УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ

МЕДИЦИНИ

НИЧИК СЕРГІЙ АНАТОЛІЙОВИЧ

УДК 619:616.98:578.842.11:615.371

Розробка та застосування засобів специфічної профілактики сказу тварин

16.00.03 — ветеринарна мікробіологія та вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора ветеринарних наук

Харків-2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної
медицини УААН, Державній Сумській біологічній фабриці і Білоруському
науково-дослідному інституті експериментальної ветеринарії ім.
Вишелеського С.М.

Наукові консультанти:

доктор ветеринарних наук, професор, член-кореспондент УААН Стегній Борис
Тимофійович, Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної
медицини УААН, директор;

доктор ветеринарних наук, професор, член-кореспондент УААН,

Головко Анатолій Миколайович, Державний науково-дослідний контрольний

інститут біотехнології і штамів мікроорганізмів, директор.

Офіційні опоненти:

доктор ветеринарних наук, професор, академік УААН Красніков Геннадій
Андрійович, Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини
УААН, завідувач лабораторії;

доктор ветеринарних наук, професор Скибицький Володимир Гурійович,
Національний аграрний університет Кабінету Міністрів України, завідувач
кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології;

доктор ветеринарних наук, професор, член-кореспондент УААН Мандигра
Микола Станіславович, Інститут епізоотології УААН, директор.

Провідна установа — Одеський державний аграрний університет МАП України,
кафедра епізоотології та паразитології, м. Одеса.

Захист відбудеться “4” квітня 2006 року о 900 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 в Інституті експериментальної і
клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою: 61023, м. Харків, вул.
Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту
експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою:
61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

Автореферат розісланий“ 2 ” березня 2006р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої доктор ветеринарних наук,
професор

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Сказ – одна з найбільш поширених у світі
зооантропонозних нейроінфекцій свійських і диких тварин. На сьогодні
благополучними щодо сказу залишаються лише Австралія і декілька
острівних країн та держав Європи (Нова Зеландія, Японія, Норвегія,
Швеція, Іспанія, Португалія). Щорічно від сказу гинуть понад 1 млн.
тварин (Недосеков В.В. з співавт., 2003), 50000 людей (Шестопалов А.М. з
співавт., 2001), серед яких частка дитячої смертності сягає 30-50%
(Rotavel J. і ін., 1998).

Боротьба зі сказом залишається однією з найскладніших проблем, котра
може бути вирішеною тільки загальними зусиллями
адміністративно-господарчих служб, органів державної ветеринарної та
гуманної медицини, спрямованими на упорядкування утримання свійських
тварин, перш за все, собак і кішок, своєчасну вакцинацію, відловлювання
бездоглядних тварин, регуляцію чисельності популяції диких м’ясоїдних у
природних умовах.

Однією з важливих складових проблеми контролю сказу є специфічна
профілактика, особливо серед диких тварин, індивідуальне застосування
вакцин котрим неможливе. У зв’язку з цим важко переоцінити досягнення з
оральної імунізації диких м’ясоїдних тварин, яка була запропонована
наприкінці 70-х років минулого сторіччя. Досвід, накопичений за час
впровадження оральної імунізації, свідчить про її ефективність при
викорененні сказу навіть в умовах росту популяції диких тварин, якщо
проводиться системна їх вакцинація впродовж декількох років (Aubert
М.Т., 1999).

Останнім часом епізоотична ситуація щодо сказу ускладнюється зростанням
ролі диких тварин у поширенні хвороби, серед яких лисиця займає провідне
місце, особливо в країнах Європи, у тому числі в Україні. Аналізуючи
проблему так званої “європейської моделі” рабічної інфекції, Макаров
В.В. з співавт. (2002) також пов’язують зростання за останнє десятиріччя
на території пострадянських країн кількості неблагополучних пунктів із
розширенням ареалу мешкання диких тварин, особливо лисиці, яких вважають
хазяїном-резервуаром і переносником інфекції.

Ситуація, що склалася внаслідок поширення сказу серед диких м’ясоїдних,
сприяє залученню в епізоотичний процес свійських тварин, перш за все,
собак і, що особливо турбує, кішок. Ріст популяції бездоглядних собак і
кішок, скупчення цих тварин у великій кількості на околицях міст та
смітниках, з одного боку, і процес синантропізації диких м’ясоїдних
тварин внаслідок доступності корму в цих місцях, з іншого боку, робить
неминучим контакт цих тварин і можливість інфікування. В зв’язку з цим
виникає проблема щодо організації заходів боротьби з бездоглядними
собаками і кішками та дикими м’ясоїдними тваринами шляхом скорочення
популяції.

Другим аспектом у системі боротьби зі сказом є вакцинопрофілактика.
Нині для імунотерапії і профілактики цієї хвороби запропоновані досить
ефективні засоби вітчизняного і зарубіжного виробництва. В багатьох
країнах світу застосовуються як живі, так й інактивовані вакцини, проте,
їхня якість, як відзначають Недосеков В.В. і Хухоров И.Ю. (2003), не
завжди забезпечує необхідний рівень стійкості до зараження вірусом
сказу, що негативно відбивається на ефективності системи антирабічних
заходів. Успіхи і невдачі при щепленні диких тварин залежать в значній
мірі від імуногенності вакцин. Проте є ряд причин
загально-організаційного порядку, що негативно впливають на
профілактичну ефективність застосування антирабічних препаратів.

Одним із факторів, що впливають на ступінь захисту при вакцинації
тварин, є знижена імунобіологічна реактивність організму. Як відомо, на
фоні вторинних імунодефіцитів у тварин, що супроводжуються порушенням
клітинного імунітету і в більшості випадків залишаються не
діагностованими, вакцинація буває недостатньо ефективною, оскільки не
забезпечує формування напруженого імунітету (Красочко П.А. з співавт.,
2001). Підвищення ефективності вакцинації у таких випадках можливе при
використанні засобів, підсилюючих протективну імунну відповідь організму
на введений препарат. У зв’язку з цим існує необхідність не тільки у
розробці більш ефективних в імуногенному відношенні вакцин, а й в
пошукові та застосуванні нових імуномодуляторів.

Розробка специфічних засобів боротьби зі сказом зараз спрямована на
створення інактивованих вакцин для щеплення свійських м’ясоїдних і
сільськогосподарських тварин, а також живих антирабічних вакцин для
імунізації диких м’ясоїдних. Загальними вимогами до цих біопрепаратів є
їхня небезпечність та імуногенна ефективність. Небезпечність залежить
від біологічних властивостей виробничих штамів вірусу сказу, на основі
яких виготовляється вакцина, дози і кратності застосування (Жестерев
В.И., Лаптева О.Г., 2004). Оптимізація цих показників, що має важливе
значення у плані розробки науково обґрунтованих технологій виготовлення
і застосування вакцини проти сказу, дозволяє конструювати біопрепарати
із заданими властивостями. Сучасна технологія виготовлення антирабічних
вакцин тісно пов’язана з процесом культивування клітин і вірусу
(Жестерев В.И., Юрков С.Г., 2003). Інтенсивний розвиток і широке
застосування клітинних систем обумовлюються станом і можливостями ринку
біопрепаратів. На підставі цього є доцільною розробка та удосконалення
наукових основ технологій культивування виробничих штамів вірусу сказу і
виготовлення високоефективних антирабічних вакцин.

Актуальність і перспективи розвитку цих досліджень зумовлені рядом
технологічних аспектів виготовлення специфічних засобів профілактики
сказу. Визначальною умовою виконання цієї роботи було, зокрема, вибір
виробничих штамів, вивчення технології їхнього культивування,
репродуктивної активності в різних клітинних культурах, способів
очистки, інактивації, розробка препаративних форм вакцин, доз і
кратності застосування та імуногенності.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є
складовою науково-технічної програми 04 «Розробити на основі
прогресивних технологій ефективну систему діагностики, терапії та
профілактики хвороб, спільних для різних видів тварин», № державної
реєстрації 0101U001616 (2001-2005 роки), а також виконувалась за
договором творчої співдружності з Білоруським НДІЕВ ім. Вишелеського
С.В. та ініціативної науково-виробничої діяльності на Державній Сумській
біофабриці.

Мета і завдання досліджень. Мета досліджень – розробка живої
антирабічної культуральної та удосконалення технології виготовлення
інактивованої антирабічної сухої культуральної вакцини на основі
виробничих штамів вірусу сказу, репродукованих в культурі перещеплюваних
клітин, та засобу, підсилюючого імуногенну ефективність інактивованого
біопрепарату.

Для досягнення зазначеної мети були поставлені такі завдання:

— вивчити особливості та тенденції розвитку епізоотичного процесу щодо
сказу в Україні;

— випробувати і дати оцінку продуктивності в залежності від способів
вирощування та визначити перспективну клітинну систему для культивування
виробничих штамів вірусу сказу;

— вивчити біологічні властивості виробничих штамів вірусу сказу в умовах
інтенсивної технології напрацювання біомаси;

— розробити живу антирабічну культуральну вакцину, провести лабораторне
і виробниче випробування імуногенних властивостей;

— удосконалити спосіб виготовлення інактивованої антирабічної
культуральної вакцини і вивчити її імуногенні властивості;

— визначити теоретичні і практичні основи використання імуномодулятора
для корекції поствакцинального імунітету при щепленні тварин з
імунодефіцитним станом;

— розробити і видати регламенти промислового виготовлення живої та
інактивованої антирабічних культуральних вакцин.

Об’єкт дослідження: сказ тварин, контроль епізоотичної ситуації,
специфічні засоби профілактики.

Предмет дослідження: культури клітин, виробничі штами вірусу сказу,
способи культивування, біологічні властивості, жива та інактивована
вакцина проти сказу, імуногенність, дози і кратність застосування,
принади, стимуляція імунітету при вакцинації.

Методи досліджень. Роботу виконували із застосуванням епізоотологічного,
вірусологічного, патогістологічного, імунологічного, біохімічного та
статистичного методів досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів. В результаті проведених
досліджень розроблена нова жива антирабічна культуральна вакцина
(Рабівак ХТТ), для виготовлення якої використаний новий атенуйований
штам НФ-2 вірусу сказу, репродукований у моношаровій культурі
перещеплюваних клітин ВНК-21, клон 13/04, вирощуваної на суміші
живильних середовищ 199 та Ігла з подвійним набором амінокислот.
Створена препаративна форма вакцини, що являє собою блістер-принади, які
вміщують атенуйований вірус сказу, технологічно придатна для
біофабричного виробництва та застосування у мисливських угіддях для
імунізації диких м’ясоїдних. Вакцина у дозі 5 мл (одна-дві принади)
забезпечує утворення напруженого імунітету впродовж 8 місяців.

На клон 13/04 перещеплюваних клітин ВНК-21, виробничий штам НФ-2 вірусу
сказу, спосіб одержання вакцини проти сказу тварин „Рабівак ХТТ” та
спосіб виробництва принади для пероральної імунізації м’ясоїдних тварин
проти захворювання на сказ отримані деклараційні патенти на корисну
модель: № 6015 від 15.04.2005 р., № 3248 та № 3245 від 15.10.2004 р.,
№5296 від 15.02.2005 р. та №7544 від 15.06.2005 р.

Запропоновано новий спосіб виготовлення інактивованої антирабічної сухої
культуральної вакцини, що включає накопичення біомаси виробничого штаму
Щелково-51С вірусу сказу при ролерному культивуванні заражених у процесі
висіву клітин ВНК-21, клон 13/04, інактивацію 0,025% в-пропіолактоном
при 4-10 оС впродовж 24 годин і ліофільне висушування під захистом
сахарозо-желатино- (або пептоно-) агарової суміші. Вакцина не містить
живого вірусу, нешкідлива для тварин, має високу імуногенність, безпечна
для довкілля.

Вакцина апробована на поголів’ї великої рогатої худоби з різним станом
імунної системи. Показана імуногенна ефективність інактивованої
антирабічної сухої культуральної вакцини при сумісному щепленні з
ліпополісахаридним комплексом, виготовленим на Державній Сумській
біофабриці із штаму КМІЕВ-11 Bac.alvei.

Новизна розробок підтверджена деклараційними патентами на корисну модель
– «Спосіб одержання антирабічної вакцини» — № 9060 від 15.09.2005 р.,
«Спосіб стимуляції імунітету у тварин» — № 10104 від 15.11.2005 р. та
«Штам Rabdoviridae Щелково-51С для виготовлення вакцини проти сказу
тварин» № 9061 від 15.09.2005 р.

Теоретичне і практичне значення одержаних результатів. Розроблено
науково-практичні основи параметрів технологічних процесів при
виготовленні живої та інактивованої антирабічних культуральних вакцин із
застосуванням економічно ефективної, технологічної лінії перещеплюваних
клітин ВНК-21 при ролерному культивуванні виробничих штамів вірусу
сказу; запропоновані і реалізовані нові методичні підходи до захисту
імунобіологічних властивостей живого атенуйованого вірусу сказу від дії
шлункових ферментів за допомогою пектину та інактивованої вакцини при
ліофільному висушуванні за допомогою сахарозо-желатино- (або
пептоно)-агарової суміші; отримані нові дані про механізм корекції
імунітету у тварин з імунодефіцитним станом при щепленні інактивованої
антирабічної сухої культуральної вакцини одночасно з ліпополісахаридним
комплексом КМІЕВ-11.

Теоретичні положення підтверджені експериментальними даними в
лабораторних і виробничих умовах.

