НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К.ЗАБОЛОТНОГО

КЛОЧКО ВІТАЛІЙ ВІКТОРОВИЧ

УДК 615.331+57.083.1

Штам-продуцент антистафілококового антибіотика батуміну і його
біосинтетична активність

03.00.07 – мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі антибіотиків Інституту мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий
співробітник Кіпріанова Олена Андріївна, Інститут мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, провідний науковий
співробітник відділу антибіотиків

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, член-кор. НАН
України Мацелюх Богдан Павлович, Інститут мікробіології і вірусології
ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу генетики
мікроорганізмів

доктор медичних наук, старший науковий співробітник Поліщук Олена
Іванівна, Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В.
Громашевського АМН України, завідуюча лабораторії загальної
мікробіології

Провідна установа: Дніпропетровський національний університет,

кафедра мікробіології і
вірусології,

Міністерство освіти і науки України

Захист відбудеться “21” березня 2007 р. о 1000 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 по захисту докторських
дисертацій при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К.
Заболотного НАН України за адресою: Україна, Д 03680, Київ МСП, вул.
Заболотного, 154.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Д 03680, Київ
МСП, вул. Заболотного, 154.

Автореферат дисертації розіслано “_15_” лютого 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник
Пуріш Л.М.

Актуальність теми. Пошук і впровадження в медичну практику нових
антибіотиків і синтетичних антибактеріальних та противірусних препаратів
залишаються одним із важливих завдань сучасної біотехнології і медицини,
оскільки інфекційні захворювання займають одну з провідних позицій в
патології людини (Навашин, 1997). Починаючи з середини 90-х років ХХ ст.
тяжкі гнійно-септичні захворювання характеризуються змішаною структурою
збудників, а також значною питомою вагою у складі цих збудників
метицилінрезистентних стафілококів (MRSA) із зниженою чутливістю до
багатьох антибіотиків, що використовуються в клініці. У 40% випадків
стафілококова інфекція носить нозокоміальний характер, а назальне
носійство медичним персоналом госпітальних штамів стафілококів
перетворює хірургічні клініки, реанімаційні та акушерські відділення в
«стаціонари ризику» (Dagnra et al., 2001).

В цих умовах розробка засобів контролю стафілококової госпітальної
інфекції є однією з нагальних проблем сучасної медицини. В той же час
перелік препаратів, що використовуються для боротьби з назальним
носійством стафілококів, залишається вкрай обмеженим.

З наведеного вище випливає, що актуальним є дослідження батуміну –
антибіотика, ізольованого з бактерій роду Pseudomonas в Інституті
мікробіології і вірусології НАН України. Унікальна селективність
батуміну щодо представників роду Staphylococcus робить його препаратом
вибору для боротьби з назальним носійством і експрес-діагностики цього
патогену (Киприанова с соавт., 2005).

Проте впровадження цього оригінального вітчизняного антибіотика в
клінічну практику потребує відповіді на цілий ряд теоретичних і
прикладних питань – від встановлення таксономічного статусу продуцента і
закономірностей біосинтезу батуміну до виділення, очистки і оцінки
антимікробної активності антибіотика згідно сучасних міжнародних
стандартів.

Зв‘язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота
виконувалась згідно з напрямком науково-дослідних робіт відділу
антибіотиків Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного
НАН України за темами: «Еколого-таксономічні дослідження бактерій та
вищих рослин як ресурсів біотехнології» (2002-2004 р.р., державний
реєстраційний номер 0100U004324); «Дослідження біотехнологічних аспектів
синтезу антибіотика батуміна» (2004-2006 р.р., державний реєстраційний
номер 0104U003198 ); «Таксономічні та біотехнологічні дослідження
продуцентів біологічно-активних речовин» (2005-2006 р.р., державний
реєстраційний номер 0105U001082).

Мета і задачі дослідження. Метою нашої роботи було встановлення
закономірностей біосинтезу батуміну і характеристика його антимікробної
активності. Виконання цієї мети потребувало вирішення наступних завдань:

Таксономічне дослідження штаму-продуценту батуміну;

Аналіз закономірностей росту «Pseudomonas batumici» і біосинтезу
антибіотика в періодичній культурі;

Дослідження впливу компонентів поживного середовища на біосинтез
батуміну і оптимізація умов його біосинтезу;

Розробка методів визначення батуміну;

Оцінка антимікробної активності батуміну згідно сучасних міжнародних
стандартів.

Об’єктом дослідження був штам-продуцент антистафілококового антибіотика
«Pseudomonas batumici » 17, а також утворюваний ним антибіотик батумін.

Предметом дослідження були: таксономічний статус і умови підтримання
штаму-продуценту, закономірності розвитку штаму “P.batumici” і утворення
ним антибіотика, ізоляція, очистка, методи визначення і характеристика
антимікробної активності батуміну.

Методи дослідження. Для вирішення поставлених завдань, зокрема для
дослідження штама-продуцента і антибіотика батуміну, використовувалися
сучасні мікробіологічні, молекулярно-генетичні та фізико-хімічні методи.
В дослідах також використовували статистичні методи обробки даних.

Наукова новизна одержаних результатів полягає в тому, що :

Вперше методами поліфазного таксономічного аналізу досліджено
таксономічний статус “P.batumici” – продуцента нового антибіотика
батуміну;

Встановлено закономірності росту штаму “P.batumici” в періодичній
культурі та їх зв’язок з біосинтезом антибіотика;

Показана роль найважливіших макро- і мікроелементів в розвитку
“P.batumici” і синтезі батуміну; на основі отриманих даних оптимізовано
середовище для його біосинтезу;

Встановлені методи визначення батуміну в культуральній рідині і очищених
препаратах антибіотика;

Вперше із застосуванням прийнятих міжнародних стандартів і
референс-штамів охарактеризована антимікробна активність батуміну,
підтверджена його унікальна селективна активність відносно стафілококів.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані наукові дані щодо
закономірностей росту штаму-продуценту антибіотика батуміну, встановлені
оптимальні умови його утворення і біологічна активність, визначена за
міжнародними стандартами, можуть бути використані як основа нормативної
документації при впровадженні у виробництво і медичну практику
оригінального антистафілококового антибіотика.

