.

Стереологічне дослідження впливу епізодичної гіпоксії на розвиток деяких відділів головного мозку в експерименті (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 2561
Скачать документ

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

ХАРКІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ТАДТАЄВ Сергій Георгійович

УДК: 616.831.45 + 616.433(-053.31:618.33)-091:618.3-008.6

Стереологічне дослідження впливу епізодичної гіпоксії на розвиток деяких
відділів головного мозку в експерименті

14.03.02 – патологічна анатомія

Автореферат дисертації

на здобуття вченого ступеня

кандидата медичних наук

Харків – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському державному медичному університеті МОЗ
України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Яковцова Антоніна
Федорівна, Харківский державний медичний університет МОЗ України,
завідувач кафедри патологічної анатомії.

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Якимова Тамара
Петрівна, Інститут медичної радіології АМН України ім. С.П. Григор’єва,
м. Харків, головний науковий співробітник лабораторії патоморфології;

доктор медичних наук, професор Шлопов Валерій Геннадійович, Донецький
державний медичний університет ім. М. Горького, завідувач відділом
морфології ЦНІЛ.

Захист дисертації відбудеться 13 грудня 2007 року на засіданні
спеціалізованої Вченої Ради Д 64.600.01 при Харківському державному
медичному університеті МОЗ України (61022, м. Харків, проспект Леніна,
4).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Харківського державного
медичного університету (61022, м. Харків, проспект Леніна, 4).

Автореферат розісланий 13 листопада 2007 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук, професор Лазуренко В.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Хронічна епізодична гіпоксія (ХЕГ), що виникає
при деяких хворобах дихальної та серцево-судинної систем, є частим
явищем у дітей. Однією з найбільш поширених причин виникнення
епізодичної гіпоксії є обструктивне апное під час сну (ОАС), яким, по
різним оцінкам, страждають від 1 до 5 % дітей дошкільного віку (Ю. І.
Фещенко; Л. А. Яшина; М. А. Полянська та ін., 2003; И.А Кельмансон,
2002; G.M. Nixon, R.T. Brouillette, 2005).

Порушення поведінки і когнітивних здібностей є найбільш значним
наслідком ОАС у дітей. Дитяча ОАС пов’язана з порушеннями пам’яті і
моторних навиків (С.Л. Бабак, Л.А.Голубев, Р.А.Григорьянц, 1999; D.W.
Beebe et al., 2004; R.B. Mitchell, J.Kelly, 2006; H.E. Montgomery-Downs,
V.M. Crabtree, D. Gozal, 2005), що в комбінації з гіперактивністю (S.A.
Mulvaney et al., 2006; C.L. Rosen et al., 2004; M.S. Urschitz et al.,
2004) веде до зниження успішності в школі (D. Gozal, 1998; M.S. Urschitz
et al., 2003). Епідеміологічні дослідження указують на наявність
довготривалих когнітивних наслідків ОАС (D. Gozal, L. O’Brien, B.W. Row,
2004; D. Gozal, D.W. Pope, Jr., 2001).

Вважається, що когнітивні наслідки ОАС безпосередньо пов’язані з
морфофункціональними порушеннями в корі головного мозку і гіпокампі, що
викликаються, в основному, ХЕГ (L. Kubin, D. Gozal, M. Czyzyk-Krzeska,
2003). Більш того, вважається, що патологічні механізми ОАС, включаючи
ХЕГ, приводять до порушення центрального контролю верхніх дихальних
шляхів, що у свою чергу викликає хронізацію захворювання (A. Bradford,
M. McGuire, K.D. O’Halloran, 2005).

Експериментальні дослідження грають ключову роль в з’ясуванні патогенезу
ОАС, оскільки вони дозволяють з’ясувати індивідуальний внесок ХЕГ шляхом
проведення розділення патогенетичних механізмів захворювання, що не
представляється можливим в умовах клініки (D. Gozal, L.M. O’Brien,
2004). Більш того, тоді як загальний ефект дисфункції множинних систем
очевидний в клінічній картині ОАС, самі регіони ЦНС, в яких відбувається
дисфункція, характер морфологічних і функціональних порушень, властивих
дисфункції цих регіонів, а також їх точний внесок в клінічні наслідки
залишаються невідомими через відсутність патоморфологічного матеріалу. В
той же час, експериментальних досліджень, які б використовували точні
стереологічні морфометричні методи і стосувалися б питань впливу ХЕГ на
регіони ЦНС, що відповідають за когнітивні, поведінкові функції та
контроль верхніх дихальних шляхів, ще не проводилося.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконана відповідно щодо плану наукових досліджень Харківського
державного медичного університету і є фрагментом НДР “Порушення
механізмів інтегративних систем плоду в умовах материнського
неблагополуччя” (державний реєстраційний номер N0102U001871).

