Українська Академія Аграрних наук

Нікітський ботанічний сад – Національний науковий центр

Митрофанова

Ірина Вячеславівна

УДК 504.73:57.085.2

Соматичний ембріогенез та органогенез як основа біотехнології отримання
і збереження багаторічних садових культур

03.00.20 — біотехнологія

Автореферат

дисертація на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Ялта – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі біотехнології і біохімії рослин Нікітського
ботанічного саду — Національного наукового центру УААН

Науковий консультант:

доктор технічних наук,

професор, академік УААН

Єжов Валерій Микитович,

Нікітський ботанічний сад – Національний науковий центр УААН,

завідувач відділу біотехнології і біохімії рослин.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор

Кучук Микола Вікторович,

Інститут клітинної біології і генетичної інженерії НАН України,

в.о. завідувача відділу генетичної інженерії;

доктор біологічних наук, професор

Бугара Олександр Михайлович,

Таврійській національний університет ім. В.І. Вернадського

Міністерства освіти і науки України,

завідувач кафедри фізіології рослин і біотехнології;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Ігнатова Світлана Олександрівна,

Південний біотехнологічний центр у рослинництві УААН і МОН України,
завідувач лабораторії культури тканей.

Захист відбудеться “2” листопада 2007 р. о 10.00 год. на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 53.369.01 при Нікітському ботанічному саді
– Національному науковому центрі за адресою: 98648, Україна, АР Крим, м.
Ялта, Нікітський ботанічний сад – Національний науковий центр

Факс: (38) 0654 33-65-50, Е-mail: [email protected]

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Нікітського ботанічного
саду – Національного наукового центру за адресою: 98648, Україна, АР
Крим, м. Ялта, НБС-ННЦ

Автореферат розісланий “5” вересня 2007 року.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук
Садогурський С.Ю.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Біотехнологічні підходи, засновані на культивуванні
органів і тканин багаторічних садових рослин поза організмом, на штучних
живильних середовищах у регульованих асептичних умовах, відкривають
принципово нові можливості для фундаментальних і прикладних досліджень.
Рослинні системи in vitro є зручними моделями для дослідження складних
механізмів, що лежать в основі проліферації, клітинної диференціації,
гістогенезу, органогенезу, соматичного ембріогенезу та регенерації
цілого організму з клітин, що культивую Также и бонитировка? – Кем
предложена – не указано. ться і мають тотипотентність (Бутенко, 1964,
1999; Кунах, 1995, 2005; Deverno, 1995; Merkle, 1997; Thorpe, Harry,
1997; Батыгина, Васильева, 2002). У прикладному аспекті на основі знань
про біологію клітини in vitro розробляються меристемні технології,
ембріокультура, гаплоїдні технології, клітинна селекція, генна та
клітинна інженерія (Здруйковская-Рихтер, 2003; Ігнатова, 2001; Мельничук
та ін., 2003; Jain, Ishii, 2003). Теоретичну основу абсолютно всієї
методології культури клітин, органів і тканин, у тому числі клонального
мікророзмноження, становить морфогенез in vitro. Незважаючи на наявні
експериментальні роботи в галузі вивчення процесів морфогенезу і
регенерації рослин в умовах in vitro, досі залишаються не розробленими
системи отримання та збереження рослин in vitro для більшості
багаторічних садових культур. Це обумовлено відсутністю чітких, добре
відтворюваних методик, їх трудомісткістю, а також нестачею знань про
морфогенетичні потенції органів і тканин цих культур та способи
управління морфогенезом.

Колекційний генофонд Нікітського ботанічного саду — Національного
наукового центру містить у собі різноманітні види та сорти декоративних,
субтропічних і кісточкових плодових, ефіроолійних рослин, що мають як
естетичне, так і господарське значення. Разом з цим, складнощі, що
виникають при традиційному розмноженні, у процесі селекції і збереження
багаторічних садових культур, спонукають науковців звертатися до
сучасних методів біотехнології рослин.

Отже, спрямовані на глибоке вивчення процесів соматичного ембріогенезу
та органогенезу дослідження є вельми актуальними, бо не тільки
дозволяють поповнити знання про морфогенез рослин у цілому, зробити
істотний внесок у розробку його теоретичних основ, але й розробити
біотехнологічну методологію розмноження та збереження цінних видів і
сортів декоративних, субтропічних і кісточкових плодових культур та
ефіроолійних рослин.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. У дисертаційній
роботі узагальнено результати науково-дослідної роботи, виконаної у
відповідності до науково-тематичних планів відділу біотехнології і
вірусології рослин у рамках науково-технічних програм УААН за темами
“Інтродукувати і вивчити генофонд декоративних, плодових і технічних
рослин, удосконалити методи селекції і біотехнології та на їх основі
створити нові сорти інтенсивного типу” (№ ДР 0192U034076), “Поповнення і
вивчення генофонду плодових, субтропічних, горіхоплідних, декоративних,
ефіроолійних, лікарських, пряноароматичних і красильних рослин;
створення їх продуктивних і стійких сортів з використанням сучасних
методів фізіології, біохімії й біотехнології” (№ ДР 0197U004324),
“Розробити теоретичні і практичні принципи збереження і збільшення
біологічного різноманіття декоративних, плодових і нових технічних
рослин шляхом інтродукції, акліматизації, біотехнології та спрямованої
селекції” (№ ДР 0101U007189), згідно з тематичним планом державної
науково-технічної програми 03.04-МВ/322-97 “Теоретичні основи селекції
та насінництва сільськогосподарських культур” за завданням “Розробити
методи інтенсифікації формоутворюючих процесів субтропічних,
горіхоплідних і кісточкових плодових культур через отримання сома- і
каліклонів”, планом науково-технічної програми УААН “Біотехнологія
культурних рослин 2001-2005 рр. “Розробка і впровадження ДНК-технологій,
культури тканин та органів in vitro для розвитку теорії і практики
селекції рослин”, затвердженої постановою Президії УААН (протокол №17
від 21.12.2000 р.), у рамках Державної НТП 02.12 “Перспективні
біотехнології” за договором №2/655-97 і проектом 02.12/07734
“Синтезувати поліплоїди лікарських рослин Hyssopus officinalis L. та
Nepeta cataria var.citriodora Beck. з використанням антимікротрубочкових
сполук в умовах in vitro” з Міністерством України у справах науки та
технології (№ ДР 0198U002007), у рамках Державної НТП 3.2.
“Біотехнологія рослин та біобезпека” за договором ДП/39-2003 і проектом
03.02.02/0000728 “Розробити раціональну систему збереження в умовах in
vitro цінних генотипів декоративних рослин, субтропічних і кісточкових
плодових культур” з Міністерством освіти і науки України (№ ДР
0103U005992). З 2006 р. робота продовжується за завданням відділу
біотехнології і біохімії рослин НБС-ННЦ УААН 09.02/017 “Створити в
умовах in vitro колекції цінного рослинного генофонду на основі вивчення
біотичних і абіотичних факторів безпересадочного культивування
регенерантів плодових, субтропічних і декоративних культур” (№ ДР
0106U006808).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи — виявити закономірності процесів
соматичного ембріогенезу та органогенезу декоративних, субтропічних,
кісточкових плодових і ефіроолійних культур і на їх основі розробити
системи розмноження та збереження in vitro досліджуваних видів і сортів.

Відповідно до поставленої мети передбачалося вирішити такі завдачі:

1. Встановити морфогенетичні потенції органів і тканин ломиноса і
розробити систему прямого і непрямого соматичного ембріогенезу.

2. Виявити особливості регенерації рослин каладіума і показати можливі
шляхи морфогенезу in vitro цієї культури.

3. Визначити оптимальні умови культивування експлантів фікуса
ліровидного, що індукують процес соматичного ембріогенезу.

4. Установити закономірності регенерації рослин субтропічних плодових
культур (зизифус, ківі, фейхоа, хурма) в умовах in vitro.

5. Дослідити особливості прямої регенерації рослин in vitro з листкових
дисків ефіроолійних рослин (м’ята котяча, гісоп).

6. На основі встановленого регенераційного потенціалу експлантів
декоративних (ломиніс, троянда, орхідея, юка), субтропічних (ківі,
фейхоа) і кісточкових плодових (алича, персик, слива) культур розробити
систему in vitro для тривалого збереження рослин при низьких позитивних
температурах.

7. Провести порівняльний аналіз особливостей морфогенезу in vitro
культур, які вивчалися і виявити закономірності та шляхи регенерації
рослин.

Об’єкт дослідження. Процеси соматичного ембріогенезу та органогенезу in
vitro.

Предмет дослідження. Шляхи реалізації морфогенетичного потенціалу різних
експлантів досліджуваних культур, особливості одержання та депонування
рослин в умовах іn vіtro.

Методи дослідження. Методи культури органів і тканин,
молекулярно-біологічний метод (полімеразно-ланцюгова реакція, ПЛР),
гістологічні методи, метод світлової та флуоресцентної мікроскопії,
методи статистичного аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше на основі проведеного
глибокого дослідження процесів прямого і непрямого соматичного
ембріогенезу in vitro ломиноса, каладіума, фікуса ліровидного
встановлено морфогенетичні потенції їх органів і тканин та
закономірності індукції формування і розвитку ембріоїдів. Виявлено
основні фактори, що впливають на частоту соматичного ембріогенезу рослин
і обумовлюють реалізацію морфогенетичних потенцій in vitro у
досліджуваних культур (індуктор, генотип, тип експланта, концентрація
цитокініну, температура та інтенсивність освітлення). Доведено висунуту
гіпотезу про провідну роль індуктора (соматичний зародок або група
соматичних зародків) у процесі соматичного ембріогенезу ломиноса.
Показано можливість формування 7 морфологічних типів соматичних зародків
ломиноса, з яких тільки 4 здатні до формування повноцінних рослин.
Вперше в результаті вивчення молекулярно-генетичної гетерогенності
рослин ломиноса, одержаних при різних способах регенерації in vitro,
встановлено особливості мінливості геному. Визначено, що збільшення
кількості пасажів підвищувало частоту вторинного соматичного
ембріогенезу ломиноса, каладіума та фікуса ліровидного. Вперше показано
різні шляхи реалізації морфогенетичного потенціалу вегетативних бруньок
ломиноса та висічок листка каладіума і фікуса ліровидного.

Вперше установлено високу регенераційну здатність листкових експлантів
ряду субтропічних плодових культур до адвентивного пагоноутворення, а
сім’ядолей – до соматичного ембріогенезу і прямої регенерації
мікропагонів.

Показано вплив розташування експланта на живильному середовищі,
концентрації фітогормонів, інтенсивності освітлення і температури на
процес прямої регенерації рослин м’яти котячої та гісопу. Доведено
позитивний ефект оптимальної концентрації тідіазурону на процес прямої
регенерації мікропагонів ефіроолійних культур.

Створено реципієнтні системи in vitro ківі, зизифуса, фейхоа, хурми,
м’яти котячої та гісопу на основі прямої регенерації цих рослин з
листкових експлантів, що свідчить про високу тотипотентність клітини.

Вперше розроблено основні принципи депонування in vitro декоративних,
субтропічних і кісточкових плодових рослин. Основним підходом до
збереження колекцій цінних генотипів є мінімізація росту експлантів і
запобігання їх старінню за рахунок комплексного використання кількох
ефекторів, таких як температура, інтенсивність освітлення, склад
живильного середовища, концентрації осмотика та ретарданту.

Практичне значення одержаних результатів. Уперше розроблено спосіб
прямого соматичного ембріогенезу ломиноса, що дав змогу масово
розмножити генетично однорідний посадковий матеріал. Підібрано склад
живильних середовищ для прямого і непрямого соматичного ембріогенезу
ломиноса. Розроблено способи соматичного ембріогенезу та органогенезу
каладіума. В результаті непрямого соматичного ембріогенезу і регенерації
мікропагонів з калюсу листків каладіума отримано нові форми, що
відрізняються розміром і забарвленням листкової пластинки. Вдосконалено
метод мікророзмноження фікуса ліровидного за рахунок розробки способу
прямого соматичного ембріогенезу з листка.

