.

Спадкові дистрофії строми рогівки (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 4840
Скачать документ

ІНСТИТУТ ОЧНИХ ХВОРОБ І ТКАНИННОЇ ТЕРАПІЇ

ІМ. В.П. ФІЛАТОВА АМН УКРАЇНИ

ДРОЖЖИНА ГАЛИНА ІВАНІВНА

УДК 617.713-007.23-053:616-056.7–036–073–092-089

Спадкові дистрофії строми рогівки

(ПАТОГЕНЕЗ, КЛІНІКА, ДІАГНОСТИКА, ЛІКУВАННЯ)

14.01.18 – Офтальмологія

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Одеса – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті очних хвороб і тканинної терапії ім.
В.П.Філатова АМН України.

Науковий консультант:

доктор медичних наук, старший науковий науковий співробітник ПАСЄЧНІКОВА
Наталія Володимирівна, Інститут очних хвороб і тканинної терапії ім.
В.П. Філатова АМН України, директор

Офіційні опоненти:

член-кореспондент НАН та АМН України, доктор медичних наук, професор
СЕРГІЄНКО Микола Маркович, Київська медична академія післядипломної
освіти ім. П. Л. Шупика МОЗ України, завідувач кафедри офтальмології

доктор медичних наук, професор, ВЕСЕЛОВСЬКА Зоя Федорівна, Київський
міський центр судинно-ендокринних захворювань органу зору Київської
міської клінічної лікарні №1 МОЗ України, директор

доктор медичних наук, старший науковий співробітник

САВКО Валентин Владиславович, Інститут очних хвороб і тканинної терапії
ім. В.П. Філатова АМН України, керівник відділу увеїтів і
мікрохірургічного лікування їх наслідків

Провідна установа: Харківська державна медична академія післядипломної
освіти, кафедра офтальмології, МОЗ України, м. Харків

Захист відбудеться “25” червня 2005 р. о 10.00 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 41.556.01 в Інституті очних хвороб і
тканинної терапії ім. В.П. Філатова АМН України за адресою: 65061, м.
Одеса, Французький бульвар, 49/51.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту очних хвороб і
тканинної терапії ім. В.П. Філатова АМН України (65061, м. Одеса,
Французький бульвар, 49/51).

Автореферат розісланий “24“ травня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук, професор Пономарчук В. С.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Спадкові стромальні дистрофії рогівки (вузликова,
гратчаста, плямиста, кристалічна і дистрофія Рейс-Бюклерса) є
двосторонніми прогресуючими захворюваннями, що ведуть до помутніння
рогівки і суттєвого зниження зору (Reim M.et al., 1985, Thiel H., 1981,
Waring G., 1978). За відсутності своєчасно проведеного хірургічного
лікування ці захворювання рогівки є причиною інвалідності. За даними
літератури, серед показань до кератопластики (КП) вони складають в
Саудівській Аравії – 3,5%, Німеччини – 4,0%, США – 4,9%, в Південній
Індії – 8,1%, в Японії – 12,5% (Al Faran M., Tabarra K.,1991, Klinworth
G., et al.,1997, Linguist T., 1991, Pandrowala H.et al.,2004, Santo R.,
et al., 1995, Seitz B., et al., 2004).

Подібні відомості у вітчизняній літературі відсутні. Вивчення цієї
патології в Україні також не проводилося.

Найбільш частою причиною звертання хворих на спадкові дистрофії строми
рогівки (СДСР) до офтальмолога є рецидивуючі ерозії (РЕ) (Nauman G.,
1997, Rodrigues M., Krachmer J., 1988, Smolin G., Thoft R., 1994). При
цьому їх частота, інтенсивність і ступінь супутньої запальної реакції
істотно відрізняються у різних пацієнтів. Хронічний перебіг хвороби з
рецидивуючим запальним компонентом спричиняє повторне звертання хворих
на СДСР до офтальмолога, що обумовлює медичну, соціальну і економічну
значущість проблеми.

Морфологічною основою розвитку РЕ при СДСР є порушення адгезії базальних
клітин епітелію до боуменової мембрани (БМ) внаслідок накопичення між
цими структурами патологічних депозитів (амілоїда – при гратчастій,
гіаліна – при вузликовій, глікозоаміногліканів – при плямистій, ліпідів
– при кристалічній дистрофії), а також вторинних дегенеративних змін в
передніх шарах рогівки (Nauman G., 1997, Weidle E., 1996). Пошкодження
епітелію є пусковим механізмом розвитку запалення при СДСР, що може бути
як асептичним, так і ускладнитися приєднанням інфекції. Проте дані
літератури, що стосуються запалення, при СДСР, одиничні (Jonides A.., et
al., 1997, Luchs J. et al. 1995). Не дивлячись на очевидність розвитку
запалення при СДСР, його вплив на особливості клінічного перебігу і
структурні зміни в рогівці при цій патології не вивчений. Залишаються не
з’ясованими особливості імунологічної реактивності організму, стан
метаболізму рогівки, а також стабільність мембран лізосом при різних
видах СДСР, що супроводжуються наявністю запального компоненту і без
нього.

До останнього часу діагноз різних форм СДСР ставився на підставі
характерної клінічної картини, а також типових морфологічних і
гістохімічних ознак дистрофії (Reim M., 1995, Thiel H., 1981,Waring G.,
et al., 1978). Проте відомо, що деякі види дистрофій, як на ранніх, так
і на пізніх стадіях розвитку захворювання, клінічно важко
диференціювати, а морфологічні дослідження тканини рогівки можливі лише
після проведеної КП.

Відкриття в 1997р. TGFBI гена, мутації в якому є причиною розвитку
деяких форм СДСР з аутосомно-домінантним типом спадкування, відкрило
нову епоху у вивченні патогенезу цих захворювань рогівки (Munier l., et
al.,1997). Показано, що певні мутації характерні для конкретних
клінічних форм СДСР (Gupta S., et al., 1998, Hotta Y.,et al., 1999,
Konoshi M., et al., 2000, Korvatska E., et al.,1998). У зв’язку з цим
виявлення відповідної мутації в гені TGFBI може лягти в основу
диференціального діагнозу різних видів СДСР.

