МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

ХАРКІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ТАДТАЄВ Сергій Георгійович

УДК: 616.831.45 + 616.433(-053.31:618.33)-091:618.3-008.6

Стереологічне дослідження впливу епізодичної гіпоксії на розвиток деяких
відділів головного мозку в експерименті

14.03.02 — патологічна анатомія

Автореферат дисертації

на здобуття вченого ступеня

кандидата медичних наук

Харків – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському державному медичному університеті МОЗ
України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Яковцова Антоніна
Федорівна, Харківский державний медичний університет МОЗ України,
завідувач кафедри патологічної анатомії.

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Якимова Тамара
Петрівна, Інститут медичної радіології АМН України ім. С.П. Григор’єва,
м. Харків, головний науковий співробітник лабораторії патоморфології;

доктор медичних наук, професор Шлопов Валерій Геннадійович, Донецький
державний медичний університет ім. М. Горького, завідувач відділом
морфології ЦНІЛ.

Захист дисертації відбудеться 13 грудня 2007 року на засіданні
спеціалізованої Вченої Ради Д 64.600.01 при Харківському державному
медичному університеті МОЗ України (61022, м. Харків, проспект Леніна,
4).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Харківського державного
медичного університету (61022, м. Харків, проспект Леніна, 4).

Автореферат розісланий 13 листопада 2007 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук, професор Лазуренко В.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Хронічна епізодична гіпоксія (ХЕГ), що виникає
при деяких хворобах дихальної та серцево-судинної систем, є частим
явищем у дітей. Однією з найбільш поширених причин виникнення
епізодичної гіпоксії є обструктивне апное під час сну (ОАС), яким, по
різним оцінкам, страждають від 1 до 5 % дітей дошкільного віку (Ю. І.
Фещенко; Л. А. Яшина; М. А. Полянська та ін., 2003; И.А Кельмансон,
2002; G.M. Nixon, R.T. Brouillette, 2005).

Порушення поведінки і когнітивних здібностей є найбільш значним
наслідком ОАС у дітей. Дитяча ОАС пов’язана з порушеннями пам’яті і
моторних навиків (С.Л. Бабак, Л.А.Голубев, Р.А.Григорьянц, 1999; D.W.
Beebe et al., 2004; R.B. Mitchell, J.Kelly, 2006; H.E. Montgomery-Downs,
V.M. Crabtree, D. Gozal, 2005), що в комбінації з гіперактивністю (S.A.
Mulvaney et al., 2006; C.L. Rosen et al., 2004; M.S. Urschitz et al.,
2004) веде до зниження успішності в школі (D. Gozal, 1998; M.S. Urschitz
et al., 2003). Епідеміологічні дослідження указують на наявність
довготривалих когнітивних наслідків ОАС (D. Gozal, L. O’Brien, B.W. Row,
2004; D. Gozal, D.W. Pope, Jr., 2001).

Вважається, що когнітивні наслідки ОАС безпосередньо пов’язані з
морфофункціональними порушеннями в корі головного мозку і гіпокампі, що
викликаються, в основному, ХЕГ (L. Kubin, D. Gozal, M. Czyzyk-Krzeska,
2003). Більш того, вважається, що патологічні механізми ОАС, включаючи
ХЕГ, приводять до порушення центрального контролю верхніх дихальних
шляхів, що у свою чергу викликає хронізацію захворювання (A. Bradford,
M. McGuire, K.D. O’Halloran, 2005).

Експериментальні дослідження грають ключову роль в з’ясуванні патогенезу
ОАС, оскільки вони дозволяють з’ясувати індивідуальний внесок ХЕГ шляхом
проведення розділення патогенетичних механізмів захворювання, що не
представляється можливим в умовах клініки (D. Gozal, L.M. O’Brien,
2004). Більш того, тоді як загальний ефект дисфункції множинних систем
очевидний в клінічній картині ОАС, самі регіони ЦНС, в яких відбувається
дисфункція, характер морфологічних і функціональних порушень, властивих
дисфункції цих регіонів, а також їх точний внесок в клінічні наслідки
залишаються невідомими через відсутність патоморфологічного матеріалу. В
той же час, експериментальних досліджень, які б використовували точні
стереологічні морфометричні методи і стосувалися б питань впливу ХЕГ на
регіони ЦНС, що відповідають за когнітивні, поведінкові функції та
контроль верхніх дихальних шляхів, ще не проводилося.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконана відповідно щодо плану наукових досліджень Харківського
державного медичного університету і є фрагментом НДР “Порушення
механізмів інтегративних систем плоду в умовах материнського
неблагополуччя” (державний реєстраційний номер N0102U001871).

Дисертант безпосередньо брав участь у проведенні стереологічного
дослідження структур головного мозку експериментальних тварин що зазнали
впливу епізодичної гіпоксії під час розвитку. Автор самостійно провів
гістологічну та імуногістохімічну обробку експериментального матеріалу
та аналіз отриманих експериментальних даних під час виконання
дисертаційної роботи.

Мета і завдання дослідження. Метою цієї роботи було встановлення
патоморфологічних змін в корі головного мозку, гіпокампі, ядрі
під’язикового нерва і амбігуального ядра під впливом хронічної
епізодичної гіпоксії в ранньому онтогенезі в експерименті.