На основі вивчення впливу гормональних, трофічних і фізичних факторів
культивування на органи і тканини цінних субтропічних культур, таких як
зизифус, ківі, хурма та фейхоа розроблено способи регенерації рослин in
vitro з листкових дисків і подано реципієнтну систему для подальших
маніпуляцій, що підвищують ефективність створення нових форм і сортів.
Уперше розроблено і запатентовано в Україні спосіб прямої регенерації
мікропагонів з листкових експлантів ківі. Форми хурми, одержані
внаслідок прямої регенерації мікропагонів із сім’ядолей незрілих
зиготичних зародків, вирощуються в дослідному господарстві
“Новокаховське” (Херсонська обл.).

Уперше розроблено і запатентовано спосіб прямої регенерації адвентивних
мікропагонів гісопу звичайного. Використання цього методу дозволило
розмножити рослини м’яти котячої, які передано до відділу нових
ароматичних і лікарських рослин НБС-ННЦ і які перебувають у колекційних
посадках.

Уперше в Україні створено повільно зростаючу in vitro колекцію цінних
декоративних, субтропічних, кісточкових плодових рослин на основі
розробки біотехнологічної системи депонування рослин при низьких
позитивних температурах, що представлена 27 сортами троянди, 3 видами
орхідей, 1 видом юки, 9 сортами ломиноса, 4 сортами й 2 гібридами ківі,
2 формами фейхоа, 2 сортами аличі, 1 сортом абрикоса та 10 сортами
сливи.

Результати дисертаційної роботи використовуються в навчальному процесі
під час підготовки студентів, фахівців і магістрів на біологічному
факультеті Таврійського національного університету ім. В.І. Вернадського
(м. Сімферополь), на факультеті екології й біотехнології
Навчально-наукового інституту охорони природи і біотехнології
Національного аграрного університету (м. Київ), на біологічному
факультеті Московського державного університету ім. М.В. Ломоносова (м.
Москва, Росія), а також їх включено до лабораторних практикумів і
лекційних матеріалів спецкурсів “Основи біотехнології”, “Культура клітин
рослин з основами біотехнології”, “Клональне мікророзмноження рослин”,
“Біологія”, “Мікробіологія і вірусологія” та “Загальна біотехнологія”.

Особистий внесок здобувача. Результати досліджень, які подані в
дисертації, одержані здобувачем у відділі біотехнології і вірусології
рослин та у відділі біотехнології і біохімії рослин Нікітського
ботанічного саду – Національного наукового центру УААН. Дисертаційна
робота спланована і виконана автором під керуванням наукового
консультанта, д.т.н., професора, академіка УААН В.М. Єжова. Ідеї,
гіпотези та теоретичні концепції належать здобувачеві. Безпосередньо
дисертантом проведений інформаційний пошук і зроблений глибокий аналіз
даних світової літератури, підготовлений огляд. Автором проведені всі
лабораторні дослідження та роботи з адаптації рослин в закритому ґрунті.
Написання дисертації та її оформлення здійснене здобувачем самостійно.
Дослідження молекулярно-генетичної гетерогенності ломиноса проведено
разом із співробітниками Південного біотехнологічного центру УААН і МОН,
м. Одеса (д.б.н. Сиволап Ю.М., м.н.с. Галаєв А.В.). Онтогенетичні
дослідження соматичного ембріогенезу ломиноса та каладіума проведено
разом із співробітниками Інституту фізіології і біохімії рослин та
мікроорганізмів РАН, м. Саратов, Росія (д.б.н. Соколов О.І). До
дисертації включено дані експериментів, проведених разом з аспірантами,
науковими співробітниками різних підрозділів НБС-ННЦ.

Всеукраїнській конференції “Садівництво на межі тисячоліть” (Київ,
2000), Intl. Sci. Conf. “Growth, Development and Productivity of Plants.
Theoretical and practical Problems” (Babtai, Lithuania, 2000; 2004), 4
Intl. Conf. “Propagation of Ornamental Plants” (Sofia, Bulgary, 2000), X
Intl. Conf. “Plant Embryology” (Nitra, Slovak Republic, 2001), Intl.
Symposium “Biotechnology approaches for exploitation and preservation of
plant resources” (Yalta, 2002), II Ukrainian-Bulgarian Workshop on Plant
Biotechnology (Yalta, 2002), Всеукраїнській конференції молодих учених
“Актуальные вопросы современного естествознания – 2003” (Сімферополь,
2003), II Міжнародній конференції молодих учених “Современные проблемы
генетики, биотехнологии и селекции растений” (Харьків, 2003), IV
Міжнародній конференції “Геном растений” (Одеса, 2003), 5th Intl. Symp.
“Plant Biotechnology: Progress and Development” (Stara Lesna, Slovak
Republic, 2003), VIII Міжнародній конференції “Биология клеток растений
in vitro и биотехнология” (Саратов, Росія, 2003), Міжнародній
конференції “Охрана и культивирование орхидей” (Харьків, 2003),
Ukranian-U.K. Workshop on Plant Biotechnology “Biotech Approaches to
Engineering plant growth” (Yalta, 2004), Intl. Conf. of Baltic States
“Plant Tissue Culture: From Theory to Practice” (Salaspils, Latvia,
2004), Міжнародній конференції, присвяченій 60-річчю Головного
ботанічного саду ім. М.В. Цицина РАН, “Ботанические сады как центры
сохранения биоразнообразия и рационального использования растительных
ресурсов” (Москва, Росія, 2005), науковій конференції “Сучасна
біотехнологія в сільському господарстві та медицині” (Киев, 2005), V
Міжнародній конференції “Цветоводство без границ” (Харьків, 2006), III
Міжнародній конференції “Фактори експериментальної еволюції організмів”
(Алушта, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 61 наукову працю у
вітчизняних і зарубіжних виданнях, у їх числі 24 – у спеціалізованих
виданнях, 2 патенти України на винахід, 2 статті у збірнику наукових
праць, 33 – у збірниках матеріалів і тез міжнародних конгресів,
симпозіумів і конференцій.

Структура і обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 354 сторінках
комп’ютерного тексту. Вона складається зі вступу, 8 розділів, висновків,
практичних рекомендацій, списку використаної літератури, що включає 552
найменування, у їх числі 453 – іноземними мовами, і додатків. Дисертація
містить 38 таблиць і 106 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРНИХ ДАНИХ

У літературному огляді наведено детальний опис шляхів реалізації
морфогенетичного потенціалу органів і тканин вищих рослин в умовах in
vitro за допомогою соматичного ембріогенезу, як найважливішого
біологічного механізму розвитку і регенерації рослин. На численних
прикладах різних видів розглянуто його різні типи, генезис і фактори,
необхідні для ефективного функціонування цього унікального способу
розмноження рослин у різних системах in vitro, спрямованих на поліпшення
поданих культур та їх широкомасштабну репродукцію. Відзначено переваги і
недоліки кожного з досліджених різними авторами шляхів соматичного
ембріогенезу. Особливу увагу приділено складу живильних середовищ у
взаємозв’язку з вмістом трофічних компонентів і регуляторів росту.
Розглянуто роль останніх як індукторів, інгібіторів і тригерів етапів
соматичного ембріогенезу. Показано вплив фізичних факторів
(інтенсивність освітлення, спектральний склад світла, фотоперіод,
температура) на ефективність проходження окремих етапів цього процесу.
Відображено питання прояву сомаклональної мінливості при культивуванні
органів і тканин рослин в умовах in vitro. Представлено галузі
застосування соматичного ембріогенезу в біотехнології для цілей
розмноження, селекції і кріозбереження цінного рослинного матеріалу.
Показано сучасний стан питань прямої і непрямої регенерації вищих рослин
з різних експлантів і показано результати, одержані різними авторами в
процесі досліджень.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Для проведення досліджень було використано модельні рослини,
представлені видами, сортами та формами родин: Ranunculaceae, Rosaceae,
Ebenaceae, Myrtaceae, Moraceae, Agavaceae, Actinidiaceae, Araceae,
Orchidacea, Lamiaceae з колекційного генофонду НБС-ННЦ. В експерименти з
соматичного ембріогенезу та орагногенезу було включено експланти
ломиноса (Clematis L.), каладіума (Caladium hortulanum Birdsey.) і
фікуса ліровидного (Ficus lyrata Warb.). Для розроблення реципієнтних
систем in vitro як вихідний рослинний матеріал використано вегетативні
бруньки, листя, мікропагони і зародки хурми (Diospyros kaki Thunb.),
фейхоа (Feijoa sellowiana Berg.), зизифуса (Ziziphus jujuba Mill.), ківі
(Actinidia deliciosa (Chev.) Liang, Ferguson), м’яти котячої (Nepeta
cataria L.) та гісопу (Hyssopus officinalis L.). У дослідженнях з
депонування рослин і створення повільно зростаючих колекцій в умовах in
vitro використовувалися такі культури, як троянда (Rosa L.), ломиніс
(Clematis), цимбідіум (Cymbidium hybridum, C. minima), досинія (Dossinia
sp.), юка (Yucca aloifolia L., Y. torrey Shafer.), ківі (A. deliciosa),
фейхоа (F. sellowiana), абрикос (Prunus armeniaca L.), алича (Prunus
cerasifera Ehrh.), слива (Prunus domestica L.).

Умови стерилізації рослинного матеріалу підбиралися під кожну з
досліджуваних культур. Залежно від походження експланта, що вводився,
опрацьовувалися експозиція і концентрація стерилізуючого агента. Як
антисептики було використано комерційний препарат Domestos (Unilever
Madyarorszбg Kft., Угорщина), що містить 5% розчин гіпохлориту Na, 70%
етиловий спирт (Медасепт, Україна), 0,08% розчин AgNO3 (Merсk,
Німеччина), 1% розчин Thimerosal (Merсk, Німеччина), які звільняли
експланти, що вводяться, від бактеріальної та грибної інфекції.
Результати цих експериментів викладено в розділах 3, 4, 5 дисертації.

При вивченні морфогенетичних потенцій органів і тканин в умовах in vitro
досліджуваних культур було використано ряд базових живильних середовищ,
таких як Моньє (Monnier, 1973), Кнудсона С (Knudson, 1925), МС
(Murashige, Skoog, 1962), В5 (Gamborg, Eveleigh, 1968), КЛ (Quoirin,
Lepoivre, 1977), які при виконанні експериментів було модифіковано. Для
регулювання процесів соматичного ембріогенезу та органогенезу рослин in
vitro до складу живильного середовища вводили фітогормони цитокінінового
(0,44-44,00 мкМ БАП, 0,46-46,00 мкМ кінетину, 0,46-45,62 мкМ зеатину,
1,0-9,0 мкМ ТДЗ) і ауксинового типу дії (0,29-11,47 мкМ ІОцК, 0,25-9,8
мкМ ІОлК, 0,27-10,74 мкМ НОК, 4,52-13,56 мкМ 2,4-Д. Як основний вуглевод
для культивування органів і тканин застосовували сахарозу в концентрації
20-40 г/л. Експланти вирощували в культуральній кімнаті, де залежно від
об’єкта дослідження, що культивується, та експерименту підтримувалася
температура 20-30(С, 16-годинний фотоперіод, інтенсивність освітлення
0-62,5 мкМ м-2 с-1 і 70% відносна вологість повітря. Частину експлантів
поміщали до термостату з температурою 25(С. Субкультивування тканин і
органів проводили через 15-30 діб.

Приготування та забарвлення препаратів проводили відповідно до методик,
викладених у роботах У.Дженсена (1965), Є. Пірса (1962) і М.Н. Прозіної
(1960). Зрізи забарвлювали 0,1% водяним розчином акридинового
жовтогарячого, 0,5% водяним розчином толуїдинового синього та водяним
розчином DAPI (10 мкг/мол). На постійних препаратах досліджували
особливості формування первинних і вторинних соматичних зародків, а
також утворення адвентивних бруньок ломиноса, каладіума та фікуса
ліровидного. Зрізи (5 і 10 мкм) одержували з використанням мікротома
МС-2 (Росія). Всі препарати аналізували та фотографували під
флуоресцентним мікроскопом Leica DMLB (Німеччина). Розвиток соматичних
зародків і утворення адвентивних бруньок досліджували під
стереомікроскопом МБС-9 (Росія).