За результатами проведених досліджень розроблені і запропоновані для
практичного використання:

— жива антирабічна культуральна вакцина (Рабівак ХТТ) для оральної
імунізації диких м’ясоїдних тварин, що впроваджена у виробництво на
Державній Сумській біофабриці. Реєстраційне посвідчення № 0489-04-059-04
видане Державним департаментом ветеринарної медицини України 27.10.2004
р.;

— інструкція з виготовлення і контролю Рабівак ХТТ. Затверджена
директором Державної Сумської біофабрики і узгоджена в Державному
науково-дослідному контрольному інституті біотехнології і штамів
мікроорганізмів 20.06.2004 р.;

— ТУ У 24.4.00483004-668-2002 на Рабівак ХТТ. Затверджені Головним
державним інспектором ветеринарної медицини України 30.09.2004 р.;

— настанова із застосування Рабівак ХТТ. Затверджена Головним державним
інспектором ветеринарної медицини України 30.09.2004 р.;

— вакцина антирабічна інактивована суха культуральна із штаму
Щелково-51. Реєстраційне посвідчення № 0589-04-0098-04 видане Державним
департаментом ветеринарної медицини України 24.12.2004 р.;

— інструкція з виготовлення і контролю вакцини антирабічної
інактивованої сухої культуральної із штаму Щелково-51. Затверджена
директором Державної Сумської біофабрики 15.01.2002 р. Доповнення № 1 і
№ 2 до інструкції затверджені 12.09.2002 р. і 07.07.2003 р.;

— ТУ У 46.15.254-97 на вакцину антирабічну інактивовану суху
культуральну із штаму Щелково-51. Затверджені Головним державним
інспектором ветеринарної медицини України 28.10.1997 р. Повідомлення № 1
про внесення зміни до ТУ У 46.15.254-97 на вакцину. Затверджені Головним
державним інспектором ветеринарної медицини України 30 січня 2006 р.;

— технологічний регламент з виготовлення та контролю імуностимулятора
КМІЕВ-11. Затверджений директором Державної Сумської біофабрики 30 січня
2006 року.

Особистий внесок здобувача. Автор особисто виконав, проаналізував та
узагальнив увесь обсяг експериментальних досліджень. Частина результатів
отримана разом із завідуючою вірусологічним відділом Центральної
Державної лабораторії ветеринарної медицини Троценко З.Р. (визначення за
серологічними тестами напруженості імунітету у поствакцинальний період
при оральній імунізації диких м’ясоїдних тварин живою культуральною
Рабівак ХТТ), доктором ветеринарних наук, професором, завідувачем
відділу вірусних і пріонних інфекцій БілНДІЕВ Красочкою П.А. та доктором
ветеринарних наук, професором, головним науковим співробітником цього
відділу Ковальовим М.О. (вивчення патогенності і патотропності
культуральних виробничих штамів вірусу сказу, питань імуногенезу при
пероральній імунізації, обмінних процесів та імунобіологічних змін в
організмі щеплених тварин) та кандидатом ветеринарних наук, завідувачем
лабораторії епізоотології ІЕКВМ УААН Бабкіним М.В. (проведення
епізоотологічного моніторингу сказу в Україні).

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи
доповідалися та обговорювалися на засіданнях вчених рад Інституту
експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, Білоруського
науково-дослідного інституту експериментальної ветеринарії імені
Вишелеського С.В., науково-технічній раді Державної Сумської біофабрики
та конференціях різного рівня:

1. Міжнародній науково-практичній конференції: “Ветеринарна медицина:
сучасні аспекти розробки, маркетингу i виробництва ветеринарних
препаратів”. 24-31 травня 2004 р., Феодосія.

2. II-му Міжнародному конгресі спеціалістів ветеринарної медицини, 3-4
серпня 2004 р., Київ.

3. Міжнародній науково-практичній конференції, присвяченій 80-річчю
ФГУП “Щелковский биокомбинат”. 21-23 вересня 2004 р., Щелково.

4. III-й Міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених і
аспірантів: “Молоді вчені – майбутнє вітчизняної ветеринарної медицини”,
27 вересня-1 жовтня 2004 р., Суми.

5. Міжнародній науково-практичній конференції: “Забезпечення
ветеринар-но-санітарного благополуччя тваринництва, якості і безпеки
продукції”, 27-29 жовтня 2004 р., Одеса.

6. Міжнародній науково-практичній конференції: “Ветеринарна медицина
2005: сучасний стан та актуальні проблеми забезпечення ветеринарного
благополуччя тваринництва”, 30 травня — 4 липня 2005 р., Ялта.

7. Міжнародній науково-практичній конференції: “Актуальні проблеми
ветеринарної медицини в умовах сучасного тваринництва”, присвяченій
75-річчю НДІЕВ ім. С.В. Вишелеського ІАН Білорусі, 2005 р., Мінськ.

8. Simpozijum: Scotarstvo, veterinarstvo, agroekonomia utrazikonim
procesia. Herceg-Novi, 19-24 jun. 2005.

Публікації. Основні положення дисертації опубліковані у 30 наукових
працях, з яких 1 брошура, 21 стаття (13 одноосібно) у фахових виданнях,
перелік яких затверджений ВАК України; 8 патентів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 299 сторінках
комп’ютерного тексту, ілюстрована 62 таблицями та 32 рисунками,
складається з вступу, огляду літератури, розділів: матеріали і методи
досліджень, результати власних досліджень та їх аналізу, висновки та
пропозиції виробництву, список використаних джерел літератури і додатки.
Список літературних джерел включає 424 найменування, у тому числі 188
зарубіжних авторів.

ВЛАСНІ ДОСЛІДЖЕННЯ

Матеріали і методи досліджень. Робота виконувалась впродовж 2000-2005
років на базі цеху противірусних препаратів Державної Сумської
біофабрики, лабораторій епізоотології та біотехнології Інституту
експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, Центральної та
обласних і районних лабораторій ветеринарної медицини, а також
Білоруського науково-дослідного інституту експериментальної ветеринарії
імені Вишелеського С.В. за договором з творчої співдружності.

Епізоотичний стан щодо сказу в Україні і суміжних країнах вивчали за
даними Міжнародного епізоотичного бюро та Державного департаменту
ветеринарної медицини України і Центральної Державної лабораторії
ветеринарної медицини, а також шляхом особистого аналізу епізоотичної
ситуації зі сказу в Полтавській та Сумській областях.

У процесі розробки антирабічних вакцин використали фіксований вірус
сказу, зокрема, штам РБ-71 (БілНДІЕВ-ВГНКІ), адаптований до ембріонів
курей і культур первинно трипсинізованих клітин нирки свиней та
фібробластів ЕК, вірулентність якого для мишей при інтрацеребральному
зараженні складала 3,63-5,47 lg ЛД50/0,03 мл; штам Щелково-51, що
підтримується на білих мишах і кролях, титр вірулентності – 4,8-5,2 lg
ЛД50/0,03 мл та штам CVS (Challеnqe virus standart) – надійшов у 1971
році із лабораторії профілактики сказу Інституту полімієліту і вірусних
енцефалітів РАМН, підтримується на білих мишах, кролях, собаках і
вівцях, титр вірулентності – 4,6-5,4 lg ЛД50/0,03 мл.

Штами РБ-71 і Щелково-51 вірусу сказу культивували у первинних і
перещеплюваних клітинних системах. Первинні культури клітин отримували
за модифікованим Younqner J. (1954) методом Dulbecco R.(1954). Вихідним
матеріалом для трипсинізації були нирки плодів собак та ембріони курей і
перепілок. Із перещеплюваних клітин використовували лінії Vero, Frhk,
ВНК-21/13, ПС, МДСК.

Культури клітин вирощували в 1,5-літрових матрасах та ролерних бутлях
ємністю 0,5 і 3-5 л на живильних середовищах 199, Ігла МЕМ і ДМЕМ та їх
суміші з додаванням 5-10% сироватки крові великої рогатої худоби.
Живильні середовища готували з імпортних наборів компонентів на
Державній Сумській біофабриці. Перещеплювані клітини підтримували шляхом
серійних пересівів та зберігали в замороженому стані у рідкому азоті.
Життєздатність клітинної популяції у процесі культивування, а також
після дефростаціі визначали фарбуванням трипановим синім. Ступінь
життєздатності клітин оцінювали за проліферативною активністю, а
репродуктивну спроможність — за приростом їхньої біомаси на визначеній
площині культуральних посудин та терміном формування моношару.

Штами РБ-71 і Щелково-51 вірусу сказу адаптували до нових умов
культивування шляхом послідовно зростаючих пасажів. В якості вихідного
вірусовміщуючого матеріалу штаму РБ-71 використали мозок заражених ним
овець, а штаму Щелково-51 – клітино-культуральну суспензію.
Вірулентність виробничих штамів НФ-2 і Щелково-51 та імуногенність
вакцин вивчали на мишах, кролях, собаках, вівцях і великій рогатій
худобі. У дослідах використано більше 12000 білих мишей — масою 18-20 г
і мишей-сисунів масою 6-8 г, 180 кролів породи Шиншила масою 1,8-2,0 кг,
60 морських свинок, 340 безпорідних собак віком 4-24 місяців, 57 лисиць,
66 овець 1,5-2-річного віку та 146 голів великої рогатої худоби.
Інфекційність культурального вірусу сказу визначали титруванням на білих
мишах, для чого готували десятикратні розведення, що вводили
інтрацеребрально, а імуногенність – за титром вірусонейтралізуючих
антитіл в сироватках крові щеплених вакцинами тварин. Реакцію
нейтралізації вірусу сказу проводили на білих мишах за
загальноприйнятною методикою з робочими двократними розведеннями
досліджуваних сироваток з постійною дозою вірусу (30 ЛД50/0,03 мл).
Радіоактивне мічення культурального вірусу для оральної імунізації при
вивченні патотропності здійснювали 5Н3-уридином у БілНДІЕВ.
Вірусовміщуючу культуральну суспензію очищали за допомогою природної
седиментації та центрифугування. Одержаний вірус інактивували фенолом,
формальдегідом, теотропіном, етанолом, в-пропіолактоном при 3-х
температурних режимах (4-10 єС, 20-22 єС і 37±0,5 єС).

Після завершення кожного технологічного циклу напівфабрикати перевіряли
на стерильність та залишкову інфекційність, яку визначали шляхом
3-разового послідовного інтрацеребрального зараження білих мишей,
стерильність контролювали за ГОСТ 28085-89 («Препараты биологические.
Метод бактериологического контроля стерильности») висіванням на МПБ,
МПА, тіоглікольове середовище та середовище Сабуро. Нешкідливість та
авірулентність вакцини контролювали внутрішньом’язовим введенням мишам
(по 30-40 голів на кожен зразок або серію) у дозі 0,5 мл/гол з подальшим
наглядом за тваринами впродовж 14 діб. Імуногенність визначали
кількісним методом, випробовуючи захисні властивості нерозбавлених і в
розведеннях вакцин при контрольному інтрацеребральному зараженні
імунізованих тварин штамом CVS вірусу сказу у дозі 30 ЛД50/0,03 мл/гол.
Оцінку стану клітинного імунітету проводили за методикою Чеботкевича
М.Н. і Лютинского С.И. (Методы оценки состояния иммунной системы и
факторов неспецифической резистентности в ветеринарии, С.-П.-1998).

Статистичний аналіз даних здійснювали за допомогою редактора
електронних таблиць Microsoft Excel XP (2002) та пакету програм
Statistika v 6.1 (Rus). Щодо статистичної обробки даних
експериментальних досліджень продуктивності клітинних систем варіаційний
знак досліджуваних тканин (числа клітин, одержаних при трипсинізації,
або кількості знятих із посудин при пересівах перещеплюваних клітин)
визначали, використовуючи елементи математичного аналізу (Меркур’єв Є.,
1964). Квадратичні відхилення і середнє арифметичне вираховували для
сукупності поставлених дослідів. За таблицею Стьюдента знаходили рівень
вірогідності (р).

Дані з вивчення інфекційності вірусу та імуногенності вакцин піддавали
статистичній обробці за методом Кербера у модифікації Ашмаріна І.
(1962).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Епізоотологічний стан щодо сказу в Україні. У соціальному відношенні
сказ залишається однією із найважливіших медико-ветеринарних проблем, з
якою людство стикається на п’яти материках планети. Вивченням проблеми
поширення, діагностики, профілактики та розробки заходів боротьби зі
сказом займались і продовжують займатися багато дослідників як за
кордоном, так і в країнах пострадянського простору (Ведерников А.А. з
співавт., 1974; Селимов М.А., 1978; Stцhr K. et al, 1990; Прискока В.А.
з співавт., 1996; Котенко М. з співавт., 1997; Павленко М., Троценко
З.Р., 2000; Груздев К.Н., Недосеков В.В., 2001; Гришок Л.П. з співавт.,
2002; Макаров В.К., 2002; Скибицький В.Г., 2003 та ін.).

В Україні захворювання на сказ має значне поширення, проте заходи
боротьби поки що проводяться безсистемно, тільки в неблагополучних
осередках. Між тим в багатьох країнах світу розроблено національні
програми з ліквідації сказу на таких принципах, як всебічний
епізоотологічний моніторинг та керування епізоотичним процесом на основі
постійного нагляду, аналізу і оцінки епізоотичної ситуації та
оперативного комплексного впливу на нього шляхом розриву усіх ланок
епізоотичного ланцюга, з подальшим блокуванням і повним знешкодженням на
рівні популяції, епізоотичного осередку, конкретної адміністративної
території.

Нами встановлено, що епізоотичний стан щодо сказу в Україні продовжує
залишатися напруженим і обумовлено це в першу чергу збільшенням
кількості неблагополучних пунктів. На сьогодні сказ зареєстровано в усіх
природно-географічних зонах України, у т. ч. і в АР Крим, в той час як
до 2004 року неблагополучними були лише 23 області.

При аналізі сучасної епізоотичної ситуації щодо сказу в Україні за
одиницю епізоотичного обліку нами обраний неблагополучний пункт, а не
хвора тварина, оскільки у нашій країні сказ характеризується низьким
індексом вогнищевості. Так, за період 1994-2004 рр. він дорівнював 1,2
(11121:9332). За останні десять років виявлено 9332 неблагополучних
пункти із сказу. Особливо значне збільшення спостерігали у 2002 році,
коли кількість їх досягла – 1312, що перевищило у 5,1 рази рівень 1994
року.

