КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

ЛЯННА ОЛЬГА ЛЕОНІДІВНА

УДК 577.152.34; 616.006

Роль цистеїнових катепсинів у деградації білків при патологічних станах

03.00.04 – біохімія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Дніпропетровському національному університеті.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Чорна Валентина Іванівна,

Дніпропетровський національний університет,

професор кафедри експериментальної фізики.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий
співробітник

Мінченко Олександр Григорович,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України,

завідувач відділу молекулярної біології;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Хижняк Світлана Володимирівна,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

біологічний факультет,

провідний науковий співробітник

лабораторії фізико-хімічної біології.

Захист відбудеться «24» _грудня____ 2007 р. о 16 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного
університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, пр-т академіка
Глушкова 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 434.

Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 64, біологічний
факультет, спеціалізована вчена рада Д 26.001.24.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Київського національного
університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул.
Володимирська, 58.

Автореферат розісланий «15» _листопада_ 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради
Т.Р. Андрійчук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Біохімічні, клініко-біохімічні дослідження механізмів
патологічних процесів та розробка ефективних заходів для збереження
здоров’я нації становить особливо актуальну проблему для України.
Внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС, яка класифікується як глобальна
техногенна катастрофа, загострення екологічної ситуації, рівень
захворюваності населення країни невпинно зростає (Іпатов А.В., 2002,
Леха В., 2005). На окрему увагу в цьому питанні заслуговує проблема
канцерогенезу (Зюков О., 2002, Ліанова Е.М., 2006, Міронова Ю.А., 2006).
На фоні активного вивчення процесу виникнення неоплазії, залишається
багато нез’ясованого стосовно протікання пухлинної трансформації клітин,
отримання ними властивостей, які обумовлюють стійкість протипухлинним
методам лікування (Koblinski J.E. et al., 2000, Castells A. et al.,
2002, Lin N.U. et al., 2004, Skrzydlewska E. et al., 2005, Nusse R.,
2007). На особливу увагу заслуговують дослідження біохімічних процесів,
які мають місце в клітині при її перетворенні на злоякісну та змін
метаболізму функціонування її ферментних систем. Відомо, що
протеолітичні ферменти, які приймають участь у канцерогенезі,
залучаються в складну послідовність взаємовідносин ракової клітини з
нормальними прилеглими тканинами, регуляторними та захисними системами
організму хазяїна (Matrisian L.M. et al., 2003, DeClerk Y.A. et al.,
2004, Arora P. et al., 2007). Останнім часом особлива увага приділяється
дослідженню участі протеолітичного-антипротеолітичного балансу та його
регуляції за канцерогенезу (Turk B. et al., 2000, Berdowska I. et al.,
2004). Серед протеїназ, пов’язаних зі злоякісним ростом, основними є
металопротеїнази, аспартільна протеїназа катепсин D та цистеїнові
протеїнази (катепсини В, L та Н) (Okamoto I. et al., 1999, Mareel M. et
al., 2003, Fehrenbacher N. et al., 2005). Порушення експресії,
компартменталізації, секреції цистеїнових катепсинів та регуляції їх
активності представляє собою відмінну рису пухлинних клітин (Jedeszko
C., 2004, Mohamed M., 2006). Секреція лізосомних кислих протеїназ
клітинами пухлини призводить до деструкції екстрацелюлярного матриксу та
лізису базальної мембрани, що є необхідною умовою інвазії пухлини
(Kayser K., 2003, Werle B. et al., 2004). Відомо, що за нормальних умов
незначна кількість каталітично активних катепсинів, які звільнилися з
лізосом пошкоджених клітин, ефективно блокується їх внутрішньо- та
зовнішньоклітинними інгібіторами, тоді як у трансформованій клітині
активація протеїназ пов’язана зі змінами синтезу, процесінгу та
локалізації їх ендогенних інгібіторів (Dickinson D.P., 2002, Turk B. et
al., 2002, Hirsch J. et al., 2004). Але питання участі лізосомних
цистеїнових протеїназ та їх ендогенних інгібіторів у процесах росту,
інвазії та метастазування пухлин залишається остаточно нез’ясованим.
Таким чином, визначення ролі лізосомних цистеїнових протеїназ
(катепсинів В, L та Н) і модуляції їх активності за умов пухлинного
росту в залежності від конкретної нозології, а також встановлення
зв’язку даних показників з характером перебігу, відповіддю на обрану
терапію та прогнозом захворювань зумовлюють актуальність проведення
досліджень у цьому напрямку.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана
у рамках д/б теми № Фіз.Ф.-63.2-04 “Роль лізосомних протеїназ в
діагностиці патологічного стану організму” кафедри експериментальної
фізики Дніпропетровського національного університету, д/б теми №
4-152-07 “Молекулярно-клітинні механізми розвитку патології нервової
системи та розробка комплексних методів ранньої діагностики” (№ д/р
0107U000529) медичного факультету Дніпропетровського національного
університету, д/б теми “Використання та встановлення критеріїв
ефективності ведучих груп психотропних речовин на поведінкові когнітивні
та мнестичні процеси при психотичних станах” (№ д/р 0199U002121) ЦНДЛ
Дніпропетровської державної медичної академії та договору про
науково-технічне співробітництво між Дніпропетровським національним
університетом та Дніпропетровською державною медичною академією №1256
(2005-2008 рр.).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи – дослідження участі лізосомних
цистеїнових катепсинів у протеолізі білків та особливостей модуляції
активності катепсинів ендогенними інгібіторами за умов патологій.
Відповідно до мети поставлено такі задачі:

дослідити активність лізосомних цистеїнових катепсинів у
післяопераційному матеріалі та плазмі крові хворих з пухлинами головного
мозку;

виділити, очистити та дослідити фізико-хімічні властивості тканинних
ендогенних білкових інгібіторів лізосомних цистеїнових катепсинів за
канцерогенезу головного мозку;

дослідити вплив тканинного ендогенного інгібітору на гідроліз
фібронектину, основного білка екстрацелюлярного матриксу сполучної
тканини, цистеїновими катепсинами;

дослідити активність лізосомних цистеїнових катепсинів у
післяопераційному матеріалі та плазмі крові хворих із пухлинами
щитовидної залози;

виділити, очистити та дослідити фізико-хімічні властивості цистеїнових
катепсинів з пухлин щитовидної залози різного ступеня злоякісності;

дослідити гідроліз тиреоглобуліну, основного білка епітеліальної
тканини, цистеїновими катепсинами, виділеними та очищеними з пухлин
щитовидної залози;

дослідити та оцінити зміни активності лізосомних цистеїнових катепсинів
у плазмі крові хворих із онкологічними захворюваннями головного мозку та
щитовидної залози у післяопераційний період;

дослідити динаміку активності лізосомних цистеїнових катепсинів після
операції на моделі післяопераційного соматогенного болю у щурів, а також
за умов введення металотіонеїнів.

Об’єкт дослідження. Шляхи регуляції протеолізу в тканинах головного
мозку та щитовидної залози за патологічних станів.