Для досягнення вказаної мети були поставлені наступні завдання:

Розробити адекватну неінвазивну експериментальну модель впливу хронічної
епізодичної гіпоксії в ранньому постнатальному періоді;

Виявити морфофункціональні особливості кори головного мозку, гіпокампу,
ядра під’язикового нерву і амбігуального ядра тварин експериментальної
та контрольної групи з використанням сучасних точних стереологічних
морфометричних методів;

Виявити особливості морфофункціональної перебудови кори головного мозку,
гіппокаму, ядра під’язикового нерву та амбігуального ядра під впливом
епізодичної гіпоксії з застосуванням імуногістохімічних методів;

Провести дисперсійний аналіз впливу хронічної епізодичної гіпоксії на
морфофункціональний стан кори головного мозку, гіппокаму, ядра
під’язикового нерву та амбігуального ядра у різні терміни після
завершення експериментальної процедури;

Сформулювати закономірності патоморфологічних змін в досліджуваних
структурах під впливом хронічної епізодичної гіпоксії, а також провести
оцінку можливості морфологічного відновлення досліджуваних структур
після завершення дії ХЕГ.

Об’єкт дослідження. Патологічна анатомія мозку під впливом хронічної
епізодичної гіпоксії.

Предмет дослідження. Кора головного мозку, гіпокамп, ядро під’язикового
нерву та амбігуальне ядро.

Методи дослідження. Макроскопічний, стереологічний, гістологічний,
гістохімічний, імуногістохімічний, статистичний.

Наукова новизна. Вперше на експериментальному матеріалі тканини мозку
щурів лінії Sprague-Dawley в результаті комплексного дослідження із
застосуванням морфологічного, морфометричного, імуногістохімічного і
статистичного методів, виявлені закономірні зміни в постнатальному
розвитку кори головного мозку, гіпокампу, ядра під’язикового нерва і
амбігуального ядра, обумовлені впливом хронічної епізодичної гіпоксії.

Результати роботи розширюють наявні представлення про роль і значення
ХЕГ у патогенезі й морфогенезі ОАС у дітей. У результаті комплексного
дослідження центральної нервової системи щурів при дії ХЕГ вперше
встановлено патогенез змін, що ведуть когнитивних та поведінкових
порушень. Зазначено, що при ураженні структур ЦНС хронічною епізодичною
гіпоксією спостерігається низка патологічних змін, таких як зменшення
кількості нейронів і гліоцитів, астрогліоз в пірамідальному шарі СА1
поля гіппокампу, зниження об’ъему ядер нейронів в ядрі під’язичного
нерву, наявність гендер-залежного дисбалансу кількості гліоцитів та
збільшення кількості нейронів в корі головного мозку.

Встановлені характер, спрямованість і причинно-наслідкові зв’язки
спостережуваних морфологічних змін і поведінкових і когнітивних
порушень, а також змін в контролі верхніх дихальних шляхів, характерних
для даної експериментальної моделі. Проведена оцінка можливості
морфологічного відновлення досліджуваних структур після завершення
експериментальної дії, а також екстраполяція експериментальних даних на
наслідки ОАС у дітей.

Вперше був виявлений гендер-залежний характер відновлення
гіпокампального поля СА1 після закінчення дії ХЕГ, що корелює з
когнитивним відновленням характерним для застосованої експериментальної
модели і, таким чином, вказує на можливість терапевтичного використання
механізмів цього відновлення. Вперше встановленний довготривалий вплив
ХЕГ на морфофункціональний стан нейронів ядра під’язикового нерву, що
може вказувати як на хронічную дисфункцію контролю м’язів верхніх
дихальних шляхів та і можливість рецидиву ОАС.

Практична значущість роботи. Проведене комплексне дослідження морфології
кори головного мозку, гіпокампу, ядра під’язикового нерва і
амбігуального ядра дозволило з’ясувати особливості впливу частої в
постнатальному онтогенезі хронічної епізодичної гіпоксії на розвиток цих
структур ЦНС. Виявлені зміни і закономірності відкривають нові аспекти
патогенезу хронічної епізодичної гіпоксії і дозволяють проведення
екстраполяції і пояснення когнітивних і поведінкових порушень у дітей з 
ОАС.

Матеріали роботи були впроваджені у навчальний процес кафедр
патологічної анатомії; гістології, цитології та ембріології;
патологічної фізіології Харківського державного медичного університету,
кафедри патологічної анатомії Харківського державного університету ім.
Каразіна, кафедри патологічної анатомії Харківської медичної академії
післядипломної освіти.

Особистий внесок здобувача. Ідея роботи, напрямок, обсяг і методи
дослідження визначені разом з науковим керівником, професором
А.Ф. Яковцовою. Автор брав безпосередню участь у плануванні
експериментальних процедур з ХЕГ, що проводилися у
науково-дослідницькому інституті при дитячий лікарні Kosair (Луісвілль,
США), під керівництвом професора D. Gozal. Самостійно автором був
проведений повний обсяг роботи з гістологічної обробки
експериментального матеріалу, імуногістохімії та стереологічного аналізу
при консультативній підтримці Dr. T. Ansari та Dr. P. Sibbons, що
очолюють відділ патоморфології при науково-дослідницькому інституті
Northwick Park (Лондон, Велікобрітанія). Статистична обробка матеріалу
проводилася особисто автором при консультативній підтримці спеціаліста
із статистики P. Bassett. У аналізі й узагальненях отриманих
результатів, у спільних наукових виданнях авторові дисертації належить
75 % ідей та розробок.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались на
20-ій конференції объєднанних спілок дослідження сну (APSS) (2006,
Солт-лейк-сіті, США), щорічній конференції американської торакальної
спілки (2006, Сан-діего, США), Всеукраїнській науково-практичній
конференції “Сучасні проблеми морфології” (2006, Полтава, Україна), 24й
щорічній конференції “Порушення сну у дітей” (2006, Ранчо Міраж, США),
VII науковій конференції молодих вчених з міжнародною участю,
присвяченій пам’яти академіка В.В.Фролькіса (2006, Київ, Україна), 18 
конференції спілки нейроанатомії (2005, Брайтон, Велікобрітанія), в
палаті общин парламенту Велікобрітанії з приводу десятиріччя з моменту
заснування Northwick Park Institute for Medical Research (2004, Лондон,
Велікобрітанія) .