Поширеність мутацій гена TGFBI і їх фенотипичні прояви СДСР в даний час
є предметом інтенсивного вивчення офтальмологів і генетиків Франції,
Японії, США, Німеччини, Швейцарії і інших країн (Dighiero P., etal.,
2000, Hellenbroich Y., et al., 2001, Klinworth G., 1999,Yamamoto S., et
al., 2000). Вивчаються фенотипи дистрофій, що зустрічаються на
територіях різних країн в різних географічних регіонах та відповідальні
за їх виникнення мутації (Klinworth G., 1999, Witchel H., 2002, Yamamoto
S.,et al., 2000). Спектр мутацій гена TGFBI, а також зв’язок цих мутацій
з клінічними фенотипами різних видів СДСР у пацієнтів з України не
вивчений. До теперішнього часу не вивчена частота збігу клінічного
діагнозу з результатами морфологічних і молекулярно-генетичних
досліджень. Залишається також невизначеною роль вищеперелічених методів
дослідження в диференціальній діагностиці різних видів і типів СДСР.

Не дивлячись на те, що впродовж майже 70 років кератопластика є основним
методом лікування СДСР покази до крізної і пошарової КП при цій
патології рогівки до теперішнього часу чітко не визначені. Зарубіжні
роботи присвячені в основному аналізу результатів крізної КП при СДСР
(Ellies P., et al.,2002, Lang et al. 2003., Marcon A., et al., 2003,
Tompson R. et al., 2003). До теперішнього часу в літературі є єдине
повідомлення Lyons З., з співавт. (1994), присвячене порівняльному
аналізу результатів пошарової і крізної КП при вузликовій СДСР, подібні
дослідження при інших видах СДСР відсутні.

При порівняльному аналізі ефективності КП відсутній стандартизований
опис стану рогівки, з приводу якого проводять КП, що через велику
різноманітність клінічних проявів СДСР робить неможливим порівняння
результатів різних видів кератопластики. Не розроблено прогнозування
результатів оперативного лікування при СДСР, яке б дозволило оцінити
імовірність отримання певного оптичного результату КП залежно від
поєднання декількох чинників ризику у конкретного пацієнта.

Серед чинників помутніння трансплантата після КП при СДСР, в літературі
є повідомлення тільки про рецидив дистрофії, як про причину його
помутніння (Marcon A., et al., 2003). Вплив інших чинників на прозорість
трансплантата після кератопластики при СДСР не вивчений. У зв’язку з цим
важливим є аналіз різних факторів, що впливають на помутніння
трансплантата, а також вивчення тривалості збереження прозорості
трансплантата після КП при СДСР з урахуванням виявлених чинників.
Сповільнена регенерація рогівкової тканини при СДСР (Берова С.С.,
Пенчева Е.И., 1992), яка виражається в більш тривалому існуванні набряку
строми трансплантата і сповільненій, у порівнянні з іншими
захворюваннями, епітелізацією поверхні трансплантата після
кератопластики (Smolin G., Thoft R., 1994), обумовлює необхідність
пошуку фармакологічних препаратів, здатних робити багатокомпонентний
вплив на різні фази запальної реакції, що розвивається при проведенні
кератопластики у хворих НСДР.

Все викладене підтверджує актуальність проблеми діагностики і лікування
НСДР і значення досліджень у вказаних напрямах.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота
виконувалася в рамках планових НДР інституту очних хвороб і тканинної
терапії ім. В.П. Філатова АМН України “Розробити підходи до
патогенетично орієнтованої терапії запальних і дистрофічних захворювань
рогівки (1996-1998гг.), в якій автор була виконавцем № держреєстрації
0196И002783; “Вивчення патогенетичного значення запалення в перебігу і
прогресуванні первинних і вторинних дистрофій рогівки“ (1999-2001гг.) №
держреєстрації 0199U001085, в якій автор була керівником теми;
“Удосконалити медикаментозне і хірургічне лікування хворих із запальними
і дистрофічними захворюваннями рогівки на основі вивчення їх патогенезу”
(2002-2004 рр.) № держреєстрації 0102U002740, в якій автор була
керівником теми, а також НДР інституту молекулярної біології і генетики
НАН України “ Молекулярні основи функціонування генома і його регуляція”
(2000 –2006 рр.) №. держреєстрації 0104U000436, де автор є
співвиконавцем.

Мета роботи – Підвищення ефективності діагностики і лікування хворих на
спадкові стромальні дистрофії рогівки (гратчастій, вузликової, плямистій
і дистрофії Рейс-Бюклерса), що протікають з наявністю запального
компоненту і без нього, шляхом застосування комплексу сучасних методів
діагностики (клінічних, генеалогічних, морфологічних і
молекулярно-генетичних); вивчення деяких патогенетичних ланок
дистрофічного процесу (стану окислювально-відновлювальних процесів,
протеїназно-інгібіторного балансу, стабільності лізосомальних мембран),
а також імунологічної реактивності організму для вибору оптимальної
тактики кератопластики і прогнозу її результатів.

Задачі дослідження.

Вивчити частоту виявлення запального компоненту при різних видах СДСР і
його вплив на особливості клінічного перебігу і структурні зміни в
рогівці при цій патології.

Вивчити діагностичну цінність комплексу клінічних, морфологічних і
молекулярно-генетичних (частота мутацій R124C, R124H, R124L, R555W і
R555Q в 4 і 12 екзонах гена TGFBI при гратчастій, вузликовій СДСР і
дистрофії Рейс-Бюклерса) методів дослідження в диференціальній
діагностиці різних видів СДСР.

Вивчити особливості імунологічної реактивності організму, стан
метаболізму рогівки (окислювально-відновлювальних процесів,
протеїназно-інгібіторного балансу) і стабільності лізосомальних мембран
клітинних структур рогівки при різних видах СДСР, що супроводжуються
наявністю запального компоненту і без нього.

Вивчити в експерименті вплив препарату системної ензимотерапії флогензим
на особливості клінічного перебігу запального процесу в рогівці і її
метаболізм (протеїназно-інгібіторний баланс, відновлення білків,
стабільність лізосомальних мембран).

Вивчити ефективність фототерапевтичної кератектомії в лікуванні СДСР при
локалізації патологічних змін в поверхневих шарах рогівки, а також
пошарової і крізної кератопластики при СДСР в залежності від виду
дистрофії і наявності запального компоненту в клінічному перебігу
захворювання.