Як у 1994, так і у 2004 роках загальна кількість неблагополучних
територій в цілому по країні не змінилася, а абсолютне зростання
неблагополучних пунктів досягло 819, тобто збільшилось на 318,6%, в той
час як на долю неблагополуччя серед сільськогосподарських тварин
приходиться 208,7% (з 386 до 768 випадків). Таке просторове поширення
сказу характерне для ензоотичного неблагополуччя і відсутності єдиного
первинного вогнища. При аналізі розподілу кількості випадків сказу по
географічних зонах України виявлені значні відмінності (рис.1).

Рис.1 Зони поширення сказу з 1994 по 2004 роки (кількість
неблагополучних пунктів)

Так, середньостатистична кількість 502±135,5 неблагополучних пунктів
щодо сказу усіх видів тварин у лісостеповій зоні перевищувала цей
показник у 2 рази в поліссі (227±120,5) і в 1,4 рази в степовій зоні
(355±87,2). Відповідно кількість уражених тварин (580) була вищою, ніж у
2 рази в поліссі і в 1,4 рази в степовій зоні (459).

Результати визначення взаємозв’язку між кліматичними та ландшафтними
особливостями природно-географічних зон і напруженістю епізоотичного
процесу підтверджують важливість співвідношення свійських і диких тварин
у підтриманні епізоотичного процесу сказу в Україні. Результати
порівняння видової структури тварин, котрі захворіли на сказ в різних
зонах, переконливо свідчать, що питома вага свійських і диких тварин у
неблагополучних пунктах степу і лісостепу істотно не відрізняються, де
кількість захворілих на сказ диких м’ясоїдних була в межах — 33%,
сільськогосподарських — 21-23% і свійських м’ясоїдних – 43-45%. У зоні
полісся кількість випадків сказу серед диких тварин досягала – 60% від
загальної кількості виявлених. Отримані дані вказують, що основним
резервуаром рабічної інфекції є звичайна лисиця, яка мешкає не тільки в
місцях дикої природи, а й в культурних ландшафтах, включаючи околиці
міст і сіл. Це також пояснює різницю у співвідношенні неблагополучних
пунктів щодо сказу диких і свійських тварин у поліссі, степу та
лісостепу, де концентрація поголів’я лисиць вище.

Між тим, позитивна кореляція між випадками сказу лисиць і свійських
м’ясоїдних складає всього – 0,85, а коефіцієнт кореляції сказу лисиць і
сільськогосподарських тварин – 0,37, на підставі чого можна припустити,
що у даному ланцюзі передачі сказу лисиці не відіграють провідної ролі.
Це підтверджується високим коефіцієнтом – 0,86 кореляції випадків
захворювання на сказ свійських м’ясоїдних і сільськогосподарських
тварин. Отримані дані свідчать, що проміжною ланкою передачі вірусу
сказу від лисиць сільськогосподарським тваринам є свійські м’ясоїдні,
контроль за якими і проведення своєчасної профілактичної імунізації
сприяло б забезпеченню значного зниження захворюваності
сільськогосподарських тварин.

Порівнюючи динаміку поширення сказу в Україні за останні 11 років
(рис.2), ми встановили, що загальний тренд неблагополуччя і тренди за
видами тварин збігаються за спрямованістю (виражене наростання кількості
неблагополучних пунктів у 2000, 2001 і 2003 роках), але розрізняються за
вираженістю кореляції, яка складає – 0,58 для диких і свійських
м’ясоїдних і 0,86 для свійських м’ясоїдних і сільськогосподарських
тварин. Таким чином, останні дані вказують на провідну роль у поширенні
сказу свійських м’ясоїдних (кішки, собаки).

Що стосується сезонності сказу, яка вивчалась в Полтавській та Сумській
областях, нами встановлено її зв’язок з життєвою активністю диких тварин
(рис.3). Максимальна кількість випадків сказу у цих тварин припадає на
листопад-березень (період гону і виплоду) і мінімальна на літній період.
Серед свійських тварин максимум напруженості епізоотичного процесу
спостерігається в травні-червні, що співпадає з пасовищним періодом.

Рис. 2 Динаміка виявлення неблагополучних пунктів в Україні за період з
1994-2004 роки

Коефіцієнт між піковими значеннями (березень) і спадом (липень) досить
значний – 21 (мін./макс.)

Рис. 3 Сезонність епізоотії сказу на прикладі Сумської і Полтавської
областей в 2003-2004 роках.

На благополуччя щодо сказу в Україні суттєво впливав епізоотичний стан
у суміжних з Україною країнах. При аналізі епізоотичної ситуації щодо
сказу встановлено, що в Росії епізоотія сказу теж мала два піки підйому
(1999 і 2003 роки), у розвитку яких найбільше значення належало диким
тваринам. Показник кореляції кількості неблагополучних пунктів щодо
сказу диких і свійських м’ясоїдних складав – 0,98, сільськогосподарських
і свійських м’ясоїдних тварин – 0,91, сільськогосподарських і диких
м’ясоїдних тварин – 0,92. Він свідчить, що в Росії, як і в Україні,
епізоотичний процес сказу мав аналогічний характер.

В Білорусі в епізоотичному процесі домінують дикі м’ясоїдні, а серед
сільськогосподарських тварин не встановлено зростання випадків
захворювання на сказ. Не виключено, що це обумовлено системним
широкомасштабним щепленням проти сказу. Показник кореляції між кількістю
неблагополучних пунктів щодо сказу диких і свійських м’ясоїдних складав
– 0,94, сільськогосподарських і диких м’ясоїдних тварин – 0,43, а
сільськогосподарських і свійських м’ясоїдних тварин – 0,63.

В Молдові також основні піки епізоотії сказу припадали на 1999 і 2003
роки, проте на відміну від України там відбулося значне зниження
кількості випадків захворювання на сказ у 2000 році. Кореляція між
кількістю неблагополучних пунктів щодо сказу диких і свійських
м’ясоїдних становила – 0,99, сільськогосподарських і диких тварин – 0,97
та сільськогосподарських тварин і свійських м’ясоїдних – 0,99.

За видовим складом тварин, що захворіли на сказ, показники були фактично
однаковими в Україні та суміжних країнах пострадянського простору.
Кількість випадків сказу серед диких тварин знаходилась у межах 39-46% і
лише в Білорусі – 68%, а сільськогосподарських тварин в Україні – 21%,
Росії – 29%, Молдові – 24%, в Білорусі лише 9%. Встановлена також
відмінність щодо участі в епізоотичному процесі свійських м’ясоїдних
(собак і кішок), кількість яких в Україні становила – 40%, Росії – 31%,
Молдові – 23%, тобто коефіцієнт співвідношення цих тварин — 1,8; 0,8; та
0,7 відповідно. В Україні та Росії кількість випадків захворювання на
сказ кішок майже у 2 рази перевищувала цей показник у собак, а в
Білорусі та Молдові навпаки переважала кількість випадків сказу серед
собак.

Порівнюючи динаміку епізоотичного процесу зі сказу в Україні та в
Словаччині, Румунії, Польщі і Угорщині, ми встановили аналогічну
тенденцію щодо його розвитку, хоча вона відрізнялась за термінами
реєстрації. В Словаччині пік епізоотії сказу припадав, як в Україні і
Росії, на 1999 і 2003 роки, коли кількість неблагополучних пунктів
складала 354 і 237, відповідно, а показник кореляції між їхньою
кількістю серед диких і свійських м’ясоїдних був на рівні — 0,51,
сільськогосподарських і диких тварин – 0,21 та сільськогосподарських і
свійських м’ясоїдних тварин – 0,67.

В Румунії пік епізоотії сказу приходився на 2001 рік (324
неблагополучних пункти), що перевищує в 6,9 разів цей показник 1999 року
(47 пунктів). Проте, показник кореляції між кількістю неблагополучних
щодо сказу пунктів у Румунії серед диких і свійських м’ясоїдних
порівняно з Україною становив 0,56, сільськогосподарських і свійських
м’ясоїдних тварин – 0,96.

В Польщі, незважаючи на її природно-географічні особливості території,
динаміка епізоотичного процесу в період з 1996 по 2000 роки
характеризувалася зниженням напруженості. І тільки в 2001-2004 роках
кількість неблагополучних щодо сказу пунктів зросла з 1148 до 2569,
причому в основному за рахунок захворювання серед диких тварин. Це
підтверджується показником кореляції між кількістю неблагополучних
пунктів щодо сказу серед диких і свійських м’ясоїдних тварин, який
складав 0,91, сільськогосподарських і диких тварин – 0,56, а
сільськогосподарських і свійських м’ясоїдних – 0,54.

В Угорщині напруженість епізоотичного процесу щодо сказу на відміну від
України в останні 10 років менша, але динаміка та тенденція його
розвитку дещо схожа. Як і в Україні, в Угорщині спостерігалося
збільшення кількості неблагополучних пунктів щодо сказу у 2000 році.
Проте, показник кореляції цих пунктів захворювання диких і свійських
м’ясоїдних був на рівні – 0,85, сільськогосподарських і свійських
м’ясоїдних тварин – 0,68, а сільськогосподарських і диких м’ясоїдних
тварин лише 0,23.

За видовим складом тварин, які уражались у Словаччині, питома вага
сільськогосподарських тварин знаходилась на рівні 1%, Румунії – 12%,
Польщі – 8%, Угорщині – 5%, свійських м’ясоїдних (кішок і собак) – 10 та
7%, 11 та 12%, 6 та 4% і 11 та 4% відповідно. В той же час, як і в
Україні, в цих країнах найвища питома вага у підтриманні епізоотичного
процесу щодо сказу належала диким тваринам, зокрема, в Словаччині вона
складала – 81%, Румунії – 64%, Польщі – 82% та Угорщині – 80%.

Таким чином, можна припустити, що в період спаду напруженості
епізоотичного процесу свійські м’ясоїдні та сільськогосподарські тварини
перестають включатися в епізоотичну ланку і збудник сказу знаходиться в
своїй природній екологічній ніші – популяції диких тварин. У зв’язку з
цим однією з проблем контролю сказу є постійний облік і аналіз ситуації
в неблагополучних пунктах та проведення профілактичної вакцинації. На
підставі зазначеного ми зосередили свої зусилля на розробці живої
антирабічної культуральної вакцини для імунізації диких м’ясоїдних та
удосконаленні технології виготовлення інактивованої культуральної
вакцини проти сказу сільськогосподарських і свійських м’ясоїдних тварин.

Вибір і вивчення репродуктивних властивостей виробничих штамів вірусу
сказу. При розробці нових вакцин наші дослідження були спрямовані, перш
за все, на вибір клітинних систем для культивування і накопичення
біомаси виробничих штамів, оскільки вони є головною ланкою
біотехнологічного процесу виготовлення біопрепаратів.

На сьогодні в практичній вірусології та біотехнології набули широкого
застосування дві клітинні системи: первинно трипсинізованих та
перещеплюваних клітин. Розмаїття засобів отримання та культивування
створюють сприйнятливі умови для їхнього використання.

Отримані нами дані стосуються порівняльної оцінки цих систем, в
результаті якої встановлена залежність накопичення клітинної біомаси від
способу культивування і вихідної концентрації. При вивченні
культуральних властивостей первинно трипсинізованих клітин, зокрема,
нирки собак та фібробластів ембріонів курей і перепілок встановлено, що
вони зберігають характерну для них в організмі морфологію і є придатною
тест-системою для накопичення вірусу сказу. Разом з тим, недовгочасний
термін життєздатності і необхідність поповнення донорської тканини для
трипсинізації обмежують їхнє використання в біотехнології виготовлення
біопрепаратів. Перещеплювані клітини Vero, Frhk, ПС та ВНК-21, клон
13/04, МДСК мають значні переваги. На відміну від первинних культур
клітин вони не потребують складних умов отримання і культивування. У
серії дослідів з вивчення умов культивування первинних і перещеплюваних
клітин показано, що як при стаціонарному (в матрасах), так і ролерному
(в бутлях) культивуванні зі збільшенням висівної концентрації
підвищується щільність клітин від 105 до 5х105/см2 ростової поверхні
культуральних посудин. Скорочуються терміни формування моношару з 5-6 до
2-3 діб. Проте подальший приріст клітинної біомаси зменшується не тільки
за рахунок підвищеної концентрації, але також внаслідок контактної
інгібіції росту і пригнічення функціональної життєдіяльності клітин
продуктами метаболізму, що накопичуються навколо них у середовищі,
особливо в матрасах.

Продуктивна активність клітин також залежала від складу живильного
середовища. На цей час застосовують високоякісні живильні середовища, що
збалансовані за амінокислотним складом, вітамінами, ферментами, котрі
стимулюють ріст клітин in vitrо. Проте вітчизняна біотехнологія
клітинних культур відчуває їх дефіцит, оскільки в Україні відсутнє
виробництво вихідних для їхнього виготовлення компонентів. Ми
використали комерційні набори сухих компонентів середовищ, що надходять
із далекого зарубіжжя, котрі відрізняються за складом і якістю
амінокислот, що впливає на ріст клітин. Проведені дослідження з
культивування перещеплюваних клітин у різних комбінаціях живильних
середовищ показали, що збагачені амінокислотами середовища, зокрема з
подвійним їхнім вмістом, підвищують репродуктивну здатність клітин і
вихід біомаси для зараження вірусом сказу. Вирощування клітин у суміші
живильних середовищ 199 і Ігла ДМЕМ забезпечувало однорідність
клітинного моношару, придатного для зараження вірусом сказу.