Молекулярно-біологічний аналіз рослин ломиноса, одержаних у результаті
органогенезу, прямого та непрямого соматичного ембріогенезу in vitro,
проводили за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. ДНК виділяли за
допомогою СТАВ-буфера (Сиволап, 1998). Для ампліфікації використовували
прилад “Терцік” (ДНК-технологія, Росія). Реакційна суміш для проведення
ISSR – ПЛР обсягом 20 мкл містила: 50 мМ КСl, 20 мМ трис-НСl (рН 8,4 при
Т 25(С), 2-5 мМ MgCl2, 0,01% Tween 20, з 0,2 мМ кожного нуклеотиду, 0,2
мкМ праймера, 20 нг ДНК й 1 од. Taq-полімерази. Ампліфікацію з сімома
ISSR-праймерами проводили в режимі: перша денатурація — 93(С – 1 хв. 30
с, 35 циклів — 60(С – 40 с, 70(С – 1 хв., 93(С – 30 с, остання елонгація
— 70(С – 1 хв. 30 с. Електрофорез продуктів ампліфікації ДНК проводили в
однократному буфері (0,045 М Трис-борат і 10 мМ ЕДТА, рН 8,0) в 2%-ному
агарозному гелі довжиною 12 см при 100-130 В протягом 2,5 год. Гелі,
попередньо забарвлені бромистим етидієм, після електрофоретичного поділу
продуктів ампліфікації фотографували в ультрафіолетовому світлі на
плівку “Мікрат-300”. Результати ISSR-аналізу обраховували згідно з M.
Nei і W. Li (1979).

При проведенні експериментів зі створення зростаючих in vitro колекцій
декоративних, субтропічних і кісточкових плодових культур для
характеристики регенераційної здатності експлантів використовували ряд
показників: ростовий індекс, частота регенерації, органогенетичний
індекс, ефективність мікророзмноження, викладених у методиках оцінки
рослинних об’єктів (Калинин и др., 1980; Dudits, Hesky, 1990).
Уповільнення ростових процесів досліджуваних культур проводилося за
допомогою введення до складу живильного середовища таких інгібіторів
росту: 15, 20, 30, 60, 90 г/л сахарози, 40, 50, 60 мг/л маніту, 40, 50,
60 мг/л сорбіту, 20, 30 г/л глюкози, 0,9, 1,8 мг/л (-аспарагіну, 5-10
мг/л АБК і 0,2-1,2 мг/л хлор холін хлориду (ССС). Методика введення
інгібіторів опрацьовувалася нами в процесі проведення експериментів.
Пробірки, колби та банки з експлантами поміщали до холодильних камер з
регульованою низькою позитивною температурою (5 ( 1(С) та інтенсивністю
освітлення 1,25-3,75 мкМ м-2 с-1. Рослинний матеріал фіксували через 3,
6, 12, 24, 36 місяців культивування. Оцінювали якісні (бонітування за
допомогою 4-бальної шкали) та кількісні характеристики депонованих
експлантів (життєздатність, довжина мікропагона, кількість міжвузль,
кількість коренів).

Для вкорінення мікропагонів використовували 0,49-9,80 мкМ ІОлК і
1,07-5,37 мкМ НОК. Експланти поміщали на живильне середовище, що містить
Ѕ норми солей з МС, 1-1,5% сахарози, 25 мг/л мезоінозиту, 0,6-0,8% агару
(Sigma-Aldrich, США). Укорінені мікропагони та рослини, одержані із
соматичних зародків, висаджували до стерильного субстрату (торф: пісок –
2:1, торф: пісок: лісова земля – 2:1:1, торф: пісок: лісова земля –
1:1:2). Адаптовані до умов in vivo рослини вирощували в теплиці.

Математичну обробку даних проводили, використовуючи комп’ютерну програму
STATISTICA for Windows, 6/0 (StatSoft, Inc/ 1984-2001) за допомогою
методів статистичного аналізу, викладених у посібнику Г.Ф. Лакіна
(1990).

МОРФОГЕНЕТИЧні ПОТЕНЦІї ОРГАНІВ І ТКАНИН ЛОМИНОСА (CLEMATІs L.) В УМОВАХ
ІN VІTRO І РОЗРОБлення СИСТЕМИ СОМАТИЧнОГО еМБРіОГЕНЕЗу

Для розроблення біотехнологічної системи розмноження рослин ломиноса
вперше вивчено особливості регенерації рослин через соматичний
ембріогенез і органогенез іn vіtro і виявлено основні фактори, що
впливають на морфогенетичний потенціал органів і тканин досліджуваних
сортів.

У процесі досліджень визначено оптимальні строки введення в умови іn
vіtro вегетативних бруньок сортів ломиноса Серенада Крима, Юность,
Нєвєста, Crіmson Star, Космічєская мєлодія, Вєчний зов, Ай-Нор, Лєсная
Опєра. Так, у період з лютого по квітень кількість бруньок, що утворюють
мікропагони або соматичні зародки, досягала 90-100%. Поряд із тим,
визначено ефективний спосіб стерилізації рослинного матеріалу (спосіб
послідовного застосування 70% етилового спирту – 1 хв. і 4%-ного розчину
гіпохлориту Na – 15 хв.), при якому кількість експлантів, вільних від
контамінації, досягала 98%.

Проведено вивчення компонентного складу індукційного живильного
середовища як фактора, що не тільки виявляє, але й підтримує якісні
характеристики морфогенетичних подій, які відбуваються у вегетативних
бруньках ломиноса, що розвиваються в процесі культивування іn vіtro. Для
експлантів ломиноса експериментально підібрано сольову основу середовища
МС і визначено необхідність присутності в ньому для індукції процесу
непрямого соматичного ембріогенезу в якості дедиференціатора зеатину в
концентрації 1,8 мкМ. Установлено, що протягом 30 діб культивування
ембріогенного калюсу з’являлися ембріогенні зони, меристематичні бугорці
та ембріоїди (рис. 1, 2). Гістологічний аналіз показав, що в
ембріогенній масі є як ембріогенні, так і неембріогенні клітини.
Виявлено, що на 3 добу культивування активізувалися процеси мітотичної
та меристематичної активності в ембріогенній масі клітин. Проембріо
починав формуватися внаслідок асиметричних поділів найчастіше
безпосередньо всередині калюсу. Соматичні зародки з’являлися на поверхні
калюсу тільки на 35-40 добу культивування.

Рис. 1. Формування меристематичних бугорців на поверхні калюсу ломиноса
сорту Серенада Крима

Рис. 2. Соматичний зародок, що утворився в калюсу ломиноса сорту
Серенада Крима

Показано, що присутність у середовищі зеатину індукувала утворення
біполярних структур на поверхні та всередині калюсу. Так, максимальну
кількість ембріоїдів на експлант (25 ( 2,6 шт.) було одержано на
середовищі МС, доповненому 1,8 мкМ зеатину через 4 тижні культивування.
На стадії дозрівання в умовах іn vіtro відзначали утворення глобулярних,
сердечковидних і торпедовидних ембріоїдів ломиноса, подібно до розвитку
зиготичних зародків.

Уперше встановлено, що розвиток соматичних зародків ломиноса в умовах іn
vіtro залежав від його морфологічного типу. З виявлених 7 морфологічних
типів соматичних зародків, тільки 4-и мали регенераційний потенціал: 1 –
односім’ядольний, 2 – двосім’ядольний, 3 – полісім’ядольний, 4 —
трубчастий. Проростання таких соматичних зародків відбувалося протягом
30-40 діб культивування.

Наступне субкультивування соматичних зародків на середовище, що містить
1,8 мкМ зеатину і різні концентрації ІОлК, приводило до утворення
вторинних ембріоїдів на поверхні вже сформованих зародків, що
розвиваються. При цьому встановлено, що частота вторинного ембріогенезу
залежала від концентрації ІОлК у живильному середовищі. Оптимальною
виявилася концентрація 0,9 мкМ ІОлК, при якій середня кількість
ембріоїдів склала 30 ( 5,2 штук на експлант.

Використання фізичних факторів як ефекторів соматичного ембріогенезу
дало змогу встановити оптимальні значення температури (26(С) і
інтенсивності освітлення (40 мкМ м-2 с-1), при яких кількість розвинених
ембріоїдів досягала 25-30 штук на експлант (рис. 3, 4).

Рис. 3. Залежність частоти утворення соматичних зародків ломиноса від
впливу температури в процесі культивування іn vіtro Рис. 4. Залежність
частоти соматичного ембріогенезу від впливу інтенсивності освітлення в
процесі культивування калюсу ломиноса

Поряд із тим, вивчено особливості утворення мікропагонів із калюсу
ломиноса. Показано, що калюс листкового походження діаметром 7-10 мм є
компетентним експлантом, здатним формувати максимальну кількість
адвентивних бруньок на живильному середовищі МС, що містить 2,3 мкМ
зеатину.

Проведено молекулярно-генетичний аналіз донорної рослини та сомаклонів
ломиноса сорту Серенада Крима, одержаних шляхом органогенезу та
соматичного ембріогенезу. Встановлено особливості мінливості геному при
різних способах регенерації іn vіtro. За допомогою ІSSR праймерів
виявлено 105 ампліконів, з яких поліморфними виявилися 6. Середній
показник гетерогенності рослин ломиноса склав 5,7%. На дендрограмі (рис.
5) видно, що найбільш генетично диференційованим від інших є контроль
(материнська рослина, що не ввійшла до жодного з двох кластерів). Разом
з тим, всі рослини, одержані з соматичних зародків і доведені до
цвітіння, не відрізнялися за фенотипом від вихідної.

Рис. 5. Дендрограма, що відображує взаємини між 13 рослинами ломиноса,
побудована на основі ІSSR-аналізу за допомогою UPGMA, відповідно до
генетичних дистанцій, визначених за Нєм і Лі. По вертикалі вказано
номери рослин, одержаних шляхом *: органогенезу з калюсу (рослини 1, 2 і
3); непрямого соматичного ембріогенезу (рослини 4, 5 і 6); прямого
соматичного ембріогенезу з листкових дисків (рослини 7, 8 і 9); прямого
соматичного ембріогенезу із сегментів мікропагонів (рослини 10, 11 і
12); контроль (доросла рослина 13)

На основі порівняльного вивчення морфогенетичних потенцій вегетативних
бруньок 8 сортів ломиноса (Серенада Крима, Юность, Нєвєста, Crіmson
Star, Космічєская мєлодія, Вєчний зов, Ай-Нор, Лєсная Опєра) розроблено
систему прямого соматичного ембріогенезу. Встановлено залежність
формування соматичних зародків від генотипу та концентрації БАП у
живильному середовищі МС. Оптимальною виявилася концентрація БАП, що
дорівнювала 2,22 мкМ, присутність якої в середовищі індукувала
соматичний ембріогенез та утворення максимальної кількості зародків у
всіх сортів ломиноса. В усіх досліджуваних сортів утворення соматичних
зародків відбувалося безпосередньо на поверхні вегетативних бруньок,
найчастіше в зоні апекса, де клітини активно діляться. На 20 добу
культивування експлантів відзначено появу маси глобулярних структур.
Поряд із тим, характерною рисою цих сортів була здатність первинних
соматичних зародків до вторинного ембріогенезу. Досліджувані сорти
розрізнялися між собою за частотою вторинного ембріогенезу. Так, високу
частоту ембріогенезу, що досягала 65-100%, було відзначено у сортів
Нєвєста, Crіmson Star, Серенада Крима, Юность, Ай-Нор при культивуванні
на середовищі, що містило 2,2 мкМ БАП. Таким чином, як у випадку
первинного, так і вторинного ембріогенезу, вищий ембріогенний потенціал
мали бруньки сортів ломиноса, що відносилися до груп Ланугіноза і
Жакмана.

У процесі досліджень уперше виявлено існування зони активізації
утворення соматичних зародків ломиноса – тобто існували ембріоїд або
група ембріоїдів, які були здатні індукувати як первинний, так і
вторинний соматичний ембріогенез. Такий експлант був названий нами
«індуктором». Вплив «індуктора» на соматичний ембріогенез виявлявся в
активному утворенні додаткових зародків на експлантах, поміщених на
живильне середовище. Це було нами відзначено в усіх сортів ломиноса, за
винятком сорту Космічєская мелодія. Наша гіпотеза щодо впливу
«індуктора» на сусідні експланти ломиноса через живильне середовище, до
якого виділялися індукуючи речовини (метаболіти, гормони тощо) не
підтвердилася. Поряд із тим, було встановлено, що «індуктор» міг діяти
досить тривалий відрізок часу (до 2-3 років). Позитивною стороною
призупинення процесу соматичного ембріогенезу за рахунок видалення
«індуктора» була можливість поділу соматичних зародків на окремі
фракції, шляхом їх згрупування за розміром і стадією розвитку.