Публікації. По темі дисертації опубліковано 4 статті в спеціалізованих
журналах, які входять в затверджений ВАК України список наукових видань,
і 4 роботи у вигляді тез доповідей в матеріалах міжнародних і
республіканських конференцій.

Структура дисертації. Дисертація викладена на 172 сторінках
машинописного тексту, складається зі вступу, огляду літератури, 5
розділів матеріалів власних досліджень, обговорення, виводів, списку
використаних літературних джерел, додатків. Бібліографія містить 334
назви (у тому числі україно- і російськомовних — 31, на інших мовах 303)
на 36 сторінках. Робота ілюстрована 48 таблицями і 45 малюнками, зокрема
8 мікрофотографіями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень. Дослідження було проведене в співпраці з
інститутом медичних досліджень Northwick Park (Лондон, Великобританія) і
науково-дослідним інститутом при дитячій лікарні Kosair (Луїсвілль,
США).

Для досягнення мети та розв’язання задань дослідження був поставленний
експеримент з використанням щурів лінії Sprague-Dawley. В цілому, в
роботі було використано 48 щурів обох статей: 24 – в групі контролю і 24
в експериментальній групі. Профіль епізодичної гіпоксії задавався шляхом
заміни кімнатного повітря в камерах апарату Oxycycler моделі А44ХO
(Reming Bioinstruments, Нью Йорк, США) на газову суміш, що містить 10 %
O2 кожні 90 секунд на протязі 24 годин на добу. Тварини
експериментальної групи піддавалися дії епізодичної гіпоксії з 10 по 25
день після народження, тоді як контрольна група знаходилися в сусідніх
камерах в умовах циркулюючого кімнатного повітря. Одна третина тварин
експериментальної і контрольної груп була виведена з експерименту з
використанням перфузійної фіксації 4 % нейтральним розчином
формальдегіду у віці чотирьох, восьми і двадцяти тижнів.

Після закінчення фіксації в розчині формаліну з мозку щурів з
використанням скальпеля і диссекційного мікроскопа Wild Heerbrugg
виділявся передній мозок, що містив кору і гіпокамп, і довгастий мозок,
що містив амбігуальне ядро і ядро під’язикового нерва. З метою
привнесення елементу систематичної випадкової вибірки відповідно до
вимог стереологічних методів (R.E. Miles, P.J. Davy, 1976; A. Stuart,
1976), вищезгадані частини мозку щурів заливалися 2% розчином агару,
нарізалися на блоки завтовшки в 1,97 мм і проводилися в парафін.

Виготовлені гістологічні зрізи товщиною 30 мкм поміщалися на
гістологічні скельця, покриті 2 %  розчином 3-амінопропіл-триетоксілану
(APTS). Готові зрізи забарвлювалися гематоксилином по Майєру, а також з
використанням непрямого авідин-біотинового методу для імуногістохімічної
візуалізації гліального фібрілярного кислого білка (ГФКБ) і білка
нейрональної ізоформи синтази оксиду азоту (nNO-синтази).

Оцінка об’єму структур, щільності нейронів і кліток глії, об’єму ядер
нейронів, а також загальної кількості нейронів і кліток глії в
досліджуваних структурах проводилася за допомогою стереологічної
морфометрії (методи Кавальері, нуклеатор та оптичний дисектор). Об’єм
структур оцінювався з використанням методу Кавальєрі, шляхом підрахунку
відміток, співпадаючих з досліджуваною структурою на проектованому і
оцифрованому гістологічному зрізі за допомогою апарату Canon FR100 і
програми Histometrix версії 5.0. Оцінка об’єму ядер нейронів, чисельної
щільності і загальної кількості нейронів і кліток глії проводилася за
допомогою методу нуклеатора та оптичного дисектора, програми Histometrix
версії 5.0, мікроскопа Leitz Laborlux S, іммерсійного об’єктиву Leitz
NPL Fluotar 1.32 із збільшенням X100, мікрометрів Heidenhain MT60K і
Heidenhain ND281A, відеокамери FVS CL600 і персонального комп’ютера
Pentium III з відеокартою Matrox Meteor 2.

Статистичний аналіз включав підрахунок коефіцієнта помилки (СЕ) для
кожної стереологичної оцінки об’єму, щільності і кількості. Оскільки
отримані дані мали нормальний розподіл, то статистичний аналіз впливу
ХЕГ з урахуванням статі і віку тварини на динаміку змін морфометричних
параметрів проводився шляхом порівняння контрольної і експериментальної
груп з використанням трьохфакторного дисперсійного аналізу на основі
програм Statistica версії 6.0 і Stata версії 9.0.