Вивчити тривалість збереження прозорості трансплантата після
кератопластики при різних видах СДСР і виявити комплекс найбільш значних
ознак, що впливають на цей показник.

Виявити чинники, які впливають на оптичні результати пошарової
кератопластики при різних видах СДСР і розробити математичну модель, що
дозволить прогнозувати оптичні результати пошарової кератопластики.

Вивчити ефективність препарату “флогензим” для профілактики запальної
реакції після кератопластики у хворих з СДСР.

На підставі отриманих даних запропонувати комплекс методів діагностики
СДСР, розробити диференційований підхід до вибору виду кератопластики і
патогенетично обгрунтувати доцільність включення препарату системної
ензимотерапії “флогензим” для профілактики запальної реакції після
кератопластики.

Об’єкт дослідження: спадкові дистрофії строми рогівки.

Предмет дослідження: частота виявлення запального компоненту,
особливості клінічного перебігу, морфологічні зміни в тканині рогівки,
мутації R124C, R124H, R124L, R555W і R555Q в 4 і 12 екзонах гена TGFBI,
активність окислювально-відновлювальних, лізосомальних ферментів,
трипсиноподібних протеїназ, антитрипсинова активність, стан
імунологічної реактивності організму, ефективність пошарової і крізної
кератопластики, ефективність фототерапевтичної кератектомії, терміни
збереження прозорості трансплантата після кератопластики, фактори, що
впливають на оптичні результати кератопластики, ефективність флогензима
в лікуванні запальної реакції після кератопластики.

Методи дослідження: загальноклінічні (біомікроскопія, офтальмоскопія,
флюоресцеїновий тест, візометрія, періметрія); морфологічні (світлова і
електронна мікроскопія) – дослідження тканини рогівки; генеалогічні
(вивчення родоводів); молекулярно-генетичні (дослідження спектру мутацій
гена TGFBI); імунологічні (визначення Т-і В- лімфоцитів та їх
субпопуляцій, сенсібілізації до антигенів рогівки); біохімічні (вивчення
стану окислювально-відновлювальних процесів, протеїназно інгібіторного
балансу, стабільності мембран лізосом); радіоізотопні (вивчення
відновлення білків); методи статистичного аналізу.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше виявлені морфологічні
відмінності тканини рогівки у хворих гратчастою дистрофією рогівки при
наявності клін7ічних ознак запаленнярогівки, від класичної морфологічної
картини цієї дистрофії, – відсутність в 35,7% випадків специфічних
депозитів (можливо внаслідок резорбції клітинами запального
інфільтрату); наявність вогнищ запалення, що складаються з макрофагів;
наявність складного гіаліна, що утворюється в результаті деструкції
колагену, виражена дегенерація строми рогівки і кератоцитів.

Вперше у хворих з різними клінічними формами СДСР з різних регіонів
України встановлений спектр мутацій гена TGFBI (виявлені мутації R124C,
R555Q, R555W).

Отримані нові знання про порушення метаболізму рогівки при СДСР.
Встановлений дисбаланс в протеїназно-інгібіторній системі, найбільш
виражений при гратчастій дистрофії (підвищення активності
трипсиноподібних протеїназ – на 27,6% на фоні зниження антитрипсинової
активності -на 25,1%), порушення окислювально-відновлювальних процесів з
переважанням анаеробних процесів (підвищення активності
лактатдегідрогенази на 25,3%), а також зниження стабільності мембран
лізосом (збільшення відношення неседиментованої активності кислої
фосфатази і катепсина Е до зв’язаної активності цих ферментів у 2 рази).

Вперше показано, що виявлені порушення метаболізму посилюються під
впливом запалення, про що свідчить підвищення при гратчастій дистрофії
(ГД) активності трипсиноподібних протеїназ – на 29,8% в умовах зниження
антитрипсинової активності – на 23,1%, підвищення активності
лактатдегідрогенази на 25,3% на фоні зниження активності
глюкозо-6-фосфатдегідрогенази на 25,7%, збільшення відношення
неседиментованої активності кислої фосфатази і катепсина Е до зв’язаної
активності цих ферментів в 2 рази в порівнянні з цими показниками при
відсутності запалення. Виявлені порушення метаболізму створюють умови
для переважання деструктивних процесів в тканині рогівки з подальшим
розвитком прогресуючою дезорганізації її строми.

Доповнені знання про чинники, що знижують оптичні результати пошарової
кератопластики у хворих з СДСР: вид дистрофії, стан поверхні рогівки,
глибина локалізації патологічних змін у стромі, наявність васкуляризації
рогівки, а також вік, в якому проведена перша кератопластика. На
підставі виявлених чинників розроблені логістична, дискримінантна і
нейросітьова моделі, що дозволяють прогнозувати можливость підвищення
гостроти зору на 0,3 і більше після пошарової кератопластики в
залежності від поєднання декількох факторів ризику у конкретного
пацієнта.

Поширені знання про чинники ризику порушення прозорості трансплантата
після кератопластики при СДСР, найбільш вагомими з яких є васкуляризація
рогівки, наявність запального компоненту, післяопераційні ускладнення,
повторні кератопластики. Розроблена модель прогнозу імовірності
збереження прозорості трансплантата після кератопластики у конкретного
хворого СДСР залежно від поєднання даних чотирьох факторів ризику.

Вперше виявлено підвищення рівня сенсибілізації до антигенів рогівки при
СДСР. При наявності запального компоненту у перебігу СДСР рівень
сенсибілізації до антигенів рогівки суттєво підвищений і складає –
11,5%, при відсутності запального компоненту – 8,3%.

На підставі експериментально-клінічних досліджень поширені уявлення про
механізми дії системної ензимотерапії. Вперше показано зниження під
впливом “флогензима” рівня сенсибілізації до антигенів рогівки, а також
встановлено мембраностабилізуюча і стимулююча синтез білків в рогівці
дія препарату.

Практичне значення отриманих результатів. Встановлено, що у хворих з
різними видами СДСР, що проходять з наявністю запального компоненту,
спостерігається розвиток фокальних, субтотальних або тотальних
дегенеративних змін рогівки і трансплантата, які дещо стирають
патогномонічні ознаки різних видів дистрофії, що істотно ускладнює їх
диференціальну діагностику.

