Національна академія наук України

Інститут молекулярної біології та генетики

ФІЛОНЕНКО ВАЛЕРІЙ ВІКТОРОВИЧ

УДК 577.218

577.217

Структурно-функціональні особливості кіназ рибосомного білка S6 — S6К1
та S6К2

03.00.03 – молекулярна біологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

КИЇВ 2005

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі структури та функцій нуклеїнових кислот
Інституту молекулярної біології та генетики НАН України. Окремі
дослідження проведено в лабораторії клітинної регуляції Інституту
ракових досліджень Людвіга (м.Лондон, Велика Британія).

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент
НАН України

Риндич Алла Володимирівна,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України,

зав. відділу молекулярної онкогенетики;

доктор біологічних наук, професор

Матишевська Ольга Павлівна,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка,

професор кафедри біохімії;

доктор біологічних наук

Сидоренко Світлана Павлівна

Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології імені
Р.Є.Кавецького НАН України,

завідувач лабораторії сигнальних каскадів клітини.

Провідна установа: Інститут біології клітини НАН України, м.Львів.

Захист дисертації відбудеться “27” вересня 2005 року о 10-00 годині
на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту
молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03143,
м.Київ-143, вул..Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної
біології та генетики НАН України.

Автореферат розіслано 26 серпня 2005 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук
О.В. Підпала

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Сигнальні системи клітини відіграють ключову роль
у координованій регуляції функціонування окремо взятої клітини і
організму в цілому. Їхня основна функція полягає в передачі
позаклітинних стимулів, що індукуються гормонами, факторами росту,
цитокінами, від рецепторів клітинної мембрани до відповідних
компартментів клітини (ядро, цитоплазма), що, в свою чергу, призводить
до змін експресії відповідних генів як на рівні транскрипції, так і на
рівні трансляції мРНК (Conlon et al., 1999; Fingar et al., 2004).
Передача позаклітинного сигналу опосередковується складним каскадом
послідовних фосфорилювань/дефосфорилювань компонентів сигнальних шляхів,
що відповідно опосередковуються кіназами/фосфатазами білків і ліпідів.
Дослідження молекулярних механізмів передачі позаклітинних стимулів
лежить в основі розуміння шляхів міжклітинної комунікації і регуляції
функціонування окремо взятої клітини.

Ціла низка патологій, включаючи злоякісну трансформацію клітини, діабет,
ожиріння, серцево-судинні захворювання та інші, супроводжується
порушеннями функціонування сигнальних систем пов’язаних зі змінами
експресії чи активності їхніх окремих компонентів (Holland et al.,
2004). У багатьох випадках компоненти сигнальних систем, що зазнають
суттєвих змін у процесі онкогенезу, а саме — рецептори клітинної
мембрани та їхні ліганди, адапторні білки, кінази та фосфатази білків та
ліпідів, використовують у сучасній онкології як біомаркери злоякісної
трансформації, а також як безпосередні мішені в специфічній хіміо- та
імунотерапії онкологічних захворювань (Sebolt-Leopold and Herrera, 2004;
Xu et al., 2004; Stephens et al., 2005).

Все більш зрозумілішим стає те, що причиною зазначених патологій є
багатофакторні порушення у функціонуванні клітин. Навіть у межах
патологій, що мають однакові клінічні прояви, існують суттєві
відмінності на молекулярному рівні, в тому числі і серед сигнальних
молекул. Таким чином, дослідження сигнальних систем як у нормі, так і
при патологічних станах дозволяє виявити нові молекулярні маркери для
розробки сучасних підходів в діагностиці та терапії цілої низки
патологій.

Згідно з даними літератури, РІ3К/mTOR-залежний сигнальний шлях, що
знаходиться під контролем відповідно РІ3К (фосфатидилінозитол 3’-кінази)
та mTOR кінази, є одним з провідних у регуляції основних клітинних
функцій, а саме — росту клітин, проліферації, диференціації та апоптозу.
Активація РІ3К/mTOR сигнального шляху починається з активації власне РІ3
кінази, що індукується активованими внаслідок взаємодії з позаклітинними
мітогенами рецепторами плазматичної мембрани (Richardson et al., 2004).
Активність mTOR кінази залежить не лише від дії мітогенних стимулів,
опосередкованих РІ3К, а і від сигналів, індукованих поживними речовинами
(амінокислотами, глюкозою, жирними кислотами) (Tee et al., 2005).

Відповідальними за одну з кінцевих ланок у передачі мітогенних стимулів
у клітині є родина кіназ рибосомного білка S6 (S6К), донедавна
представлена лише однією — S6К1 (Kozma et al., 1990). Саме завдяки S6К
відбувається конвертація позаклітинних стимулів у безпосередню
фізіологічну відповідь клітини, а саме — активацію білкового синтезу.
Каталітична активність S6К полягає у фосфорилюванні рибосомного білка S6
і, як наслідок, активації трансляції цілого субкласу мРНК, що містять у
5’-ділянці, яка не транслюється (5’UTR), специфічну олігопіримідинову
послідовність. Ці мРНК кодують компоненти апарату трансляції – рибосомні
білки та деякі фактори трансляції (Thomas et al., 2002).

Треба зазначити, що регуляція на рівні трансляції завдяки присутності
структурованих послідовностей в 5’UTR властива цілій низці макромолекул,
залучених до регуляції клітинного циклу. Однак механізми такої активації
ще детально не досліджені, хоча і підкреслюється провідна роль
фосфорилювання та дефосфорилювання відповідних білків (Pickering et al.,
2005).

На сьогодні існують підтвердження того, що з активацією S6К пов’язана
активація транскрипції і генів рибосомних РНК і відповідно
функціонування S6К1 безпосередньо пов’язане з регуляцією біогенезу
рибосом (Hannan et al., 2003). Таким чином, S6K є одним із ключових
ензимів, причетних не лише до регуляції трансляції мРНК компонентів
апарату трансляції, а й до регуляції в цілому білкового синтезу в
клітині, індукованого мітогенними стимулами.

Доведено, що S6К здатна фосфорилювати in vitro цілу низку додаткових
субстратів, а саме: проапоптичний білок BAD (Harada et al., 2001); білок
SKAR, що бере участь у сплайсингу мРНК (Richardson et al., 2004); фактор
транскрипції CREM (de Groot et al., 1994); субстрат інсулінового
рецептора (IRS) (Harrington et al., 2005); фактор ініціації трансляції
білкового синтезу 4В (eIF4B) (Raught et al., 2004). Відповідно функції
S6К не обмежені лише регуляцією білкового синтезу, однак вони мають бути
підтвердженими in vivo.

На момент початку досліджень напевно було відомо про наявність лише
однієї форми S6К, хоча експерименти з нокаутними по гену S6К мишами
свідчили про можливість існування додаткової форми S6К, здатної, хоча і
частково, компенсувати її відсутність (Shima et al., 1998). Нещодавно
паралельно з нашими дослідженнями декількома групами було ідентифіковано
нову форму S6К, названу S6К2 (Saitoh et al., 1998; Lee-Fruman et al.,
1999; Koh et al., 1999).

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота
відповідає основному плану фундаментальних досліджень, які проводяться у
відділі структури та функцій нуклеїнових кислот Інституту молекулярної
біології та генетики НАН України за бюджетною темою №2.2.4.10 –
“Дослідження сигнальних шляхів при злоякісній трансформації та пошук
пухлиноспецифічних антигенів” (номер державної реєстрації — 0101U000360,
2001-2005 рр.), а також у рамках співробітництва з Інститутом ракових
досліджень Людвіга (Лондон, Велика Британія), згідно з договором про
наукове співробітництво.

Мета та завдання дослідження. Метою дослідження було визначення
структурно-функціональних особливостей представників родини кіназ
рибосомного білка S6 – S6K1 та S6K2 і з’ясування відмінностей у рівні
їхньої експресії та субклітинній локалізації в нормальних тканинах та
пухлинах людини. Відповідно до мети поставлено такі завдання:

1. Провести детальний порівняльний аналіз первинних структур S6К1 та
S6К2.

2. Визначити субстратну специфічність S6К1 та S6К2 по відношенню до S6
рибосомного білка.

3. Дослідити вплив мітогенних факторів на активацію S6К1 та S6К2 у
відповідь на стимуляцію клітин.

4. Встановити роль фосфорилювання гомологічних сайтів у S6K1 та S6K2 для
їхньої активації.

5. Визначити місце РІ3К/mTOR-залежного сигнального каскаду у регуляції
активності S6К2. Порівняти вплив інгібіторів РІ3К та mTOR кіназ на
індуковану мітогенами активність S6К1 та S6К2.

6. З огляду на існування теоретично розрахованого сайта фосфорилювання
протеїнкінази С (РКС) у структурі S6К2 дослідити роль РКС у регулюванні
активності та субклітинної локалізації S6К2.

7. Отримати високоспецифічні поліклональні та моноклональні антитіла
проти рекомбінантних повнорозмірних форм S6K1 та S6K2 та їхніх
фрагментів, експресованих у системі бактерій та бакуловірусу.

8. Дослідити рівень експресії S6К1 та S6К2 у різних тканинах ссавців на
рівні мРНК та на рівні білка.

9. Методом двогібридної системи дріжджів визначити нові S6К-асоційовані
білки та з’ясувати значення виявлених взаємодій.

10. Дослідити рівень експресії та особливості субклітинної локалізації
S6К у нормальних тканинах, доброякісних та злоякісних пухлинах людини.

Об’єкт дослідження — молекулярні механізми передачі позаклітинних
мітогенних стимулів за участі РІ3К/mTOR-залежного сигнального каскаду.

Предмет дослідження – кінази рибосомного білка S6 (S6K1 та S6K2), РІ3К,
mTOR, КоА-синтаза, культивовані лінії клітин людини; нормальні тканини,
злоякісні та доброякісні пухлини людини.

Методи дослідження — клонування кДНК фрагментів у плазмідні конструкції,
конструювання експресувальних векторів, експресія рекомбінантних білків
у бактеріальних та бакуловірусних експресувальних системах, очищення
рекомбінантних білків із лізатів клітин, Нозерн-блот аналіз, отримання
моноклональних та поліклональних антитіл, імуногістохімічні дослідження
парафінованих зрізів тканин, дріжджова двогібридна система, метод
сайт-спрямованого мутагенезу, тимчасова трансфекція клітин ссавців кДНК
конструкціями, імунопреципітація та Вестерн-блот аналіз, конфокальна
сканувальна мікроскопія, визначення кіназної активності S6K in vitro,
визначення ензиматичної активності КоА-синтази.

Наукова новизна одержаних результатів. Ідентифіковано нову форму кінази
рибосомного білка S6 – S6K2. Доведено здатність S6K2 фосфорилювати S6
рибосомний білок та залежність її активності від мітогенних стимулів.
Встановлено подібність механізмів регуляції S6K1 та S6K2 у клітині, що
потребує участі РІ3К/mTOR-залежного сигнального шляху та фосфорилювання
S6K2 за гомологічними з S6K1 сайтами. Виявлено відмінності в кінетиці
активації S6K1 та S6K2 мітогенними стимулами, що свідчить про існування
відмінностей в механізмах регуляції активності та функціонуванні S6K.
Вперше встановлено, що РКС здатна фосфорилювати S6K2, але не S6K1.
Визначено, що сайтом фосфорилювання є Ser486. Доведено, що він ключовим
для регулювання субклітинної локалізації S6K2.

Знайдено новий S6K1-зв’язувальний білок та ідентифіковано його як
КоА-синтазу. Вперше клоновано кДНК, що кодує КоА-синтазу. Біохімічними
методами підтверджено, що КоА-синтаза є біфункціональним ферментом і має
одночасно дефосфоКоА-кіназну та фосфопантотенатаденілтрансферазну
активності і відповідно каталізує два останніх етапи біосинтезу КоА.

Вперше показано, що КоА-синтаза взаємодіє з S6K1 у клітинах ссавців.
Встановлено, що С-кінцеві регуляторні ділянки як S6K1, так і КоА-синтази
залучені до утворення білково-білкового комплексу. Методами конфокальної
мікроскопії клітин та субклітинного фракціонування виявлено
мітохондріальну локалізацію КоА-синтази. Доведено, що N-кінцевий
гідрофобний домен КоА-синтази відповідає за її асоціацію з зовнішньою
мембраною мітохондрій. Вперше встановлено зв’язок функціонування
сигнальних молекул із ензимами відповідальними за біосинтез КоА.

