).

Результати досліджень та їх обговорення. Внаслідок проведених
токсикометричних досліджень встановлено, що ЕС ЕД-20 і Е-40
характеризуються високою токсичністю, незначними відмінностями видової
чутливості експериментальних тварин, а леткий компонент ЕС – ЕХГ – є
помірно токсичною при інгаляційному впливі і високотоксичною сполукою
при внутрішньошлунковому введенні. У порівняльному аспекті ЕС ЕД-20 дещо
більш токсична, ніж ЕС Е-40 (рис.1). Оскільки токсичність незатверділих
діанових ЕС прямо залежить від епоксидного числа і обернено – від
величини молекулярної маси і в`язкості (Н.И. Шумская, 1962; А.П.
Яворовский, 1990), то виявлені нами відмінності у величинах ЛК50 для ЕС
ЕД-20 і Е-40 можна пояснити більшою молекулярною масою останньої.

Про важливу роль епоксидних груп у токсичності ЕС і ЕХГ свідчить
встановлена нами значно більш висока ЛД50 первинного метаболіту ЕХГ
3-хлор-1,2-пропандіолу порівняно з вихідною сполукою (табл. 1). Це
пов`язано з перетворенням епоксигрупи ЕХГ під впливом ЕГ у дві
гідроксильні групи (В.А. Кобляков, 1990; F. Oesch, 1982).

Рис. 1. Параметри токсичності і небезпечності ЕС ЕД-20 і Е-40 (щурі)

Таблиця 1

Порівняльна оцінка параметрів токсичності ЕХГ і його метаболіту

3-хлор-1,2-пропандіолу для щурів при внутрішньошлунковому введенні в
організм

Вивчення параметрів небезпечності летких компонентів ЕС ЕД-20 і Е-40 в
умовах гострого інгаляційного динамічного надходження в організм
показало, що ці сполуки мають незначну варіабельність смертельних
концентрацій і становлять високу небезпеку розвитку смертельного
інгаляційного отруєння. Причому ЕС ЕД-20 має значно більшу потенціальну
небезпечність виникнення смертельного інгаляційного отруєння порівняно з
Е-40. Реальна небезпека розвитку гострого несмертельного отруєння ЕС
ЕД-20 і Е-40, що оцінюється за Limac i Zac, також висока і приблизно
однакова для обох смол (рис. 1). Біологічна активність досліджуваних
смол характеризується гепатоспецифічністю, що узгоджується з даними
літератури (В.Я. Витрищак, 1990; В.О. Шефтель, 1991; Y. J. Surh et al.,
1998; Я.Б. Ли, 2001).

Як свідчать отримані у роботі результати, досліджувані епоксидні сполуки
мають чітко виражену добову і сезонну ритмічність токсичної дії,
характер якої залежить від рівня токсичного впливу на організм. Акрофаза
циркадних і циркануальних ритмів токсичності ЕХГ, ЕС ЕД-20 і Е-40, які
застосовувалися в дозі 1/10 ЛК50, реєструвалася в середині світлого
періоду часу і зимою, а в дозі ЛК50 – в нічні години і літом
відповідно. Чутливість тварин до досліджуваних епоксидів, які
застосовувалися в концентраціях, близьких до порогових, відстає від фази
чутливості цих сполук у разі використання їх у середньосмертельних
концентраціях при аналізі добових ритмів на 12 годин, а сезонних –
приблизно на 180 днів. Очевидно, добові й сезонні ритми чутливості до
невисокої дози ЕХГ і летких компонентів ЕС ЕД-20 і Е-40 є функцією
ензимної активності ферментів печінки. Про це свідчать збільшення
активності цитохром Р-450-редуктази (M.A. Miller et al., 1978),
НАДФН-цитохром-с-редуктази (G. Нarisch et al., 1980) і Г-S-Т (M.H.
Davies et al., 1983) у печінці щурів і мишей у темний і зниження у
світлий час доби, пік тривалості гексобарбіталового сну в 14 год. з
мінімумом у 20 год. (V. Nair, 1974). Підтвердженням залежності сезонних
ритмів чутливості до невисоких доз ЕХГ, ЕС ЕД-20 і Е-40 від активності
відповідних ензимів печінки є зниження вмісту цитохрому Р-450 у
мембранах ендоплазматичного ретикулуму печінки щурів-самців, швидкості
N-деметилювання амінопірину й етилморфіну в зимовий період порівняно з
літнім, а також зменшення швидкості гідроксилювання аніліну в осінній
сезон (П.И. Лукиенко, Л.И. Сушко, 1980).

