ІНСТИТУТ ГЕРОНТОЛОГІЇ АМН УКРАЇНИ

Маргітич Віктор Михайлович

УДК 577.115

Склад жирних кислот за умов патологічних станів та можливість його
корекції під впливом N-ацилетаноламінів

03.00.04 ? біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Київ ? 2005 рік Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі біохімії ліпідів Інституту біохімії ім. О.В.
Палладіна НАН України

Науковий консультант ? доктор біологічних наук, професор,

член-кореспондент НАН та АМН України

Гула Надія Максимівна,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України,

керівник відділу біохімії ліпідів

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор

Кульчицький Олег Костянтинович,

Інститут геронтології АМН України,

керівник лабораторії регуляції метаболізму

доктор медичних наук, професор

Микоша Олексій Степанович,

Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН
України,

головний науковий співробітник лабораторії гормональної регуляції
метаболізму

доктор біологічних наук, професор

Курський Михайло Дмитрович,

Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України,

головний науковий співробітник відділу біохімії м’язів

Провідна установа: Національний медичний університет ім. О.О.
Богомольця, кафедра біоорганічної, біологічної та фармацевтичної хімії,
м. Київ

Захист дисертації відбудеться “_23”___червня_ 2005 р. о 13оо годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.551.01 при Інституті
геронтології АМН України за адресою: 04114, м. Київ, вул. Вишгородська,
67

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту геронтології АМН
України за адресою: 04114, м. Київ, вул. Вишгородська, 67

Автореферат розісланий “_20”__травня__________ 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат медичних наук Потапенко Р.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Протягом останніх десятиріч доведено ключову роль
ліпідів, загалом, та жирних кислот, зокрема, у життєдіяльності клітини.
Ліпіди служать важливими структурними компонентами біологічних мембран,
енергетичним субстратом клітини, беруть участь у реакціях сигнальної
трансдукції, екзо- та ендоцитозу тощо. Серед факторів, що визначають
фізико-хімічні та біологічні властивості жирних кислот, слід вказати на
довжину вуглеводневого ланцюга, ступінь його ненасиченості, розташування
подвійних зв’язків, ступінь розгалуженості ланцюга, тип хімічного зв’зку
карбоксильної групи жирної кислоти з полярною частиною фосфо- та
гліколіпідних молекул, а також ступінь окисленості жирнокислотних
залишків. Ліпіди беруть участь у фіксації білків у фосфоліпідному
бішарі, служать неполярним середовищем для жиророзчинних субстратів і
кофакторів ферментів, забезпечують відповідну орієнтацію білків у
клітинній мембрані, зумовлюють конформаційні зміни білків та їх фолдинг,
а також виступають у ролі регуляторів та модуляторів ферментативної
активності (M.T. Nakamura, T.Y. Nara, 2004 ).

Поліненасичені жирні кислоти (PUFA) є чутливим субстратом для
вільнорадикального окислення. За умов різноманітних патологічних станів
відбувається активація процесів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ). На
рубежі тисячоліть сформульовано теорію оксидативного стресу як
провідного фактору патогенезу багатьох захворювань, ? ішемічної хвороби
серця (ІХС), артеріальної гіпертензії (АГ), злоякісних новоутворень тощо
(J.K. Willcox, et al., 2004). Для лікування та профілактики заворювань,
що супроводжуються оксидативним стресом, було запропроновано
використовувати антиоксиданти. Результати проведених з позицій доказової
медицини широкомасштабних клінічних досліджень хоч і не підтвердили
клінічну ефективність антиоксидантів при ІХС та злоякісних
новоутвореннях (G. Bjelakovic, et al., 2004), проте засвідчили високу
ефективність інстенсивної холестерол-знижуючої терапії з використанням
статинів у пацієнтів з ІХС у вигляді зменшення ризику гострих коронарних
подій та продовження тривалості життя (К.С. Ferdinand, 2004; S.M.
Grundy, et al., 2004). Збагачення харчового раціону PUFA n-3 ряду також
сприяє зниженню смертності та фатальних коронарних подій у пацієнтів з
ІХС (L. Hooper,et al., 2004), а також попереджує розвиток злоякісних
новоутворень (І. Roland, et al., 2004; Н. Tsuda, et al., 2004).

Незважаючи на значні успіхи фармакологічної корекції гіперхолестеролемії
у пацієнтів з ІХС, питання порушення складу жирних кислот та їх
функціональної ролі за умов патологічних станів у людини вивчено
недостатньо. У зв’язку з цим в 2003 р. науковцями зі США запропоновано
спеціальну програму вивчення ліпідому людини, в рамках якої планується
здійснити повний якісний та кількісний аналіз ліпідів клітини з метою
виявлення механізмів взаємодії ліпідів з іншими молекулами клітини та
впливу ліпідів на функціональну активність внутрішньоклітинних органел (
HYPERLINK «http://www.lipidmaps.org» www.lipidmaps.org , 2005).

У відділі біохімії ліпідів Інституту біохімії (керівник
член-кореспондент НАН та АМН України Н.М. Гула) дослідження по вивченню
функціональної ролі ліпідів було розпочато ще два десятиліття тому
назад. Частину результатів цих досліджень представлено у докторській
дисертації Г.Л. Волкова “Роль холестерин-залежних регуляторних
механізмів у структурно-функціональній організації біологічних мембран”
(1996), в якій показано, що підвищення рівня вільного холестеролу в
клітинах ссавців супроводжується збільшенням ступеня ненасиченості
фосфоліпідів (PL) мембран, і, навпаки, пониження рівня вільного
холестеролу в клітині асоціюється зі зростанням ступеня насиченості PL
мембран, за рахунок чого в’язкість клітиних мембран не змінюється, що
добре узгоджується з теорією гомовіскозної адаптації (J.R. Hazel, 1988).
Зміни у якісному та кількісному складі ліпідів забезпечуються за рахунок
деацилювання / реацилювання, трансацилювання та обміну основами PL, а
також елонгації та десатурації жирних кислот (G.M. Hatch, 2004; M.T.
Nakamura, T.Y. Nara, 2004).

Наведені факти диктують необхідність вивчення універсальних
закономірностей порушення складу жирних кислот біологічних об’єктів за
умов патологічних станів та пошуку біологічно активних ліпідів, що
здатні забезпечити корекцію складу жирних кислот та PL з метою розробки
інноваційних лікарських засобів для фармакотерапії захворювань.

До біологічно активних ліпідів відносяться, зокрема, похідні жирних
кислот, ? N-ацилетаноламіни (NAE), ? представники нещодавно відкритого
класу ендоканнабіноїдів. Ці сполуки вперше були описані групами Н.М.
Гулої та Г.Г.О. Шміда (США) в декотрих клітинах ссавців за умов
патологічних станів у 80-х роках минулого століття. Авторами
сформулювано гіпотезу про мембранотропні та мембранопротекторні
властивості NАЕ, й експериментально продемонстровано дозо-залежний вплив
цих сполук на мембранопов’язані процеси, такі як транспорт катіонів,
активність ферментів тощо (N.M. Gulaya, et al., 1993; N.M. Gulaya, et
al., 1990; H.H.O. Schmid, et al., 1990). У 90-х роках ХХ ст.
розшифровано хімічну структуру ендогенного ліганду каннабіноїдних
рецепторів, ? N-арахідоноїлетаноламіну (тривіальна назва ? “анандамід”).
З того часу розпочалося широкомасштабне дослідження біохімічних та
фармакологічних властивостей анандаміду та інших NAE. На жаль, в
науковій літературі відсутні дані про використання NAE з метою корекції
складу жирних кислот та фосфоліпідів за умов патологічних станів.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Наукові
дослідження за темою дисертаційної роботи здійснювалися у відділі
біохімії ліпідів (керівник відділу ? член-кореспондент НАН та АМН
України, доктор біологічних наук, професор Н.М. Гула) протягом 1994 ?
2004 рр. у рамках:

бюджетної наукової тематики відділу біохімії ліпідів Інституту біохімії
НАН України в рамках проблеми 2.28.4 “Біохімія тварин і людини”, держ.
рег. № 0194U013504, за темою 2.10.6 “Вивчення функціональної ролі та
механізму дії природних біологічно активних ліпідів N-ацилетаноламінів”,
затвердженою Президією НАН України, у 1994 ? 1998 рр.;

бюджетної наукової тематики відділу біохімії ліпідів Інституту біохімії
НАН України в рамках теми 0194U013504 “Вивчення функціональної ролі та
механізму дії природних біологічно активних ліпідів N-ацилетаноламінів”,
шифр 2.28.4.7, та теми 0199U000271 “Роль ліпідів у загальному механізмі
розвитку патологічних станів та вивчення протекторної дії природних
N-ацилетаноламінів (NAE) та С27-стероїдів”, шифр 2.28.4.7, затвердженої
Президією НАН України на 1999 ? 2003 рр.;

гранту Державного фонду фундаментальних досліджень (ДФФД) № 5.4/154 в
рамках теми “Вивчення процесів перетворення в тканинах довголанцюжкових
N-ацилетаноламінів ? представників нового класу біологічно активних
сполук” у 1997 ? 1999 рр.;

науково-дослідної програми “Визначення метаболічних механізмів морфінної
залежності з метою розробки нових методів та способів її корекції.”
(Тема 83 Д) у 1994 ? 1997 рр.;

спільного проекту Інституту біохімії НАН України та Інституту клінічної
та експериментальної хірургії АМН України: “Вивчення
мембраностабілізуючих препаратів на деструктивні зміни в донорських
органах та тканинах при зберіганні. Створення передумов для розробки
консервуючих розчинів” (державна реєстрація № 5-516) у 1992 – 1995 рр.;

спільного проекту Інституту біохімії НАН України та Інституту
геронтології АМН України “Вивчення природних мінорних ліпідів з
“незвичайною” структурою та їх протекторної дії при патологічних
процесах у серці” (№ 32Д) у 1993 – 1994 рр.;

спільного проекту Інституту біохімії НАН України та Інституту
геронтології АМН України “Вивчення впливу N-ацилетаноламінів на
фосфоліпідний склад плазматичних мембран міокардіоцитів, на ритмічну та
скорочувальну функції серця при коронарній недостатності з метою
розробки лікарського препарату” (№ 84Д) у 1995 р.;

наукового проекту “Розробка нового кардіотропного препарату
N-ацилетаноламіну” (грант № 02.03/05560 Міннауки України) у 1997 – 1999
рр.;

спільного проекту Інституту біохімії НАН України та INSERM U352, INSA
Lyon (Франція), на реалізацію якого було отримано грант НАТО (ENVIR.LG
961087) на 1997 – 2001 рр.;

гранту International Soros Science Foundation (N K15100) “Вивчення
впливу природного мінорного компоненту мембран клітин ?
N-ацилетаноламіну на утворення вільних радикалів та механізм його
інгібуючого впливу на перекисне окиснення ліпідів” у 1995 р.;

гранту НАН та МААН для молодих учених в 1996 р., а також стипендій
Президента України, призначених тричі поспіль загальним терміном на 6
років (1995 – 2000 рр.);

наукової теми Державного комітету України з питань науки та технологій:
“Вивчення механізму дії довголанцюжкових N-ацилетаноламінів на
внутрішньоклітинний гомеостаз йонів Са в гладеньких м’язах” (грант №
5.2./ 127) у 1994 – 1995 рр.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи ? встановити та
охарактеризувати склад жирних кислот за умов патологічних станів у
людини та піддослідних тварин, а також експериментально, з використанням
відповідних моделей патологічних станів, запропонувати можливість
корекції складу жирних кислот та PL ушкоджених тканин за допомогою NАЕ.

Об’єкт дослідження ? порушення складу ліпідів за умов патологічних
станів та внаслідок дії несприятливих факторів зовнішнього середовища у
людини та щурів; відновлення складу ліпідів за умов експериментальних
патологічних станів у щурів під впливом NАЕ.

Предмет дослідження ? жирнокислотний склад мембран еритроцитів у
пацієнтів з АГ, ІХС, ліквідаторів аварії на Чорнобильській АЕС у
віддаленому періоді після йонізуючого опромінення (ліквідатори), а також
пухлинної тканини при карциномі щитоподібної залози у дітей;
жирнокислотний склад тканини міокарда та печінки щурів за умов
експериментальної ішемії / реперфузії цих органів, а також тканини
головного мозку при морфінній залежності у щурів; та вплив NАЕ на склад
жирних кислот ушкоджених тканин за умов вищезгаданих модельних
патологічних станів у щурів.

Для досягнення мети сформульовано наступні завдання:

встановити наявність можливих спільних закономірностей порушення складу
жирних кислот та їх похідних у біологічних структурах людини за ІХС, АГ,
карциномі щитоподібної залози, у віддаленому періоді після йонізуючого
опромінення, при гострих патологічних станах, що супроводжуються ішемією
/ реперфузією у людини та піддослідних тварин;

в експериментах на піддослідних тваринах встановити факт модифікуючого
впливу NAE на перебіг мембранопов’язаних процесів та склад ліпідів
біологічних структур;

обгрунтувати можливість використання NAE для корекції порушеного складу
жирних кислот і PL на експериментальних моделях гострої ішемії /
реперфузії міокарда та печінки, а також хронічної морфінної залежності у
щурів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше виявлено універсальну
закономірність формування дисбалансу жирних кислот за умов хронічних
патологічних станів у вигляді парадоксального зростання відсоткового
вмісту PUFA переважно за рахунок арахідонової кислоти (20:4 n-6) на тлі
підвищеного рівня загального холестеролу в біологічних структурах (у
пацієнтів з АГ, ІХС, раком щитоподібної залози). Патологічні стани, що
супроводжуються зменшенням рівня загального холестеролу в біологічних
тканинах, асоціюються зі зниженням вмісту PUFA n-6 та n-3 ряду, зокрема
20:4 n-6 та докозагексаєнової кислоти (22:6 n-3), а також загальних і
декотрих індивідуальних PL (експериментальна морфінна залежність у
щурів). Вищенаведені зміни вперше інтерпретуються з позицій теорії
гомовіскозної адаптації: зростання кількості холестеролу у біологічних
структурах людини та піддослідних тварин компенсується підвищенням рівня
поліненасичених ліпідів, а зменшення кількості холестеролу ? пониженням
рівня поліненасичених ліпідів. На відміну від хронічних патологічних
станів, гостра ішемія / реперфузія міокарда у людини та піддослідних
тварин супроводжується зростанням кількості PUFA вільних та
естерифікованих у складні ліпіди, що, однак, не компенсується
підвищенням рівня загального та вільного холестеролу. З огляду на
існування певного лаг-періоду з моменту підвищення вмісту PUFA до
компенсаторного зростання рівня холестеролу в клітині за умов
патологічних станів, а також виходячи з того факту, що PUFA є
ендогенними лігандами низки ядерних рецепторів / факторів транскрипції,
висловлено припущення про реалізацію механізмів гомовіскозної адаптації
на рівні регуляції експресії генів.

Нами сформульовано концепцію про дуалістичну функціональну роль
підвищення вмісту PUFA в біологічних системах за умов патологічних
станів. Захисне значення надлишку PUFA полягає в полегшенні перебігу
мембранопов’язаних процесів за рахунок пониження упорядкованості
ліпідного бішару та забезпеченні клітини попередниками “вторинних
месенджерів”, що вивільняються у цитозоль у відповідь на дію гормонів та
інших біологічно активних речовин та, у кінцевому рахунку, запускають
комплекс захисних реакцій, спрямованих на мінімізацію ушкодження
клітини. Негативне значення накопичення PUFA полягає в ушкодженні
специфічних функцій клітини за рахунок надмірного утворення, зокрема,
моногідроксильованих похідних жирних кислот. Так, вперше показано, що
накопичення моногідроксильованих похідних PUFA в імунокомпетентних
клітинах ліквідаторів асоціюється з імунним дисбалансом. При цьому
підвищення вмісту цих сполук у мононуклеарах ліквідаторів аварії на ЧАЕС
є функцією величини поглинутої дози йонізуючого опромінення. Таким
чином, зміни вмісту PUFA в клітині за умов патологічних станів
асоціюються з реструктуризацією якісного складу фосфоліпідів і
холестеролу, в результаті чого може розвинутися стійкий дисбаланс жирних
кислот.

Оскільки гомовіскозна адаптація та компенсація змін у ліпідному складі є
важливою стратегією захисту клітини, то одним з раціональних підходів до
розробки цитопротекторних засобів є пошук біологічно активних ліпідів,
здатних забезпечити відновлення складу жирних кислот та PL в ушкоджених
тканинах. Нами обгрунтовано та запропоновано можливість використання NAE
для корекції / модуляції складу жирних кислот та PL за умов патологічних
станів. Висловлено робочу гіпотезу, що модифікація складу жирних кислот
та PL під впливом насичених NAE може асоціюватися з пригніченням
вільнорадикального окислення та модулюючим впливом на енергозалежний
транспорт Са2+. Вперше продемонстровано, що нейропротекторна дія суміші
насичених та ненасичених NAE у щурів з морфінною залежністю асоціюється
з дозо-залежною модифікацією вмісту жирних кислот, фосфоліпідів та
дофаміну в тканині головного мозку, а також з істотним зменшенням
споживання ad libitum морфіну.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані дозволяють
стверджувати про існування біохімічних механізмів компенсації порушення
складу жирних кислот біологічних структур за умов хронічних патологічних
станів. Дуалістичне розуміння біологічного значення дисбалансу жирних
кислот та компенсаторної ролі холестеролу заохочує переглянути сучасну
терапевтичну стратегію фармакотерапії гіперхолестеролемії та розробити
більш диференційовані підходи до фармакотерапії дисліпідемій, що
враховуватимуть не тільки рівень холестеролу та ліпопротеїнів у
сироватці / плазмі крові, а й вміст жирних кислот, їх
моногідроксильованих похідних та PL у формених елементах крові. Це
дозволить ефективно управляти ризиками фатального ушкодження клітини
внаслідок дії патогенного чинника.

Одержані результати закладають раціональний фундамент для можливого
використання ендоканнабіноїдів як оригінальних лікарських засобів для
фармакотерапії морфінної залежності та патологічних станів, що
супроводжуються ішемією / реперфузією міокарда та інших органів. В
рамках гранту Міннауки (див. вище) у 1997-1999 рр. був реалізований
проект “Розробка нового кардіотропного препарату N-ацилетаноламіну”,
яким було започатковано доклінічний етап створення інноваційного
кардіопротекторного препарату N-ацилетаноламіну.