Результати власних досліджень та їх обговорення. Дія ХЕГ призводила до
зниження маси тіла самців, але не самок щурів, найбільш вираженому у
віці 8 тижнів (322,25±8,02 грам, 245,50±4.86 грам, p<0,001), що узгоджується з експериментальними даними інших дослідників (A. Kanaan et al., 2006; M.L. Schwartz et al., 2004; Z. Simonova et al., 2003), затримкою у фізичному розвитку у дітей з ОАС (A.D. Everett, W.C. Koch, F.T. Saulsbury, 1987), і, видно, має багатофакторний патогенез, що включає дисфункцію гіпоталамо-гіпофізально-гонадної осі та виявляється у гіпогонадизмі, зниженному вмісті циркулюючого аналогічного інсуліну фактору росту-1 і гормону росту у сироватці крові та порушенні його секреції у відповідності з циркадним ритмом. Тоді як ХЕГ не мала вираженого впливу на масу мозку та імунореактивність nNO-синтази в корі головного мозку тварин експериментальної групи, було відмічено зниження об'єму кори, особливо виражене у тварин у віці 4 тижнів (1,87x10-7м3±0,03x10-7м3, 1,76x10-7м3±0,04x10-7м3, р=0,038), що виникає із-за ХЕГ-індукованих змін в об'ємі кортикального нейропілю. Кількість клітин глії в корі головного мозку зростала з віком тварин незалежно від статі з 1,82x107±0,15x107 в 4 тижня до 2,03x107±0,06x107 в 8 тижнів та 2,53x107±0,79x107 в 20 тижнів (р<0,001). Крім того, дане дослідження встановило, що під впливом ХЕГ в корі головного мозку тварин віку 4 і 8 тижнів відбувається складна реорганізація кліток глії з підвищенням імунореактивності ГФКБ у самців щурів і зниженням ГФКБ і кількості клітин глії у самок (1,62x107±0,12x107; 2,12x107±0,09x107, p<0,019). Оскільки ранній постнатальний період є критичним часом для гліогенеза, і, особливо, олігодендрогліогенеза, подібні зміни можуть приводити до довготривалого порушення мієлінізації і лежати в основі функціональних дефіцитів що відмічаються у щурів під впливом ХЕГ. Дані, приведені в цій роботі, свідчать про зростання об'єму ядер нейронів в корі головного мозку з віком, незалежно від статі тварин, з 188,29x10-16м3±6,61x10-16м3 в 4 тижні до 204,25x10-16м3±2,66x10-16м3 в 8 тижнів і 254,25x10-16м3±6,01x10-16м3 в 20 тижнів (р<0,001), який корелював із зростанням цього показника в інших вивчених структурах головного мозку щурів. Проте ХЕГ не призводила до зміни цього показника нейронів кори головного мозку. Дисперсійний аналіз виявив підвищення кількості нейронів в корі головного мозку щурів всіх вікових груп під впливом ХЕГ, особливо помітне у самців у віці 4 тижнів (3,02x107±0,06x107, 3,49x107±0,09x107, p=0,007), яке імовірно виникає завдяки посиленню нейрогенеза і міграції клітин-попередників нейронів. Проте, відсутність кореляції цього збільшення з функціональними порушеннями, що виникають в цій експериментальній моделі, говорить про неповну інтеграцію цих нових нейронів в існуючі нейронні мережі або про дисфункцію самих нейронних мереж із-за порушення мієлінізації. Об’ем гіпокампального регіона СА1 зростав з віком тварин незалежно від статі з 7,66x10-10м3±0,24x10-10м3 у 4 тижня до 7,82x10-10м3±0,24x10-10м3 в 8 тижнів та 8,14x10-10м3±0,24x10-10м3 в 20 тижнів (р=0,005), що корелювало із зростанням об’ему ядер нейронів у цьому регіоні з 276,29x10-16м3±9,56x10-16м3 у віці 4 тижнів до 294,50x10-16м3±8,29x10-16м3 в 8 тижнів та 340,50x10-16м3±7,66x10-16м3 у 20 тижнів (р<0,001), та з динамикою кількості клітин глії – 7,76x104±0,72x104 в 4 тижня, 7,98x104±0,34x104 в 8 тижнів та 8,54x104±1,08x104 в 20 тижнів (р=0.016). Тоді як ХЕГ не впливала на об'єм гіпокампального поля СА1 і об'єм ядер гіпокампальних нейронів, виявлялося значне зниження кількості нейронів (7,43x105±0,31x105, 5,88x105±0,57x105, р=0,03) і нейроглії (7,76x104±0,72x104, 4,31x104±0,72x104, р=0,006) в цьому регіоні у самок і самців щурів у віці 4 тижнів. Більш того, в СА1 самців щурів експериментальної групи у віці 8 і 20 тижнів була помітна підвищена експресія астрогліального маркеру ГФКБ, що говорить про астрогліоз і, таким чином, відображає великий ступінь пошкодження цієї структури у самців щурів дією ХЕГ. Імовірно, що ХЕГ має найбільш негативний вплив на олігодендроцити гіппокампу щурів. Більш того, період експериментального впливу ХЕГ у застосованій експериментальній моделі збігався з критичним періодом постнатального розвитку олігодендроцитів та міелінізації провідних путів гіппокампу щурів. Зниження ефективності виконання гіппокамп-залежних завдань по завершенню ХЕГ процедур є чітко встановленим у молодих гризунів, що говорить о кореляцію виявленого нейронального та гліального дефіциту в СА1 з функціональними порушеннями, і його ключовій ролі в ранніх когнітивних порушеннях при застосуванні ХЕГ. По закінченню експериментальної процедури було помітне кількісне відновлення поля СА1 з однаковою кількістю нейронів у самців експериментальної і контрольної групи у віці 8 і 20 тижнів, тоді як у самок експериментальної групи кількість нейронів перевищувала таке у самок контрольної групи у віці 8 тижнів (7,13x105±0,20x105 і 8,70x105±0,44x105, р=0,019) і 20 тижнів (5,79x105±0,37x105 і 7,58x105± 0,42x105, р=0,019). Відомо, що гіпокамп ссавців характеризується пластичністю та здатністю до функціонального та кількісного відновлення після ішемічних, гіпоксичних та хімічних уражень. Таким чином, було встановлено, що вплив ХЕГ приводить до нейрогенезу та міграції клітин-попередників до гіпокампу, що приводить до значного відновлення його структури