Найбільш оптимальні умови накопичення клітинної біомаси забезпечувало
ролерне культивування. При порівняльному випробуванні перещеплюваних
клітин показана можливість їхнього використання в промисловому
напрацюванні вихідної біомаси клітин. Разом з тим селекціонований нами
клон 13/04 перещеплюваних клітин ВНК-21 виявився більш продуктивним.
Вихід клітин у бутлях порівняно з культурою в 1,5-літрових матрасах
складав – 324 млн., що відповідає – 3,36х105 клітин/см2 ростової
поверхні і 7,2х105 клітин/мл живильного середовища, а в матрасах
відповідно 86 млн., тобто 2,86х105 клітин/см2 і 4,3х105 клітин/мл
середовища. Окрім того, в ролерних бутлях на добу раніше формувався
моношар клітин порівняно з матрасами, а накопичення біомаси первинних
було у 3 та перещеплюваних у 3,6 рази вищим на одиницю об’єму живильного
середовища.

Отримані результати з накопичення клітинної біомаси слугували підґрунтям
для використання лінії перещеплюваних клітин ВНК-21, клон 13/04, у
подальших експериментах з розробки живої та інактивованої антирабічних
культуральних вакцин.

Адаптація і вивчення імунобіологічних властивостей виробничих штамів
вірусу сказу. При конструюванні живої та удосконаленні технології
виготовлення інактивованої антирабічних культуральних вакцин була
приділена значна увага вивченню їхніх властивостей. Відомо, що клітинна
система впливає на антигенність, імуногенність та патогенність
репродукованого в ній вірусу. Обрані нами селекціоновані з фіксованого
вірусу сказу «Овечий-ВГНКИ» штами РБ-71 і Щелково-51, для виготовлення
вакцин при культивуванні в клітинних культурах, репродукували без
проявлення цитопатичних змін, у зв’язку із чим інфекційна активність
визначалася за вірулентністю для білих мишей при інтрацеребральному
зараженні.

Встановлено, що у процесі адаптації до нових умов культивування дещо
змінювалася репродуктивна активність обох штамів. В перших пасажах вона
знижувалась, а потім підвищувалась і фактично стабілізувалась, починаючи
з 3-4 пасажів. Зокрема, репродуктивна активність штаму РБ-71 у першому
пасажі як у первинних, так і перещеплюваних культурах клітин була на
1,0-1,5 lg МЛД50/0,03 мл нижчою порівняно з вихідним титром (5,0 lg
МЛД50/0,03 мл). У культурах перещеплюваних клітин Vero, МДСК, Frhk і
ВНК-21 титр інфекційності стабілізувався на рівні 5,5-6,8 lg МЛД50/0,03
мл, а в первинних культурах клітин ФЕК і ФЕП, за винятком НС, -3,5-4,5
lg МЛД50/0,03 мл. В культурі первинних клітин нирки собаки (НС) титр
штаму РБ-71 становив 5,1-5,5 lg МЛД50/0,03 мл. З перещеплюваних клітин
культури ВНК-21 та Frhk, в яких вірус накопичувався у титрі 6,2-6,8 lg
МЛД50/0,03 мл, виявилися найбільш чутливими до штаму РБ-71. Досить
стабільні, проте дещо нижчі, титри вірусу забезпечували культури клітин
МДСК (5,5-6,3 lg МЛД50/0,03 мл) і Vero (5,5-5,8 lg МЛД50/0,03 мл)
впродовж послідовних 15 пасажів.

При порівняльному вивченні репродуктивних властивостей штаму Щелково-51
в культурах первинних і перещеплюваних клітин (ФЕК, ФЕП і ПС, Vero,
MDCK, Frhk, ВНК-21/13 та ВНК-21, клон 13/04) виявлена така ж чітка
закономірність розвитку інфекційності, яка спостерігалась при
культивуванні штаму РБ-71. У першому пасажі штаму Щелково-51 інфекційна
активність його в культурах первинних клітин знижувалась на 2,5-2,6 lg
МЛД50/0,03 мл, а в перещеплюваних – на 1,6-2,5 lg МЛД50/0,03 мл, в
залежності від їхньої видової належності. Починаючи з 3-5 пасажів
репродуктивна активність штаму Щелково-51 стабілізувалась в первинних
культурах клітин ФЕК і ФЕП на рівні 3,3-3,9 lg МЛД50/0,03 мл, а
перещеплюваних ПС – 5,2-5,8; Vero – 4,4-5,0; МДСК – 4,6-5,2; Frhk –
4,9-5,6; ВНК-21/13 – 6,4-6,7-і, ВНК-21, клон 13/04, — 7,0-7,3 lg
МЛД50/0,03 мл.

Таким чином, оптимальну репродуктивну активність штамів РБ-71 і
Щелково-51 забезпечувала культура перещеплюваних клітин ВНК-21, особливо
клон 13/04. Це підтверджено і результатами культивування клітин і вірусу
в середовищах, збагачених за поживними речовинами. Так, при
культивуванні клітин і штамів РБ-71 та Щелково-51 в суміші середовищ 199
та Ігла ДМЕМ титр інфекційності культурального вірусу був на 1 lg
МЛД50/0,03 мл вищим порівняно з культивуванням на моносередовищах (199
та Ігла ДМЕМ), що обумовлено підвищенням якості клітинної культури і, як
наслідок, репродуктивності вірусу. Одночасно встановлена залежність
репродукції штамів РБ-71 і Щелково-51 вірусу сказу від способу
культивування. В наших експериментах виявлено більш високі титри вірусу
при ролерному способі культивування клітин і вірусу, що пояснюється
більш вираженою продуктивністю клітин, а також механізмом поширення
вірусу. В стаціонарних культурах клітин (у матрасах) інфекція
розвивається і поширюється контактним шляхом, від клітини до клітини, а
при ролерному ще й через середовище у процесі обертання бутлів, що
прискорює процес її розвитку і репродукції вірусу.

Під час адаптації до нових умов культивування мінялась не тільки
репродуктивна здатність штамів РБ-71 і Щелково-51 вірусу сказу.
Одночасно знижувалась їхня інфекційність для тварин. Якщо вихідний штам
РБ-71 спричинював 100% загибель мишей на 6-7 добу після
інтрацеребрального зараження, то в інфікованих вірусовміщуючою
культуральною суспензією 5 і 10 та 15 пасажів вона наставала на 10-12,
12-14 і 14-16 добу. В той же час при внутрішньом’язовому і підшкірному
введенні вірус не проявляв вірулентності, заражені миші залишались
живими, що також підтверджено результатами внутрішньом’язового
інфікування кролів, цуценят і лисиць, у яких не спостерігали зміни
загального стану організму. Вони залишились здоровими.

Що стосується вивчення впливу пасажування штаму Щелково-51 в клітинних
системах на його нейротропні властивості, то в цих дослідах не
встановлено значних змін. В той час, як при внутрішньом’язовому і
підшкірному введенні мишам культурального вірусу 5 і 10 пасажів не
спостерігалось клінічних змін у загальному стані тварин і через 30 діб,
при дослідженні мозку забитих мишей, вірус не виявлявся, при
інтрацеребральному зараженні зберігалась його вірулентність на рівні
2,2-2,9 lg МЛД50/0,03 мл.

Зважаючи на те, що у процесі репродукції вірусу сказу як in vivo, так in
vitro біологічні тест-системи мають різну здатність синтезувати вірусні
протеїни, наступним етапом наших досліджень було з’ясування антигенних
властивостей адаптованих до нових умов культивування штамів РБ-71 і
Щелково-51. Встановлено, що зразки суспензій вірусу сказу, отриманих при
його культивуванні у вирощених в культурах перещеплюваних клітин ВНК-21
і Frhk на середовищах різного складу, не втрачають здатність продукувати
в організмі імунізованих мишей вірусоспецифічні антитіла у титрах до 5
log2.

Таким чином, у процесі адаптації тканинного вірусу сказу (штам РБ-71) і
пасажування штаму Щелково-51 в клітинних системах отримано атенуйовані
штами, які запатентовані відповідно, як штами НФ-2 та Щелково-51С, і які
мають високу репродуктивну активність, накопичуються в перещеплюваних
клітинах у титрах до 6,4 і 7,2 lg МЛД50/0,03 мл, зберігають здатність
щодо індукції вірусоспецифічних антитіл в організмі імунізованих
тварин, і, при парентеральному введенні не спричиняють захворювання
(таблиця).

Розробка живої антирабічної вакцини для оральної імунізації диких
м’ясоїдних. При створенні живої культуральної вакцини для імунізації
м’ясоїдних тварин були вивчені імуногенні властивості виробничого штаму
НФ-21 на кролях, собаках і лисицях. Встановлено, що дворазове
внутрішньом’язове введення кролям 2 мл, м’ясоїдним 3 мл/гол
культуральної суспензії вірусу з титром інфекційності 5,5 lg МЛД50/0,03
мл з інтервалом у 12 діб викликало індукцію нейтралізуючих антитіл у
високих титрах (4,0-6,5 log2) і створення напруженого імунітету.

Таблиця 1

Характеристика виробничих штамів вірусу сказу

Показники НФ-2 Щелково-51С

одиниця виміру необхідні параметри одиниця виміру необхідні параметри

Доза зараження співвідношення за об’ємом вірус-середовище 1:30
співвідношення за об’ємом вірус-середовище 1:30

Час репродукції в культурі години 72-96 години 72-96

Титр інфекцій-ності після репродукції lg МЛД50/0,03мл 6,4-6,8 lg
МЛД50/0,03мл 7,0-7,2

При інтрацеребральному зараженні через 45 діб після імунізації штамом
CVS вірусу сказу тварини залишались клінічно здоровими, в той час як
групи інтактних тварин після зараження контрольним штамом на 8-12 добу
захворіли на сказ і загинули. При оральному введенні кролям (6 мл),
собакам і лисицям (10 мл) дворазово через 24 години титри
вірусонейтралізуючих антитіл були невисокими (1,5-3,0 log2), а створений
імунітет недостатньо напружений. При контрольному зараженні кролів
захист імунізованих тварин складав до 80%, а у собак і лисиць 50%. Це
пояснюється і узгоджується з даними спеціальної літератури щодо
часткового переварювання антигену вірусу сказу при пероральному
застосуванні. Отримані результати спонукали до пошуку засобів підвищення
імуногенності атенуйованого вірусу при оральному введенні.
Експериментально нами встановлено, що вірус сказу досить чутливий до дії
шлункового соку. Після 10-хвилинного контакту вірус повністю
інактивувався. Під захистом випробуваних речовин інфекційна активність
вірусу зберігалась, проте титри інфекційності залежали як від терміну
взаємодії з шлунковим соком, так і від властивостей використаних
речовин. Кращі захисні властивості встановлено у 2% пектину. Титр
інфекційності вірусу під його захистом знижувався на 0,5 lg МЛД50/0,03
мл лише через 2 години взаємодії з шлунковим соком. Менше захищали вірус
від дії шлункового соку інші речовини. Під захистом 1% пектину за цей
термін титр інфекційності атенуйованого вірусу сказу знижувався на 1,7
lg; 3% крохмалю – на 2,2 lg; 10% желатину – на 4,1 lg МЛД50/0,03 мл.
Льняний відвар виявився зовсім непридатний для захисту вірусу від
шлункового соку.

На підставі отриманих даних щодо захисту за допомогою пектину антигенних
властивостей атенуйованого штаму від дії шлункового соку були
виготовлені 3 зразки вакцини з різною інфекційністю вірусу (4,0; 5,0 і
6,0 lg МЛД50/0,03 мл), що випробувані на білих мишах і собаках. Як
свідчать результати, імуногенність зразків вакцини залежала від дози і
кратності введення. Якщо в імунізованих тварин формувався напружений
імунітет при оральному введенні зразків вакцини з інфекційністю вірусу
4, 5 і 6 lg МЛД50/0,03 мл, який захищав їх при контрольному зараженні
штамом CVS вірусу сказу, то рівень вірусонетралізуючих антитіл,
індукованих в організмі цих тварин, відрізнявся. Зокрема встановлено, що
зі збільшенням одноразової дози з 0,5 до 2 мл титр вірусонейтралізуючих
антитіл зростав для зразка вакцини з інфекційністю вірусу 4 lg
МЛД50/0,03 мл з 1,5 до 2,5 log2,,5 lg МЛД50/0,03 мл — з 3,0 log2 до
3,6 log2 і 6 lg МЛД50/0,03 мл — з 3,4 до 4,6 log2. Дво-, три-, чотири і
п’ятиразове введення вакцини сприяло більш високій індукції специфічних
до вірусу сказу антитіл порівняно з одноразовою оральною імунізацією у
дозі 0,5 мл у 1,6-1,9 разів. Проте суттєвої різниці щодо рівня
ВН-антитіл при дво-п’ятиразовому введенні вакцини з інтервалом в одну
добу у мишей не виявлено.

Аналогічні результати з випробування цих зразків живої культуральної
вакцини отримані також при оральній імунізації собак шляхом одно-, дво-
і триразового згодовування принад, у якості яких використали курячі
яйця, що вміщували по 5 мл вакцини з інфекційною активністю 4, 5 і 6 lg
МЛД50/0,03 мл. У сироватках крові, відібраної на 21 добу, виявлені
ВН-антитіла, титр яких у одноразово імунізованих знаходився на рівні
3,6-4 log2. Зі збільшенням кратності (дво- і триразово) введення
встановлені більш високі титри антитіл (4,8-5,8 log2), що також залежало
від вихідної інфекційності вірусу у вакцині (5 і 6 lg МЛД50/0,03 мл).
Випробувана вакцина, як і вірус-вакцина з штаму ТС-80, що була взята як
контроль, захищала від зараження собак штамом вірусу CVS.

?

hU

hU

yyyy^„

yyyy]„

yyyy]„pa$

I o u p

?

¦

???

???

???

?

„«

yyyy]„«

t

??

:), захищають від інтрацеребрального зараження контрольним штамом CVS,
не призводять до негативних поствакцинальних наслідків, і, отже, є
нешкідливими. При спостереженні впродовж 2,5 місяців за імунізованими
випробуваною вакциною з штаму НФ-2 і вірус-вакциною з штаму ТС-80
тваринами жодна з них не захворіла на сказ і не загинула.