Дисертант безпосередньо брав участь у проведенні стереологічного
дослідження структур головного мозку експериментальних тварин що зазнали
впливу епізодичної гіпоксії під час розвитку. Автор самостійно провів
гістологічну та імуногістохімічну обробку експериментального матеріалу
та аналіз отриманих експериментальних даних під час виконання
дисертаційної роботи.

Мета і завдання дослідження. Метою цієї роботи було встановлення
патоморфологічних змін в корі головного мозку, гіпокампі, ядрі
під’язикового нерва і амбігуального ядра під впливом хронічної
епізодичної гіпоксії в ранньому онтогенезі в експерименті.

Для досягнення вказаної мети були поставлені наступні завдання:

Розробити адекватну неінвазивну експериментальну модель впливу хронічної
епізодичної гіпоксії в ранньому постнатальному періоді;

Виявити морфофункціональні особливості кори головного мозку, гіпокампу,
ядра під’язикового нерву і амбігуального ядра тварин експериментальної
та контрольної групи з використанням сучасних точних стереологічних
морфометричних методів;

Виявити особливості морфофункціональної перебудови кори головного мозку,
гіппокаму, ядра під’язикового нерву та амбігуального ядра під впливом
епізодичної гіпоксії з застосуванням імуногістохімічних методів;

Провести дисперсійний аналіз впливу хронічної епізодичної гіпоксії на
морфофункціональний стан кори головного мозку, гіппокаму, ядра
під’язикового нерву та амбігуального ядра у різні терміни після
завершення експериментальної процедури;

Сформулювати закономірності патоморфологічних змін в досліджуваних
структурах під впливом хронічної епізодичної гіпоксії, а також провести
оцінку можливості морфологічного відновлення досліджуваних структур
після завершення дії ХЕГ.

Об’єкт дослідження. Патологічна анатомія мозку під впливом хронічної
епізодичної гіпоксії.

Предмет дослідження. Кора головного мозку, гіпокамп, ядро під’язикового
нерву та амбігуальне ядро.

Методи дослідження. Макроскопічний, стереологічний, гістологічний,
гістохімічний, імуногістохімічний, статистичний.

Наукова новизна. Вперше на експериментальному матеріалі тканини мозку
щурів лінії Sprague-Dawley в результаті комплексного дослідження із
застосуванням морфологічного, морфометричного, імуногістохімічного і
статистичного методів, виявлені закономірні зміни в постнатальному
розвитку кори головного мозку, гіпокампу, ядра під’язикового нерва і
амбігуального ядра, обумовлені впливом хронічної епізодичної гіпоксії.

Результати роботи розширюють наявні представлення про роль і значення
ХЕГ у патогенезі й морфогенезі ОАС у дітей. У результаті комплексного
дослідження центральної нервової системи щурів при дії ХЕГ вперше
встановлено патогенез змін, що ведуть когнитивних та поведінкових
порушень. Зазначено, що при ураженні структур ЦНС хронічною епізодичною
гіпоксією спостерігається низка патологічних змін, таких як зменшення
кількості нейронів і гліоцитів, астрогліоз в пірамідальному шарі СА1
поля гіппокампу, зниження об’ъему ядер нейронів в ядрі під’язичного
нерву, наявність гендер-залежного дисбалансу кількості гліоцитів та
збільшення кількості нейронів в корі головного мозку.

Встановлені характер, спрямованість і причинно-наслідкові зв’язки
спостережуваних морфологічних змін і поведінкових і когнітивних
порушень, а також змін в контролі верхніх дихальних шляхів, характерних
для даної експериментальної моделі. Проведена оцінка можливості
морфологічного відновлення досліджуваних структур після завершення
експериментальної дії, а також екстраполяція експериментальних даних на
наслідки ОАС у дітей.

Вперше був виявлений гендер-залежний характер відновлення
гіпокампального поля СА1 після закінчення дії ХЕГ, що корелює з
когнитивним відновленням характерним для застосованої експериментальної
модели і, таким чином, вказує на можливість терапевтичного використання
механізмів цього відновлення. Вперше встановленний довготривалий вплив
ХЕГ на морфофункціональний стан нейронів ядра під’язикового нерву, що
може вказувати як на хронічную дисфункцію контролю м’язів верхніх
дихальних шляхів та і можливість рецидиву ОАС.