Показано, що застосування молекулярно-генетичних методів дослідження і
виявлення мутацій, відповідальних за розвиток конкретних видів дистрофії
рогівки, дозволяє на доклінічній стадії захворювання (в дитячому віці)
встановити діагноз СДСР, у дорослих пацієнтів – з високою точністю
проводити диференціальну діагностику різних видів і типів дистрофій

Розроблена кількісна бальна оцінка комплексу ознак стану рогівки при
СДСР (стан поверхні рогівки і її строми, глибина локалізації
патологічних змін у стромі, наявність васкуляризації і запальних змін
рогівки, а також гострота зору), на підставі якої виділено дві стадії
розвитку патологічного процесу – помірних і виражених патологічних змін
в рогівці. Розроблений алгоритм визначення належності хворого до однієї
із стадій.

Доведено, що при плямистій дистрофії рогівки ефективним методом
лікування є крізна кератопластика. При гратчастій і вузлковій дистрофії
однаково обгрунтований вибір як крізної, так і пошарової кератопластики.

Фототерапевтична кератектомія є ефективним методом лікування СДСР і їх
рецидивів при локалізації патологічних змін в поверхневих шарах строми
(не глибше 85 мк), яка дозволяє в 90,0% випадків поліпшити якість
поверхні рогівки, усунути рогівковий синдром, підвищити гостроту зору в
середньому на 0,45 і відстрочити кератопластику.

Запропонований спосіб лікування запальної реакції після кератопластики у
хворих з дистрофіями рогівки з використанням “флогензима”, дозволяє
понизити ступінь сенсибілізації до антигенів рогівки, скоротити терміни
епітелізації на 1,5 діб трансплантата, а також резорбції його набряку на
4,5 діб (патент України № 66278 А).

Впровадженя в практику. Результати досліджень впроваджені в
офтальмологічну практику і використовуються в Інституті очних хвороб і
тканинної терапії ім.В.П.Філатова АМН Украіни. Основні положення роботи
включені до програми лекцій і практичних занять факультету
післядипломної освіти Одеського державного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Ідея наукового дослідження належить
дисертанту в співавторстві з проф.В.В.Вітом. Здобувачем здійснена
постановка і розробка проблеми дослідження, визначена методологія
роботи, проведені клінічні дослідження і хірургічне лікування хворих з
СДСР. Самостійно автором проаналізовані архівні дані 101 хворого (224
ока), а також проведені клінічні спостереження за 175 хворими з СДСР
(391 око). Дисертанту належить ідея по дослідженню впливу флогензима на
перебіг запального процесу в рогівці, самостійно проведені
експериментальні і клінічні дослідження по вивченню впливу флогензима на
перебіг запальної реакції в оці. Автором самостійно забирався
біологічний матеріал для молекулярно-генетичного (n=89), гістологічного
(n=88), і біохімічного дослідження (n=60). Здобувачем особисто
проведений клініко-генеалогічний аналіз, а також зіставлення результатів
клінічних, морфологічних, молекулярно-генетичних, імунологічних,
біохімічних методів дослідження і їх узагальнення. Спосіб лікування
запальної реакції після кератопластики у хворих з дистрофіями
розроблений в співавторстві з д.м.н. Дегтяренко Т.В. Морфологічні
дослідження проведені при консультативній допомозі проф.В.В.Віта.
Молекулярно-генетичні дослідження проведені в інституті
молекулярної-біології і генетики НАН України м. Київ при консультативній
допомозі зав. відділом геномики людини д.б.н. Л.А. Лівшиць. Імунологічні
дослідження (n=81) проведені в лабораторії імунології інституту очних
хвороб і тканинної терапії ім. В.П. Філатова АМН України. З науковим
консультантом роботи д.м.н. Н.В. Пасєчніковою обговорені і узагальнені
основні наукові і практичні положення дисертації. Самостійно автором
проведений статистичний аналіз отриманих результатів при консультативній
допомозі наукового співробітника Драгомірецкої Е.І.

В наукових роботах, опублікованих за темою дисертації в співавторстві
провідна роль у визначенні задач дослідження, аналізі результатів,
визначення їх цінності для застосування в клініці належить дисертанту.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації викладені
на 93, 96, 98-102 Конгресах німецького офтальмологічного суспільства у
1996, 2000-2004 р., IX і X з’їздах офтальмологів України (Одеса, 1996,
2002); X Міжнародній конференції офтальмологів Одесса-Генуя (Одеса,
1997), XI Congress of the European Society of Ophthalmology (Budapest,
1997), XXVIIIth міжнародному конгресі офтальмологів (Амстердам, 1998),
XII Конгресі Європейського офтальмологічного товариства (Стокгольм,
1999), науковій конференції офтальмологів, присвяченій 125-річчю з дня
народження В.П. Філатова (Одеса, 2000), Ювілейній Всеросійській
конференції, присвяченій 100-річчю НДІ очних хвороб ім. Гельмгольця
(Москва, 2000), Ювілейній науково-практичній конференції офтальмологів з
міжнародною участю, присвяченій 100-річчю кафедри і клініки очних хвороб
(Одеса, 2003), Європейській конференції по генетики людини (Бірмінгем,
Англія, 2003), ювілейному симпозіумі “Актуальні проблеми офтальмології”
(Москва, 2003), науково-практичній конференції по офтальмології
“Актуальні проблеми медико-соціальної експертизи і реабілітації
інвалідів унаслідок офтальмопатології” (Дніпропетровськ, 2003),
Всеросійській науково-практичній конференції офтальмологів “Нові
технології в лікуванні захворювань рогівки” (Москва, 2004), науковій
конференції офтальмологів Причорномор’я (Одеса, 2004), Міжнародному
семінарі “Інформаційні системи і технології” (Одеса, 2004), засіданнях
одеського обласного наукового офтальмологічного товариства (2000,
2002-2004 рр.), на міжобласних науково-практичних конференціях
офтальмологів (Рівно, 1999; Івано-Франківську, 2001; Дніпропетровську
2002; Ужгороді 2004), міжнародній конференції “Біофізичні стандарти та
інформаційні технології в медицині” (Одеса, 2004).

