.

Роль оксиду азоту в механізмах ураження печінки ксенобіотиками (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 3541
Скачать документ

Інститут біології тварин УААН

Ярошенко Тетяна Ярославівна

УДК 591.477+546.17]-02:616.36-099

Роль оксиду азоту в механізмах ураження печінки ксенобіотиками

03.00.04 – біохімія

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів – 2007

Дисертація є рукописом.

Робота виконана в Тернопільському державному медичному університеті
імені І.Я. Горбачевського Міністерства охорони здоров’я України

Науковий керівник доктор медичних наук, професор

Корда Михайло Михайлович,

Тернопільський державний медичний університет імені І.Я. Горбачевського

Міністерства охорони здоров’я України

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор,

член-кореспондент НАН України

Стойка Ростислав Степанович

Інститут біології клітини НАН України,

завідувач відділу регуляції проліферації клітин

доктор біологічних наук,

Столяр Оксана Борисівна

Тернопільський національний педагогічний університет імені Володимира
Гнатюка Міністерства освіти і науки України,

професор кафедри хімії

Провідна установа – Інститут біохімії імені О.В. Палладіна НАН України,
лабораторія біохімії коферментів, м. Київ.

Захист відбудеться ” 20 ” березня 2007 р. о 10
годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01. в
Інституті біології тварин УААН за адресою: 79034, м. Львів, вул. В.Стуса
38

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин
УААН за адресою: 79034, м. Львів, вул. В.Стуса 38

Автореферат розісланий ” 19 ” лютого 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради
Віщур О.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Печінка є важливою мішенню для багатьох токсинів:
ксенобіотиків, ендотоксинів, спиртів. Людина в процесі життєдіяльності
стикається з мільйонами хімічних сполук, багато з яких мають
гепатотропні властивості (Губский Ю.И., 1993; Корда М.М., 1998; Гонський
Я. І., 2001). Якщо взяти до уваги також поширення алкоголізму, токсико-
і наркоманій, стає зрозуміло, чому на сьогодні захворювання печінки є
одним з найпоширеніших видів патології в клініці внутрішніх хвороб. Тому
важливим завданням біології і медицини є досконале вивчення молекулярних
механізмів патогенної дії ксенобіотиків на печінку. Найчастіше
різноманітні токсини викликають некротичне ураження гепатоцитів. Зручною
моделлю для експериментального відтворення некротичного процесу у
печінці є інтоксикація аліловим спиртом. У печінці аліловий спирт (АС)
метаболізується до акролеїну (Belinsky S.A., 1985), який здатний
окиснювати сульфгідрильні групи, при цьому в процес, в першу чергу,
включається відновлений глутатіон, що призводить до різкого зниження
його вмісту в клітинах (Harstad E.B., 2002). Алкілування нуклеофільних
груп макромолекул, викликане акролеїном, а також активація пероксидації
ліпідів внаслідок зниження вмісту відновленого глутатіону є основними
причинами, що призводять до некротичного пошкодження клітин аліловим
спиртом (Chamulitrat W., 1996., HYPERLINK
“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&do
pt=Abstract&list_uids=11835631&query_hl=17” Alam K., 2001., Moore
P.K., 2003).