На основі проведених досліджень визначено основні фактори, що впливають
на процес прямого соматичного ембріогенезу ломиноса. Такими факторами є
концентрація екзогенного цитокініну БАП, температура, інтенсивність
освітлення, «індуктор» соматичного ембріогенезу та генотип. Встановлено,
що при концентрації БАП 2,22 мкМ, температурі 24(С та інтенсивності
освітлення 40 мкМ·м-2·с-1 активізація процесів первинного і вторинного
соматичного ембріогенезу відбувається тільки в присутності «індуктора».
Частка його впливу складала 50%.

Всі одержані в умовах іn vіtro рослини адаптовано іn vіvo і висаджено іn
sіtu. Адаптація соматичних зародків і рослин, одержаних з них, до умов
іn vіvo проходила протягом 20-30 діб. Висадження до відкритого ґрунту
сформованих рослин з потужною мочкуватою кореневою системою та
дерев’янистими або напівдерев’янистими стеблами здійснювали через 9-12
місяців після адаптації до умов закритого ґрунту.

Таким чином, нами вперше створені оптимальні умови регенерації рослин
через непрямий і прямий соматичний ембріогенез ломиноса та запропонована
біотехнологічна система одержання рослин іn vіtro через прямий
соматичний ембріогенез (рис. 6).

Рис. 6. Біотехнологічна система отримання рослин ломиноса через прямий
соматичний ембріогенез (середовище МС, доповнене 2,22 мкМ БАП)

соматичний ембріогенез І РЕГЕНЕРАЦІЯ РОСЛИН каладіума (Caladium
hortulanum Birdsey.) І ФІКУСА ліровидного (Ficus lyrata warb.) в умовах
in vitro

На відміну від ломиноса, у каладіума та фікуса ліровидного саме листя
виявилося компетентним експлантом, здатним до утворення як соматичних
зародків, так і мікропагонів.

Установлено строки введення первинних експлантів каладіума і фікуса.
Так, листя каладіума, відібране в період із травня по липень, було
найбільш морфогенним, при цьому частота утворення соматичних зародків
досягала 86-100%. Бруньки фікуса ліровидного вводили протягом усього
року, а експланти листка відбирали з регенерантів, які культивувались в
умовах in vitro. Визначено оптимальні способи стерилізації рослинного
матеріалу обох видів, що дали змогу одержувати до 100% експлантів,
вільних від контамінації: каладіум – 1,8%-ний розчин гіпохлориту натрію
(5 хв.) ( 70%-ний етанол (1 хв.) ( дистильована H2O; фікус ліровидний –
70%-ний етанол (1 хв.) ( 4%-ний розчин гіпохлориту натрію (15 хв.) (
дистильована H2O.

У процесі дослідження було модифіковано склад живильного середовища МС
(С1) та підібрано оптимальні концентрації цитокініну для індукції
морфогенетичних процесів у тканинах листків двох сортів каладіума, що
приводять до соматичного ембріогенезу. Серед випробуваних концентрацій
кінетину оптимальною виявилася 2,32 мкМ, при якій формувалися соматичні
зародки на 66,67% та 70,78% листкових дисків у сортів Pink Gem і
Triumphe de Compte відповідно. Поряд із тим, удалося визначити найбільш
морфогенні зони, здатні до прямого і непрямого соматичного ембріогенезу.
Такими зонами виявилися – зона з’єднання листової пластинки з черешком і
край висічки листка. Період розвитку від уведення первинних експлантів
каладіума в культуру до появи глобулярних структур по краю висічки
листка без етапу калюсоутворення склав 30 діб.

У процесі досліджень також установлено, що шляхи реалізації
морфогенетичного потенціалу експлантів залежали від умов культивування.
У разі відсутності освітлення формувалися тільки соматичні зародки. На
світлі відбувалося три морфогенетичних процеси: органогенез у
морфогенному калюсі, непрямий і прямий соматичний ембріогенез. У зоні
з’єднання листкової пластинки з черешком ембріогенні структури
з’являлися безпосередньо в епідермальній і субепідермальній зоні висічки
листка. Протягом наступних 30 діб спостерігали розвиток повноцінних
соматичних зародків. Наступні пасажі соматичних зародків на живильне
середовище С1 індукували вторинний ембріогенез (рис. 7). Весь процес від
уведення експлантів до регенерації рослин склав 3 місяці (рис. 8).

Рис. 8. Регенеранти каладіума, одержані з соматичних зародків через
прямий ембріогенез

Непрямий соматичний ембріогенез і пряму регенерацію мікропагонів з
висічок листка каладіума спостерігали на середовищах С2 з БАП і НОК.
Установлено оптимальні концентрації фітогормонів (2,22 мкМ БАП і 2,69
мкМ НОК), які індукували утворення максимальної кількості мікропагонів і
ембріоїдів.

У результаті непрямого соматичного ембріогенезу у сорту Triumphe de
Compte, непрямої регенерації мікропагонів і непрямого соматичного
ембріогенезу у сорту Pink Gem отримано нові форми з різними соматичними
мутаціями. У виділених рослин соматичні мутації виявлялися у вигляді
різних форм листкової пластинки, її забарвленні та жилкуванні.

Вивчення регенераційної здатності зон листка фікуса ліровидного
показало, що всі вони мали високий морфогенетичний потенціал, який
реалізувався через соматичний ембріогенез і пряму регенерацію
мікропагонів. Відзначено, що край листкової пластинки виявився найбільш
компетентним до утворення соматичних ембріоїдів. У зоні уздовж основної
жилки і у черешка найчастіше індукувався процес прямої регенерації
мікропагонів.

Ефективність індукції соматичного ембріогенезу фікуса ліровидного
залежала від концентрації БАП у живильному середовищі Куорін і Лепойвре.
Максимальна кількість ембріоїдів формувалася на живильному середовищі
КЛ, доповненому 0,89-1,33 мкМ БАП. Кількість соматичних зародків
досягала в середньому 7,5 ( 0,2 штук на експлант. Соматичні зародки
проходили всі стадії розвитку, які було чітко видно вже на 30 добу
культивування. Повноцінні рослини з ембріоїдів фікуса формувалися на
40-60 добу від початку індукції формування соматичних зародків.

Як і у випадку з культурами ломиноса та каладіума, вторинний соматичний
ембріогенез фікуса ліровидного відбувався на індукційному живильному
середовищі. Збільшення кількості субкультивувань значно підвищувало
частоту вторинного соматичного ембріогенезу. Безперервний процес
соматичного ембріогенезу фікуса ліровидного відбувався протягом 2 років,
при цьому частота ембріогенезу залишалася на одному рівні і досягала
95-100%.

Підвищення концентрації БАП до 1,78 мкМ індукувало процес прямої
регенерації адвентивних мікропагонів з листкових експлантів фікуса
ліровидного. Поряд із тим, показано, що максимальна кількість коренів
(5,8 ( 0,1 штук на мікропагін) утворилася на Ѕ норми середовища МС,
доповненого 0,98 мкМ ІОлК.

У процесі досліджень вивчено умови адаптації in vivo регенерантів
каладіума та фікуса.

Таким чином, розроблено біотехнологічні системи одержання рослин
каладіума та фікуса ліровидного через соматичний ембріогенез і
органогенез (рис. 9, 10). Розроблені біотехнологічні системи розмноження
рослин дають можливість одержувати до 40.000000 регенерантів каладіума
та 4.000000 регенерантів фікуса ліровідного на рік.

Рис. 9. Біотехнологічна система регенерації рослин каладіума в умовах in
vitro

Рис. 10. Біотехнологічна система мікророзмноження фікуса ліровидного
(температура 24(1(С, інтенсивність освітлення 40 мкМ м-2 с-1,
16-годинний фотоперіод)

ПОРІВНЯЛЬНЕ ВИВЧЕННЯ ПРЯМОЇ РЕГЕНЕРАЦІЇ РОСЛИН ІЗ зиготичних ЗАРОДКІВ І
ЛИСТкОВИХ ЕКСПЛАНТІВ РЯДУ СУБТРОПІЧНИХ ПЛОДОВИХ КУЛЬТУР І РОЗРОБлення
реципієнтної СИСТЕМИ в УМОВАХ in vitro

Біотехнологія розмноження субтропічних плодових культур створювалася
нами на основі порівняльного вивчення прямої регенерації рослин із
зиготичних зародків і листкових експлантів зизифуса, ківі, фейхоа і
хурми та була спрямована на розроблення реципієнтної системи в умовах in
vitro.

На етапі введення первинних експлантів в умови in vitro виявлено, що
здатність ізольованих бруньок фейхоа, ківі, хурми і зизифуса
регенерувати мікропагони залежала від генотипу і концентрації
цитокінінів у живильному середовищі. Так, 0,88 мкМ і 4,40 мкМ БАП
виявилися ефективними для регенерації мікропагонів з ізольованих бруньок
зизифуса і ківі, відповідно. Культивування протягом 3 тижнів ізольованих
бруньок хурми на живильному середовищі МС, що містить 2,22 мкМ БАП
стимулювало активну регенерацію мікропагонів. Тим часом додавання в
середовище МС зеатину в концентрації 0,91 мкМ індукувало первинну
регенерацію мікропагонів фейхоа. Однак наступний розвиток мікропагонів
відбувався на середовищі, доповненому 2,73 мкМ зеатину.

Поряд із тим, у процесі досліджень установлено оптимальні строки
попередньої обробки зиготичних зародків зизифуса, ківі, фейхоа і хурми,
введених у культуру in vitro (рис. 11). Проведене порівняльне вивчення
компетентності зиготичних зародків 4-х субтропічних культур до
проростання під впливом низьких позитивних температур показало, що
частота проростання зародків досягала 100% при попередній обробці фейхоа
і ківі протягом 15 діб. Однак для розвитку зародків хурми і зизифусу
тривалість попередньої обробки збільшували до 30 діб.

Рис. 11. Залежність частоти проростання проростків із зиготичних
зародків зизифуса, ківі, фейхоа та хурми від тривалості впливу низьких
позитивних температур (5 ( 1°С)

При вивченні морфогенетичних потенцій сім’ядолей, листків і сегментів
мікропагонів ківі, зизифуса, фейхоа та хурми було встановлено, що
регенераційний потенціал залежав від генотипу, типу експланта і
концентрації ТДЗ. Використання ТДЗ у концентрації від 1,0 мкМ до 9,0 мкМ
для прямої і непрямої регенерації мікропагонів дало змогу індукувати
розвиток мікропагонів із сім’ядолей і листкових експлантів зизифуса та
хурми, з листкових дисків фейхоа, ківі та сегментів мікропагонів фейхоа,
ківі і хурми. Так, для прямої регенерації мікропагонів з листкових
експлантів і сім’ядолей хурми оптимальними були середовища, що містять
6,0 мкМ і 9,0 мкМ ТДЗ відповідно. Утворення максимальної кількості
мікропагонів з листка та сім’ядолей зизифуса спостерігали на
середовищах, доповнених 3,0 мкМ і 9,0 мкМ ТДЗ відповідно.

@

< > h j l n p O

e

e

@

B

< > l n p   O

~

???????~

ae

e

e

nn« j\nnnn

d

???

?????

_:bdgpl®n?qoocUoooooooooooooooUooooo

i

i

i

????К 0,98 мкМ стимулювала утворення коренів у 100% мікропагонів фейхоа,
ківі, хурми та середня кількість коренів на експлант досягала 4,5 ( 0,2
штук. Повноцінні рослини ківі, фейхоа, зизифуса та хурми для наступного
висадження на адаптацію були одержані через 2, 3, 4 і 5 місяців
культивування відповідно. Визначено основні умови адаптації in vivo
регенерантів досліджуваних субтропічних плодових культур.

Таким чином, на підставі одержаних результатів уперше розроблено
біотехнологічну систему отримання рослин ківі, зизифуса, фейхоа та хурми
через пряму регенерацію мікропагонів з вегетативних бруньок, сім’ядолей
і листя, прямий соматичний ембріогенез із сім’ядолей, органогенез і
непрямий соматичний ембріогенез у морфогенному калюсі (рис. 12).