Предмет дослідження. Органоспецифічні особливості регуляції активності
цистеїнових катепсинів В, L, Н; фізико-хімічні властивості цистеїнових
катепсинів В, L, Н; взаємодія катепсинів з ендогенними білковими
інгібіторами, виділеними та очищеними з пухлин головного мозку; динаміка
активності цистеїнових катепсинів у біологічних рідинах та тканинах за
патологічних станів; деградація цистеїновими катепсинами основних білків
сполучної та епітеліальної тканин.

Методи дослідження: біохімічні для визначення активності ферментів,
спектрофотометричні, хроматографічні для очистки білків,
електрофоретичні для з’ясування молекулярних мас та чистоти ізольованих
білків, а також математичної статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексне
дослідження активності цистеїнових катепсинів у післяопераційному
матеріалі та плазмі крові хворих за канцерогенезу головного мозку та
щитовидної залози. Показано, що рівень активності ферментів залежить від
ступеня злоякісності пухлин.

Вперше запропоновано метод виділення та очистки ендогенних білкових
інгібіторів цистеїнових катепсинів та отримано очищені препарати
тканинних ендогенних білкових інгібіторів з тканин головного мозку без
новоутворень та пухлин головного мозку; досліджено їх фізико-хімічні та
функціональні властивості.

Вперше отримано очищені препарати цистеїнових катепсинів папілярної та
фолікулярної карцином щитовидної залози, проведено порівняльний аналіз
їх фізико-хімічних властивостей (Мr, Vmax, Км) та досліджено гідроліз
тиреоглобуліну цистеїновими катепсинами, які ізольовані з цих пухлин.

Вперше показано, що активність цистеїнових катепсинів змінюється в
післяопераційний період хворих із онкологічними захворюваннями головного
мозку та щитовидної залози, що проявляється у найбільш виражених змінах
активності катепсинів на першу добу після операції, та тенденцією до її
нормалізації на сьому добу післяопераційного періоду. За використання
моделі післяопераційного соматогенного болю в структурах і відділах ЦНС
та сироватці крові щурів досліджено активність цистеїнових катепсинів на
першу добу та через тиждень після проведення операції, а також визначено
вплив на неї металотіонеїнів (МТ-ІІ).

Практичне значення одержаних результатів. Визначення величин активності
цистеїнових катепсинів В, L, Н у біологічних рідинах та тканинах хворих
із онкологічними захворюваннями головного мозку та щитовидної залози
може бути інформативним методом оцінки (тестом) стану протеолізу
організму за канцерогенезу та використовуватись як об’єктивний показник
перебігу захворювання та ефективності обраної терапії. Дослідження
гідролізу основних білків сполучної (фібронектину) та епітеліальної
(тиреоглобуліну) тканин за участю цистеїнових катепсинів є зручним та
інформативним додатковим критерієм оцінки прогресу хвороби, а також
розширює можливості теоретичної медицини у плані сприяння для з’ясування
механізму ґенезу та терапії онкологічних захворювань.

Результати досліджень включено до програми курсу “Методи наукових
досліджень” для магістрів за спеціальністю лікар-ветеринар
Дніпропетровського державного аграрного університету. Отримані
результати використовуються в лікувально-діагностичній практиці
ЛОР-онкологічного відділення Дніпропетровської обласної клінічної
лікарні ім. Мечнікова при проведенні клініко-біохімічних аналізів.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом було самостійно виконано аналіз
даних літератури, проведено експериментальні дослідження та статистична
обробка отриманих результатів. Розробка методології та обговорення
результатів проведено сумісно з науковим керівником. Консультативна
допомога в інтерпретації результатів біохімічних досліджень, наданні
матеріалів для дослідження та проведенні експериментів надано д.б.н.,
проф. Бразалуком О.З., д.б.н., проф. Ушаковою Г.О., д.мед.н., проф.
Кобеляцьким Ю.Ю, д.мед.н., проф. Хворостенко М.І., к.мед.н.
Ніколаєнко Т.П.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були
представлені на конгресах, симпозіумах та конференціях: І-м Молодежном
научно-практическом форуме “Информационные технологии в ХХІ веке”
(Днепропетровск, 2003), Установчому з’їзді Українського товариства
клітинної біології (Львів, 2004), 8 Междисциплинарной международной
конференции биологической психиатрии “Стресс и поведение”
(Санкт-Петербург, Россия, 2004), Міжнародній науково-практичній
конференції “Сучасний стан і проблеми експериментальної та клінічної
біохімії” (Тернопіль, 2004), Науково-практичній конференції “Актуальні
питання променевої діагностики і лікування онкологічних захворювань”
(Чернівці, 2004), Науково-практичній конференції “Фундаментальні питання
експериментальної та клінічної ендокринології” (Харків, 2005),
Науково-практичній конференції з міжнародною участю “Сучасні проблеми
медичної та клінічної біохімії” (Чернівці, 2005), ІV з’їзді Українського
товариства терапевтичних радіологів та радіаційних онкологів (Алушта,
2005), FEBS Forum of Young Scientists (Visegrad, Hungary, 2005), 30th
FEBS Congress and 9th IUBMB Conference (Budapest, Hungary, 2005), 5th
Parnas Conference “Molecular mechanisms of cellular signaling” (Kyiv,
2005), IV Львівсько-Люблінській конференції “Сучасні аспекти
експериментальної та клінічної біохімії” (Люблін, Польща, 2006), ХІ
з’їзді онкологів України (Судак, АР Крим, 2006), Конференции
“Нейроспецифические метаболиты и энзимологические основы деятельности
ЦНС” (Пенза, Россия, 2006), ІХ Українському біохімічному з’їзді (Харків,
2006), 6th Parnas Conference “Molecular Mechanism of Cellular Signaling”
(Krakow, Poland, 2007), ІІІ Міжнародній конференції молодих вчених
“Розмаїття живого. Екологія. Адаптація. Еволюція.” (Одеса, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 18 робіт, з них 6
статей, які опубліковані у профільних вітчизняних та зарубіжних
журналах, 11 тез доповідей у збірниках матеріалів міжнародних та
вітчизняних конференцій, симпозіумів, конгресів та 1 патент.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 122
сторінках друкованого тексту та складається з вступу, огляду літератури,
опису матеріалів та методів, результатів досліджень та їх обговорення,
висновків, списку використаних джерел, що включає 288 посилання (36
вітчизняних та 252 закордонних джерел) та додатків. Робота ілюстрована
17 таблицями та 50 рисунками.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Експериментальну модельну частину роботи проведено на щурах лінії
Wistar, 4 місячного віку, вагою 180-220 г (54 тварини). Тварини
знаходилися в стандартних умовах із циклічністю доби: світло – 12 годин,
ніч – 12 годин. Для дослідження використано такі структури та відділи
головного мозку: гіпокамп, кора великих півкуль, мозочок, продовгуватий
мозок, таламус/гіпоталамус, а також сироватку крові. В дослідах
використано плазму крові донорів; тканини головного мозку, без
новоутворень, людей, що загинули від нещасного випадку; плазму крові та
післяопераційний матеріал хворих із пухлинами головного мозку
(невриноми, ангіоми, менінгеоми, астроцитоми, гліобластоми); плазму
крові та післяопераційний матеріал хворих із пухлинами щитовидної залози
(вузловий еутиреоїдний зоб, папілярний, фолікулярний рак) (загальна
кількість пацієнтів становила 107 осіб). В процесі виконання
дисертаційної роботи було передбачено заходи по забезпеченню безпеки для
здоров’я пацієнтів, дотримання їх прав та морально-етичних норм у
відповідності до конвенції Ради Європи про права людини і біомедицини,
Гельсінської декларації прав людини та відповідних законів України.

