.

Структурно-функціональні властивості гемаглютиніну і нейрамінідази різних штамів віруса грипу Н9N2 (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 2859
Скачать документ

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені В. Н. Каразіна

ГІСІНА ІРИНА ЛЕОНІДІВНА

УДК 043:577.214:578.81

Структурно-функціональні властивості гемаглютиніну і нейрамінідази
різних штамів віруса грипу Н9N2

03.00.04 – біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертаціі на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському національному університеті імені
В. Н. Каразіна МОН (Харків, Україна).

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Перський Євген Ефроїмович,

Харківський національний університет

ім. В.Н. Каразіна МОН, завідувач кафедри біохімії

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор

Войціцький Володимир Михайлович,

Київський національний університет

ім. Тараса Шевченка,

професор кафедри біохімії

доктор біологічних наук, професор

Петров Сергій Анатолійович,

Одеський національний університет

ім. І. І. Мечнікова МОН,

професор кафедри біохімії

Провідна установа: Інститут молекулярної біології і генетики НАН
України, відділ білкової інженерії та біоінформатики

Захист відбудеться 06.03 2007 р. о 16 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д.64.051.17 Харківського національного
університету

ім. В.Н. Каразіна МОН за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд.
Ш-15.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці
Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна МОН за
адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи. 4.

Автореферат розісланий 06.02. 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук
Падалко В.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Грип – широко розповсюджене вірусне захворювання
тварин та людини, що призводить до серйозних ускладнень та часто
закінчується смертю хворого. Характерна особливість грипу – періодичне
повторення епідемій, що можуть переростати в пандемії і охоплювати
величезні території.

Такий характер хвороби є результатом високої швидкості эволюції вирусів
грипу. Одна з найважливіших причин цього – сегментованість їхнього
геному, що може спричинити реасортацію генів за умов комбінованної форми
інфекції, коли організм хазяїна інфікований одночасно різними підвидами
вірусу. В такому випадку виникають нові варіанти збудника, проти яких
населення не має імунного захисту [Perrish C.R. et al., 2005; Lewis
D.B., 2006]. Значна мінливість вірусів грипу сприяє їхньому широкому
розповсюдженню, високому епідемічному потенціалу та здібності змінювати
хазяїв, навіть далеких систематично один від одного [Perrish C.R. et.
Al, 2006].

Одним з найактуальніших питань сьогодні є перехід вірусу грипу від
птахів до ссавців і, в першу чергу, до людей. Реальна можливість цього
вперше була описана в 1997 та 1999 роках, коли в Гонконзі спостерігалися
випадки захворювання декількох людей, викликані вірусами пташиного
гриппу двох серотипів – Н5N1 та Н9N2. Таким чином, зараз в природі
циркулюють мінімум два варіанти вірусів пташиного грипу, що здібні до
переходу на людину [ Guo Y. et al., 1999, Guan Y. et al., 2000; Lin Y.
P. et al., 2000].

На сьогодні, в результаті сезонних міграцій диких птахів, а також
завдяки індустріалізації птахівництва та широкому розповсюдженню його
продуктів, небезпечний для людей вірус Н5N1 поширився по величезних
територіях в Азії, Європі, Америці та на Близькому Сході. Його знайдено
і на території України, в Криму. Наразі від вірусу цього серотипу
загинуло вже біля 90 человік з тих 170, що захворіли [Olsen B., Munster
V.J.,Walltnsten A. et al, 2006] Вірус Н9N2 менш патогенний для птахів,
ніж Н5N1. Крім того, відомо лише про 2 випадки захворювання, що
пов’язані з ним, серед людей [Peiris M., Yuen K.Y., Leung C.V. et al.,
1999: Lin Y. P., Shaw M., Gregory V., 2000]. Але, зважаючи на постійні
еволюційні зміни, що мають місце, цей вірус уособлює сьогодні таку ж
потенційну загрозу, як декілька років тому вірус Н5N1.