Особистий внесок здобувача. Експериментальний матеріал, викладений у
дисертації, отримано автором самостійно під керівництвом д.б.н.
Кіпріанової О.А. Автором проведено поліфазний таксономічний аналіз
штаму “P.batumici”. Досліджено умови його культивування та біосинтезу
батуміну при періодичному процесі. Досліджено вплив ряду макро- і
мікроелементів на біосинтетичну здатність штаму-продуценту, на основі
чого оптимізовано склад поживного середовища. Розроблено методи
визначення концентрації батуміну згідно рекомендацій Державної
Фармакопеї України. Розроблено методи виділення і очищення антибіотика
батуміну, встановлено його антимікробний спектр та ступінь активності
згідно сучасних міжнародних стандартів CLSI.

Робота з дослідження умов культивування штаму-продуценту антибіотика на
ферментерах проводилась здобувачем в м. Гент (Бельгія) на факультеті
агробіотехнології Гентського університету. Дослідження фізико-хімічних
властивостей батуміну (аналіз ЯМР-спектру і оптичного кута обертання)
проводились на базі відділу хімії фторорганічних сполук Інституту
органічної хімії НАН України. Сіквенс фрагменту 16S рРНК штаму
“P.batumici” проведено за участю к.б.н., с.н.с. відділу антибіотиків
Інституту мікробіології і вірусології НАН України Реви О.М. Розрахунок
економічних коефіцієнтів і коефіцієнтів біосинтетичної здатності, а
також розрахунок співвідношення С/N при оптимізації поживного середовища
проведено за участю д.б.н., проф., пр.н.с. Інституту мікробіології і
вірусології НАН України Пирог Т.П.

Формулювання основних положень, постановка завдань, обговорення
одержаних результатів та їх узагальнення, підготовка публікацій за
результатами досліджень проведені особисто автором під керівництвом
д.б.н. Кіпріанової О.А.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи були
представлені на Міжнародній науково-практичній конференції «Мікробні
біотехнології» (м. Одеса, 11-15 вересня 2006 р. ); на VI-й міжнародній
конференції фармацевтів України (м. Харків, 28-30 вересня 2005 р. ); на
міжнародних конференціях для молодих вчених «Молодь і досягнення у
вирішенні проблем сучасності» (м. Чернівці, 2-3 листопада 2005 р. і 31
жовтня – 1 листопада, 2003 р.), на міжнародних науково-практичних
конференціях «Биология – наука XXI века» (м. Пущіно, Росія, 17-21 травня
2004 р. і 14-18 квітня, 2003 р.), на конференції молодих вчених
Інституту мікробіології і вірусології НАН України ( м. Київ, 4-6 грудня
2006 р. та 10-12 грудня 2002 р.).

На ІV-му конкурсі науково-технічних проектів “Інтелектуальний потенціал
молодих вчених – місту Києву” (2004 р.) робота “Дослідження основ
біосинтезу нового високоактивного антистафілококового антибіотика
батуміну”, автором якої був дисертант, була відзначена першою премією
Київської міської державної адміністрації.

Публікації. Результати дисертаційної роботи представлені в трьох
статтях, опублікованих у наукових профільних журналах та в 6 тезах,
опублікованих за результатами конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 140
сторінках машинописного тексту і складається з розділів «Вступ», «Огляд
літератури», «Матеріали і методи дослідження», «Результати досліджень та
їх обговорення», «Заключення», «Висновки», «Список використаних джерел»,
який містить 170 посилань, з них – 100 іноземних авторів. Робота містить
20 таблиць та 31 рисунок.

РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Огляд літератури складається з 4 підрозділів, в першому з яких
описуються антибіотичні речовини, виділені з бактерій роду Pseudomonas,
в другому – закономірності їх біосинтезу. Третій підрозділ присвячено
псевдомоновій кислоті та її застосуванню для боротьби зі стафілококовою
інфекцією. В четвертому підрозділі наводяться дані щодо структури
батуміну, механізму його дії та перспектив використанні в медичній
практиці.

РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Об’єктом дослідження був штам «Pseudomonas batumici» 17, одержаний
шляхом мутагенезу, захищений патентом України (Пат. 23609А, 1998) і
підтримуваний у відділі антибіотиків Інституту мікробіології і
вірусології НАН України. Для дослідження спектру дії і активності
антибіотика батуміну використовували міжнародні референс-штами
тест-мікроорганізмів з Української колекції мікроорганізмів (УКМ),
зокрема грампозитивні (в тому числі анаеробні) та грамнегативні
бактерії, а також гриби, включаючи дріжджі. Використані штами є загально
прийнятими у світовій практиці для оцінки антимікробної дії
антибіотиків, і включені в Фармакопеї всіх розвинених країн.

Методи культивування. Культивування штама «P.batumici» – продуцента
батуміну проводили в колбах Ерленмейера, об’ємом 750 мл, в які вносили
50-100 мл поживного середовища, на круговій качалці (частота обертів –
220 об/хв), при температурі – 25(С протягом 72 годин. Концентрацію
біомаси визначали за оптичною густиною клітинної суспензії з наступним
перерахунком на абсолютно суху вагу клітин у відповідності з
калібрувальним графіком (Пирог, 2003).

Процес ферментації проводили на ферментерах «Biostat М» (Німеччина):
об’єм поживного середовища – 1,5 л; ступінь аерації – 1,0; доза
інокулюму — 1%; температура – 25(С; час культивування – 65 годин.
Частоту обертів мішалки ферментеру змінювали від 250 до 700 об/хв.

Методи оптимізації поживного середовища. Поживне середовище оптимізували
за вмістом джерел вуглецевого, азотного і фосфорного живлення.
Використовували метод ортогональних латинських прямокутників – 6
факторів (сполук) на 4-х рівнях (концентраціях). Також визначали
оптимальне для синтезу батуміну співвідношення С/N. Досліджували вплив
макро- і мікроелементів та деяких джерел вуглецю на синтез антибіотика.
Розрахунок показників, які характеризують кількісні співвідношення між
вихідними компонентами середовища та кінцевими продуктами розраховували
за методами, наведеними в літературі (Иванов с соавт., 1987).

Методи визначення концентрації батуміну. Для кількісного визначення
антибіотика батуміну застосовували біологічний і фізико-хімічний методи
(Державна Фармакопея України, 2001). Біологічне визначення активності
батуміну проводили методом дифузії в агар (тест-мікроорганізм –
Staphylococcus aureus 6539P); фізико-хімічне – спектрофотометрією
спиртового розчину батуміну, отриманого елюцією з хроматографічної
пластини, при довжині хвилі 225 нм (максимум поглинання батуміну).