та функції. Слід зазначити, що гендерні відмінності в характері морфологічного відновлення СА1 поля гіпокампу корелюють з відмінностями у функціональному відновленні по завершенню ХЕГ (L.Kheirandish et al., 2005). - " $ & B 0 D 6 8 : x ® n r t ? U DB r t r t JUMoeoeoeoeoeoeeTHAEAEAEAEAE???????? & R Вплив ХЕГ на розвиток амбігуального ядра був обмежений транзиторним астрогліозом і підвищенням активності ГФКБ у щурів у віці 4 і 8 тижнів, а також помірним зниженням об'єму структури, що було виявлене за допомогою дисперсійного аналізу (різниця середніх -0,18x10-11м3 (довірчий інтервал -0,33, -0,03, р=0,017). Об’ем ядра під'язикового нерва зростав з віком щурів з 2,29x10-10м3± 0,07x10-10м3 у 4 тижня до 2,17x10-10м3± 0.11x10-10м3 у 8 тижнів та 2,64x10-10м3±0,12x10-10м3 у 20 тижнів (р=0,005). Вплив ХЕГ приводив до зменшення об’ему ядра у самців щурів (різниця середніх -0.23x10-10м3, p=0,05, довірчий інтервал -0.45, 0.00), та збільшення об’ему ядра у самок (різниця середніх 0,27x10-10м3 (p=0,02, довірчий інтервал 0,05, 0,50). Об’ем ядер нейронів в ядрі під'язикового нерва щурів зростав з віком незалежно від статі тварин, з 315,17x10-16м3±8,52x10-16м3 в 4 тижні до 547,17x10-16м3±16,54x10-16м3 у 8 тижнів та 937,50x10-16м3± 32,20x10-16м3 у 20 тижнів (р<0,001). Стереологічний аналіз впливу ХЕГ на ядро під'язикового нерва показав збільшення кількості нейронів в структурі у самок щурів (7,18x103±0,74x103, 8,99x103±0,15x103, p=0,039), а також стійке зниження об'єму ядер нейронів, що входять до складу цієї структури, помітне у всіх вікових групах і особливо – у віці 4 тижнів (315,17x10-16м3±8,52x10-16м3, 276,57x10-16м3±6,63x10-16м3, р=0,004) і 8 тижнів (547,17x10-16м3±16,54x10-16м3, 427,83x10-16м3±19,71x10-16м3, р=0,001). ХЕГ також призводила до стійкого зниження кількості кліток глії в ядрі під'язикового нерва, найбільш виражене у тварин у віці 4 тижнів (1,54x104±0,05x104, 1,14x104±0,15x104, р=0,037) і 8 тижнів (1,71x104±0,05x104, 1,44x104±0,07x104, р=0,012). Відомо, що об'єм ядра нейрону тісно пов'язаний з деякими іншими морфологічними параметрами нейрона, включаючи розмір перикаріона, ступінь арборизації дендритів і кількість пост-синаптичних дендритичних терміналів, що дозволяє підозрювати ХЕГ в порушенні постнатального ультраструктурного розвитку нейронів ядра під'язикового нерва. Такі нейрональні зміни у поєднанні із стійким дефіцитом кліток глії, спостережуваним в структурі, можуть пояснити функціональні порушення в контролі верхніх дихальних шляхів при ХЕГ (S.C. Veasey et al., 2004). Аналіз отриманих результатів дослідження дозволяє зробити висновок про те, що вплив ХЕГ на розвиток чотирьох структур мозку характеризується комбінацією довготривалих деструктивних і адаптивних морфологічних змін, які можуть лежати в основі функціональних змін, як в експериментальних моделях ХЕГ, так і у дітей з ОАС. ВИСНОВКИ Здійснені в даній дисертаційній роботи дослідження дозволили вирішити актуальну задачу патологічної анатомії – визначення морфофункціональних змін у корі, гіпокампі, ядрі під’язичного нерву та амбігуальному ядрі під впливом ХЕГ під час постнатального розвитку цих структур, що може бути експериментальними та теоретичними обгрунтуваннями профілактики розвитку неврологічної патології у дітей з ОАС. Вплив ХЕГ характеризується якісними та кількісними морфологічними змінами та є наслідком комбінації як деструктивних так і адаптивних процесів, що відбуваються в вивчених структурах. Застосована експериментальна модель впливу ХЕГ є апробірованою та характеризується як мінімальним порушенням сну так і значними когнитивними та поведінковими порушеннями у щурів в тестах водяного лабірінту Моріса та відкритому полі. Таким чином, спостережені морфофункціональні зміни ЦНС щурів є наслідком впливу ХЕГ, а не інших патологічних компонентів ОАС. Дані наведені у цьому дослідженні переконливо свідчать про про те, що ХЕГ, а не інші патологічні компоненти ОАС, несуть переважну відповідальність за когнитивну дисфункцію та затримку у фізичному розвитку, спостережувану у дітей з ОАС. Вивчені структури нервової системи характеризуються різною чутливістю до дії ХЕГ, а також мають різну здатність до відновлення. Більш чутливими до дії ХЕГ є гіппокамп, кора головного мозку та ядро під’язикового нерву, а менш чутливим є амбігуальне ядро. І зокрема, в СА1 полі гіппокампа у щурів віком 4 тижні відмічалося зниження кількості нейронів (7,43x105±0,31x105, 5,88x105±0,57x105, р=0,03) і нейроглії, в корі головного мозку – зниження її об'єму, особливо виражене у тварин у віці 4 тижнів (1,87x10-7м3±0,03x10-7м3, 1,76x10-7м3±0,04x10-7м3, р=0,038), а також підвищення кількості нейронів, підвищення імунореактивності ГФКБ у самців щурів і зниженням ГФКБ і кількості клітин глії у самок, а також незмінна активність nNO-синтази. В ядрі під’язикового нерву відмічалося зниження об’єму ядра, об’ему ядер нейронів, помітне у всіх вікових групах (4 тижні - 315,17x10-16м3±8,52x10-16м3, 276,57x10-16м3±6,63x10-16м3, р=0,004), зниження кількості кліток глії - (4 тижні - 1,54x104±0,05x104, 1,14x104±0,15x104, р=0,037). Відновлення СА1 мало гендер-залежний характер, з однаковою кількостю нейронів у самців у віці 8 і 20 тижнів, помітним ГФКБ-астрогліозом, та більшою ніж в контролі кількостю нейронів у самок у 8 тижнів (7,13x105±0,20x105 і 8,70x105±0,44x105, р=0,019) і 20 тижнів (5,79x105±0,37x105 і 7,58x105± 