Визначення активності цистеїнових катепсинів В, L, Н. Активність
катепсину В досліджували за розщепленням p-нітроаніліду
Nб-бензоїл-D,L-аргініну (БАПА) “Fluka” (Швейцарія) за 60 хв інкубації
при 37 єС (Barrett A. et al., 1981) з деякими модифікаціями (Черная В. и
др., 1989). Активність катепсину L визначали за гідролізом 1%
азоказеїну, денатурованому 3М сечовиною за 60 хв інкубації при 37 єС
(Березин В. и др., 1982). Азоказеїн синтезували за методом Сурінова Б.Г.
и др. (Суринов Б.Г., 1965). Активність катепсину Н виявляли за
гідролізом в-нафтіламіду L-лейцину (Лей-НА) “Koch-Light Laboratories”
(Англія) за 120 хв інкубації при 37 єС (Schwartz W. et al., 1980) з
деякими модифікаціями (Черная В. и др., 1989).

Виділення та очистку катепсинів В, L, Н проведено згідно до схеми
(Чорна В.І., 2001).

Виділення та очистку тканинних ендогенних білкових інгібіторів
цистеїнових катепсинів проведено згідно до авторської схеми, яка
включала такі етапи: гомогенізація (середовище гомогенізації – 0,025 М
трис-HCl буфер (рН 7,4), який містив ЕДТА – 0,001 М, NaCl – 0,15 М,
тритон Х-100 – 0,2 %), висолювання сульфатом амонію (до 80% насичення),
гель-хроматографію на колонці з сефадексом G-150 (“Pharmacia”, Швеція),
іонообмінну хроматографію на DEAE- сефадексі A-50 (“Pharmacia”, Швеція)
(десорбцію білків ендогенних інгібіторів проводили 0,3 М NaCl,
приготовленому на 0,1 М фосфатному буфері (рН 6,0)) та
гель-хроматографію на колонках з сефадексом G-100 (“Pharmacia”, Швеція).

Модель експериментального післяопераційного соматогенного болю за
Бреннаном (Brennan T.J., 1996).

Визначення молекулярних мас білків виконано за допомогою авторської
комп’ютерної програми Glikan (Какадій О.Л. та ін., 2003).