Публікації. Основні результати опубліковані в 44 наукових роботах, в
яких відображено зміст роботи і отримані результати. З них 22 журнальні
статті, які опубліковані в наукових виданнях, затверджених ВАК України,
отриманий 1 патент на винахід, 21 робота опубліковано в матеріалах і
тезах конференцій, симпозіумів, з’їздів .

Об’єм і структура дисертації. Дисертація викладена на 376 сторінках
комп’ютерного тексту на російській мові. Вона складається з вступу, 12
розділів власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів
дослідження, висновків, списку використаних джерел літератури, 76
таблиць, ілюстрована 70 малюнками, які займають 25 окремих сторінок
Список літератури складається з 273 джерел, які займають 24 сторінки.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Характеристика хворих. Клінічні дослідження проведені у 276 хворих з
СДСР (615 спостережень, очей) у віці від 6 до77 років (М=40,8?14,2SD).
Чоловіків було 325 (52,8%), жінок – 290 (47,2%). У зв’язку з тим, що
частина хворих лікувалася в стаціонарі з приводу СДСР неодноразово, в
роботі використовували термін “спостереження” (число очей), який включає
зареєстрований стан ока на час чергового консервативного або
хірургічного лікування пацієнта. З числа обстежених хворих 101 хворий
(224 ока) належали до архівної групи, 175 хворих (391 очей) – склали
власні спостереження.

З класичних видів СДСР найчастіше зустрічалася гратчаста дистрофія –
40,2%, вузликова і плямиста склали 31,1% і 26,0%, відповідно.
Кристалічна дистрофія Шнайдера і дистрофія Рейс-Бюклерса спостерігалися
рідко, відповідно – 0,9% і 1,8% (табл.1.).

Таблиця 1

Розподіл обстежених хворих з СДСР по видах дистрофії і віку

Вид дистрофії Кількість спостережень

(очей) хворих

Вік (в літах)±SD

абс.

%

Вузликова 191 31,1 41,65±12,65

Гратчаста 247 40,2 45,5±13,75

Плямиста 160 26,0 33,8±12 33

Кристалічна 6 0,9 37,0±22,04

Рейс-Бюклерса 11 1,8 24±21,6

Всього 615 100

Консервативне лікування проведено на 179 очах, хірургічне – на 436.
Пошарова КП здійснена на 334 (82,1%) очах, крізна – КП на 73 (17,9%).
Фототерапевтична кератектомія проведена у 17 хворих на 19 очах.

Клінічні дослідження, проведені у хворих з СДСР, включали: візометрію,
дослідження переднього відділу ока при боковому освітленні,
біомікроскопію, флюоресцеїновий тест, тонометрію, периметрію, визначення
величини сумарної сльозопродукції, часу розриву слізної плівки,
ультразвукове дослідження середовищ ока, офтальмоскопію, фоторегістрацію
змін в рогівці.

Частоту спіткання запального компоненту (ЗК) в клінічному перебігу СДСР
оцінювали на підставі вивчення даних анамнезу, клінічних і морфологічних
досліджень. Залежно від наявності ЗК в перебігу СДСР всіх хворих
розділили на 2 групи – з наявністю ЗК і відсутністю ЗК. В групу хворих
“без ЗК” були включені пацієнти з СДСР з відсутністю клінічних ознак
запальної реакції з боку кон’юнктиви і рогівки протягом всього періоду
спостереження. В групу “з ЗК” були включені хворі з рогівковим
синдромом, наявністю рецидивуючих ерозій, персистируючих дефектів
епітелію, а також із запальною інфільтрацією строми різного ступеня
(кератити, виразки, абсцеси). До часто рецидивуючого відносили ЗК, який
спостерігався кілька разів в році або щорічно. До рідко, рідко
рецидивируючого – той, що спостерігався не більшеодного разу в 3-5 років
і рідше.

Матеріал і методи дослідження. Клінічні і генеалогічні дослідження
проведені у 276 хворих.

Морфологічні дослідження проведені в 88 дисках рогівки, отриманих під
час крізної і пошарової кератопластики. Светлооптичним методом вивчено
21 диск рогової оболонки, отриманий після КП хворих з вузликовою
дистрофією, 36 дисків з ГД, 31 диск – з плямистою СДСР. При первинній КП
одержано 69 рогівкових дисків, 19 – при ретрансплантації. Для визначення
якісного складу депозитів використовували гістохімічні дослідження,
зрізи офарблювали Конго-червоним (на амілоїд) і Массоновим трихромовим
(на гіалін). Ультраструктурним методом з цього матеріалу вивчено 26
дисків.

Молекулярно-генетичні дослідження для визначення мутацій в 4 і 12
экзонах гена TGFBI проведені у 69 індивідів з НСДР і у 20 клінічно
здорових членів їх сімей. З них було 42 дорослих пацієнта і двоє дітей
трьох і одинадцяти років з 23 неродинних сімей з гратчастою дистрофією
(тип 1); 12 дорослих пацієнтів і троє дітей – восьми, дев’яти і десяти
років з одинадцяти неродинних сімей з вузликовою дистрофією (Грену І);
п’ять хворих з п’яти неродинних сімей з плямистою дистрофією (Грену II),
двоє дорослих пацієнтів, а також троє дітей, з них двоє сибсів шести і
15 років з дистрофією Рейс-Бюклерса з двох неродинних сімей. ДНК була
екстрагована з лейкоцитів периферичної крові методом фенол-хлороформної
екстракції (Манитиас Т. з співавт., 1984). Для аналізу мутантного
варіанта послідовності 4-го і 12 екзонів гена TGFBI проводили специфічну
ампліфікацію ДНК in vitro методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)
(Saiki R. et al.,1988). Для диференціального аналізу певних типів
мутацій проводили гідролітичне розщеплення продуктів ПЛР наступними
ендонуклеазами рестрикції: PstI, DraIII, RsrII, BstXI, BgIII для мутацій
R124C, R124H, R124L, R555W, R555Q, відповідно. Гидролізованні продукти
ПЛР аналізували після їх розділення електрофорезом в 10%
поліакріламідному гелі.

Для оцінки метаболізму рогівки вивчений стан
окислювально-відноволювальних процесів, протеїназно-інгібіторного
балансу, а також стабільність мембран лізосом. Визначення активності
лактатдегідрогенази проведено за методом H.Bergmeyer (1970). Активність
глюкозо-6-фосфат дегідрогенази визначали за методом G.Lohr (1970).