0,42x105, р=0,019). Вплив ХЕГ на розвиток амбігуального ядра був обмежений транзиторним астрогліозом і підвищенням активності ГФКБ у щурів у віці 4 і 8 тижнів, а також помірним зниженням об'єму структури. Тимчасові ХЕГ-індуковані зміни в корі головного мозку і гіпокампі у вигляді зменшеної кількості нейронів та клітин глії у полі СА1 та підвищеної експресії ГФКБ у корі головного мозку свідчать, що на ранньому етапі нейрокогнитивні порушення, притаманні цій експериментальній моделі та ОАС у дітей, виникають із-за дисфункції, в основному, гіпокампальних механізмів, тоді як на пізніших етапах вираженість і вид когнітивних порушень визначається дисфункцією кортикальных, субкортикальных механізмів та їх зв’язків. Дисперсійний аналіз впливу ХЕГ показав, що відновлення гіпокампального поля СА1 має помітний гендер-залежний характер, та характеризується гіперплазією нейронального шару цей структури, що корелює з гендер-залежним відновленням когнітивних функцій у самок, але не самців щурів. Цей феномен свідчить про можливість терапевтичного використання невідомих на даний момент механізмів морфологічного і когнітивного відновлення у самок щурів. Одним з таких механізмів може бути дисфункція гіпоталамо-гіпофізарно-гонадної осі у самців щурів. Таким чином, затримка фізичного розвитку на 8 тижні після завершення дії ХЕГ, а також деяке “недосягнення” нейрогенного потенціалу ХЕГ шляхом зниження нейрогенеза та/або виживання нових нейронів у гіппокампі самців щурів вказує на потенціальну роль ХЕГ у довготривалій дисфункції гіпоталамо-гіпофізарно-гонадної осі у самців щурів у формі гіпогонадизму. Морфологічні дані, що стосуються впливу ХЕГ на розвиток гіппокампу щурів, є підтвердженням гіпотези про більш значний ушкоджувальний вплив ХЕГ на самців, ніж самок щурів. Цей факт може бути пов’язаний з підвищеною захворюванністю подібним до синдрому дефіциту уваги і гіперактивності хлопчиків з ОАС. Чутливість нейронів ядра під'язикового нерва до ХЕГ, з тривалим зниженням об’ему ядер нейронів у ядрі під’язикового нерву, виявлена в даному дослідженні, підтримує гіпотезу про важливу роль ХЕГ в хронізації ОАС, завдяки індукції морфофункціональних порушень в центральних механізмах контролю верхніх дихальних шляхів. Крім того, значна чутливість до впливу ХЕГ ядра під'язикового нерву та відсутність помітних змін у амбігуальному ядрі свідчить про більш значну роль дисфункції контролю м'язів язика, ніж контролю м'язів задньої стінки глотки при хронізації апное. Довготривалий характер морфофункціональних порушень в ядрі під’язикового нерву свідчить про те, що зміни в контролі верхніх дихальних шляхів при ХЕГ можуть бути необоротними, таким чином указуючи на необхідність ранньої діагностики і лікування ОАС у дітей. Ці морфофункціональні порушення можуть бути відповідальні за рецидив ОАС у пацієнтів, що були проліковані, при виникненні в них додаткових факторів ризику. Практичні рекомендації. Дане дослідження вказує на значний і довготривалий характер порушень в морфофункціональному розвитку структур ЦНС під впливом ХЕГ. Таким чином, ця робота узгоджуються як з експериментальними даними, що вказують на короткочасні і довготривалі когнітивні порушення у тварин під впливом ХЕГ, так і з епідеміологічними дослідженнями, що свідчать про негативні наслідки ОАС у дітей, зокрема – понижену успішність в школі і підвищений ризик розвитку синдрому дефіциту уваги і гіперактивності. Довготривалі морфофункціональні порушення у ядрі під’язичного нерву під впливом ХЕГ вказують на можливість хронічних порушень в контролі верхніх дихальних шляхів. Це спостереження корелює з клінічними даними про значно підвищенний рівень захворюваності ОАС у людей, що мали ОАС у дитинстві та були проліковані. Таким чином, на підставі спостережень даного дослідження сімейним лікарям, педіатрам і отолярингологам пропонується звертати додаткову увагу на дітей з симптомами порушення дихання під час сну, а також проводити навчання їх батьків на предмет раннього виявлення зміни характеру дихання у дітей під час сну, та порушень фізичного і когнітивного розвитку, з метою попередження наслідків ОАС, а лікарям-терапевтам рекомендується проводити цільове обстеження пациентів з сердцево-судинними захворюваннями та гіперсомнією для виявлення ОАС. Значне порушення морфофункціонального розвитку структур ЦНС під впливом ХЕГ вказує на можливість використання стереологічної оцінки морфофункціональних параметрів цих структур, і зокрема визначення загальної кількості нейронів у пірамідальному шарі СА1 поля гіпокампа і імунореактивності ГФКБ, як можливий альтернативний метод патологоанатомічної діагностики патології раннього постнатального періоду, зв’язаної з пливом ХЕГ. СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ Тадтаєв С.Г. Морфологические особенности различных структур головного мозга при повреждающем воздействии эпизодической гипоксии // Український морфологічний альманах. – 2006. – Том 4. – № 3. – С. 82 – 84. Яковцова А.Ф., Тадтаев С.Г., Sibbons P., Ansari T. Особенности повреждающего воздействия прерывистой гипоксии на ядра черепно-мозговых нервов // Вісник морфології. – 2006. – № 12. – С. 254–256. (Автором проведений стереологічний аналіз впливу хронічної епізодичної гіпоксії на морфофункціональний стан трьох ядер ствола мозку (амбігуального, ядра под’язичного нерву, дорсального ядра вагуса) у щурів віком 4, 8, 20 тижнів, а також проведена первинна статистична обробка.) А.