Розроблено лабораторний спосіб синтезу N-([1-14C]-пальмітоїл)етаноламіну
з [1-14C]-пальмітинової кислоти та моноетаноламіну, що може знайти
належне застосування в наукових дослідженнях з метою вивчення
метаболізму NAE в біологічних структурах піддослідних тварин.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційну роботу було сплановано і
виконано автором, в основному, самостійно, під загальним керівництвом
наукового консультанта. Ідеї, гіпотези та теоретичні концепції належать
здобувачеві. Автор дисертаційної роботи є основним виконавцем
досліджень, результати яких викладені у даній роботі. Роль співавторів
окремих досліджень визначена у відповідних публікаціях і патенті та
окремих письмових угодах. Оскільки робота є багатопрофільною та виконана
за участю науковців низки інститутів системи НАН та АМН України, то
частина результатів досліджень, які наводяться у дисертації,
опубліковано у співавторстві (Гулий М.Ф., Гула Н.М., Фролькіс В.В.,
Костерин С.О., Синицький В.М., Чумак А.А., Базика Д.А., Лагард М.,
Пріжан А.-Ф., Гішардан М., Тевенон Ш., Коваленко В.М., Вікторов О.П.,
Мітченко О.І., Артамонов М.В., Бабич Л.Г., Говсеєва Н.М., Горідько Т.М.,
Жуков О.Д., Зіньковський М.Ф., Клімашевський В.М., Коваленко А.,
Корнієнко Т.М., Кузьменко А.І., Мельничук С.Д., Пугач Б.В., Семикопна
Т.В., Слинченко Н.М., Шинлова О.П., Шликов С.Г., Харченко Н.К.,
Шагідулін М.Ю. та ін.). Факт використання результатів досліджень,
люб’язно наданих співавторами, спеціально відзначається у дисертаційній
роботі. Автор дисертації висловлює щиру подяку кандидату біологічних
наук, старшому науковому співробітнику В.М. Клімашевському за цінну
методичну допомогу щодо хроматографічного аналізу жирних кислот.

Апробація результатів дисертації.

1st Congress of the European Association for Clinical Pharmacology and
Theurapeutics, Paris, France (1995);

12th Annual Meeting and 1st International Conference of the Academy of
Surgical Research, Muenster, Germany / J. Investigative Surgery (1996);

Всеукраїнська науково-методична конференція “Хімічні науки і
сучасність”, Полтава: Освіта (1999);

VII Український біохімічний з’їзд, Київ (1997);

3rd Congress of the International Society for the Study of Fatty Acids
and Lipids, Lyon, France (1998);

17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, San
Francisco, California (1997);

11th International Conference on Advances in Prostaglandin and
Leukotriene Research: Basic Science and New Clinical Applications,
Florence, Italy (2000);

11th ESC Conference at the Charitй Berlin for medical students and young
doctors, Berlin, Germany (2000);

Міжнародний медико-фармацевтичний конгрес “Ліки та життя”, Київ (2004);

ХХ Міжнародний Київський симпозіум з наукознавства та історії науки і
техніки “Академічна наука: минуле, сучасне, майбутнє”, Київ (2004).

Науковий семінар Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (12
січня 2005 р.).

Публікації. По темі дисертації опубліковано 29 статей та 9 тез доповідей
у вітчизняних фахових та зарубіжних періодичних виданнях, а також
матеріалах і тезах наукових конференцій, (див. перелік власних
публікацій наприкінці кожного розділу експериментальної частини
дисертації), подано 1 заявку на патент.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал та методи досліджень Відповідно до мети представленої роботи та
покладених завдань нами було використано біологічний матеріал 124
пацієнтів з АГ, ІХС, ліквідаторів (кров) та хворих на рак щитоподібної
залози (екстирпована під час хірургічної операції пухлинна та
позапухлинна тканина щитоподібної залози); а також відповідні тканини,
отримані від 141 білого щура з модельними патологічними станами ішемії /
реперфузії та морфінної залежності.

Екстракція ліпідів. У відділі біохімії ліпідів Інституту біохімії ім.
О.В. Палладіна НАН України розроблено, уніфіковано та валідовано
методику якісного та кількісного хроматографічного аналізу жирних
кислот, їх похідних, а також складних ліпідів біологічних об’єктів
людини та піддослідних тварин, що включає управління ризиками виникнення
артефактів. Це дало змогу добитися високої відтворюваності результатів,
і, як наслідок, належної вірогідності отриманих наукових даних. Для
екстракції ліпідів використано метод E.G. Bligh, W.I. Dyer (1959). Щоб
уникнути артефактного накопичення NAE, N-ацильованих фосфоліпідів (NAPE)
та лізо-фосфоліпідів, а також пероксидативної деградації PUFA,
біологічний матеріал з моменту його відключення від системного кровотоку
або реперфузійного середовища прогятом 60-90 сек поміщали у скраплений
азот (W.W. Christie, 1982).

Визначення фосфоліпідів. Кількісний аналіз загальних (сумарних) PL у
ліпідному екстракті визначали за допомогою молібдатного реагенту (V.E.
Vaskovsky, et al., 1975). Для розділення індивідуальних PL
використовували високоефективну двовимірну мікротонкошарову
хроматографію. Розподіл діацильних та плазмалогенних (алкіл /
алкенільних) форм основних PL (фосфатидилхоліну та
фосфатидилетаноламіну) здійснювали за методом реакційної тонкошарової
хроматографії.

Якіснй та кількісний аналіз жирних кислот.

Якісний та кількісний аналіз метилових ефірів жирних кислот здійснювали
з використанням газо-рідинного хроматографа “Carlo Erba” (Італія) з
полум?яно-йонізаційним детектором. Метилові ефіри жирних кислот
отримували згідно методичних рекомендацій W.W. Christie (1982). Для
хроматографії метилових ефірів жирних кислот використовували скляні
колонки (2,5 м ? 3 мм). Як носій застосовували Chromosorb W/HP з
нанесеною фазою 10% Silar 5CР (“Serva”, ФРН).

Газова хроматографія моногідроксильованих жирних кислот. Газову
хроматографію з мас-спектрометрією здійснювали з використанням системи
НР6890 (“Hewlett Packard”, США), оснащеної мас-селективним детектором
серії 5973. Кількісне визначення вільних та естерифікованих у
фосфоліпіди моногідроксильованих жирних кислот здійснювали на підставі
порівняння площі досліджуваних піків з такою внутрішніх стандартів ?
рицинолеїнової кислоти та 2-рицинолеоїл-фосфатидилхоліну, відповідно.

Кількісний аналіз холестеролу. Визначення загального холестеролу
(вільний холестерол + ефіри холестеролу) здійснювали за допомогою методу
газо-рідинної хроматографії. Вміст холестеролу визначали на хроматографі
“Carlo Erba” (Італія) або “Chrom-5” (Чехія) з використанням колонки з
нержавіючої сталі довжиною 0,5 м, заповненої Chimalite W (80-100 меш) з
нанесеною 1,5% рідкою фазою OV-1 (“Shimadzu”, Японія). Як внутрішній
стандарт використовували ?-ситостерол, який додавали до зразків на
стадії екстракції ліпідів згідно методу Блая-Дайєра.

Синтез міченого N-пальмітоїлетаноламіну (14C-NPE). Для лабораторного
синтезу міченого препарату NАЕ використовували етаноламін, та мічену
пальмітинову кислоту ([1-14C]-16:0) Хімічний синтез міченого NРE
проводили за схемою:

СН3?(СН2)14?14СООН + Н2N?СН2?СН2?ОН ? СН3?(СН2)14?14СО?НN?СН2?СН2?ОН +
Н2О

під час якої відбувається проста хімічна конденсація жирної кислоти (у
даному випадку [1-14C]-16:0) з моноетаноламіном, внаслідок чого
утворюється 14C-NPE та вода. З метою оцінки ступеня чистоти та
відповідності отриманого кінцевого продукту 14C-NPE було використано
мікротонкошарову та газову хроматографію, які засвідчили відповідність
синтезованого продукту 14C-NPE та наявність незначної кількості домішок,
які не перевищують 0,5% від загальної кількості синтезованого продукту.

Вивчення енергозалежного транспорту Са2+ в субклітинних структурах
міометрію

Фракцію плазматичних мембран, збагачену інвертованими везикулами
сарколеми, виділяли з міометрію свині. Акумуляцію Са2+ у фракції
плазматичних мембран досліджували за допомогою ізотопної методики з
використанням 45Са2+. Кількість йонів Са2+, що пасивно поступили в
везикули та адсорбувалися на їх поверхні, визначали за умови відсутності
АТР в середовищі інкубації. Транспортний процес ініціювали введенням у
вищезгадане середовище аліквоти розчину (40СаС12 + 45СаС12). Кількість
Са2+, акумульованого в везикулах в ході Mg2+, АТР-залежного процесу,
розраховували по різниці між накопиченням даного катіону із середовища
інкубації та енергозалежним включенням Са2+ у везикули з інкубаційного
середовища з аналогічним складом, але яке не містило АТР.
Радіоактивність мембранних фільтрів вимірювали на рідинному
сцинтиляційному спектрометрі SL-400 фірми “Intertechnique” (Франція).
Очищену Са2+, Mg2+-ATP-азу виділяли з сарколеми свиней за допомогою
методу афінної хроматографії на кальмодулін-сефарозі 4В. АТР-гідролазну
реакцію ініціювали шляхом введення в середовище аліквоти розчину
ферментного білка.

Для пермеабілізації клітин гладеньких м’язів невагітніх щурів,
естрогенізованих за добу до забору тканини, використовували нейонний
детергент дігітонін. Акумуляцію Са2+ в суспензії пермеабілізованих
дигітоніном клітин гладеньких м’язів міометрію досліджували також за
допомогою ізотопної методики (45Са2+). Накопичення Са2+ в
ендоплазматичному ретикулумі пермеабілізованих міоцитів досліджували з
використанням рутенієвого червоного, який повністю пригнічує
енергозалежну акумуляцію Са2+ в мітохондріях клітин міометрію.
Акумуляцію Са2+ в мітохондріях пермеабілізованих клітин гладеньких
м’язів вивчали, використовуючи тапсигаргін, який пригнічує Mg2+,
АТР-залежний кальцієвий насос ендоплазматичного ретикулуму.

Одержання ізольованих клітин та субклітинних фракцій. Лімфоцити /
мононуклеари виділяли згідно методу, описаного N. Meskini, et al.
(1993). Для виділення мембран еритроцитів використовували метод I.D.
Dodge, et al. (1963). Ізольовані мітохондрії тканини печінки щурів
отримували згідно рекомендацій, що описані G. Sottocasa (1976).

Експериментальні моделі патологічних станів

Модель ішемії / реперфузії ізольованого серця. Дану методику розроблено
в лабораторії академіка НАН та АМН України В.В. Фролькіса. Екстирпацію
серця у дев’ятимісячних щурів-самців лінії Wistar (n=20), з масою тіла
280-320 г, здійснювали під ефірним наркозом. Піддослідних тварин
розділили на 3 групи: “контроль” – здійснювали перфузію ізольованого
серця розчином Tyrode протягом 1 год; “ішемія / реперфузія” –
здійснювали перфузію ізольованого серця розчином Tyrode протягом 30 хв,
після чого припиняли перфузію протягом 10 хв (стадія ішемії), а потім
проводили реперфузію розчином Tyrode протягом 20 хв; “ішемія /
реперфузія + NSE” – здійснювали перфузію ізольованого серця розчином
Tyrode з добавленим до нього розчином NSE в кінцевій концентрації 10-6 М
протягом 30 хв, після чого припиняли перфузію протягом 10 хв (стадія
ішемії), а потім проводили реперфузію розчином Tyrode з NSE в кінцевій
концентрації 10-6 М протягом 20 хв. У групах “ішемія / реперфузія” та
“ішемія / реперфузія + NSE” після 30 хв перфузії повністю перекривали
доступ перфузійного розчину до ізольованого серця. Через 10 хв гострої
модельної нормотермічної ішемії відновлювали живлення, реперфузію
продовжували ще протягом 20 хв. До часу проведення біохімічних
досліджень серце зберігали у скрапленому азоті.

Модель викликаної вазопресином гострої ішемії міокарда (ГІМ). Роботу
виконано на 30 щурах-самцях віком 8-10 міс, масою 280-320 г у
лабораторії академіка НАН та АМН України В.В. Фролькіса. Тварин
розподілили на три групи. До першої увійшли щури без ГІМ, яким під
нембуталовим наркозом вводили 0,5 мл 9,6% етилового спирту в
ізотонічному розчині; до другої ? щури з ГІМ, яким спочатку вводили 0,5
мл 9,6% етилового спирту в ізотонічному розчині, а через 10 хв ? 1 мкг
вазопресину (компанія “Sigma”, США); до третьої ? щури з ГІМ, яким
попередньо вводили NРE (1 мкмоль) в 0,5 мл 9,6 % етилового спирту в
ізотонічному розчині, а через 10 хв ? вазопресин у вищевказаній дозі.
Щурів декапітували через 20 хв після початку експерименту, забирали
серце, яке негайно поміщали у скраплений азот.

Модель ішемії / реперфузії донорської печінки. В дослідження увійшло 28
щурів-самців з масою тіла 250-300 г. Перфузію печінки здійснювали
негайно після її екстирпації від щура згідно методу N. Kamada (1988) з
використанням охоложденого розчину ЄвроКоллінз (EC). На 5 хв
експерименту перфузію припиняли, а печінку поміщали у розчин EC впродовж
2, 6 та 22 год при 4 °С. Печінку, яка протягом 6 год знаходилися у
розчині ЕС, піддавали реперфузії протягом 2 год з використанням
нагрітого до 37 оС оксигенованого розчину Krebs-Henseleit. Хірургічні
операції по екстирпації печінки, а також процедури перфузії, консервації
та реперфузії здійснювалися під наркозом науковим співробітником М.Ю.
Шагідуліним в Інституті хірургії та трансплантології АМН України
(директор член-кореспондент НАН та АМН України, професор, доктор
медичних наук В.Ф. Саєнко).

Піддослідних тварин розподілили на 9 груп. Першу групу склав інтактний
контроль; другу ? органи, піддані перфузії розчином ЕС протягом 5 хв;
третю ? органи, піддані перфузії розчином ЕС у присутності NРE протягом
5 хв; четверту ? органи, поміщені в розчин ЕС протягом 6 год; п’яту ?
органи, поміщені в розчин ЕС у присутності NРE протягом 6 год; шосту ?
органи, поміщені в розчин ЕС протягом 22 год; сьому ? органи, поміщені в
розчин ЕС у присутності NРE протягом 22 год; восьму ? донорські органи,
піддані реперфузії через 6 год після поміщення в розчин ЕС; дев’яту ?
донорські органи, піддані реперерфузії через 6 год після поміщення в
розчин ЕС у присутності NРE.

Модель морфінної залежності. Досліди проведено на 44 білих щурах-самцях
лінії Wistar з масою 200-350 г згідно методологічних підходів I.P.
Stolerman, R. Kumar (1970). Піддослідних тварин розділили на такі групи.
До контрольної групи (група 1) увійшло 6 інтактних щурів. Дослідні щури
протягом тижня мали можливість вибирати між питтям води або 15%-го
розчину етанолу. Після цього тваринам, які віддавали перевагу питтю
15%-го розчину спирту, протягом 7 тижнів давали можливість здійснювати
вибір для пиття між 0,01%-й розчином морфіну та питною водою. Протягом
першого тижня тварини споживали пересічно 0,25 мг морфіну на 1 кг маси
тіла. Наприкінці експерименту тварини збільшували дозу випитого морфіну
приблизно в 10 разів (до 2 ? 2,2 мг морфіну на 1 кг маси тіла), і їх
розділяли наступним чином. Групу 2 склали 15 щурів-морфіністів
(плацебо). Піддослідним тваринам груп 3?7 протягом 7 днів
внутрішньоочеревинно вводили суміш NAE у наступних курсових дозах: 5
щурам (група 3) ? з розрахунку 3,5 мг/кг маси тіла; 4 тваринам (група 4)
? 35 мг/кг маси; 6 особинам (група 5) ? 200 мг/кг; 4 щурам (група 6) –
350 мг/кг; та 4 піддослідним тваринам (група 7) – 700 мг/кг. Тварин
декапітували під ефірним наркозом. Мозок негайно забирали й протягом 60
сек. поміщали в скраплений азот до отримання ліпідного екстракту.