Рис. 12. Біотехнологічна система розмноження й отримання рослин
субтропічних плодових культур

ОСОБЛИВОСТІ РЕГЕНЕРАЦІЇ РОСЛИН М’ЯТИ КОТячої (NEPETA CATARІa VAR.
CІTRІODORA BECK.) І гісопу (HYSSOPUS OFFІCІNALІs L.) ЯК ОСНОВА системи
РОЗМНОЖЕННЯ in vitro ЕФІРООЛІЙНИХ КУЛЬТУР

Для розроблення реципієнтної системи ефіроолійних рослин проведено
вивчення морфогенетичних потенцій висічок листка м’яти котячої (N.
catarіa var. cіtrіodora Beck.) і гісопу (H. offіcіnalіs L.).

Встановлено, що частота регенерації листкових експлантів м’яти котячої і
гісопу залежала від ряду факторів і насамперед від концентрації
тідіазурону та тривалості культивування. У гісопу і м’яти котячої
максимальну кількість листкових експлантів, здатних до регенерації
адвентивних бруньок і мікропагонів, відзначали на 8 тиждень
культивування. Визначено оптимальні концентрації ТДЗ для гісопу – 6,0
мкМ і для м’яти котячої – 9,0 мкМ, застосування яких індукувало
утворення мікропагонів у 75-90% листкових дисків при адаксіальному
розташуванні на середовищі. При цьому показано залежність регенерації
мікропагонів м’яти котячої і гісопу від інтенсивності освітлення.
Визначено оптимальні показники (для гісопу – 25 мкМ м-2 с-1, для м’яти
котячої – 37,5 мкМ м-2 с-1), при яких, 50% і 70% листкових дисків гісопу
і м’яти котячої були здатні до утворення адвентивних бруньок і
регенерації мікропагонів. Крім того, встановлено, що регенерація
максимальної кількості адвентивних бруньок і мікропагонів відбувалася на
листових експлантах, відібраних з мікропагонів м’яти котячої і гісопу,
які культивуються in vitro, після 4-5-того пасажу.

Протягом року від одного листкового експланта м’яти котячої і гісопу
було одержано 10.000 мікропагонів, які відокремлювали та укорінювали на
Ѕ норми середовища МС, доповненого ІОлК (2,46 мкМ і 9,80 мкМ,
відповідно). Число укорінених мікропагонів м’яти котячої і гісопу
досягало 72% й 80% відповідно.

Таким чином, як результат проведених досліджень подано біотехнологічну
систему мікророзмноження м’яти котячої і гісопу, що складається з
послідовних етапів і дала змогу одержати до 10.000 рослин у рік (рис.
13).

Рис. 13. Біотехнологічна система розмноження м’яти котячої та гісопу

ОСНОВИ СТВОРЕННЯ ГЕНОБАНКУ РОСЛИННОЇ ПЛАЗМИ ДЕКОРАТИВНИХ, СУБТРОПІЧНИХ І
КІСТОЧКОВИХ ПЛОДОВИХ КУЛЬТУР В УМОВАХ ІN VІTRO

Поряд з вивченням особливостей соматичного ембріогенезу, органогенезу та
розробленням реципієнтних систем декоративних, субтропічних і
ефіроолійних рослин, одним з важливих напрямів у біотехнології рослин є
збереження рослинних об’єктів в умовах іn vіtro, що дає змогу створити
резервний банк генетичної плазми цінних, рідкісних, зникаючих, нових
видів і сортів.

На основі ростового індексу, частоти регенерації і органогенетичного
індексу вперше визначено оптимальні експланти декоративних, субтропічних
і кісточкових плодових культур для депонування в умовах іn vіtro (табл.)
Характеристика оптимальних експлантів декоративних, субтропічних і
кісточкових плодових культур для подальшого депонування в умовах in
vitro

Показник Генотип Тип експланта

вегетативна брунька мікропагін

(1-2 см) соматичний зародок протокорм листковий диск

GI, мг

(120 діб) Cymbidium hybridum — — — 20,76 ( 1,06 —

C. minima — — — 12,38 ( 3,25 —

ОІ Rosa sp. 3,7 9,2 — — —

R. chinensis minima 5,6 10,0 — — —

Clematis sp. 3,4 10,0 20,0 – 25,0 — 3,2

C. hybridum 1,3 5,3 — 10,0 – 20,0 —

C. minima 1,4 4,2 — 8,0 – 16,0 —

Dossinia sp.

10,0

Yucca aloifolia,

Y. torrey 4,5 9,3 — — —

Prunus armeniaca 3,3 6,2 — — —

P. cerasifera,

P. domestica 8,2 12,1 — — —

Actinidia deliciosa 3,2 6,2 — — 11,0

Feijoa sellowiana 2,1 5,3 — — 2,6

R, % Rosa sp. 60 90 — — —

R. minima 55 100 — — —

Clematis sp 90 95 80 — 30

C. hybridum,

C. minima 80 90-95 — 100 —

Dossinia sp. 90 95 — — —

Y. aloifolia,

Y. torrey 90 95 — — —

P. armeniaca 60 80 — — —

P. cerasifera,

P. domestica 60 95 — — —

A. deliciosa 90 95 — — 100

F. sellowiana 60 90 — — 40

Примітка. GI – ростовий індекс; ОІ – органогенетичний індекс; R –
частота регенерації

Попередні експерименти з підбору оптимальних температур для тривалого
збереження експлантів ківі, абрикоса, аличі, троянди, орхідей і ломиноса
в умовах іn vіtro показали, що серед досліджуваних культур найвищу
життєздатність мали експланти ківі. Однак спосіб збереження експлантів в
умовах іn vіtro тільки за рахунок регулювання температури та
інтенсивності освітлення виявився малоефективним, оскільки більшість
експлантів після депонування надто витягувалися і не були здатні до
регенерації пагонів після перенесення до стандартних умов культивування.

Отже, далі був вивчений вплив кожного з ефекторів, і зіставлені одержані
оптимальні показники, що дало змогу відпрацювати правильну стратегію в
збереженні іn vіtro експлантів троянд, ломиноса, юки, орхідей, фейхоа,
ківі, аличі, сливи та абрикоса.

У процесі досліджень показано, що при тривалому культивуванні всіх
досліджуваних видів рослин на середовищах, що містять 15-90 г/л
сахарози, ясно простежується тенденція зниження життєздатності
експлантів при збільшенні періоду депонування та підвищення
життєздатності при збільшенні концентрації сахарози в живильному
середовищі. Встановлено, що на середовищах з концентрацією сахарози 90
г/л життєздатність експлантів троянд, орхідей, ломиноса, юки, фейхоа та
ківі досягала 50-90%. Серед цих культур вищу життєздатність мали
соматичні зародки ломиноса та протокорми цимбідіума. В експлантів юки
відзначено низький рівень життєздатності (20-25%) порівняно з іншими
досліджуваними видами та сортами рослин. Практично в усіх видів і сортів
на середовищах з 60 і 90 г/л сахарози спостерігали утворення адвентивних
бруньок і розвиток коренів. Крім того, при додаванні в середовища 90 г/л
сахарози кінетика росту експлантів знижувалася в 2-3 рази порівняно з
контролем залежно від виду та сорту рослини. Збільшення періоду
депонування до 24 місяців дало змогу знизити кінетику росту експлантів
троянди мініатюрної і зберігати мікропагони життєздатними. В експлантів
ломиноса встановлено залежність кінетики росту від строків збереження та
типу експланта, закладеного на депонування в умови іn vіtro.

Введення в живильні середовища маніту та сорбіту також знижувало
кінетику розвитку експлантів і підвищувало життєздатність. Після
6-місячного депонування використання 60 мг/л маніту стабілізувало
розвиток експлантів. Залежно від генотипу досліджуваної рослини
життєздатність досягала 70-90%. Наявність у середовищі маніту
збільшувало життєздатність мікропагонів мініатюрної троянди сорту Бебі
Бантінг. Однак через 12 місяців депонування 20-30% експлантів
досліджуваних культур були здатні розвиватися після перенесення до
стандартних умов культивування.

Введення в живильне середовище ретарданта — хлор холін хлориду (ССС)
значно підвищувало життєздатність експлантів порівняно з контролем.
Проведений скринінг досліджуваних культур, що піддавалися впливу низьких
позитивних температур і ретарданту ССС протягом 12 місяців, дав змогу
виділити найбільш життєздатні культури. Встановлено, що при концентрації
ССС 0,2-0,4 г/л кількість життєздатних експлантів у таких рослин як
троянда, ломиніс, орхідея, юка, алича, слива, абрикос досягала 100%.
Поряд з інгібуванням росту експлантів, ССС індукував ріст коренів у
таких культур як троянда, ломиніс, юка, фейхоа і слива. Частота
укорінення мікропагонів ломиноса у таких сортів, як Серенада Крима і
Юность через 24 місяці депонування досягала 100%.

Спільне використання оптимальних концентрацій ССС і сахарози, показників
інтенсивності освітлення і температури значно збільшило як період
збереження в безпересадочній культурі, так і життєздатність експлантів
досліджуваних культур. Це дало змогу нам уперше розробити спосіб
мінімізації росту декоративних, субтропічних і кісточкових плодових
культур в умовах іn vіtro, та створити генобанк цінної рослинної плазми.
Цю біотехнологічну систему збереження рослин подано на рисунку 14.

Рис. 14. Біотехнологічний процес депонування цінних видів і сортів
декоративних, субтропічних і кісточкових плодових культур

Отже, на основі комплексного вивчення процесів соматичного ембріогенезу
та органогенезу запропоновано біотехнологічну схему отримання та
збереження цінних видів і сортів декоративних, субтропічних, кісточкових
плодових і ефіроолійних рослин (рис. 15). В поданій на рисунку схемі, що
складається з кількох системних блоків удалося розкрити регенераційний
потенціал досліджуваних культур і продемонструвати основні фактори
(індуктор, генотип, тип експланта та його походження, живильне
середовище, фітогормони та їх концентрації, інтенсивність освітлення та
температура), показати ступінь їх впливу на процеси соматичного
ембріогенезу і органогенезу та відобразити кінцевий продукт –
біотехнологічні системи розмноження, реципієнтні системи і системи
збереження багаторічних рослин в умовах іn vіtro.

Рис. 15. Біотехнологічна схема одержання та збереження цінних видів і
сортів декоративних, субтропічних, кісточкових і ефіроолійних рослин (СЕ
— соматичний ембріогенез)

ВИСНОВКИ

1. У результаті проведеного вивчення шляхів морфогенезу та особливостей
регенерації рослин in vitro у багаторічних садових культур (ломиноса,
каладіума, троянди, орхідей, фікуса, юки, зизифуса, ківі, хурми, фейхоа,
аличі, сливи, абрикоса, мґяти котячої та гісопу) установлено загальні
закономірності індукції і реалізації процесів соматичного ембріогенезу
та органогенезу, що полягають у визначальній ролі типу експланта і його
походження, генотипу, живильного середовища, концентрації фітогормону,
температури та інтенсивності освітлення. Особливе значення для розвитку
соматичних зародків має індуктор. На основі виявлених закономірностей
процесів соматичного ембріогенезу та органогенезу створено та
вдосконалено системи розмноження і збереження in vitro декоративних,
субтропічних, кісточкових плодових і ефіроолійних культур для клонування
видів і сортів, які важко розмножуються, розробки реципієнтних систем і
створення генобанку цінної рослинної плазми.

2. Вперше визначено 4 шляхи реалізації морфогенетичного потенціалу
органів і тканин різних сортів ломиноса. Для оцінки ступеня
гетерогенності рослин ломиноса сорту Серенада Крима, отриманих у
результаті реалізації експлантами різних шляхів регенерації, показано
інформативні можливості молекулярно-генетичного маркера – ПЛР аналізу.
Встановлено середній показник гетерогенності рослин, що склав 5,7%. При
цьому виявлено, що регенеранти, одержані з соматичних зародків, які
вступили до фази цвітіння, не відрізнялися за фенотипом від
материнського сорту.

3. Вперше встановлено залежність індукції включення ембріогенного шляху
розвитку в меристемних клітинах бічних, верхівкових бруньок і калюсу
через прямий і непрямий соматичний ембріогенез від генотипу,
концентрації БАП (2,22 мкМ) або зеатину (1,3 мкМ), температури (24 (
1(С), інтенсивності освітлення (40 мкМ·м-2·с-1) та наявності індуктора,
яким є соматичний зародок. Продемонстровано провідну роль індуктора в
процесі соматичного ембріогенезу, частка впливу якого становила 50%.