Оскільки жива культуральна вакцина з штаму НФ-2 вірусу сказу
призначалась для імунізації диких м’ясоїдних тварин, необхідно було
створити привабливу до поїдання форму препарату. Ми врахували видові
особливості цих тварин, виживаємість яких залежить від їхньої природної
здатності щодо взаємовідносин із сородичами, захисту території мешкання,
пошуку корму, чому сприяє їхній орган нюху. Була створена принада, що
являє собою блістер у формі пакета розміром 1,5-2х4,5 см із
полівінілхлоридної плівки, в якому розміщували імунізуючу дозу вакцини.
Блістер-пакет заключали в брикет м’ясної принади, здобрений зверху
рибним борошном. Ці брикети були зручними до споживання твариною, не
втрачалися при розжовуванні, добре зберігалися в замороженому стані і
були стійкими у зовнішньому середовищі.

Зважаючи на те, що принади розкладаються в місцях заселення дикими
тваринами, і можуть бути з’їденими польовими гризунами, ми змоделювали
лабораторний дослід з вивчення патогенності вакцинного вірусу для мишей,
яким згодовували м’ясні принади, котрі вміщували 5, 10, 15 і 20 мл, що
становило 0,25; 0,5; 0,75 і 1 мл вакцини/голову. Як показали результати,
миші, за винятком контрольної групи, залишались живими без проявів
вакцино-індукованого сказу впродовж 30 діб спостереження. У декількох
мишей контрольної групи, що отримували штам CVS вірусу сказу, на 12-15
добу були виявлені ознаки захворювання на сказ і через 3-4 доби їх
загибель.

У досліджених в РН групових пробах сироваток крові вакцинованих мишей
встановлені вірусоспецифічні антитіла у титрах від 3,1 до 3,8 log2. При
вірусологічному дослідженні мозку забитих імунізованих досліджуваною
вакциною мишей вірус не вдалося виділити.

Отже, атенуйований штам НФ-2 вірусу сказу, на основі якого
виготовляється жива культуральна вакцина, є апатогенним для мишей і може
з принадами без обмеження застосовуватись для імунізації диких тварин у
польових умовах.

Поряд із цим на базі БілНДІЕВ були з’ясовані швидкість і шляхи
проникнення вакцинного вірусу в організмі імунізованих перорально
морських свинок, оскільки ці фактори впливають на процеси імуногенезу і,
що важливо, на терміни формування несприйнятливості до збудника сказу.
Мічений 5НЗ-уридином сконцентрований за допомогою ПЕГ-6000 до титру
інфекційності 6,67-7,87 lg МЛД50/0,03 мл вірус вже через добу знаходили
в усіх органах знекровлених тварин. Найбільшу його концентрацію за
інтенсивністю радіометрії виявили в тонкому кишечнику, брижових
лімфовузлах, селезінці та крові, що збігалося з результатами, отриманими
при внутрішньом’язовому введенні вакцинного вірусу. На 4 добу
спостерігали підвищення показників інтенсивності радіометрії в брижових
лімфовузлах і селезінці, а при внутрішньом’язовому способі введення ще й
в печінці, в той час як у крові і інших органах вона була менше
вираженою. На 10 добу при пероральному введенні вірус не знаходили в
стравоході, шлунку, нирках і крові, а в інших органах інтенсивність
результатів радіометрії вірусу була незначною. Найбільша концентрація
введеного внутрішньом’язово вірусу на 10 добу спостерігалася в
регіональному лімфовузлі (стегновому) і селезінці, а в інших органах
вірус не виявлявся.

За МФА вакцинний вірус встановлювали ще й на 10-й добі в кишечнику,
брижових і регіональних лімфовузлах, селезінці, печінці, спинному і
головному мозку. Радіонуклід із органів контрольної групи виводився
впродовж перших 3-4 діб.

Таким чином, результати проведеного досліду показали, що як при
пероральній, так і внутрішньом’язовій імунізації тварин проти сказу
відбувається проникнення вірусу в регіональні лімфовузли, а потім через
кров він розповсюджується в інші органи. Проте, динаміка розподілення
вірусу дещо відрізнялася за термінами проникнення в різні органи, що
підтверджується більш раннім виявленням вірусу в імунокомпетентних
органах при внутрішньом’язовому введенні.

З термінами проникнення і інтенсивності накопичення вакцинного вірусу в
імунокомпетентних органах співпадають дані щодо вивчення пато- та
імуноморфологічних змін у них. Результати досліджень у динаміці розвитку
поствакцинального імунітету при пероральному введенні живої
культуральної вакцини свідчать, що на 5 добу в брижових лімфовузлах
виявлені запальні процеси, які супроводжувались розширенням синусів,
появою в них серозного ексудату, набряком синусного ендотелію,
розширенням кровоносних судин у трабекулах і м’якотних шнурах. У
фолікулах знаходили розширені центри із лімфоїдних і плазматичних
клітин. Плазмоцитарна реакція була більш виражена в брижових лімфовузлах
порівняно з тазовими і підколінними.

На 10 добу в брижових лімфовузлах знаходили лише виражені гіперпластичні
процеси, що характеризувалися гіперплазією клітин, багатих на РНК. У
віддалених лімфовузлах і селезінці морфологічні зміни мали такий же
характер, проте були менш вираженими. Плазмоцитарна реакція була більш
чіткою порівняно з попередніми результатами досліджень на 5 добі.
Загальна кількість клітин плазматичного ряду збільшувалась у 5 разів (з
37 до 202), серед яких переважали молоді форми (55%).

На 15 добу після вакцинації були більш виражені гіперпластичні процеси в
лімфовузлах, де виявляли реактивні центри, у цитоплазмі лімфоїдних і
плазматичних клітин підвищувався вміст РНК, що свідчило про підсилення
їх функціональної активності. Плазмоцитарна реакція досягала найвищого
розвитку в брижових лімфовузлах, менш вираженою вона була в підколінних
і тазових, а також у селезінці.

Через 30 і 45 діб у лімфовузлах і селезінці спостерігалися лише
гіперпластичні процеси, що характеризувалися розмноженням лімфоїдних і
частково ретикулярних клітин. Плазмоцитарна реакція помітно була
слабкішою. Загальна кількість клітин плазматичного ряду порівняно з
контролем збільшувалась через 30 діб у 4 рази і через 45 діб у 2 рази.
Серед клітин плазматичного ряду переважали плазмоцити, менше було
плазмобластів і проплазмоцитів.

При внутрішньом’язовому введенні вакцини реакція і зміни в
імунокомпетентних органах виявлялися раніше і були більш вираженими
порівняно з повільним розвитком при пероральній імунізації.

Як встановлено, на тривалість імунітету при пероральній імунізації
м’ясоїдних тварин суттєво впливали дози і схеми введення живої
антирабічної культуральної вакцини. Отримані нами результати досліджень,
проведених на собаках від 4-5-місячного віку до 1-2 років, показали, що
оптимальною є доза 5 мл вакцини, яка була нереактогенною, не призводила
до підвищення температури тіла в імунізованих тварин, індукувала
продукцію вірусонейтралізуючих антитіл на рівні з вакциною в дозі 10 мл
( 4,3-4,6 lоg2). Більш придатною виявилася схема дворазового введення по
5 мл вакцини з 12-добовим інтервалом або триразово через 1 і 12 діб. Ці
дози ( 10 і 15 мл на курс імунізації) забезпечували створення
напруженого імунітету. Як і в собак, одноразово імунізованих вакциною
підвищеними дозами (10 і 20 мл), встановлено несприйнятливість при
контрольному зараженні штамом СVS на 42 добу від початку імунізації,
хоча в групах одноразово імунізованих у дозах 5 і 10 мл спостерігали
захворювання і загибель по 1 тварині (25% від загальної кількості
піддослідних собак).

При порівняльному вивченні динаміки вірусонейтралізуючих антитіл в
організмі щеплених антирабічною культуральною вакциною собак їхня
індукція дещо відрізнялась за термінами виявлення і тривалості
імунітету. Зокрема, при внутрішньом’язовому щепленні вірусонейтралізуючі
антитіла у титрах 6,2 lоg2 знаходили вже на 7 добу, в той час, як при
пероральній імунізації — лише на 12 добу у титрі 4,3 lоg2. Проте вже на
17 добу від початку імунізації титри вірусонейтралізуючих антитіл при
обох способах вакцинації вирівнювалися і знаходилися на рівні 6,4-6,8
lоg2, а починаючи з 60 доби дещо знижувались від 6,0 до 3,4 lоg2 на 120
добу, 3,2-3,0 lоg2 через 240 діб. Після зараження контрольним штамом СVS
вірусу всі імунізовані собаки залишались клінічно здоровими.

Таким чином, результати цих досліджень свідчать, що розроблена жива
антирабічна вакцина, яка отримала назву “Рабівак ХТТ”, з атенуйованого
штаму НФ-2 вірусу сказу є імуногенною при дворазовому пероральному
застосуванні у дозі 5 мл з інтервалом 12 діб, і забезпечує напружений
імунітет впродовж 240 діб. У препаративній формі блістер-принад у
замороженому стані Рабівак ХТТ зберігає імуногенні властивості впродовж
року. Через 24 місяці імуногенна здатність вакцини знижувалась у
середньому на 26,7%, проте, вона залишалась достатньо імуногенною,
викликала накопичення вірусонейтралізуючих антитіл у захисному титрі у
80-83,3% імунізованих тварин.

Матеріали щодо технології виготовлення і контролю якості Рабівак ХТТ
були узагальнені і представлені у вигляді нормативної документації, яка
узгоджена в ДНКІБШМ і затверджена Державним департаментом ветеринарної
медицини України. Згідно з наказом № 75 Головного державного інспектора
ветеринарної медицини України від 24 листопада 2003 року “Про широку
апробацію вакцини Рабівак ХТТ для пероральної імунізації м’ясоїдних у
польових умовах» на Державній Сумській біофабриці були виготовлені
дослідно-промислові серії біопрепарату за технологією, яка передбачала
використання атенуйованого штаму НФ-2 вірусу сказу, репродукованого в
моношаровій культурі перещеплюваних клітин ВНК-21, клон 13/04, до
надосадової культуральної суспензії якого після 24-годинної седиментації
при 4- 10 °С додавали 2% яблучного пектину.

Інфекційність культурального штаму НФ-2 вірусу сказу у вакцині складала
6,4-6,8 lg МЛД50/ 0,03 мл. Перевірка за показниками якості вакцини (на
контамінацію бактеріями, грибами і мікоплазмами за ГОСТ 28085-89,
нешкідливість за ДСТУ 46.024-2002 на білих мишах, яким вводили підшкірно
по 0,5 мл Рабівак ХТТ, та імуногенність за титром вірусонейтралізуючих
антитіл у щеплених вакциною мишей) відповідала вимогам технічних умов і
вона визнана придатною до застосування для імунізації диких м’ясоїдних
тварин. З метою широкої виробничої апробації за цією технологією було
виготовлено 10 серій Рабівак ХТТ загальним об’ємом 544,11 тис. доз, які
за висновком комісії, в складі якої приймав участь представник ДНКІБШМ,
відповідали вимогам, що наведені в нормативних документах.

Виробничі випробування Рабівак ХТТ проведені в мисливських угіддях 25
районів Полтавської області, де за період 1994-2003 років було
зареєстровано 1077 неблагополучних пунктів, в яких спостерігали
захворювання 1438 тварин (ВРХ – 555, ДРХ – 29, собак – 257, свиней – 2,
котів – 5, лисиць – 302, куниць – 7, єнотів – 19, борсуків – 4, щурів –
2, вовків, козуль та кажанів – по 1 тварині). До цього щеплення проти
сказу проводились в області безсистемно. Вакцини КАРМАК (Словенія),
Синраб (Росія), РАБІФОКС — штам SAD PS (Німеччина) застосовувались
локально і в невеликих об’ємах, що не сприяло поліпшенню епізоотичного
стану зі сказу.

Нами поставлено 312 тисяч доз Рабівак ХТТ, котра сформованими у кожному
районі групами фахівців була розкладена в мисливських угіддях, в місцях
мешкання диких тварин. Щільність розкладання складала від 9,1 до 46,3, у
середньому 27,7 принад-вакцини/км2 . Ефективність поїдання принад у
перші 3 доби складала – 49,2%, 8 діб – 77,2% і 15 діб – 93,2%.
Споживання принад у Гребінківському, Гадяцькому, Лохвицькому,
Миргородському та Хорольському районах у перші доби було максимальним і
завершилось за 8 діб, а в Диканському, Зінківському, Шишацькому не
перевищувало 75%.

З метою з’ясування ефективності імунізації лисиць проведено контрольний
відстріл цих тварин, проте в невеликій кількості. Із досліджених в
Центральній державній лабораторії ветеринарної медицини за методом ІФА
через 1,5-2-місяці після вакцинації 42 проб сироваток крові відстріляних
тварин в 33-х виявлені специфічні до вірусу сказу антитіла. Кількість
позитивно реагуючих склала – 78,6%. Титри вірусоспеціфічних антитіл
коливались від 0,06 до 4,4 МО. При наступному через 2,5-3 місяці від
початку імунізації позитивно реагуючими були лише 31,25% з титром
антитіл 3,6-0,14 МО, що вказувало на поступове зниження напруженості
імунітету.

Що стосується епізоотичної ситуації щодо сказу тварин після застосування
Рабівак ХТТ у Полтавській області, встановлено зменшення на 76
неблагополучних пунктів і на 103 випадки захворювання на сказ порівняно
з 2003 роком. В той же час спостерігалась тенденція їхнього зростання
наприкінці року, що пояснюється зменшенням імунної популяції тварин за
рахунок приплоду, а також зниженням напруженості поствакцинального
імунітету, що вказує на необхідність проведення вакцинації диких
м’ясоїдних два рази на рік (восени в період гону і весною для охоплення
вакцинацією підростаючого молодняка).