Статистична обробка результатів досліджень Отримані результати оброблено
статистично з використанням t-критерію Ст’юдента. Вірогідними вважали
результати при p<0,05. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ Порушення складу жирних кислот при хронічних патологічних станах у людини та дії несприятливих факторів зовнішнього середовища Розподіл жирних кислот у тінях еритроцитів у пацієнтів з АГ та ІХС Вивчено розподіл жирних кислот мембран еритроцитів у 36 хворих на АГ ІІ ст. та 27 пацієнтів з ІХС з гіперхолестеролемією. Серед хворих на ІХС були пацієнти без АГ (n=9) та з АГ (n=18). Контролем слугували 6 практично здорових осіб з нормохолестеролемією та артеріальним тиском (АТ) <140/90 мм.рт.ст. Усі пацієнти знаходилися в умовах стаціонару в Інституті кардіології ім. М.Д. Стражеска АМН України (директор член-кор. АМН України В.М. Коваленко). В табл. 1 наведено дані по розподілу індивідуальних жирних кислот в мембранах еритроцитів хворих на АГ та ІХС. Як випливає з наведених результатів, за АГ без клінічної картини ІХС спостерігається істотне пониження вмісту насичених жирних кислот (SFA) – міристинової (14:0), пальмітинової (16:0) та стеаринової (18:0) на тлі підвищення відсотку арахідонової (20:4 n-6) та докозатриєнової (22:3) кислот порівняно зі здоровими особами. При цьому рівень поліненасичених жирних кислот (PUFA) n-3 ряду практично не змінюється. У пацієнтів з ІХС без АГ, порівняно зі здоровими особами, окрім 16:0 та 18:0, вірогідно зменшується відсотковий вміст докозанової кислоти (22:0), а також низки PUFA на кшталт ейкозопентаєнової (20:5 n-3), 22:3, докозатетраєнової (22:4) та докозапентаєнової (22:5 n-3). При цьому істотно зростає рівень 20:4 n-6 та докозагексаєнової (22:6 n-3) кислот, відповідно. Причому відсоток 22:6 n-3 в мембранах еритроцитів пацієнтів з ІХС без АГ майже в 6 раз перевищує такий в здорових осіб, а 20:4 n-6 – на 74%. Що стосується розподілу жирних кислот у мембранах еритроцитів пацієнтів з ІХС на тлі АГ, то його профіль нагадує такий хворих з АГ без ІХС: вміст SFA, – 14:0, 16:0 та 18:0, істотно понижується на тлі підвищення відсотку 20:4 n-6 порівняно зі здоровими особами. При цьому рівень PUFA n-3 ряду практично не змінюється порівняно зі здоровими особами. Можна побачити, що АГ, ІХС та поєднання обидвох патологічних станів характеризуються як спільними рисами, так і певними відмінностями. Спільним є те, що за цих патологічних станів має місце зменшення рівня SFA, а також суттєве зростання рівня основних PUFA. Відмінним є те, що у пацієнтів з підвищеним АТ з клінічними проявами ІХС або без таких спостерігається зростання лише PUFA n-6 ряду порівняно зі здоровими особами. У пацієнтів з ІХС з величиною АТ <140/90 мм.рт.ст. спостерігається істотне зростання рівнів як 20:4 n-6 (основна PUFA n-6 ряду), так і 22:6 n-3 (основна PUFA n-3 ряду). Для того, щоб глибше зрозуміти природу змін у розподілі жирних кислот при АГ та ІХС, варто звернути увагу на особливості біосинтезу жирних кислот. Відомо, що еритроцити не посідають власного генетичного апарату, який би регулював біосинтез жирних кислот – останні переносяться до цих клітин за допомогою ліпопротеїнів дуже низької щільності (VLDL) головним чином з печінки, де відбувається їх синтез. В організмі людини de novo можуть синтезуватися лише SFA та моноєнові жирні кислоти (MUFA). Зменшення вмісту SFA при АГ та ІХС може відбуватися внаслідок зниження інтенсивності їх синтезу de novo. Що стосується основних PUFA n-3 та n-6 рядів, то вони в організмі людини не синтезуються з SFA та MUFA. Так, 20:4 n-6 утворюється шляхом елонгації та ?6 / ?5 десатурації лінолевої кислоти (18:2 n-6), а 22:6 n-3 – за рахунок елонгації та ?6 / ?5 десатурації за такою схемою: ліноленова кислота (18:3 n-3) ? 20:5 n-3 ? 22:5 n-3 ? 24:6 n-3 ? 22:6 n-3 (за рахунок ?-окислення 24:6 n-3 у пероксисомах). При цьому 18:2 n-6, 18:3 n-3 та 20:5 n-3 не синтезуються в тканинах людського організму, а надходять з продуктами харчування (M.T. Nakamura, T.Y. Nara, 2004). Тому дисбаланс жирних кислот може бути пов’язаний з порушенням ремоделювання жирних кислот під впливом елонгаз і десатураз, асоційованого з гіперхолестеролемією при АГ та ІХС. Таблиця 1. Розподіл жирних кислот у тінях еритроцитів у пацієнтів з артеріальною гіпертензією (АГ) та ішемічною хворобою серця (ІХС) (моль% до загального вмісту жирних кислот, M?m). Жирні кислоти Здорові особи (n=6) Пацієнти з АГ (n=29) ІХС без АГ (n=9) ІХС на тлі АГ (n=18) Міристинова (14:0) 0,85?0,08 0,47?0,04* 2,04?0,76 0,44?0,06*# Пентадеканова (15:0) 0,17?0,01 0,18?0,01(n=28) 0,91?0,25* 0,17?0,01# iзо-пальмітинова (i16:0) 0,23?0,03(n=4) 0,26?0,09(n=23) 0,17(n=1) 0,14?0,01* Пальмітинова (16:0) 24,99?0,66 21,58?0,56* 17,54?0,82* 21,12?0,69*# Пальмітолеїнова (16:1 n-9) 0,67?0,09 0,66?0,08 0,54?0,07 0,74?0,11 Гептадеканова (17:0) 0,51?0,05 0,48?0,01 0,49?0,03 0,48?0,01 Гептадекамоноєнова (17:1 n-10) 0,56(n=1) 0,12?0,03(n=18) 0,17(n=1) 0,08?0,01 iзо-стеаринова (i18:0) 0,49?0,12 0,55?0,18(n=28) 0,46?0,07 0,30?0,03 Стеаринова (18:0) 23,15?0,61 20,67?0,48* 17,23?0,94* 20,31?0,61*# Олеїнова (18:1 n-9) 15,14?0,48 15,51?0,40 13,79?0,80 15,63?0,32# Лінолева (18:2 n-6) 8,39?0,56 9,73?0,38 8,52?0,26 9,82?0,45# Ейкозанова (арахінова) (20:0) 0,82?0,05 0,79?0,04 0,98?0,06 0,83?0,05 Ейкозамоноєнова (20:1 n-11) 0,64?0,07 0,59?0,02 0,59?0,15 0,61?0,04 Генейкозанова (гондова) (21:0) 0,43?0,01 0,45?0,01 0,50?0,04 0,43?0,02 Ейкозатриєнова (20:3) 0,93?0,08 1,03?0,06 1,71?0,88 1,12?0,07 Арахінодова (20:4 n-6) 7,09?0,59 10,17?0,60* 12,36?1,88* 10,68?0,64* Докозанова (бегенова) (22:0) 2,39?0,09 2,58?0,11 1,16?0,15* 2,59?0,15# Ейкозопентаєнова (20:5 n-3) 0,38?0,06(n=3) 0,44?0,05(n=22) Сліди 0,47?0,05 Докозамоноєнова (ерукова) (22:1 n-11) 0,17(n=1) 0,20?0,05(n=8) 0,28(n=1) 0,20?0,05 Докозадиєнова (22:2) 0,46?0,02 0,56?0,05(n=27) 0,32(n=1) 0,58?0,08 Докозатриєнова (22:3) 0,71?0,06 1,23?0,13* 0,39?0,04* 1,38?0,19*# Докозатетраєнова (22:4) 5,12?0,50 5,11?0,31(n=26) Сліди 5,06?0,41 Докозапентаєнова (22:5 n-3) 5,70?0,37 5,70?0,27 3,46?0,22* 5,61?0,39 Докозагексаєнова (22:6 n-3) 0,81?0,03 0,99?0,12 4,64?0,38* 0,98?0,16# Примітки: Позначкою * помічено вірогідні зміни щодо групи “Здорові особи” (p<0,05); Позначкою # помічено вірогідні зміни щодо групи “Пацієнти з ІХС без АГ” Відомо, що атеросклеротичний процес розвивається безсимптомно протягом десятиліть і клінічно проявляється зазвичай у другій половині життя людини. Супутня АГ ускладнює перебіг атеросклеротичного процесу, що виражається істотним зростанням ризику гострого коронарного синдрому, частоти фатальних коронарних подій, серцево-судинної та загальної смертності. Факт відсутності компенсаторного підвищення рівня 22:6 n-3 у клітинних мембранах за АГ можна розглядати як важливий чинник несприятливого впливу підвищеного АТ на перебіг атеросклеротичного процесу, а також як раціональне обгрунтування необхідності призначення пацієнтам за АГ та ІХС лікарських засобів, що модулюють склад PUFA n-6 та n-3 ряду. Жирні кислоти пухлинної тканини при злоякісних новоутвореннях щитоподібної залози Аварія на Чорнобильській АЕС викликала істотне зростання ризику розвитку злоякісних новоутворень щитоподібної залози в осіб, що зазнали дії йонізуючого опромінення, зокрема дітей (Н.Д. Тронько, Т.И. Богданова, 1999). Нами вивчено склад жирних кислот пухлинної тканини порівняно з позапухлинною тканиною щитоподібної залози у 10 дітей, що зазнали дії йонізуючого опромінення внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС. Як представлено в табл. 2, в пухлинній тканині щитоподібної залози істотно понижується рівень SFA, – лауринової кислоти (12:0) та 16:0, порівняно з позапухлинною тканиною. При Таблиця 2. Розподіл жирних кислот пухлинної тканини щитоподібної залози людини (моль% від загальної кількості жирних кислот, M?m, n=10). Жирні кислоти Позапухлинна тканина (n=10) Пухлинна тканина (n=10) Лауринова (12:0) 0,11?0,02 0,06?0,01 * Тридеканова (13:0) 0,06?0,02 0,04?0,01 Міристинова (14:0) 1,02?0,14 0,82?0,17 Міристолеїнова (14:1) 0,09?0,02 0,09?0,01 ізо-пентадеканова (i15:0) 0,05 0,05 Пентадеканова (15:0) 0,26?0,01 0,24?0,03 iзо-пальмітинова (i16:0) 0,37?0,18 0,17?0,06 Пальмітинова (16:0) 21,77?1,07 18,17?1,10 * Пальмітолеїнова (16:1 n-9) 1,80?0,39 2,87?1,15 Гептадеканова (17:0) 0,53?0,06 0,50?0,03 Гептадекамоноєнова (17:1 n-10) 0,55?0,21 0,27?0,02 iзо-стеаринова (i18:0) 0,72?0,41 0,23?0,06 Стеаринова (18:0) 16,73?1,37 14,48?0,98 Олеїнова (18:1 n-9) 32,41?2,13 29,49?1,36 Лінолева (18:2 n-6) 12,60?1,10 16,08?0,87 * Нонадецилова (19:0) 0,16?0,04 0,23?0,08 Ейкозанова (арахінова) (20:0) 0,16?0,03 0,13?0,01 Ейкозамоноєнова (20:1 n-11) 0,77?0,12 0,75?0,08 Генейкозанова (21:0) 0,83?0.06 1,12?0,11 * Ейкозадиєнова (20:2) 0,62?0,07 1,01?0,10 * Ейкозатриєнова (20:3) 1,29?0,18 1,99?0,37 Арахідонова (20:4 n-6) 5,43?0,89 9,17?1,20 * Докозанова (бегенова) (22:0) 0,91?0,13 1,09?0,13 Докозамоноєнова (22:1 n-11) 0,15?0,04 0,24?0,07 Докозадиєнова (22:2) 1,36?0,69 0,50?0,06 Докозатриєнова (22:3) 0,23 0,31?0,09 Докозапентаєнова (22:5 n-3) 0,58?0,11 0,64?0,07 Докозагексаєнова (22:6 n-3) 1,16?0,72 0,29 (n=1) Неідентифіковані 0,08?0,02 0,17?0,06 Примітка: позначкою * помічено вірогідні зміни щодо групи “Позапухлинна тканина” (p<0,05); Таблиця 3. Індивідуальні фосфоліпіди (нг Рі/мг білка) та загальний холестерол (мкг/мг білка) пухлинної тканини щитоподібної залози людини (M?m; n=5-8) Ліпіди Позапухлинна тканина Пухлинна тканина Фосфатидилхолін 1908?750 3164?664 Фосфатидилетаноламін 821?263 1812?326* Фосфатидилсерин 330?122 489?80 Фосфатидилінозитол 200?74 415?54* Кардіоліпін 204?66 439?155 Лізо-фосфатидилхолін 53,7?35,0 100,7?37,2 Сфінгомієлін 531?167 930?130 Неідентифікований Рі 74,7?31,7 2,69?0,74 Загальний холестерол 97,0?9,0 170,0?30,0* Примітка: позначкою * помічено вірогідні зміни щодо групи “Позапухлинна тканина” (p<0,05) цьому суттєво зростають кількості РUFA: на 28% зростає кількість 18:2 n-6, на 63% – докозадиєнової кислоти (20:2 n-6), на 69% – 20:4 n-6. Вміст 18:0 та олеїнової кислоти (18:1 n-9) вірогідно не змінюється. В результаті у пухлинній тканині істотного зменшується кількість сумарних SFA та зростає ? сумарних РUFA порівняно з позапухлинною тканиною. Як представлено у табл. 3, в пухлинній тканині щитоподібної залози зафіксовано дворазове підвищення рівнів фосфатидилінозитолу, фосфатидилетаноламіну та загального холестеролу порівняно з позапухлинною тканиною. Таким чином, у пухлинній тканині щитоподібної залози виявлено підвищення рівня 20:4 n-6, 18:2 n-6, фосфатидилінозитолу та фосфатидилетаноламіну, що асоціюється зі зростанням рівня загального холестеролу. Моногідроксильовані жирні кислоти мононуклеарів периферичної крові ліквідаторів у віддаленому періоді після аварії на ЧАЕС Як відзначено в резолюції 3-ї Міжнародної конференції “Медичні наслідки Чорнобильської катастрофи: підсумки 15-річних досліджень” (4 – 8 червня 2001 р., Київ, Україна), після аварії на ЧАЕС захворюваність на патологію щитоподібної залози, а також серцево-судинні, цереброваскулярні, захворювання тощо істотно збільшилася, що, в принципі, може бути пов’язано з порушенням ліпідного складу біологічних тканин. Відомо, що PUFA є попередниками в синтезі моногідроксильованих похідних жирних кислот. Логічно припустити, що хронічна дія несприятливих факторів зовнішнього середовища на організм людини може спричинитися до накопичення PUFA та їх моногідроксильованих похідних в імунокомпетентних клітинах, спричиняючи виникнення імунного дисбалансу, ключова роль якого у патогенезі серцево-судинних та онкологічних захворювань не викликає сумніву. Імунний дисбаланс є важливим фактором виникнення пухлинних та непухлинних захворювань, а також раннього старіння (A.A. Chumak, et al., 1997). На жаль, практично нічого не відомо про розподіл моногідроксильованих жирних кислот, ? важливих продуктів оксидативного LOX-залежного метаболізму PUFA, в імунокомпетентних клітинах ліквідаторів. У зв’язку з цим нами було вивчено вміст моногідроксильованих жирних кислот в мононуклеарах периферичної крові ліквідаторів через 12 років після аварії на ЧАЕС. В дослідженні взяли участь 39 пацієнтів. Учасники дослідження були розділені на три групи – до першої увійшли ліквідатори, що отримали поглинуту дозу йонізуючого опромінення понад 0,32 Гр; до другої – ліквідатори, що отримали поглинуту дозу йонізуючого опромінення менш ніж 0,32 Гр; до третьої – неопромінені особи. Всі учасники дослідження були обстежені в Інституті клінічної радіології Наукового центру радіаційної медицини (НЦРМ) АМН України. Як показано в табл. 4, основними вільними та естерифікованими у PL моногідроксильованими жирними кислотами мононуклеарів, як опромінених, так і неопромінених осіб, є 13(S)-гідроксиоктадекадиєнова кислота (13-HODE) та 12(S)-гідрокси-5,8,10,14-ейкозатетраєнова кислота (12-НЕТЕ). Вищезгадані сполуки складають частку в 64,3 та 19,2%, відповідно, від загальної кількості вільних моногідроксильованих жирних кислот, а також 66,2 та 7,8%, відповідно, ? естерифікованих у PL моногідроксильованих жирних кислот мононуклеарів неопромінених осіб. Інші моногідроксильовані метаболіти PUFA із довжиною ланцюга 20 та 22 вуглецевих атомів складають мінорну частину загального пулу вільних моногідроксильованих жирних кислот. В мононуклеарах ліквідаторів з поглинутою дозою <0,32 Гр порівняно з особами, що не зазнали опромінення, спостерігається істотне підвищення рівнів вільної 12-гідрокси-5,8,10-гептадекатриєнової кислоти (ННТ) в 4,8 рази, 8(S)-гідрокси-5,9,11,14- ейкозатетраєнової кислоти (8-НЕТЕ) – в 2,3 рази, 12-НЕТЕ – в 4,8 рази, загальних вільних гідроксиейкозатетраєнових кислот (НЕТЕ) – в 4,8 рази; 14- гідрокси-похідного PUFA з довжиною ланцюга 22 атоми вуглецю (14-ОН-22) – в 4,4 рази та загальних гідрокси-похідних PUFA з довжиною ланцюга 22 атоми вуглецю (ОН-22) – в 3,8 рази. В ліквідаторів з поглинутою дозою йонізуючого опромінення >0,32 Гр вігорідно підвищується лише рівень
5(S)-гідрокси-6,8,11,14-ейкозатетраєнової кислоти (5-НЕТЕ) та 8-НЕТЕ в
мононуклеарах периферичної крові порівняно з неопроміненим контролем.

Таблиця 4.