Ф. Яковцова, С. Тадтаев, P. Sibbons, T. Ansari. Особенности повреждающего воздействия прерывистой гипоксии на кору головного мозга и гиппокамп // Запорожский медицинский журнал. – 2006. – № 4 (37). – С. 51-52. (Автором проведена повна гістологічна обробка матеріалу та стереологічний аналіз впливу хронічної епізодичної гіпоксії на морфофункціональний стан кори та СА1 поля гіппокампу у щурів віком 4, 8, 20 тижнів.) А.Ф.Яковцова, В.Д.Марковский, С.Г.Тадтаев, В.В.Гаргин. Стереометрическое исследование гиппокампа крысят, перенесших эпизодическую десатурацию // Вісник проблем біології і медицини. – 2006. – № 2. – С.400 - 402. (Автором проведена повна гістологічна обробка матеріалу та стереологічний аналіз безпосереднього впливу хронічної епізодичної гіпоксії з 10 по 25 постнатальний день на морфофункціональні параметри СА1 поля гіппокампу щурів віком чотири тижня.) Tadtayev S., Gozal D., Reeves S.R., Ansari T.I., Row B.W., Sibbons P. Quantitative morphometric analysis of the effects of chronic intermittent hypoxia on three brainstem nuclei in a developmental rodent model // Proc. 20th Associated Professional Sleep Societies Meeting. – Salt Lake City (USA). - Sleep. – 2006. – Vol. 29A. – P.189 – 190. (Автором проведений гістологічний, імуногістохімічний, стереологічний аналіз впливу хронічної епізодичної гіпоксії на морфофункціональний стан трьох ядер ствола мозку (амбігуального, ядра под’язичного нерву, дорсального ядра вагуса) у щурів віком 4, 8, 20 тижнів, а також проведена первинна статистична обробка.) Tadtayev S., Gozal D., Row B.W., Ansari T.I., Sibbons P. Stereological investigation in a rodent model of pediatric sleep disordered breathing: morphometric evidence for cognitive deficiencies // Proc. American Thoracic Society Meeting.–San Diego (USA). – 2006. – Vol. 3(2) A. – P.112 - 113. (Автором проведена повна гістологічна обробка матеріалу та стереологічний аналіз впливу хронічної епізодичної гіпоксії на морфофункціональний стан кори та СА1 поля гіппокампу у щурів віком 4, 8, 20 тижнів.) Ansari T.I., Tadtayev S., Gozal D., Row B.W., Sibbons P. Stereological investigation in a rodent model of pediatric sleep disordered breathing // Proc. 24th Annual conference on Sleep Disorders in Infancy and Childhood. –Rancho Mirage (USA). – 2006. – Vol.1. – P.3. (Автором проведений стереологічний аналіз впливу хронічної епізодичної гіпоксії на морфофункціональний стан кори та СА1 поля гіппокампу у щурів віком 4, 8, 20 тижнів.) Tadtayev S., Gozal D., Ansari T.I., Sibbons P. Chronic intermittent hypoxia in the early postnatal period has gender dependent effects on the rat nervous system: evidence from a stereological study // Proc. 18th British Neuroscience Association National Meeting. – Brighton (UK). – 2004. – Vol.1 – P.241. (Автором проведена повна гістологічна обробка матеріалу та стереологічний аналіз впливу хронічної епізодичної гіпоксії на морфофункціональний стан кори, дорсального ядра вагуса, СА1 поля гіппокампу у щурів віком 20 тижнів.) АНОТАЦІЯ Тадтаєв С.Г. Стереологічне дослідження впливу хронічної епізодичної гіпоксії на розвиток деяких відділів головного мозку у експеременті. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за фахом 14.03.02 – патологічна анатомія. – Харківський державний медичний університет МОЗ України, Харків, 2007 рік. Дисертація присвячена вивченню морфологічних особливостей дії хронічної епізодичної гіпоксії (ХЕГ) на постнатальний розвиток структур центральної нервової системи в експериментальній моделі обструктивного апное під час сну (ОАС) у дітей з використанням сучасних морфологічних, імуногістохімічних та стереологічних методик. Всього було досліджено 48 щурів породи Sprague-Dawley обох статей контрольної і експериментальної групи у віці 4, 8 і 20 тижнів. Тварини експериментальної групи піддавалися дії ХЕГ з 10 по 25 день після народження. Було виявлено, що відновлення гіпокампального поля СА1 має помітний гендер-залежний характер і може бути обумовлено ХЕГ- індукованим гіпогонадизмом у самців. Чутливість нейронів ядра під'язикового нерву до ХЕГ, підтримує гіпотезу про важливу роль ХЕГ в хронізації ОАС, а відмінності в чутливості до ХЕГ ядра під'язикового нерву і амбігуального ядра вказують на превалюючу роль дисфункції контролю м'язів язика в хронізації апное. Ключові слова: хронічна епізодична гіпоксія, обструктивне апное під час сну, стереологія, кора головного мозку, гіпокамп, ядро під'язикового нерва, амбігуальне ядро. АННОТАЦИЯ Тадтаев С.Г. Стереологическое исследование влияния хронической эпизодической гипоксии на развитие некоторых отделов головного мозга в эксперименте. – Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.02 – патологическая анатомия. – Харьковский государственный медицинский университет, Харьков, 2007 год. Диссертация посвящена изучению морфологических особенностей воздействия хронической эпизодической гипоксии (ХЭГ) на постнатальное развитие структур центральной нервной системы в экспериментальной модели обструктивного апноэ во время сна (ОАС) у детей с использованием современных стереологических морфометрических методик. Всего было исследовано 48 крыс породы Sprague-Dawley обоего пола контрольной и экспериментальной группы в возрасте 4, 8 и 20 недель. Животные экспериментальной группы подвергались воздействию ХЭГ с 