Визначення сумарної активності трипсиноподібних протеїназ і
антитрипсинової активності проведено за методом Чеснокової Н.Б. ((1995).
Стан мембран лізосом оцінювали, використовуючи визначення
неседиментованої і пов’язаної з мембранними компонентами активності
ферментів – кислої фосфатази і катепсина Е (Дингл Дж.1980). Всі ці
біохімічні дослідження проведені в тканині рогівки 28 хворих з ГД; 15
хворих з плямистою дистрофією і 17 хворих з вузликовою дистрофією..

Імунологічні дослідження проведені у 81 хворого з НСДР з використанням
загальноприйнятих методів визначення кількості основних популяцій і
субпопуляцій лімфоцитів в периферичній крові (Дегяренко Т.В., 1990), а
також визначення абсолютного вмісту лімфоцитів (СД3+), у тому числі
Т-хелперів (СД4+) і Т-супресорів (СД8+), абсолютний вміст В-лімфоцитів
(СД19+) з використанням моноклональних антитіл (Глузман Д.Ф., 2003).
Також визначали фагоцитарну активність нейтрофілів, вміст
імуноглобулінів основних класів (А, М і G) в плазмі крові методом
радіальної імунодифузії по Манчині; рівень аутосенсибілізації до
аутоантигенів рогівки на основі тестів навантажень активних Е-РОК з
антигенами рогівки ока (Дегтяренко Т.В., Макулькин Р.Ф., 1997).

Аналіз результатів КП здійснювали за такими показниками: вік пацієнтів,
вік, в якому проведена перша КП, вид дистрофії, вид КП, наявність ЗК в
клінічному перебігу СДСР, його частота, гострота зору після КП без
корекції і з максимальною корекцією, наявність ускладнень в
післяопераційному періоді, наявність ретрансплантацій, терміни
збереження прозорості трансплантата. Для вивчення ефективності крізної і
пошарової КП на підставі вивчення перерахованих клінічних показників
нами була розроблена комплексна оцінка стану рогівки КП, що включає
шість найбільш інформативних показників.

Тривалість збереження прозорості трансплантата після кератопластики при
СДСР і визначення чинників, що впливають на його помутніння, вивчені на
підставі ретроспективного аналізу віддалених результатів кератопластик
(крізної і пошарової) на 224 очах хворих з СДСР. З них з приводу
вузликової дистрофії КП проведена на 79 (35,3%), гратчастої – на 73
(32,6%), плямистої – на 72 (32,1%) очах. Терміни спостереження за станом
трансплантата коливалися від 7,5 місяців до 20,5 років (51,9±37,4SD)
міс.

Експериментальні дослідження виконані на 39 кроликах (78 очей) породи
шиншила у віці від 8 до 12 місяців масою 2,0-3,0 кг. На моделі
виразкового бактерійного кератита (ВБК) вивчали вплив флогензима на
особливості клінічного перебігу запального процесу і морфологічні зміни
в рогівці; стабільність лізосомальних мембран, стан
протеїназно-інгібіторного балансу, а також на обмін білків в тканині
рогівки (методом радіоактивної індикації з використанням амінокислоти
пролін, міченої по водню (3 Н-D, L -2,3,4,5-пролін). В експерименті
вивчено вплив флогензима на особливості імунологічної реактивності
організму при модельованому ВБК.

Клінічні дослідження по вивченню ефективності флогензима після КП
проведені у 23 хворих НСДР (17 – з гратчастою, 2 – з вузликовою і 4 – з
плямистою дистрофією). Флогензим призначали перорально по 476 мг 3 рази
на день за троє діб до кератопластики і протягом трьох тижнів після
операції у складі комплексного лікування.

Залежно від характеру даних, отриманих в ході дослідження, застосовували
відповідні методи статистичного аналізу. Для оцінки чисельних показників
розраховували середнє значення (М) і стандартне відхилення (SD). Для
оцінки відмінностей в двох групах використовувався критерій Стьюдента.
Оцінку чисельних показників до і після лікування здійснювали за
допомогою критерію Стьюдента для зв’язаних вибірок (Реброва О.Ю.2002).
При оцінці чисельних показників в трьох групах використовувався
дисперсійний аналіз з подальшим застосуванням критерію множинного
порівняння Ньюмана-Кейлса (Гланц С., 1999). Для чисельної оцінки
бінарних факторів ризику неефективності лікувальних дій, розраховували
відношення шансів (odds ratio) і відповідні довірчі інтервали (Реброва
О.Ю.2002). З метою вивчення впливу групи факторів на оптичний результат
кератопластики використовували метод багатофакторного аналізу,
реалізований у вигляді мультиваріантного математичного моделювання з
використанням логістичної регресії (Янковой А.Г., 2001). Для оцінки
стану очей хворих з СДСР одночасно по декількох ознаках був застосований
метод автоматичного угрупування – кластерний аналіз (Юнкеров В.И.,
Григорьев С.Г.,2002). Для аналізу чинників, що впливають на оптичний
результат кератопластики, був застосований дисперсійний аналіз (Бюль
Ахим, 2002). З метою отримання моделей прогнозу оптичного результату
пошарової КП використовували дискримінантний аналіз, нейросітьове
моделювання (Каллан Р., 2001). Імовірність збереження прозорості
трансплантата аналізували з використанням методу множинних оцінок
Каплан-Мейера (Гланц С., 1999). Для оцінки впливу чинників ризику на
імовірність помутніння трансплантата використовували регресійну модель
Коксу (Кокс Д.Р., 1998).

Результати дослідження та їх обговорення.

Аналіз частоти спіткання ЗК залежно від виду дистрофії показав тісний
зв’язок між цими показниками (?2=109,5; р=0,00007), найбільш часто в
93,6% випадків ЗК спостерігався у хворих з гратчастою дистрофією.
Частота спіткання ЗК в клінічному перебігу вузликової і плямистої
дистрофії склала 50,0% і 62,5%, відповідно. Клінічні дослідження
показали, що рецидивуючі ерозії з рогівковим синдромом спостерігалися на
305 очах (49,6%), кератити – на 91 (14,83%), виразки рогівки – на
21(3,4%), абсцеси рогівки – на 6 очах (1,0%).