Вільні та естерифіковані у фосфоліпіди моногідроксильовані жирні кислоти
в мононуклеарах периферичної крові ліквідаторів у віддаленому періоді
після йонізуючого опомінення внаслідок аварії на ЧАЕС (пмоль/106 клітин,
M?m)

Моногідроксильовані жирні кислоти Опромінені пацієнти з поглинутою
дозою йонізуючого опромінення

>0,32 Гр (n=13)

<0,32 Гр (n=10) Неопромі-нені пацієнти (n=16) Вільні моногідроксильовані жирні кислоти HHT (12-гідрокси-5,8,10-гептадекатриєнова) 0,92?0,37 1,96?0,85* 0,41?0,10 13-HODE (13(S)-гідроксиоктадекадиєнова) 7,81?3,73 4,48?1,63 4,00?1,48 5-HETE (5(S)-гідрокси-6,8,11,14-ейкозатетраєнова) 0,44?0,16* 0,28?0,09 0,14?0,02 8-HETE (8(S)-гідрокси-5,9,11,14- ейкозатетраєнова) 0,26?0,10* 0,15?0,05* 0,07?0,01 12-HETE (12(S)-гідрокси-5,9,11,14-ейкозатетраєнова) 2,55?1,59 5,65?2,61* 1,20?0,29 15-HETE (15(S)-гідрокси-5,9,11,14- ейкозатетраєнова) 0,25?0,10 0,36?0,10 0,19?0,05 Загальні HETE (гідрокси-5,9,11,14- ейкозатетраєнові) 3,49?1,69 6,64?2,80* 1,59?0,34 11-OH-22 (11-гідрокси-похідне жирних кислот з довжиною ланцюга 22 атоми вуглецю) 0,05?0,02 0,07?0,02 0,03?0,01 14-OH-22 (14-гідрокси-похідне жирних кислот з довжиною ланцюга 22 атоми вуглецю) 0,08?0,03 0,05?0,02 0,03?0,01 17-OH-22 (17-гідрокси-похідне жирних кислот з довжиною ланцюга 22 атоми вуглецю) 0,08?0,03 0,05?0,02 0,03?0,01 Загальні OH-22 (гідрокси-похідні жирних кислот з довжиною ланцюга 22 атоми вуглецю) 0,58?0,22 0,86?0,34* 0,23?0,05 Моногідроксильовані жирні кислоти, естерифіковані у фосфоліпіди HHT (12-гідрокси-5,8,10-гептадекатриєнова) 0,47?0,17 0,78?0,28 0,28?0,08 13-HODE (13(S)-гідроксиоктадекадиєнова) 22,88?8,64 35,10?13,12* 9,69?2,14 5-HETE (5(S)-гідрокси-6,8,11,14-ейкозатетраєнова) 0,22?0,09 0,30?0,12 0,25?0,04 8-HETE (8(S)-гідрокси-5,9,11,14- ейкозатетраєнова) 0,80?0,20 2,35?1,35* 0,51?0,11 12-HETE (12(S)-гідрокси-5,9,11,14-ейкозатетраєнова) 4,76?2,57 4,97?2,13* 1,15?0,36 15-HETE (15(S)-гідрокси-5,9,11,14- ейкозатетраєнова) 2,12?0,66*# 0,33?0,08* 0,91?0,19 Загальні HETE (гідрокси-5,9,11,14- ейкозатетраєнові) 7,89?3,31 7,96?3,44 3,18?0,60 11-OH-22 (11-гідрокси-похідне жирних кислот з довжиною ланцюга 22 атоми вуглецю) 0,44?0,10 0,52?0,17 0,31?0,07 14-OH-22 (14-гідрокси-похідне жирних кислот з довжиною ланцюга 22 атоми вуглецю) 3,38?1,49 3,64?2,39 0,94?0,37 17-OH-22 (17-гідрокси-похідне жирних кислот з довжиною ланцюга 22 атоми вуглецю) 0,78?0,24* 0,53?0,28 0,25?0,05 Загальні OH-22 (гідрокси-похідні жирних кислот з довжиною ланцюга 22 атоми вуглецю) 4,61?1,70 4,69?2,77 1,50?0,45 Примітки: Позначкою * помічено вірогідні зміни щодо групи “ Неопромінені пацієнти” (p<0,05); Позначкою # - достовірні зміни щодо підгрупи опромінених пацієнтів з поглинутою дозою йонізуючого опромінення <0,32 Гр Встановлено, що у ліквідаторів з поглинутою дозою <0,32 Гр рівні 13-HODE, 8-НЕТЕ та 12-НЕТЕ, естерифіковані у PL мононуклеарів периферичної крові, різко підвищуються (у 3,6, 4,7 та 4,3 рази, відповідно), тимчасом як кількість 15(S)-гідрокси-5,8,11,13- ейкозатетраєнової кислоти (15-НЕТЕ) зменшується в 2,7 рази порівняно з особами, що не зазнали йонізуючого опромінення. У ліквідаторів з поглинутою дозою опромінення >0,32 Гр спостерігається істотне підвищення
вмісту 15-НЕТЕ (у 2,3 рази) та 17-гідрокси-похідного PUFA з довжиною
ланцюга 22 атоми вуглецю (17-ОН-22) (у 3,2 рази) порівняно з контрольною
групою.

Розподіл моногідроксильованих жирних кислот між фракціями вільних та
естерифікованих у PL сполук є асиметричним. Так, середні кількості
13-HODE, загальних НЕТЕ та загальних ОН-22, естерифікованих у PL
мононуклеарів неопромінених осіб, у 2,4, 2,0, та 6,6 разів, відповідно,
перевищують аналогічні показники, що стосуються фракції вільних сполук.

Виявлено позитивну кореляцію між поглинутою дозою йонізуючого
опромінення та вмістом вільних 5-НЕТЕ (r = +0,591, p = 0,0001) і 8-НЕТЕ
(r = +0,510, р = 0,0009); естерифікованих у PL 15-НЕТЕ (r = +0,551, р =
0,0003) та 17-ОН-22 (r = +0.562, р =0,0002); а також сумарних 5-НЕТЕ (r
= +0.496, р = 0,0013), 15-НЕТЕ (r = +0.586, р = 0,0001) та 17-ОН-22 (r =
+0,586, р = 0,0001).

В представленій роботі вперше показано дозо-залежне накопичення декотрих
моногідроксильованих похідних PUFA у мононуклеарах периферичної крові
через 12 років після йонізуючого опромінення ліквідаторів аварії на
ЧАЕС. Встановлено, що їх накопичення є функцією поглинутої дози
йонізуючого опромінення. Вміст більшості моногідроксильованих жирних
кислот змінюється бімодально. Так, вміст ННТ та 12-НЕТЕ істотно зростає
в мононуклеарах осіб з поглинутою дозою в діапазоні 0,05 – 0,32 Гр
порівняно з неопроміненим контролем, але не відрізняється від останнього
в пацієнтів з поглинутою дозою, що перевищує 0,32 Гр. Рівні вільних
5-НЕТЕ та 8-НЕТЕ, а також естерифікованих у PL та сумарних 15-НЕТЕ та
17-ОН-22 зростають у дозо-залежний спосіб.

Вищенаведені зміни вочевидь є наслідком хронічного стресу, ініційованого
дією йонізуючого опромінення у віддаленому минулому, та згодом
поглибленого дією інших патогенних чинників. Небажаними проявами
акумуляції моногідроксильованих жирних кислот в лімфоцитах є імунний
дисбаланс, що може спричинити підвищення захворюваності та
розповсюдженості найбільш поширених патологічних станів у віддаленому
після дії йонізуючого опромінення періоді – АГ, ІХС, злоякісних
новоутворень, імунодефіцитних станів тощо.

Наведені у даному розділі результати власних досліджень закладають
раціональний фундамент для пошуку біологічно активних сполук ліпідної
природи, які здатні модифікувати перебіг мембранопов’язаних процесів та
полегшували компенсацію порушень ліпідного складу клітини з метою її
захисту від ушкодження. Літературні дані та результати власних
досліджень дають вагомі підстави вважати, що довголанцюжкові NAE, які
відносяться до нещодавно відкритого класу біологічно активних сполук, ?
ендоканнабіноїдів, посідають потужні цитопротекторні властивості,
модифікують перебіг мембранопов’язаних процесів та полегшують
відновлення жирних кислот тканин-мішеней за умов патологічних станів.

Порушення складу жирних кислот при гострих патологічних станах, що
супроводжуються ішемією / реперфузією, та обгрунтування застосування NAE
для корекції складу жирних кислот і мембранопов’язаних процесів у нормі
й при гострих патологічних станах

Групою Шміда продемонстровано накопичення NAРE та NAE за умов
експериментальної оклюзії коронарної артерії в собаки через 6-27 год.
після коронарної оклюзії. У центральній та периферичній інфарктній зонах
NAPE міститься у значних кількостях, сягаючи 4 – 6% від загальної
кількості фосфоліпідів. Рівень же вільних NAE сягає приблизно 0,5
мкмоль/г тканини (D.E. Epps, et al., 1979; D.E. Epps, et al., 1980).
Основними N-ацильними залишками NAPE є пальмітат, стеарат та олеат,
частка яких сягає до 80% у загальній структурі NAРE. Оскільки NAE
утворюється в кількостях, необхідних для виявлення кардіопротекторної
дії по відношенню до кардіоміоцитів, що прилягають до зони некрозу
серцевого м’язу, лише через декілька годин після гострої коронарної
події, існує необхідність забезпечити раннє надходження даної сполуки в
зону ушкодження міокарда, що, вочевидь, дозволило б мінімізувати ступінь
незворотнього ушкодження серцевого м’язу. У зв’язку з вищенаведеним,
нами було досліджено склад жирних кислот тканини міокарда, вилученого зі
системного кровообігу в ході проведення хірургічної операції на
відкритому серці у людини, а також вплив NSЕ та NРЕ на ліпіди тканини
міокарда за умов його гострої ішемії та реперфузії у щурів.

Особливості жирнокислотного складу міокарда людини при ішемії /
реперфузії

Вивчено склад жирних кислот тканини серця, вилученого зі системного
кровообігу в ході проведення хірургічної операції на відкритому серці у
12 дітей, яку виконували в Інституті серцево-судинної хірургії ім. М.
Амосова АМН України.

Отриманий біологічний матеріал розділяли на три групи: першу групу
склали зразки тканини міокарда, отримані безпосередньо перед припиненням
коронарного кровообігу; другу – зразки тканини міокарда, отримані
наприкінці періоду зупиненого коронарного кровообігу в умовах холодової
та хімічної кардіоплегії (фаза гострої ішемії); третю – зразки тканини
міокарда в період реперфузії на 3-ій хв після відновлення коронарного
кровообігу (фаза реперфузії). Загальний період ішемії міокарда у різних
пацієнтів складав 17-145 хв.

У фракції вільних жирних кислот (FFA) тканини міокарда (табл. 5) в
результаті зупинки коронарної перфузії відбувається суттєве підвищення
рівня 18:2 n-6 порівняно з групою коронарної перфузії. За умов
реперфузії вміст вільних 18:2 n-6, 18:3 n-3 та 20:4 n-6 істотно
перевищує показники контрольної групи. В складі ефірів холестеролу
(Е-Сhol) тканини міокарда у фазі гострої ішемії міокарда відбувається
істотне зменшення кількості 18:2 n-6 та 22:5 n-3. У фазі гострої ішемії
міокарда також відбувається істотне підвищення рівня 18:1 n-9 і 18:2 n-6
у фракції PL тканини міокарда порівняно з групою коронарної перфузії. За
умов реперфузії істотно зростає рівень лізо-фосфатидилетаноламіну,
зменшується вміст 22:5 n-3 у складі PL, при цьому кількість даної жирної
кислоти у складі E-Chol підвищується, що може віддзеркалювати порушення
процесів ремоделювання жирних кислот та складних ліпідів у результаті
зупинки коронарної перфузії та його часткове відновлення під час
реперфузії. Вірогідних змін кількості загального холестеролу в тканині
міокарда за умов ішемії та реперфузії не виявлено.

Вплив NSЕ на склад жирних кислот при ішемії / реперфузії ізольованого
серця щурів

Як представлено в табл. 5, на відміну від ішемії / реперфузії міокарда
людини під час хірургічної операції на відкритому серці, вилученому із
системного кровообігу, після реперфузії ізольованого ex vivo серця щура
вираженого підвищення рівня FFA не спостерігається. Це може бути
пов’язано з фактом накопичення E-Chol в тканині міокарда за умов ішемії
/ реперфузії ізольованого серця щура, що забезпечує секвестрування
надлишку FFA. Тимчасом NSE в кінцевій концентрації 10-6 М призводить до
істотного зменшення, порівняно з контролем, кількості вільних 18:2 n-6,
22:5 n-3 і 22:6 n-3.

В результаті ішемії / реперфузії ізольованого серця щурів у фракції
E-Chol спостерігається істотне підвищення рівня 16:1 та 22:5 n-3
порівняно з контролем. Додавання NSE в кінцевій концентрації 10-6 М
спричиняє істотне зменшення, порівняно з контролем, більшості жирних
кислот, естерифікованих у E-Chol – 14:0, 16:0, 16:1 n-9, 18:0, 18:1 n-9,
18:2 n-6, 20:4 n-6, 22:6 n-3. Крім того, NSE в концентрації 10-5 М
викликає виражене зменшення рівня E-Chol, що накопичуються при ішемії /
реперфузії, до величини контрольних показників.

За ішемії / реперфузії істотних змін в їх розподілі у складі фракції PL
тканини міокарда ізольованого серця щурів не відбувається, за винятком
підвищення рівня 14:0. Внесення NSE у розчин для перфузії та реперфузії
призводить до істотного зростання кількості 18:0 у складі фракції
загальних PL та вірогідного зменшення рівня РUFA n-6 та n-3 ряду – 18:2
n-6, 20:4 n-6 та 22:6 n-3. Зростання рівня 18:0 у складі фракції PL
можна пояснити тим фактом, що до складу NSE входить залишок стеаринової
кислоти. Потрапляючи в карідоміоцити, NSE може служити донором 18:0 у
реакціях ресинтезу PL.

Слід зауважити, що за ішемії / реперфузії істотних зрушень в абсолютному
вмісті індивідуальних PL та загального холестеролу в тканині
ізольованого серця щурів не спостерігається. NSE викликає зменшення
рівня лізо-фосфатидилхоліну та фосфатидилгліцеролу порівняно з
контролем. Зменшення кількості PL з аритмогенними властивостями, –
лізо-фосфатидилхоліну, можна розлядати як важливий фактор
кардіопротекторної дії NSE. Істотне зменшення відсоткового вмісту
кардіоліпіну за ішемії / реперфузії вочевидь є проявом мітохондріальної
дисфункції. Введення NSE в розчин для перфузії та реперфузії в кінцевій
концентрації 10-6 М попереждує зменшення відсоткового вмісту
кардіоліпіну, що може мати важливе значення для забезпечення належної
функції мітохондрій кардіоміоцитів.

Таблиця 5.

Загальні закономірності змін складу жирних кислот, фосфоліпідів та
холестеролу в тканині міокарда за умов його гострої ішемії та реперфузії

Показники Ішемія / реперфузія міокарда у людини (n=12)

Гостра ішемія міокарда, викликана вазопресином у щурів (n=14) Ішемія /
реперфузія ізольованого серця щура

(n=12)

Ішемія

Реперфузія

?NРE

+NРE

?NSE

+NSE

Жирні кислоти нмоль / мг білка % вміст нмоль / мг білка

Міристинова

PL E-Chol

Пальмітинова

E-Chol

Пальмітолеїнова

E-Chol E-Chol

Стеаринова

E-Chol ?; PL

Олеїнова PL

E-Chol

Лінолева FFA ;

E-Chol?; PL FFA

FFA ; E-Chol

PL

Ліноленова

FFA

Арахідонова

FFA

E-Chol ; PL

Докозапентаєнова E-Chol E-Chol ; PL

E-Chol FFA

Докозагексаєнова

FFA ; E-Chol;

PL

Холестерол нмоль / мг білка мг/г тканини нмоль / мг білка

Загальний

Ефіри холестеролу

НВ НВ

? (10-5 М)

Фосфоліпіди нмоль Рі / г тканини % вміст нмоль Рі / мг білка

Фосфатидилхолін

Лізо-фосфатидилхолін

Кардіоліпін

? (%)

Примітки: ? і ? ? відповідно вірогідне підвищення та пониження рівня
показника щодо контролю (цифрові дані наведено у частині “Додаток”
рукопису дисертації у таблицях 1-5, 16-22, 28-30)

Оскільки локалізація, синтез і функціональна роль різних PL істотно
відрізняється, нами було вивчено вплив NSE на особливості ацильного
складу PL тканини міокарда за умов ішемії / реперфузії ізольованого
серця щурів (див. табл. 6). Так, за ішемії / реперфузії рівень 14:0,
16:0 та 18:0 у складі кардіоліпіну суттєво зменшується, при цьому
кількість РUFA не змінюється. Внесення NSE у розчин для перфузії та
реперфузії у кінцевій концентрації 10–6 М запобігає вірогідному
зменшенню рівня 16:0 та викликає істотне підвищення вмісту 22:5 n-3.

За умов ішемії / реперфузії вміст фосфатидилінозитолу в тканині міокарда
вірогідно не змінюється. Введення до складу розчину для перфузії та
реперфузії NSE викликає істотне збільшення кількості РUFA – 18:2 n-6,
18:3 n-3 та 20:4 n-6 порівняно з контролем. Враховуючи факт зростання
РUFA і вмісту фосфатидилінозитолу в тканині міокарда за ішемії /
реперфузії під впливом NSE, можна припустити, що NSE здатний впливати на
обмін фосфатидилінозитолу.

За умов ішемії / реперфузії ізольованого серця щурів вміст основних
жирних кислот, естерифікованих у фосфатидилсерин, не змінюється. NSE
також не викликає істотних змін у вмісті 18:0 у складі фосфатидилсерину
порівняно з групою “ішемія /реперфузія”.

Показано, що за умов ішемії / реперфузії ізольованого серця щурів вміст
основних жирних кислот, зв’язаних з фосфатидилетаноламіном, практично не
змінюється. NSE у кінцевій концентрації 10–6 М викликає істотне
зменшення вмісту 14:0, 18:1 n-9, 18:2 n-6, 18:3 n-3 і 20:4 n-6 порівняно
з контролем.

Таблиця 6.

Загальні закономірності змін жирнокислотного складу фосфоліпідів та їх
корекція за допомогою NSE (10-6 М) за умов гострої ішемії / реперфузії
ізольованого серця щурів (n=3)

Жирні кислоти (нмоль/г тканини) Кардіоліпін

Фосфатидил-інозитол

Фосфати-дилсерин

Фосфатиди-летаноламін

Фосфати-дилхолін

?NSE

+NSE

?NSE

+NSE

?NSE

+NSE

?NSE

+NSE

?NSE

+NSE

Примітки: ? і ? ? вірогідне підвищення і пониження рівня, відповідно,
щодо контролю (без NSE) (цифрові дані наведено у частині “Додаток”
рукопису дисертації у вигляді таблиць 23-27)

Вміст естерифікованих у фосфатидилхолін жирних кислот в тканині міокарда
за умов ішемії / реперфузії ізольованого серця щурів вірогідно не
змінюється. NSE викликає істотне збільшення кількості 20:4 n-6 порівняно
з контролем. Враховуючи факт вірогідного зменшення відсоткового вмісту
лізо-фосфатидилхоліну в тканині міокарда ізольованого серця щурів за
ішемії / реперфузії під впливом NSE можна припустити, що NSE здатний
гальмувати деградацію фосфатидилхоліну.

Модифікація ацильного складу гліцерофосфоліпідів, ? кардіоліпіну,
фосфатидилінозитолу, фосфатидилетаноламіну і фосфатидилхоліну, так само,
як і E-Chol може бути важливою ланкою загального механізму
кардіопротекторної дії NSE за умови ішемії / реперфузії міокарда.

Вплив NPЕ на склад жирних кислот при гострій ішемії міокарда, викликаній
вазопресином

Як відомо, при АГ, ІХС, серцевому нападі значно зростає концентрація
вазопресину в крові, внаслідок чого можуть виникати аритмії по типу
брадикардії, атріо-вентрикулярної блокади, екстрасистолії тощо (В.В.
Фролькис, и др., 1983). Це дозволяє вважати вазопресинову модель
патогенетично обгрунтованою для вивчення фармакологічного впливу нових
молекул, розроблених для лікування гострого коронарного синдрому. Нами
вивчено кардіопротекторну дію NРE за умов викликаної вазопресином
гострої ішемії міокарда (ГІМ).