10 по 25 день после рождения. Проведено морфологическое, иммунногистохимическое и стереологическое исследование коры головного мозга, гиппокампа, ядра подъязычного нерва и амбигуального ядра экспериментальных животных. Определены объемы структур, численные плотности нейронов и глии, объемы ядер нейронов и абсолютное число нейронов и клеток глии в исследуемых структурах; иммунногистохимически определены активность нейрональной синтазы оксида азота (nNO-синтази) и глиального фибриллярного кислого белка (ГФКБ). В результате проведенных исследований представлены стереологические параметры деструктивных и адаптивных реакций, наблюдающихся в ткани исследуемых структур в течение их постнатального развития под воздействием ХЭГ. Установлено, что изучаемые структуры имеют различную чувствительность к воздействию ХЭГ, а также разную способность к восстановлению. Временные изменения ХЭГ-индуцированных изменений в коре головного мозга и гиппокампе указывают на то, что на раннем этапе нейрокогнитивные нарушения возникают из-за дисфункции в основном гиппокампальных механизмов, в то время как на более поздних этапах выраженность и вид когнитивных нарушений, по всей видимости, определяется дисфункцией кортикальных и субкортикальных механизмов. Было выявлено, что восстановление гиппокампального поля СА 1 имеет заметный гендер-зависимый характер, что коррелирует с гендер-зависимым восстановлением когнитивных функций у самок, но не самцов крыс, и может быть обусловлено предполагаемым ХЭГ-индуцированным гипогонадизмом у самцов. Различная чувствительность к ХЭГ-воздействию была также отмечена в ядре подъязычного нерва и амбигуальном ядре, контроллирующих поддержание верхних дыхательных путей в раскрытом состоянии. Чувствительность нейронов ядра подъязычного нерва к ХЭГ, поддерживает гипотезу о важной роли ХЭГ в хронизации ОАС, а различия в чувствительности к ХЭГ ядра подъязычного нерва и амбигуального ядра указывают на превалирующую роль дисфункции контроля мышц языка в хронизации апноэ. Полученные данные о постнатальном развитии субстратов когнитивных функций указывает на возможность использования неизвестных на данный момент механизмов, обуславливающих гендер-зависимое восстановление гиппокампального поля СА1 у самок, с целью терапевтической коррекции когнитивных последствий ОАС у детей. Постоянный характер обнаруженных изменений нейронов ядра подъязычного нерва, говорит об их необратимости, таким образом указывая на необходимость ранней диагностики и лечения ОАС у детей, а также предполагает повышенный риск рецидива ОАС после проведенного лечения. На основе наблюдений данного исследования семейным врачам, педиатрам и отолярингологам предлаетеся обращать дополнительное внимание на детей с симтомами нарушения дыхания во время сна, а также проводить обучение их родителей с целью раннего выявления изменения характера дыхания во время сна и нарушений физического и когнитивного развития с целью предупреждения последствий ОАС. Определение стереологических показателей морфофункционального состояния структур головного мозга при развитии в условиях ХЭГ рекомендуется использовать как важный дополнительный метод патологоанатомической диагностики патологии постнатального периода, связанной с воздействием ХЭГ. Ключевые слова: хроническая эпизодическая гипоксия, обструктивное апноэ во время сна, стереология, гиппокамп, кора головного мозга, ядро подъязычного нерва, амбигуальное ядро. SUMMARY Tadtayev S.G. Stereological investigation of specific brain regions in a developmental model of chronic intermittent hypoxia.- Manuscript. Thesis submitted for the scientific degree of candidate of medical sciences in pathological anatomy – specialty 14.03.02. – Kharkov State Medical University, Ministry of Public Health, Kharkov, Ukraine, 2007. The thesis describes investigation of the effect of chronic intermittent hypoxia (CIH) on postnatal development of cerebral cortex, hippocampus, hypoglossal nucleus and nucleus ambiguus in rodent model of paediatric obstructive sleep apnoea (OSA) with use of precise stereological morphometric techniques. The experimental model involved exposure of 48 Sprague-Dawley rats of both genders to either room air or a CIH profile consisting of alternating room air and 10 % oxygen every 90 seconds 24 hours a day from postnatal day 10 to postnatal day 25. Animals have been withdrawn from the experiment in three equal groups aged 4, 8 and 20 weeks. The findings of the study relating to the changes in the CA1 field in the late post-CIH period provide a morphological correlate to neurocognitive recovery occurring in CIH-treated female but not male rats, suggesting that mechanism(s) underlying gender-dependent morphological recovery may provide venues for therapeutic intervention. Persistent decline in neuronal nuclear volume of hypoglossal neurons implicates CIH in the contribution to self-perpetuation of obstructive sleep apnea. Key words: obstructive sleep apnoea, intermittent hypoxia, stereology, cortex, hippocampus, hypoglossal nucleus, nucleus ambiguus. ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ nNO-синтаза – нейрональна ізоформа синтази оксиду азоту ГФКБ – гліальний фібрілярний кислий білок ОАС – обструктивне апное під час сну / обструктивне сонне апноє ХЕГ – хронічна епізодична гіпоксія ЦНС – центральна нервова система PAGE 15

Похожие записи