Практична значущість роботи. Проведене комплексне дослідження морфології
кори головного мозку, гіпокампу, ядра під’язикового нерва і
амбігуального ядра дозволило з’ясувати особливості впливу частої в
постнатальному онтогенезі хронічної епізодичної гіпоксії на розвиток цих
структур ЦНС. Виявлені зміни і закономірності відкривають нові аспекти
патогенезу хронічної епізодичної гіпоксії і дозволяють проведення
екстраполяції і пояснення когнітивних і поведінкових порушень у дітей з 
ОАС.

Матеріали роботи були впроваджені у навчальний процес кафедр
патологічної анатомії; гістології, цитології та ембріології;
патологічної фізіології Харківського державного медичного університету,
кафедри патологічної анатомії Харківського державного університету ім.
Каразіна, кафедри патологічної анатомії Харківської медичної академії
післядипломної освіти.

Особистий внесок здобувача. Ідея роботи, напрямок, обсяг і методи
дослідження визначені разом з науковим керівником, професором
А.Ф. Яковцовою. Автор брав безпосередню участь у плануванні
експериментальних процедур з ХЕГ, що проводилися у
науково-дослідницькому інституті при дитячий лікарні Kosair (Луісвілль,
США), під керівництвом професора D. Gozal. Самостійно автором був
проведений повний обсяг роботи з гістологічної обробки
експериментального матеріалу, імуногістохімії та стереологічного аналізу
при консультативній підтримці Dr. T. Ansari та Dr. P. Sibbons, що
очолюють відділ патоморфології при науково-дослідницькому інституті
Northwick Park (Лондон, Велікобрітанія). Статистична обробка матеріалу
проводилася особисто автором при консультативній підтримці спеціаліста
із статистики P. Bassett. У аналізі й узагальненях отриманих
результатів, у спільних наукових виданнях авторові дисертації належить
75 % ідей та розробок.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались на
20-ій конференції объєднанних спілок дослідження сну (APSS) (2006,
Солт-лейк-сіті, США), щорічній конференції американської торакальної
спілки (2006, Сан-діего, США), Всеукраїнській науково-практичній
конференції “Сучасні проблеми морфології” (2006, Полтава, Україна), 24й
щорічній конференції “Порушення сну у дітей” (2006, Ранчо Міраж, США),
VII науковій конференції молодих вчених з міжнародною участю,
присвяченій пам’яти академіка В.В.Фролькіса (2006, Київ, Україна), 18 
конференції спілки нейроанатомії (2005, Брайтон, Велікобрітанія), в
палаті общин парламенту Велікобрітанії з приводу десятиріччя з моменту
заснування Northwick Park Institute for Medical Research (2004, Лондон,
Велікобрітанія) .

Публікації. По темі дисертації опубліковано 4 статті в спеціалізованих
журналах, які входять в затверджений ВАК України список наукових видань,
і 4 роботи у вигляді тез доповідей в матеріалах міжнародних і
республіканських конференцій.

Структура дисертації. Дисертація викладена на 172 сторінках
машинописного тексту, складається зі вступу, огляду літератури, 5
розділів матеріалів власних досліджень, обговорення, виводів, списку
використаних літературних джерел, додатків. Бібліографія містить 334
назви (у тому числі україно- і російськомовних – 31, на інших мовах 303)
на 36 сторінках. Робота ілюстрована 48 таблицями і 45 малюнками, зокрема
8 мікрофотографіями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень. Дослідження було проведене в співпраці з
інститутом медичних досліджень Northwick Park (Лондон, Великобританія) і
науково-дослідним інститутом при дитячій лікарні Kosair (Луїсвілль,
США).

Для досягнення мети та розв’язання задань дослідження був поставленний
експеримент з використанням щурів лінії Sprague-Dawley. В цілому, в
роботі було використано 48 щурів обох статей: 24 – в групі контролю і 24
в експериментальній групі. Профіль епізодичної гіпоксії задавався шляхом
заміни кімнатного повітря в камерах апарату Oxycycler моделі А44ХO
(Reming Bioinstruments, Нью Йорк, США) на газову суміш, що містить 10 %
O2 кожні 90 секунд на протязі 24 годин на добу. Тварини
експериментальної групи піддавалися дії епізодичної гіпоксії з 10 по 25
день після народження, тоді як контрольна група знаходилися в сусідніх
камерах в умовах циркулюючого кімнатного повітря. Одна третина тварин
експериментальної і контрольної груп була виведена з експерименту з
використанням перфузійної фіксації 4 % нейтральним розчином
формальдегіду у віці чотирьох, восьми і двадцяти тижнів.