Як ми вже відзначали, при введенні смертельних доз ЕХГ, ЕС ЕД-20 і Е-40
максимальна чутливість до них фіксувалася в нічні години й літній час,
що не узгоджується з вищенаведеним добовим і сезонним підвищенням
активності ферментів детоксикації в печінці. З огляду на те, що ЕХГ у
високих концентраціях і дозах чинить виражену токсичну дію на центральну
нервову систему, можна припустити, що мозкова тканина сама має ритм
чутливості до епоксидів, незалежний від ритму активності ферментів,
метаболізуючих дані сполуки. Це припущення підтверджується й тим, що
пригнічена іонами Са2+ аденілатциклазна активність стріатуму головного
мозку щурів піддається добовим циклічним ритмам (Y. Chern et al., 1996).

Установлені параметри токсикокінетики провідного й найбільш токсичного
леткого компонента ЕС ЕД-20 ЕХГ свідчать про те, що в умовах гострої
динамічної інтоксикації леткими компонентами досліджуваної смоли цей
галоїдовуглеводень відрізняється високою біодоступністю, тривало
циркулює в системному кровотоці й досягає максимальної концентрації на
6-й годині після інтоксикації. Якщо зіставити отримані нами дані про
динаміку розвитку некробіотичних, дегенеративних і некротичних процесів
у печінці, які найбільш виражені на 3-5-ту добу після інтоксикації, з
динамікою зміни концентрації ЕХГ у крові (максимум через 6 годин), то
можна дійти висновку, що розвиток токсичного ефекту летких компонентів
ЕС відстає в часі від швидкості збільшення концентрації ЕХГ і
проявляється після певного латентного періоду. Такий характер формування
токсичного процесу характерний для алкілувальних агентів (С.Н. Голиков
и др., 1986), до яких належить і ЕХГ (K. Hemminki, 1980; K.P. Romano et
al., 2007).

Токсичність ліпідорозчинних ксенобіотиків багато в чому залежить від
здатності зв’язуватися з білками сироватки крові (А.И. Луйк, В.Д.
Лукьянчук, 1984). Експериментальні дослідження свідчать про те, що ЕХГ
здатний вступати в процеси зворотної взаємодії з білками сироватки
крові, серед яких як за ступенем афінітету, так і за величиною
концентрацій місць зв’язування основна роль належить сироватковому
альбуміну (СА). Лише невелика частка досліджуваної епоксидної сполуки
здатна утворювати комплекси з г-глобуліном. При концентрації ЕХГ у
діалізному апараті в діапазоні від 5,4(10-5 до 6,6(10-5М відбувається
насичення зв`язувальних центрів досліджуваних транспортних білків. З
точки зору виявлення токсичних властивостей ЕХГ зв’язування з
альбуміном може сприяти знешкодженню отрути, що створює певні
перспективи для розроблення антидотно-лікувальних засобів, які впливають
на процеси зворотного комплексоутворення ЕХГ із СА.

Екскреція ЕХГ із сечею здійснюється в порівняно невисоких концентраціях
щодо тих, які визначаються в сироватці крові, і поступово зростає до 3-ї
доби експерименту. Очевидно, СА, будучи добрим конкурентним інгібітором
екскреції ксенобіотиків, не сприяє видаленню ЕХГ із сечею, а транспортує
отруту в печінку, де остання метаболізується до менш токсичних
водорозчинних дигідродіолів, які потім екскретуються із сечею.

Наступний аспект, що вимагає обговорення, – яким чином леткі компоненти
ЕС ЕД-20 проявляють свою токсичну дію. Одним з можливих механізмів є
стимуляція ПОЛ. Дійсно, уже через 1 годину після вилучення тварин з
камери спостерігається максимальне збільшення ІАХ у крові й ДК у
печінці, а через 6 годин – ІСХ у крові (табл. 2). Настільки значне
підвищення вільнорадикальних процесів у ранній термін після
інтоксикації, збігається за часом з піком концентрації у крові леткого
компонента ЕС – ЕХГ. ЕХГ, що містить у своїй структурі епоксидну групу,
яка виявляє високі окисні властивості й здатність відщеплювати вільні
радикали, може, на наш погляд, атакувати ненасичені жирні кислоти (НЖК)
з відривом водню від вуглецевих атомів, які перебувають в (-положенні
щодо подвійного зв’язку. При цьому утворюються радикали НЖК, а в
молекулах лінолевої, ліноленової й арахідонової кислот може з’являтися
система поєднаних подвійних зв’язків (Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков,
1972). Виразна захисна дія кверцетину й ліпіну, введених до і після
отруєння леткими компонентами ЕС ЕД-20, які зменшували гепатотоксичний
ефект останніх, свідчить на користь прооксидантного механізму дії ЕС
ЕД-20.