В табл. 5 представлено дані щодо вмісту жирних кислот в ліпідному
екстракті тканини серця щурів за ГІМ, викликаної введенням 1 мкг
вазопресину. На 10-й хвилині експерименту в щурів з ГІМ спостерігається
істотне зменшення кількості 16:1 n-9, яке практично повністю усувається
завдяки попередньому інтраюгулярному введенню піддослідним тваринам NРE
у кількості 1 мкмоль.

°

?

H r »

&

J

?

E

th

H x Ue

»

@

???»

$

&

?

?

@

OJPJQJ

OJPJQJ

h Re

@

@

THTHTHTH8Ykd

@

@

@

@

@

THTHTHTH8Ykdu

@

@

@

@

@

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

J

O

J

O

J

O

J

O

J

O

J

O

J

O

J

O

J

O

J

@

@

@

@

@

$

@

@

@

@

@

@

@

@

@

@

@

@

@

@

$

@

@

@

@

@

h ReCJ

@

$

@

@

@

@

@

@

@

yyyy&во проходить, хоча ще й на десятій хвилині реєструється
брадикардія. Найбільш характерними проявами викликаної вазопресином
коронарної недостатності є двофазні зміни амплітуди зубця Т, зміни
положення сегменту S-T відносно ізолінії. Перша фаза цього процесу (до 2
хв) характеризується різким збільшенням амплітуди зубця Т (через 1,5 хв
амплітуда зубця Т збільшена на 0,1 мB), підняттям сегменту S?T. Під час
другої фази відбувається зниження або інверсія зубця Т (на 5 хв
амплітуда зубця Т зменшилася на 0,05 мB), депресія сегменту S?T, що
відбиває прояви субендокардіальної ішемії серцевого м’яза.

Попередня ін’єкція щурам NРE запобігає накопиченню лізо-фосфатидилхоліну
в тканині міокарда щурів, викликаного введення вазопресину. При цьому
суттєво зменшується рівень фосфатидилсерину. Введення NРE в дозі 1
мкмоль щурам з ГІМ запобігає розвитку брадикардії та екстрасистолії,
змінам частоти серцевих скорочень та модифікації зубця Т (рис. 1, ІІ).

Рис. 1.

Вплив NРE на перебіг гострої ішемії міокарда, що викликана вазопресином
у щурів

І ІІ

Примітки:

І. Зміни ЕКГ щура при введенні вазопресину: 1 – вихідна; 2, 3, 4, 5 –
час після введення вазопресину, відповідно 30 сек, 1 хв, 2 хв, 3 хв; К ?
калібровка;

ІІ. Вплив NPE на зміни ЕКГ щура при введенні вазопресину: 1 – вихідна;
2, 3, 4, 5 – час після введення вазопресину, відповідно 30 сек, 1 хв, 2
хв, 3 хв; К ? калібровка;

ЕКГ записано, інтерпретовано та люб’язно надано кандидатом медичних
наук, старшим науковим співробітником Інституту геронтології АМН України
Б.В. Пугач.

Отримані нами дані засвідчують, що NРE в дозі 1 мкмоль виявляє виражений
кардіопротекторний та антиаритмічний ефекти, що асоціюються з
модифікуючим впливом фармакологічно активного ліпіду на склад жирних
кислот та фосфоліпідів.

Вплив NРЕ на склад жирних кислот тканини печінки за умов ішемії /
реперфузії

Вивчено ефект NРE на склад жирних кислот та PL печінки щурів при гострій
ішемії, що розвивається в результаті експозиції ізольованої печінки в
умовах припинення та відновлення її перфузії. Як випливає з даних,
наведених в табл. 7, внаслідок вилучення печінки зі системного
кровообігу з наступною її перфузією протягом 5 хв відбувається істотне
зниження рівня 18:2 n-6, 22:5 n-3 та 20:0 порівняно з інтактною
печінкою. Введення у середовище перфузії NРE у концентрації 10 мкмоль/л
запобігає зниженню рівня 18:2 n-6 та 22:5 n-3, а також спричиняє
зростання рівня пальмітолеїнової кислоти (16:1 n-9).

На 6 год ішемії ізольованої печінки спостерігається істотне підвищення
рівня 16:1 n-9 порівняно з інтактним контролем. NРE викликає підвищення
рівня 16:1 n-9 та пониження кількості 18:0 та 20:0 у тканині ізольованої
печінки за умов ішемії порівняно з контролем.

На 22 год ішемії ізольованої печінки спостерігається підвищення рівня
16:1 n-9, а також зниження кількості 20:0 порівняно з інтактним
контролем. Внесення NРЕ у перфузійний розчин призводить до підвищення
рівня 16:0 та 16:1 n-9 порівняно з інтактним контролем а також до
зниження кількості 20:0 порівняно з інтактним контролем.

Внаслідок реперфузії печінки щурів оксигенованим розчином
Krebs-Henseleit протягом 2 год відбувається значне зростання рівнів 16:0
та 16:1 n-9 порівняно з інтактним контролем. При цьому тільки вміст 20:0
істотно понижується. NРE призводить до істотного підвищення відсотку
16:1 n-9 та пониження 18:2 n-6, 20:4 n-6 та 20:0 порівняно з інтактним
контролем.

Можна побачити, що в умовах ішемії та реперфузії ізольованої печінки
відбуваються мультимодальні зміни в складі ліпідів. Так, у перші 5 хв
гіпоксії вміст РUFA у тканині печінки зменшується, що компенсується
пониженням кількості загального холестеролу; на 6 год гіпоксії
спостерігається істотне підвищення вмісту 16:1 n-9, при цьому кількість
загального холестеролу не відрізняється від контролю; на 22 год гіпоксії
вміст 16:1 n-9 залишається підвищеним порівняно з контролем, що
асоціюється з підвищенням рівня загального холестеролу. Внесення NРE у
перфузійний розчин запобігає флуктуаціям у кількості загального
холестеролу; при цьому вже на 5 хв гіпоксії NРE викликає накопичення
16:1 n-9, яка здатна підтримувати рідинність ліпідів на належному рівні
та, водночас, є поганим субстратом для вільнорадикального окислення.
Крім того, протягом 6 год NРE запобігає утворенню лізо-фосфатидилхоліну.

Таблиця 7.

Вплив NРE на жирнокислотний склад (моль% від сумарних жирних кислот),
вміст фосфоліпідів (мкг Pi / г тканини) та загального холестеролу (мг /
г тканини) в тканині печінки щурів за умов гіпоксії / реперфузії (M?m;
загалом n=24)

Показники Гіпоксія / реперфузія печінки щура

Ішемія

5 хв

6 год

22 год

Реперфузія

?NРE

+NРE

?NРE

+NРE

?NРE

+NРE

?NРE

+NРE

нтаєнова ?

Загальний холестерол ?

?

?

Фосфоліпіди

Фосфатидилхолін

? ?

Фосфатидилетаноламін

? ?

Фосфатидилсерин ? ?

? ?

Фосфатидилінозитол

?

Лізо-фосфоліпіди

?

? ? ? ?

Примітки: ? і ? ? відповідно вірогідне підвищення та пониження рівня
показника щодо контролю (цифрові дані наведено у частині “Додаток”
рукопису дисертації у вигляді таблиць 6-15)

Введення NРE у перфузійний розчин викликає модифікацію складу жирних
кислот та PL. Цей ефект NРE асоціюється з його цитопротекторним впливом
на тканину печінки, що підтверджено результатами мікроскопічного аналізу
її структури, проведеного фахівцями Інституту хірургії та
трансплантології АМН України. Вони показали, що додавання NPE до розчину
ЕС гальмує розвиток дистрофічних змін у тканині печінки на 6 та 22 год
гіпоксії, а також стабілізує морфологічну структуру органа у вигляді
ущільнення оболонки та цитоплазми клітин, збереження структури
печінкових балок при одночасному зменшенні їх об’єму.

Вплив N-пальмітоїлетаноламіну (NРЕ) на енергозалежний транспорт Са2+ в
клітині

При вивченні впливу NPE на Mg2+, АТР-залежне включення Са2+ в
інвертовані везикули плазматичної мембрани клітин міометрію свині
знайдено, що NPE в концентрації 10 мкМ Рис. 2.

Вплив NPE на на Mg2+, АТР-залежну акумуляцію Са2+ у фракції плазматичних
мембран клітин міометрію.

нмоль Са2+ / мг білка

Час, хвилини

Примітки: 1 та 2 – у відсутності та в присутності NPE (10 мкМ) у
середовищі інкубації, відповідно, 3 – стимуляція енергозалежної
акумуляції Са2+ за рахунок внесення аліквоти розчину NPE (кінцева
концентрація 10 мкМ) в середовище інкубації, що за вихідних умов не
містить NPE (момент внесення аліквоти показаний стрілкою).

Рис. 3.

Концентраційна залежність активуючого впливу NPE на Мg2+, АТР-залежну
акумуляцію Са2+ у фракції плазматичних мембран клітин міометрію.

нмоль Са2+ на 1 мг білка

Рис. 4.

Вплив NPE на нечутливу до дії рутенієвого червоного (10 мкМ),
стимульовану оксалатом (10 мкМ), Mg2+, АТР-залежну акумуляцію Са2+ в
пермеабілізованих клітинах міометрію, 1 та 2 – у присутності та
відсутності NPE (10 мкМ) в середовищі інкубації, відповідно.

нмоль Са2+ на 1 мг білка

Час, хвилини

Примітки: 1 та 2 – у відсутності та в присутності NPE (10 мкМ) у
середовищі інкубації, відповідно

Рис. 5.

Концентраційна залежність інгібуючого впливу NPE на нечутливу до дії
рутенієвого червоного (10 мкМ), стимульовану оксалатом (10 мкМ), Mg2+,
АТР-залежну акумуляцію Са2+ в пермеабілізованих клітинах міометрію.

нмоль Са2+ на 1 мг білка

стимулює транспортний процес в середньому на 28-46%. Як показано на
рис. 2, цей ефект спостерігається як у випадку присутності NPE з самого
початку експерименту в інкубаційному середовищі, так і при внесенні в
останнє аліквоти NPE через деякий час після початку досліду.

Виходячи з отриманих даних про залежність активуючого впливу NPE на
Mg2+, АТР-залежне включення Са2+ в везикули плазматичної мембрани в
залежності від концентрації (рис. 3), можна зробити висновок про те, що
в концентрації, яка не перевищує 1 мкМ, NPE практично не впливає на
рівень включення Са2+ в везикули; в діапазоні ж його концентрацій 1-10
мкМ спостерігається виражена стимуляція цього процесу. Подальше
підвищення концентрації NPE до 50 мкМ супроводжується деяким зниженням
енергозалежного включення Са2+ в мембранний препарат. Як з’ясувалося,
NPE, внесений в середовище інкубації в концентрації 10 мкМ, не впливає
на пасивне вивільнення Са2+ в середовище розведення з везикул
плазматичної мембрани, попередньо навантаженими цим катіоном в
результаті інкубації мембранного препарату в розчині, що містив 1 мМ
СаС12 (дані не наведено). Отже, NPE сам по собі не змінює базальну
кальцієву проникність плазматичних мембран клітин міометрію.

В наступних експериментах було досліджено вплив NPE безпосередньо на
солюбілізовану з плазматичної мембрани клітин гладеньких м’язів матки,
очищену з використанням метода афінної хроматографії на
кальмодулін-сефарозі 4В транспортну Са2+, Mg2+-АТР-азу. Знайдено, що при
дії 20 мкМ NPE спостерігається слабко виражена тенденція до зниження (в
середньому на 14,7±3,3%) швидкості Са2+, Mg2+-залежного ферментативного
гідролізу АТР, який каталізувався солюбілізованою Са2+, Mg2+-АТР-азою.
Таким чином, NPE не тільки не активує, а навіть дещо пригнічує
активність солюбілізованої Са2+, Mg2+-ATP-aзи.

В дослідах, виконаних на суспензії пермеабілізованих міоцитів матки
невагітніх естрогенізованих щурів, було виявлено, що NPE (10 мкМ)
частково (на 30-50%) інгібує нечутливу до дії рутенієвого червоного (10
мкМ), стимульовану оксалатом (10 мкМ), Mg2+, АТР- залежну акумуляцію
Са2+ в ендоплазматичному ретикулумі клітин міометрію (рис. 4).
Залежність впливу NPE від концентрації на цю акумуляцію має складний
характер: при концентрації сполуки 10-7 М, накопичення Са2+
пригнічується на 30%, подальше підвищення концентрації NPE в діапазоні
10-7– 10-6 М практично не призводить до зростання інгібуючого ефекту,
однак наступне збільшення концентрації мінорного ліпіду від 10-6 до 10-5
М викликає прогресуюче зниження акумуляції Са2+ в ендоплазматичному
ретикулумі (рис. 4). NPE, використаний в концентрації 10 мкМ, частково
(на 30-50%) інгібує пригнічувану рутенієвим червоним (10 мкМ) нечутливу
до дії тапсигаргіну (50 нМ) енергозалежну акумуляцію Са2+ в мітохондріях
пермеабілізованих клітин міометрію: у відсутності та присутності NPE
вона складає 611 и 413 пмоль Са2+ на 106 клітин за 10 хв, відповідно
(дані не наведено).

Отже, NPE (10 мкМ), стимулюючи Mg2+, АТР-залежний кальцієвий насос
плазматичної мембрани міометрію, одночасно інгібує енергозалежну
акумуляцію даного катіону у внутрішньоклітинних кальцієвих депо –
ендоплазматичному ретикулумі та мітохондріях.

У відповідності до отриманих даних про різноспрямовану дію NPE на Mg2+,
АТР-залежний транспорт Са2+ у фракції плазматичних мембран клітин
міометрію та активність солюбілізованої транспортної Са2+, Mg2+-ATP-ази,
виділеної з цього ж об’єкту, нами висловлено міркування, що NPE впливає
на цей мембранопов’язаний фермент не прямо, а за рахунок певного
проміжного механізму, що не проявляється на рівні препарату
солюбілізованої транспортної Са2+, Mg2+-ATP-ази. Можна припустити, що
важливою ланкою цього механізму може бути спричинена NPE модифікація
ліпідів плазматичної мембрани.

Встановлено, що жирнокислотний склад ліпідного екстракту плазматичної
мембрани істотно не змінюється під впливом NPE (дані не представлено).
Як випливає з даних, наведених в табл. 8, добавлення NPE (10 мкМ) в
інкубаційне середовище, що містить препарат плазматичних мембран клітин
гладеньких м’язів матки, призводить до триразового збільшення
відсоткового вмісту неламелярного PL ? лізо-фосфатидилхоліну, який
стимулює утворення гексагональної Н(ІІ) фази. Також вірогідно
збільшується вміст фосфатидилінозитолу – аніонного фосфоліпіда, який
здатний стимулювати активний транспорт Са2+ (L. Missiaen, et al., 1991).
Таким чином, активуючий вплив NPE на Mg2+, АТР-залежну акумуляцію Са2+ в
везикулах плазматичної мембрани асоціюється з модифікацією її
фосфоліпідного складу.

NPE у концентрації 10 мкМ (експозиція 10 хв) викликає збільшення
кількості фосфатидилхоліну (на 100%), сфінгомієліну (на 40%) та
фосфатидилетаноламіну (на 36%). Звертає на себе увагу той факт, що в
пермеабілізованих міоцитах під впливом NPE найбільш суттєво збільшується
вміст фосфатидилхоліну та сфінгомієліну, що забезпечують ламелярну
структуру мембран. При цьому кількість неламелярного
фосфатидилетаноламіну, що утворює гексагональну Н(ІІ)-фазу (S.W. Hui, et
al., 1981), збільшується в меншій мірі. Таким чином, після інкубації з
NPE переважають ламелярні фосфоліпідні молекули. У присутності NPE в
ендоплазматичному ретикулумі та мітохондріях пермеабілізованих міоцитів
спостерігається деяке інгібування енергозалежного транспорту Са2+, що, в
принципі, може бути пов’язано зі змінами фосфоліпідного складу мембрани.
Накопичення ламелярних PL у клітині може призводити до певного
пригнічення функціональної активності кальцієвого насосу
ендоплазматичного ретикулуму та мітохондрій.

Таблиця 8.

Вплив NPE (10 мкМ) на фосфоліпідний склад плазматичної мембрани міоцитів
матки свині (% від загальної кількості, M?m; n=6-9) та пермеабілізованих
міоцитів матки щурів (мкг Рі/106 клітин, M?m; n=3).