Найбільш важливу роль в процесі інфікування відіграють
структурно-функціональні властивості поверхневих білків вірусу грипу –
гемаглютиніну (HА) та нейраміниідази (NА), антигенні властивості яких
покладено в основу класифікації вірусів грипу. Саме за допомогою цих
білків вірус адсорбується на клітинах організму хазяїна і здійснює
проникнення в них. Крім того, саме ці білки є основними мішенями для
системи імунного захисту хазяйського організму від вірусів.

Еволюційні зміни структури поверхневих білків вірусу лежать в основі
цілого спектру змін біологічних властивостей вірусів. Так, зміни їх
первинної будови в області антигенних детермінант, навіть не дуже
суттєві на перший погляд, можуть вплинути на ефективність захисту
організма хазяїна від вірусної інфекції. Структура та властивості цих
білків, а також разні варіанти їхніх сполучень, можуть визначати
вірулентність та патогенність вірусів. Нарешті, сама можливість переходу
віруса грипу від птахів до ссавців, в тому числі й до людини, залежить
від характера структурних змін цих білків в ході еволюції віруса.

Але особливостям молекулярної еволюції NА i НА та їх генів у віруса Н9N2
до останнього часу приділялось мало уваги порівняльно з вірусом Н5N1.
Саме це не дозволяло оцінити належним чином ступінь потенційної
небезпеки вірусу Н9N2 для людей.

В зв’язку з тим, що сказано, актуальним є вивчення молекулярних
механізмів структурно-функціональної мінливості NА, НА та їх генів, що
має місце в процесі еволюції вірусу Н9N2, та спроба пов’язати їх із
здібністю цього вірусу змінювати хазяїна – переходити від птахів до
ссавців, зокрема і до людини.

Ці дослідження важливі як для з’ясування загальних молекулярних
процесів, що лежать в основі еволюції вірусів грипу, так і для
прогнозування та виявлення потенційно найбільш епідемічних і патогенних
різновидів вірусу грипу. Такий прогноз, що стосується, зокрема,
антигенних особливостей білків, які вивчаються, може бути корисним для
розробки стратегії ефективної вакцинації населення, основаної на виборі
найбільш відповідних вірусних штамів, а також методів лікування
захворювання, коли воно вже виникло.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана
на кафедрі біохімії Харківського національного університету імені В.Н.
Каразіна в рамках держбюджетних тем “Фізіолого-біохімічні і
структурно-функціональні механізми адаптації біологічних систем до
екстремальних чинників довкілля в онтогенезі” (№ держреєстрації
0100U003268) та “Закономірності фізіолого-біохімічної та
структурно-функціональної адаптації біологічних систем до несприятливих
факторів середовища в онтогенезі” (№ держреєстрації 0103U005734).

Мета та задачі дослідження. Мета роботи – виявити особливості
молекулярної еволюції вірусу грипу Н9N2, що сприяють можливості його
переходу від птахів до ссавців.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі задачі:

Визначити нуклеотидні послідовності РНК в ділянках генів HА і NА, а
також первинну структуру відповідних областей цих білків, що
відповідають за їх функціональні власивості, для різних ізолятів вірусу
грипу Н9N2, отриманих в птахівничих господарствах Ізраіля у курей,
індиків, гусей, страусів в період епізоотії 2000 – 2004 років.

Вивчити швидкість, ступінь та константи зв’язування НА у цих штамів
вірусу грипу Н9N2 з клітинами ссавців та птахів in vitro.

Дослідити температурну залежність ферментативної активності NA у цих
штамів вірусу грипу Н9N2 in vitro.

Встановити можливу кореляцію між різницею функціональної активності HА
та NА і особливостями їхніх первинних структур у цих штамів вірусу грипу
Н9N2, а також виявити еволюційні зміни, що можуть в найбільшій мірі
сприяти переходу вірусу від птахів до ссавців.

На основі вивчених первинних структур побудувати еволюційне дерево цих
штамів вірусу грипу Н9N2 та виділити в ньому штами, які потенційно
найбільш здібні переходити до ссавців.