Методи виділення і очистки батуміну. Культуральну рідину «P.batumici»
екстрагували хлороформом (1:2). Одержаний екстракт випарювали під
вакуумом та розчиняли в ацетоні. Препаративну хроматографію проводили на
колонці; як тверду фазу використовували силікагель та систему
бензол:ацетон (1:1) як елюент. Розділення на колонці вели методом елюції
наведеною вище системою. Швидкість елюції, а також об’єми відібраних
фракцій були постійними. Вихід батуміну з колонки контролювали за
допомогою тонкошарової хроматографії на пластинах «Silufol» з подальшою
візуалізацією пластин парами йоду. Всі активні фракції об’єднували та
випарювали під вакуумом.

Методи дослідження ПМР батуміну і кута оптичного обертання. Метод
протоно-магнітного резонансу (ПМР): розчинник – дейтеріоацетон;
внутрішній еталон – тетраметилсилан; концентрація зразка в пробі – 30
мг/мл; температура зразка: плюс 25(С. Вимірювання проводили на приладі
«Varian 300» при радіочастоті 300 МГц. Отримані дані обробляли за
допомогою комп’ютерної програми «NUTS NMR Data Processing Program»,
отримували графічне відображення сигналів ПМР та порівнювали їх з
теоретично-розрахованим за допомогою програми «ChemDrawUltra», виходячи
з структурної формули батуміну.

Вимірювання кута оптичного обертання батуміну проводили за допомогою
поляриметру «Atago Polax-2 L» (готували 1% розчин очищеного антибіотика
в метанолі).

Методи визначення антимікробної активності батуміну. Активність
батуміну визначали за сучасними міжнародними стандартами CLSI (Wikler
et al., 2005), використовуючи, згідно методики, агар Мюллера-Хінтона
(МХА) та референс-штами тест-мікроорганізмів, включені в CLSI.

Фено- і генотипові методи дослідження. Фенотипові дослідження
«P.batumici» проводилися за основними характеристиками, що
використовуються при ідентифікації псевдомонад: окислення глюкози,
оксидазна реакція, встановлення спектрів вуглецевого живлення та інші.
(Смирнов, 1990). Також було проведено сіквенс гену 16S рРНК, тобто для
встановлення статусу «P.batumici» було використано метод поліфазного
таксономічного аналізу.

Статистична обробка результатів. Всі досліди проводили у 3-5 повтореннях
для отримання достовірних результатів, які обробляли статистичними
методами аналізу (Лакин, 1990).

Розділ 3. Результати досліджень та їх обговорення.

Штам «Pseudomonas batumici» – продуцент антибіотика батуміну.
Штам-продуцент антибіотика батуміну – «P.batumici» виділений
співробітниками ІМВ НАНУ з грунтового зразка (Кіпріанова, 1974).
Фенотипове дослідження продуцента і аналіз його властивостей на перших
етапах роботи свідчили про його належність до роду Pseudomonas. Метою
наших досліджень була детальна характеристика фенотипових властивостей
«P.batumici» і аналіз його таксономічного статусу з використанням
сучасних методів генетичного аналізу. Був проведений сіквенс
гіперваріабельної ділянки гену 16S рРНК (довжина фрагменту – 396 п.н.).
За даними сіквенсу встановлено, що дослідженій ділянці гену «P.batumici»
відповідали п’ять різних видів псевдомонад, фенотипові властивості яких
наведено в таблиці 1; рівень ідентичності становив 99%.

Таблиця 1

Характеристика «P.batumici» і генетично близьких видів роду
Рseudomonas

Фенотипова

ознака Назва виду

P.

batumici P.

gingeri P.

putida P.

asplenii P.

fuscovaginae P. oryzihabitans

Кількість джгут. 1-5 2-4 2-5 1-3 1-4 1

Флуоресц.пігм. — + + + + —

Оксидаза + + + н/о + —

Денітрифікація — — — — — +

Гідроліз

ідроліз

Желатину — н/о — + + —

Твіну 80 — н/о — н/о + —

Крохмалю — н/о — — + —

Засвоєння:

D-ксилози — + — + н/о +

L -арабінози + — — + + +

D-маннози + + — н/о н/о +

D-галактози + + — + н/о +

cахарози + — — + н/о —

трегалози + + — н/о + +

мальтози — — — + н/о +

лактози — — — + н/о —

ацетату — + + н/о н/о +

пропіонату — + + н/о н/о н/о

валеріату — + + н/о н/о н/о

тартрату — + + н/о н/о н/о

ітаконату + + — н/о н/о н/о

маніту + + — н/о н/о н/о

сорбіту — + — н/о — +

інозиту + + — н/о — +

адоніту — н/о — н/о + —

о-оксибензоату — + — н/о н/о —

гіпурату — н/о + н/о н/о н/о

креатину — — + н/о н/о н/о

cаркозину + — + н/о н/о н/о

L -серину — + + н/о н/о н/о

L-лейцину — + + н/о н/о н/о

L-лізину — + + н/о н/о н/о

Примітка.»+» – наявність ознаки; » – » – відсутність ознаки; «н/о» –
даних в літературі не опубліковано.

Аналізуючи наведені дані (табл.1), можна зробити висновок, що всі п’ять
видів роду Pseudomonas істотно відрізняються від «P.batumici» за
фенотиповими властивостями. Також у цих видів відсутнє і
антибіотикоутворення. Наведені вище дані дозволяють припустити, що штам
«P.batumici» являє собою новий вид роду Pseudomonas. Оскільки Комітет з
узгодження підходів в систематиці бактерій рекомендує у суперечних
випадках надавати перевагу саме результатам фенотипового аналізу
(Approved list…,1980) то отримані дані дозволяють прийти до висновку,
що «P.batumici» еволюційно близький до флуоресціюючої групи і очевидно
являє собою новий вид роду Pseudomonas.

Встановлення параметрів культивування «P.batumici».

Дослідження нових антибіотиків неможливе без аналізу факторів, що
впливають на рівень біосинтетичної активності продуцента. Тому нами були
вивчені параметри культивування, а саме температура, аерація, рН
середовища.

Залежність росту «P.batumici» та синтезу батуміну від температури
представлена на рис. 1. Штам-продуцент не розвивався при досліджених
граничних температурах 6 та 39(С, причому остання температура призводила
до загибелі клітин.

Рис. 1. Вплив температури на ріст «P.batumici» і біосинтез батуміну.