Фосфоліпіди Плазматична мембрана

Пермеабілізовані міоцити

Контроль

Інкубація з NPE

Контроль

Інкубація з NPE

Фосфатидилхолін 41,93?2,10 39,50?0,81 23,47?3,71 48,19?0,72*

Фосфатидилетаноламін 23,82?0,78 23,77?1,01 21,71?1,55 29,50?1,51*

Фосфатидилсерин 8,22?0,29 7,72?0,84 7,53?1,00 7,62?0,94

Фосфатидилінозитол 4,15?0,21 4,94?0,22 * 4,89?1,19 6,10?0,80

Сфінгомієлін 16,40?1,91 15,09?0,72 5,32?0,31 7,45?0,48*

Лізо-фосфатидилхолін 0,79?0,11 2,29?0,25 * Не знайдено Не знайдено

Лізо-фосфатидилетаноламін 1,05?0,27 Не знайдено Не знайдено Не знайдено

Кардіоліпін 2,71?0,21 2,80?0,27 2,47?0,60 3,87?1,15

Неідентифікований Рі 0,92?0,14 3,88?0,22 * 0,62?0,09 1,76?0,46

Примітка: * вірогідні зміни щодо контролю (p<0,05) Отримані дані вказують на можливість використання NРE з метою модифікації мембранопов’язаних процесів та ремоделювання ліпідів біологічних об’єктів. Нейропротекторна дія ендоканнабіноїдів при морфінній залежності Вплив суміші NAE на жирнокислотний склад головного мозку щурів До складу синтетичної суміші NAE увійшли жирні кислоти (моль% від їх загальної кількості): 14:0 ? 10,92%; 16:0 ? 23,27%; 16:1 n-9 ? 12,25%; 18:0 ? 5,10%; 18:1 n-9 ? 13,62%; 18:2 n-6 ? 1,79%; 20:0 ? 2,78%; 20:4 n-6 ? 1,19%; 20:5 n-3 ? 11,46%; 22:6 n-3 ? 3,05%. Як представлено в табл. 9, при морфінної залежності у тканині мозку щурів (група плацебо) істотно зростають рівні SFA – іsо16:0, 16:0 та 18:0 порівняно з інтактним контролем. При цьому знижується кількість основних MUFA – 18:1 n-9 та ейкозамоноєнової (20:1 n-11), а також 22:2 та 22:5 n-3. В тканині мозку тварин з морфінною залежністю з’являється нехарактерна для інтактних щурів жирна кислота з дуже довгим вуглеводневим ланцюгом – лігноцеринова (24:0). Введення NAE у курсовій дозі 3,5 мг/кг призводить до зростання рівнів іsо16:0, 16:0, іsо18:0 порівняно з групами інтактних щурів та тварин з опійною морфінною залежністю. При цьому, вірогідно знижений під впливом морфіну рівень низки жирних кислот таких, як 18:1 n-9, 20:1 n-11, а також 22:2 та 22:5 n-3, у разі введення NAE у цій дозі не відрізняється від показників групи плацебо. Відсоток же 18:0 практично повертається до контрольних показників. Крім того, у щурів, що отримували NAE у курсовій дозі 3,5 мг/кг, спостерігається вірогідне зниження рівнів 18:2 n-6, 20:0 та 20:4 n-6 порівняно з контрольними тваринами, та такими з опійною наркоманією. NAE у курсовій дозі 35 мг/кг спричиняє зростання порівняно з інтактними щурами рівня 16:0, 16:1 n-9 та іsо18:0. Кількість 18:2 n-6, 20:0, 20:1 n-11, генейкозанової (21:0), 20:4 n-6, 22:0, ейкозамоноєнової (22:1 n-11), 22:2 та 22:5 n-3 вірогідно понижується порівняно з інтактними щурами та групою плацебо. При цьому вміст 18:0 та 18:2 n-6 повертається до контрольних показників. Призначення NAE у курсовій дозі 200 мг/кг справляє виражений репаруючий ефект на ацильний склад ліпідів тканини мозку щурів з експериментальною опійною наркоманією. Так, не відрізняються від контрольних показників кількості майже всіх жирних кислот, окрім 16:0 та 18:0, кількість яких достовірно підвищена, а також 18:1 n-9, 20:4 n-6 та 22:5 n-3, відсоток яких понижений порівняно з контрольною групою та групою плацебо. Введення NAE у курсовій дозі 350 мг/кг призводить до вірогідного зростання порівняно з групою плацебо рівнів 18:2 n-6, 20:4 n-6 та 22:5 n-3. Водночас відсоток іsо16:0, іsо18:0, 18:0, 20:0 та 22:2 достовірно понижується порівняно з вищенаведеною групою щурів. Кількості 16:1 n-9 вірогідно підвищується, а 18:1 n-9, 20:1 n-11, 22:0 та 22:1 n-11 ? достовірно знижується порівняно з групою інтактних тварин. При введенні NAE у курсовій дозі 700 мг/кг вірогідно підвищується рівень 16:0. Одночасно, вміст 20:1 n-11, 22:1 n-11, 22:0 та 22:5 n-3 понижується порівняно з групою інтактних тварин. Отже, при морфінній залежності у щурів спостерігається виражене зниження рівня MUFA та зростання насиченості ліпідів тканини головного мозку, що, в принципі, може призводити до порушення мембранопов’язаних функцій та метаболічних порушень за експериментальної опійної наркоманії. Ін’єкція щурам з морфінною залежністю NAE у різних курсових дозах призводить до складних змін жирнокислотного складу. Так, NAE у курсовій дозі 700 мг/кг забезпечує практично повне відновлення рівня MUFA; 350 мг/кг ? сприяє відновленню показників вмісту SFA та UFA; у всіх курсових дозах (за винятком 350 мг/кг) ? до елімінації 24:0 з тканини головного мозку щурів з морфінною залежністю. Можна виснувати, що дозо-залежний ефект NAE на відновлення складу жирних кислот носить мультимодальний нелінійний характер, що вочевидь пов’язано з фактом присутності в суміші NAE сполук з різною довжиною та насиченістю вуглеводневого ланцюга. Як представлено в табл. 10, у щурів з морфінною залежністю відбувається істотне зменшення кількості PL у тканині головного мозку. За морфінної залежності кількість фосфатидилхоліну, фосфатидилетаноламіну, фосфатидилсерину, сфінгомієліну та фосфатидилінозитолу в тканині головного мозку щурів істотно знижується. Вплив NAE на відновлення складу жирних кислот тканини головного мозку в щурів з морфінною залежністю носить мультимодальний дозо-залежний характер. Так, введення щурам з морфінною залежністю NAE у курсовій дозі 3,5 мг/кг призводить до вірогідного підвищення рівня фосфатидилсерину, сфінгомієліну та кардіоліпіну порівняно з групою плацебо; кількість загальних та індивідуальних PL (окрім кардіоліпіну, вміст якого зростає) істотно не відрізняється від інтактного контролю. Подальше підвищення курсової дози NAE (35 ? 700 мг/кг) не забезпечує відновлення абсолютного вмісту фосфатидилсерину в тканині мозку порівняно з інтактними тваринами. Введення NAE у дозі 200 ? 700 мг/кг також не забезпечує відновлення абсолютного рівня сфінгомієліну в тканині мозку порівняно з інтактними щурами, а у дозі 350 ? 700 мг/кг ? кількості фосфатидилінозитолу у тканині головного мозку щурів щодо інтактного контролю. У разі введення NАЕ щурам з морфінною залежністю у курсовій дозі 350 мг/кг, рівень загальних ліпідів та PL статистично не відрізняється від такого в інтакних тварин, а в дозі 700 мг/кг вищезгадані показники вірогідно підвищуються порівняно з тваринами з морфінною залежністю, які отримували плацебо. Крім того, NAE у курсовій дозі 700 мг/кг повністю відновлює кількість загальних PL у тканині головного мозку щурів-морфіністів. Таблиця 9. Вплив NAE на розподіл жирних кислот тканини головного мозку щурів з морфінною залежністю (моль% загальної кількості жирних кислот, M?m). Жирні кислоти Інтактні щури (n=6) Щури з морфінною залежністю, яким вводили NAE в курсовій дозі (мг/кг маси тіла) 0 (Плацебо) (n=15) 3,5 (n=5) 35 (n=4) 200 (n=6) 350 (n=4) 700 (n=4) 1 2 3 4 5 6 7 8 Міристинова 0,11(n=1) 0,13?0,03 0,14?0,02 0,15?0,03 0,11?0,01 0,12?0,01 0,09(n=1) Пентадеканова 0,12?0,13 0,09(n=1) 0,07(n=1) 0,33?0,11 Ізо-пальмітинова 0,39(n=1) 0,67?0,09* 1,63?0,11*# 1,09?0,42 0,65?0,1 0,13?0,05# 0,29?0,05# Пальмітинова 15,32?1,48 19,04?0,79* 21,56?0,4*# 23,49?0,49*# 20,21?0,65* 17,22?0,46 21,37?0,25* Пальмітолеїнова 0,32?0,02 0,35?0,03 0,37?0,04 0,47?0,03* 0,25?0,03 0,47?0,03* 0,35?0,004 Гептадеканова 0,29?0,03 0,32?0,02 0,25?0,01# 0,26?0,02# 0,34?0,02 0,23?0,01# 0,41?0,06 Гептадекамоноєнова 0,56?0,22 0,16(n=1) 0,10?0,01 Ізо-стеаринова 1,18?0,78 1,93?0,31 4,60?0,25*# 2,91?0,81 1,85?0,24 0,21?0,02# 1,19?0,31 Стеаринова 26,45?1,15 29,60?0,85* 26,95?0,34# 28,76?0,61 33,92?1,18*# 23,30?0,24*# 29,04?0,54 Олеїнова 29,19?1,34 24,78?0,36* 22,95?1,00* 24,03?0,81* 24,65?0,78* 24,98?0,49* 26,12?0,56 Лінолева 0,78?0,08 1,05?0,11 0,55?0,06*# 0,65?0,06# 0,85?0,24 2,41?0,49*# 0,99?0,01 Ліноленова 0,19?0,01 0,14(n=1) 0,12?0,00*# Арахінова 1,58?0,08 1,63?0,09 1,29?0,11# 1,17?0,02*# 1,90?0,15 1,31?0,07*# 1,80?0,27 Гондова 6,84?0,59 4,86?0,28* 3,86?0,23*# 3,63?0,18*# 5,51?0,28 4,56?0,17* 4,42?0,10* Генейкозанова 0,53?0,05 0,39?0,03* 0,36?0,01* 0,31?0,01*# 0,43?0,06 0,41?0,02 0,43?0,06 Ейкозатриєнова 0,45?0,03 0,56?0,03 0,59?0,25 Арахідонова 9,67?1,33 7,90?0,71 5,89?0,57*# 5,07?0,36*# 4,69?0,87*# 14,42?0,74*# 7,51?0,06 Бегенова 1,77?0,10 1,62?0,12 1,10?0,12*# 1,05?0,07*# 1,75?0,15 1,47?0,04* 1,67?0,04 Докозамоноєнова 0,79?0,03 0,69?0,05 0,58?0,05* 0,54?0,05*# 0,73?0,04 0,58?0,04* 0,60?0,03* Докозадиєнова 1,13?0,11 0,72?0,06* 0,60?0,05* 0,53?0,05* 0,70?0,05* 0,47?0,03*# 0,62?0,04* Докозатриєнова 0,45?0,04 0,87?0,30 0,90?0,10* 0,84?0,08* 0,30(n=1) Докозапетаєнова 2,60?0,13 1,83?0,21* 1,35?0,17* 1,24?0,16*# 0,85?0,18*# 3,12?0,12*# 1,51?0,12* Докозагексаєнова 1,99?1,87 2,00?0,20 3,71?1,09 2,31?0,16 1,06(n=1) 2,11?0,06 1,37?0,24 Продовження табл. 9. 1 2 3 4 5 6 7 8 Лігноцеринова 2,75?0,49 2,21?0,39 Неідентифіковані 0,65?0,06 0,78?0,16 1,52?0,31# 0,56?0,13 0,21?0,03*# Насичені 46,7?2,9 55,7?1,1* 57,8?0,7* 59,1?1,6* 60,9?1,2*# 46,0?0,8# 56,4?0,8* Ненасичені 52,7?2,8 43,7?1,2* 40,8?0,6*# 39,3?1,5*# 39,0?1,2*# 53,8?0,7# 43,5?0,8* Моноєнові 37,4?1,9 30,7?0,6* 27,8?1,2*# 28,7?1,0* 31,8?0,8* 30,6?0,6* 31,5?0,5* Диєнові 1,9?0,1 1,8?0,1 1,1?0,04*# 1,2?0,06*# 1,5?0,2 2,9?0,5# 1,6?0,1 Інші полієнові 13,4?0,8 11,2?1,0 11,8?1,5 9,5?0,6* 5,6?1,1*# 20,3?0,7*# 10,4?0,3* Насичені/ненасичені 0,92?0,12 1,30?0,06* 1,42?0,04* 1,51?0,10* 1,60?0,08*# 0,80?0,03# 1,30?0,04* Примітки: * вірогідні зміни щодо групи “Інтактні щури” (p<0,05); # вірогідні зміни щодо групи плацебо Таблиця 10. Вплив NAE на склад фосфоліпідів тканини мозку щурів з морфінною залежністю (мкг/г тканини) (M?m; n=4-6) Фосфоліпіди Інтактні щури (n=6) Щури з морфінною залежністю, яким вводили NAE в курсовій дозі (мг/кг маси тіла) 0 (Плацебо) (n=15) 3,5 (n=5) 35 (n=4) 200 (n=6) 350 (n=4) 700 (n=4) Фосфатдилхолін 672?17 594?18* 621?22 549?65 602?44 686?23# 642?44 Фосфатидилетаноламін 727?16 663?16* 706?28 598?79 685?51 734?32 700?54 Фосфатидилсерин 236?5 192?7* 225?9# 183?15* 197?15* 204?8* 185?17* Сфінгомієлін 121?4 88?6* 121?13# 101?11 97?7* 90?3.1* 98?9* Фосфатидилінозитол 60?3 42?4* 51?4 47?7 53?6 46?5* 34?6* Лізо-фосфатидилсерин 31?6 24?10 26?3 26?10 12?2 11(n=1) 10(n=1) Фосфатидна кислота 28?2 38?6 33?7 21?4# 28?7 42?25 Кардіоліпін 18?3 26?4 39?3.1*# 71?31 27?6 37?5* 26?10 Загальні фосфоліпіди 2000?40 1690?40* 1870?60# 1620?140* 1740?110 1740?120 1880?50# Примітки: * вірогідні зміни щодо групи “Інтактні щури” (p<0,05); # вірогідні зміни щодо групи плацебо Таблиця 11. Зміни у споживанні ad libitum 0,01% розчину морфіну щурами з морфінною залежністю до призначення NAE (протягом 7-го тижня експерименту) та після призначення NAE (протягом 8-го тижня експерименту; M?m; n=4-6) Курсова доза NAE (мг/кг) Споживання 0,01% розчину морфіну в мл пересічно за добу протягом: 7-го тижня (до призначення NAE 8-го тижня (під час призначення NAE) % зміни споживання 0 (плацебо) 4,32+0,50 5,72+0,90 +32,4% 3,5 4,23+0,68 3,60+0,94 -14,9% 35 5,48+0,58 2,82+0,51# -48,5% 200 4,98+0,35 3,95+0,52 -20,7% 350 5,08+0,39 3,70+0,68 -27,2% 700 6,93+0,71 6,08+0,33 -12,3% Примітка: # вірогідні зміни щодо групи плацебо Як випливає з даних, наведених в табл. 11, протягом 8-го тижня морфінної залежності щури далі нарощували об’єми добровільно спожитого морфіну. Тимчасом, щури-морфіністи усіх груп, котрим було призначено NAE в різних курсових дозах не тільки перестали збільшували обсяги випитого 0,01% розчину морфіну, а навіть дещо скоротили добровільне його споживання. В останньому відношенні найбільш ефективною виявилася курсова доза 35 мг/кг, за якої щури з морфінною залежністю майже наполовину, й при тому статистично вірогідно, зменшили кількість добровільно спожитого морфіну. Ці факти ясно засвідчують, що модифікація складу жирних кислот та PL на тлі відновлення вмісту катехоламінів (дані не представлено) у тканині головного мозку щурів з експериментальною опійною залежністю під впливом NAE асоціюється зі скороченням добровільного споживання морфіну, що свідчить про нейропротекторну дію NAE та послаблення наркотичної залежності у піддослідних тварин. Суміш синтетичних ендоканнабіноїдів, що складаються з SFA-, MUFA- та PUFA-NAE, можуть бути потенційними кандидатами в лікарські засоби з нейропротекторними властивостями для фармакотерапії морфінної залежності. УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕНЬ Виявлено існування спільних закономірностей порушення складу жирних кислот мембран, клітин та тканин при хронічних серцево-судинних та онкологічних захворюваннях, а також у віддаленому періоді після дії йонізуючого опромінення (див. табл. 12). Універсальною ознакою вивчених хронічних патологічних станів є неспецифічне зростання рівнів PUFA та PL, зокрема фосфатидилетаноламіну, в біологічних структурах, яке компенсується підвищенням рівня вільного та загального холестеролу, але не E-Chol. Наведені зміни забезпечують компенсацію порушень ліпідного складу при хронічних захворюваннях, в результаті чого підвищений вміст факторів, що понижують упорядкованість ліпідного бішару (PUFA та неламелярні PL), нівелюється зростанням рівня холестеролу, який підвищує упорядкованість ліпідного бішару. Біологічний сенс компенсації порушень ліпідного складу може полягати у посиленні захисних резервів клітини з метою забезпечення її виживання та адаптації до дії патогенного чинника шляхом задоволення її підвищеної потреби у PUFA як факторів регуляції мембранопов’язаних функцій та попередників вторинних месенджерів ліпідної природи, що опосередковують дію гормонів стресу. Ціною, яку платить клітина за виживання у разі тривалої дії патогенного чинника, може бути стійкий ліпідний дисбаланс, здатний викликати порушення специфічних функцій клітини та виникнення хронічних захворювань. Таблиця 12. Загальні закономірності змін ступеня насиченості жирних кислот, вмісту фосфоліпідів та холестеролу в біологічних структурах людини та щурів за умов хронічних патологічних станів Показники АГ (n=29) ІХС (n=27) Рак щитоподібної залози (n=10) Ліквідатори у віддаленому періоді після аварії на ЧАЕС (n=15) Ненасичені жирні кислоти ?a ?a ?b ?a Загальний холестерол ?h ?h ?d ?f Загальні фосфоліпіди нв нв ?e ?g Фосфатидилетаноламін нв нв ?e ?g Насичені жирні кислоти ?a ?a ?b ?a Примітки: амоль% від загальної кількості жирних кислот у мембранах еритроцитів людини; bмоль% від загальної кількості жирних кислот тканини щитоподібної залози людини; dмкг/мг білка пухлинної тканини щитоподібної залози людини; eнг Рі/мг білка пухлинної тканини щитоподібної залози людини; fмг/мг білка мембран еритроцитів людини; gмкг Рі/мг білка мембран еритроцитів людини; hммоль/л сироватки крові; нв ? показник не вивчався. В результаті зростання рівня PUFA у клітині може підвищуватися їх доступність для циклооксигенази та ліпоксигенази. Внаслідок цього в імунокомпетентних клітинах у високих кількостях можуть утворюватися продукти, що негативно впливають на імунну функцію, ? зокрема моногідроксильовані похідні PUFA, що може служити ключовим фактором патогенезу різноманітних захворювань. Патогенетичні механізми, які були запущені в період прямого контакту з патогенним чинником (наприклад, йонізуючим опроміненням) можуть функціонувати й далі за рахунок подальшої хронічної дії інших несприятливих факторів та формування стійкого дисбалансу жирних кислот. Як вважає Л.