Об’єкт дослідження – зв’язок між еволюційними змінами первинної
структури РНК в генах HА та NА і структурно-функціональними
властивостями цих білків.

Предмет дослідження – нуклеотидні послідовності РНК, амінокислотні
послідовності HА і NА, їхні адсорбційнi, ферментативні та антигенні
властивості, еволюційні зв’язки між штамами вірусу грипу Н9N2.

Методи дослідження – полімеразна ланцюгова реакція – ПЛР, электрофорез в
агарозному гелі, секвенування ДНК і визначення амінокислотних
послідовностей НА та NА, методи виміру функціональних властивостей цих
білків (реакції гальмування гемаглютинаційної та нейрамінідазної
активностей, визначення швидкості адсорбції і коефіцієнту зв’язування
вірусу з моношаровою культурою клітин нирок собаки і курячими
еритроцитами, спектрофотометричне визначення питомої активності вірусної
NА), побудова еволюційного дерева штамів вірусу грипу Н9N2.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше визначені первинні
структури ділянок генів HА і NА та відповідні їм амінокислотні
послідовності, що обумовлюють функціональні властивості цих білків, які
були вилучені з 61 штаму вірусу грипу птахів H9N2 на протязі
епідемічного спалаху цієї хвороби в 2000 – 2004 р.р. На підставі
отриманих даних проведено систематичне дослідження молекулярних
механізмів еволюції вірусу H9N2 за 4-річний період.

Показано, що еволюція вірусу грипу в ході епізоотії йшла не шляхом
поступових змін від первісного варіанту до кінцевого, а шляхом появи
ряда форм, що відрізняються як одна від одної, так і від початкового
варіанту.

Вперше показано зв’язок між конкретними мутаціями в нуклеотидному складі
генів HА і NА, відповідними амінокислотними змінами та функціональною
активністю цих білків – швидкістю та ступенем адсорбції вірусу на
клітинах і температурним оптимумом дії NА.

Отримані дані вперше демонструють структурно-функціональні властивості
молекул HА та NА, що відіграють вирішальну роль у взаємодії збудника
хвороби та хазяїна і дозволяють вірусу грипу птахів H9N2 переходити в
резервуар ссавців.

Вперше описано варіанти вірусу H9N2, які є найбільш відповідними
кандидатами для переходу на ссавців, в тому числі і на людей.

Теоретичне та практичне значення отриманих результатів. З теоретичної
точки зору, отримані результати доповнюють сучасні уявлення про
молекулярні засади еволюції вірусів грипу та є важливими для розуміння
процесів, що дозволяють вірусам переходити від птахів до ссавців.
Зокрема, вони розкривають зв’язок між мутаційними змінами в генах та
структурно-функціональними властивостями білків, відповідальних за
взаємодію віруса з клітинами хазяїв, що належать до різних систематичних
груп організмів. Отримані дані дозволяють також розробити молекулярні
критерії можливості різних варіантів вірусу пташиного грипу переходити
на ссавців та людей.

Практичне значення результатів дисертаційної роботи полягає насамперед в
тому, що вони можуть бути корисними для передбачення появи нових штамів
вірусу грипу з підвищеною здібністю інфікувати організм людини. Дані про
еволюційні зміни первинної структури та антигенні властивості
поверхневих білків вірусу можуть бути використані для планування і
прискорення створення нових вакцин, а саме, для рекомендації вибору
нових вірусних штамів, що можуть забезпечити максимальну захисну реакцію
організму тварин та людини від грипу. Отримані результати
використовуються в навчальному процесі під час викладання спецкурсів
“Фізіологічні і біохімічні основи адаптації”, “Молекулярні основи
імунології” та “Молекулярні механізми еволюції” на біологічному
факультеті Харківського національного університету ім. В. Н. Каразіна.

Особистий внесок здобувача. Відповідно до поставлених мети та задач
роботи, автором самостійно виконано запланований обсяг експериментальних
досліджень, розрахунки еволюційних відношень досліджених штамів вірусу
грипу, аналіз наукової літератури, зроблена статистична обробка
фактичного матеріалу.