В цілому ріст «P.batumici» і біосинтез батуміну відбуваються в
діапазоні температур – від 10 до 35(С, однак оптимум синтезу батуміну
спостерігається при t=25(С.

Дані щодо впливу аерації на ріст «P.batumici» та синтез антибіотика
наведені в табл. 2.

Таблиця 2

Ріст «P.batumici » і біосинтез батуміну в залежності від масопереносу
кисню

Кv, гО2/л(год 1,0 0,70 0,60 0,50 0,45 0,30 0,25 0,20

Об’єм п.с.

в колбах, мл 25 40 50 65 75 120 150 200

Біомаса, г/л 7,70

(0,4 8,30

(0,42 8,50

(0,44 7,20

(0,36 7,0

(0,35 6,90

(0,35 6,50

(0,32 5,90

(0,30

Концентрація

батуміну,мг/л 110,0

(5,5 120,1

(6,2 125,3

(6,5 95,2

(5,0 90,0

(5,0 85,4

(4,3 75,2

(3,5 55,0

(2,8

Виходячи з наведених даних, можна сказати, що ріст «P.batumici» в доволі
широких діапазонах мало залежить від умов аерації. На синтез
антибіотика, на відміну від росту бактерій, аерація середовища впливала
значно суттєвіше. Так, при значеннях Кv = 0,6-1,0 г О2/л(год
спостерігалось максимальне антибіотикоутворення. У разі зменшення
значень Кv відбувалось поступове зниження концентрації батуміну в
культуральній рідині.

Результати досліджень з культивування «P.batumici» при різних значеннях
рН наведені в табл. 3.

Таблиця 3

Ріст «P.batumici» і біосинтез батуміну при різних значеннях рН
середовища

Значення рНпочаткові 4,5 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0

Значення рНкінцеві 4,8 5,7 6,5 7,2 7,8 8,6

Біомаса, г/л 0,1

(0,01 4,9

(0,25 7,5

(0,37 8,3

(0,55 6,9

(0,30 0,07

(0,01

Концентрація

батуміну,мг/л 0 40

(3,0 115

(6,2 120

(6,4 95

(5,2 0

Ріст «P.batumici» і синтез батуміну знаходяться в прямій залежності від
рівня рН. При значеннях рН 4,5 і 9,0 батумін не синтезується, оскільки
при цих умовах «P.batumici» практично не розвивається. При значеннях
рН, близьких до нейтральних, ріст культури та концентрація батуміну були
максимальними. При відхиленні від нейтральних значень ріст і синтез
антибіотика поступово знижувалися.

Оптимізація поживного середовища.

Оптимізація поживного середовища проводилася нами з метою отримання
максимально простого поживного середовища, яке б забезпечувало
стабільний вихід батуміну з мінімальною кількістю домішок. За основу для
оптимізації, як контроль, брали розроблене у попередні роки поживне
середовище (Пат. 23609А, 1998). Використовували метод ортогональних
латинських прямокутників, з подальшим розрахунком ефектів впливу. На
основі розрахованих ефектів (табл. 4), обираючи з них максимальні
значення та відповідні їм значення концентрацій компонентів,
встановлювали оптимізований таким чином склад поживного середовища.

З метою подальшої оптимізації було встановлене співвідношення С/N. Для
оцінки ефективності того чи іншого джерела розраховували економічний
коефіцієнт (Y) та коефіцієнт біосинтетичної здатності (Q).

Таблиця 4

Ефекти впливу компонентів середовища на ріст «P.batumici»

Компоненти поживного середовища

Глюкоза Сечовина KNO3 K2HPO4 NaCl MgSO4

г\л Ефект г\л Ефект г\л Ефект г\л Ефект г\л Ефект г\л Ефект

10

-13,9 0 -11,9 0 -9,2 0 -28 0 -3,5 0 -35,8

15

11,0 0,5 -8,4 1,0 -2,4 0,5 10,8 0,5 -7,2 0,25 23,1

30

7,2 1,0 17,5 1,5 9,0 1,0 6,5 1,0 -5,9 0,5 12,8

45

-4,2 1,5 -0,2 2,0 -9,2 1,5 10,7 1,5 17,3 0,75 -0,1

Серед ряду досліджених сполук найбільш ефективними виявилися глюкоза,
сечовина і нітрат калію. Було показано, що при співвідношенні C:N=10:1
(табл.5) коефіцієнт біосинтетичної здатності був найбільшим. Причому як
нітрат калію, так і сечовина мали приблизно рівні показники коефіцієнту
біосинтетичної здатності.

Таблиця 5

Економічні коефіцієнти (Y) та коефіцієнти біосинтетичної здатності (Q)
при різних співвідношеннях C:N

Джерела вуглецю

і азоту C:N=10:1 C:N=15:1 C:N=20:1

Y,% Q,% Y,% Q,% Y,% Q,%

C6H12O6+KNO3 18,8 38,2 15,1 29,2 11,7 27,1

C6H12O6+(NH2)2CO 29,2 37,4 22,2 30,0 13,7 26,8

C6H12O6 +(NH2)2CO

+KNO3 38,0 33,5 32,9 31,1 23,0 26,0

Оптимальним був варіант, де азотне живлення культури забезпечувалось
сечовиною, оскільки вона є доступною і дешевшою за нітрат калію. Також
для забезпечення культури азотом сечовини потрібно майже в 4 рази менше,
ніж нітрату калію.

Поетапною оптимізацією було отримано середовище наступного складу (г/л):
глюкоза – 15; сечовина – 1,3; K2HPO4 – 0,5; NaCl – 0,5; MgSO4 – 0,25,
яке забезпечувало не тільки збільшення біосинтезу батуміну, але й
мінімальну кількість баластних речовин.

До сполук, що мають вплив на мікроорганізми також відносять різні
органічні кислоти та амінокислоти. У літературі є багато даних щодо
впливу цих сполук на біосинтез різних антибіотиків, утворюваних
бактеріями (Егоров, 1994; Жарикова, 1979; Віпияч, 1970). Нами був
проведений ряд експериментів, в яких вивчався вплив органічних кислот,
що відносяться до різних класів, на біосинтез батуміну.

i

?

?

TH

a

i

?

?

?

`„

Ue-TH U#’&?+@-®-z.oiiaOOOIIIIIIAAAAAA??