Надалі показано, що іншою ймовірною причиною посилення ПОЛ і
нагромадження ТБК-активних продуктів може бути інактивація клітинних
антиоксидантів – тіолів, основну частину яких складає глутатіон (L.A.
Videla et al., 1980). Це узгоджується зі швидким і раннім (на 1-й годині
експерименту) зниженням вмісту SH-груп у печінці щурів при інтоксикації
леткими компонентами ЕС ЕД-20 (табл. 2) і різким посиленням токсичності
ЕХГ на фоні введення фенобарбіталу. Відомо, що введення щурам
фенобарбіталу призводить до виснаження запасів відновленого глутатіону і
значного прискорення утворення ДК і МДА (C.P. Siegers, 1982; M.J. Carle,
J.R. Fry, 1989). Докази ролі SH-груп у механізмі прооксидантного ефекту
летких компонентів ЕС ЕД-20 отримані при аналізі часових особливостей
протікання цього процесу (табл. 2). Виявилося, що найбільш значне
зниження SH-груп відзначалося через 1 добу після інтоксикації, коли в
печінці фіксувалися максимальна концентрація МДА, найбільше зниження ПРЕ
і найнижча активність ЕГ. Отже, максимальне збільшення концентрації МДА
в печінці отруєних тварин спостерігається при критичному зниженні
SH-груп білків і низькомолекулярних сполук. Збільшення -S-S-груп на 6-й
і 72-й годинах дослідження пов’язане, імовірно, з окислюванням
продуктами ПОЛ “малих тіолів” або з порушенням третинної структури
білків і ферментів організму. На користь цього свідчать дані, що окисна
активність перекисних продуктів реалізується насамперед при взаємодії з
SH-групами білків, а утворення дисульфідних зв’язків не характерне для
процесу окислювання білкових тіогруп, але має місце при окислюванні
цистеїну і глутатіону (Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков, 1972).
Спостережуване різке зниження концентрації -S-S-груп через 24 години
після інтоксикації леткими компонентами ЕС ЕД-20 свідчить про перевагу в
цей час процесів алкілування сульфогідрильних груп над їх окисленням.
Про правильність суджень щодо ролі тіолів у механізмі токсичної дії
летких компонентів ЕС ЕД-20 свідчить високий захисний ефект
ацетилцистеїну.

Таблиця 2

Вплив летких компонентів ЕС на динаміку біохімічно-функціональних

показників печінки білих щурів (M(m, n=7-10)

Відомо, що однією з причин зниження рівня SH-груп і виснаження запасів
глутатіону при метаболізмі ксенобіотиків, що мають у своїй структурі
епоксидну групу, є спонтанне приєднання епоксисполук до глутатіону, а
також кон’югація останніх із трипептидом, яка каталізується Г-S-Т і (-ГТ
(F. Oesch, 1982; В.А. Кобляков, 1990; L. Soleo, 1999). Будучи пасткою
для реакційноздатних епоксидів і ліпоперекисів, Г-S-Т проявляють
детоксикуючі властивості (И.Е. Ковалева, О.Ю. Полевая, 1985). При
інтоксикації леткими компонентами ЕС ЕД-20 активність Г-S-Т і (-ГТ, що
беруть участь на 1-й і 2-й стадіях кон’югації епоксидів із глутатіоном,
була підвищена практично в усі терміни спостереження (табл. 2). При
цьому інтенсивне підвищення активності Г-S-Т через 1 добу після
припинення інгаляційного впливу на фоні різкого зниження рівня SH- і
-S-S-груп у печінці свідчить про підвищену витрату глутатіону як для
знешкодження летких компонентів ЕС ЕД-20, так і гідроперекисів, що
приводить до зниження його рівня нижче критичного. Отримані нами
результати досліджень підтверджуються даними A. Yukihiko et al. (1980)
про підвищення активності Г-S-Т у сироватці крові при гострому гепатиті
й можуть бути, на наш погляд, показником вираженості гепатотоксичності
ЕС.