Удосконалення технології виготовлення вакцини антирабічної
інактивованої сухої культуральної із штаму Щелково-51. Незважаючи на те,
що на сьогодні запропоновано ряд інактивованих антирабічних засобів
профілактики сказу, що широко використовуються ветеринарною медициною,
проблема створення ефективних вакцин залишається актуальною не тільки
щодо їх ефективності, а багатьох технологічних аспектів. На Державній
Сумській біофабриці з 1997 року виготовляється вакцина антирабічна
інактивована суха культуральна з штаму Щелково-51, яка була впроваджена
замість знятої з виробництва тканинної Рабівак-Ф. У процесі виготовлення
цієї вакцини нами зроблено аналіз технологічних процесів із
застосуванням виробничого штаму Щелково-51, різних клітинних систем для
його репродукції і напрацювання напівфабрикатів, на підставі якого
внесені зміни щодо технології виробництва. Перш за все, за результатами
вибору тест об’єкту для культивування і накопичення вихідної для
виготовлення вакцини біомаси штаму Щелково-51 встановлено, що більш
чутливою і продуктивною є ролерна моношарова культура перещеплюваних
клітин ВНК-21, клон 13/04, в якій титр інфекційності був досить
стабільним на рівні 7,0-7,3 lg МЛД50/0,03 мл і перевищував цей показник
в культурі клітин ПС на 1,5 lg, Vero — 2,3 lg, MDСK — 2,1 lg, Frhk — 1,7
lg i BHK-21/13 — 0,6 lg МЛД50/0,03 мл, а в первинно трипсинізованих
культурах ФЕП і ФЕК — на 3,4 і 3,6 lg МЛД50/0,03мл. До того ж, ролерний
спосіб культивування клітин і вірусу виявився продуктивнішим у 2 рази
внаслідок накопичення його біомаси порівняно із стаціонарним (у
матрасах), а також виключення із технологічного процесу вирощування
моношарової культури інтактних клітин для зараження вірусом за рахунок
запропонованого способу зараження суспензії клітин при висіві в ролерні
бутлі.

Встановлений факт високої репродуктивної здатності штаму в
перещеплюваних клітинах ВНК-21, клон 13/04, і удосконалена технологія
зараження клітин та культивування штаму Щелково-51 має важливе практичне
значення щодо зниження виробничих і енергетичних витрат.

На підставі аналізу засобів і методів з інактивації біомаси, що містить
вірус сказу, перед нами постало завдання щодо вибору найбільш
ефективного інактиватора. На моделі культурального вірусу у
порівняльному аспекті була вивчена інактивуюча дія фенолу,
формальдегіду, теотропіну, етанолу та в-про-піолактону при трьох
температурних режимах (4-10 єС, 20-22 єС, 37±0,5 єС). Повна інактивація
вірусу за 24 години при 4-10 єС, найбільш оптимальній температурі, яка
не впливала негативно на його антигенну активність, досягалась за
допомогою 0,025% в-пропіолактону, що підтверджено відсутністю залишкової
вірулентності у трьох послідовних пасажах шляхом інтрацеребрального
зараження мишей інактивованим матеріалом. 0,75% фенол також забезпечував
при цьому температурному режимі інактивацію штаму Щелково-51 вірусу
сказу, проте, оскільки він, за даними Стогова Л.С. з співавт. (1975), в
поєднанні з неоптимальним температурним фактором може згубно відбиватись
у процесі збереження на імуногенності, а також у зв’язку з досить
вираженими його подразнюючими властивостями для вакцинованих тварин, ми
зупинили свій вибір на в-пропіолактоні. Він не впливав на антигенну
структуру інактивованого вірусу. Активність антигену з інактивованого
в-пропіолактоном вірусу була високою і забезпечувала індукцію
вірусонейтралізуючих антитіл на рівні 5,7 log2. Титр вірусоспецифічних
антитіл у тварин, щеплених зразками вірусу, інактивованого 0,75%
фенолом; 0,3% формальдегідом; 0,1% теотропіном і 40% етанолом, був на
рівні 5,6; 5,4; 4,8; і 5,0 log2, відповідно, що вказує на деяке зниження
антигенної активності, особливо зразків, інактивованих теотропіном і
етанолом.

Одним із важливих аспектів наших досліджень щодо удосконалення
технології з виготовлення інактивованої вакцини було визначення
залежності її імуногенних властивостей від форми випуску біопрепарату.
Як відомо, терміни придатності рідкої вакцини недовготривалі і залежать
від способу консервації, для чого використовують різні речовини або їхні
суміші. Проте без належного температурного режиму не досягається
довготривале збереження. Сублімаційне висушування значно розширює
температурний діапазон збереження і транспортування вакцин. Однак
ліофільне висушування знижує імуногенність інактивованого вірусу сказу і
потребує використання захисних речовин. Нами випробувані у порівняльному
аспекті захисні властивості суміші з 7,5% сахарози + 1,5% желатину +
0,03% агара; 7,5% сахарози + 1,5% желатину + 1% пептону; 7,5% сахарози +
1,5% желатину; 1% пептону та знежиреного молока. Найбільш вираженими
стабілізуючими властивостями імуногенності вакцини як у процесі
висушування, так і збереження впродовж 12 місяців мали
сахарозо-желатинова, сахарозо-желатино-агарова та
сахарозо-желатино-пептонна суміші. Титри вірусонейтралізуючих антитіл у
мишей, щеплених ліофілізованими зразками вакцини під захистом зазначених
сумішей, фактично були на рівні щеплених рідкою вакциною. Однак
імуногенна активність останньої навіть при збереженні у замороженому
стані при мінус 20 єС вже через 9 місяців знижувалась майже вдвічі, а
через рік — у чотири рази. На підставі отриманих результатів було
скомпоновано захисне середовище для стабілізації імуногенних
властивостей інактивованої вакцини у процесі висушування, збереження і
транспортування на розчині 0,44% двозаміщеного та 0,99% однозаміщеного
калію фосфорнокислого (деклараційний патент на корисну модель 9060 від
15.09.2005 р.).

За результатами досліджень внесені зміни до інструкції з виготовлення і
контролю вакцини антирабічної інактивованої сухої культуральної з штаму
Щелково-51 як доповнення № 1 і № 2, що затверджені директором біофабрики
12 вересня 2002 р. і 7 липня 2003 р., котрі передбачають культивування
штаму Щелково-51 в перещеплюваній культурі клітин ВНК-21/13,
використання культуральної вірусовміщуючої біомаси для виготовлення
вакцини з титром інфекційності не нижче 5 lg МЛД50/0,03 мл, його
інактивації та склад захисного середовища для висушування вакцини. Ці
зміни включені до ТУ У 46.15.254-97 і затверджені Головним державним
інспектором ветеринарної медицини України

27 грудня 2004 р.

Виготовлені за удосконаленою технологією зразки вакцини (рідкої і сухої)
випробувані на імуногенність на мишах, собаках, вівцях і молодняку
великої рогатої худоби. Результати цього досліду показали, що вакцина
забезпечувала формування напруженого імунітету у білих мишей, який був
тотожним з тим, що отримували при застосуванні сухої Рабівак-Ф і вакцини
культуральної з штаму Щелково-51, інактивованого 0,75% фенолом. Зразки
рідкої і сухої вакцини викликали активну індукцію вірусонейтралізуючих
антитіл, які виявлялись у сироватках крові мишей на 7 добу після
щеплення (у титрі 4,6 log2), а після повторного введення вакцини через
28 діб підвищувались на 1-1,5 log2. Рівень вірусонейтралізуючих антитіл
корелював зі стійкістю мишей до інтрацеребрального зараження штамом CVS
фіксованого вірусу сказу. Вакцина виявилась нешкідливою: при підшкірному
введенні 0,5 мл вакцини тварини залишались живими. У місці введення
вакцини ніяких змін, як-то набряк чи запалення не спостерігали.

Результати випробування вакцини антирабічної інактивованої сухої
культуральної зі штаму Щелково-51 на собаках підтвердили її високу
імуногенність. Привертає увагу те, що інактивована вакцина в дозі 2 мл
індукувала утворення на 7 добу вірусонейтралізуючих антитіл у титрі 3,2
log2. Проте після повторного введення через 24 доби він підвищувався до
6,6 log2. Оптимальною дозою для собак є 2-3 мл (в залежності від маси
тварин), яка при дворазовому щепленні забезпечувала імунітет впродовж 12
місяців. Імуногенність розробленої нами вакцини перевірена також на
вівцях і молодняку ВРХ, у яких при дворазовому введенні у дозах 3 і 5 мл
вона створювала імунітет з рівнем вірусонейтралізуючих антитіл 5,8-6,8
log2.

Таким чином, результати проведених досліджень свідчать, що удосконалена
технологія виробництва вакцини антирабічної інактивованої сухої
культуральної зі штаму Щелково-51 дозволяє виготовляти високоактивний в
імуногенному відношенні, нешкідливий для тварин, безпечний для довкілля
(внаслідок відсутності живого збудника) біопрепарат, який не
поступається застосовуваним до цього часу Рабівак-Ф і вакцини з штаму
Щелково-51, інактивованого фенолом.

У відповідності з нормативною документацією, затвердженої Державним
департаментом ветеринарної медицини, до якої внесені відповідні зміни, в
умовах Державної Сумської біофабрики виготовлено 5638572 дози, у тому
числі у 2005 році — 1717000 доз вакцини антирабічної інактивованої сухої
культуральної з штаму Щелково-51. Усі серії перевірені на стерильність,
нешкідливість та імуногенність на білих мишах. За результатами
державного контролю вони визнані придатними для використання. З них на
01.01.2006 року реалізовано 5465116 доз 183 серій. Ні на одну з них не
надійшло рекламацій.

Корекція поствакцинального антирабічного імунітету. Останнім часом у
біотехнології сформувались два напрямки розвитку засобів імунологічного
захисту: продовжуються і розширюються зусилля щодо створення ефективних
в імуногенному відношенні вакцин і одночасно швидко розвивається новий
розділ з регуляції імунологічної реактивності за допомогою неспецифічних
препаратів – імуномодуляторів. Багатообіцяюча сукупність біологічних
захисних факторів, що відносяться до основних категорій специфічного і
неспецифічного (природного) імунітету, зараз розглядається як єдиний
комплекс. Оскільки ступінь захисту ЦНС від вірусу сказу надзвичайно
зростає з підвищенням вмісту вірусонейтралізуючих антитіл, є
необхідність у прискоренні їхньої індукції. Зважаючи на те, що при
вимушеній антирабічній імунізації можуть бути щепленими тварини з не-
діагностованими порушеннями імунної системи, які супроводжуються
пригніченням функції макрофагів, презентувати антиген імунокомпетентним
клітинам, утворення цитотоксичних Т-лімфоцитів та В-лімфоцитів, від яких
залежить синтез вірусоспецифічних антитіл, є одним із завдань досліджень
було вивчення імунної відповіді у тварин із різним станом імунної
системи.

У трьох господарствах Сумської області були сформовані групи корів, стан
імунітету яких оцінювали за рівнем імуноглобулінів та
альбуміно-глобулінового співвідношення. Перший гурт складався з корів з
дефіцитним станом імунітету, у яких рівень імуноглобулінів не
перевищував 12-17%, а альбуміно-глобулінове співвідношення було 1,1;
другий — з частковим імунодефіцитом — рівень імуноглобулінів не
перевищував 18-22%, а альбуміно-глобулінове співвідношення було в межах
0,8-1.0 і третій — з нормальним станом імунітету (рівень імуноглобулінів
сягав вище 22%, а альбуміно-глобулінове співвідношення менше 0,8. Кожний
гурт корів був розділений на 2 групи, одній з яких щепили підшкірно
дворазово з інтервалом 10 діб вакцину антирабічну інактивовану суху
культуральну з штаму Щелково-51 у дозі по 5 мл, другій — вакцину
водночас з введенням ліпополісахаридного комплексу, виготовленого нами
на Державній Сумській біофабриці шляхом лужного гідролізу культури штаму
КМІЕВ-11 Bac. аlvei, з розрахунку 7 мг/кг маси тварин. За імунологічним
дослідженням на мишах і цуценятах встановлено, що ЛПС КМІЕВ-11
нешкідливий для тварин при пероральному і підшкірному введенні, має
виразні імунопотенціюючі властивості. В організмі тварин
ліпополісахаридний комплекс КМІЕВ-11 стимулював функцію
імунокомпетентних клітин, призводив до зростання загальної кількості
лімфоцитів у середньому на 1,8±0,5%, Т- і В- лімфоцитів на 43,2 і 72,4%,
відповідно, а також значно активізував фагоцитоз. Фагоцитарне число та
фагоцитарний індекс підвищувались на 5,29 та 263%.

За імунологічним аналізом зразків крові у наших дослідах встановлено, що
антирабічна вакцина активізувала в організмі щеплених корів
гематологічні попередники незалежно від стану імунної системи до 33,4%
порівняно з показниками контрольних (не імунізованих груп). Фагоцитарне
число підвищувалось на 5,4 одиниць, а фагоцитарний індекс зростав в
середньому на 235%, хоча у корів з імунодефіцитним станом ці показники
імунної відповіді фактично досягали максимального рівня лише на 60 добу,
в той час як у тварин з нормальним станом імунітету — на 28-30 добу. При
щепленні вакцини водночас з ЛПС КМІЕВ-11 фагоцитарне число та
фагоцитарний індекс були значно вищими, що вказує на модулюючі
властивості на макрофагальну ланку імунної відповіді організму корів: на
7 добу зростав показник кількості нейтрофілів до 17-18%, а через 28 діб
він перевищував останній у контрольних тварин у 4-5,5 разів.