4. Виявлено 7 морфологічних типів соматичних зародків ломиноса, з яких 4
здатні до формування повноцінних рослин.. Показано здатність первинних
соматичних зародків досліджуваних сортів ломиноса до вторинного
ембріогенезу. Продемонстровано високу частоту як первинного, так і
вторинного ембріогенезу, що досягала 65-100% у сортів Нєвєста, Crіmson
Star, Юность, Серенада Крима і Ай-Нор.

5. Уперше розроблено біотехнологічні системи отримання рослин ломиноса
через прямий і непрямий соматичний ембріогенез (каулігенну
ембріоїдогенію), і показано можливість масового клонального
мікророзмноження окремих сортів на індукційному живильному середовищі.

6. Визначено основні фактори, що впливають на ефективність регенерації
рослин каладіума та фікуса ліровидного через соматичний ембріогенез: час
відбору експланта і введення його в умови іn vіtro, тип експланта та
зона листкової пластинки, трофічний фактор (живильне середовище для
каладіума — МС, для фікуса — КЛ) і концентрація цитокініну (0,89 мкМ БАП
у фікуса ліровидного і 2,32 мкМ кинетину у каладіума).

7. Розроблено біотехнологічні системи соматичного ембріогенезу
(фоліарної ембріоїдогенії) та органогенезу для каладіума та фікуса
ліровидного. Установлено залежність підвищення ефективності
мікророзмноження за рахунок використання різних способів регенерації
рослин з експлантів листка.

8. Проведено порівняльне вивчення морфогенетичних потенцій органів і
тканин ківі, зизифуса, хурми і фейхоа та показано високу регенераційну
здатність листкових експлантів до адвентивного пагоноутворення.
Визначено оптимальні концентрації фітогормонів, які індукують процес
прямої регенерації мікропагонів із листкових експлантів ківі (8,90 мкМ
БАП і 8,56 мкМ ІОцК), зизифуса (3,0 мкМ ТДЗ), фейхоа (9,0 мкМ ТДЗ) та
хурми (6,0 мкМ ТДЗ). В результаті прямої регенерації мікропагонів із
сім’ядолей хурми отримано 99 нових селекційних форм. Установлено
оптимальні концентрації ауксинів, що сприяють 100% укоріненню
мікропагонів ківі, фейхоа, хурми та зизифуса. Вперше для ківі, зизифуса,
фейхоа та хурми подано 5 різних шляхів регенерації рослин.

9. Установлено залежність прямої регенерації мікропагонів гісопу та
м’яти котячої від генотипу, концентрації ТДЗ, кількості субкультивувань,
розташування листкових дисків на живильному середовищі та інтенсивності
освітлення. Визначено концентрації ТДЗ для гісопу – 6 мкМ та для м’яти
котячої — 9 мкМ, застосування яких індукувало утворення мікропагонів у
70-90% листових дисків при адаксіальному розташуванні на середовищі.
Максимальна кількість адвентивних бруньок і мікропагонів розвивалася з
листкових експлантів досліджуваних культур, відібраних в умовах іn vіtro
з мікропагонів після 4-5 пасажу при інтенсивності освітлення 25 мкМ м-2
с-1 (гісоп) і 37,5 мкМ м-2 с-1 (м’ята котяча).

10. Уперше розроблено реципієнтні системи зизифуса, ківі, хурми,
фейхоа, м’яти котячої і гісопу для подальшого їх використання в селекції
на продуктивність, адаптивність до несприятливих абіотичних факторів і
стійкість до хвороб.

11. На основі визначення ростового індексу, частоти регенерації і
органогенетичного індексу подано оптимальні експланти декоративних,
субтропічних і кісточкових плодових культур для подальшого депонування в
умовах іn vіtro.

12. Установлено найважливіші фактори, що впливають на тривалість
збереження в умовах іn vіtro експлантів досліджуваних рослин: генотип,
температура (5(1(С), інтенсивність освітлення (1,25-3,75 мкМ м-2 с-1),
склад живильного середовища (Ѕ МС, В5, КЛ, Кнудсона С), концентрації
ретарданту та осмотика. Виявлено залежність зміни кінетики росту
експланта та його життєздатності від концентрації сахарози, маніту,
сорбіту, АБК і ССС у середовищі для депонування. Показано, що спільне
використання 90 г/л сахарози і 0,4 г/л ССС дає змогу зберігати експланти
життєздатними в безпересадочній культурі протягом 12-24 місяців.

13. Розроблено спосіб мінімізації росту рослин при низьких позитивних
температурах в умовах іn vіtro і на його основі створено генобанк цінних
видів і сортів декоративних, кісточкових і субтропічних плодових культур
у вигляді повільно зростаючих колекцій, поданий 27 сортами троянди, 3
видами орхідей, 1 видом юки, 9 сортами ломиніса, 4 сортами і 2 гібридами
ківі, 2 формами фейхоа, 2 сортами аличі, 1 сортом абрикоса та 10 сортами
сливи.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Розроблені способи прямого соматичного ембріогенезу та органогенезу
ломиноса, каладіума і фікуса ліровидного рекомендується використовувати
для масового розмноження цінних сортів, як реципієнтні системи та для
збереження рослин в умовах іn vіtro.

2. Розроблену систему непрямого соматичного ембріогенезу каладіума
пропонується застосовувати в створенні нових селекційних форм.

3. Подані реципієнтні системи зизифуса, хурми, фейхоа, ківі, м’яти
котячої і гісопу на основі прямої регенерації мікропагонів з листкових
експлантів рекомендується використовувати для генетичної трансформації і
впливу селективного агента.

4. Розроблений спосіб регенерації рослин із сім’ядолей незрілих зародків
субтропічних плодових культур рекомендується використовувати для
подолання постгамної несумісності при одержанні міжсортових і міжвидових
гібридів.

5. Пропонується використовувати для створення генобанку рослинної плазми
у вигляді повільно зростаючих колекцій іn vіtro розроблений спосіб
мінімізації росту декоративних, субтропічних і кісточкових плодових
культур.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Митрофанова О.В., Славгородская-Курпиева, Митрофанова И.В., Лукичева
Л.А. Диагностика вирусных болезней и биотехнологические приемы получения
безвирусного посадочного материала косточковых плодовых культур. – Ялта:
Издательство Крымпресс, 2000. – 45 с. (брошюра). (Здобувачем написано 4
розділ і підготовлено публікацію до друку).

Митрофанова О.В., Зленко И.Л., Митрофанова И.В., Иванова Н.Н. Об
условиях пролиферации протокормов цимбидиума // Бюлл. Никит. ботан.
сада. – 1990. – Вып. 72. – С. 105-111. (Здобувачем проведене планування
експерименту, підібрані оптимальні живильні середовища, отримані рослини
з протокормів, результати зведені до таблиць і графіків).

Митрофанова И.В. Микроклональное размножение субтропических и
тропических плодовых культур (обзор литературы) // Труды Никит. ботан.
сада. – 1997. – Т. 119. – С. 63-95.

Пандей Д.К., Митрофанова И.В. Сравнительное изучение особенностей
морфогенеза индийского (Zizyphus mauritiana Lam.) и китайского (Zizyphus
jujuba Mill.) зизифусов в условиях in vitro // Труды Никит. ботан. сада.
– 1997. – Т. 119. – С. 127-143. (Дисертантом сплановано дослідження і
виконано частину робіт, пов`язаних із культивуванням вегетативних
бруньок і мікропагонів зизифусу китайського, разом із співавтором
проаналізовано результати досліджень і підготовлено статтю до
публікації).

Митрофанова И.В., Казас А.Н., Хохлов С.Ю. Особенности клонального
микроразмножения хурмы // Бюлл. Никит. ботан. сада. – 1998. – Вып. 80. –
С. 153-158. (Здобувачем виконано роботи щодо планування експерименту,
оптимізації умов культивування, отримання рослин в умовах in vitro і
підготовки статті до друку).

Митрофанова О.В., Митрофанова И.В., Смыков А.В., Лесникова Н.П. Методы
биотехнологии в селекции и размножении субтропических и косточковых
плодовых культур // Труды Никит. ботан. сада. – 1999. – Т. 118. – С.
189-199. (Дисертантом проведено основні експерименти, підготовлено і
написано частину роботи, пов`язану з біотехнологічними методами
розмноження субтропічних і кісточкових плодових культур).

Митрофанова И.В. Прямая регенерация микропобегов из листовых дисков киви
(Actinidia

deliciosa (Chev.) Liang, Ferguson) в условиях in vitro // Інтродукція
рослин. – 2000. – № 1. – С. 157-158.

Mitrofanova I., Ivanova N. Using of leaf discs for direct regeneration
of issope plants // Horticulture and Vegetable Growing: Scientific works
Lithuanian Inst. Hort. and Lithuanian Univ. Agr. – 2000. – Vol. 19, N 3,
Part 1. – P. 427-433. (Безпосередньо здобувачем проведено
експериментальну роботу, статистичну обробку матеріалу, написання статті
і підготовка її до друку виконані із співавтором).

Mitrofanova I.V., Mitrofanova O.V. Using broad genetic diversity and in
vitro culture to enhance of breeding of some subtropical fruit plants //
Acta Hort. – 2000. – N 538. – P. 169-172. (Здобувачем складено загальну
схему дослідження, проведено основні експерименти, спільно зі
співавтором підготовлено публікацію до друку).

Митрофанова О.В., Митрофанова И.В. Состояние и перспективы
биотехнологических исследований садовых культур на юге Украины //
Садівництво: Міжвідомчий тематичний науковий збірник. – 2000. – Вип. 50.
– С. 296-281. (Дисертантом на основі виконаних досліджень підготовлені
матеріали з біотехнології одержання декоративних, субтропічних і
кісточкових плодових культур, подані попередні результати зі збереження
рослин при низьких позитивних температурах).

Mitrofanova O., Lesnikova N., Mitrofanova I., Vogegov S. Application of
biotechnology methods for obtaining the valuable cultivars of stone
fruits // Horticulture and Vegetable Growing: Scientific works
Lithuanian Inst. Hort. and Lithuanian Univ. Agr. – 2000. – Vol. 19, N 3,
Part 1. – P. 367-374. (Здобувачем сплановано експеримент, проведені
аналіз одержаних результатів).

Митрофанова О.В., Митрофанова И.В. Изучение вирусов цветочных культур и
эффективные методы оздоровления растений in vitro // Вісник Київського
Національного Університету ім. Т. Шевченка. Серія Біологія. – 2001. –
Вип. 35. – С. 47-53. (Дисертантом сплановано і частково проведено
методичні роботи з розмноження оздоровленого рослинного матеріалу
квіткових культур, підготовлено публікацію до друку).

Кондратенко О.В., Митрофанова И.В. Особенности клонального
микроразмножения двух сортов миниатюрных роз // Бюл. Никит. ботан. сада.
– 2002. – Вып. 86. – С. 38-40. (Здобувачем проведено керування роботою,
здійснено контроль за фітогормональним складом живильного середовища,
отримано основні результати експериментів і здійснено редагування
статті).

Mitrofanova I.V., Movchan O.P., Shishkin V.A., Mitrofanov V.I.
Gene-pool collection in Nikitsky Botanical Gardens – National Scientific
Center // Bull. State Nikitsky Bot. Gardens. – 2002. – N 85. – P. 30-33.
(Дисертантом сплановано і проведено експерименти з депонування
експлантів в умовах in vitro, підготовлено публікацію до друку).

Mitrofanova I.V., Yezhov V.N. Plant regeneration of Clematis L. through
somatic embryogenesis in vitro // Bull. State Nikitsky Bot. Gardens. –
2002. – N 86. – P. 16-19. (Здобувачем проведено планування експерименту,
опрацьовано етап введення експлантів ломиноса до умов in vitro,
розроблено спосіб непрямого соматичного ембріогенезу, спільно із
співавтором підготовлено матеріал до друку).

Кондратенко О.Н., Митрофанова И.В. Влияние различных концентраций
витаминов на рост и развитие растений фейхоа (Feijoa sellowiana Berg.) в
культуре in vitro // Ученые записки Таврического национального
университета им. В.И. Вернадского. Серия Биология. – 2003. – Т. 16 (55),
№ 2. – С. 98-102. (Дисертантом здійснено контроль за проведенням усіх
етапів дослідження, запропоновано необхідність оптимізації експерименту,
отримано основні результати досліджень).

Митрофанова И.В. Регенерация in vitro микропобегов из вегетативных
почек зизифуса китайского (Zizyphus jujube Mill.) и физические факторы
культивирования // Бюлл. Никит. ботан. сада. – 2003. – Вып. 87. – С.
63-66.