Планування напрямків досліджень та інтерпретацію отриманих результатів
проведено сумісно з науковим керівником. Ізоляцію вірусів та оцінку
їхньої патогенності було проведено сумісно зі співробітниками
Ветеринарного інституту Кимрона (Бейт-Даган, Ізраїль), що відображено в
спільних публікаціях. В дисертації не використані ідеї чи розробки, які
належали б співавторам опублікованих наукових праць.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались та
обговорювались на ХIII Конгресі всесвітньої ветеринарної асоціації
домашніх птахів (Денвер, Колорадо, 2003 р.); щорічному з’їзді
Ізраїльського товариства мікробіологів (Тель-Авів, 2003 р.); ХІІ
Міжнародному конгресі імунологів і ІV щорічній Конференції імунологів
(FOCIS) (Монреаль, Канада, 2004 р.); науковій Конференції, присвяченій
70-річчю кафедри генетики і цитології Харківського національного
університету ім. В. Н. Каразіна (Харків, 2004 р.); V Інтернаціональному
симпозіумі по захворюванням птахів (Берлін, Німеччина, 2004 р.);
IX Українському біохімічному з’їзді (Харків, 2006 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 14 наукових праць,
серед яких 6 статей у журналах та 8 тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду
літератури, опису матеріалів та методів дослідження, 4-х розділів
результатів дослідження та їх обговорення, заключення, висновків та
списку літератури (з 194 джерел). Робота викладена на 144 сторінках
друкованого тексту і містить 18 малюнків та 26 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Дослідження проведені на 61 штамі вірусу
грипу H9N2, що були виділені у птахівничих господарствах Ізраіля в
період епізоотії 2000 – 2004 р.р. Референтні штами пташиного
{ty/wisconsin-66 – (H9N2)} та людських {Singapore/57 – (H2N2) і Hong
Kong/68 (H3N2)} вірусів грипу були люб’язно надані доктором Скехелом
[Dr. Skehel, World Influenza Center, National Institute for Mеdical
Reserch, Mill Hill, London].

Для ізоляції вірусів 9–10-денні ембріони курей інфікували шляхом
введення культури віруса (1 мл трахеальних та клоакальних змивів в
гліцерофосфатному буфері, рН 7,2) в алантоїсну порожнину. Через 48–96
годин після зараження алантоїсну рідину відбирали, аліквотували,
перевіряли на присутність антигену, заморожували та зберігали при – 800
С.

Патогенність вірусів оцінювали за індексом смертності (IVPI) курчат
віком 6 тижнів після внутрішньовенного введення вірусу методом,
рекомендованим ОІЕ [Office International des Epizootiеs, 2000].

Функціональні властивості HА та NА вивчали у вірусів, що були отримані
на початку, в середині та в кінці епізоотії і порівнювали їх з
властивостями цих білків у референтних вірусів.

Антигенні властивості HА визначали за допомогою реакції гальмування
гемаглютинації (РГГА). Визначення проводили в 1% суспензії курячих
еритроцитів, що містила 4 аглютинаційні одиниці (АО) антигену, за
допомогою набору референтних антисироваток до 15-ти серотипів HА (Н1 –
Н15) и 9-ти серотипів NА (NA1 – NA9) за методом, який рекомендовано ВООЗ
[Douwdal W.A. et al., 1979]. Антисироватки були надані доктором
Вебстером [Dr. Webster, St. Jude Children’s Research Hospital, Memphis,
USA].

Про рецепторні властивості HА робили висновки згідно з реакцією
гемаглютинації, яку проводили в двох варіантах – на моношаровій культурі
клітин нирок собаки (МDCK) та на еритроцитах курей.

Клітини МDCK отримували з клітинного банку АТСС (American Type Culture
Collection) і культивували в середовищі МЕМ (Minimum Essential Medium) з
10% ембріональною сироваткою теляти. В разі еритроцитів використовували
їхню 15% суспензію та алантоїсну рідину з титром не менш, ніж 1:128
[Rivetz R., Lipkind M., 1985].ступінь адсорбції вірусу оцінювали за
зміною титру гемаглютинації в пробах, які відбирали з інтервалами 15
хвилин для клітин МDCK та 2 хвилини -для курячих еритроцитів при 40С.