&

^„7

&

&

&

a$

a$

`„Aa$

>?F?N?V?`?h?r?t?z?|?†????? ?????1/4?Ae?I?O?a?ae?ae?T¶ooooooiaaoooooooooo
oYNN

ер, 1976), тому можна припустити, що ці речовини також приймають певну
участь в синтезі молекули батуміну. До другого класу відносяться –
капронова, пропіонова, бурштинова – кислоти, що не впливали на
біосинтетичну здатність культури; до третього класу– оцтова, сорбінова,
акрілова і пеларгонова кислоти – сполуки, наявність яких в поживному
середовищі повністю пригнічувала розвиток продуцента.

На останньому етапі роботи з оптимізації параметрів культивування і
поживного середовища було досліджено періодичний процес росту
«P.batumici» при його вирощуванні на колбах, і біосинтезу батуміну у
встановлених оптимальних умовах (рис.2).

Рис. 2. Біосинтез батуміну в оптимізованих умовах культивуання

Максимуми накопичення біомаси і біосинтезу антибіотика, як в контролі,
так і в оптимізованих умовах, припадали на третю добу культивування.
При цьому було досягнуто зростання синтезу батуміну, порівняно з
контролем, більш ніж у два рази.

Біосинтез батуміну в умовах ферментеру.

Всі попередні дослідження були проведені нами при глибинному
культивуванні на колбах. Нашим подальшим завданням було одержання
батуміну і вивчення закономірностей його біосинтезу в умовах ферментеру.

Було встановлено, що при вирощуванні «P.batumici» в умовах ферментера,
як і при вирощуванні в колбах, біосинтез батуміну відбувається
паралельно з накопиченням біомаси (рис.3). На сьому годину культивування
біомаса продуцента починала зростати, а після 28 годин наступала
логарифмічна фаза розвитку культури. В стаціонарну фазу штам-продуцент в
ферментері виходив значно швидше, ніж при його культивації в колбах, а
саме через 45 годин (в колбах – через 65 годин). Після 50-55 годин
ферментації відбувалося поступове зниження концентрації клітин в
культуральній рідині, тобто в умовах ферментера штам «P.batumici»
повністю проходив усі стадії свого розвитку за 2-2,5 доби на відміну від
його вирощування в колбах, де весь процес займав 3-3,5 доби.

Щодо накопичення батуміну, то тут можна відмітити певні цікаві моменти.
Більшість антибіотиків є тими метаболітами, що починають
накопичуватись у фазі затримки росту мікроорганізмів (Егоров, 1994;
Навашин, 1970). Культура «P.batumici» є виключенням з цього правила.

Так, вже через 6-8 годин ферментації починався процес виділення батуміну
в культуральну рідину. При цьому нерозведена культуральна рідина давала
зону затримки росту тест-культури діаметром 15-20 мм. Протягом
наступних 30 годин концентрація антибіотика зростала. При переході
культури в стаціонарну фазу, тобто після 50-55 годин росту,
концентрація батуміну залишалася сталою.

Встановлені закономірності вказують на те, що антибіотик батумін є тим
екзометаболітом, біосинтез якого проходить паралельно з розвитком
культури.

Рис. 3. Ріст «P.batumici» і синтез батуміну в умовах ферментера.

Максимальна концентрація батуміну в культуральній рідині при вирощуванні
«P.batumici» в умовах ферментеру спостерігалась через 55 годин і
становила 175-180 мг/л.

Методи визначення концентрації батуміну та їх порівняльна
характеристика.

Одним із важливих етапів впровадження антибіотиків в медичну практику
є розробка методів їх кількісного визначення, яке здійснюють різними
методами: біологічними та фізико-хімічними. Кожен з цих методів має
свої переваги і недоліки та використовується для певних цілей. Нами була
перевірена можливість використання біологічного (метод дифузії в агар)
та фізіко-хімічного (спектрофотометричного) методів визначення батуміну
та проведений їх порівняльний аналіз.

На першому етапі роботи з очищеного препарату батуміну готували розчини
з заданим рядом концентрацій і визначали їх же за цими методами. Дані
досліду наведено в табл.6.

Експериментальні дані вказують, що визначені в дослідах значення
концентрацій, виміряних за допомогою цих методів, досить точно
відповідали початково заданим.

Таблиця 6

Визначення концентрації в очищених препаратах батуміну

Задані

концентрації, мг/л Визначені в досліді концентрації, мг/л

Фізико-хімічний

метод (спектрофотометрія) Біологічний

метод ( дифузія в агар)

4,0 3,9(0,2 4,2(0,21

6,0 5,7(0,29 6,1(0,30

7,5 7,8(0,31 7,7(0,32

10,0 10,4(0,53 1,6(0,55

15,0 14,6(0,65 15,3(0,8

20,0 20,4(0,9 20,5(1,0

Це підтверджує рівноправність і правомірність застосування як
біологічного, так і фізико-хімічного методів для кількісного визначення
батуміну в очищених препаратах.

Обидва методи були застосовані для встановлення концентрації антибіотика
в культуральній рідині. Був проведений ряд однакових за умовами
дослідів, в ході яких визначали біосинтетичну активність «P.batumici».
Як видно з табл.7, встановлені значення концентрацій батуміну суттєво
залежали від обраного методу його визначення.

Таблиця 7

Визначення концентрації батуміну в культуральній рідині

№№ дослідів Визначені концентрації, мг/л

Фізико-хімічний

метод (спектрофотометрія) Біологічний

метод (дифузія в агар)

1 205,4(10,3 350,0(12,2

2 108,4(3,3 270,4(12,7

3 199,8(8,0 400,0(18,3

4 267,6(11,0 310,0(10,2

5 220(10,8 320,5(11,8

З наведених результатів випливає, що біологічний метод визначення
батуміну в культуральній рідині «завищував» показники концентрації
антибіотика в 1,5-2 рази порівняно з фізико-хімічним. Причиною цих
розходжень може бути наявність в культуральній рідині «P.batumici»
інших, крім батуміну, антимікробних речовин, здатних підвищувати
активність культуральної рідини щодо стафілококів.. Зокрема це
феназин-1-карбонова кислота (Кіпріанова, 1974) та ряд мінорних
компонентів батуміну (Есипов, 1982). , близьких до нього за хімічною
структурою. Зазначимо, що біологічний метод, згідно Державної Фармакопеї
України, використовується тільки для кількісного визначення стандартних
розчинів високо очищених антибіотиків і в чітко визначеному інтервалі
концентрацій.