Між тим основним показником імуномодулюючого ефекту ЛПС КМІЕВ-11 при
одночасному введенні з вакциною було більш виражене збільшення Т- і
В-лімфоцитів, кількість яких зростала на 47 і майже на 90% порівняно з
контролем, що корелює з продукцією вірусонейтралізуючих антитіл, титр
яких у корів з нормальним станом імунної системи був на рівні 5,4 log2
на сьому добу і досягав максимуму (7,0 log2) через 28 діб після
щеплення, (рис 4).

У корів з імунодефіцитним станом введення вакцини водночас з ЛПС
КМІЕВ-11 забезпечувало більш ранню індукцію вірусонейтралізуючих
антитіл, які встановлені вже на 7 добу у титрі 3,4-3,6 log2 , в той час
як при щепленні однієї вакцини їхній показник досягав цього рівня лише
на 60 добу. До того ж, титр антитіл на рівні 3,0 log2 утримувався у цих
тварин до 10 місяців, після чого поступово знижувався до 2,5 log2 через
12 місяців і майже до мінімуму — 0,9±0,5 log2 через 15 місяців від
початку імунізації. Отримані дані свідчать, що у корів з імунодефіцитним
станом слабкіше виражена протективна відповідь на щеплення антирабічної
вакцини і через 10 місяців вони можуть бути сприйнятливими до вірусу
сказу.

У тварин, яким вводили вакцину одночасно з ЛПС КМІЕВ-11, встановлена
суттєва активізація клітинної популяції імунної системи і продукції
вірусонейтралізуючих антитіл, титр яких був вищим на 1,5-2 log2
порівняно з щепленими однією вакциною. У корів з імунодефіцитним станом
імунна відповідь на щеплення вакцини і ЛПС КМІЕВ-11 була більш
продуктивною, хоча титр вірусонейтралізуючих антитіл і не досягав рівня
показників у тварин з нормальним станом імунної системи. Однак за
рахунок ЛПС КМІЕВ-11 спостерігався позитивний ефект щодо індукції
захисного титру вірусоспецифічних антитіл уже на 7 добу від початку
імунізації, рівень яких становив 5,0 log2 і утримувався (±0,5 log2)
впродовж року (термін спостереження).

Отримані результати свідчать, що застосування ЛПС КМІЕВ-11 підвищує
імунний захист та макрофагальну ланку імунної відповіді у тварин з
імунодефіцитним станом і дозволяє здійснювати корекцію поствакцинального
антирабічного імунітету шляхом активації функції популяції клітин
імунної системи у щеплених вакциною тварин. Ліпополісахаридний комплекс
КМІЕВ-11 в організмі тварин з імунодефіцитним станом відновлює функцію
імунокомпетентних клітин, вирівнює та підсилює процеси імуногенезу у
поствакцинальний період. Імунологічна перебудова організму великої
рогатої худоби при щепленні вакциною антирабічною інактивованою сухою
культуральною з штаму Щелково-51 водночас з ЛПС КМІЕВ-11 супроводжується
підвищенням функціональної активності макрофагів, Т- і В- лімфоцитів та
більш високою продукцією вірусонейтралізуючих антитіл, поліпшенням
антиоксидантного статусу тварин та інших показників неспецифічної
резистентності.

Отже, нами на підставі науково-теоретичного обґрунтування і
експериментальних досліджень створені та рекомендовані до застосування
жива антирабічна культуральна вакцина (Рабівак ХТТ) для оральної
імунізації диких м’ясоїдних та удосконалена технологія виготовлення
вакцини антирабічної інактивованої сухої із штаму Щелково-51, розроблено
засіб для корекції поствакцинального антирабічного імунітету у тварин з
імунодефіцитним станом.

На запропоновані засоби специфічної профілактики сказу тварин
підготовлена і затверджена Державним департаментом ветеринарної медицини
України нормативна документація, за якою на Державній Сумській
біофабриці налагоджене їхнє серійне виробництво.

ВИСНОВКИ

1. На підставі аналізу епізоотичної ситуації щодо сказу тварин у світі
та в Україні визначені основні особливості та тенденції розвитку
епізоотичного процесу в сучасний період і головні фактори, що визначають
ризики виникнення, розповсюдження та контролю цього зооантропонозу,
зокрема регуляції популяції диких тварин та вакцинації. Експериментально
обґрунтована і технологічно розроблена жива культуральна вакцина для
імунізації диких м’ясоїдних. Удосконалено технологію виготовлення
антирабічної інактивованої культуральної вакцини для щеплення свійських
тварин, запропоновані препаративні форми і дози їхнього застосування, а
також засоби корекції імунітету у щеплених тварин.

2. Тенденція поширення сказу серед тварин залежить від зональних
природно-географічних особливостей території України, заселення
популяцій диких м’ясоїдних, в першу чергу рудої лисиці, яка є основним
резервуаром інфекції, проведення системної та регулярної вакцинації
шляхом застосування препаратів з різною імуногенністю. З 1994 року по
2004 рік більше, ніж у три рази збільшилась загальна кількість випадків
реєстрації уражених сказом тварин, у тому числі свійських, що
обумовлюється збудником хвороби природного типу.

3. Перебіг сказу тварин в Україні носить стаціонарний ензоотичний
характер. За 11-річний період підвищення епізоотичної напруженості щодо
сказу обумовлено активізацією природних і зростаючим збільшенням
ландшафтних осередків захворювання на сказ свійських м’ясоїдних і
сільськогосподарських тварин в приміських і сільських місцевостях.
Спостерігається стале сезонне збільшення числа захворювань на сказ без
вираженої циклічності епізоотії.

4. Розроблена жива культуральна вакцина Рабівак ХТТ з атенуйованого
штаму НФ-2 вірусу сказу, репродукованого в ролерній культурі
перещеплюваних клітин ВНК-21, клон 13/04, з інфекційною активністю не
нижче 5,0 lg МЛД50/0,03 мл, що вміщує 2% пектину, апатогенна для
лабораторних і м’ясоїдних тварин при внутрішньом’язовому, підшкірному та
пероральному введенні.

5. Препаративна форма Рабівак ХТТ для перорального застосування, що
являє собою блістер-принади, в яких вакцина в дозі 5 мл в пакетах із
полівінілхлоридної плівки заключена в брикети з шматочків м’яса або
риби, здобрених рибним або м’ясо-кістковим борошном, забезпечує
створення напруженого імунітету (титр вірусонейтралізуючих антитіл
6,4-6,8 1оg2) у тварин впродовж 8 місяців.

6. Виробничий штам Щелково-51С вірусу сказу, отриманий шляхом адаптації
культивуванням у культурі перещеплюваних клітин, що використовується для
виготовлення інактивованої антирабічної вакцини, має високу інфекційну
активність 7,0 lg МЛД50/0,03 мл і забезпечує максимальне накопичення
вірусу на 3-4 добу.

7. Зараження суспензії перещеплюваних клітин ВНК-21, клон 13/04, при
висіві в ролерні культуральні бутлі, дозволяє скоротити термін отримання
вихідної для виготовлення препарату вірусовміщуючої сировини на час,
котрий витрачається на вирощування моношарової культури клітин (4-6
діб).

8. Удосконалена технологія виготовлення вакцини антирабічної
інактивованої культуральної сухої з штаму Щелково-51 вірусу сказу,
репродукованого в ролерній моношаровій культурі перещеплюваних клітин
ВНК-21, клон 13/04, та інактивованого в-пропіолактоном, дозволяє
виготовляти екологічно безпечний для довкілля препарат, який має високу
профілактичну ефективність (100%) і не поступається живій вакцині.

9. в-пропіолактон в кінцевій концентрації 0,025% забезпечує повну, без
залишкової інфекційності, інактивацію вірусу сказу при температурі 4-10
°С і експозиції впродовж 24 годин порівняно з 0,75% фенолом, для якого
цей термін складає 48 годин.

10. Сублімаційне висушування інактивованої вакцини під захистом
сахарозо-желатинової чи сахарозо-желатино-агарової суміші у
співвідношенні 2:1 ефективно стабілізує її вихідні імуногенні
властивості. Включення до складу живої вакцини 2% яблучного пектину
захищає вакцинний вірус від дії шлункових ферментів i дозволяє зменшити
його імунізуючу дозу при оральному введенні препарату.

11. Розроблені технології виготовлення вільних від сторонньої
мікрофлори, нешкідливих для тварин, високо активних живої та
інактивованої культуральних антирабічних вакцин забезпечують збереження
їх імуногенності впродовж 12 місяців. Імунітет у щеплених ними тварин
виробляється з 12 i 7 доби відповідно після вакцинації i триває 8 i 12
місяців (термін спостереження).

12. Застосування ліпополісахаридного комплексу КМІЕВ-11, виготовленого
iз штаму Вас. alvei, при вакцинації тварин проти сказу проявляє
імунореабілітуючу та імунопотенціюючу дію на імунну систему, активізує
як специфічні, так i неспецифічні фактори резистентності організму у
тварин з імунодефіцитним станом, підвищує імунну відповідь на
антирабічну вакцину, що супроводжується більш високою продукцією
вірусонейтралізуючих антитіл (на 1,5-2,0 log2), зростанням Т- i В-
лімфоцитів на 9% i 7% відповідно фагоцитарного числа на 3,4% та
фагоцитарного індексу на 1 одиницю порівняно з вакциною.

13. Розроблені і затверджені регламенти промислового виготовлення живої
культуральної вакцини Рабівак-ХТТ (ТУ У 24.4.00483004.668-2002) та
вакцини антирабічної інактивованої культуральної сухої з штаму
Щелково-51 вірусу сказу (ТУ У 46.15.254-97), що впроваджені у
виробництво на Державній Сумській біофабриці, за якими на 01.01.2006 р.
реалізовано 1884022 i 5465116 доз, відповідно.

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

Розроблені, затверджені та впроваджені у виробництво:

1. Жива антирабічна культуральна вакцина Рабівак ХТТ для оральної
імунізації диких м’ясоїдних тварин. Реєстраційне посвідчення №
0489-04-059-04 видане Державним департаментом ветеринарної медицини
України 24 жовтня 2004 року.

1.1. Інструкція з виготовлення і контролю Рабівак ХТТ. Затверджена
директором Державної Сумської біофабрики і узгоджена в Державному
науково-дослідному контрольному інституті біотехнології і штамів
мікроорганізмів 20 червня 2004 року.

1.2. ТУ У 24.4.00483004-668-2002 на Рабівак ХТТ. Затверджені Головним
державним інспектором ветеринарної медицини України 30 вересня 2004
року.

1.3. Настанова із застосування Рабівак ХТТ. Затверджена Головним
державним інспектором ветеринарної медицини України 30 вересня 2004
року.

2. Вакцина антирабічна інактивована суха культуральна із штаму
Щелково-51. Реєстраційне посвідчення № 0589-04-0098-04 видане Державним
департаментом ветеринарної медицини України 24 грудня 2004 року.

2.1. Зміни до інструкції з виготовлення і контролю вакцини антирабічної
інактивованої сухої культуральної з штаму Щелково-51. Доповнення № 1 і №
2 затверджені 12 вересня 2002 року і 7 липня 2003 року, відповідно,
директором Державної Сумської біофабрики і узгоджені в Державному
науково-дослідному контрольному інституті біотехнології і штамів
мікроорганізмів.

2.2. Зміни до ТУ У 46.15.254-97 на вакцину антирабічну інактивовану суху
культуральну з штаму Щелково-51. Затверджені Головним державним
інспектором ветеринарної медицини України 27 грудня 2004 року.

3. Технологічний регламент з виготовлення та контролю імуностимулятора
КМІЕВ-11. Затверджений директором Державної Сумської біофабрики
30.01.2006 р.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Нычик С.А. Распространение, профилактика и меры борьбы с бешенством
животных в Украине // Сумы. – 2006. – 162 с.

2. Фотін А.І., Ничик С.А. Умови культивування культур клітин для
розмноження вакцинних штамів вірусу сказу // Вісник Сумського
національного аграрного університету. – Суми.- 2002. – Вип. 7. – С.
97-99. (Дисертант провів експериментальні дослідження, брав участь в
інтерпретації отриманих результатів і написанні статті).

3. Фотін А.І., Ничик С.А. Одержання вірусного матеріалу для виготовлення
антирабічної вакцини для пероральної вакцинації диких м’ясоїдних //
Вісник Сумського національного аграрного університету. – Суми. — 2002. –
Вип. 8. — С. 98-99. (Дисертант провів експериментальні дослідження і
оформив статтю).

4. Ничик С.А., Аранчій С.В. Епізоотологічні аспекти профілактики сказу
із застосуванням перорального методу імунізації вакциною «Рабівак ХТТ»
// Ветеринарна медицина України. — 2005. – № 6. — С. 9-10. (Дисертант
брав участь у вивченні поширення сказу, аналізі отриманих даних та
розробці заходів специфічної профілактики).

5. Ничик С.А. Вивчення строків виникнення та тривалості імунітету після
пероральної вакцинації диких хижаків при сказі // Аграрний вісник
Причорномор’я. – Одеса. — 2004. – Вип. 25. — С. 24-28.

6. Ничик С.А. Визначення оптимальної дози вірусу та схеми пероральної
антирабічної імунізації диких хижаків // Забезпечення вет.-сан.
Благополуччя тваринництва, якості і безпеки продукції. Зб. праць
Одеського аграрного університету. Аграрний вісник Причорномор’я. –
Одеса. — 2004. – Ч. 1. — С. 159-161.

7. Ничик С.А. Підбір оптимальних режимів ліофільного висушування
культуральної вакцини // Ветеринарна медицина України. — 2005. — № 1. —
С. 33.

8. Ничик С.А. Перевірка якості антирабічної вакцини “Рабівак Ф” //
Вісник Сумського національного аграрного університету. – Суми. — 2004. —
Вип. 7(12). — С. 113-116.