Поряд з Г-S-Т не менш важливу роль у знешкодженні епоксидів відіграє
фермент ЕГ, що відповідає за гідратацію епоксидів з утворенням більш
полярних діолів, які, як правило, є менш токсичними або нетоксичними
сполуками (А.Э. Кранаускас и др., 1986; Н.Я. Головенко, 2004; L. Mei et
al., 2006). Її активність підвищувалася тільки через 1 годину після
припинення інгаляційної затравки і далі була стійко знижена, досягаючи
на 3-5-ту добу експерименту мінімальних значень, які у 2,1-2,4 раза
нижче контрольних (табл. 2). Виражене зменшення активності ЕГ може бути
пов’язано, очевидно, із взаємодією епоксидних сполук із SH-групами й
залишком гістидину, що входять у найближче оточення активного центра
цього ферменту (M.G. Parkki, 1982; D.P. MacEachran et al., 2007).
Головна роль в інгібуванні ЕГ належить, імовірно, леткому компоненту ЕС
– ЕХГ (В.А. Филов, 1990).

Таким чином, уже через 1 добу після гострої інтоксикації ЕС шлях
метаболічного приєднання через відсутність глутатіону й шлях гідролізу
епоксидів у зв’язку з низькою активністю ЕГ фактично заблоковані, що
призводить до ковалентного зв’язування епоксидів з макромолекулами
клітини, SH-групами білків, мембранних структур, ферментів, підсилюючи
цитотоксичний ефект і, як свідчать дані електронно-мікроскопічних
досліджень, має пряме відношення до появи фокальних осередків некрозу в
зонах вираженої гіперплазії агранулярної цитоплазматичної сітки. Ці
результати свідчать про те, що рівень Г-S-Т у печінці може бути точним
показником ранньої стадії некрозу. Внаслідок інактивації SH-груп виникає
внутрішньодольковий дефіцит сірковмісних амінокислот, якому належить
досить важлива роль у патогенезі токсичного ушкодження печінкової
паренхіми

(Н.А. Толоконцева, В.А. Филов, 1976).

Для з’ясування інших можливих причин підвищення вмісту продуктів ПОЛ
досліджували деякі показники антиоксидантної системи організму.
Установлено, що гостра інтоксикація леткими компонентами ЕС ЕД-20
призводить до вірогідно вираженого зниження активності КТ, підвищення
концентрації ФР у крові й зниження ПРЕ (табл. 2). Очевидно, при низькій
активності КТ, Н2О2 у присутності Оя2 й іонів Fe2+, концентрація яких у
крові при інтоксикації ЕС, судячи із вмісту ФР, збільшена, здатна в
реакціях Фентона й Хабера-Вейса швидко розкладатися з утворенням
НОя-радикалів (C.L. Ramos et al., 1992), що є основними ушкоджуючими
агентами в біологічних системах (В.З. Ланкин и др., 2000) і спричиняють
явища гемолізу еритроцитів, які досягають максимуму на 3-5-ту добу
експерименту. Високий рівень ПОЛ при інтоксикації леткими компонентами
ЕС ЕД-20 і низька активність КТ, що реєструвалися нами, свідчать про
роль НОя-радикалів у стимуляції процесів ліпопероксидації в печінці й
декомпенсації першої лінії захисту від активних форм кисню, що
призводить до формування так званого “окисного стресу”.

Аналізуючи отримані результати, можна дійти висновку, що в механізмі
токсичної дії летких компонентів ЕС лежать два взаємозалежні процеси, що
практично одночасно виникають і проявляються ранньою тіолопривною дією й
активацією ПОЛ.

Який би не був механізм індукції ПОЛ, критичне зниження рівня
відновлених тіолів у печінці через 1 добу після гострої інтоксикації
леткими компонентами ЕС ЕД-20, збільшення реагування епоксидів з
макромолекулами, гіперпродукція ТБК-реактантів, різке посилення гемолізу
еритроцитів свідчать про поширену мембранопатію на фоні виснаження
антиоксидантної системи організму. Високий рівень процесів ПОЛ викликає
ще більше зниження активності ЕГ, що гальмує метаболізм летких
компонентів ЕС, збільшує час їх циркуляції в крові (більше 3 діб) і
підсилює токсичний ефект.

Важливо відзначити, що перекиси ліпідів проявляють свою негативну дію не
тільки на вузлові ферменти метаболізму епоксидних сполук і ферменти
антиоксидантного захисту, але також і на енергетичний обмін у печінці.
Під впливом індукованого леткими компонентами ЕС ЕД-20 ПОЛ відбувається
достовірне зменшення в печінці вмісту АТФ на 26-48% з одночасним
істотним підвищенням рівня АДФ на 36-39%, АМФ – 67-162%, Фн – 43-75% і
зменшенням співвідношення АТФ/АДФ в 1,5-2,6 раза, що свідчить про
пригнічення окисного фосфорилювання й енергетичний дефіцит у цілому.