М. Овсянникова, та ін. (2001), синдром дезадаптації, що розвивається під впливом несприятливих факторів зовнішнього та внутрішнього середовища реалізується в патології серцево-судинної, ендокринної, травної та інших систем організму з прискоренням вікової інволюції та скороченням тривалості життя. Вищенаведені зміни вперше інтерпретуються з позицій теорії гомовіскозної адаптації: зростання кількості поліненасичених ліпідів у біологічних структурах людини та піддослідних тварин компенсується підвищенням рівня холестеролу, а зменшення кількості поліненасичених ліпідів ? пониженням рівня холестеролу. Застосування принципів теорії гомовіскозної адаптації для інтерпретації дисбалансу жирних кислот дозволяє запропонувати концепцію про дуалістичну функціональну роль підвищення вмісту PUFA в біологічних системах за умов патологічних станів у людини, зокрема, та ссавців, загалом. Захисне значення надлишку PUFA вочевидь полягає в полегшенні перебігу мембранопов’язаних процесів за рахунок пониження упорядкованості ліпідного бішару та забезпеченні клітини попередниками “вторинних месенджерів”, що вивільняються у цитозоль у відповідь на дію різноманітних гормонів та інших біологічно активних речовин та, у кінцевому рахунку, запускають комплекс захисних реакцій, спрямованих на мінімізацію ушкодження клітини. Негативне значення накопичення PUFA полягає в ушкодженні специфічних функцій клітини за рахунок надмірного утворення, зокрема, моногідроксильованих похідних жирних кислот. Нами вперше показано, що накопичення моногідроксильованих похідних PUFA в імунокомпетентних клітинах ліквідаторів асоціюється з імунним дисбалансом. При цьому підвищення вмісту цих сполук у мононуклеарах ліквідаторів аварії на ЧАЕС є функцією величини поглинутої дози йонізуючого опромінення. Отже, зміни вмісту PUFA в клітині за умов хронічних патологічних станів асоціюються з реструктуризацією якісного та кількісного складу PL і холестеролу, в результаті чого може розвинутися стійкий дисбаланс жирних кислот. Гостра ішемія / реперфузія міокарда у людини та піддослідних тварин також супроводжується зростанням кількості вільних та естерифікованих у складні ліпіди PUFA, а також накопиченням лізо-фосфоліпідів, що, однак, на відміну від хронічних патологічних станів, не компенсується підвищенням рівня загального та вільного холестеролу. З огляду на існування певного лаг-періоду з моменту підвищення вмісту PUFA до компенсаторного зростання рівня холестеролу при відповідних захворюваннях, зроблено припущення про те, що за умов гострих патологічних станів, які супроводжуються ішемією / реперфузією, клітина не встигає у належній мірі забезпечити перебіг реакцій гомовіскозної адаптації, регуляція яких, не виключено, здійснюється на рівні експресії генів під впливом, зокрема, PUFA. Той факт, що клітина в умовах гострого ушкодження не здатна власними ресурсами в короткі строки забезпечити перебіг реакцій гомовіскозної адаптації на належному рівні, диктує необхідність введення екзогенних біологічно активних ліпідів, що здатні полегшити цей процес та / або мімікріювати компенсаторну роль ущільнюючого мембрани фактору, ? холестеролу. Нещодавно опубліковано дані про те, що NАE легко вбудовується в ліпідні рафти плазматичної мембрани та проникає всередину клітини через кавеоли (M.J. McFarland, et al., 2004). Відомо, що ліпідні рафти складаються зі щільно упакованих молекул холестеролу та сфінголіпідів з довгим насиченим вуглеводневим ланцюгом у рідкій фазі з високою ступінню впорядкованості та низькою латеральною дифузією ліпідів (K. Simons, D. Toomre, 2000). Правдоподібно, NAE міг би заміщати відносний дефіцит холестеролу при гострих патологічних станах, що супроводжуються підвищенням рівня PUFA та лізо-фосфоліпідів, компенсуючи “розріджуючий” вплив останніх на ліпідний бішар, а також модифікуючи перебіг мембранопов’язаних процесів. Оскільки NAE містить у своєму складі жирну кислоту, він міг би також служити і донором ацилу для складних ліпідів. Модифікація ацильного складу гліцерофосфоліпідів тканини серця щурів, ? кардіоліпіну, фосфатидилінозитолу, фосфатидилетаноламіну і фосфатидилхоліну / лізо-фосфатидилхоліну, а також E-Chol може бути важливою ланкою загального механізму кардіопротекторної дії NSE за умови ішемії / реперфузії міокарда. Також нами вперше продемонстровано, що нейропротекторна дія суміші насичених та ненасичених NAE у щурів з морфінною залежністю асоціюється з дозо-залежною модифікацією складу жирних кислот та фосфоліпідів, модуляцією вмісту дофаміну в тканині головного мозку, а також істотним зменшенням споживання ad libitum морфіну. Нарешті, цінною властивістю насичених довголанцюжкових NAE є те, що вони здатні компенсувати зрушення в жирнокислотному складі біологічних тканин, не впливаючи на вміст загального / вільного холестеролу, але запобігаючи накопиченню Е-Chol. Наведені факти дозволяють розглядати ендоканнабіноїди як перспективні кандидати в інноваційні лікарські засоби з цитопротекторними властивостями, що здатні коригувати дисбаланс жирних кислот за умов патологічних станів, які супроводжуються ішемією / реперфузією, а також наркотичною залежністю. ВИСНОВКИ У дисертації, у відповідності до поставленої мети та завдань дослідження, отримано нові дані стосовно універсальних змін у розподілі жирних кислот біологічних об’єктів за умов гострих та хронічних патологічних станів, і на підставі отриманих результатів, а також на основі науково-теоретичних та прикладних досліджень з використанням моделей патологічних станів у піддослідних тварин, запропоновано можливість застосування ендоканнабіноїдів типу N-ацилетаноламінів для корекції дисбалансу жирних кислот за умов гострої ішемії, реперфузійного синдрому та морфінної залежності. Дисбаланс жирних кислот є універсальним фактором патогенезу хронічних серцево-судинних та онкологічних захворювань людини. Дисбаланс жирних кислот при ішемічній хворобі серця, артеріальній гіпертензії та раку щитоподібної залози характеризується певними спільними рисами, а саме зниженням кількості основних насичених жирних кислот (пальмітинової та / або стеаринової), а також підвищенням вмісту поліненасичених жирних кислот n-6 ряду (лінолевої та / або арахідонової) та n-3 ряду (докозагексаєнової); Підвищення рівня поліненасичених жирних кислот та фосфоліпідів, зокрема фосфатидилетаноламіну, а також зниження вмісту насичених жирних кислот в біологічних структурах у пацієнтів з хронічними захворюваннями, ? ішемічною хворобою серця, артеріальною гіпертензією та раком щитоподібної залози, а також у ліквідаторів у віддаленому періоді після аварії на ЧАЕС асоціюється зі зростанням кількості загального холестеролу. Пониження рівнів поліненасичених жирних кислот (докозадиєнової та докозапентаєнової), мононенасичених жирних кислот (олеїнової) і фосфоліпідів (фосфатидилхоліну, фосфатидилетаноламіну, фосфатидилсерину, фосфатидилінозитолу та сфінгомієліну), а також підвищення вмісту насичених жирних кислот (пальмітинової та / або стеаринової) у щурів з експериментальною морфінною залежністю супроводжується пониженням рівня загального холестеролу; За умов хронічних патологічних станів у людини та щурів зміни у ліпідному складі відбуваються за певними закономірностями, що піддаються інтерпретації з позицій теорії гомовіскозної адаптації, а саме підвищення вмісту поліненасичених жирних кислот супроводжується зростанням рівня рівня загального / вільного холестеролу, а пониження вмісту поліненасичених та мононенасичених жирних кислот, ? зниженням рівня загального / вільного холестеролу. Результати власних досліджень дозволяють поширити сферу застосування теорії гомовіскозної адаптації на біологічні системи людини та ссавців, постулюючи, що гомовіскозна адаптація є універсальною стратегією живих організмів; Гострі патологічні стани (ішемія / реперфузія міокарда та печінки) супроводжуються підвищенням рівня декотрих вільних та естерифікованих у фосфоліпіди мононенасичених жирних кислот (пальмітолеїнової та олеїнової) і поліненасичених жирних кислот (лінолевої, ліноленової та арахідонової), а також лізо-фосфатидилхоліну на тлі незміненого / пониженого вмісту загального холестеролу або незміненого / підвищеного вмісту ефірів холестеролу. На відміну від хронічних захворювань, за умов гострих патологічних станів зростання рівня мононенасичених та поліненасичених жирних кислот не компенсується підвищенням рівня загального / вільного холестеролу; Показано дозо-залежне накопичення декотрих моногідроксильованих похідних поліненасичених жирних кислот у мононуклеарах периферичної крові у ліквідаторів через 12 років після аварії на ЧАЕС. В мононуклеарах ліквідаторів з поглинутою дозою йонізуючого опромінення <0,32 Гр спостерігається істотне підвищення рівнів вільних 12-гідрокси-5,8,10-гептадекатриєнової та 8(S)- і 12(S)-гідрокси-5,9,11,14-ейкозатетраєнових кислот, загальних гідрокси-5,9,11,14-ейкозатетраєнових кислот, 14-гідрокси-похідного жирних кислот з довжиною ланцюга 22 атоми вуглецю, загальних гідрокси-похідних жирних кислот з довжиною ланцюга 22 атоми вуглецю та естерифікованих у фосфоліпіди 13(S)-гідроксиоктадекадиєнової, 8(S)- і 12(S)-гідрокси-5,9,11,14-ейкозатетраєнових кислот. В ліквідаторів з поглинутою дозою >0,32 Гр в мононуклеарах периферичної крові вігорідно
підвищується рівень вільних 5(S)- та
8(S)-гідрокси-5,9,11,14-ейкозатетраєнових кислот, а також
естерифікованих у фосфоліпіди 15(S)-гідрокси-5,9,11,14-ейкозатетраєнової
та 17-гідрокси-похідного жирних кислот з довжиною ланцюга 22 атоми
вуглецю порівняно з неопроміненим контролем. Розподіл більшості
моногідроксильованих жирних кислот між фракціями вільних та
естерифікованих у фосфоліпіди сполук є асиметричним. Кількості
13(S)-гідроксиоктадекадиєнової, загальних
гідрокси-5,9,11,14-ейкозатетраєнових та загальних гідрокси-похідних
жирних кислот з довжиною ланцюга 22 атоми вуглецю, естерифікованих у
фосфоліпіди мононуклеарів неопромінених осіб, у декілька разів
перевищують рівень вільних сполук. При цьому в ліквідаторів з поглинутою
дозою <0,32 Гр 5(S)- 12(S)- та 15(S)-гідрокси-6,8,11,14-ейкозатетраєнові кислоти розподілені рівномірно по фракціях вільних та естерифікованих у фосфоліпіди моногідроксильованих жирних кислот; Зростання рівня моногідроксильованих жирних кислот у мононуклеарах периферичної крові ліквідаторів є функцією поглинутої дози йонізуючої радіації та асоціюється з імунним дисбалансом. Виявлено позитивну кореляцію між поглинутою дозою йонізуючого опромінення та вмістом вільних 5(S)- та 8(S)-гідрокси-6,8,11,14-ейкозатетраєнових кислот; естерифікованих у фосфоліпіди 15(S)-гідрокси-6,8,11,14-ейкозатетраєнової та загальних гідрокси-похідних жирних кислот з довжиною ланцюга 22 атоми вуглецю; та сумарних 5(S)- і 15(S)- гідрокси-6,8,11,14-ейкозатетраєнових, а також 17- гідрокси-похідного жирних кислот з довжиною ланцюга 22 атоми вуглецю. Акумуляція моногідроксильованих жирних кислот кислот у мононуклеарах периферичної крові ліквідаторів є наслідком хронічного стресу, ініційованого дією йонізуючого опромінення у віддаленому минулому, небажаними проявами якої є імунний дисбаланс; NPE в концентрації 10 мкМ стимулює активність Mg2+, АТР-залежного кальцієвого насосу плазматичної мембрани міометрію, інгібуючи нечутливу до дії рутенієвого червоного, стимульовану оксалатом Mg2+,АТР-залежну акумуляцію Са2+ в ендоплазматичному ретикулумі клітин міометрію, а також пригнічувану рутенієвим червоним, нечутливу до дії тапсигаргіну енергозалежну акумуляцію Са2+ в мітохондріях пермеабілізованих клітин міометрію. При цьому NPE не здійснює активуючого впливу на солюбілізовану з плазматичної мембрани клітин гладеньких м’язів матки, очищену з використанням метода афінної хроматографії на кальмодулін-сефарозі 4В транспортну Са2+, Mg2+-АТР-азу. Активуючий вплив NPE на Mg2+, АТР-залежну акумуляцію Са2+ в везикулах плазматичної мембрани асоціюється з накопиченням у ній лізо-фосфатидилхоліну, а інгібуючий вплив NPE на Mg2+, АТР-залежну акумуляцію Са2+ в ендоплазматичному ретикулумі та мітохондріях ? з переважною акумуляцією фосфатидилхоліну та сфінгомієліну; Цитопротекторний ефект ендоканнабіноїдів асоціюється з тканиноспецифічною, дозозалежною, мультимодальною модифікацією складу жирних кислот і PL. NАE полегшує перебіг гомовіскозної адаптації за умов гострих (ішемія / реперфузія міокарда та печінки, гостра ішемія міокарда) та хронічних (морфінна залежність) патологічних станів у щурів, викликаючи, зокрема, перерозподіл MUFA та PUFA між різними класами ліпідів, запобігаючи деградації фосфатидилхоліну до лізо-фосфатидилхоліну та вільних PUFA, при цьому істотно не впливаючи на кількість загального / вільного холестеролу. Показано, що нейропротекторний ефект NAE асоціюється з відновленням складу ліпідів та добровільним і суттєвим зменшенням споживання морфіну щурами з експериментальною опійною наркоманією. СПИСОК ОСНОВНИХ ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ Горідько Т.М., Маргітич В.М., Клімашевський В.М., Говсеєва Н.М., Пугач Б.В., Гула Н.М., Фролькіс В.В. Фосфоліпідний склад серця щурів за гострої ішемії міокарда, змодельованої вазопресином // Укр. біохім. журн. – 1996. – Т. 68, № 1. – С. 99-102. Гула Н.М., , Маргітич В.М., Горідько Т.М., Говсеєва Н.М., Пугач Б.В., Клімашевський В.М., Фролькіс В.В. Захисний вплив N-пальмітоїлетаноламіну на розвиток експериментальної ішемії серця щурів, що викликана вазопресином // Журн. АМН України. – 1996. – Т. 2, № 4. – С. 712-721. Гулая Н.М., Говсеева Н.Н., Климашевский В.М., Шинлова О.П., Слинченко Н.М., Маргитич В.М., Костерин С.А. Влияние N-пальмитоилэтаноламина на энергозависимый транспорт Са2+ в везикулах сарколеммы миометрия и их фосфолипидный состав // Укр. биохим. журн. – 1997. – Т. 69, № 5-6. – С. 64-74. Гулая Н.М., Бабич Л.Г., Шлыков С.Г., Маргитич В.М., Говсеева Н.Н., Климашевский В.М., Костерин С.А. Влияние N-пальмитоилэтаноламина на энергозависимый транспорт Са2+ во внутриклеточных структурах миометрия и их фосфолипидный состав // Укр. биохим. журн. – 1997. – Т. 69, № 5-6. – С. 75-84. Гула Н.М., Маргітич В.М., Коцюруба А.В., Клімашевський В.М., Вікторов О.П., Мітченко О.І., Семикопна Т.В. Дисліпідемія як фактор патогенезу ендотеліальної дифункції при гіпертонічній хворобі // Український кардіологічний журнал. – 1998. – № 12. – С. 54-56. Гула Н.М., Синицький В.М., Маргітич В.М., Н.К. Харченко, Говсеєва Н.М., Артамонов М.В., Гулий М.Ф. Зв’язок між порушенням вмісту моноамінергічних нейромедіаторів та деяких вільних амінокислот у тканині мозку щурів при морфінізмі // Архів психіатрії. – 1998. – № 1(16). – С. 93-97. Мельничук С.Д., Кузьменко А.И., Маргитич В.М., Говсеева Н.Н., Горидько Т.Н., Гулая Н.М. Влияние углекислоты на свободнорадикальные процессы в условиях искусственного гипобиоза у крыс // Укр. биохим. журн. – 1998. – Т. 70, № 1. – С. 87-94. Гула Н.М., Маргітич В.М., Говсеєва Н.М., Клімашевський В.М., Жуков О.Д., Синицький В.М. Зміни ліпідного складу мозку тварин з експериментальною морфінною залежністю // Укр. біохім. журн. – 1998. – т. 70, № 2. – С. 98-105. Семикопна Т.В., Мітченко О.І., Клімашевський В.М., Маргітич В.М., Гула Н.М. Зміни ліпідного складу мембран червонокрівців за есенційної гіпертензії // Укр. біохім. журн. – 1998. – Т. 70, № 6. – С. 132-135. Gulaya N.M., Kuzmenko A.I., Margitich V.M., Govseeva N.M., Melnichuk S.D., Goridko T.M., Zhukov A.D. Long-chain N-acylethanolamines inhibit lipid peroxidation in rat liver mitochondria under acute hypoxic hypoxia // Chem. Phys. Lipids. – 1998. – Vol. 97. – P. 49-54. Маргітич В.М., Жуков О.Д., Артамонов М.В., Гула Н.М. Зручний спосіб лабораторного синтезу міченого за жирною кислотою N-([1-(14)С]пальмітоїл)етаноламіну // Укр.біохім.журн. ? 1999. ? Т. 71, № 6. ? С. 108-110. Фролькіс В.В., Артамонов М.В., Жуков О.Д., Клімашевський В.М., Маргітич В.М., Гула Н.М. Ліпідний склад і скорочувальна активність ізольованого серця щурів за постішемічної реперфузії та за умов впливу насичених досвголанцюжкових N-ацилетаноламінів // Укр.біохім.журн. – 2000. – 72, № 1. – С. 56-63. Gulaya N.M., Margitich V.M., Chumak A.A., Lagarde M., Prigent A.-F., Zhukov A.D., Artamonov M.V., Klimashevsky V.M., Govseeva N.M. Chernobyl clean-up workers erythrocyte membrane lipid content at the remote period // Ukr. Biochіm. Zh. – 2000. – Vol. 72, N 6. – P. 56-62. Гула Н.М., Маргітич В.М., Коцюруба А.В., Клімашевський В.М., Говсеєва Н.М., Буханєвіч О.М., Вікторов О.П., Мітченко О.І., Семикопна Т.В. Ендотеліальна дисфункція та дисліпідемія як молекулярний базис порушення внутрішньосерцевої динаміки при есенціальній гіпертензії // Журн. АМН України. – 2000. – Т. 6, № 1. – С. 107-114. Артамонов М.В., Гула Н.М., Клімашевський В.М., Жуков О.Д., Маргітич В.М., Фролькіс В.В. Вплив N-стеароїлетаноламіну на розподіл ліпідів різних класів у тканині серця щурів за умов ішемії – реперфузії // Укр.біохім.журн. – 2001. – Т. 73, № 1. – С. 101-109. Горідько Т.М., Гула Н.М., Маргітич В.М., Говсеєва Н.М., Клімашевський В.М., Шагідулін М.Ю. Вивчення впливу N-пальмітоїлетаноламіну на склад фосфоліпідів та жирних кислот печінки щурів за ішемії // Укр. біохім. журн. – 2001. – Т. 73, № 1. – С. 82-87. Артамонов М.В., Зіньковський М.Ф., Гула Н.М., Маргітич В.М., Клімашевський В.М. Зміни ліпідного складу міокарда в умовах хірургічного втручання з використанням холодової та хімічної кардіоплегії // Укр.біохім.журн. – 2001. – Т. 73, № 2. – С. 123-129. Chumak A., Thevenon C., Gulaya N., Guichardant M., Margitich V., Bazyka D., Kovalenko A., Lagarde M., Prigent A.-F. Monohydroxylated fatty acid content in peripheral blood mononuclear cells and immune status of people at long times after the Chernobyl accident // Radiat. Res. – 2001. – Vol. 156, N 5 (Pt 1). – P. 476-487. Гула Н.М., Горідько Т.М., Маргітич В.М., Говсеєва Н.М., Клімашевський В.М., Шагідулін М.Ю. Вивчення впливу N-пальмітоїлетаноламіну на склад фосфоліпідів та жирних кислот ішемізованої печінки щурів за реперфузії // Укр. біохім. журн. – 2001. – Т. 73, № 4. – С. 33-38. Гула Н.М., Синицький В.М., Маргітич В.М., Клімашевський В.М., Говсеєва Н.М., Кузьменко О.І., Горідько Т.М., Гулий М.Ф. Вплив хронічної морфінної інтоксикації на склад есенційних фосфоліпідів мозку // Журн. АМН України. – 2001. – Т. 7, № 4. – С. 741-749. Гулий М.Ф., Синицький В.М., Гула Н.М., Маргітич В.М. Вільні амінокислоти головного мозку при експериментальній опійній наркоманії у щурів // Архів психіатрії. ? 2001. ? № 1-2 (24-25). ? С. 76-77. Гула Н.М., Маргітич В.М., Коваленко В.М., Корнієнко Т.М., Семикопна Т.В., Клімашевський В.М., Жуков О.Д., Артамонов М.В. Жирні кислоти мембран еритроцитів за ішемічної хвороби серця // Укр. біохім. журн. – 2001. – Т. 73, № 6. – С. 134-137. Артамонов М.