Вперше досліджено особливості експресії S6К1 та S6К2 на рівні білка в
різних тканинах ссавців. Виявлено тканиноспецифічний характер експресії
S6K та відсутність кореляції між вмістом S6K та її мРНК у тканинах.

Вперше досліджено вміст S6К1 та S6К2 в доброякісних пухлинах та
злоякісних пухлинах молочної залози, щитовидної залози та ендометрію
людини у порівнянні з нормальними тканинами. Встановлено підвищений
вміст S6К1 та S6К2 в злоякісних пухлинах. Вперше проведено порівняння
субклітинної локалізації S6К1 та S6К2 у нормальних тканинах та пухлинах
молочної залози, щитовидної залози та ендометрію людини і виявлено
тенденцію до накопичення S6К1 і, в значно більшій мірі, S6К2 у ядрі
злоякісних клітин усіх типів досліджуваних пухлин.

Практичне значення одержаних результатів. Клоновано кДНК послідовність
нової форми S6K — S6K2 та S6K1-звязувального білка – КоА синтази, що
дозволяє застосування широкого спектра молекулярно-біологічних методів
для дослідження механізмів функціонування РІ3К/mTOR-залежного
сигнального шляху та його зв’язку з ензимами біогенезу КоА.

Клонування гена КоА-синтази дозволяє отримувати високоочищений препарат
КоА-синтази в необмежених кількостях, що може полегшити створення
препаратів для лікування хвороб, пов’язаних із порушенням біосинтезу КоА
та обміну вітаміну В5 в організмі.

Отримано полі- та моноклональні антитіла проти S6К1 та S6К2,
КоА-синтази, які можуть бути використані для подальшого дослідження
функціональних особливостей вказаних макромолекул у різних типах клітин
і тканин імунохімічними та імуногістохімічними методами. Визначення
рівня експресії та особливостей субклітинної локалізації S6К у
злоякісних пухлинах у комбінації з використанням уже відомих маркерів
злоякісних пухлин може бути корисним для розробки засобів детальної
діагностики та прогнозування перебігу онкологічних захворювань. Отримані
результати дають підставу розглядати S6К1 та S6К2 як потенційні мішені
для майбутньої хіміотерапії онкологічних захворювань молочної залози
людини.

Матеріали дисертаційної роботи можуть бути використані у спецкурсах з
молекулярної біології та біохімії для студентів біологічних факультетів.

Особистий внесок здобувача. Усі дослідження виконувались за
безпосередньої участі здобувача. Дисертант особисто брав участь в
ідентифікації та подальшій детальній характеристиці нової форми кінази
рибосомного білка S6. Автором самостійно створено більшість кДНК
конструкцій рекомбінантних форм кіназ рибосомного білка S6,
проаналізовано активність їхніх продуктів та отримано моноклональні
антитіла до S6K1 та S6K2. Дисертантом досліджено рівень in vitro
фосфорилювання рекомбінантних форм S6K1 та S6K2 за участі РКС.

Дисертантові належить ідея існування змін рівня експресії та
субклітинної локалізації S6K у злоякісних клітинах. Автор брав
безпосередню участь у плануванні усіх представлених експериментів та
обговоренні результатів. Ним самостійно проаналізовано весь отриманий
матеріал та сформульовано усі положення і висновки роботи. Більшість
наукових робіт, що відображають результати дисертації, підготовлено до
друку дисертантом.

Ролі мітогенних факторів для активації S6K досліджували спільно з к. б.
н. Т. Й. Вальовкою (Лондон, Велика Британія). Визначення ролі
PI3K/mTOR-залежного шляху в регуляції активності S6K2 проводили спільно
з к. мед. н І. Гутом та М. Вотерфілдом (Лондон, Велика Британія).
Експерименти з використанням двогібридної системи дріжджів та
характеристику КоА-синтази було виконано спільно з к. б. н. О. М.
Живолупом, к. б. н. І. О. Немазаним та Г. Г. Панасюк. Визначення
нуклеотидної послідовності кДНК КоА-синтази здійснено спільно з Т.
Фентоном та Х. Ребхолз (Лондон, Велика Британія). Отримання гомогенатів
пухлин та виявлення в них вмісту S6K1 та S6K2 проводили спільно з к. б.
н. Л. О. Савінською та к. б. н. Г. В. Овчаренко. Дослідження
субклітинної локалізації S6K1 та S6K2 в нормальних тканинах та пухлинах
людини проводили спільно з д. б. н. П. В. Погрібним, к. мед. н. В. С.
Усенком, к. б. н. В. В. Лизогубовим та Д. І. Литвином. Дослідження
субклітинної локалізації рекомбінантних форм S6K2 в клітинах НЕК 293
проводили спільно з к. мед. н. І. Т. Гутом та к. б. н. Т. Й. Вальовкою
(Лондон, Велика Британія). Субклітинну локалізацію КоА-синтази
досліджували спільно з М. Ванг (Лондон, Велика Британія). Поліклональні
антитіла проти Кі67 антигену отримували спільно з к. б. н. М. В.
Родніним та І. О. Тихонковою. Мас-спектральний аналіз фосфорильованих
форм S6K2 здійснювали спільно з Р. Крамером (Лондон, Велика Британія).
Автор висловлює щиру подяку к. мед. н. І. Т. Гуту за корисні поради та
допомогу в плануванні та проведенні експериментів та при обговоренні
результатів. Одержані результати обговорено та опубліковано в спільних
наукових працях.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації
апробовано на семінарах відділу структури та функцій нуклеїнових кислот
та наукових конференціях ІМБіГ НАНУ і представлено у вигляді доповідей
на конгресі „Онкологія-2000” (Київ, 2000), на ІІІ Парнасівській
конференції (Львів, 2000), на ІV Парнасівській конференції (Вроцлав,
Польща, 2002), на VIII Українському біохімічному з’їзді (Чернівці,
2002), на 17-му конгресі Європейської асоціації ракових досліджень
(EACR) (Мадрид, Іспанія, 2002), на спеціальному конгресі FEBS з
сигнальних шляхів (Брюссель, Бельгія, 2003), на Установчому з’їзді
Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004), на 29-му
конгресі FEBS (Варшава, Польща, 2004), на V Парнасівській конференції
(Київ, 2005).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 24 статті у провідних
закордонних та вітчизняних фахових виданнях та тези 12 доповідей на
наукових конференціях.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду
літератури, матеріалів та методів дослідження, експериментальної
частини, аналізу та узагальнення результатів, висновків, списку
використаних джерел. Дисертацію викладено на 312 сторінках стандартного
машинопису. Вона містить 95 рисунків, 5 таблиць. Список використаної
літератури охоплює 314 найменуваннь.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Для експресії рекомбінантних білків у
бактеріальній системі та системі клітин ссавців використовували плазміди
pET 23d(+), pET 24d(+) (Novagen), pcDNA3.1(+), pcDNA A4/TO
(Invitrogene). Рекомбінантні форми S6K клонували злитими з ЕЕ-міткою, де
ЕЕ — поліглутамінова послідовність. Рекомбінантні форми КоА-синтази
клонували злитими з Мус-міткою. Імунопреципітацію рекомбінантних форм
S6K та КоА-синтази з лізатів клітин НЕК293, трансфікованих відповідними
ДНК конструкціями, здійснювали за допомогою анти-ЕЕ та анти-Мус
моноклональних антитіл.

Як антиген для отримання моноклональних та поліклональних антитіл проти
S6K1, S6K2 використовували їхні С-кінцеві рекомбінантні пептиди з
найменшим (23 %) рівнем гомології, попередньо клоновані з
6хHis-послідовністю, експресовані в клітинах бактерій та очищені афінною
хроматографією на NiNTA-сефарозі. Для отримання антитіл проти
КоА-синтази використовували її С-кінцевий фрагмент, одержаний
аналогічним способом. При одержанні поліклональних антитіл проти
C-кінцевого фосфопептиду S6K2, що містить сайт фосфорилювання РКС, як
антиген використовували синтезований фірмою Alta Bioscience синтетичний
пептид (SGTKKpS486KRGRG), що відповідає амінокислотній послідовності
S6K2 з 481 по 491 а.з.

Для імунізації використовували самців кролів масою 2-3 кг, яким вводили
препарати афінно очищених антигенів в ад’юванті Фрейнда. Робили шість
підшкірних ін’єкцій вздовж хребта по 15-20 мкг пептиду на ін’єкцію.
Через 8 тижнів робили повторну імунізацію такою ж кількістю антигену у
неповному ад’юванті Фрейнда. Втретє кролів імунізували через 4, тижні
використовуючи 200 мкг препарату в ЗФP для кожного. Титр сироватки
визначали методом ELISA.

Моноклональні антитіла отримували за модифікованим протоколом злиття
спленоцитів імунізованих мишей лінії ВАLB/c з мієломними клітинами лінії
Sp/20 у присутності ПЕГ 1500.

Для створення «bait»-конструкцій використовували плазміди рEG202,
рEG202-NLS, pNLexA. Для пошуку S6K-зв’язувальних білків як «bait»
застосовували повнорозмірну форму S6K1 яким скринували кДНК бібліотеку
19-денних ембріонів миші.

У роботі використано ендонуклеази рестрикції виробництва фірми MBI
Fermentas (Литва). Рестрикцію ДНК проводили у відповідному для кожної
ендонуклеази буфері, згідно з рекомендаціями виробника. Для розрізання
ДНК (1 мкг) використовували 2U ендонуклеази рестрикції в об’ємі 20 мкл.
Реакційну суміш інкубували при 37 0 C 1-2 год, а ДНК фрагменти
аналізували методом ДНК електрофорезу в агарозному гелі. Мутантні форми
S6K та КоА-синтази, які містили точкові заміни амінокислотних залишків,
створювали за допомогою набору QuickChange™ для сайт-спрямованого
мутагенезу (Stratagene), згідно з рекомендаціями виробника. У реакції
використовували суперскручену дволанцюгову ДНК вектора із вставкою, два
синтетичних олігонуклеотидних праймери, що містили мутацію, та
високоточну PfuTurbo ДНК-полімеразу. Праймери для мутагенезу були від 25
до 45 п. н. довжиною та мали температуру плавлення (Tm), більшу чи рівну
78 0 C; некомплементарний триплет знаходився у центрі праймера та мав
додаткові комплементарні 10-15 п. н. по краях.

Нуклеотидну послідовність усіх створених рекомбінантних ДНК конструкцій
визначали за допомогою автоматичного ДНК секвенатора ABI 73A™ (Applied
Biosystems) з використанням набору для секвенування.

Нозерн-блот аналіз. Для Нозерн-блот аналізу використовували
нітроцелюлозні мембрани, на яких було імобілізовано зразки полі(А)+ РНК
виділені з різних тканин людини (CLONTECH). Використовували такі кДНК
проби: для аналізу мРНК S6К1 – кДНК фрагмент (476 п. н.), що містив 56
п. н. з 3’-кінця кодуючої ділянки та 420 п. н. з 3’-кінця некодуючої
ділянки кДНК EST клону S6К1 людини (АА425599); для аналізу мРНК S6К2 —
650 п. н. кДНК фрагмент, що містив 518 п. н. кодуючої ділянки та 130 п.
н. кодуючої ділянки кДНК EST клону S6К2 людини (АА 410355); для аналізу
мРНК КоА-синтази — 850-п. н. фрагмент (1-850) кДНК КоА-синтази кодуючої
ділянки. Проби кДНК мітили [32Р] за допомогою набору для мічення
(Readiprime TMII, Amersham Biosciences). Як контроль використовували
кДНК пробу для ?-актину (CLONTECH). Усі етапи гібридизації та детекції
проводили згідно з рекомендаціями Amersham Biosciences.

Тимчасова трансфекція клітин НЕК293. Клітини за 12 год до трансфекції
пересаджували на чашки діаметром 60мм у кількості 1,2.106. Тимчасову
трансфекцію клітин НЕК293 проводили з використанням 2,5-10 мкг
відповідної плазмідної ДНК та реагенту LipofectAMINE (Life Technologies,
Inc.) згідно з рекомендаціями виробника. Для кожної трансфекції
плазмідну ДНК та 10 мкл LipofectAMINE розчиняли окремо у 100 мкл
середовища без сироватки Opti-MEM (Gibco BRL). Суміші інкубували
протягом 10 хв при кімнатній температурі, об’єднували та інкубували
додатково 30 хв для формування ДНК-ліпосомних комплексів. Протягом цього
періоду клітини промивали 2 рази середовищем DMEM без сироватки та
додавали до клітин 2 мл середовища Opti-MEM. ДНК-ліпосомні комплекси
додавали до клітин, що надалі культивували протягом 5 год при 37 0 C в
CO2 інкубаторі. Після цього Opti-MEM середовище замінювали на середовище
DMEM з 10 % сироватки, а трансфіковані клітини культивували ще додатково
24 год. Експресію рекомбінантних білків у клітинах аналізували методом
Вестерн-блот аналізу.