При всіх видах СДСР при наявності в їх клінічному перебігу ЗК
спостерігалися дегенеративні зміни рогівки – фокальні або дифузні
різного ступеня вираженості від помірних, що дозволяли розглянути
клінічні ознаки дистрофій, до інтенсивних, які мали вид більма. Останні
не дозволяли визначити вид дистрофії.

Перша кератопластика при наявності ЗК в клінічному перебігу вузликової
СДСР проведена в (42,1±11,4) роки, при його відсутності на 1,5 роки
пізніше – в (43,7±11,5) років; при ГД – в (48,6±10,6) і (59,0±5,7) років
(р=0,035), відповідно; при плямистій дистрофії – в (30,2±SD9,6) і –
(35,2±SD9,4) років (р=0,005), відповідно. Таким чином, при наявності ЗК
у хворих на СДСР кератопластика проводилася в більш ранньому віці, що
очевидно пов’язано із збільшенням вторинних дегенеративних змін в
рогівці.

При світлооптичному дослідженні дисків рогівки, отриманих при первинній
КП (n=69), типові морфологічні зміни, характерні для СДСР, були знайдені
в 49 дисках (71,0%) – у 20-ти хворих з плямистою, 11 – з вузликовою, і
18 з гратчастою дистрофією (Табл. 2).

Таблиця 2

Характер морфологічних змін, виявлених світлооптичним методом в рогівці
хворих з СДСР при первинній кератопластиці

Морфологічні зміни Вид дистрофії

Вузликова (n=17)

Гратчаста (n=28)

Плямиста

(n=24)

Всього

(n=69)

Абс.

%

Абс.

%

Абс.

%

Абс.

%

Частота типових депозитів 11 64,7 18 64,3 20 83,30 49 71,0

Частота неспецифічних дегенеративних змін 15 88,2 28 100,0 24 100 67
97,1

Частота запальних змін 2 11,8 10 35,7 16 25,0 28 40,6

В решті 20 дисків депозитів, характерних для НСДР, не виявлено. В
переважній більшості дисків – 67 (97,1%) були знайдені неспецифічні
дегенеративні зміни епітелію, БМ і строми.

Запальні зміни строми рогівки у вигляді інфільтрації плазматичними
клітинами і сегментоядерними лейкоцитами та помірної лимфоидної
інфільтрації знайдені в 28 дисках (40,6%). У всіх хворих, із запальними
змінами в дисках рогівки, в анамнезі були встановлені часто рецидивуючі
(не менше 2-3 разів на рік) ерозії і кератити. Вираженість
дегенеративних змін як при клінічному, так і при морфологічному
дослідженні у хворих одного і того ж віку з часто рецидивуючими
запальними процесами (2-3 рази на рік), значно перевищувала таку у
хворих, в анамнезі яких запальні процеси були відсутні, або
спостерігалися рідко (1 раз в 3-5 років). Отримані дані свідчать про те,
що запальні процеси в роговій оболонці хворих з СДСР прискорюють
розвиток дегенеративних змін в рогівці, що веде до більш раннього
зниження зору.

Порівняльний аналіз морфологічних змін в рогівці хворих з СДСР при
первинній кератопластиці і ретрансплантації показав, що неспецифічні
дегенеративні зміни виявляються у всіх дисках порівнюваних груп. При
цьому типові депозити знайдені в 1,7 разів рідше при ретрансплантаціях
(в 71,0% дисків при первинній КП і 42,1% – при ретрансплантаціях).
Запальні зміни в дисках при ретрансплантаціях виявлені у 47,4% випадків,
– при первинній КП – у 40,4%. Отримані результати дозволяють вважати, що
в 47,4% випадків ретрансплантація була обумовлена не рецидивом
дистрофії, а запальними і дегенеративними змінами трансплантата.

При морфологічному дослідженні найбільш схільний до зберігання стан
структур рогівки відзначено при вузликовій дистрофії. Найбільш виражені
дегенеративні зміни в епітелії і субепітеліальних шарах знайдені при ГД,
що очевидно пов’язано з високою частотою спіткання ЗК при цій СДСР.
Проведені дослідження выявили морфологічні відмінності тканин рогівки у
хворих з ГД при наявності ознак запалення від класичної морфологічної
картини гратчастої дистрофії: часта відсутність типових депозитів,
можливо в результаті резорбції специфічних депозитів клітинами
запального інфільтрату; наявність запальних вогнищ, що складаються з
макрофагів; наявність відкладень складного гіаліна, що утворюється в
результаті деструкції колагену; виражена дегенерація сполучної тканини
строми: кератоцитів, колагенових волокон і основної речовини.

Таким чином, отримані результати свідчать про те, що наявность ЗК при
СДСР прискорює розвиток дегенерації рогівки, веде до більш раннього
зниження зору, істотно змінює клінічну картину дистрофії і ускладнює
диференціальну діагностику різних видів НСДР.

За результатами клініко-генеалогічного обстеження у всіх пацієнтів ГД
рогівки встановлений аутосомно- домінантний тип спадкування.

В результаті молекулярно-генетичного аналізу четвертого экзона гена
TGFBI мутація R124C знайдена у 35 дорослих пацієнтів (79,5%) з 23
неродинних сімей з ГД і однієї 11-річної дитини. У восьми сім’ях з
клінічним діагнозом ГД, в шести з яких клінічний діагноз був
підтверджений морфологічними дослідженнями, мутація R124C, характерна
для класичної РД (тип 1) не знайдена. Результати молекулярно-генетичних
досліджень стали підставою для поглибленого клінічного обстеження
пацієнтів в сім’ях цих пацієнтів. При детальному аналізі особливостей
клінічного перебігу ГД в цих сім’ях знайдені такі загальні фенотипічні
ознаки ГД – відносно пізній початок захворювання (26-46 років), а також
досить товсті решітковидні структури в стромі рогівки. Ці клінічні дані
дозволіли припустити в даних сім’ях наявність іншого типу ГД, що
підтверджує відсутність мутації R124C (Arg124Cys) в четвертому екзоні
гена TGFBI, специфічної для класичної ГД (тип 1). Можна припустити,
ураховуючи аутосомно-домінантний тип спадковості ГД, в цих сім’ях ГД
III-A або IV типу. Для точного встановлення типу ГД необхідне
молекулярно-генетичне дослідження інших мутацій в гені TGFBI, а також в
інших генах.