Статистичну обробку результатів проводили загальноприйнятими методами
варіаційної статистики (Лакин Г.Ф., 1990). Розрахунки та побудову
графіків виконано на РС –Pentium (133) з використанням прикладних
програм Microsoft Office Excel 2003, Statistica 5.0. Вірогідними вважали
результати, якщо p<0,05. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ Дослідження ролі лізосомних цистеїнових катепсинів у патологічних процесах нервової тканини. Згідно до сучасних наукових досліджень, лізосомні цистеїнові катепсини В, L та їх ендогенні інгібітори використовуються як маркери росту пухлини та прогностичні фактори при злоякісних новоутвореннях різного ґенезу (Berdowska I., 2004, Jedeszko C. et al., 2004). Дані стосовно участі цистеїнових катепсинів у процесах росту, інвазії та метастазуванні пухлин головного мозку мають суперечливий характер. Відомо, що при онкологічних захворюваннях головного мозку відбуваються різноспрямовані зміни експресії цих білків, їх внутрішньоклітинної компартменталізації та активності (Berquin I.M. et al., 1996, Demchik L.L. et al., 1999, Lah T.T. et al., 2000). Нами показано, що активність цистеїнових катепсинів В та L в пухлинах головного мозку вірогідно вища за контрольні показники та залежить від тяжкості онкологічного захворювання (рис. 1А,Б). Це узгоджується з даними літератури (Sivaparvathi M. et al., 1996, Demchik L.L. et al., 1999), та свідчить про порушення функціонального стану лізосомно-вакуолярного апарату трансформованих клітин тканин головного мозку. В плазмі крові хворих із пухлинами головного мозку, встановлено вірогідне збільшення активності тканинного цистеїнового катепсину L, що вказує на дезорганізацію лізосомних мембран та наявність цитолітичних процесів у тканинах головного мозку за канцерогенезу (рис. 1В). Відомо, що збільшення кількості лізосом, зміна їх внутрішньоклітинної локалізації, з тенденцією переміщення з перінуклеарної області клітини до периферійної, лабілізація мембран лізосом, на фоні порушення протеолітичного-антипротеолітичного балансу трансформованої клітини може призводити до вивільнення лізосомних гідролаз у позаклітинний простір, що, згідно за сучасними уявленнями, спричинює деградацію компонентів екстрацелюлярного матриксу та обумовлює процеси інвазії та метастазування (Koblinski J. et al., 2000, Wall S.J. et al., 2003, Skrzydlewska E. et al., 2005). Рис.1. Активність цистеїнових катепсинів В (А) та L (Б) в післяопераційному матеріалі та катепсину L (В) в плазмі крові хворих із пухлинами головного мозку (M±m): 1 – контроль (n=10); 2 – доброякісні пухлини (n=6); 3 – злоякісні пухлини (n=12). * - р < 0,05 по відношенню до контролю Підвищення рівнів активності катепсинів В та L у післяопераційному матеріалі хворих із пухлинами головного мозку можуть обумовлюватись такими факторами: зміни фізико-хімічних властивостей катепсинів (зміни молекулярних мас ферментів; підвищення швидкості ферментативної реакції, за рахунок зміни спорідненості ензимів до ендо- та екзогенних субстратів; зміщення оптимуму рН ферментів в більш кислу зону) (Чорна В.І., 2001); підвищення синтезу та експресії цистеїнових катепсинів (Rempel S.A. et al., 1994, Sivaparvathi M. et al., 1995); порушення регуляції активності катепсинів їх ендогенними інгібіторами (Sivaparvathi M. et al., 1996, Levicar N. et al., 2002). На користь останнього фактору свідчать дані, які отримано нами при дослідженні регуляторних та фізико-хімічних властивостей тканинних ендогенних білкових інгібіторів цистеїнових катепсинів, виділених та очищених згідно (Лянна О.Л. та ін., 2004) з тканин головного мозку без новоутворень та пухлин головного мозку (гліобластома) людини. Показано, що ендогенні інгібітори, виділені та очищені з контрольних та трансформованих клітин тканин головного мозку пригнічують активність катепсинів L та Н у середньому на 90%. Активність катепсину В пригнічується інгібітором з головного мозку без новоутворень на 88%, тоді як ступінь пригнічення активності ферменту інгібітором з гліобластоми становить 25% (табл. 1). Менш виражена дія інгібітору з гліобластоми на активність катепсину В у пухлинах головного мозку, ймовірно, є однією з причин підвищення протеолізу в клітинах нервової тканини за канцерогенезу, що проявляється в надмірній активації катепсину В у злоякісних захворюваннях головного мозку (Kos J. et al., 2000, Skrzydlewska E., 2005). Таблиця 1 Фізико-хімічні властивості тканинних ендогенних білкових інгібіторів цистеїнових катепсинів При дослідженні кінетичних характеристик ендогенних інгібіторів цистеїнових катепсинів, за допомогою методів графічного аналізу Луйнвівера-Берка (у зворотних координатах 1/V(1/S)), Міхаеліса-Ментен та Диксона, показано, що при пригніченні активності катепсинів В та Н, значення Кі для інгібіторів з гліобластоми перевищують показники Кі інгібіторів з тканин головного мозку без новоутворень. Це може свідчити про відмінності в утворенні фермент-інгібіторних комплексів за канцерогенезу. Встановлено, що інгібітори з тканин головного мозку без новоутворень та пухлин головного мозку, є термостабільними білками, які конкурентно пригнічують активність катепсину В та проявляють змішаний тип інгібування по відношенню до катепсинів L та Н. Ймовірно, що підвищена активність лізосомних пептидгідролаз у злоякісних пухлинах головного мозку, пов’язана зі зміною впливу на їх активність ендогенних інгібіторів, спричинених особливостями фізико-хімічних властивостей білків-інгібіторів пухлинних клітин. Основним глікопротеїном есктрацелюлярного матриксу, залученим до процесів клітинної адгезії, міграції та інвазії є фібронектин. За даними літератури, участь фібронектину в процесах клітинної диференціації має пряме відношення до малігнізації, оскільки показано зникнення даного глікопротеїну з поверхні малігнізованих клітин за канцерогенезу головного мозку (Kochi N. et al., 1983, Єна Я.М. та ін., 1997). При дослідженні здатності цистеїнових катепсинів В, L та Н гідролізувати цей білок в умовах in vitro, нами отримано набір фрагментів фібронектину в широкому діапазоні молекулярних мас (від 147 до 33,5 кДа), що на фоні встановленої високої активності цих протеїназ у тканинах злоякісних пухлин головного мозку, може свідчити про безпосереднє залучення цистеїнових катепсинів клітин тканин головного мозку до деструкції даного глікопротеїну. Слід відмітити, що ендогенний інгібітор з тканин головного мозку без новоутворень, який проявляє високий ступінь пригнічення гідролізу катепсинами хромогенних субстратів, не пригнічує деградації фібронектину досліджуваними пептидгідролазами, але призводить до зміни спектру фрагментованості фібронектину, про що свідчить поява нових фрагментів даного глікопротеїну. Таким чином, представлені дані свідчать про безпосередню участь лізосомних цистеїнових катепсинів у канцерогенезі головного мозку, і вказують на перспективність та інформативність використання показників рівня активності цих ферментів у біологічному матеріалі хворих як для теоретичної та клінічної біохімії, так і для медицини. Дослідження участі лізосомних цистеїнових катепсинів у злоякісних пухлинах щитовидної залози. Не зважаючи на помітний прогрес у розумінні механізмів канцерогенезу щитовидної залози (Shuja S. et al., 1999, Lippman S.M. et al., 2000, Turner H.E. et al., 2003), поширеність онкологічних захворювань даного органу невпинно зростає (Schlumberger M. et al., 2004, Ванушко В.Э., и др., 2005, Бондаренко О.