Розраховували час адсорбції 50% вірусу на клітинах ( t50% ) , константу
ії швидкості (К – тангенс початкового кута нахилу кінетичної кривої
адсорбції) та за методом Скетчарда [Dupuis G., Clairoux-Moreau S., 1980]
– константу зв’язування (Кб=[Сv ? Cc] /[Сv] ? [Cc], де [Сv ? Cc] –
питомий вміст комплексів клітина-вірус, Сv і Cc – питомий вміст вільних
вірусу та клітин відповідно).

Ферментативну активність NА при 150, 250, 370, 420 і 560С оцінювали за
ступенем гідролізу нею субстрата – фетуїна та виражали в одиницях
оптичної густини при ? = 549 нм [ Palmer D.F. et al, 1975]. На підставі
отриманих даних розраховували константу Міхаеліса Km

Реакцію гальмування активності NА (РГNА) проводили за методом,
рекомендованим ОІЕ, в рівних об’ємах вірусовмісних рідин – алантоїсній
рідині та антинейрамінідазній антисироватці.

Вірусну РНК виділяли з алантоїсної рідини за допомогою набору mini kit
Viral RNA фірми QIAGEN, Valencia, Calif. і використовували для
клонування ДНК в ПЛР. В реакціях ПЛР для ділянок нуклеотидних
послідовностей, що дозволяють ідентифікувати підтипи HА та NА вірусів
грипу, було використано 2 набори праймерів: 15 пар (Н1f – Н15f, Н1r –
Н15r) для HА и 9 пар (1Nf – 9Nf, 1Nr – 9Nr) для NА [Lee M.-S. et al,
2001]. Праймери були сконструйовані в лабораторії молекулярної
вірусології (Kimron Veterenary Institute, Beit Dagan, Israel).

Продукти реакції розділяли методом електрофорезу в агарозному гелі,
вирізали відповідні ділянки, очищали за допомогою набору фірми QIAGEN,
Valencia, Calif. і секвенували .

Відтворення амінокислотних послідовностей за відповідними їм
нуклеотидними та статистичний аналіз результатів проводили за допомогою
комп’ютерної програми Bio Edit Package, Version 5
[www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.,1997]. Еволюційні дерева будували за
програмою PHYLIP (Phylogeny Inference Package, Version 3,6) [www.
evolution. genetics. washington. edu/ phylip., 2000]. В цих розрахунках
використовували також взяті з генного банку послідовності NА і HА 23
вірусів грипу птахів, ссавців, в тому числі людини, які були вилучені в
період 1979 – 1999 років.

Статистичну обробку даних біохімічних досліджень проводили
використовуючи критерій Стьюдента та непараметричний критерій
Вілкоксона-Манна-Уітні [Иванов Ю. И., Погорелюк О. Н., 1990].

Результати досліджень та їх обговорення

Еволюція структурно-функціональних властивостей НА. Про функціональні
властивості HА можна судити за швидкістю та ступенем адсорбції вірусу на
клітинах – мішенях. На рис. 1 зображені часові залежності ступеню
зв’язування 6 штамів вірусу грипу H9N2 (включаючи референтний штам
ty/wisconsin-66) на культурі клітин собаки МDCK та курячих эритроцитах,
а в табл.1 наведені розраховані згідно з цими кривими константи
швидкості, часи адсорбції 50% вірусу на різних клітинах та константи
зв’язування його з різними клітинами.

Як видно, для всіх досліджених штамів швидкість і ступінь адсорбції
вірусів на курячих еритроцитах набагато вищі, ніж на клітинах MCDK. На
16-у хвилину віруси всіх штамів повністю пов’язуються з першими, в той
час як на других ступінь адсорбції навіть за 90 хвилин не досягає 100%.