У двох сибсів шести і 15 років з однієї сім’ї з клінічним діагнозом
дистрофія Рейс-Бюклерса при молекулярно-генетичному дослідженні знайдена
мутація R124C (Arg124Cys) в четвертому екзоні гена TGFBI, специфічна для
класичної ГД рогівки (тип 1). Таким чином, первинно встановлений
клінічний діагноз дистрофія Рейс-Бюклерса виявився невірним і на
підставі результатів молекулярно-генетичного дослідження був змінений на
гратчасту дистрофію рогівки. У трьох членів іншої сім’ї з клінічним
діагнозом дистрофія Рейс-Бюклерса, включаючи семирічну дитину, знайдена
мутація R124Q, специфічна для дистрофії Рейс-Бюклерса. Таким чином, в
цій сім’ї поставлений нами клінічний діагноз відповідав даним
молекулярно-генетичного дослідження.

З п’ятнадцяти хворих вузликовою дистрофією рогівки (Грену 1) мутація
R555W (Arg555Trp) в 12 екзоні гена TGFBI, характерна для цієї дистрофії,
виявлена у дев’яти пацієнтів (60,0%) з п’яти неродинних сімей, з них у
однієї дитини 9 років. У шести хворих з п’яти неродинних сімей з
клінічним діагнозом вузликова дистрофія рогівки (тип 1) специфічна для
цієї дистрофії мутація R555W (Arg555Trp) не знайдена. Аналіз родоводу,
фенотипічних особливостей дистрофії, а також результатів
молекулярно-генетичного дослідження дозволив вважати первинно
встановлений клінічний діагноз вузликової дистрофії рогівки невірним і
змінити його на плямисту дистрофію рогівки (Грену II). З п’яти сімей з
клінічним діагнозом плямиста СДСР ні в одному випадку мутацій в гені
TGFBI не знайдено. Отримані результати свідчать про відносність ролі
клінічних ознак в диференціальній діагностиці різних видів СДСР, що
виявляється в незбіжності клінічного діагнозу з результатами
молекулярно-генетичних досліджень як на ранніх стадіях захворювання,
коли клінічні ознаки дистрофії досить мізерні, так і на пізніх стадіях
розвитку захворювання, коли в клінічній картині дистрофії переважають
вторинні дегенеративні зміни і відмежувати вид, а тим більш тип
дистрофії, нерідко не можливо. Таким чином, у хворих з СДСР клінічних,
генеалогічних і морфологічних даних може бути недостатньо для правильної
постановки діагнозу. Для точного встановлення виду і типу дистрофії
необхідний молекулярно-генетичний аналіз, проведення якого можливо в
будь-якому віці і стадії розвитку дистрофії.

Стан метаболізму рогівки і мембран лізосом клітинних структур рогівки
при СДСР з наявністю запального компоненту і без нього вивчени у 60
хворих. З них 28 хворих були з гратчастою (15 – з наявністю ЗК і 13 –
без нього); 15 – з плямистою (8 з наявністю ВК і 7 – без нього) і 17 – з
вузликовою дистрофією (8 – з наявністю ВК і 9 – без ВК).

При визначенні стану окислювально-відновлювальних процесів в тканині
рогівки хворих з СДСР встановлено підвищення активності ЛДГ при
гратчастій дистрофії на 27,6% (р0,05), в порівнянні з контролем.
При запаленні активність ЛДГ в тканині рогівки зростала і перевищувала
контрольні значення показника при гратчастій дистрофії на 59,9%
(р0,05), в порівнянні з контролем. В групі “із запаленням” АТП
підвищувалася більш, ніж у 2 рази – на 54,4% (рae? OJPJQJ ?(? ’ ? ss»»—s—sS @ @ aa1/21/21/21/21/21/2–1/21/21/2v @ $ @ O $ @ ?? ?$??? ?$??? Y6#- @ @ @ @ @ ??????????=4,739, р=0,029). За даними гістологічного дослідження до кінця експерименту на 28 добу в основній групі спостерігалося стихання запального процесу в рогівці, тоді як в контрольній групі – збереження ознак гострого запалення. Під впливом флогензима встановлено зниження рівня аутосенсибілізації організму до антигенів рогівки (18,20?7,02% до 4,2?2,89%) в порівнянні з групою тварин, що одержували традиційне лікування з (10,4?5,0)% до (2,18?2,9)%, а виявлена відмінність в ступені зміни цього показника між основною і контрольною групами була достовірна ( р=0,05). Вивчення впливу флогензима на протеїназно-інгібіторний баланс показало, що в гострій фазі модельованого ВБК під впливом препарату встановлено достовірне підвищення сумарної АТП в рогівці на 19,4-22,6% на фоні тенденції до підвищення АТА, що може сприяти більш швидкому видаленню пошкоджених білкових і клітинних структур з тканини рогівки. В репаративної фазі виразкового кератита під впливом флогензима відзначено зниження АТП в рогівці з одночасним підвищенням антитрипсинової активності на 23,2-26,2%, що створює оптимальні умови для регенерації. При вивченні впливу флогензима на різні форми лізосомальних ферментів встановлений його стабілізуючий вплив на мембрани лізосом клітинних структур рогівки, про що свідчить зниження відношення неседиментованої активності кислої фосфатази і катепсина Е до зв'язаної активності цих ферментів в гострій фазі запального процесу - у 1,6 і 1,9 рази, у фазі репаративної регенерації – у 2 і 2,5 рази, відповідно, для кожного ферменту. При вивченні впливу флогензима на біосинтез білків рогівки встановлено, що інтенсивность накопичення міченої амінокислоти пролін (Н3- D, L- 2, 3, 4, 5-пролін) в тканинах ока інтактних тварин складав в рогівці 611,9±41,85, в райдужній оболонці -784,4±33,21, в циліарному тілі - 641,3±47,23 імп/хв. Результати визначення ступеня накопичення радіоактивного ізотопу в тканинах ока показали, що інтенсивність накопичення в рогівці тварин, що одержували традиційне лікування на 36,6% нижче (р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020