Визначення ензиматичної активності S6К. Для визначення активності S6K
рекомбінантні форми ЕЕ-S6K імунопреципітували з лізатів трансфікованих
клітин, використовуючи відповідні антитіла та білок А сефарозу. Сефарозу
відмивали тричі буфером для лізування клітин та один раз буфером для
кіназної реакції (50 мM Hepes, pH 7,5, 10 мM MgCl2, 1 мM DTT, 10 мM
3-гліцерофосфат). Кіназну реакцію ініціювали додаванням до
імунопреципітованих на сефарозі комплексів 25 мкл кіназного буфера, що
додатково містив 50 мкM ATP, 5 мкКi [?-32P]ATP та 20 мкг 80S рибосом,
виділених з печінки щура (Thomas et al., 1978). Реакцію проводили при 30
0 C протягом 10 хв та зупиняли додаванням 2xбуфера для приготування
зразків і прогріванням (90 0 С, 5 хв). Зразки розділяли методом
гель-електрофорезу в 10 % ПААГ, а кількість включеного у S6 білок
радіоактивного [32P] визначали за допомогою приладу “Phosphoimager
system” (Bio-Rad).

Визначення активності КоА-синтази. Для визначення
фосфопантотенатаденілтрансферазної активності КоА-синтази рекомбінантні
форми Myc-КоА-синтази імунопреципітували з лізатів трансфікованих клітин
із використанням відповідних антитіл та білок А сефарози. Сефарозу
відмивали тричі буфером (50 мM трис-HCl, pH 8,0, 10 мM MgCl2, 1,5 мM
DTT). Реакцію ініціювали додаванням до імунних комплексів 50 мкл буфера,
що додатково містив 0,2 мM 4’- фосфопантетонат (4’-PP), 0,25 мM ATР та
0,5 мкКi [?-32P]ATР. Реакційну суміш інкубували при 25 0 C протягом 30
хв. Продукти реакції розділяли за допомогою низхідної паперової
хроматографії з використанням Whatman 3MM паперу, суміші ізобутилової
кислоти та гідроксиду амонію у співвідношенні 100:60, що містила 1 мM
EDTA. Для ідентифікації радіоактивно мічених продуктів використовували
“Phosphoimager system” (Bio-Rad). Визначення дефосфо-КoA-кіназної
активності імунних комплексів або рекомбінантної форми His-dPКoAK
проводили при 25 0 C протягом 30 хв у буфері, що містив 150 мM трис-HCl,
pH 8,0, 10 мM MgCl2, 1,5 мM DTT, 0,2 мM dPКoA, 0,25 мM ATР, 0,5 мкКi
[?-32P]ATР. Продукти реакції розділяли, також, за допомогою низхідної
паперової хроматографії.

Імунофлуоресцентна мікроскопія. Клітини NIH3T3 і НЕК293 вирощували на
13-мм покривних скельцях, трансфікували 0,5 мкг відповідної плазмідної
ДНК із використанням PolyFect за рекомендованими виробником умовами
(QIAGEN). Трансфіковані клітини культивували протягом 24 год, а потім
фіксували 4 % параформальдегідом та преіммобілізували 0,2 % Triton
X-100. Первинні анти-Myc або анти-ЕЕ антитіла у розведенні 1:1000
інкубували з фіксованими клітинами протягом 1 год, з наступним
додаванням вторинних мічених флуоресцеїнізоціанатом анти-мишачих
антитіл. Для визначення локалізації мітохондрій до клітин перед
фіксацією додавали 100 нM розчин барвника MitoTracker Orange CMTMRos
(Molecular Probes) та інкубували протягом 15 хв. Флуоресцентно мічені
клітини вивчали за допомогою конфокального мікроскопа Zeiss LSM510,
зображення аналізували за допомогою програми LSM510.

Імуногістохімічний аналіз зразків тканин з використанням моноклональних
та поліклональних антитіл. Для імуногістохімічного аналізу S6K1, S6K2,
Ki-67, PCNA у тканинах людини використовували відповідні моноклональні
або поліклональні антитіла. Інкубацію антитіл із фіксованими зрізами
тканин здійснювали протягом 1 год при кімнатній температурі,
використовуючи набір “PicTure PLUS Kit” (“Zymed”, США). Зразки відмивали
ЗФР, а візуалізацію сигналів здійснювали із застосуванням
авідин-біотинової системи та подальшого фарбування тканин у 0,05 %
розчині 3’3’- тетрагідрохлорид діамінобензидину (Sigma, США), який
містив 0,01 % H2O2. Специфічність забарвлення контролювали шляхом заміни
первинних антитіл на ЗФР з 1 % БСА або ж їхнім блокуванням попередньою
інкубацією із відповідним антигеном. Надалі зрізи дофарбовували
гематоксиліном протягом 1 хв. Дегідратовані спиртом та ксилолом зрізи
заливали канадським бальзамом (Sigma, USA) та висушували не менше двох
тижнів при кімнатній температурі. Інтенсивність імуногістохімічного
забарвлення у цитоплазмі та ядрах клітин аналізували за допомогою
світлового мікроскопа “Axioplan” (“Zeiss”, Німеччина) та системи
відеовводу зображень (відеокамера Sony DXC-151AP). Для кожного зразка
досліджували 20 випадково вибраних полей зору, а зображення зберігали у
форматі Tiff. За допомогою програми “ImagePro” підраховували кількість
клітин з позитивно забарвленими ядрами та цитоплазмою. Аналізували 500
ракових клітин.

Результати досліджень та обговорення.

Порівняльний аналіз первинних структур S6K1 та S6K2. Аналіз EST бази
даних дозволив виявити клон, що містив високогомологічний до ДНК
послідовності S6K1 фрагмент кДНК, з використанням якого як зонду було
клоновано кДНК білка структурно подібного до S6K1 (Gout et al., 1998),
який, можливо, є новою формою кінази рибосомного білка S6 – S6K2.

Детальний аналіз первинної структури S6K1 та гіпотетичної S6K2 дозволив
виявити 70 % ідентичність та 82 % подібність цих білків (рис. 1) і
свідчить про існування у S6K2 аналогічної із S6K1 доменної організації.

Крім того, як і у S6K1, у структурі S6K2 виявлено два альтернативних
старти трансляції мРНК, а саме — Met1 та Met14, що свідчить про
можливість існування, аналогічно з S6K1, двох різних за розміром ізоформ
S6K2 – S6K2/I (1-495 а.з.) і S6K2/II (14-495 а.з.). У межах N-кінцевого
подовження, аналогічно із S6K1, у більшої за розміром форми S6K2
ідентифіковано багату на Arg послідовність (RGRRAR), що, згідно з даними
літератури, може виконувати функцію сигналу ядерної локалізації.

У структурі S6K2 виявлено сім із восьми охарактеризованих для S6K1
гомологічних сайтів фосфорилювання (рис. 1). У межах автоінгібіторного
псевдосубстратного домену S6K2 виявлено Ser423, Ser430, Ser436, Ser441,
що є гомологічними за розташуванням та мікрооточенням до Ser 434,
Ser441, Ser447, Ser452 у S6K1; в межах подовження кіназного домену —
Ser383 та Thr401, які гомологічні до Ser394 та Thr412 у S6K1; у
каталітичному домені — Thr241, гомологічний Thr252 у S6K1. Винятком є
лише Thr444 у S6K1, для якого не знайдено гомологічного амінокислотного
залишку в S6K2.

Найсуттєвіші відмінності в амінокислотній послідовності для S6K1 та S6K2
виявлені для N- та С-кінцевих ділянок, де ідентичність становить 28 та
25 %, відповідно.

У структурі С-кінцевої ділянки S6K2 знайдено багату на пролін (459-480
а.з.), що за даними літератури (Gout et al., 1998), може бути залучена
до утворення білок-білкових комплексів за рахунок взаємодії з SH3
доменами інших білків.

Таким чином, високий рівень гомології первинних структур S6K1 та S6K2,
особливо в межах каталітичного домену, вказує на подібну ензиматичну
активність кіназ. Існування в послідовності S6K2 гомологічних сайтів
фосфорилювання, залучених до активації S6K1, передбачає подібні
механізми регуляції активності S6K1 і S6K2.

Відмінності у структурній організації, що стосуються регуляторних N- та
С-кінцевих ділянок, свідчать про існування відмінностей у функціонуванні
кіназ у клітині, в першу чергу пов’язаних із особливостями регуляції
їхньої активності, субклітинної локалізації і, можливо, використанням
альтернативних субстратів.

Оскільки подовжену форму S6K1/I на сьогодні не досліджено в роботі
аналізували тільки вкорочені форми S6K – S6K1/II і S6K2/II.

Аналіз субстратної специфічності S6K1 та S6K2. Як зазначалося раніше,
найбільш охарактеризованим субстратом S6K1 є білок малої 40S субчастинки
рибосоми S6. Високий ступінь гомології амінокислотних послідовностей
S6К1 та S6К2, особливо у каталітичному домені, свідчить про можливість
використання кіназами спільного субстрату — S6 рибосомного білка. Для
підтвердженя цього припущення було перевірено здатність S6K2
фосфорилювати S6 білок. Для цього кДНК послідовності цитоплазматичних
S6К1 та S6К2 було клоновано у вектор для експресії у клітинах ссавців
pcDNA3.1(+) у рамці з EE-міткою, що використовували надалі для
імунопреципітації рекомбінантних S6K із лізатів трансфікованих клітин
НЕК293 за допомогою анти-ЕЕ антитіл.

Здатність рекомбінантних S6K фосфорилювати рибосомний білок S6
перевіряли in vitro використовуючи як субстрати [32Р]АТР та очищені з
печінки щура 80S рибосоми. Беручи до уваги той факт, що S6K1 активується
у відповідь на мітогенні стимули, одночасно було перевірено здатність
S6K2 до активації у відповідь на ембріональну сироватку крові. Для цього
S6K2 імунопреципітували з лізатів трансфікованих НЕК293 клітин, які
культивували на збідненому сироваткою середовищі або надалі стимулювали
додаванням сироватки.

Наведені на рис. 2 дані свідчать, що S6K2 здатна не менш ефективно за
S6K1 фосфорилювати S6 рибосомний білок. При цьому ефективність його
фосфорилювання зростає в 3-4 рази після стимуляції клітин сироваткою і,
отже, S6K2 активується у відповідь на позаклітинні мітогенні стимули.

Вестерн-блот аналіз лізатів клітин до та після стимуляції клітин
сироваткою за допомогою анти-ЕЕ свідчить, що активація обох форм кіназ
супроводжується зниженням електрофоретичної рухливості рекомбінантних
білків (рис. 2 Б), що скоріше за все відображає рівень фосфорилювання
кінази і відповідно можна припустити, що активація S6K2 також
супроводжується фосфорилюванням кінази за множинними сайтами
фосфорилювання.

Дослідження ролі гомологічних сайтів фосфорилювання S6K1 та S6K2 для
регуляції їхньої активності. Відомо, що активація S6K1 відбувається
внаслідок послідовного фосфорилювання за щонайменш восьми сайтами, однак
лише фосфорилювання по залишках Thr252 і Thr412 призводить до
остаточної, повної активації кінази. Згідно з даними літератури PDK та
mTOR, відповідно, здійснюють це фосфорилювання (Weng et al., 1998).

Для порівняльного аналізу функціональної значущості гомологічних сайтів
фосфорилювання S6K для їхньої ензиматичної активності проаналізовано
мутантні форми кіназ, де Thr412, Thr252 у S6K1 та Thr401, Thr241 у S6K2
було замінено на негативно заряджену амінокислоту Asp, що імітує
фосфорильований стан вказаних залишків.

Аналіз активності мутантних форм (S6K1Т412D та S6K2Т401D),
імунопреципітованих з клітин НЕК293, трансфікованих відповідними ДНК
конструкціями, виявив 2-3 разове зростання активності як S6K1, так і
S6K2 стосовно рівня фосфорилювання рибосомного білка S6 (рис. 3).