Але в обох випадках характер адсорбції референтного та інших вивчених
штамів суттєво розрізняються. Швидкість та ступінь адсорбції
референтного віруса на клітинах курки вищі, а на клітинах собаки –
нижчі, ніж всіх інших вірусів. Це свідчить про те, що в процесі еволюції
вірусу Н9N2 в період з 1966 по 2004 р. його спорідненість до клітин
птахів зменшилась, а до клітин ссавців – зросла.

В той же час, як видно, ці зміни спорідненості в період 2000 – 2004 р.р.
за своїм характером не є регулярними. Так, у штама, що був ізольований в
травні 2000 р, адсорбція на клітинах собаки більш інтенсивна, ніж у
штамів, ізольованих в січні та травні 2004 р. Значення констант
адсорбції на цих клітинах у штама, ізольованого в січні 2003 р.,
вірогідно нижча, ніж у штама, ізольованого в липні цього ж року і т.ін.
(Табл. 1). Це свідчить, що єдиний процес – наближення спорідненості
пташиного віруса H9N2 до рецепторів клітин ссавців здійснюється
звичайним шляхом – в результаті диференційної еволюції мутантних форм,
що виникають безперервно.

Цілком природно, що в основі цього процесу лежать мутації в генах HА,
які змінюють його первинну структуру, та, відповідно, функціональні
властивості.

Приєднання вірусу грипу до клітини можливе тільки після активації HА
шляхом розщеплення його молекули тканинними протеазами хазяїна в сайті
розщеплення – між 326 і 330 амінокислотними залишками, і взаємодією
клітинного рецептора з рецептор-зв’язуваючою ділянкою HА – поміж
амінокислотними залишками у позиціях 98 – 228.

Різна кінетика адсорбції, що знайдена у досліджених штамів, може
вказувати на те, що в процесі еволюції вірусу виникли структурні
відмінності – або в сайтах розщеплення, або в рецептор-зв’язуваючих
сайтах, або в тих та інших

Для підтвердження існування таких замін і з’ясування їх характеру для
всіх штамів, ізольованих на протязі епізоотії 2000 – 2004 р.р., а також
референтного штаму вірусу птахів, на основі вивчення відповідних
нуклеотидних послідовностей порівнювали поміж собою первинну структуру
обох ділянок.

Таблиця 1

Константи швидкості (К), часи 50% – ної адсорбції (t50%) та константи
зв’язування (Кб)

штамів вірусу пташиного грипу H9N2 на клітинах МDCK та курячих
еритроцитах

Штам вірусу,

дата ізоляції Клітини MDCK Еритроцити курки

К, % /хв. t50%, хв. Кб К, %/хв t50%, хв. Кб

ty/wisconsin-66, 1966 1,33+

0,15 43,5+

3,8 0,024±

0,006 39,57+

4,22 1,2+

0,08 2,70±

0,33

ty/90710/, 30.05.2000 3,68*+

0,32 15,0*+

1,7 0,090*±

0,010 26,31*+

1,98 1,8+

0,20 1,18*±

0,21

ty/615/, 30.01.2002 2,02*+

0,18 35,5*+

2,9 0,037±

0,008 30,82+

3,12 2,2*+

0,24 0,48*±

0,05

ty/965/, 17.03.2002 2,02*+

0,22 35,5*+

3,2 0,037±

0,007 21,18*+

2,32 2,4*+

0,22 0,55*±

0,06

сh/1373/, 14.07.2003 4,12*+

0,46 11,5*+

0,9 0,530*±

0,060 21,18*+

1,95 2,8*+

0,21 0,15*±

0,02

ty/1562/, 28.12.2003 2,97*+

0,25 17,0*+

1,5 0,060*±

0,009 21,18*+

2,23 2,8*+

0,19 0,15*±

0,02

ty/1747/, 15.05.2004 2,97*+

0,25 17,0*+

1,6 0,060*±

0,009 21,18*+

1,95 2,8*+

0,30 0,15*±

0,02

Примітка* – вірогідно відносно референтного штаму (р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020