О. та ін., 2007), що спонукає пошуки нових маркерів ранньої діагностики, показників перебігу хвороби та критеріїв прогнозу канцерогенезу щитовидної залози (ЩЗ). Лізосомно-вакуолярний апарат клітин ендокринних залоз, завдяки своїй динамічності та пластичності є зручним та інформативним предметом дослідження. Нами показано, що в післяопераційному матеріалі хворих зі злоякісними (папілярний та фолікулярний рак) пухлинами ЩЗ рівень активності катепсинів В та L у 3,4 та 2,7 рази відповідно вищий ніж у доброякісних (вузловий еутиреоїдний зоб) пухлинах ЩЗ (рис. 2). Показано, що в плазмі крові хворих із доброякісними пухлинами ЩЗ рівень активності цистеїнового катепсину L вірогідно не відрізнявся від контрольного показника, тоді як при злоякісних пухлинах ЩЗ перевищував у 3,8 рази контрольні показники (рис. 2В), що вказує на модифікаційні зміни мембран лізосом та наявність цитолітичних процесів у пухлинах ЩЗ. Рис.2. Активність цистеїнових катепсинів B (А) та L (Б) в післяопераційному матеріалі та катепсину L (В) в плазмі крові хворих із пухлинами ЩЗ (M±m): 1 – у доброякісних пухлинах ЩЗ (n=10); 2 – у злоякісних пухлинах ЩЗ (n=21); * - р < 0,05 по відношенню до показників активності у доброякісних пухлинах ЩЗ. Високий рівень активності катепсинів у клітинах злоякісних пухлин ЩЗ спричинюють такі фактори: підвищення синтезу та концентрації катепсинів (Shuja S. et al., 1999); порушення регуляції активності катепсинів їх ендогенними інгібіторами (Dickinson D.P., 2002); зміни фізико-хімічних властивостей цистеїнових пептидгідролаз у злоякісних клітинах ЩЗ. На користь останнього фактору свідчать результати досліджень, проведених нами, по вивченню фізико-хімічних властивостей цистеїнових катепсинів, виділених та очищених зі злоякісних пухлин (папілярної та фолікулярної карцином) ЩЗ. За допомогою схеми виділення та очистки, отримано цистеїнові катепсини В, L та Н з папілярної карциноми ЩЗ людини очищені у 318, 905 та 404 рази відповідно до екстракту, та з фолікулярної карциноми – у 683, 915 та 436 рази відповідно. З’ясувалося, що під дією катепсину L, виділеного та очищеного з папілярної карциноми ЩЗ, зміни швидкості реакції від концентрації субстрату мають характер сигмоїдної залежності, тоді як для катепсину L з фолікулярної карциноми виявляється класична гіперболічна залежність (рис. 3). Кінетичні криві реакції для катепсинів В та Н, яким властива і екзопептидазна активність також мають сигмоїдну форму залежності при фолікулярній карциномі ЩЗ, що може свідчити про підвищену чутливість ферментів до змін концентрацій метаболітів, модуляторів активності та можливість алостеричної регуляції даних пептидгідролаз за канцерогенезу щитовидної залози. Рис.3. Застосування координат Міхаеліса-Ментен для визначення характеру залежності швидкості гідролізу субстратів цистеїновими катепсинами: А, Б – активність катепсину В очищеного з папілярної (А) та фолікулярної (Б) карцином ЩЗ; В, Г – активність катепсину L з папілярної (В) та фолікулярної (Г) карцином ЩЗ; Д, Е – активність катепсину Н з папілярної (Д) та фолікулярної (Е) карцином ЩЗ. @ h l t ? i   A Ae AE 4 p @ B D F ? ? i D ? ? ?   4 r Oe 1При дослідженні деградації ТГ катепсинами В та Н, виділеними та очищеними з папілярної та фолікулярної карцином ЩЗ, відмінностей у фрагментації глікопротеїну не виявлено, а продукти деградації мають молекулярні маси від 321 до 61 кДа. Встановлено, що гідроліз ТГ очищеним катепсином L з фолікулярної карциноми ЩЗ відрізняється від деградації ТГ катепсином L з папілярної карциноми ЩЗ, що проявляється в появі фрагментів тиреоглобуліну з молекулярними масами 155, 104, 96 та 61 кДа. Таким чином, з папілярної та фолікулярної карцином ЩЗ отримано цистеїнові катепсини В, L, Н та визначено їх молекулярні маси (29 кДа). Аналіз фізико-хімічних властивостей виявив відмінності у специфічності цистеїнових катепсинів В, L, Н у злоякісних пухлинах ЩЗ за змінами Vmax, KM/Куяв та кінетики каталізу. Методом електрофорезу в ПААГ з ДСН встановлена деградація тиреоглобуліну цистеїновими катепсинами В, L, Н, виділеними з папілярної та фолікулярної карцином ЩЗ. Показана відмінність у ступені фрагментованості тиреоглобуліну для катепсину L з фолікулярної карциноми ЩЗ, порівняно із гідролізом ТГ катепсином L з папілярної карциноми, яка проявляється у появі нових фрагментів. Активність лізосомних цистеїнових катепсинів після операції по видаленню пухлин. Рівень активності катепсину L, визначений у плазмі крові хворих із патологіями головного мозку та щитовидної залози, свідчить про порушення функціонального стану лізосомно-вакуолярного апарату клітин нервової та епітеліальної тканин за канцерогенезу. Зміни даного показника на різних етапах лікування хворих можуть вказувати на наявність/відсутність цитолітичних процесів у тканинах організму та пов’язаних з ними метаболічних порушень. Рівні активності катепсину L у плазмі крові хворих, визначали у день проведення операції по видаленню пухлини та порівнювали із показниками на сьомий день після операції. Згідно з даними літератури, перший день після хірургічного втручання є періодом вираженої гіпералгезії, а на сьому добу відбувається загоєння рани та послаблення гіпералгезії (Кобеляцький Ю.Ю. и др., 1999, Козубенко Н.В. и др., 2001). Встановлено, що на сьомий день після операції рівні активності катепсину L у плазмі крові хворих із менінгіомами та астроцитомами зменшились на 94 та 22% відповідно до показника активності ферменту у день операції (рис. 4А), а в плазмі крові хворих із доброякісними та злоякісними пухлинами ЩЗ активність ферменту вірогідно зменшилась у 14,0 та 13,0 рази відповідно, порівняно з операційним показником (рис. 4Б). Зниження активності цистеїнового катепсину L в плазмі крові хворих після проведення хірургічної операції, свідчить про те, що видалення пухлини – джерела неконтрольованої протеолітичної активності, яка є наслідком метаболічних змін та порушень протеолітичного-антипротеолітичного балансу в клітинах пухлин – відбивається на функціональному стані лізосомно-вакуолярного апарату. Представлені дані вказують на можливість використання визначення рівня активності цистеїнового катепсину L в плазмі крові хворих із пухлинами головного мозку та щитовидної залози для моніторингу перебігу онкологічного захворювання. Рис.4. Активність катепсину L в плазмі крові хворих з пухлинами головного мозку (А) та щитовидної залози (Б) у післяопераційний період (M±m): 1 – контроль (n=18ч30), 2 – менінгіома (n=6), 3 – астроцитома (n=5), 4 – доброякісні пухлини ЩЗ (n=10), 5 – злоякісні пухлини ЩЗ (n=21). * - р < 0,05 по відношенню до контролю;+ - р < 0,01 по відношенню до операційного показника Відомо, що для онкологічних хворих одним із наслідків хвороби є біль (Ананьева Л.П., 2004, Машфорт М.Л. и др., 2004). Показано, що лізосомно-вакуолярний апарат безпосередньо залучений до перебігу як фізіологічних (росту дендритів, утворенні синапсів, стабілізації та ремоделюванні персистуючих синапсів, відновленні пошкоджених аксонів), так і патологічних (нейродегенеративних тощо) процесів клітин нервової тканини (Cataldo A.M., 1996, Bednarski E. et al., 1997, Nakanishi H. et al., 2003, Artal-Sanz M. et al., 2005), а завдяки своїй реактивності та потужному гідролітичному потенціалу (Dickinson D.P., 2002), може бути граничною ланкою в механізмі підвищення природної резистентності організму. Залучення лізосомних цистеїнових катепсинів до механізмів післяопераційного болю вивчено на експериментальній моделі післяопераційного соматогенного болю. В умовах поставленого експерименту досліджено динаміку активності катепсинів у структурах та відділах головного мозку, залучених до ноцицептивних механізмів, та сироватці крові щурів. Оперативне втручання призводило до появи гіпералгезії на першу добу після операції, про що свідчили також показники фізіологічної активності тварин, отримані за допомогою тестування у “відкритому полі” (Кобеляцький Ю.