Митрофанова И.В. Особенности микроразмножения гемарии разноцветной и
доссинии в условиях in vitro // Біологічний вісник. – 2003. – Т. 7, № 1
– 2. – С. 43-45.

Митрофанова И.В., Галаев А.В., Сиволап Ю.М. Исследование
молекулярно-генетической гетерогенности растений клематиса (Clematis
L.), полученных путем органогенеза и соматического эмбриогенеза in vitro
// Цитология и генетика. – 2003. – № 6. – С. 12-16. (Здобувачем на
основі розроблених ним біотехнологічних систем одержано рослини
ломиноса, спільно зі співавторами проведено ПЛР-аналіз і підготовлено
статтю до публікації).

Митрофанова І.В., Кондратенко О.В. Збереження в культурі in vitro
мініатюрних троянд // Бюлл. Никит. ботан. сада. – 2004. – Вып. 90. – С.
77-80. (Дисертантом проведене планування експерименту, отримання рослин
in vitro, розроблено метод збереження експлантів при низьких позитивних
температурах, проведено редагування статті, підготовка її до друку).

Mitrofanova I.V, Mitrofanova O.V. Development of recipient system of
woody subtropical plants in vitro // Acta Universitatis Latveiensis.
Biology. – 2004. – Vol. 676. – P. 189-196. (Здобувачем розроблено
способи регенерації субтропічних рослин, проведено аналіз результатів,
спільно зі співавтором підготовлено статтю до публікації).

Mitrofanova I.V. Influence of carbohydrates and physical factors of
cultivation on formation of Cymbidium hybridum and Cymbidium minima
protocorms in vitro // Bull. State Nikitsky Bot. Gardens. – 2005. – N
91. – P. 126-130.

Митрофанова И.В., Работягов В.Д., Иванова Н.Н. Сравнительное изучение
прямой регенерации микропобегов котовника и иссопа in vitro с целью
пополнения генофонда // Бюлл. Никит. ботан. сада. – 2006. – Вып. 92. –
С. 5-9. (Дисертантом сплановано дослідження, безпосередньо проведено
експерименти, розроблено біотехнологічний підхід у створенні
реципієнтних систем ефіроолійних рослин, проаналізовано результати
досліджень і відредаговано публікацію).

Митрофанова И.В., Соколов О.И., Митрофанова О.В., Иванова Н.Н. Пути
реализации морфогенетического потенциала каладиума (Caladium hortulanum
Birdsey.) и цветной каллы (Zantedeschia hybrida) в условиях in vitro //
Біологічний вісник. – 2006. – Т. 10, № 1. – С. 64-67. (Здобувачем
проведено основні експерименти з вивчення морфогенетичних потенцій
органів і тканин досліджуваних культур, спільно із співавторами
підготовлено постійні препарати та проведено гістологічний аналіз на
флуоресцентному мікроскопі, проаналізовано результати і підготовлено
статтю до друку).

Пат. на винахід 61018 A Україна, МПК 7 А01Н4/00. Спосіб прямої
регенерації мікропагонів з листкових експлантів Actinidia deliciosa
(Chev.) Liang, Ferguson в культурі in vitro: Пат. на винахід 61018 A
Україна, МПК 7 А01Н4/00 / Митрофанова І.В., Іванова Н.М. (Україна). – №
20021210668; Заявлено 27.12.2002 р.; Надрук. 15.10.2003 р., Бюл. 10.
(Дисертантом заплановано і проведено всі експерименти, підготовлено всі
матеріали для патенту, проведено редакційну правку).

Пат. на винахід 68595 Україна, МПК 7 А01Н4/00. Спосіб регенерації
адвентивних мікропагонів Hyssopus officinalis L. в умовах in vitro: Пат.
на винахід 68595 Україна, МПК 7 А01Н4/00 / Митрофанова І.В., Іванова
Н.М., Митрофанова О.В. (Україна). – № 2003087613; Заявлено 12.08.2003
р.; Надрук. 15.06.2006 р., Бюл. 6. (Здобувачем на основі його
багаторічних досліджень підготовлено матеріал для написання патенту,
проведено його редакційну правку).

Mitrofanova I., Mitrofanova O. Special features of somatic embryogenesis
and plant regeneration of Clematis in vitro // Propagation of Ornamental
Plants — IPPS / Eds. Iv. Iliev, P. Zelev, I. Tzvetkov. – Sofia: SEEK &
SHARE: Balkanpress. – 2000. – P. 70-75. (Дисертантом заплановано і
проведено всі експерименти, визначено оптимальні умови для одержання
соматичних зародків, спільно зі співавтором підготовлено матеріал для
публікації).

Митрофанова И.В. Использование биотехнологических методов в создании
медленно растущих коллекций ценного растительного генофонда // Фактори
експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. Укр. т-ва генетиків
і селекціонерів ім. М.І. Вавилова / За ред. М.В. Роїка. – Київ: Логос,
2006. – Т. 3. – С. 613-618.

Митрофанова И.В., Иванова Н.Н. Влияние углеводов на образование
протокормов и ауксинов в процессе ризогенеза цимбидиума в культуре in
vitro // Регуляторы роста и развития растений: Тез. докл. II конф. (29
июня – 1 июля 1993 г., г. Москва, Россия). – Москва, 1993. – С. 49.

Митрофанова И.В., Виджешвар П., Мязина Л.Ф. Регенерация микропобегов из
листовых эксплантов Actinidia deliciosa Planch. // Проблемы дендрологии,
садоводства и цветоводства: Тез. докл. междунар. конф. молодых ученых
(25-27 сентября 1995 г., г. Ялта). – Ялта, 1995. – С. 107.

Митрофанова И.В., Митрофанова О.В. Роль фитогормонов в регуляции
процессов морфогенеза субтропических плодовых культур in vitro //
Регуляторы роста и развития растений: Тез. докл. III междунар. конф.
(27-29 июня 1995 г., г. Москва, Россия). – Москва, 1995. – С. 216.

Митрофанова И.В., Работягов В.Д., Аксенов Ю.В. Морфогенез и регенерация
растений котовника in vitro // Переработка лекарственного сырья и
производство фитопрепаратов для медицины и сельского хозяйства: Тез.
докл. междунар. науч.-практ. конф. (5-6 сентября 1996 г., Алматы,
Казахстан). – Алматы, 1996. – С. 75.

Mitrofanova I.V., Ivanova N.N., Rabotyagov V.D., Zilbervarg I.R.,
Shenfish N.R. Special features of the genus Nepeta’s plants
morphogenesis and regeneration in vitro // Problems and perspectives of
biotechnology development in ornamental gardening and horticulture:
Abstracts Intl. Conf. (25-26 September 1997, Yalta, Ukraine). – Yalta,
1997. – P. 67.

Mitrofanova I.V., Kin E.V., Mitrofanova O.V., Donushkina E.A. Obtaining
of somatic embryos in tissue culture of Clematis L // In vitro Plant
Cell Biology, Biotechnology and Germplasm Preservation: Abstracts VII
Intl. Conf. (25-28 November 1997, Moscow, Russia). – Moscow, 1997. – P.
136.

Mitrofanova I.V., Myazina L.F., Litvinova T.V., Khokhlov S.Yu.
Micropropagation of subtropical horticultural plants in vitro for the
purposes of selection and preservation of valuable genotypes // Problems
and perspectives of biotechnology development in ornamental gardening
and horticulture: Abstracts Intl. Conf. (25-26 September 1997, Yalta,
Ukraine). – Yalta, 1997. – P. 76.

Mitrofanova I.V., Mitrofanova O.V. Somatic embryogenesis and plant
regeneration of Clematis L. in vitro // Plant Biotechnology: Abstracts
II Intl. Symp. (4-8 October 1998, Kyiv, Ukraine). – Kyiv, 1998. – P. 87.

Mitrofanova I.V., Zilbervarg I.R., Mitrofanova O.V., Ivanova N.N.,
Rabotyagov V.D., Blume Ya.B. Special features of micropropagation and
obtainment of the new nep and issope selection forms in vitro // Plant
Biotechnology: Abstracts II Intl. Symp. (4-8 October 1998, Kyiv,
Ukraine). – Kyiv, 1998. – P. 158.

Mitrofanova O.V., Mitrofanova I.V. Viruses of subtropical and stone
fruit cultures and biotechnological receptions of plants improvement //
Bioresourses and viruses: Abstracts II Intl. Conf. (7-10 September 1998,
Kyiv, Ukraine). – Kyiv, 1998. – P. 200.

Mitrofanova O.V., Mitrofanova I.V., Smikov A.V. Biotechnology in
ornamental gardening and horticulture breeding programs // Plant
Biotechnology: Abstracts II Intl. Symp. (4-8 October 1998, Kyiv,
Ukraine). – Kyiv, 1998. – P. 88.

Mitrofanova I.V. Plant regeneration via somatic embryogenesis in
Clematis L. // Materials 7th Intl. Meeting of Young Scientists in
Horticulture, Lednice, Czech Republic, 14-16 September 1999. – Lednice,
1999. – P. 335-338.

Mitrofanova I.V., Mitrofanova O.V. Obtainment of a genetic diversity
and using of culture in vitro in breeding of some subtropical fruit
plants // Fruit Breeding and Genetics: Abstracts Intl. Symp. of the
EUCARPIA (6-10 September 1999, Dresden, Germany). – Dresden, 1999. – P.
A22.

Zilbervarg I.R., Mitrofanova I.V. Features of morphogenesis in organ
and tissue culture of nep and issope // Materials 7 Intl. Conf. of Young
Scientists in Horticulture, Lednice, Czech Republic, 14-16 September
1999. – Lednice, 1999. – P. 263-267.

Mitrofanova I.V., Mitrofanova O.V., Lesnikova N.P. Gene-bank of plants
in vitro in Nikita Botanical Garden (Yalta, Ukraine) // Plant Physiology
and Biochemistry: Abstracts 12th Congress of the FESPP (21-25 August
2000, Budapest, Hungary). – Paris: ELSEVIER, 2000. – Vol. 38. – S. 19.

Mitrofanova I., Kondratenko O. Special features of embryo development
in vitro of some subtropical fruits // Plant Embryology: Abstracts X
Intl. Conf. (5-8 September 2001, Nitra, Slovak Republic). – Nitra, 2001.
– P. 137.

Karpov P.A., Mitrofanova I.V. Approaches in micropropagation in vitro
of some arboreal monocotyledon plants with find expression in apical
domination // Biotechnology approaches for exploitation and preservation
of plant resources: Abstracts Intl. Symp. (26-30 May 2002, Yalta,
Ukraine). – Yalta, 2002. – P. 32-33.

Kondratenko O.V., Mitrofanova I.V. Features of miniature roses clonal
micropropagation // Biotechnology approaches for exploitation and
preservation of plant resources: Abstracts Intl. Symp. (26-30 May 2002,
Yalta, Ukraine). – Yalta, 2002. – P. 34.

Mitrofanova I.V. Plant biotechnology in Nikitsky Botanical Garden –
National Scientific Center // Abstracts II Ukrainian-Bulgarian Workshop
on Plant Biotechnology, Yalta, Ukraine, 29 May – 1 June 2002. – Yalta,
2002. – P. 20.

Mitrofanova I.V., Lesnikova N.P., Shishkin V.A. Conservation in vitro
of plant genetic resources in Nikitsky Botanical Gardens (Yalta,
Ukraine) // Biotechnology approaches for exploitation and preservation
of plant resources: Abstracts Intl. Symp. (26-31 May 2002, Yalta,
Ukraine). – Yalta, 2002. – P. 60-61.

Mitrofanova I.V., Yezhov V.N. In vitro propagation of Clematis L.
through somatic embryogenesis // Biotechnology approaches for
exploitation and preservation of plant resources: Abstracts Intl. Symp.
(26-30 May 2002, Yalta, Ukraine). – Yalta, 2002. – P. 22.

Кондратенко О.Н., Митрофанова И.В. Особенности клонального
микроразмножения Feijoa sellowiana Berg. в условиях in vitro //
Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений: Тез.
докл. II междунар. конф. молодых ученых (19-23 мая 2003 г., г. Харьков).
– Харьков, 2003. – С. 51.

Митрофанова И.В. Минимализация роста декоративных растений под
воздействием химических факторов в культуре in vitro // Биология клеток
растений in vitro и биотехнология: Тез. докл. VIII Междунар. конф. (9-13
сентября 2003 г., г. Саратов, Россия). – Саратов, 2003. – С. 202.