Найімовірніше, що в механізмі виникнення дефіциту високоенергетичних
фосфатних зв’язків лежать установлені нами порушення у функціонуванні
дихального ланцюга. Про це свідчать зниження вмісту семихінонних ВР і
таких переносників електронів, що беруть участь в 1-му і 2-му пунктах
поєднання окислювання й фосфорилювання, як ЗСБ, а також різке
збільшення генерації в печінці НКЗ, що, природно, призводить до
пригнічення процесів окислювання й фосфорилювання, а отже, і утворення
АТФ (табл. 2).

Можна припустити, що ЕХГ-інтоксикація, яка викликає підвищення рівня
НКЗ, пов’язана з порушеннями в гепатоцитах комплексів гемового й
негемового заліза, задіяних у перенесенні електронів у мітохондріях. Ці
сполуки, порушуючи внутрішньоклітинні мембранні структури, судячи із
вмісту ФР у крові, очевидно, приводять до збільшення кількості вільного
заліза, яке і включається в комплекси з g=2,03 (Я.И. Ажипа, 1983).
Характерно, що збільшення вмісту НКЗ на 72-й годині експерименту
супроводжувалося зниженням концентрації FeS-білків мітохондрій, які
забезпечують сигнал ЕПР із g-фактором 1,94. Останнє свідчить про перехід
частини FeS-парамагнітних комплексів з g-фактором, що дорівнює 1,94, у
нітрозильні комплекси з g-фактором 2,03, який виключає їхню подальшу
участь у мітохондріальному транспорті електронів і фосфорилюванні (Я.И.
Ажипа, 1983).