9. Ничик С.А. Розповсюдження фіксованого вірусу сказу в
імунокомпетентних органах хижаків // Науковий вісник Львівської
національної академії ветеринарної медицини імені С. З. Гжицького. –
Львів. — 2004.- Том 6 (№3). — Ч. 2. — С. 76-79.

10. Ничик С.А., Бабкін М.В., Прохорятова О.В. Культивування вірусу сказу
в перещеплюваних лініях культур клітин // Ветеринарна медицина:
міжвідомчий тематичний науковий збірник – Харків. — 2004. – Вип. 84. —
С. 528-531. (Дисертант впровадив крупномасштабне культивування
перешеплюваних клітин в умовах біофабрики, інтерпретував отримані
результати).

11. Ничик С.А., Рисований В.І., Ярошенко В.І. Використання перепелів,
ембріонів і культур клітин з них в ветеринарній практиці // Вісник
Сумського національного аграрного університету. – Суми. — 2004. – Вип.
2(11). — С. 107-109. (Дисертант визначив у порівняльному аспекті
чутливість ембріонів перепелів і первинних культур до вірусу сказу).

12. Ничик С.А. Пероральна імунізація живими вакцинами, як метод
профілактики сказу // Вісник Полтавської державної аграрної академії.
– Полтава. — 2004. – Вип. 4. – С. 67-68.

13. Ничик С.А. Вивчення антигенної активності вірусу сказу, отриманого
на різних біологічних об’єктах // Проблеми зооінженерії та ветеринарної
медицини. – Харків. — 2005. – Вип. 12(37). — Ч. 2. — С. 175-177.

14. Ничик С.А., Прохорятова О.В., Бабкін М.В., Троценко З.Р. Сучасна
характеристика сказу в Харківській, Сумській та Полтавській областях //
Ветеринарна медицина: міжвідомчий тематичний науковий збірник. – Харків.
— 2005. – Вип. 85. — С. 930-934. (Дисертант накопичив фактичний
матеріал, зробив аналіз, брав участь у написанні статті).

15. Ничик С.А. Підбір оптимальних культур клітин і поживних середовищ
для патогенного вірусу сказу у високих титрах // Науково-технічний
бюлетень Інституту біології тварин .ДНДКІ ветпрепаратів та кормових
добавок. – Львів. — 2005. – Вип. 6. — № 1. – С. 105-108.

16. Ничик С.А. Технологічні аспекти виготовлення культуральної
інактивованої антрирабічної вакцини зі штаму “Щелково-51С” //
Ветеринарна медицина України. – 2005. — № 8.- С. 46-48.

17. Nychic S.A. Development of methods of rabies control in wilb fauna
// Simpozijum: Scotarstvo, veterinarstvo, agroekonomija utranzikonim
procesima. Herceg.- Novi, 19-24 jun. 2005 Zb. Krat. sadzaja Proc.Abstr.
— Herceg Novi, — 2005. – Р. 120.

18. Ничик С.А. Характеристика епізоотичної ситуації щодо сказу в Україні
// Вісник Сумського національного аграрного університету. – Суми.-
2005. – Вип. 1-2 (13-14). — С. 109-111.

19. Ничик С.А. Проблемні аспекти превентивної стратегії щодо виникнення
антропургічних вогнищ сказу // Ветеринарна медицина України. – 2005. — №
10. — С. 40-42.

20. Ничик С.А. Перевірка якості культуральної антирабічної вакцини //
Аграрний вісник Причорномор’я. – Одеса. — 2005. – Вип. 30. — С. 82-86.

21. Ничик С.А. Вивчення факторів, що впливають на епізоотичний процес
при сказі тварин у північно-східній Україні // Ветеринарна
біотехнологія. – 2005. — № 7. — С. 133-137.

22. Ничик С.А. Корекція поствакцинального антирабічного імунітету //
Ветеринарна медицина України. — 2005. — № 12.- С. 34-36.

23. Деклараційний патент на корисну модель України 3248 7 С12N7/00.
Штам Rabdoviridae «НФ-2» для виготовлення вакцини проти сказу / Ничик
С.А., Мірошник С.П., Панасенко А.І., Дорошенко Я.В.; Державна Сумська
біологічна фабрика. Заявл. 20.08.2004, опубл. 15.10.2004. — Бюл. № 10.
– 7 с. (Дисертант провів експериментальні дослідження і оформив заявку
на патент).

24. Деклараційний патент на корисну модель України 3245 7 А61К39/17.
Cпociб одержання вакцини проти сказу тварин Paбiвaк «ХТТ» / Ничик С.А.,
Мірошник С.П., Панасенко А.І., Дорошенко Я.В.; Державна Сумська
біологічна фабрика. Заявл. 20.08.2004; опубл. 15.10.2004. — Бюл. № 10. –
5 с. (Дисертант провів експериментальні дослідження і оформив заявку на
патент).

25. Деклараційний патент на корисну модель України 9060 7 А61К39/205.
Cпociб одержання антирабічної вакцини / Ничик С.А., Мірошник С.П.,
Дорошенко Я.В., Бабкін М.В., Романенко О.А.; Державна Сумська біологічна
фабрика. – Заявл. 25.11.2004; опубл. 15.09.2005 Бюл. № 9. – 7 с.
(Дисертант провів експериментальні дослідження і оформив заявку на
патент).

26. Деклараційний патент на корисну модель України 6015 7 С12N5/00.
Штам перещеплюваних клітин нирки сірійського хом’ячка ВНК-21 CLONE 13/04
/ Стегній Б.Т., Ничик С.А., Білокінь В.С., Бабкін М.В., Лаврик О.А.,
Юрченко О.М.; ІЕКВМ УААН. Заявл. 29.06.2004; опубл. 15.04.2005. Бюл. №
4. – 3 с. (Дисертант провів експериментальні дослідження і оформив
заявку на патент).

27. Деклараційний патент на корисну модель України 10104 7 А61К35/78,
А61К38/01. Спосіб стимуляції імунітету у тварин / Ничик С.А., Красочко
П.А.; Державна Сумська біологічна фабрика. – 20041210236. – Заявлено
13.12.2004; опубл. 15.11.2005. Бюл. № 11. – 9 с. (Дисертант провів
експериментальні дослідження і оформив заявку на патент).

28. Деклараційний патент на корисну модель України 9061 7 А61К39/205.
Штам Rabdoviridae «Щелково-51С» для виготовлення вакцини проти сказу
тварин/ Ничик С.А. Державна Сумська біологічна фабрика.
Заявл.25.11.2004, опубл. 15.09.2005. Бюл. № 9. – 5 с. (Дисертант провів
експериментальні дослідження і оформив заявку на патент).

29. Деклараційний патент на корисну модель України 5296 7 А61К39/295.
Спосіб виробництва принади для пероральної імунізації м’ясоїдних тварин
проти захворювання на сказ/ Солодчук В.Л., Ничик С.А. Державне
товариство з обмеженою відповідальністю «Укрветпромпостач».
Заявл.10.12.2004, опубл. 15.02.2005. Бюл. № 2. – 6 с. (Дисертант провів
експериментальні дослідження і оформив заявку на патент).

30. Деклараційний патент на корисну модель України 7544 7 А61К39/295.
Спосіб виробництва принади для пероральної імунізації диких м’ясоїдних
тварин проти інфекційних захворювань/ Солодчук В.Л., Ничик С.А. Державне
товариство з обмеженою відповідальністю «Укрветпромпостач».
Заявл.25.01.2005, опубл. 15.06.2005. Бюл. № 6. – 7 с. (Дисертант провів
експериментальні дослідження і оформив заявку на патент).

Ничик С.А. Розробка і застосування засобів специфічної профілактики
сказу тварин. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора ветеринарних наук за
спеціальністю 16.00.03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія.
Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН.
Харків, 2006.

Захищаються дані з аналізу епізоотичної ситуації сказу тварин в Україні,
методичні аспекти застосування клітинних систем у промисловій технології
виготовлення живої та інактивованої антирабічних культуральних вакцин,
теоретичне та експериментальне обґрунтування основних технологічних
процесів з вибору і культивування виробничих штамів вірусу сказу,
конструювання і розробки технології промислового виготовлення та
застосування зазначених біопрепаратів і корекції поствакцинального
імунітету.

Підібрана технологічна клітинна система, що забезпечує активну
репродукцію і накопичення біомаси виробничих штамів вірусу сказу з
високою інфекційністю. Визначені ефективні захисні середовища, що
зберігають антигенні властивості вакцинного вірусу сказу при пероральній
імунізації диких м’ясоїдних тварин та при сублімаційному висушуванні
інактивованого біопрепарату.

У лабораторних і виробничих випробуваннях на різних видах тварин
показано, що вакцини нешкідливі, екологічно безпечні, високоімуногенні.
При дворазовому застосуванні активізують в організмі щеплених тварин усі
компоненти імунної системи, забезпечують індукцію вірусонейтралізуючих
антитіл у високих титрах (5,0-6,0 log2), створюють захист від інфекції
впродовж 8 і 12 місяців відповідно.

Запропоновано засіб для корекції імунітету при щепленні тваринам з
імунодефіцитним станом вакцини інактивованої антирабічної сухої
культуральної з штаму Щелково-51.

Розроблена нормативна документація на засоби специфічної профілактики
сказу затверджена Державним департаментом ветеринарної медицини України,
виробництво яких налагоджено на Державній Сумський біофабриці.

Ключові слова: сказ, епізоотична ситуація, виробничі штами вірусу сказу,
біологічні властивості, клітинні системи, культивування, жива та
інактивована антирабічні вакцини, інактивація, антигенні властивості,
імуногенність, ліпополісахарид, доза.

Нычик С.А. Разработка и применение средств специфической профилактики
бешенства животных. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук по
специальности 16.00.03 – ветеринарная микробиология и вирусология.
Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины УААН.
Харьков, 2006.

Защищаются данные по анализу эпизоотической ситуации бешенства в
Украине, методические аспекты применения клеточных систем в промышленной
технологии изготовления живой и инактивированной антирабических
культуральных вакцин, теоретическое и экспериментальное обоснование
основных технологических процессов по выбору и культивированию
производственных штаммов вируса бешенства, конструированию и разработке
технологии промышленного изготовления и применения этих препаратов.

Подобранная технологичная клеточная система обеспечивает активную
репродукцию и накопление биомассы производственных штаммов вируса
бешенства с высокой инфекционностью. Скомпонованы эффективные защитные
среды, сохраняющие антигенные свойства производственных штаммов вируса
бешенства живой вакцины при оральной иммунизации диких плотоядных
животных и в процессе сублимационного высушивания инактивированного
биопрепарата.

В лабораторных и производственных испытаниях на различных видах животных
показано, что вакцины безвредны, экологически безопасны, высоко
иммуногенные. При двукратном введении в дозах 5 мл с интервалом 10-12
суток активизируют в организме привитых животных все компоненты иммунной
системы, обеспечивая образование вируснейтрализующих антител в титрах
5,0-6,0 log2 и защиту от заражения на протяжении 8 и 12 месяцев,
соответственно.

Предложен способ иммунокоррекции при иммунизации вакциной антирабической
инактивированной сухой культуральной с помощью липополисахаридного
комплекса, изгоотовленного методом щелочного гидролиза культуры Bac.
alvei, штамм КМИЭВ-11. Одновременное введение животным антирабической
вакцини и ЛПС КМИЭВ-11 сопровождается повышением функциональной
активности макрофагов, Т- и В-лимфоцитов и более высокой продукцией
вируснейтрализующих антител, улучшению антиоксидантного статуса и других
показателей резистентности животных на фоне вторичных иммунодефицитов.

Разработанная нормативная документация на средства специфической
профилактики бешенства утверждена Государственным департаментом
ветеринарной медицины Украины, производство которых освоено на
Государственной Сумской биофабрике.

Ключевые слова: бешенство, эпизоотическая ситуация, производственные
штаммы вируса бешенства, биологические свойства, клеточные системы,
культивирование, инактивация, живая и инактивированная антирабические
вакцины, антигенные свойства, иммуногенность, липополисахарид, доза.

Nychik S.A. Development and application of means for specific
prophylaxis of rabies. – Manuscript.

Thesis for a Doctor’s degree (Veterinary Medicine), speciality 16.00.03-
Veterinary Microbiology and Virology. Institute of Experimental and
Clinical Veterinary Medicine of UAAS, Kharkov, 2006.

Data on analysis of rabies epizootical situation in Ukraine, methodical
aspects of cell systems application for industrial technology of live
and inactivated antirabic cultural vaccine manufacturing, theoretical
and experimental ground of main technological processes of choosing and
cultivation of rabies virus production strains, constructing and
development of industrial manufactural technology and application of
these preparations are maintained.

Selected technological cell system provides an active reproduction and
accumulation of rabies virus strain biomass of high infectivity.
Effective protective media which preserve antigenic properties of rabies
virus production strains of live vaccine at oral immunization of wild
carnivorous and during sublimatical drying process of inactivated
biopreparations have been determined.

In experimental and production tests on different animal species it was
shown that vaccines are harmless, environmentally safe,
high-immunogenic. At two-fold inoculation in the dose of 5 ml at 10–12
days intervals they activate all immune system components at vaccinated
animals providing antiviral antibody formation in high titres (5.0 – 6.0
log2) and protection from infection during 8 and 12 months,
respectively. The method of immunocorrection at animal immunization with
antirabic inactivated dried cultural vaccine against a background for
secondary immunodeficiency is proposed.

Developed normative documentation for rabies specific prophylaxis means
has been approved by State Department of Veterinary Medicine of Ukraine
and their production has been established at State Sumy Biofactory.

Key words: rabies, epizootic situation, rabies virus production strains,
biological properties, cell systems, culture, inactivation, live and
inactivated antirabic vaccines, antigenic properties, immunogenecity,
lypopolysaccharide, doze.

PAGE 1

Похожие записи