Митрофанова И.В., Галаев А.В., Сиволап Ю.М. Оценка полиморфизма
сомаклонов клематиса (Clematis L.), полученных в условиях in vitro //
Геном растений: Тез. докл. IV междунар. конф. (10-13 июня 2003 г., г.
Одесса). – Одесса, 2003. – С. 28.

Митрофанова И.В., Попкова Л.Л., Митрофанова О.В. Микроразмножение
драгоценных орхидей в культуре in vitro // Геном растений: Тез. докл. IV
междунар. конф. (10-13 июня 2003 г., г. Одесса). – Одесса, 2003. – С.
66.

Мовчан О.П., Митрофанова И.В., Клименко З.К. Изучение регенерационной
способности органов и тканей розы садовой при введении в культуру in
vitro // Актуальные вопросы современного естествознания – 2003: Тез.
докл. Всеукраинской конф. молодых ученых (11-13 апреля 2003 г., г.
Симферополь).– Симферополь, 2003. – С. 62.

Mitrofanova I. Development of direct and indirect regeneration in vitro
of woody subtropical plants // Plant Biotechnology: Progress and
Development: Abstracts 5th Intl. Symp. (7-13 September 2003, Stara
Lesna, Slovak Republic). – Stara Lesna, 2003. – P.44.

Lesnikova-Sedoshenko N., Mitrofanova I., Gorina V. Embryoculture and
obtaining of new forms in Prunus armeniaca L. // Plant Tissue Culture:
From Theory to Practice: Abstracts Intl. Conf. of Baltic States (27-28
May 2004, Salaspils, Latvia). – Salaspils, 2004. – P. 27.

Mitrofanova I. The effect of carbohydrates concentration and physical
factors on in vitro morphogenesis of Cymbidium hybridum and Cymbidium
minima // Growth and Development of Plants. Theoretical and Practical
Problems: Abstracts Intl. Sci. Conf. (7-9 June 2004, Babtai, Lithuania).
– Babtai, 2004. – P. 59.

Mitrofanova I.V., Galaev A.V., Sivolap Yu.M. Somatic embryogenesis in
Clematis L. and study of molecular-genetic heterogeneity of obtained in
vitro somaclones // Biotech Approaches to Engineering plant growth:
Materials Ukranian-U.K. Workshop on Plant Biotechnology (14-16 March
2004, Yalta, Ukraine). – Yalta, 2004. – P. 30-33.

Mitrofanova I., Mitrofanova O. Development of recipient system of
subtropical woody plants in vitro for future genetic transformation //
Plant Tissue Culture: From Theory to Practice: Abstracts Intl. Conf. of
Baltic States (27-28 May 2004, Salaspils, Latvia). – Salaspils, 2004. –
P. 21.

Mitrofanova O., Mitrofanova I. Virus diseases of tropical orchids and
the way to clean up of plants // Plant Tissue Culture: From Theory to
Practice: Abstracts Intl. Conf. of Baltic States (27-28 May 2004,
Salaspils, Latvia). – Salaspils, 2004. – P. 41.

Митрофанова И.В., Ежов В.Н., Митрофанова О.В., Иванова Н.Н., Мовчан
О.П. Создание в условиях in vitro коллекций ценного растительного
генофонда в Никитском ботаническом саду – Национальном научном центре
(Ялта, Украина) // Ботанические сады как центры сохранения
биоразнообразия и рационального использования растительных ресурсов:
Материалы междунар. конф., посвященной 60-летию Главного ботанического
сада им. Н.В. Цицина РАН (5-7 июля 2005 г., г. Москва, Россия). –
Москва, 2005. – С. 349-351.

Анотація

Митрофанова І.В. Соматичний ембріогенез та органогенез як основа
біотехнології отримання і збереження багаторічних садових культур. –
Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за
фахом 03.00.20 – біотехнологія. – Нікітський ботанічний сад –
Національній науковий центр УААН, Ялта, 2007.

Дисертаційну роботу присвячено розробленню ефективних біотехнологічних
систем одержання та збереження декоративних, субтропічних і кісточкових
плодових, ефіроолійних рослин на основі вивчення особливостей
соматичного ембріогенезу та органогенезу цих культур в умовах in vitro.

Досліджено процеси соматичного ембріогенезу у ломиноса, каладіума та
фікуса ліровидного паралельно з пошуком комплексу оптимальних факторів,
що регулюють утворення незиготичних зародків і виявленням
закономірностей розвитку ембріоїдів. Підтверджено висунуту нами гіпотезу
про важливість ролі “індуктора” у соматичному ембріогенезі ломиноса. В
результаті вивчення молекулярно-генетичної гетерогенності рослин
ломиноса нами встановлені особливості мінливості геному при різних
способах регенерації in vitro. Вперше розроблено високоефективні
біотехнологічні системи одержання рослин ломиноса, каладіума та фікуса
ліровидного через соматичний ембріогенез та органогенез, де в якості
компетентних експлантів було використано вегетативні бруньки та листя.

Проведено порівняльне вивчення морфогенетичних потенцій органів і тканин
ківі, зизифуса, хурми та фейхоа і показано високу регенераційну
здатність листкових експлантів до адвентивного пагоноутворення.
Запропоновано комплекс умов для регенерації рослин м’яти котячої та
гісопу з листкових дисків. Уперше створено реципієнтні системи in vitro
для зизифуса, хурми, фейхоа, ківі, м’яти котячої та гісопу.

Вперше визначено оптимальні експланти декоративних, субтропічних і
кісточкових плодових культур для подальшого депонування в умовах in
vitro. Встановлено найважливіші фактори, що впливають на тривалість
збереження в умовах in vitro експлантів досліджуваних рослин. Розроблено
спосіб мінімізації росту рослин в умовах in vitro і на його основі
створено генобанк цінних видів і сортів декоративних, кісточкових і
субтропічних плодових культур у вигляді повільно зростаючих колекцій.

Ключові слова: ломиніс, каладіум, фікус ліровидний, зизифус, ківі,
фейхоа, хурма, м’ята котяча, гісоп, троянда, орхідея, юка, абрикос,
слива, алича, соматичний ембріогенез, органогенез, реципієнтна система,
депонування, in vitro

Аннотация

Митрофанова И.В. Соматический эмбриогенез и органогенез как основа
биотехнологии получения и сохранения многолетних садовых культур. –
Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по
специальности 03.00.20 – биотехнология. – Никитский ботанический сад –
Национальный научный центр УААН, Ялта, 2007.

Диссертационная работа посвящена разработке эффективных
биотехнологических систем получения и сохранения декоративных,
субтропических и косточковых плодовых, эфиромасличных растений на основе
изучения особенностей соматического эмбриогенеза и органогенеза этих
культур.

Исследованы процессы соматического эмбриогенеза у клематиса, каладиума и
фикуса лировидного, параллельно с поиском комплекса оптимальных
факторов, регулирующих образование незиготических зародышей и выявлением
закономерностей развития эмбриоидов. Отработаны этапы введения
эксплантов в условия in vitro, индукции формирования эмбриогенных
структур, развития соматических зародышей, вторичного эмбриогенеза,
получения растений и их адаптации in vivo. Подтверждена, выдвинутая
нами, гипотеза о важности роли “индуктора” в соматическом эмбриогенезе
клематиса. Установлена зависимость включения эмбриогенного пути развития
в меристемных клетках боковых и верхушечных почек клематиса от генотипа,
“индуктора”, концентрации БАП (2,22 мкМ), температуры (24 ( 1(С),
интенсивности освещения 40 мкМ·м-2·с-1. Показано, что наиболее
эффективно функционировала биотехнологическая система у клематисов групп
Ланугиноза и Жакмана. В результате изучения молекулярно-генетической
гетерогенности растений клематиса нами установлены особенности
изменчивости генома при различных способах регенерации in vitro. Средний
показатель гетерогенности растений клематиса составил 5,7%. Однако, все
растения, доведенные до цветения не отличались по фенотипу от исходного.
На основании полученных результатов впервые разработаны
высокоэффективные биотехнологические системы получения растений
клематиса, каладиума и фикуса лировидного через соматический эмбриогенез
и органогенез, где в качестве компетентных эксплантов были использованы
вегетативные почки и листья.

В результате проведенных многолетних исследований, впервые разработаны
реципиентные системы in vitro для зизифуса, хурмы, фейхоа, киви.
Подобраны условия культивирования, необходимые для реализации процесса
регенерации растений из листовых эксплантов и семядолей.

Предложен комплекс условий для регенерации растений котовника и иссопа
из листовых дисков и впервые разработана реципиентная система in vitro
для этих культур. Определены концентрации ТДЗ для иссопа – 6 мкМ, для
котовника – 9 мкМ, применение которых индуцировало образование
микропобегов у 70-90% листовых дисков при адаксиальном расположении на
среде.

Впервые определены оптимальные экспланты декоративных, субтропических и
косточковых плодовых культур для дальнейшего депонирования в условиях in
vitro на основе ростового индекса, частоты регенерации и
органогенетического индекса. Установлены важнейшие факторы, влияющие на
длительность сохранения в условиях in vitro эксплантов исследуемых
растений: генотип, температура (5(1(С), интенсивность освещения
(1,25-3,75 мкМ м-2 с-1), состав питательной среды (Ѕ МС, В5, КЛ,
Кнудсона С), концентрации ретарданта (0,4 г/л ССС) и осмотика (90 г/л
сахарозы). Показано, что совместное использование всех эффекторов
позволяет сохранять экспланты жизнеспособными в беспересадочной культуре
на протяжении 12-24 месяцев. Разработан способ минимизации роста
растений при низких положительных температурах в условиях in vitro и на
его основе создан генобанк ценных видов и сортов декоративных,
косточковых и субтропических плодовых культур в виде медленно растущих
коллекций.

Ключевые слова: клематис, каладиум, фикус лировидный, зизифус, киви,
фейхоа, хурма, котовник, иссоп, роза, орхидея, юкка, абрикос, слива,
алыча, соматический эмбриогенез, органогенез, реципиентная система,
депонирование, in vitro

Summary

Mitrofanova I.V. Somatic embryogenesis and organogenesis as a basis of
obtaining and preservation of perennial horticultural plants. –
Manuscript.

Thesis for Doctor of Science degree in Biology (Dr. Sci. Biol.),
speciality 03.00.20 – biotechnology. – Nikitsky Botanical Gardens –
National Scientific Center. Ukrainian Academy of Agricultural Science,
Yalta, 2007.

This dissertation is devoted to development of effective
biotechnological systems of obtaining and preservation of ornamental
plants, subtropical and stone fruits, essential oil plants based on
study of features of somatic embryogenesis and organogenesis of these
cultures.

The processes of somatic embryogenesis in clematis, caladium and lyrate
fig were investigated, with search of a complex of the optimal factors
regulated formation of non-zygotic embryoids and revealing of laws of
embryoids development. The stages of explants introduction in conditions
in vitro, induction of embryogenic structures formation, development of
somatic embryoids, secondary embryogenesis, obtaining of plants and
their acclimatization in vivo were fulfilled. High effective
biotechnological systems of ornamental plants obtaining through somatic
embryogenesis and organogenesis were developed for the first time, where
as competent explants the vegetative buds and leaves were used.

The culture conditions, which are necessary for realization of process
of direct plant regeneration from leaf disks in subtropical and
essential oil plants, were determined and recipient system for zizyphus,
kiwi, persimmon, feijoa, nep and hyssop was created.

The major factors influencing on duration of preservation of explants of
ornamental plants, subtropical and stone fruits in conditions in vitro
were established. The method of minimization of plants growth in vitro
at low positive temperatures was developed and genepool collection of
valuable species and cultivars was created.

Kew words: clematis, caladium, lyrate fig, zizyphus, kiwi, feijoa,
persimmon, nep, hyssop, rose, orchids, yucca, apricot, plum, sweet plum,
somatic embryogenesis, organogenesis, recipient system, preservation, in
vitro

_______________________________________________________________________
____________

Підписано до друку 23.07.2007 г. Формат 60х84 1/16.

Папір типографський. Друк цифровий.

Умов. друк. арк. 1,9. Тираж 100 прим. Замовлення № 0-39.

________________________________________________________________________
___________

Інформаційно-видавницький відділ

Таврійського національного університету ім. В.І. Вернадського

95007, м. Сімферополь, проспект Академіка Вернадського, 4.

Похожие записи