При фізико-хімічному визначенні концентрації батуміну, культуральна
рідина «P.batumici» проходить цілий ряд етапів обробки (екстракція,
випарювання, хроматографія, елюція), в ході яких можливі часткові втрати
батуміну і як наслідок – занижені дані концентрацій.

З аналізу даних можна зробити висновок. За наявності значної кількості
варіантів досліду найбільш простим в технічному плані методом визначення
концентрації батуміну є біологічний метод, який дозволяє обрати з усіх
варіантів експерименту найкращий. Проте гарантовані значення активності
штаму-продуценту можуть бути одержані лише фізико-хімічним
(спектрофотометричним) методом.

Виділення і очищення батуміну.

Поряд з ферментацією, одним з важливих етапів виробництва антибіотиків
є процес їх виділення та очищення, необхідний для отримання
препаративних форм та оцінки активності. Очистку батуміну проводили
методом препаративної колонкової хроматографії за наступною схемою
(рис.4).

Отримана з колонки сполука була перевірена на відповідність структурі
батуміну фізико-хімічними та біологічними методами. Встановлено, що пік
поглинання в УФ-спектрі дорівнював 225 нм, показник Rf 0,45-0,46.

Культивування «P.batumici »

(t=25(С, (=72 год, рН(6,5-7,2,(=220 об/хв)

Культуральна рідина

Екстракція хлороформом,

осушування Na2SO4(безводним)

Вакуум-випарювання, отримання екстракту

Колонкова хроматографія екстракту

(силікагель, елюція – ацетон:бензол (1:1))

Вакуум-випарювання активних фракцій

Повторна хроматографія на колонці

Очищений на 90% батумін (масло)

Рис.4. Схема виділення і очищення батуміну.

Результати ПМР-аналізу показали співпадіння між теоретичними
(розрахованими на комп’ютері, виходячи з структурної формули батуміну) і
експериментальними (виміряними на приборі ПМР) даними. В
експериментально отриманому ПМР-спектрі, як і в теоретично
розрахованому, найбільша інтенсивність сигналів спостерігалась в районі
2, 3-4 і 6 мільйонних долей хімічного зсуву. Кут оптичного обертання
становив: мінус 13,5°. Антистафілококова активність речовини знаходилася
в межах – 0,2-0,5 мкг/мл. Аналіз за цими методами сполуки, отриманої
з хроматографічної колонки, однозначно вказував на її відповідність
антибіотику батуміну.

Спектр антимікробної дії батуміну.

Успіхи в дослідженні антимікробних речовин, прогрес медицини і
біотехнології стали основою для створення уніфікованої міжнародно
визнаної методології оцінки активності антибіотиків – CLSI (Clinical and
Laboratory Standards Institute). Було охарактеризовано антимікробний
спектр батуміну згідно сучасних стандартів CLSI.

Оскільки для батуміну характерна висока антистафілококова активність
(Чуркіна, 1987; Смирнов, 1999), то, перш за все, вивчався його вплив на
стафілококи за методами CLSI на поживних середовищах МХА та МПА.
Результати наведено в табл. 8.

Таблиця 8

Активність батуміну щодо бактерій роду Staphylococcus (CLSI)

№ п/п

Назва штаму і його номер УКМ МПК, мкг/мл

МХА МПА

1 S. aureus B-904 0,25 0,125

2 S.aureus B-4001 0,25 0,0625

3 S. aureus B-918 0,25 0,0625

4 S.aureus B-909 0,25 0,0625

5 S. capitis B-4002т 0,25 0,0625

6 S. chromogenes B-4003т 0,5 —

7 S.cohnii B-4004т 0,25 0,0625

8 S. epidermidis B-919 0,25 0,0312

9 S. intermedius B-4009т 0,5 0,125

10 S. lentus B-4010т 0,25 0,0625

11 S. saprophyticus B-4011т 0,25 0,0625

12 S. sciuri B-4012т 0,5 —

13 S. xylosus B-4014т 0,25 0,0625

Примітка: «-» – не досліджували; т – типовий штам.

Отримані дані підтвердили високу антистафілококову активність батуміну.
На більшість представників цього роду антибіотик діяв при концентрації
0,25 мкг/мл (середовище МХА). Бактерицидні концентрації батуміну були
близькі або співпадали з бактеріостатичними.

Активність батуміну залежала від обраного середовища для вирощування
стафілококів – на МПА вона була в 2-4 рази вищою, ніж на МХА. Відомо,
що активність антибіотиків залежить від складу поживних середовищ для
культивування тест-штамів мікроорганізмів – певні білки, амінокислоти і
інші сполуки, що входять до складу цих середовищ, зв’язуючись з
біологічно активними групами антибіотиків, інактивують їх, знижуючи при
цьому рівень МПК (Дмитриева с соавт., 1965).

Результати дослідження активності батуміну щодо широкого спектру
мікроорганізмів, встановлені титрацією на агарі Мюллера-Хінтона,
наведені в табл. 9.

Дані свідчать, що переважна більшість досліджених мікроорганізмів були
стійкими до батуміну, хоча ріст деяких ентеробактерій (Klebsiella
pneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Escherichia coli) гальмувався
при концентрації антибіотика 8-16 мкг/мл. Нами була вперше досліджена
дія батуміну на анаеробні мікроорганізми – спороутворюючі клостридії,
які виявилися нечутливими до антибіотика. Повну резистентність до
батуміну виявили досліджені штами псевдомонад, дріжджів і мікроскопічних
грибів.

Таблиця 9

Антимікробний спектр дії батуміну (CLSI)

№ п/п Назва штаму і його номер в УКМ МПК, мкг/мл

Грампозитивні

1 Bacillus cereus B-908 256

2 Bacillus mycoides B-903 256

3 Bacillus pumilus B-912 256

4 Bacillus pumilus B-913 (256

5 Bacillus subtilis B-901 256

6 Streptococcus feacalis B-915 (256

7 Micrococcus flavus Ac-634 (256

8 Micrococcus luteus Ac-632 (256

9 Micrococcus varians Ac-613 (256

10 Mycobacterium phlei Ac-402 64

11 Mycobacterium smegmatis B-917 64

12 Arthrobacter globiformis Ac-661 128

13 Clavibacter michiganensis Ac-629 128

14 Clostridium sporogenes B-924 (512

Грамнегативні

15 Escherichia coli B-916 64

16 Escherichia coli B-906 16

17 Escherichia coli B-926 32

18 Klebsiella pneumoniae B-920 8

19 Bordetella bronchiseptica B-922 8

20 Proteus vulgaris B-905 32

21 Pseudomonas aeruginosa B-900 (256

22 Brevundimonas diminuta B-914 64

23 Salmonella enterica serovar Abony B-921 64

Гриби

24 Candida albicans Y-2681 (512

25 Candida tropicalis Y-2473 (512

26 Candida utilis Y-984 (512

27 Saccharomyces cerevisiae Y-2474 (512

28 Zygosaccharomyces rouxii Y-2475 (512

29 Aspergillus niger F-16693 (512

Примітка: «(» – батумін не діє на тест-мікроорганізм при даній
концентрації.