Поряд із цим, заміна Thr252Asp у S6K1 та Тhr241Asp у S6K2 призводила до
протилежного ефекту, а саме — повного інгібування активності щодо
фосфорилювання S6 рибосомного білка. Одночасна мутація обох регуляторних
сайтів фосфорилювання (S6K1Т412D/Т252D та S6K2Т401D/Т241D) не
відновлювала активності мутантних форм кіназ.

Отримані результати свідчать, що фосфорилювання Thr401 у S6K2 аналогічно
фосфорилюванню Thr401 у S6K1 є важливим для активації кіназ.

Приймаючи до уваги дані літератури, щодо ключової ролі фосфорилювання
Thr252, розташованого в каталітичному домені S6K1, для остаточної
активації S6K1 (Thomas, 2002), представлені дані вказують, що Thr241 у
S6K2 є також функціонально необхідним для прояву кіназної активності.

Мутаційний аналіз залишку Lys123 у S6K1, що, як відомо, входить до
каталітичного сайта S6K1 і залучений до зв’язування з АТР (Thomas et
al., 1998), і Lys 112 у S6K2 вказує на те, що Lys 112 є критичним для
функціонування каталітичного домену S6K2 також. Згідно наведених даних
його заміна на Arg, як і у випадку S6K1, призводить до інактивації S6K2
у реакції фосфорилювання S6 рибосомного білка (рис. 3).

Роль мітогенних факторів в регуляції активності S6K1 та S6K2. Згідно з
даними літератури, S6K1 активується у відповідь на стимуляцію клітин
різними ростовими факторами, зокрема, епідермальним фактором росту
(EGF), фактором росту з тромбоцитів (PDGF), інсуліном та сироваткою
(Chou and Blenis, 1995). Встановлено також опосередковану інтегринами
активацію S6K1 у клітинах макрофагів лінії P388D1 та фібробластах REF52,
індуковану взаємодією клітин з фібронектином чи ламініном (Wei et al.,
1998).

Порівняння динаміки активації S6K1 та S6K2 у відповідь на стимуляцію
клітин НЕК293 сироваткою свідчить про двофазовий характер активації обох
кіназ (рис. 4), однак кінетика активації S6K1 і S6K2 суттєво
відрізнялися. На відміну від S6K1, активація S6K2 відбувається значно
швидше. Крім того, другий пік активності S6K2 збігався у часі з першою
стадією інактивації S6K1, що вказує на різний за часом прояв їхньої
функціональної активності у відповідь на стимулювання мітогенами і
можливу функціональну відмінність кіназ.

У разі опосередкованої інтегринами активації максимальний рівень
активності для обох форм S6К припадав на 90-ту хв після стимуляції
клітин фібронектином і характеризувався 3,5-4-кратним зростанням
кіназної активності (рис. 5). Однак для S6K2 характерним є існування
додаткового піка активації з максимумом на 40-й хв, фази інактивації
впродовж наступних 20 хв і піка активації, що збігається з єдиним піком
активації S6K1. Як і при активації кіназ сироваткою, кінетика активації
S6K1 має більш уповільнений характер.

Таким чином, виявлені відмінності в активації S6K1 та S6K2 свідчать про
здатність S6K2 забезпечувати ранню відповідь клітин на дію позаклітинних
стимулів, у той час як S6K1, скоріш за все, забезпечує більш пізню
стадію регуляції фосфорилюванння S6 білка. Можливість існування
диференційних механізмів модуляції сигнальних шляхів, які
опосередковують регуляцію S6K1 та S6K2, було надалі досліджено з
використанням специфічних інгібіторів mTOR та РІ3K – рапаміцину та
вортманіну відповідно.

Визначення ролі РІ3К/mTOR-залежного сигнального шляху в стимульованій
мітогенами активації S6K2. Дані літератури свідчать, що
РІ3К/mTOR-залежний сигнальний каскад відіграє провідну роль в регуляції
активності S6K1 у відповідь на мітогенні стимули (Kozma et al., 1990).
Для того щоб перевірити роль цього сигнального шляху у регуляції
активності S6K2, було проаналізовано вплив інгібіторів РІ3К та mTOR
кіназ вортманіну та рапаміцину, відповідно, на стимульовану сироваткою
активацію S6К2 порівняно з S6К1. Для цього, як і у попередніх дослідах,
рекомбінантні ЕЕ-S6K1 та ЕЕ-S6K2 було екпресовано у клітинах лінії
НЕК293 трансфікованих відповідними кДНК конструкціями. Активність
рекомбінантних кіназ, імунопреципітованих з лізатів клітин анти-ЕЕ
антитілами, перевіряли за рівнем фосфорилювання S6 рибосомного білка in
vitro.

Як свідчать дані, наведені на рис. 6 А, Б, рапаміцин має менший
інгібіторний ефект на стимульовану сироваткою активність S6K2 порівняно
з S6K1.

Таким чином, здатність рапаміцину до інгібування стимульованої
сироваткою активності S6K2 свідчить про участь mTOR у регуляції
активності S6K2. Однак відмінності в рівні інгібуючої дії рапаміцину
порівняно з S6K1 вказують на можливість існування альтернативного,
mTOR-незалежного, шляху регуляції S6K2.

Як вже зазначалось, аналіз гомологічних сайтів фосфорилювання у S6K1 та
S6K2 свідчить про відсутність у S6K2 одного з них, який розташований у
псевдосубстратному автоінгібіторному домені S6K1. Було зроблено
припущення, що можливо з цим пов’язані відмінності в регуляції S6K за
участі mTOR. Дані, наведені на рис. 6 В, свідчать, що створення
додаткового сайта фосфорилювання у S6K2, гомологічного Thr444 у S6K1,
шляхом введення заміни Val433Thr призводить як до підвищення загальної
активності S6K2, так і чутливості кінази до інгібіторної дії рапаміцину.
Таким чином, можна припустити, що фосфорилювання Thr444 у S6K1 також
відбувається в mTOR-залежний спосіб і є важливим для активації кінази.
Крім того регуляція активності на цьому рівні у S6K2 відсутня.

Для визначення ролі РІ3К в регуляції активності S6K2 клітини
культивували у присутності різних концентрацій вортманіну після
стимуляції клітин сироваткою. Суттєвих відмінностей у рівні інгібування
активності S6K1 та S6K2 кіназ виявлено не було (рис. 7). Результати
представлених експериментів дають підставу вважати, що РІ3К-залежний
сигнальний шлях залучений до регуляції мітогенної активації S6K2 таким
же чином, як і S6K1.

Для підтвердження регуляторної ролі фосфорилювання Thr444 y S6K1 в
регуляції активності кінази за участі mTOR досліджено мутантні форми
S6K1 та S6K2, що не мали С-кінцевих ділянок де саме розташований Thr444.
Представлені дані (рис. 8) свідчать про суттєве зменшення чутливості
S6K1/?С100 до інгібіторного ефекту рапаміцину. Натомість помітних змін у
чутливості S6K2/?C81 до рапаміцину, як і передбачалось, не виявлено.

Можна зробити висновок про те, що саме з відмінностями у структурі
С-кінцевих ділянок S6K1 і S6K2, і наявністю у S6K1 додаткового сайту
фосфорилювання, відсутнього у S6K2, пов’язана різна чутливість кіназ до
регуляторного впливу mTOR.

Порівняння інгібіторного впливу вортманіну на стимульовану сироваткою
активність вкорочених та повнорозмірних форм S6K1 та S6K2 не виявило
суттєвих відмінностей в їхній чутливості.

S6K2 як субстрат для різних ізоформ РКС. Аналіз амінокислотної
послідовності S6K2 дозволив виявити потенційний сайт фосфорилювання для
РКС, розташований у С-кінцевій ділянці кінази (рис. 9) у межах
додаткового сигналу ядерної локалізації (NLS2) (Lee-Fruman et al.,
1999).

У структурі S6K1, що має дуже низьку гомологію з S6K2 у відповідній
ділянці, додаткового NLS і відповідно подібного сайта фосфорилювання для
РКС не виявлено.

Для того щоб перевірити, чи здатна РКС фосфорилювати С-кінцеву ділянку
S6K2 in vitro, як субстрат для різних ізоформ РКС використовували
рекомбінантні очищені С-кінцеві пептиди S6K1 та S6K2. Результати, які
наведено на рис. 10, свідчать, що усі з перевірених ізоформ РКС
ефективно фосфорилюють S6K2 на відміну від S6K1.

На наступному етапі було перевірено, чи може РКС використовувати як
субстрат відповідні повнорозмірні форми S6K1 та S6K2, імунопреципітовані
з НЕК293 клітин, трансфікованих відповідними конструкціями. Результати
(рис. 11, А) свідчать, що всі з перевірених ізоформ РКС здатні
фосфорилювати повнорозмірну форму S6K2, однак фосфорилювання S6K1 майже
не відрізнялось від контрольних показників і було приблизно на рівні
автофосфорилювання. Дослідження мутантних форм S6K2, які мали N-
(S6K2/?N67) та C-кінцеві делеції (S6K2/?C81), свідчить, що сайт
фосфорилювання, як і передбачалось, розташований у С-кінцевій ділянці
S6K2 (рис. 11, Б).

Треба зазначити, що в цих умовах експерименту найвищий рівень
фосфорилювання S6K2 виявлено для РКС? порівняно з іншими ізоформами РКС.

Ідентифікація сайта фосфорилювання РКС у структурі S6K2 методом
мaс-спектрального аналізу. Сайт фосфорилювання в послідовності S6K2
ідентифікували за допомогою мас-спектрального аналізу. Афінно очищений
пептид His-S6K2/С використовували як субстрат для фосфорилювання РКС?.
Протеолітичне розщеплення фосфорильованого пептиду проводили
ендонуклеазою Lys-С з подальшим мас-спектральним аналізом протеолітичних
фрагментів. MALDI MS аналіз пептидів дозволив ідентифікувати сайт
фосфорилювання як Ser486.

Аналіз фосфорилювання S6K2 по залишку Ser486 у відповідь на мітогенну
стимуляцію клітин. Для аналізу фізіологічної значущості фосфорилювання
Ser486 було отримано анти-рSer486 поліклональні антитіла. Для цього як
антиген використовували штучно синтезований пептид, що відповідав 11
С-кінцевим амінокислотним залишкам S6K2 і при цьому містив
фосфорильований залишок Ser486 (SGTKKS486KRGRG). Специфічність антитіл
перевіряли методом Вестерн-блот аналізу рекомбінантних S6K до та після
фосфорилювання РКС. Із використанням вказаних антитіл досліджували вплив
різноманітних позаклітинних стимулів на рівень фосфорилювання S6К2 по
залишку Ser486.

Як видно з результатів, наведених на рис. 12, найсуттєвіше підвищення
фосфорилювання Ser486 у S6K2 відбувається після стимуляції клітин РМА,
що є відомим індуктором РКС.

Вплив РКС-залежного фосфорилювання S6K2 на кіназну активність. Оскільки
S6К кінази активуються в результаті множинного фосфорилювання по
залишках Ser та Тhr, було важливим детальніше дослідити ефект
фосфорилювання Ser486 на кіназну активність S6K2 та визначити сигнальні
шляхи, залучені до регуляції цього фосфорилювання. Як свідчать дані,
представлені на рис. 13, стимуляція клітин РМА призводить до значного
підвищення активності S6K2.

Дослідження впливу інгібіторів РІ3К і mTOR вортманіну і рапаміцину
свідчать, що індукована РМА активація S6K2 не залежить від
фосфорилювання Ser486 (рис. 14), оскільки суттєве зменшення активності
S6K2 внаслідок дії інгібіторів не супроводжувалось зниженням рівня
фосфорилювання S6K2. Крім того, заміна Ser486 на незаряджену
амінокислоту Ala повністю унеможливлювала РМА-індуковане фосфорилювання,
однак ніяким чином не впливала на індуковану РМА активність (рис. 14).

ue »

¦

TH

ph

???

u ue ¦

TH

E-EdEfEhElE3/4EAE.I2IAIooeoeUee?eoEAoe?e?e?eAooooooo?oAo?o?oooooooooA—o—
o?o?ooooooo

ph

phy

8 ¶

AE

#0&-‘uiuaeuiuaessuOessuOessuIuOessuOessuIuaeuaeuCuOessuOeuOeuA3/4·uuOess
ussussussu¦uu¦uiu¦u¦

Aилювання може впливати на субклітинну локалізацію S6K2.