Проаналізований вище ланцюг біохімічних процесів під впливом
досліджуваних отрут неминуче призводить до перерозподілу співвідношення
НАД+НАДФ/НАДН+НАДФН у печінці за рахунок зменшення окислених форм на
20-34% (р<0,001). Оскільки мембрани мітохондрій є найбільш стійкими органелами до органічних перекисів (С.Н. Голиков и др., 1986), не можна виключати можливості ковалентного зв'язування частини тіолових груп цистеїну ЗСБ із леткими компонентами ЕС, які, маючи високу ліпофільність, можуть досить легко проникати в мітохондрії й викликати зниження сигналу ЕПР із g-фактором 1,94. Зменшення коефіцієнта, що характеризує відношення окислених форм нікотинамідних коферментів до відновлених, при інтоксикації леткими компонентами ЕС ЕД-20 на 17-28% (р<0,05-0,001) також свідчить про порушення транспорту електронів і протонів у дихальному ланцюзі.Очевидно, зменшення співвідношення НАД+НАДФ/НАДН+НАДФН під впливом летких компонентів ЕС ЕД-20 при практично незмінній концентрації у печінці НАДН+НАДФН і доведеній нами високій ефективності флавінату в умовах гострої інтоксикації ЕХГ підтверджує результати ЕПР-досліджень у тій частині, що одна з ділянок гальмування перебуває в “низько” розміщених ланках ланцюга перенесення електронів на рівні флавопротеїдів (ФП), які асоційовані із ЗСБ і переносять електрони від НАДН на коензим Q.І, нарешті, варто сказати, що додатковим об'єктивним доказом порушення обміну нікотинамідних коферментів, ЗСБ, семихінонних ВР і аденілових нуклеотидів у печінці при токсичній дії летких компонентів ЕС ЕД-20 є дані про ультраструктуру мітохондрій, які характеризуються ознаками явної деструкції, дуже набряклим матриксом, деградацією крист, порушенням цілісності зовнішньої мембрани. Такі зміни в мітохондріях гепатоцитів можуть приводити до зменшення споживання ними кисню й тим самим робити свій внесок у зниження температури тіла, що спостерігається при отруєнні епоксисполуками.Таким чином, аналіз отриманих даних свідчить про те, що під впливом летких компонентів ЕС ЕД-20 відбувається порушення транспорту електронів і протонів у дихальному ланцюзі мітохондрій на ділянці ФП обох шляхів окислювання субстратів, що приводить до перерозподілу співвідношення окислених і відновлених форм нікотинамідних коферментів, гальмування окислювання й фосфорилювання зі зменшенням синтезу АТФ і виснаження енергетичних ресурсів клітини, особливо в пізній термін інтоксикації.При подальших дослідженнях нами встановлено, що в умовах модельованої патології відбувається пригнічення НАДФН-залежної монооксигеназної системи печінки, часткове блокування першої й другої фаз біотрансформації ксенобіотиків, що приводить до достовірного зменшення екскреції із сечею 4-аміноантипірину (4-ААП) у 2,8-3 раза, а N-ацетил-4-аміноантипірину (N-ац-4-ААП) – у 2,2-4 рази. Це підтверджується характерними деструктивними змінами ультраструктури ендоплазматичного ретикулума, які проявлялися вже через 6 годин і значно підсилювалися через 3 доби після отруєння. Однією із причин цього може бути гальмування на 12-й годині досліду потоку електронів до цитохрому Р450, викликане зниженням у 2,3 раза (р<0,001) рівня Мо5+-вмісних парамагнітних комплексів, які, як відомо, входять до складу мікросомальних ферментів. Можливо, за аналогією до мітохондрій, зниження потоку електронів відбувається на рівні Fe2S2 білків, асоційованих з НАДФН-специфічним ФП мікросом. Через те, що вміст ФП не вивчався, висловлене припущення має гіпотетичний характер. Проте, з огляду на результати застосування флавінату й ацетилцистеїну, цей механізм має право на існування. Раннє підвищення при цьому вмісту цитохрому Р450 на 23-58% (р<0,05-0,01) і локальна гіперплазія агранулярного цитоплазматичного ретикулума не узгод-жуються з вищенаведеними результатами. Очевидно, під впливом летких компонентів ЕС ЕД-20 (ЕХГ, толуол), на відміну, наприклад, від барбітуратів, включається існуючий механізм екстреної індукції ферментів шляхом термінового, короткочасного підвищення внутрішньоклітинної концентрації цАМФ (С.И. Ялкут, С.А. Котова, 1987; Л.С. Колесниченко, 1990), рівень якого різко зростав уже через 1-6 годин від моменту закінчення інгаляційного впливу досліджуваних отрут у2-2,5 раза (табл. 2). Внаслідок реалізації саме цього шляху відбувається під впливом летких компонентів ЕС ЕД-20 раннє підвищення активності ЕГ у печінці.Установлено також, що в умовах досліджуваної патології відбувається виражена активація ліпоксигеназного і циклооксигеназного шляхів метаболізму АК з нагромадженням у різний термін після інтоксикації високоактивних продуктів її перетворення – ЛТВ4, ПГF2(, ПГЕ2 і ТХВ2, але зменшенням ПГІ2 (табл. 2). Це, певним чином, узгоджується з отриманими даними щодо вивчення продуктів ПОЛ і стану тіол-дисульфідного обміну в аналогічних умовах експерименту.Відомо, що активність циклооксигеназ і ліпоксигеназ регулюється продуктами їхньої реакції, у тому числі перекисними сполуками, які утворюються під час цих реакцій (В.