Підсумовуючи вище наведене відзначимо, що вперше спектр дії батуміну
було визначено згідно сучасних міжнародних стандартів CLSI. Отримані
дані характеризують батумін як оригінальний за спектром дії, високо
активний і селективний антимікробний агент, перспективний для
впровадження в медицину.

ВИСНОВКИ

Таксономічне дослідження штаму-продуценту батуміну «Pseudomonas
batumici» методом поліфазного аналізу з використанням сіквенсу 16S
рРНК показало його еволюційну близькість (99%) до п’яти видів
псевдомонад: P. gingeri, P. asplenii, P. fuscovaginae, P. oryzihabitans
та P.putida. В той же час «P. batumici» істотно відрізнявся від них за
своїми фенотиповими властивостями, що свідчить про його видову
самостійність.

Встановлено оптимальні умови культивування «P. batumici» та біосинтезу
батуміну: температура — 25(С; рН(7,0; коефіцієнт аерації 0,6-0,9
гО2/л(год. Розроблено оптимізоване за вмістом макро- і мікроелементів
поживне середовище, яке містить глюкозу як джерело вуглецю і сечовину як
джерело азоту у співвідношенні С/N=10:1. Показана стимулююча біосинтез
дія ряду органічних кислот (піровиноградної, н-масляної, стеаринової) і
амінокислот (ізолейцин, метионін).

Вихід батуміну в умовах періодичного процесу культивування «P.batumici»
в ферментері становив 170-180 мг/л і залежав від кількості посівного
матеріалу і інтенсивності аерації. Синтез антибіотика проходив
паралельно з ростом культури і досягав максимуму через 50-55 год
культивування.

Біологічний (метод дифузії в агар) та фізико-хімічний
(спектрофотометричний) методи визначення батуміну давали однакові
результати при встановленні його концентрації в розчинах очищеного
препарату, але в 1,5-2 рази відрізнялися при дослідженні вмісту
батуміну в культуральній рідині продуцента. В останньому випадку надійні
результати давав фізико-хімічний метод визначення батуміну.

Удосконалено метод препаративного виділення батуміну. Двоступенева
колонкова хроматографія (стаціонарна фаза – силікагель, елюент – система
ацетон:бензол (1:1) забезпечувала 85-90%-ну очистку препарату. Останній
характеризувався типовими для батуміну фізико-хімічними показниками (
(max в УФ-спектрі – 225 нм, оптичний кут обертання ((]d25 = -13,5°;
хімічні зсуви протонів при ЯМР-аналізі – 0,8-1,4; 1,8-2,6; 3,2-3,4;
4,0-4,2; 4,7-4,9; 5,5-6,4; 7,2-7,4 м.д) та спектром біологічної дії.

Вперше проведено дослідження біологічної активності батуміну згідно
міжнародних стандартів CLSI. Підтверджено унікальність селективної дії
батуміну на різні види стафілококів (мінімальна інгібуюча концентрація
становила 0,25-0,5 мкг/мл). Більшість грампозитивних, в тому числі
анаеробних, та грамнегативних бактерій, грибів та дріжджів виявилися
стійкими до дії антибіотика.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

Клочко В.В., Кіпріанова О.А., Смірнов В.В. Вплив умов культивування на
антибіотичну активність “Pseudomonas batumici”(продуцента батуміну //
Мікробіол.журнал, 2004. – т.66, №1. – С.42-48. (Здобувачем були
самостійно встановлені параметри культивування продуцента батуміну:
досліджено вплив різних режимів температури, рН, аерації, вивчено ріст
культури в періодичному процесі та встановлено його зв’язок з
біосинтезом батуміну).

Клочко В.В. Роль джерел мінерального живлення в процесі біосинтезу
антистафілококового антибіотика батуміну // Науковий вісник
Чернівецького університету. Сер. біологія. – 2004. – № 194. – С.
17-22.

Клочко В.В., Кіпріанова О.А. Фізико-хімічний та мікробіологічний методи
визначення антистафілококового антибіотика батуміну // Науковий вісник
Чернівецького університету. Сер. біологія. – 2006. – № 297. – С.
62-66. (Здобувачем розроблено біологічний і фізико-хімічний методи
визначення концентрації батуміну як в очищених препаратах, так і в
культуральній рідині продуцента згідно рекомендацій Фармакопеї України;
проведена порівняльна оцінка цих методів між собою).

Клочко В.В., Кіпріанова О.А. Біосинтез і антимікробний спектр
антибіотика батуміну // Міжнар. наук. конф. «Мікробні біотехнології». –
Одеса (Україна), 2006. – С. 132.

Киприанова Е.А., Чуркина Л.Н., Клочко В.В. Приходько В.А.. Оригинальный
отечественный антибиотик батумин: структура и активность, биотехнология,
перспективы использования в медицине // Матеріали VI Національного
з’їзду фармацевтів України «Досягнення та перспективи розвитку
фармацевтичної галузі України». – Харків, 2005. – С. 346-347.

Клочко В.В., Желобецька О.В. Дослідження впливу різних джерел живлення
на синтез антистафілококового антибіотика батуміна // Міжнар.
наук.-практ. конференція «Шевченківська весна». – Київ (Україна), 2004.
– С.30-32.

Клочко В.В. Влияние некоторых источников питания на биосинтез
антибиотика батумина // Междунар. научно-практ. конф. «Биология – наука
XXI века». – Пущино (Россия), 2004. – С.263-264.

Чуркіна Л.М., Клочко В.В. Деякі особливості дії батуміну на
біосинтетичну активність власного штаму-продуцента // Х з’їзд Товариства
мікробіологів України. – Одеса (Україна), 2004. – С.93.