Щоб перевірити цю гіпотезу було досліджено субклітинну локалізацію
рекомбінантних S6K1 та S6K2 у трансфікованих клітинах НЕК293 у відповідь
на їхню стимуляцію РМА. Результати конфокальної мікроскопії свідчать, що
локалізація S6K2 суттєво відрізняється від такої для S6K1. На відміну
від S6K1, що переважно була локалізована у цитоплазмі, у клітинах, не
стимульованих РМА, S6K2 виявлено в ядрі (рис. 15). Стимуляція ж клітин
РМА призводила до різкого зменшення вмісту S6K2 у ядрі і до збільшення в
цитоплазмі. Таким чином, стимуляція клітин РМА призводить до
транслокації S6K2 з ядра до цитоплазми. За цих умов суттєвих змін у
локалізації S6K1 не спостерігали.

Оскільки одним із основних наслідків стимуляції клітин РМА є
фосфорилювання S6K2 по Ser486 було зроблено припущення, що саме
фосфорилюванням Ser486 супроводжується перерозподіл кінази з ядра до
цитоплазми. Для перевірки цього було визначено локалізацію
фосфорильованої по Ser486 S6K2 для чого використовували анти-рSer486
антитіла.

Результати наведені на рис. 16 свідчать, що S6K2рSer486 локалізована
винятково в цитоплазмі звідки витікає, що фосфорилювання S6K2 за Ser486
призводить саме до блокування NLS. Однак лишалось не зрозумілим де саме
відбувається фосфорилювання чи в ядрі, чи в цитоплазмі. Для з’ясування
цього питання було застосовано інгібітор ядерного експорту лептоміцин В
(LMB). Клітинам додавали LMB попередньо до стимуляції РМА, однак і за
цих умов S6K2рSer486 було детектовано винятково в цитоплазмі, що
свідчить на користь цитоплазматичного походження Ser486 фосфорилювання.
Відповідно, індуковане РМА, накопичення S6K2 у цитоплазмі не є
результатом активації ядерного експорту, а наслідком блокування ядерного
імпорту, що в свою чергу свідчить про існування постійного обміну між
ядерною і цитоплазматичною фракціями S6K2.

Для підтвердження значущості Ser486 фосфорилювання у регуляції
ядерно/цитоплазматичної локалізації S6K2 було досліджено локалізацію
мутантної форми S6K2/S486E, де Ser було замінено на кислу амінокислоту
Glu і, тим самим, модельовано фосфорильований стан S6K2 Як свідчать
отримані дані, фосфорилювання за Ser486 є не єдиним чинником, необхідним
для затримки S6K2 в цитоплазмі, оскільки мутантна форма S6K2/S486E,
подібно до S6K2 дикого типу, була всупереч очікувань локалізована
переважно у ядрі клітин і лише стимуляція РМА призводила до накопичення
кінази в цитоплазмі. Натомість додаткова мутація (Т401D/S486E) S6K2, що
за вищенаведеними даними спричинювала активацію кінази, дійсно
призводила до затримки S6K2 в цитоплазмі незалежно від стимуляції РМА.
Таким чином фосфорилювання Thr401 і відповідно активація S6К2 так само,
як і фосфорилювання Ser486, є головними чинниками в регуляції балансу
S6K2 в ядрі і цитоплазмі.

Особливості експресії S6K1/S6K2 в різних тканинах ссавців на рівні мРНК
та білка. Рівень експресії мРНК для S6K1 та S6K2 в різних тканинах
людини визначали методом Нозерн-блот аналізу препаратів тотальних мРНК,
отриманих із різних органів людини. Результати, які наведено на рис. 17,
свідчать, що в тканинах людини виявлено один специфічний транскрипт для
мРНК S6K2 розміром 2,2 тис. п. н. Натомість S6K1-специфічні проби
гібридизувалися з двома транскриптами розміром 3,4 та 7,4 тис. п. н.
Профіль експресії мРНК S6K1 та S6K2 в різних органах людини був
подібним, і загалом експресія S6K була тканиноспецифічною. Найвищий
вміст S6K1/S6K2 мРНК виявлено в серці, скелетних м’язах, селезінці,
передміхуровій залозі, товстій кишці та лімфоцитах. Низький рівень
виявлено в мозку, легенях і нирках.

Рівень експресії S6K в різних органах щура досліджували з використанням
поліклональних антитіл отриманих проти рекомбінантних С-кінцевих
фрагментів S6K1 та S6K2, що мають самий низький рівень гомології (рис.
18).

Як S6К1, так і S6К2 виявлено в усіх досліджуваних тканинах. Для S6К1
найвищий рівень експресії знайдено в мозку та м’язах, дещо нижчий, однак
досить високий у тимусі, сім’яниках, серці, яєчниках та легенях;
незначний — в передміхуровій залозі та нирках і майже зовсім не виявлено
експресії в щитовидній залозі, селезінці, печінці і кишечнику. Для S6К1
та S6К2 спостерігали в цілому подібний розподіл рівня експресії залежно
від тканини, однак для S6К1 найвищий рівень експресії було виявлено у
мозку та м’язах, а для S6К2 — в сім’яниках та яєчниках.

Порівнюючи отримані результати із закономірностями експресії відповідних
мРНК, виявлених Нозерн-блот аналізом, можна зробити висновок про
відсутність повної кореляції між рівнем експресії S6К1 та S6К2 на рівні
мРНК і білка. Це можна пов’язати, в першу чергу, з різною ефективністю
трансляції мРНК в різних тканинах і припустити існування регуляції
експресії S6K на рівні трансляції мРНК.

Визначення білків асоційованих з S6K. Для виявлення нових функціональних
зв’язків S6K було застосовано дріжджову двогібридну систему, що широко
застосовується у світі для визначення білково-білкових взаємодій.
Створено низку «bait»-конструкцій, що відповідали повнорозмірним формам,
С- та N-кінцевим фрагментам S6K1 і S6K2. Однак лише “bait”-конструкція
повнорозмірної форми S6K1 задовольняла вимогам системи і відповідно її
використовували надалі. Скринування кДНК бібліотеки 19-денних ембріонів
мишей дозволило ідентифікувати декілька позитивних клонів, однак
подальший аналіз підтвердив специфічність лише одного клону (№ 2).
Аналіз нуклеотидної послідовності кДНК позитивного клону з використанням
баз даних дозволив виявити високу гомологію центральної ділянки
білкового продукту (розрахованої молекулярної маси 62 кДа) з
фосфопантотенатаденілтрансферазою прокаріотів та нижчих еукаріотів.
C-кінцева ділянка мала натомість високу гомологію з каталітичним доменом
дефосфоКоА-кіназ. Крім того, серед вищих еукаріотів ідентифіковано
декілька функціонально не охарактеризованих білків, які мали гіпотетичні
фосфопантотенатаденілтрансферазний та дефосфоКоА-кіназний домени (рис.
19).

Згідно з даними літератури біохімічно було охарактеризовано лише ензим
очищений із печінки свині, що мав фосфопантотенатаденілтрансферазну та
дефосфоКоА-кіназну активності одночасно (Warral et al., 1982). Однак
амінокислотну послідовність відповідного ензиму не було визначено, як не
було ідентифіковано і його ген, а тому гіпотезу про існування
біфункціонального білка не було остаточно підтверджено. Відповідно було
висунуто гіпотезу, що кДНК клону 2 кодує біфункціональний ензим –
КоА-синтазу, який каталізує два останніх етапи біосинтезу КоА.

Визначення прогнозованих активностей КоА-синтази. Для підтвердження
висунутої гіпотези кДНК клону 2 та її фрагмент, що відповідає
дефосфоКоА-кіназному домену, було експресовано в клітинах бактерій і
ссавців відповідно. Ензиматичну активність рекомбінантних білків
визначали з використанням як субстратів фосфопантотенату та dPКoA (рис.
20).

Згідно з наведеними даними, повнорозмірна форма білка використовує як
субстрат для синтезу КоА як фосфопантотенат, так і dPКoA. Натомість
субстратом фрагмента білка, що містить лише dPКoAК домен, є лише dPКoA.
Перевірка активності мутантної форми КоА-синтази, у якої His203 замінено
на Ala, що, за даними літератури, призводить до блокування активності
фосфопантотенатаденілтрансферази бактерій (Izard et al., 1999),
свідчить, що ця заміна є критичною і для аналогічної активності
КоА-синтази.

Таким чином, представлені дані свідчать, що кДНК S6K1-зв’язувального
білка кодує біфункціональний фермент КоА-синтазу.

Підтвердження взаємодії S6K та КоА-синтази у клітинах ссавців. Для
підтвердження взаємодії між S6K1 та КоА-синтазою та перевірки здатності
S6K2 утворювати комплекс з КоА-синтазою відповідні рекомбінантні білки
(EE-S6K1, ЕЕ-S6K2, Myc-КоА-синтаза) експресували в клітинах НЕК293.
Гіпотетичні комплекси преципітували з використанням анти-ЕЕ антитіл і
аналізували за допомогою анти-Мус антитіл. Згідно з еспериментальними
даними (рис. 21), як S6K1, так і S6K2 здатні до утворення комплексу з
КоА-синтазою в клітинах ссавців.

Існування комплексу між ендогенними білками було підтверджено
аналогічним шляхом, однак преципітацію ендогенної КоА-синтази проводили
за допомогою поліклональних антитіл отриманих проти С-кінцевого
фрагмента КоА-синтази, а присутність S6K у складі комплексу визначали за
активністю S6K в реакції фосфорилювання S6 рибосомного білка (рис. 22).

Для визначення клітинних компартментів де може відбуватися утворення
S6K/КоА-синтаза комплексу було проаналізовано субклітинну локалізацію
КоА-синтази, експресованої в клітинах НЕК293. Оскільки за даними
літератури КоА-синтезується в цитозолі чи в примітохонріальних ділянках,
або навіть в матриксі мітохондрії (Robishaw et al., 1982; Tahiliani et
al., 1987), було одночасно визначено локалізацію мітохондрій, для чого
застосовували специфічний для мітохондрій барвник MitoTracker.

Представлені дані (рис. 23) свідчать про майже виняткову колокалізацію
КоА-синтази з мітохондріями, де саме і може утворюватися комплекс з S6K.
Згідно з дослідженями субклітинної локалізації S6K, таку можливість не
можна виключати.

Аналізуючи функціональне значення виявленої взаємодії S6K з
КоА-синтазою, встановлено, що надекспресія КоА-синтази в клітинах не
впливає на рівень фосфорилювання S6 рибосомного білка. Аналогічно
надекспресія S6K2 не впливала на активність КоА-синтази. Таким чином, на
сьогодні фізіологічне значення встановленої взаємодії лишається
незрозумілим. Однак існують дані літератури щодо ролі S6K в біогенезі
ліпідів та енергетичному метаболізмі клітини, процесів, де КоА відіграє
одну з провідних ролей (Thomas et al., 2005). З огляду на те, що
біосинтез білка є самим енергомістким процесом у клітині існування
функціонального зв’язку S6K з біогенезом КоА є цілком логічним.

Особливості експресії S6К1 та S6К2 при злоякісній трансформації. Як уже
зазначалося, ціла низка патологій, включаючи злоякісну трансформацію
клітини, діабет, ожиріння, серцево-судинні захворювання та інші,
супроводжується порушеннями функціонування сигнальних систем. У багатьох
випадках компоненти сигнальних систем використовують у сучасній
онкології як біомаркери злоякісної трансформації, а також як
безпосередні мішені в специфічній хіміо- та імунотерапії онкологічних
захворювань. Беручи до уваги те, що біогенез рибосом і відповідно рівень
білкового синтезу в злоякісних клітинах зазнають суттєвих змін, цілком
логічним було б припустити існування змін в експресії представників
родини S6K.

За даними літератури (Wu et al., 2000), високий рівень експресії S6K1
виявлено як у клітинах аденокарциноми молочної залози людини лінії MCF7,
так і в злоякісних пухлинах молочної залози.

Досліджено цілу низку клітинних ліній аденокарциноми молочної залози та
виявлено в них підвищений вміст обох форм кіназ. Порівняльний аналіз
рівня експресії S6K1 та S6K2 у пухлинах молочної залози та в умовно
нормальних тканинах, що їх оточують, також свідчить про суттєві зміни.
Вестерн-блот аналіз гомогенатів доброякісних пухлин виявив підвищений
рівень експресії S6K1 у половині проаналізованих зразків (рис. 24 А, Б).
При цьому помітних змін в експресії S6K2 не виявлено. Натомість, у
пухлинах аденокарцином молочної залози виявлено значне підвищення
експресії як S6K1, так і S6K2 (рис. 24, В).