Ю., 2006). Було показано, що в наступні дні післяопераційного періоду спостерігалося майже повне відновлення емоційної складової та частково – фізіологічної активності дослідних щурів, що свідчило про відсутність феномена хронічного болю у даній моделі (Козубенко Н.В. и др., 2001). Дослідження активності цистеїнових катепсинів проводили через 24 години після хірургічного втручання, в період найбільш вираженої гіпералгезії, та на сьому добу. Встановлено, що після проведення операції в досліджуваних структурах та відділах головного мозку щурів відбуваються зміни ферментативної активності цистеїнових катепсинів (табл. 2). Таблиця 2 Активність цистеїнових катепсинів В та L в структурах та відділах головного мозку щурів в умовах післяопераційного болю (M±m, n=5-6) Показано, що на першу добу післяопераційного періоду виявлено найбільш виражені зміни активності катепсину В, які проявляються у збільшенні активності ферменту у неокортексі, продовгуватому мозку та таламусі/гіпоталамусі в 2,8, 6,0 і 11,0 рази відповідно, а також зменшенні досліджуваного показника на 32% у гіпокампі. Рівень активності катепсину L на першу добу після хірургічного втручання виявлено збільшеним у 1,7 та 7,6 рази у гіпокампі та продовгуватому мозку щурів відповідно. Через тиждень після оперативного втручання в досліджуваних структурах та відділах мозку щурів встановлено тенденцію до нормалізації показників ферментативної активності катепсинів. Показано, що в неокортексі, гіпокампі та таламусі/гіпоталамусі активність катепсину В знижувалась в 5,0, 5,6 і 12,5 рази відповідно із попереднім терміном спостереження, а в гіпокампі активність даного ферменту, навпаки, збільшувалась у 1,3 рази порівняно з першою добою експерименту. Зменшення активності катепсину L в гіпокампі тварин на сьому добу становило 80% порівняно з попереднім терміном спостереження. Динаміка активності катепсинів В та L в досліджуваних структурах та відділах мозку щурів свідчить про те, що у відповідь на післяопераційний біль відбуваються порушення функціонального стану лізосомно-вакуолярного апарату клітин мозку, які проявляються в різноспрямованих змінах активності пептидгідролаз та активації протеолітичних процесів. В різних структурах головного мозку щурів виявлено неоднаковий характер змін активності ферментів, що пов’язано, ймовірно, із особливостями морфологічної та функціональної спеціалізації структур мозку. Результати дослідження рівнів активності катепсину L в сироватці крові дослідних щурів представлено на рис. 5. Показано, що через добу після операції рівень активності ферменту виявлено збільшеним у 4,6 рази, тоді як через тиждень активність катепсину L нормалізується. Рис.5. Активність катепсину L в сироватці крові дослідних щурів (M±m, n=5-6); * - р < 0,01 по відношенню до контролю; ** - р < 0,01 по відношенню до попереднього терміну дослідження Таким чином, динаміка активності катепсинів у функціонально й морфологічно різних структурах мозку та сироватці крові щурів вказує на участь лізосомних цистеїнових катепсинів в алгічній системі мозку при патології та, ймовірно, пов’язана з наявністю інтегративної чутливості мембран лізосом до ноцицептивних стимулів саме в тих відділах головного мозку, де превалюють сенсорні структури. З метою пошуку засобів модуляції післяопераційного болю, проведено вивчення дії металотіонеїнів (МТ) на ферментативну активність лізосомних цистеїнових катепсинів. Металотіонеїни представляють собою низькомолекулярні білки (6-8 кДа), які, завдяки своїй здатності зв’язувати іони важких металів, приймають участь у регуляторних та захисних функціях організму (Kang Y.J. et al., 1999, Levin E.D. et al., 2006). Відомо, що підвищена експресія МТ є характерною ознакою для деяких онкологічних захворювань (молочної залози, легень, щитовидної залози тощо), та розглядається як несприятливий прогностичний фактор для хворих (Hosokawa Т. et al., 2000, Miranda A. et al., 2002, Cherian M.G. et al., 2003). За даними літератури, МТ-ІІ проявляють нейротрофну та захисну властивості, які сприяють збільшенню тривалості життя нейронів, ремоделінгу та відновленню тканин мозку (Chung R.S. et al., 2003, Aschner M. et al., 2005). В експериментальній моделі, МТ-ІІ вводили щурам в дозі 500 мкг/кг двічі на добу за два дні до операції та 500 мкг/кг двічі на добу протягом двох днів після операції (Кручиненко О.А. та ін., 2005). Встановлено, що в різних структурах та відділах головного мозку щурів під впливом МТ-ІІ змінюється активність цистеїнових катепсинів В, L та Н (Lyannaya O.L. et al., 2004, Черная В.И. и др., 2006). Показано, що в сироватці крові тварин рівень активності катепсину L залежав від умов введення МТ-ІІ (рис. 5). Так, при введенні МТ-ІІ щурам до операції активність катепсину L на першу добу не відрізнялась від контрольних показників, тоді як через 7 діб спостерігалось підвищення активності ферменту у 3,9 рази, а якщо МТ-ІІ вводили тваринам після операції, то рівень активності катепсину L зростав у 3,2 рази через 24 години після хірургічного втручання та повертався до контрольних показників на сьому добу, що визначає особливості репаративних механізмів клітин, адитивною складовою яких є захисна функція введених МТ-ІІ. Таким чином, представлені дані свідчать, що у післяопераційний період функціональний стан лізосомно-вакуолярного апарату клітин нервової тканини та сироватки крові змінюється, що, ймовірно, відбиває адаптивні перебудови метаболізму в тканинах організму у відповідь на ноцицептивні стимули, а порушення в системі тканинного і плазмового протеолізу після хірургічного втручання модулюється введенням МТ-ІІ. ВИСНОВКИ Досліджені біохімічні властивості лізосомних цистеїнових катепсинів В, L, Н і їх ендогенних інгібіторів за умов пухлинної трансформації тканин (нервової та ендокринної) та післяопераційного соматогенного болю. Встановлено підвищення активності цистеїнових катепсинів L та В у доброякісних та злоякісних пухлинах головного мозку, з вираженою залежністю від ступеня злоякісності для останнього. Розроблена схема виділення термостабільних ендогенних білкових інгібіторів цистеїнових катепсинів з головного мозку та гліобластоми людини, визначені їх молекулярні маси (7,5 та 14,7 кДа відповідно) і виявлені відмінності у фізико-хімічних властивостях (Vmax, Ki). Очищений ендогенний інгібітор конкурентно пригнічував активність катепсину В у нормі на 88%, а в гліобластомі на 25%; для катепсинів L та Н встановлений змішаний тип інгібування. При деградації фібронектину катепсинами В, L, Н з головного мозку людини виявлено набір фрагментів з молекулярними масами від 147 до 33,5 кДа. Під впливом виділеного інгібітору спектр фрагментованості фібронектину змінюється. Встановлені підвищені рівні активності цистеїнових катепсинів В, L, Н у злоякісних (папілярних, фолікулярних) пухлинах щитовидної залози людини порівняно з доброякісними (вузловий еутиреоїдний зоб). Катепсини В, L, Н очищені з папілярної карциноми щитовидної залози у 318, 905 та 404 рази відповідно, а з фолікулярної карциноми у 683, 915 та 436 рази відповідно до екстракту, з молекулярними масами 29 кДа. Аналіз їх фізико-хімічних властивостей виявив відмінності у специфічності цистеїнових катепсинів В, L, Н та здатності гідролізувати тиреоглобулін. Динаміка активності катепсинів В, L, Н у функціонально і морфологічно різних структурах головного мозку щурів (модель