Після закінчення фіксації в розчині формаліну з мозку щурів з
використанням скальпеля і диссекційного мікроскопа Wild Heerbrugg
виділявся передній мозок, що містив кору і гіпокамп, і довгастий мозок,
що містив амбігуальне ядро і ядро під’язикового нерва. З метою
привнесення елементу систематичної випадкової вибірки відповідно до
вимог стереологічних методів (R.E. Miles, P.J. Davy, 1976; A. Stuart,
1976), вищезгадані частини мозку щурів заливалися 2% розчином агару,
нарізалися на блоки завтовшки в 1,97 мм і проводилися в парафін.

Виготовлені гістологічні зрізи товщиною 30 мкм поміщалися на
гістологічні скельця, покриті 2 %  розчином 3-амінопропіл-триетоксілану
(APTS). Готові зрізи забарвлювалися гематоксилином по Майєру, а також з
використанням непрямого авідин-біотинового методу для імуногістохімічної
візуалізації гліального фібрілярного кислого білка (ГФКБ) і білка
нейрональної ізоформи синтази оксиду азоту (nNO-синтази).

Оцінка об’єму структур, щільності нейронів і кліток глії, об’єму ядер
нейронів, а також загальної кількості нейронів і кліток глії в
досліджуваних структурах проводилася за допомогою стереологічної
морфометрії (методи Кавальері, нуклеатор та оптичний дисектор). Об’єм
структур оцінювався з використанням методу Кавальєрі, шляхом підрахунку
відміток, співпадаючих з досліджуваною структурою на проектованому і
оцифрованому гістологічному зрізі за допомогою апарату Canon FR100 і
програми Histometrix версії 5.0. Оцінка об’єму ядер нейронів, чисельної
щільності і загальної кількості нейронів і кліток глії проводилася за
допомогою методу нуклеатора та оптичного дисектора, програми Histometrix
версії 5.0, мікроскопа Leitz Laborlux S, іммерсійного об’єктиву Leitz
NPL Fluotar 1.32 із збільшенням X100, мікрометрів Heidenhain MT60K і
Heidenhain ND281A, відеокамери FVS CL600 і персонального комп’ютера
Pentium III з відеокартою Matrox Meteor 2.

Статистичний аналіз включав підрахунок коефіцієнта помилки (СЕ) для
кожної стереологичної оцінки об’єму, щільності і кількості. Оскільки
отримані дані мали нормальний розподіл, то статистичний аналіз впливу
ХЕГ з урахуванням статі і віку тварини на динаміку змін морфометричних
параметрів проводився шляхом порівняння контрольної і експериментальної
груп з використанням трьохфакторного дисперсійного аналізу на основі
програм Statistica версії 6.0 і Stata версії 9.0.

Результати власних досліджень та їх обговорення. Дія ХЕГ призводила до
зниження маси тіла самців, але не самок щурів, найбільш вираженому у
віці 8 тижнів (322,25±8,02 грам, 245,50±4.86 грам, p68:x®n r t ? U DB r t r t JUMoeoeoeoeoeoeeTHAEAEAEAEAE???????? & R Вплив ХЕГ на розвиток амбігуального ядра був обмежений транзиторним астрогліозом і підвищенням активності ГФКБ у щурів у віці 4 і 8 тижнів, а також помірним зниженням об'єму структури, що було виявлене за допомогою дисперсійного аналізу (різниця середніх -0,18x10-11м3 (довірчий інтервал -0,33, -0,03, р=0,017). Об’ем ядра під'язикового нерва зростав з віком щурів з 2,29x10-10м3± 0,07x10-10м3 у 4 тижня до 2,17x10-10м3± 0.11x10-10м3 у 8 тижнів та 2,64x10-10м3±0,12x10-10м3 у 20 тижнів (р=0,005). Вплив ХЕГ приводив до зменшення об’ему ядра у самців щурів (різниця середніх -0.23x10-10м3, p=0,05, довірчий інтервал -0.45, 0.00), та збільшення об’ему ядра у самок (різниця середніх 0,27x10-10м3 (p=0,02, довірчий інтервал 0,05, 0,50). Об’ем ядер нейронів в ядрі під'язикового нерва щурів зростав з віком незалежно від статі тварин, з 315,17x10-16м3±8,52x10-16м3 в 4 тижні до 547,17x10-16м3±16,54x10-16м3 у 8 тижнів та 937,50x10-16м3± 32,20x10-16м3 у 20 тижнів (р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020