В., Жуков О.Д., Маргітич В.М., Клімашевський В.М., Гула Н.М. Вплив екзогенного N-стеароїлетаноламіну на жирнокислотний склад індивідуальних фосфоліпідів ізольованого серця щурів за умов постішемічної реперфузії // Укр.біохім.журн. – 2002. – Т. 74, № 2. – С. 86-94. Gula N.M., Zyn’kovskii M.F., Artamonov M., Margitich V., Klimashevskii V., Zhukov A. Changes of the children myocardium lipid composition under surgical intervention by the use of cold crystalloid cardioplegia // Biomedical Research. – 2002. – Vol. 23, N 6. – P. 241-248. Bazyka D., Chumak A., Byelyaeva N., Gulaya N., Margitich V., Thevenon C., Guichardant M., Lagarde M., Prigent A.-F. Immune cell in Chernobyl radiation workers exposed to low dose irradiation // Int. J. of Low Radiation. – 2003. – Vol. 1, N 1. – P. 63-75. Маргітич В.М. Сигнальна трансдукція ? приваблива мішень для інноваційних протипухлинних препаратів // Укр.мед. часопис. ? 2003. ? № 2 (34). ? С. 6-13. Маргітич В.М., Гула Н.М., Тронько М.Д., Лучицький Є.В., Кобяков С.К., Горідько Т.М. Зв’язок між функційною активністю щитоподібної залози, ліпідами сперми та чоловічою неплідністю // Ендокринологія. – 2004. ? Т. 9, № 2. – C. 239-243. Гула Н.М., Маргітич В.М., Артамонов М.В., Жуков О.Д., Горідько Т.М., Клімашевський В.М. Нейропротекторний ефект N-ацилетаноламінів за хронічної морфінної залежності. І. Фосфоліпіди головного мозку щурів як мішень для іхньої дії // Укр. біохім. журн. – 2004. – Т. 76, № 5. – С. 123-131. Гула Н.М., Гулий М.Ф., Харченко Н.К., Горідько Т.М., Маргітич В.М. Нейропротекторний ефект N-ацилетаноламінів при хронічній морфінній залежності. ІІІ. Вплив на вміст нейромедіаторів у головному мозку щурів.// Укр. біохім. журн. – 2005. – Т. 77, № 1. – С. 41-51. Gulaya N., Frolkis V., Goridko T., Pugach B., Margitich V., Govseeva N., Klimashevsky V. Cardioprotective effect of long-chain N-acylethanolamines (NAE) in ishemic heart // 1st Congress of the European Association for Clinical Pharmacology and Theurapeutics. ? Paris (France). ? Therapie. ? 1995. ? Suppl. ? P. 251. Shagidulin M.U., Gulaya N.M., Margitich V.M., Govseeva N.M., Goridko T.V., Klimashevsky V.M., Andreyeshchev S.A. Free-radical induced alteration of the phospholipid composition of the rat liver during reperfusion of preserved organ by HTK solution // 12th Annual Meeting and 1st International Conference of the Academy of Surgical Research. ? Muenster (Germany). ? J. Investigative Surgery. ? 1996. ? Vol. 9. ? P. 37. Чижикова О.А., Маргітич В.М. Порушення фосфоліпідного складу сперматозоонів за неплідних станів у чоловіків // Мат. Всеукраїнської науково-методичної конференції “Хімічні науки і сучасність”. ? Полтава: Освіта, 1999. ? С. 30-31. Гула Н.М., Говсеєва Н.М., Клімашевський В.М., Жуков О.Д. Маргітич В.М. Вплив хронічного введення морфіну на ліпідний склад мозку щурів // Тези доп. VII Українського біохімічного з’їзду. Київ (Україна), 1997. ? С. 126-127. Gulaya N., Margitich V., Kliamashevsky V., Govseeva N., Tronko M. Phospholipids in human thyroid carcinoma // 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology. ? San Francisco, California (USA), 1997. ? P. 3330. Margitich V.M., Thevenon C., Guichardant M., Lagarde M., Prigent A.-F., Chumak A.A., Bazyka D.A. Gulaya N.M. 12-hydroxyeicosatetraenoic acid (12-HETE) influences the immune function in the late period after radiation exposure // 3rd Congress of the International Society for the Study of Fatty Acids and Lipids. ? Lyon (France). ? 1998. ? P. 225. Margitich V.M., Gulaya N.M., Dacenko Z.M. N-acylethanolamiones restore the fertile potential of male rats with ionizing irradiation-induced sterility // 11th ESC Conference at the Charitй Berlin for medical students and young doctors. ? Berlin (Germany), 2000. ? P. 163. Маргітич В.М., Жебровська Ф.І. Глобальний біотехнологічний сектор та сучасна стратегія створення інноваційних лікарських засобів // Міжнародний медико-фармацевтичний конгрес “Ліки та життя”. ? Київ (Україна), 2004. ? С.48-49. Гула Н.М., Маргітич В.М. Ліпідоміка ? новий напрямок медико-біологічної науки // Наука та наукознавство. ? 2004. ? № 3 (45). ? С. 62-67. АНОТАЦІЯ Маргітич В.М. Склад жирних кислот за умов патологічних станів та можливість його корекції під впливом N-ацилетаноламінів. ? Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук за спеціальністю 03.00.04 ? біохімія. ? Інститут геронтології АМН України, Київ, 2005. У дисертації, у відповідності до поставленої мети та завдань дослідження, представлено нові дані стосовно біохімічних особливостей порушення складу жирних кислот за умов гострих та хронічних патологічних станів. За умов хронічних патологічних станів у людини (ішемічна хвороба серця, артеріальна гіпертезія, рак щитоподібної залози), та щурів (морфінна залежність) зміни у складі жирних кислот відбуваються за певними закономірностями, що піддаються інтерпретації з позицій теорії гомовіскозної адаптації, ? підвищення вмісту поліненасичених жирних кислот (РUFA) компенсується зростанням рівня рівня загального / вільного холестеролу, а пониження вмісту моноєнових жирних кислот (MUFA) та РUFA, ? зниженням рівня загального / вільного холестеролу. Гострі патологічні стани супроводжуються підвищенням рівня вільних та естерифікованих у фосфоліпіди MUFA та PUFA, а також лізо-фосфатидилхоліну, яке, однак, не компенсується підвищенням рівня загального або вільного холестеролу. На підставі проведених досліджень з використанням моделей патологічних станів запропоновано можливість застосування N-ацилеатаноламінів (NAE) для корекції дисбалансу ліпідів за умов гострої ішемії / реперфузії та морфінної залежності. При цьому NАE викликає перерозподіл MUFA та PUFA між різними класами ліпідів, а також запобігає деацилюванню фосфатидилхоліну з утворенням лізо-фосфатидилхоліну та вільних PUFA. Ключові слова: патологічні стани, гомовіскозна адаптація, жирні кислоти, фосфоліпіди, холестерол, N-ацилетаноламіни, ендоканнабіноїди. АННОТАЦИЯ Маргитич В.М. Состав жирных кислот при патологических состояниях и возможность его коррекции под влиянием N-ацилэтаноламинов. ? Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук по специальности 03.00.04 ? биохимия. ? Институт геронтологии АМН Украины, Киев, 2005 В диссертации, в соответствии с поставленной целью и задачами исследования, получены новые данные относительно биохимических особенностей нарушения состава жирных кислот при острых и хронических патологических состояниях. При хронических патологических состояниях у человека (ишемическая болезнь сердца, артериальная гипертензия, рак щитовидной железы) и крыс (морфинная зависимость) изменения в составе жирных кислот происходят по определенным закономерностям, которые поддаются интерпретации с позиций теории гомовискозной адаптации, ? повышение содержания полиненасыщенных жирных кислот (РUFA) компенсируется увеличнием уровня общего / свободного холестерола, а снижение содержания мононенасыщенных жирных кислот (MUFA) и РUFA ? снижением уровня общего / свободного холестерола. Острые патологические состояния сопровождаются повышением уровня свободных и эстерифицированных в фосфолипиды MUFA, а также лизо-фосфатидилхолина, которое, однако, не компенсируется повышением уровня общего и свободного холестерола. На основании проведенных исследований с использованием моделей патологических состояний у подопытных животных предложена возможность применения N-ацилэтаноламинов (NAE) с целью коррекции дисбаланса липидов при острой ишемии, реперфузионном синдроме и морфинной зависимости. При этом NАE вызывает перераспределение MUFA и PUFA между различными классами липидов, а также тормозит деацилирование фосфатидилхолина с образованием лизо-фосфатидилхолина и свободных PUFA. Ключевые слова: патологические состояния, гомовискозная адаптация, жирные кислоты, фосфолипиды, холестерол, N-ацилэтаноламины, эндоканнабиноиды. SUMMARY Margitich V.M. Fatty acid composition under pathological conditions and its modulation by N-acylethanolamines. ? Manuscript. Thesis for Doctor of Medical Sciences degree on specialty 03.00.04 ? Biochemistry. ? Institute of Gerontology of the Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kyiv, 2005. During the last two decades the compelling evidences concerning the key role of lipids were collected as well as of fatty acids in the functional activity of living cell. Lipids play a crucial role as structural compounds of biological membranes, energy source in the cell, molecules that participate in cell signaling and membrane fusion, etc. The carbon chain length, quantity and localization of double bonds of fatty acid molecules predict the physico-chemical and biological properties of cellular membranes. Polyunsaturated fatty acids (PUFA) regulate the gene expressions and lipid synthesis machinery, including elongase and desaturase activity (M.T. Nakamura, T.Y. Nara, 2004 ). It is well known that PUFA are very susceptible to the free radical oxidation. Many pathological conditions are associated with the enhanced production of reactive oxygen species (ROS) and, as a consequence, with the accumulation of peroxidatively modified lipids. The theory of oxidative stress was proposed as a key factor of the pathogenesis of many illnesses, such as coronary artery disease (CAD), essential hypertension (EH), malignant diseases, etc. (J.K. Willcox, et al., 2004). Currently antioxidants are widely used for the prevention and treatment of mentioned above diseases. Unfortunately, the results of many randomized, double blind, placebo-controlled or comparative, multi-center studies did not confirm the clinical efficacy and safety of antioxidants under CAD and cancer (G. Bjelakovic, et al., 2004). On the other hand, lipid-lowering therapy is found to be beneficial for the prevention of acute coronary events and cardiovascular mortality (К.С. Ferdinand, 2004; S.M. Grundy, et al., 2004). Despite of the advances of hyperlipidemia management in CAD patients, the problem of alteration of the fatty acid composition and the functional role of fatty acids under pathological conditions remain poorly understood. Therefore scientists from USA have launched a special project to study the human lipidome in 2003. The main scope of this project is to carry out detailed qualitative and quantitative analysis of lipids in the cell with the aim to identify and decifer the mechanisms of lipid-lipid and lipid-protein interactions and their influence on the intracellular organelle fuction ( HYPERLINK "http://www.lipidmaps.org" www.lipidmaps.org , 2005). It is necessary to note, that the studies on the functional role of lipids were started at the Department of Lipid Biochemistry of the Institute of Biochemistry of the National Academy of Sciences under supervision of the Corresponding Member of the National Academy of Sciences, Doctor of Biological Sciences, Professor N.M. Gulaya two decades ago. It was shown that the increase of free cholesterol in the mammalian cell culture leads to the enhancement of the unsaturated phospholipids in the cellular membrane, and vice versa, the decrease of free cholesterol in the cell leads to the fall of the unsaturated phospholipids in the cellular membrane. Such regulation maintains the fluidity or viscosity of the cellular membrane unchanged. These findings are consistent to the theory of homeoviscous adaptation (M. Sinensky, 1980; J.R. Hazel, 1988). It seems that the homeoviscous adaptation, maintained by several reactions of deacylation / reacylation of phospholipids, elongation and desaturation of fatty acids etc., is an universal strategy of living organism for the adaptation to changing environment, even unfavorable conditions with the aim to survive. Taken together, the profound study of the common features of alteration of cellular fatty acid composition under acute and chronic pathological conditions have to be carry out to provide scientists by the rational target for the identification of the new biologically active lipids that could promote the homeoviscous adaptation and remodeling of phospholipids and fatty acids. N-acylethanolamines (NAEs) are derivatives of fatty acids that belong to endocannabinoids, ? a novel class of the naturally occurred compounds. NAEs are putative candidates to the biologically active lipids because of wide range of their biological and pharmacological properties. Teams of Professors N.M. Gulaya (Ukraine) and H.H.O. Schmid (USA) described NAEs for the first time in the damaged tissues of mammals in 1980. It was reported that the saturated fatty acyl- and oleoyl- NAEs accumulate within the infarcted area of myocardium. Authors hypothesized that the accumulation of NAEs can protect neighboring cells from injury. If it is the case, saturated long-chain NAEs have to modulate the physico-chemical properties of cellular membrane and the membrane-associated functions as well as its lipid composition. To my knowledge there are a shortage of scientific publications concerning the effect of NAEs on lipid composition of cell under pathological conditions. New data concerning the biochemical peculiarities of the fatty acid imbalance under acute and chronic diseases was received according to the aim and objectives of the study. Chronic diseases in humans (CAD, EH, thyroid carcinoma) as well as in rats (morphine dependence) are associated with alteration of fatty acid composition of biological tissues, cells and cellular membranes. These changes could be explained by the theory of homeoviscous adaptation. Thus, the increase of PUFA levels under CAD, EH and thyroid carcinoma is compensated by the increase of the amount of total / free cholesterol, and, vice versa, decrease of levels of both monounsaturated fatty acids (MUFA) and PUFA under morphine dependence ? by the decrease of total / free cholesterol. Acute pathologies associated with ischemia / repefusion are associated with the enhancement of the levels of free and esterified into phospholipids MUFA (oleic acid), PUFA (especially linoleic and arachidonic acids) and lyso-phosphatidylcholine. However these changes are not compensated by the elevation of the total or free cholesterol. Accumulation of the monohydroxilated derivatives of PUFA in immune cells could serves as an important mechanism of immune imbalance development induced by the influence of unfavorable environmental conditions, although the further investigation are needed. The results of our experiments on the animal models of pathology conditions such as acute liver and cardiac ischemia / reperfusion, morphine dependence etc., provide us an insight into the elaboration of new pharmacologically active lipid molecules that can modify the fatty acid imbalance. It was shown that NAE can facilitate the homeoviscous adaptation within the impaired tissues under acute pathological conditions (heart and liver ischemia / reperfusion) by the way of MUFA and PUFA redistribution among the certain lipid classes as well as by the inhibition of the lyso-phosphatidylcholine and free PUFA accumulation. Administration of the mixture of NAEs with saturated and unsaturated acyl chains leads to the restoration of total lipid and phospholipid content and redistribution of the fatty acid composition of the rat brain under morphine dependence. It is notable that NAEs induce the significant increase of n-3 PUFA content in phosphatidyl choline and phosphatidyl ethanolamine in the brain of the addicted animals. These changes are associated with the significant voluntary decrease of the morphine solution intake. One can conclude that the restoration of phospholipid and fatty acid composition of the rat brain under morphine dependents is associated with the attenuation of the morbid features in the experimental animals. It seems that the general mechanism of the beneficial effects of NAE includes at least three factors: modification of fatty acid and phospholipids composition of biological tissues, inhibition of free radical-induced lipid peroxidation and modulation of membrane-associated activities. Thus, lipids could serve as a rational target for new drug research and development, especially for those that could induce the fatty acid and phospholipid remodeling in the impaired tissues. We argue to use NAE for the correction / modulation of fatty acid and phospholipid composition under acute pathological conditions. The restoration of lipid content in the injured tissues is associated with the improvement of the clinical / paraclinical signs of certain model diseases. Key words: pathology conditions, diseases, homeoviscous adaptation, fatty acids, phospholipids, cholesterol, N-acylethanolamines, endocannabinoids PAGE \* Arabic 1 PAGE \* Arabic 23 PAGE \* Arabic 24 PAGE \* Arabic 25 PAGE \* Arabic 41

Похожие записи