Визначення рівня експресії S6K у пухлинах з огляду на рівень їхньої
диференціації свідчить про статистично достовірне його підвищення як для
S6K1, так і S6K2 в пухлинах низького ступеня проліферації і відповідно
високого рівня злоякісності (рис. 25).

Імуногістохімічні дослідження зразків пухлин та умовно нормальних тканин
виявили дуже цікаву закономірність. Поряд із незначним рівнем експресії
обидві форми кінази було детектовано винятково в цитоплазмі клітин
нормальних тканин (рис. 26). Натомість у клітинах доброякісних та
злоякісних пухлин спостерігали суттєве накопичення кіназ як у
цитоплазмі, так і в ядрі.

Особливо ця тенденція виявилася характерною для S6K2. Ядерну локалізацію
S6K2 було детектовано в близько 80 % досліджуваних пухлин. Показники для
S6K1 були значно меншими. Таким чином, існує чітка тенденція до
накопичення S6K2 у ядрі злоякісних клітин, пов’язана як із підвищенням
рівня її експресії, так і змінами в регуляції балансу між вмістом S6K2 у
цитоплазмі та ядрі. Можливим наслідком цього процесу є зміни в експресії
відповідних генів, причетних до підтримки високого рівня проліферації
пухлин. Дійсно, високий вміст S6K2 виявлено в зонах контакту пухлини з
оточуючих їх тканинами, які за морфологічними ознаками нагадують зони
інвазивного росту пухлини. Крім того, для S6K2, але не S6K1 виявлено
кореляцію між збільшенням вмісту S6K2 в ядрі та експресією відомих
маркерів проліферації PCNA та Ki-67.

Дослідження інших типів пухлин, а саме — щитовидної залози та ендометрію
людини свідчить, що для них теж характерним є збільшення вмісту кіназ в
доброякісних та злоякісних пухлинах а також тенденція до транслокації
S6K у ядро, що більшою мірою стосується S6K2 (Таблиця).

Таким чином, ідентифіковано нову кіназу S6K2, яка згідно з результатами
аналізу первинної структури, має високий рівень гомології і подібну
доменну організацію з уже відомою кіназою рибосомного білка S6; два
альтернативних старти трансляції і, можливо, аналогічно з S6К1 існує у
вигляді двох ізоформ S6К2/I та S6К2/IІ. S6K2 ефективно фосфорилює як
субстрат рибосомний білок S6, має гомологічні з S6K1 сайти
фосфорилювання, ключові для її активації і знаходиться під контролем
РІ3K/mTOR-залежного сигнального каскаду.

З огляду на представлені експериментальні дані, щодо субстратної
специфічності S6K та особливостей регуляції їхньої активності
запропоновано модель ролі S6K в передачі позаклітинних стимулів
опосередкованій PI3К/mTOR-залежним сигнальним каскадом (рис. 27).

Високий рівень структурної гомології і, як наслідок, подібна субстратна
специфічність свідчить, що кінази можуть виконувати у клітині схожі
функції, а саме приймають участь у регуляції білкового синтезу шляхом
регуляції трансляції мРНК компонентів апарату трансляції: рибосомних
білків та факторів ініціації трансляції.

Однак визначені особливості в механізмах регуляції активності S6K
вказують і на відмінності в їхньому функціонуванні у клітині. Оскільки
S6K1 є більш залежною порівняно з S6K2 від mTOR кінази, активність якої
контролюється не лише мітогенними факторами, а і вмістом поживних
речовин, можна зробити припущення, що активність S6K1 необхідна як для
контролю загального білкового синтезу, так і стимульованого мітогенними
факторами. Натомість активність S6K2 в більшій мірі виявляється залежною
від мітогенних стимулів і, відповідно, кіназа залучена до
мітогено-активованої регуляції біосинтезу. Крім того, кінетика активації
S6K2 мітогенами свідчить, що S6K2 забезпечує ранню, порівняно з S6K1,
відповідь клітин на мітогенні стимули.

Ідентифікування нових субстратів S6K1, згідно даних літератури, а саме
проапоптичного білка BAD, білка залученого до сплайсингу CP80, UBF
фактора транскрипції генів рибосомних РНК, субстрату інсулінового
рецептора свідчить, що функції S6K1 не обмежується лише регуляцією
трансляції мРНК.

Цілком імовірно, що все це стосується і S6K2, оскільки на сьогодні вже
встановлено, що S6K2 здатна фосфорилювати деякі із вказаних субстратів.
При цьому, з огляду на подібну субстратну специфічність кіназ, розподіл
функцій між S6K може забезпечуватися їхньою субклітинною локалізацією та
відмінностями в механізмах активації. Приймаючи до уваги існування
додаткового сигналу ядерної локалізації та встановленого механізму
регуляції вмісту S6K2 в цитоплазмі та в ядрі за участі РКС, цілком
імовірно, що функції S6K2, в більшій мірі аніж S6K1 пов’язані з
використанням ядерних субстратів. Саме S6K2 може бути в першу чергу
залучена до регуляції експресії генів рибосомних РНК шляхом регуляції
активності фактора транскрипції UBF. Однак не можна виключати
використання і інших ядерних субстратів. На користь цього свідчить
високий вміст S6K2 в ядрах злоякісних клітин, що корелює з підвищеним
рівнем проліферації неопластичних клітин.

Визначення КоА-синтази як S6K-зв’язувального білка вказує на зв’язок
PI3K/mTOR сигнального каскаду з цілою низкою метаболічних процесів у
клітині залежних від КоА, в тому числі і з енергетичним метаболізмом
клітини. Той факт, що біосинтез білка є самим енергомістким процесом у
клітині, існування зв’язку між механізмами регуляції білкового синтезу
та регуляції енерговідновлення у клітині є цілком логічним однак
потребує більш детального дослідження.

З огляду на підвищення рівня експресії S6K та субклітинний перерозподіл
кіназ, особливо S6K2, можна зробити висновок про існування суттєвих змін
в функціонуванні кіназ при злоякісній трансформації, що пов’язані як зі
змінами в механізмах регуляції їхньої експресії, так і субклітинної
локалізації. Беручи до уваги провідну роль РКС в регуляції балансу
цитоплазматичної та ядерної фракцій S6K2, можна припустити, що це
пов’язано зі змінами в функціонуванні цієї кінази. Наведені дані, щодо
особливостей експресії S6K в злоякісних клітинах роблять їх привабливими
об’єктами для подальшого дослідження з огляду на можливість їхнього
використання як діагностичних та прогностичних маркерів, а також
перспективних мішеней для хіміотерапії онкологічних захворювань.

ВИСНОВКИ

Доведено існування родини високогомологічних кіназ рибосомного білка S6
у ссавців, представниками якої є S6K1 та S6K2. Структурно-функціональна
організація S6К1 та S6К2 свідчить як про подібність, так і відмінності в
їхньому функціонуванні у клітині, що забезпечується на рівні регуляції
активності кіназ та їхньої субклітинної локалізації.

1. Ідентифіковано нову форму кінази рибосомного білка S6 людини – S6К2,
що має значну гомологію на рівні первинної структури, аналогічну доменну
організацію та гомологічні сайти фосфорилювання з уже відомою формою
кінази S6K1.

2. Доведено, що білок малої 40S субчастинки рибосом S6 є специфічним
субстратом S6К2 аналогічно з S6К1.

3. Встановлено, що активація S6К2 відбувається у відповідь на мітогенну
стимуляцію клітин, однак кінетика активації S6К2 та S6К1 суттєво
відрізняється.

4. Показано, що гомологічні сайти фосфорилювання у S6К1 і S6К2 —
Thr412/401 і Thr252/241, відповідно, є ключовими для активації кіназ.

5. Доведено, що регуляція активності як S6К1, так і S6К2 знаходиться під
контролем РІ3К/mTOR-залежного сигнального шляху, однак роль mTOR кінази
в регуляції активності S6К2 є значно меншою порівняно з S6К1, що
пов’язано з особливостями будови С-кінцевих регуляторних ділянок S6K.

6. Виявлено існування РКС-залежної регуляції субклітинної локалізації
S6К2 у цитоплазмі та в ядрі, що відбувається шляхом фосфорилювання
Ser486 розташованого в межах додаткового сигналу ядерної локалізації
S6К2.

7. Ідентифіковано S6К-зв’язувальний білок — КоА-синтазу, що вказує на
зв’язок S6K та РІ3К/mTOR-залежного сигнального шляху з низкою
метаболічних процесів у клітині.

8. Встановлено, що КоА-синтаза локалізована переважно на мітохондріях,
де саме і може відбуватися взаємодія S6K1 та KoA-синтази.

9. Визначено структурні елементи S6K1 та KoA-синтази відповідальні за
утворення білково-білкового комплексу та мітохондріальну локалізацію
KoA-синтази, а саме — їхні С-кінцеві регуляторні ділянки та N-кінцевий
гідрофобний фрагмент КоА-синтази відповідно.

10. Вперше визначено первинну структуру КоА-синтази і доведено, що це є
біфункціональний ензим, який каталізує два останніх етапи біогенезу КоА.

11. Порівняльний аналіз вмісту S6К1 і S6К2 у нормальних тканинах та у
пухлинах молочної залози людини свідчить про підвищений рівень експресії
S6K1 в аденомах та аденокарциномах, а S6K2 — лише в аденокарциномах
молочної залози.

12. Аналіз субклітинної локалізації S6К у різних типах пухлин людини
вказує на тенденцію до накопичення S6K і більшою мірою S6K2 у ядрі
злоякісних клітин, що, можливо, пов’язано із змінами в регуляції
ядерно-цитоплазматичного транспорту S6K за участі РКС.

13. Встановлено кореляцію між підвищенням рівня проліферації злоякісних
клітин та ядерною локалізацією S6K2, але не S6K1.

14. Запропоновано модель ролі S6K1 та S6K2 у передачі позаклітинних
стимулів опосередкованій PI3К/mTOR-залежним сигнальним каскадом.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ

ДИСЕРТАЦІЇ

1. Вартанян О. А., Машанов-Голиков А. В., Вольфсон А. Д., Захарова О.
Д., Лаврик О. И., Филоненко В. В., Берестень С. Ф. Экспресс-метод
выделения фенилаланил-тРНК синтетазы млекопитающих и получение
моноклональных антител // Молекуляр. биология – 1990. — Т. 24, № 3. — С.
788-794. (Автором модифіковано методику отримання моноклональних
антитіл, підготовлено статтю до друку).

2. Gout I., Minami T., Hara K., Tsujishita Y., Filonenko V., Waterfield
M. D., Yonezawa K.. Molecular cloning and characterization of a novel
p70 S6 kinase, p70 kinase ?, containing a prolin-rich region // J. Biol.
Chem. – 1998. — Vol. 273, № 46. — Р. 30061-30064. (Автором проведено
клонування рекомбінантних форм S6K2, визначено вплив інгібіторів
вортманіну та рапаміцину на активність кінази, досліджено експресію мРНК
у тканинах ссавців).

3. Погребной П. В., Кухаренко А. П., Тихонкова И. А., Пальчевский С. С.,
Cавинская Л. А., Погребная А. П., Валевка Т. И., Маркеева Н. В.,
Солдаткина М. А., Мацука Г. Х., Гут И. Т, Филоненко В. В. Получение и
характеристика моноклональных антител против р70S6-киназы ?//
Экспериментальная онкология. — 1999. — Т. 21, № 3 — С. 232-238. (Автором
клоновано кДНК С-кінцевого фрагменту S6K1 у відповідний вектор,
рекомбінантний пептид експресовано у клітинах бактерій, проведено його
очищення та подальшу імунізацію тварин, охарактеризовано моноклональні
антитіла, підготовлено статтю до друку).

4. Вальовка Т. Й, Філоненко В. В., Пальчевський С. С, Великий М. М.,
Дробот Л. Б., Вотерфилд М., Мацука Г. Х., Гут І. Т. Функціональні та
регуляторні особливості кінази рибосомного S6 білка типу ? //
Біополімери і клітина. — 1999.- Т. 15, № 5. – C. 415-421. (Автором
досліджено кінетику активації S6К1 та S6К2 сироваткою крові,
підготовлено статтю до друку).

5. Роднін М. В., Тихонкова І. О., Філоненко В. В., Дробот Л. Б., Мацука
Г. Х., Гут І. Т. Пошук та характеристика антигенів меланоми за допомогою
методу SEREX// Біополімери і клітина.-2000.- Т. 16, № 5. – C. 339-345.
(За участі автора сформульовано завдання дослідження, проведено очистку
Кі67 антигену, підготовлено статтю до друку).