З. Ланкин и др., 2000). Невеликі кількості перекисів активують зазначені ферменти, у той час як нагромадження продуктів ПОЛ у значних кількостях може призводити до незворотного інгібування як циклооксигеназ, так і ліпо-ксигеназ (А.А. Болдырев, 1990). Очевидно, помірне підвищення в тканині печінки при гострій інтоксикації ЕС МДА, яке ми спостерігали на 6-й годині експерименту (табл. 2), стимулювало активність ліпо- і циклооксигеназ, про що свідчить збільшення концентрації ЛТВ4 і ТХВ2. Подальше збільшення в гепатоцитах ТБК-ак-тивних продуктів корелювало не тільки з різким зменшенням у плазмі крові концентрації ЛТВ4, але й зі збільшенням поряд із ТХВ2 і рівня ПГF2(, що, можливо, пов'язане з більш високою стійкістю циклооксигенази порівняно з ліпоксигеназою до негативного впливу високих концентрацій ліпопероксидів, а також із індукцією ЕС циклооксигенази-2 (F.M. Huang et al., 2003).Треба, однак, відзначити, що збільшення у плазмі крові під впливом летких компонентів ЕС рівня ПГF2( не супроводжується підвищенням концентрації ПГЕ2, хоча обидві ці сполуки є продуктами циклооксигеназної реакції. Найімовірніше, це пов'язане з тим, що циклооксигеназа каталізує тільки перший етап синтезу простагландинів. Другий етап синтезу цих біологічно активних сполук каталізує група ферментів, які відомі під назвою простагландинконвертаз. До них належать локалізовані у мікросомальній фракції ендопероксипростагландинізомерази, що відповідають за утворення ПГЕ2, і ендопероксипростагландинредуктази, що відповідають за синтез ПГF2( (Я. Мусил, 1985; В.У. Буко, 1991).У світлі обговорюваного аспекту важливо підкреслити, що ендоперокси-простагландинізомераза потребує для синтезу ПГЕ2 відновленого глутатіону як кофактора, тоді як для ендопероксипростагландинредуктази, що бере участь у синтезі ПГF2(, присутність глутатіону не обов'язкова (В.У. Буко, 1991). З огляду на те, що при гострій інтоксикації леткими компонентами ЕС спостерігається різке зменшення у крові й печінці рівня SH-груп білків і низькомолекулярних сполук, можна припустити, що відсутність паралельного із ПГF2( компенсаторного збільшення концентрації ПГЕ2 у плазмі крові пов'язана з дефіцитом SH-вмісних сполук, які витрачаються в значних кількостях на детоксикацію летких компонентів ЕС. У той самий час різке збільшення у плазмі крові й зрізах тканини печінки в дослідах “in vitro” під впливом летких компонентів ЕС ЕД-20 рівня ТХВ2 і зниження ПГІ2 свідчать про можливо більшу чутливість до кінцевих продуктів ПОЛ циклооксигенази ендотеліальної стінки судин, ніж тромбоцитів і простациклінсинтетази порівняно із тромбоксансинтетазою.У плані подальшого обговорення отриманих результатів варто сказати, що дія ПГІ2 і тромбоксанів здійснюється за допомогою аденілатциклази. Під впливом ПГІ2, що вважається досить сильним стимулятором аденілатциклази тромбоцитів, гепатоцитів й інших клітин, вміст цАМФ у них збільшується. На відміну від ПГІ2 тромбоксани зменшують активність аденілатциклази, збільшуючи рівень внутрішньоклітинного Са2+ (Я. Мусил, 1985). Вважають (Н.А. Федорова и др., 1990), що тромбоксан діє, як іонофор А23187, і свою інгібуючу дію на активність аденілатциклази реалізує через Са2+.Виходячи з вищезазначеного, можна припустити, що різке збільшення в крові під впливом летких компонентів ЕС ЕД-20 концентрації ТХВ2 на фоні зменшення ПГІ2 спричиняє надмірне зниження в тромбоцитах і гепатоцитах рівня цАМФ, спостережуване в наших дослідах (табл. 2). Зменшення вмісту цАМФ, що є антагоністом Са2+, сприяє стрімкому наростанню в клітинах концентрації цього іона. У результаті відбувається підвищення активності кальційзалежного білка кальмодуліну, який стимулює активність фосфодіестерази цАМФ і сприяє тим самим ще більшому зниженню рівня цього циклічного нуклеотиду в гепатоцитах (Ю.И. Губский, 1989).Оскільки Са2+ є пусковим сигналом для багатьох процесів у клітині, його надлишок буде чинити токсичну дію й викликати загибель гепатоцитів (Н.А. Федоров и др., 1990), що й спостерігалося нами при проведенні гістологічних і електронно-мікроскопічних досліджень тканини печінки, ушкодженої ЕС. Очевидно, збільшити проникність цитоплазматичних мембран для Са2+ у відповідь на дію ЕС може не тільки ТХВ2, але й інтенсифікація цими сполукамипроцесів ліпопероксидації, синтезу лейкотрієнів, які здатні активувати Са2+-мобілізуючу поліфосфоінозитидну систему.На особливу увагу заслуговують аналіз і обговорення даних про активацію леткими компонентами ЕС ЕД-20 метаболізму АК ліпоксигеназним шляхом, що дуже важливо, оскільки синтез ЛТВ4 супроводжується активацією вільнорадикальних процесів, продукцією О2· (В.З. Ланкин и др., 2000), пригніченням супероксидної реакції (M. Chopra, 1984), а в основі токсичних ефектів похідних НЖК лежить блокування мітохондріального електронного ланцюга (J.H. Morаn et al., 2001).