післяопераційного соматогенного болю) свідчить, що на першу добу після операції (стан гіпералгезії), відбуваються різноспрямовані зміни активності ферментів, а на сьому добу – нормалізація активності катепсинів; в сироватці крові щурів активність катепсину L зростає у стані гіпералгезії в 4,6 рази та нормалізується на сьому добу після операції. Клініко-експериментальними дослідженнями клітинного і плазмового протеолізу показана роль лізосомних цистеїнових катепсинів у реакції організму на патологічний вплив пухлин, та хірургічне втручання по видаленню пухлин головного мозку і щитовидної залози. В плазмі крові хворих спостерігається найвищий рівень активності катепсину L у день проведення операції по видаленню пухлин, та тенденція до нормалізації даного показника на сьомий день після хірургічного втручання. Отримані результати дозволяють розглядати дані катепсини як додаткові інформативні показники оцінки ступеня тяжкості та спрямованості перебігу патологічних станів в організмі. Реактивність лізосомно-вакуолярного апарату клітин залежить від типу і стадії розвитку онкологічного захворювання. Виявлені зміни плазмового протеолізу свідчать про участь лізосомних цистеїнових катепсинів В, L, Н, як у розвитку ураження, так і в адаптивних перебудовах білкового метаболізму. СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ: Лянна О.Л., Чорна В.І. Ендогенний інгібітор цистеїнового катепсину L з мозку людини // Медична хімія. – 2004. – Т.6, № 3. – С.107-109 (Здобувачем проведено виділення та очистка тканинних ендогенних білкових інгібіторів цистеїнового катепсину L, досліджено фізико-хімічні властивості отриманих інгібіторів). Chorna V., Lyanna O. Clinical and experimental studies of cysteine cathepsins in human brain tumors // Annales universitatis Mariae Curie-Sklodowska. – 2004. – Vol.XVII, № 2. – P.255-259 Здобувачем проведено дослідження по визначенню активності цистеїнових катепсинів у тканинах та біологічних рідинах хворих із пухлинами головного мозку). Чорна В.І., Лянна О.Л., Ніколаєнко Т.П., Хворостенко М.І. Клінічні та експериментальні дослідження лізосомних цистеїнових протеїназ // Медична хімія. – 2004. – Т.6, № 4. – С.73-75 (Здобувачем проведено виділення та очистка тканинних ендогенних білкових інгібіторів цистеїнового катепсину L, досліджено фізико-хімічні властивості отриманих інгібіторів). Чорна В.І., Какадій (Лянна) О.Л. Лізосомні цистеїнові протеїнази при злоякісному рості // Онкология. – 2004. – Т.6, № 2. – С.84-89 (Здобувачем проведено інформаційний пошук, підготовка матеріалів до друку). Хворостенко М.І., Лянна О.Л., Чорна В.І., Гагаркін Г.М., Матвеєва В.О., Мазур О.П. Дослідження активності цистеїнових катепсинів та визначення їх клінічного значення при пухлинах щитоподібної залози // Український радіологічний журнал. – 2005. – Т.3. – С.429-432 (Здобувачем проведено дослідження по визначенню активності цистеїнових катепсинів при пухлинах щитоподібної залози людини). Лянна О.Л., Бомбін О.В., Хворостенко М.І., Чорна В.І. Клінічні та біохімічні дослідження цистеїнових катепсинів у біологічних рідинах людини при канцерогенезі // Буковинський медичний вісник. – 2005. – Т.9, № 2. – С.155-158 (Здобувачем проведено дослідження по визначенню активності цистеїнових катепсинів у біологічних рідинах (плазмі крові та сечі) при пухлинах головного мозку людини). Пат. 8955 Україна, 7 G 01 N 33/48, G 01 N 33/50. Спосіб діагностики інфекційного мононуклеозу у дітей, спричиненого герпес-вірусом IV типу: Пат. 8955 Україна, 7 G 01 N 33/48, G 01 N 33/50; ДП “Український інститут промислової власності” – № u 2005 04692; Заявл. 19.05.05; Опубл. 15.08.05, Бюл. № 8. – 8 с. Какадій (Лянна) О.Л., Плахотнік О.В. Автоматизація обробки результатів електрофорезу та визначення молекулярних мас протеїнів у нормі та при патологічних станах // Информационные технологии в XXI веке: Материалы 1 Молодежного научно-практического форума, 23-24 квітня 2003 р. – Днепропетровск: Украинский госуд. хим.-тех. ун-т, 2003. – С.103-205. Чорна В.І., Лянна О.Л. Роль лізосомних цистеїнових протеїназ у злоякісній трансформації клітин ЦНС // Матеріали Установчого з’їзду Українського тов-ва клітин. Біології, 25-28 квітня 2004 р. – Львів: Ін-т біології клітини, 2004. – С.128. Lyannaya O.L., Chornaya V.I. The rat brain lysosomal cysteine cathepsin H participation in postoperational pain // Stress and Behavior: 8-th Multidisciplinary International Conference of Biological Psychiatry, 17-19 May 2004. – St-Peterburg (Russia): Institute of Exp. Medicine RAMS, 2004. – P.45-46. Лянна О.Л., Чорна В.І. Роль лізосомних цистеїнових катепсинів в ранній функціональній діагностиці онкологічних захворювань щитовидної залози // Фундаментальні питання експериментальної та клінічної ендокринології: Матеріали Науково-практичної конф. з міжнародною участю, 24-25 лютого 2005 р. – Харків: Харківський держ. мед. ун-т, 2005. – С.134-136. Lyanna O.L., Chorna V.I. Role of the lysosomal cysteine cathepsins and their endogeneous inhibitors in cancer genesis // The Protein World: The FEBS J. Abstracts of 30th FEBS Congress and 9th IUBMB Conference, 2-7 July 2005. – Budapest (Hungary): Semmelweis University, 2005. – Vol.272, Suppl. 1. – P.157. Lyanna O.L. Role of the lysosomal pathway of apoptosis in pathogenesis of diseases // Molecular mechanisms of cellular signaling: The Ukr. Biochem. J. Abstracts of 5th Parnas Conf., 26-29 April 2005. – Kyiv: Palladin Institute of Biochem., 2005. – Т.77, №2. – С.126. Чорна В.І., Лянна О.Л., Лутай Н.В., Хворостенко М.І., Коваль Н.О., Павлушина З.О., Гагаркин Г.М. Визначення рівнів активності цистеїнових катепсинів, тиреоїдних гормонів та деградації фібронектину при канцерогенезі щитовидної залози // Матеріали ХІ з’їзду онкологів України, 29 трав. – 2 черв. 2006 р. – Судак (АР Крим): Ін-т онкології АМН України, 2006. – С.65. Лянная О.Л., Черная В.И. Исследование лизосомных цистеиновых катепсинов и их эндогенных ингибиторов в опухолях головного мозга человека // Нейроспецифические метаболиты и энзимологические основы деятельности ЦНС: Материалы Нейрохимической конференции, 25-27 сент. 2006 г. – Пенза (Россия): Пензенский госуд. педагог. ун-т им. В.Г. Белинского, 2006. – С.128. Лянна О.Л., Чорна В.І. Лізосомні цистеїнові ендопептидази при канцерогенезі щитовидної залози // Матеріали ІХ Українського біохімічного з’їзду, 24-27 жовт. 2006 р. – Харків: Харківський нац. ун-т ім. В.Н. Каразіна, 2006. – Т.2. – С.84. Черная В.И., Лянная О.Л., Ушакова Г.А. Динамика активности катепсина В головного мозга крыс при соматогенной послеоперационной гипералгезии // Нейроспецифические метаболиты и энзимологические основы деятельности ЦНС: Материалы Нейрохимической конференции, 25-27 сент. 2006 г. – Пенза (Россия): Пензенский госуд. педагог. ун-т им. В.Г. Белинского, 2006. – С.114. Чорна В.І., Лянна О.Л. Катепсини В, L, Н і їх ендогенні інгібітори: роль у пухлинній трансформації // Матеріали ІХ Українського біохімічного з’їзду, 24-27 жовт. 2006 р. – Харків: Харківський нац. ун-т ім. В.Н. Каразіна, 2006. – Т.2. – С.22. АНОТАЦІЯ Лянна О.Л. Роль цистеїнових катепсинів у деградації білків при патологічних станах. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2007. Дисертація присвячена вивченню участі лізосомних цистеїнових катепсинів у деградації білків за канцерогенезу. Встановлено, що при пухлинній трансформації тканин (нервової та ендокринної) відбуваються порушення функціонального стану лізосом, які проявляються в збільшенні активності та змінах внутрішньоклітинної компартменталізації цистеїнових катепсинів В, L і Н. Розроблена схема виділення та очищення термостабільних ендогенних білкових інгібіторів цистеїнових катепсинів з тканин головного мозку без новоутворень та гліобластоми людини; встановлено відмінності у фізико-хімічних властивостях інгібіторів, їх здатності пригнічувати активність цистеїнових катепсинів. Показано, що катепсини В, L та Н гідролізують фібронектин, зокрема й у присутності ендогенного інгібітору, з утворенням фрагментів у широкому діапазоні молекулярних мас. Досліджено фізико-хімічні властивості цистеїнових катепсинів, виділених та очищених з папілярної та фолікулярної карцином щитовидної залози людини. Встановлено, що гідроліз тиреоглобуліну катепсинами змінюється за канцерогенезу щитовидної залози. Показано можливість використання рівня активності цистеїнових катепсинів у плазмі крові хворих для моніторингу перебігу захворювання. На експериментальній моделі післяопераційного соматогенного болю у щурів, досліджено участь цистеїнових катепсинів у алгічній системі мозку. Встановлено, що введення металотіонеїнів модулює ферментативну активність катепсинів. Отримані результати дозволяють розглядати цистеїнові катепсини як додаткові показники оцінки агресивності та спрямованості перебігу патологічних станів. Ключові слова: цистеїнові катепсини, канцерогенез, ендогенні інгібітори катепсинів, післяопераційний біль. АННОТАЦИЯ Лянная О.Л. Роль цистеиновых катепсинов в деградации белков при патологических состояниях. – Рукопись. Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2007. Диссертация посвящена изучению роли лизосомных цистеиновых катепсинов в деградации белков при канцерогенезе нервной и эндокринной тканей организма. Исследование лизосомных катепсинов, а также их тканевых эндогенных белковых ингибиторов при канцерогенезе позволяет использовать уровни активности данных ферментов в качестве вспомогательных информационных критериев оценки степени тяжести и мониторинга протекания заболевания, и свидетельствует о возможности их применения как в теоретической, так и клинической биохимии. При онкологических заболеваниях головного мозга в зависимости от степени злокачественности опухоли, установлены изменения уровней активности катепсинов В, L в послеоперационном материале и плазме крови больных. Высказано предположение, что повышение уровня активности ферментов в исследуемых тканях при канцерогенезе является результатом изменений регуляции функционирования цистеиновых катепсинов эндогенными ингибиторами клетки. Разработана схема выделения и очистки, которая позволила получить очищенные препараты тканевых эндогенных белковых ингибиторов цистеиновых катепсинов из головного мозга без новообразований и глиобластомы человека; установлено различие не только по молекулярным массам (7,5 и 14,7 кДа соответственно) и физико-химическим свойствам (Vmax, Ki), но и по степени угнетения активности катепсина В (88 и 25 % соответственно). Изменения механизма регуляции эндогенными ингибиторами цистеиновых катепсинов при клеточной трансформации отражается на способности катепсинов гидролизовать фибронектин. При онкологических заболеваниях щитовидной железы (ЩЗ) установлены изменения уровней активности катепсинов В, L в послеоперационном материале и плазме крови больных, которые зависели от степени злокачественности заболевания. В плазме крови больных со злокачественными заболеваниями уровень активности катепсина L в 3,8 раза превышал показатели контроля и в 2,7 раз – при доброкачественных опухолях ЩЗ. Применение схемы выделения и очистки цистеиновых катепсинов, позволило получить очищенные препараты катепсинов В, L и Н со злокачественных опухолей ЩЗ (папиллярной и фолликулярной карцином). Полученные ферменты имели молекулярную массу равную 29 кДа, но различались по физико-химическим свойствам (Vmax, KМ, характеру зависимости скорости реакции от концентрации субстрата) и способности гидролизовать тиреоглобулин. Показано, что определение уровня активности цистеиновых катепсинов в плазме крови больных с исследуемыми патологиями, может иметь прикладной характер в клинический медицине и нести объективную информацию о течении заболевания. На экспериментальной модели послеоперационной соматогенной боли у крыс установлено участие лизосомных цистеиновых катепсинов в алгической системе мозга. На первый день после операции, который соответствует развитию гипералгезии, происходит достоверное повышение уровня активности катепсинов в неокортексе, продолговатом мозге, таламусе/гипоталамусе и сыворотке крови крыс. На седьмой день после операции уровень активности исследуемых ферментов возвращался практически к контрольным значениям. Высказано предположение, что уровень активности катепсинов в сыворотке крови может отражать адаптационные изменения метаболизма в ответ на ноцицептивные стимулы и модулирующие их факторы (введение металлотионеинов). Полученные результаты свидетельствуют о том, что лизосомные цистеиновые катепсины принимают непосредственное участие как в развитии онкологического процесса в организме, что проявляется в изменениях их активности, локализации, формах связи с субклеточными структурами, изменения регуляции их активности эндогенными ингибиторами, так и в адаптационной реакции организма на послеоперационную боль. Ключевые слова: цистеновые катепсины, канцерогенез, эндогенные ингибиторы катепсинов, послеоперационная боль. ANNOTATION Lyanna O.L. The role of cysteine cathepsins in protein degradation during pathological states. – Manuscript. Dissertation for the candidate of biological science degree in speciality 03.00.04 – biochemistry. Kyiv National Taras Shevchenko University, Kyiv, 2007. The dissertation is devoted to investigation of lysosomal cysteine cathepsins participation in protein degradation during carcinogenesis of nervous and endocrine tissues. It was established that there were abnormality of lysosomal functional state that have been shown in increasing activity and changes in intracellular compartmentalization of cysteine cathepsins B, L and H during tissue (nervous and endocrine) tumor transformation. Using author’s scheme, the thermostable endogenous protein inhibitors of cysteine cathepsins from human brain without tumors and from glioblastoma were obtained; the physical-chemical differences of obtained inhibitors and their ability to control cysteine cathepsins activity were identified. It was shown that cysteine cathepsins hydrolyzed fibronectin (even in presence of inhibitor), forming fragments of fibronectin with wide spectrum of molecular masses. According to the scheme suggested, the obtained cysteine cathepsins from human papillary and follicular thyroid carcinomas were different in physical-chemical properties and ability to hydrolyze the thyroglobulin. The usage possibility of cysteine cathepsins’ activity levels in patients’ blood plasma for monitoring of disease was shown. On experimental model of postoperative somatogeous pain in rats, the cysteine cathepsins participation in algical brain system was observed. It was found that metallothionein introduction can modulate cathepsin enzymatic activity. The results obtained let consider cysteine cathepsins as additional appraisal indices of disease aggressiveness and orientation of pathologic state. Key words: cysteine cathepsins, carcinogenesis, endogenous inhibitors, postoperative pain. Підписано до друку 07.11.2007 р. Формат 60Ч90 1/16. Папір офсетний. Друк плоский. Ум. друк. арк. 0,9. Тираж 100 прим. Замовлення № 1147 Друкарня ДНУ. 49050, м. Дніпропетровськ, вул. Наукова, 5 тел. (0562) 46-62-85

Похожие записи