6. Вальовка Т. Й., Філоненко В. В., Великий М. М., Дробот Л. Б.,
Вотерфілд М., Мацука Г. Х., Гут І. Т. Особливості фібронектин-залежної
активації кіназ рибосомного білка S6 (S6K1 i S6K2) // Укр. бiохім.
журн.- 2000.- Т. 3, № 3. — C. 31-37. (Автором проведено клонування S6K1
i S6K2 у вектори для експресії в клітинах ссавців, визначено активність
S6K, підготовлено статтю до друку).

7. Савінська Л. О., Киямова Р. Г., Погрібний П. В., Овчаренко Г. В., Гут
І. Т., Філоненко В. В. Порівняльна характеристика експресії ? та ?
ізоформ S6 кінази в тканинах ссавців// Біополімери і клітина.- 2001. -Т.
17, № 5.-С. 374-378. (Автором сформульовано завдання дослідження,
підготовлено статтю до друку).

8. Живолуп О. М., Немазаний І. О., Побігайло Н. В., Панасюк Г. Г.,
Пальчевський С. С., Кухаренко О. П., Савінська Л. О., Овчаренко Г. В.,
Вудмаска М. І., Гут І. Т., Мацука Г. Х., Філоненко В. В. Використання
дріжджової двогібридної системи для пошуку S6К1 та S6К2 зв’язувальних
партнерів// Біополімери і клітина. — 2002. — Т. 18, № 2.-С. 102-109.
(Автором сплановано виконання експериментів, підготовлено статтю до
друку).

9. Zhyvoloup A., Nemazanyy I., Babich A., Panasyuk G., Pobigailo N.,
Vudmaska M., Naidenov V., Kukharenko O., Palchevskii S., Savinska L.,
Ovcharenko G., Verdier F., Valovka T., Fenton T., Rebholz H., Wang M.
L., Shepherd P., Matsuka G., Filonenko V., Gout I. T. Molecular cloning
of CoA Synthase. The missing link in CoA biosynthesis // J.Biol.Chem.
-2002. -Vol. 277, № 25. – Р. 22107-22110. (За участі автора сплановано
завдання дослідження, проаналізовано кДНК бібліотеку мишей з
використанням “bait” конструкцій S6K1, проведено ідентифікацію
позитивних клонів, отримано антитіла до КоА-синтази, визначено рівень
експресії КоА-синтази в різних тканинах щура, проведено мутаційний
аналіз).

10. Valovka T., Verdier F., Cramer R., Zhyvoloup A., Fenton T., Rebholz
H., Wang M. L., Gzhegotsky M., Lutsyk A., Matsuka G., Filonenko V., Wang
L., Proud C.G, Parker P. J., Gout I. T. Protein kinase C phosphorylates
ribosomal protein S6 kinase ? II and regulates its subcellular
localization // Mol. Cell. Biol. — 2003.-Vol. 23, № 3. — С. 852-863.
(Автором проведено дослідження рівня фосфорилювання рекомбінантних форм
S6K1 i S6K2 за участі РКС та вплив на нього мітогенних факторів.
Клоновано мутантні форми S6K2. За участі автора проаналізовано
анти-Ser486 антитіла, досліджено субклітинну локалізацію мутантних форм
S6K2 у трансфікованих клітинах НЕК 293).

11. Zhyvoloup A., Nemazanyy I., Panasyuk G., Valovka T., Fenton T.,
Rebholz H., Wang M. L., Foxon R., Lyzogubov V., Usenko V., Kyyamova R.,
Gorbenko O., Matsuka G., Filonenko V., Gout I. Subcellular localization
and regulation of Coenzyme A Synthase// J.Biol.Chem.-2003. –Vol. 278, №
50. — Р. 50316-50321. (За учаті автора сплановано мету дослідження,
визначено роль гідрофобних ділянок КоА-синтази для субклітинної
локалізації, клоновано N-кінцеву послідовність КоА-синтази злитою з
GFP).

12. Савінська Л. О., Усенко В. С., Лизогубов В. В., Погрібний П. В.,
Пальчевський С. С., Овчаренко Г. В., Чешук В. Г., Гут І. Т., Мацука Г.
Х., Філоненко В.В. Експресія ?- та ?- ізоформ р70S6 К у клітинних лініях
та пухлинах молочної залози людини// Біополімери і клітина.-2003.-Т. 19,
№ 1. — Р. 64-71. (Автором сплановано завдання дослідження, підготовлено
статтю до друку).

13. Lytvyn D. I., Dudchenko T. M., Lyzogubov V. V., Usenko V. S.,
Nespryadko S. V., Vinnitskaya A. B., Vorobyova L. I., Pal’chevskiy S.
S., Filonenko V. V., Pogrebnoy P. V. Expression of ?- and ?-isoform of
p70S6 kinase in human endometrial tumors// Experimental Oncology.-
2003.- Vol. 25, № 2. – P. 274-278. (За участі автора сплановано завдання
дослідження, підготовлено статтю до друку).

14. Lysogubov V. V., Usenko V. S., Khojaenko Yu. S., Lytvyn M. A.,
Soldatkina M. A.., Rodnin N. V., Filonenko V. V., Pogrebniy P. V.
Immunohistochemical analysis of p70S6 kinase ? in human thyroid tissue
upon pathology// Experimental Oncology. – 2003. — Vol. 25, № 4, — P.
304-306. (Автором сплановані завдання дослідження, приготовані препарати
пухлин для аналізу, підготовлено статтю до друку).

15. Nemazanyy I., Panasyuk G., Zhyvoloup A., Panayotou G., Gout I.,
Filonenko V. Specific interaction between S6K1 and CoA synthase: a
potential link between the mTOR/S6K pathway, CoA biosynthesis and energy
metabolism// FEBS Lett. – 2004.- Vol. 578, № 3. – Р. 357-362. (Автором
сплановано завдання дослідження, клоновано мутантні форми КоА-синтази).

16. Panasyuk G., Nemazanyy I., Filonenko V., Zhyvoloup A. Large scale
yeast transformation in low-percentage agarose medium// Biotechniques. —
2004. — Vol. 36, № 1. — P. 40-44. (За участі автора cформульовано ідею
дослідження, підготовлено статтю до друку).

17. Savinska L. O., Lyzogubov V. V., Usenko V. S., Ovcharenko G. V.,
Gorbenko O. N., Rodnin M. V., Vudmaska M. I., Pogribniy P. V., Kyyamova
R. G., Panasyuk G. G., Nemazanyy I. O., Malets M. S., Palchevskyy S. S.,
Gout I. T., Filonenko V. V. Immunohistochemical analysis of S6K1 and
S6K2 expression in human breast tumors// Experimental Oncology.-
2004.-Vol. 26, № 1. – Р. 24-30. (Автором визначені завдання дослідження,
очищено рекомбінантні форми S6K, підготовлено статтю до друку).

18. Filonenko V. V., Tytarenko R.., Azatjan S. K., Savinska L. O.,
Gaydar Y. A., Gout I. T., Usenko V. S., Lyzogubov V. V.
Immunohistochemical analysis of S6K1 and S6K2 subcellular localization
in human breast tumors// Experimental Oncology. — 2004. — Vol. 26, № 4.
— Р. 294-299. (Автором сформульовані завдання роботи щодо аналізу
субклітинної локалізації S6K, проведено статистичну обробку даних,
підготовлено статтю до друку).

19. Lyzogubov V. V., Lytvyn D. I., Dudchenko T. M., Lubchenko N. V.,
Pogrybniy P. V., Usenko V. S., Gout I. T., Filonenko V. V.
Imunnohistochemical study of S6K1 and S6K2 expression in human
endometrial adenocarcinomas// Experimental Oncology.-2004.- Vol. 26, №
4. –С. 287-293. (За участі автора сформульовані завдання дослідження та
зроблені висновки з результатів, підготовлено статтю до друку).

20. Вальовка Т. Й., Гут І. Т., Філоненко В. В. Вплив точкових мутацій
регуляторних амінокислотних залишків та делецій N- та С-кінцевих ділянок
S6K1 та S6K2 на активність кіназ // Біополімери і клітина.-2005. — Т.
21, №1. — С. 42-48. (Автором проведено клонування та in vitro визначення
активності мутантних форм S6K1 i S6K2, підготовлено статтю до друку).

21. Тихонкова І. О., Лізогубов В. B., Довгопола О. О., Коровін С. І.,
Овчаренко Г. В., Роднін М. В., Філоненко В. В. Дослідження
структурно-функціональних властивостей імуногенного фрагмента білка
Кі-67 та отримання до нього поліклональних та моноклональних антитіл//
Біополімери і клітина. — 2005. — Т. 21, № 2. — С. 180-183. (Автором
сплановано завдання дослідження та зроблено висновки, проведено
статистичну обробку даних, підготовлено статтю до друку).

22. Lyzogubov V., Khozhaenko Yu., Usenko V., Antonjuk S., Ovcharenko G.,
Tikhonkova I., Filonenko V. Immunohistochemical analysis of Ki67; PCNA
and S6K1/2 expression in human breast tumors// Experimental
Oncology.-2005.- Vol. 27, № 2. – P. 141-144. (Автором сформульовано
завдання дослідження, охарактеризовано анти-Кі67 антитіла, зроблено
висновки з результатів. Підготовлено статтю до друку

23. Панасюк Г. Г., Немазаний І. О., Філоненко В. В. Ідентифікація
ендогенних ізоформ кінази рибосомного білка S6 – S6K2// Біополімери і
клітина.-2005.-Т. 21, № 3. С. 293-295. (Автором проведено очистку
анти-S6K2 моноклональних антитіл, сплановано завдання дослідження та
зроблено висновки з отриманих результатів, підготовлено статтю до
друку).

24. Kiyamova R. G., Filonenko V. V. Tumor-associated antigens and
development of immunotherapeutics strategies //Біополімери і
клітина.-2005.-Т. 21, № 3. — С. 220-229. (Автором зроблено узагальнення
даних літератури, підготовлено статтю до друку).

25. Zhyvoloup A., Nemazanyy I., Panasyuk G., Filonenko V., Gout I. The
identification and functional characterization of novel ribosomal S6
kinase binding partner//Rev. Oncol. — 17th meeting of the European
Association for Cancer Research. – 2002. — Vol. 4, Sappl 1. — P. 1-10.
(За участі автора сплановано завдання дослідження, проаналізовано кДНК
бібліотеку мишей, проведено ідентифікацію позитивних клонів).

26. Filonenko V., Nemazanyy I., Panasyuk G., Zhyvoloup A., Matsuka G.,
Gout I. Identification and characterization of p70S6 kinase binding
partners by yeast two hybrid system 4th PARNAS conference Molecular
Mechanisms of Cell Activation, Biological Signals and their target
enzymes. — Wroclaw (Poland). — 2002. — P. 49. (За участі автора
проаналізовано кДНК бібліотеку мишей, проведено ідентифікацію позитивних
клонів).

27. Zhyvoloup A., Nemazanyy I., Panasyuk G., Filonenko V., Matsuka G.,
Gout I. The use of yeast two-hybrid system for the identification of
novel S6 kinase binding partners// Український біохімічний журнал.
Матеріали VIII-го Українського біохімічного з’їзду. — Чернівці
(Україна). — 2002, — Vol. 74, N 4b. Suppl. 2. — Р. 30. (За участі автора
проаналізовано кДНК бібліотеку мишей, проведено ідентифікацію позитивних
клонів, отримано антитіла до КоА-синтази).

28. Nemazanyy I., Zhyvoloup A., Panasyuk G., Filonenko V. Subcellular
localization and regulation of CoA synthase // EJB. — FEBS Special
Meeting on Signal Transduction. – 2003. – Vol. 270, Suppl. 1. — P. 142.
(За участі автора отримано антитіла до КоА-синтази, визначено рівень
експресії КоА-синтази в різних тканинах щура, проведено мутаційний
аналіз).

29. Nemazanyy I., Panasyuk G., Zhyvoloup A., Gout I., Filonenko V. CoA
synthase binds ribosomal S6 kinase 1 in vivo. Workshop on: The Proteins
Controlling Cell Growth And Their Role In Tumour Formation: mTOR, TSC
And PTEN Centre fore International meetings on Biology. — Madrid
(Spain). — 2003. — P. 57. (За учаті автора визначено роль гідрофобних
ділянок КоА-синтази для субклітинної локалізації, клоновано N-кінцеву
послідовність КоА-синтази злитою з GFP).