Встановлені нами підвищення синтезу ЛТВ4 і посилення процесів ПОЛ неминуче приводять до експресії індуцибельної NO-синтази і гіперпродукції NO, надлишок якого інактивує ЗСБ, до яких належать дихальні ферменти мітохондрій (Е.Б. Манухина, 2000), що, на наш погляд, є однією з можливих причин пригнічення транспорту електронів у мітохондріях. Слід зазначити, що оксид азоту після перетворення під впливом супероксидного радикала, який утворюється під час синтезу ЛТВ4 й інших ейкозаноїдів, у пероксинітрит (ONOO-), може викликати нітрозування білків та ініціювати апоптоз (M.P. Murphy, 1999; J.P. Eu et al., 2000). Про це свідчить різке збільшення кількості НКЗ у печінці під впливом летких компонентів ЕС ЕД-20 в усі терміни дослідження.Цілком імовірно, що леткі компоненти ЕС ЕД-20 є причиною загибелі гепатоцитів у результаті їх безпосередньої взаємодії з SH-групами й утворення аддуктів з біологічно важливими макромолекулами, тобто за механізмом некрозу і/або за рахунок ініціації патологічного процесу ЛТВ4, ТХВ2, ПГF2(, продуктами ПОЛ, активними формами кисню, оксидом азоту, тобто за механізмом апоптозу.Обговорення механізмів формування токсичного процесу під впливом ЕС було б неповним без урахування ролі змін у системі цАМФ/цГМФ і АКТГ. Як показали проведені нами дослідження, у початковий період після отруєння леткими компонентами ЕС ЕД-20 на фоні підвищення в крові концентрації АКТГ у печінці різко зростає вміст цАМФ (табл. 2). Ці зміни, що спостерігаються через 1 годину після отруєння, відображають один із центральних адаптаційних механізмів реакції організму (підвищення АКТГ) і клітини (підвищення цАМФ) на екстремальний стресовий вплив і свідчать про розвиток фази підвищеної резистентності в початковий період гострої інтоксикації ЕС.Отримані нами результати підтверджують виявлену Ю.І. Губським (1989) загальну закономірність, згідно з якою хімічне ураження клітин приводить до підвищення вмісту цАМФ, рівень якого швидко знижується в міру подальшого розвитку патологічного процесу в клітині. І дійсно, на більш пізніх етапах гострої інтоксикації, незважаючи на вторинне підвищення вмісту АКТГ у крові, рівень цАМФ знижується й відбувається стрімке підвищення концентрації цГМФ у печінці. Це корелює з посиленням утворення ТБК-реактантів, різким зниженням антиоксидантного захисту й може бути трактовано як початок розвитку фази виснаження, що вимагає відповідної фармакологічної корекції.Зростання рівня цГМФ у печінці сприяє значному збільшенню числа лізосом, лабілізації лізосомальної мембрани, що супроводжується вивільненням лізосомальних ферментів, у тому числі кислих гідролаз, кислої фосфатази (І.Ю. Висоцький та ін., 2003), яким належить провідна роль у реалізації мембранотоксичних ефектів хімічних речовин і стимуляції регенераторних процесів. Про початкові ознаки репаративних процесів при явищах жирової дистрофії й некрозу свідчить збільшення на 5-ту добу досліду в незмінених гепатоцитах частки конденсованого хроматину, зростання числа перихроматинових гранул, зменшення в мітохондріях числа вакуолей, а в ендоплазматичному ретикулумі - числа зв'язаних рибосом. цАМФ, навпаки, стабілізує мембрани лізосом. Подібний стабілізувальний ефект, мабуть, можуть проявляти фактори, які збільшують швидкість синтезу цАМФ або гальмують його метаболізм і регулюють рівень цГМФ у клітинах.Вважають, що цАМФ є універсальним регуляторним механізмом детоксикації ксенобіотиків за рахунок індукції метаболічної активності ферментних білків і збільшення їх синтезу (С.И. Ялкут, С.А. Котова, 1987). У зв'язку з цим є всі підстави думати, що саме таким шляхом в досліджуваних умовах експерименту відбувається швидке підвищення активності таких важливих для метаболізму ЕС ферментів, як ЕГ, Г-S-Т і (-ГТ.Виходячи з результатів досліджень молекулярних аспектів токсикодинаміки і токсикокінетики летких компонентів ЕС ЕД-20 на етапах резорбції, біотранспорту кров'ю, взаємодії з біомембранами, біотрансформації, екскреції, були визначені конкретні шляхи пошуку засобів фармакотерапії. Такий підхід до розроблення засобів детоксикації при гострих отруєннях є, на думкуВ.Д. Лук`янчука (1988), найбільш раціональним, оскільки він продиктований установленим поліморфізмом точок прикладання і багатогранністю спектра біологічних ефектів летких компонентів ЕС ЕД-20.Встановлені дані про молекулярні механізми взаємодії ЕХГ з білками сироватки крові й необхідність забезпечення фізико-хімічної спорідненості отрути й антидоту, яка випливає з них, покладені в основу принципу детоксикації, що ґрунтується на зниженні концентрації отрути в крові. Для цього використовували синтетичні ВМС, здатні фіксувати отруту, конкуруючи із транспортними білками або, точніше, доповнюючи їх природні детоксикуючі властивості.TH<*UeTH

Похожие документы
Обсуждение
    Заказать реферат
    UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2019