Клочко В.В., Киприанова Е.А., Смирнов В.В. Оптимальные параметры
культивирования штамма “Pseudomonas batumici” – продуцента
антистафилококкового антибиотика батумина // Междунар. научно-практ.
конф. «Биология – наука XXI века». – Пущино (Россия), 2003. –
С.106-107.

АНОТАЦІЯ

Клочко В.В. Штам-продуцент антистафілококового антибіотика батуміну і
його біосинтетична активність. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Інститут мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2007.

Дисертаційна робота присвячена вивченю штама «Pseudomonas batumici» –
продуцента антистафілококового антибіотика батуміну, таксономічним
дослідженням продуценту, особливостям біосинтезу батуміну, його
виділенню і очищенню, а також характеристиці антимікробної активності
антибіотика за сучасними стандартами CLSI.

Таксономічне дослідження штаму-продуценту батуміну «Pseudomonas
batumici» методом поліфазного аналізу з використанням сіквенсу 16S
рРНК показало його еволюційну близькість (99%) до п’яти видів
псевдомонад: P. gingeri, P. asplenii, P. fuscovaginae, P. oryzihabitans
та P.putida. В той же час «P. batumici» істотно відрізнявся від них за
своїми фенотиповими властивостями, що свідчить про його видову
самостійність.

Оптимізовано поживне середовище та встановлено умови культивування
«P.batumici»: температура — 25(С; рН(7,0; коефіцієнт аерації 0,6-0,9 г
О2/л(год. Проведено вирощування продуцента в умовах ферментера (вихід
батуміну становив 170-180 мг/л).

Розроблені два методи визначення концентрації батуміну в культуральній
рідині і в очищених препаратах антибіотика – біологічний (метод дифузії
в агар) та фізіко-хімічний (спектрофотометричний) . Кожен з цих методів
може використовуватися в залежності від поставлених завдань.

Розроблена схема препаративного виділення і очистки батуміну. Після
стадії двоступеневого хроматографічного очищення екстракту культуральної
рідини ступінь очищення антибіотика становив 85-90%.

Висока активність та селективність дії батуміну щодо стафілококів була
перевірена і підтверджена згідно міжнародних сучасних стандартів CLSI.

Ключові слова: антибіотики, продуцент, таксономія, біосинтез,
антимікробна активність, умови культивування, оптимізація.

АННОТАЦИЯ

Клочко В.В. Штамм-продуцент антистафилококкового антибиотика батумина и
его биосинтетическая активность. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.07 – микробиология. – Институт микробиологии и
вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2007.

Диссертационная работа посвящена изучению штамма «Pseudomonas batumici»
– продуцента антистафилококкового антибиотика батумина, таксономическим
исследованиям продуцента, особенностям биосинтеза батумина, его
выделению, очистке, а также характеристике антимикробной активности
антибиотика согласно международных стандартов CLSI.

Таксономические исследования штамма-продуцента батумина «Pseudomonas
batumici» методом полифазного анализа с использованием данных сиквенса
16S рРНК показали его филогенетическое родство (99%) с пятью видами
псевдомонад: P. gingeri, P. asplenii, P. fuscovaginae, P. oryzihabitans
и P.putida. Однако эти пять видов псевдомонад существенно отличались от
«P. batumici» по своим фенотипическим свойствам, что свидетельствует о
видовой самостоятельности «P. batumici».

Установлены оптимальные условия культивирования «P. batumici» и
биосинтеза батумина: температура — 25(С; рН(7,0; коэффициент аэрации
0,6-0,9 гО2/л(ч. Разработана оптимизированная по макро- и микроэлементам
питательная среда, в состав которой входит глюкоза (источник углерода) и
мочевина (источник азота) в соотношении С/N=10:1. Показано стимулирующее
действие на биосинтез ряда органических кислот (пировиноградной,
н-масляной, стеариновой) и аминокислот (изолейцина, метионина).

Разработаны методы определения концентрации батумина в культуральной
жидкости и в очищенных препаратах антибиотика. Биологический (диффузия
в агар) и физико-химический (спектрофотометрия) методы определения
батумина давали одинаковые результаты при установлении концентрации
антибиотика в очищенных препаратах, однако в 1,5-2 раза отличались при
определении его концентрации в культуральной жидкости. В последнем
случае более надежные результаты давал физико-химический метод.
Разработана схема препаративного выделения и очистки батумина. Стадиями
двухступенчатой колоночной хроматографии (стационарная фаза –
силикагель, элюент – система ацетон:бензол (1:1)) был получен очищенный
на 90% батумин.

Определена антимикробная активность батумина относительно широкого
спектра референс-штаммов согласно международных стандартов CLSI.
Подтверждена высокая активность и селективность батумина относительно
стафилококков.

Ключевые слова: антибиотики, продуцент, таксономия, биосинтез,
антимикробная активность, условия культивирования, оптимизация.

SUMMARY

Klochko V.V. Аntistaphylococcal antibiotic batumin producing strain and
its biosynthetic activity. – Manuscript.

Thesis for a candidate‘s degree by a speciality 03.00.07 – microbiology.
– Zabolotny Institute of Microbiology and Virology of National Academy
of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2007.

The dissertation is dedicated to study of «Pseudomonas batumici «–
the antistaphylococcal antibiotic batumin producing strain, its
taxonomic analysis, study of batumin biosynthesis, isolation,
purification and characteristic of antimicrobial activity of batumin
according to the international CLSI standards.

The high level (99%) of genetic relatedness between «P.batumici» and P.
gingeri, P. asplenii, P. fuscovaginae, P. oryzihabitans, P. putida has
been shown using the partial 16S rRNA sequence analysis. At the same
time the batumin-producing strain differed from these species in
phenotypical characteristics which gives evidence that «P.batumici» is
the new species of the genus Pseudomonas.

The optimal conditions for batumin biosynthesis were: temperature 25(C;
рН(7,0; the aeration coefficient 0,6 – 0,9 g O2/l(h; glucose as a
carbon source and urea as a nitrogen source (in the ratio C/N=10:1).
The biological (diffusion in agar) and physicochemical
(spectrophotometric) methods of batumin determination in the cultural
liquid and in pure preparations have been developed. Two-stage column
chromatography method resulted to 90% purification of batumin.

Batumin antimicrobial activity against the wide spectrum of
test-cultures was studied and its high and selective antistaphylococcal
activity was confirmed.

Key words: antibiotics, taxonomy, biosynthesis, antimicrobial activity,
culture conditions, methods of optimization.

PAGE 13

Похожие записи