30. Nemazanyy I., Panasyuk G., Zhyvoloup A., Gout I., Filonenko V. CoA
synthase binds ribosomal S6 kinase 1 in vivo // EJB. -29th FEBS Meeting.
— Warsaw (Poland). — 2004- Vol. 271. — Suppl. 1. — P. 168. (За учаті
автора сплановано мету дослідження, визначено роль гідрофобних ділянок
КоА-синтази для субклітинної локалізації, клоновано N-кінцеву
послідовність КоА-синтази злитою з GFP, досліджено рівень експресії
КоА-синтази в тканинах ссавців).

31. Pogrebnoy P. V., Markeeva N. V., Pogrebnaya A. P., Savinskaya, L.
A., Tykhonkova I. A., Gout I. T., Filonenko V. V., Matsuka G. Kh.
Generation and characterization of monoclonal antibodies to p70S6kinase
? // The 2nd Congress of Oncologist from the CIS member States
«Oncology-2000». – Kуiv (Ukraine). — 2000. – P. 158. (Автором клоновано
кДНК С-кінцевого фрагменту S6K1 у відповідний вектор, пептид
експресовано у клітинах бактерій, проведено його очищення та подальшу
імунізацію тварин, охарактеризовано моноклональні антитіла).

32. Filonenko V., Savinska L., Ovcharenko G., Vudmaska M., Panasyuk G.,
Nemazanyy I., Palchevskyy S., Gout I. Oncogenic potential of ribosomal
protein S6 kinase // Тези Установчого з’їзду Українського товариства
клітинної біології. – Львів (Україна). — 2004. – C. 114.

33. Gout I., Filonenko V. Regulation of cell growth in normal and cancer
cells // Укр. бiохім. журн. – 5-th Parnas conference Molecular
Mechanisms of Cellular Signaling. – Київ (Україна). — 2005.-Vol. 77, №
2. – P. 21. (Автором узагальнені експериментальні дані субклітинної
локалізації S6K в різних типах пухлин людини, проведено статистичну
обробку даних).

34. Nemazanyy I., Panasyuk G., Zhyvoloup A., Gout I., Filonenko V.
Specific interaction between S6K1 and CoA syntase// Укр. бiохім. журн. –
5-th Parnas conference Molecular Mechanisms of Cellular Signaling. –
Київ (Україна). — 2005.-Vol. 77, № 2. – P. 132. (За учаті автора
визначено роль гідрофобних ділянок КоА-синтази для субклітинної
локалізації, клоновано N-кінцеву послідовність КоА-синтази злитою з GFP,
перевірено взаємодію КоА-синтази з S6K2).

35. Lyzogubov V., Tytarenko R., Usenko V., Ovcharenko G., Rodnin N.,
Tikhonkova I., Filonenko V. Immunohistochemical analysis of the S6K1/2
subcellular localization and ribosomal protein S6 phosphorylation in
human breast cancer// Укр. бiохім. журн. – 5-th Parnas conference
Molecular Mechanisms of Cellular Signaling. – Київ (Україна). —
2005.-Vol. 77, № 2. – P. 206. (Автором сформульовані завдання роботи
щодо аналізу субклітинної локалізації S6K в пухлинах різних типів,
проведено статистичну обробку даних).

36. Tykhonkova I. O., Rodnin M. V., Ovcharenko G. V., Dovgopola O. O.,
Lizogubov V. V., Filonenko V. V. The studies of immunological and
structural functional properties of Ki-67 nuclear antigen fragment//
Укр. бiохім. журн. – 5-th Parnas conference Molecular Mechanisms of
Cellular Signaling. – Київ (Україна). — 2005.-Vol. 77, № 2. – P. 248.
(Автором сформульовані завдання роботи, зроблено висновки).

АНОТАЦІЯ

Філоненко В. В. Структурно-функціональні особливості кіназ рибосомного
білка S6 — S6К1 та S6К2. -Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за
спеціальністю 03.00.03 – молекулярна біологія. – Інститут молекулярної
біології та генетики НАН України, Київ, 2005.

Ідентифіковано нову форму мітоген-залежної кінази рибосомного білка S6
– S6K2, що має значну структурну гомологію з уже відомою формою S6K1.
Доведено, що S6K2 аналогічно до S6K1 є складовою РІ3К/mTOR-залежного
сигнального каскаду залученого до передачі позаклітинних мітогенних
стимулів.

Незважаючи на високий рівень субстратної специфічності отримано докази
існування відмінностой у функціонуванні кіназ у клітині, які пов’язані з
особливостями регуляції їхньої активності та субклітинної локалізації.

Встановлено, що механізм, за яким відбувається регуляція балансу між
вмістом ядерної та цитоплазматичної фракцій S6K2, потребує РКС
опосередкованого фосфорилювання Ser486.

Виявлено суттєве зміни в експресії S6K в аденокарциномах молочної
залози людини порівняно з нормальними тканинами та тенденцію до
накопичення S6K в ядрах злоякісних клітин у пухлинах різного походження.

Ідентифіковано новий S6K-зв’язувальний партнер – КоА-синтазу, що
свідчить про зв’язок РІ3К сигнального шляху з низкою метаболічних
процесів у клітині.

Ключові слова: сигнальнi системи клiтини, S6K1, S6K2, онкогенез,
мутагенез, КоА-синтаза, РКС, РІ3К, mTOR.

АННОТАЦИЯ

Филоненко В. В. Структурно-функциональные особенности киназ рибосомного
белка S6 — S6К1 и S6К2. –Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по
специальности 03.00.03 – молекулярная биология. – Институт молекулярной
биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2005.

Идентифицирована новая протеинкина, характеризующуяся в соответствии с
анализом первичной структури ее кДНК высоким уровнем структурной
гомологии с киназой рибосомного белка S6 – S6K1; аналогичной с S6К1
доменной организацией; наличием гомологичных с S6К1 сайтов
фосфорилирования; наличием двух альтернативных стартов трансляции и
соответственно предположительно двух изоформ. Это дает основание считать
ее новой формой киназы рибосомного белка S6 – S6K2. Изучение
ферментативной активности рекомбинантной S6K2/II свидетельствует, что
S6K2/II еффективно фосфорилирует как субстрат рибосомный белок S6.

Киназа рибосомного белка S6 — S6К1 является одним из ключевых ферментов,
участвующим в регуляции индуцированного митогенными факторами белкового
синтеза, которая осуществляется путем активации трансляции мРНК
компонентов аппарата трансляции – рибосомных белков и факторов
эллонгации белкового синтеза. Известно, что на уровне S6K1 происходит
интеграция внеклеточных стимулов, индуцированных как митогенными
факторами, так и питательными веществами. При этом регуляция активности
осуществляется опосредованно — через РІ3К/mTOR-зависимый сигнальный
путь. Благодаря такой интеграции осуществляется дополнительный контроль
клеточного роста и пролиферации, поскольку активация белкового синтеза
осуществляется только при наличии обоих факторов.

Представленные данные свидетельствуют о том, что все вышеизложенное
может касаться и S6K2. Результаты мутационного анализа гомологичных S6K1
сайтов фосфорилирования у S6K2 подтверждают их важность для регуляции
активности киназы. Установлено, что митогенные стимулы также приводят к
значительной активации S6K2 в реакции фосфорилирования рибосомного белка
S6, а специфичные ингибиторы РІ3К и mTOR способны блокировать
стимулированную сывороткой крови активацию S6K2. Однако при этом
выявлены и существенные отличия в функционировании S6K1 и S6K2. Кинетика
активации киназ сывороткой, несмотря на двухфазный характер, существенно
отличается. Для S6K2 характерной оказалась более ранняя активация, по
сравнению с S6K1. Установлено, что S6K2 менее чувствительна к
ингибиторному воздействию рапамицина, что связано с особенностями
структуры регуляторной С-концевой области S6K1 и S6K2, поскольку ее
удаление приводит к снижению чувствительности S6K1, но при этом не имеет
эффекта для S6K2.

Исследование белков-партнеров S6K методом двугибридной системы дрожжей,
позволило идентифицировать кДНК КоА-синтазы и доказать, что это
бифункциональный фермент, что катализирует два последних этапа
биосинтеза КоА. Существование комплекса S6K и КоА-синтазы подтверждено в
клетках млекопитающих. Тем самым впервые показана связь между
сигнальными системами и системой биосинтеза КоА и соответственно целым
рядом метаболических процессов в клетке.

Экспериментально подтверждено, что РКС способна фосфорилировать S6K2 по
Ser486 как in vitro, так и in vivo, при этом фосфорилирование не влияет
на ферментативную активность S6K2. Установлено, что фосфорилирование по
этому сайту является ключевым для регулирования субклеточной локализации
S6K2, поскольку при этом происходит блокирование NLS, приводящее к
накоплению S6K2 в цитоплазме. Блокирование же ядерного экспорта
ингибитором ядерных пор лептомицином В приводит к накоплению S6K2 в ядре
клетки.

Таким образом, установлено существование постоянного обмена между
ядерной и цитоплазматической фракциями S6K2. Функция ядерного пула S6K2
на сегодня не исследована, однако она, возможно, связана с
использованием ядерных субстратов, которые могу быть общими с S6K1, а
именно — фактором транскрипции CREM и UBF. Нельзя исключить и
использования как субстрата ядерной фракции рибосомного белка S6. Таким
образом, ядерная функция S6K2 может быть связана с регуляцией
транскрипции целого спектра генов, в том числе и генов рибосомных РНК.

Целый ряд патологий, в первую очередь онкологических, сопровождается
существенными изменениями в функционировании сигнальных систем. Изучение
уровня экспрессии и субклеточной локализации S6K1 и S6K2 в разных типах
опухолей человека свидетельствует, что они претерпевают существенные
изменения по сравнению с таковыми в нормальных тканях. Содержание S6K в
злокачественных тканях оказалось более высоким. Кроме того, обнаружено
существенное накопление S6K в ядрах раковых клеток, причем в гораздо
большей мере это наблюдалось для S6K2. Более чем в 80 % случаев
аденокарциномы молочной железы детектировано высокое содержание S6K2.
Аналогичная тенденция, хотя и в меньшей степени, наблюдалась и для
злокачественных опухолей щитовидной железы и эндометрия.

Представленные данные свидетельствуют о существовании двух
высокогомологичных форм киназ рибосомного белка S6, которые проявляют
аналогичную субстратную специфичность. Функциональная же активность S6K1
и S6K2 благодаря отличиям в механизмах регуляции их активности и
субклеточной локализации может существенно отличаться. Можна
предположить, что функции S6K1/II связаны с цитоплазматическим
компартментом и, в первую очередь, с регуляцией трансляции мРНК. Функции
же S6K2 в большей степени ориентированы на ядро и, возможно, регуляцию
транскрипции генов, в том числе и рибосомных РНК. Однако есть
предпосылки считать, что многообразие функций S6K значительно шире.
Возникновение двух форм S6K в процессе эволюции, по-видимому, связано с
усложнением механизмов координированной регуляции биосинтеза белка.

Ключевые слова: сигнальные системы клетки, S6K1, S6K2, онкогенез,
мутагенез, КоА-синтаза, РКС, РІ3К, mTOR.

SUMMARY

Filonenko V. V. Structural and functional characteristics of ribosomal
protein S6 kinases — S6K1 and S6K2. –Manuscript.

Thesis for Doctor degree in Biology, speciality 03.00.03 – molecular
biology. – Institute of Molecular Biology and Genetics of National
Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2005.

A new mitogen-dependent kinase of ribosomal protein S6 – S6K2 have been
identified. S6K2 has a high level of structural homology with already
known ribosomal protein S6 kinase S6K1.

Similar to S6K1, PI3K/mTOR dependent signaling pathway have been
demonstrated to be involved in the regulation of S6K2 activity in
response to mitogenic stimuli.

In spite of high substrate specificity the presented data suggest the
sufficient differences in the kinase functioning in the cell due to
mechanisms of the regulation of activity and subcellular localization.
It was demonstrated that regulation of nuclear and cytoplasmic content
of S6K2 requires phosphorylation of Ser486 mediated by PKC.

The new S6K2 binding partner — CoA synthase has been identified by yeast
two-hybrid approach that suggest the possible link between PI3K
signaling and regulation of number of metabolic events in the cell.

An elevated level of S6K expression and accumulation of S6K1 and to the
greater extend S6K2 in the nuclei of malignant cells have been found in
different types of human tumors.

Key words: signal transduction pathways, S6K1, S6K2, oncogenes,
mutagens, CoA synthase, РКС, РІ3К, mTOR.

PAGE \* Arabic 6

Похожие записи