Оксид азоту (NO) – впливає на фізіологічні і патологічні процеси в
кожному органі і тканині, в тому числі і в печінці. Дія NO в печінці є
багатовекторною і часто неоднозначною. З одного боку, невелика стабільна
кількість NO, що продукується, в основному конститутивна NO-синтаза
(eNOS), регулює мікроциркуляцію ( HYPERLINK
“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&do
pt=Abstract&list_uids=12003815&query_hl=6” Iwakiri T.Y., 2002), має
антиоксидні властивості і захищає клітини від цитокін-індукованого
ураження та апоптозу ( HYPERLINK
“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&do
pt=Abstract&list_uids=9625727&query_hl=21” Hinson J.A., 2002), а з
іншого боку гіперпродукція NO і його активних похідних, що має місце при
інтоксикації рядом ксенобіотиків, призводить до інгібування функції
ферментів, ушкодження ДНК, активації процесів ліпопероксидації (Sass G.,
2002., Nowicki M.J., 2003). Оскільки існує взаємозв’язок між продукцією
NO і ураженням гепатоцитів, було проведено ряд досліджень із вивчення
ефективності інгібіторів NO-синтази і донорів NO при різних патологічних
станах печінки. Проте дані літератури з цього питання розрізнені і часто
суперечливі. Пригнічення NO-синтази, особливо вибіркове блокування
індуцибельної NO-синтази (іNOS), при токсин-індукованих ураженнях
печінки нівелює патологічний процес, що проявляється в зниженні
активності вільнорадикальних процесів, підвищенні системи антиоксидного
захисту, запобіганні порушення функціонування ферментів дихального
ланцюга мітохондрій і зменшенні ступеня деструкції гепатоцитів (Gardner
C.R., 1998; Hierholzer C., et al., 1998). У той же час іншими авторами
було продемонстровано, що інгібітори NO-синтази призводять до
пригнічення активності не тільки її іNOS, але і eNOS при токсичному
ураженні печінки, що призводить до негативних змін вищезгаданих
показників (Harstad E.B., Klaassen C.D., 2002; Hinson J.A., 2002;
Anaya-Prado R, et al., 2003). Подібні суперечливі результати отримано і
при корекції токсичного гепатиту за допомогою донорів NO (Rahman T.M.,
Hodgson H., 2003). Проте в роботах (Gardner C.R., et al., 1998) було
показано, що донори NO не проявляють протективного ефекту на печінку при
її токсичному ураженні і, навіть, більше того, можуть погіршувати
перебіг патологічного процесу.

Актуальність даного дослідження зумовлена, з одного боку, великим
спектром хімічних уражень печінки, а з іншого – недосконалим
висвітленням фундаментальних патобіохімічних процесів розвитку
токсичного гепатиту, зокрема ролі NO в механізмах дії гепатотропних
некрозогенних ксенобіотиків. Робота є також актуальною в плані розробки
методів корекції некротичних змін у печінці за допомогою модуляторів
системи L-аргінін/ NO-синтази /NO.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота є складовою частиною планової наукової міжкафедральної теми
Тернопільського державного медичного університету імені І.Я.
Горбачевського, кафедр медичної хімії та загальної гігієни і екології
“Порушення метаболічних процесів в організмі тварин некрозогенними
ксенобіотиками і способи їх детоксикації” № держ-реєстрації 0101U001311,
(2002-2005 рр.) та “Вивчення порушень метаболічних процесів у тварин,
отруєних ксенобіотиками, та корекція їх за допомогою антиоксидантів”
№ держреєстрації 0106U001760, (2005

– 2007 рр.), в яких автор досліджував роль системи NO під час токсичного
ураження організму тварин АС і вивчав ефективність застосування
неселективного інгібітора іNOS L-NAME і високоселективного інгібітора
іNOS – 1400W, а також донора NO FK409 і субстрату для ферментативного
утворення NO – L-аргініну.

Тему дисертації затверджено Проблемною комісією МОЗ та АМН України
“Біологічна та медична біохімія” від 11.12. 2002 р., протокол № 4.

Мета дослідження: встановити роль NO в патогенезі гострого токсичного
гепатиту, індукованого АС, а також дослідити можливість корекції
викликаних даним токсином патологічних змін за допомогою інгібіторів
NO-синтази і донорів NO.

Для досягнення цієї мети у роботі вирішували наступні завдання:

– дослідити функціональний стан системи синтезу NO у печінці при її
ураженні АС;

– встановити взаємозв’язок між змінами функціонального стану
конституційної та індуцибельної форм NO-синтази у печінці й
інтенсивністю вільнорадикального окиснення, станом антиоксидної системи,
функціонуванням ферментів дихального ланцюга мітохондрій та вираженістю
деструктивних процесів в гепатоцитах при інтоксикації АС;

– дослідити можливість корекції патобіохімічних змін у печінці при її
ураженні АС за допомогою неселективного інгібітора NO-синтази L-NAME і
високоселективного інгібітора іNOS 1400W;

– дослідити вплив донора NO FK409 і L-аргініну – субстрату для
ферментативного утворення NO на функціональний стан різних форм
NO-синтаз, активність вільнорадикальних реакцій, стан системи
антиоксидного захисту, активність мітохондріальних ферментів і ступінь
некротичних змін в печінці при її гострому ураженні АС;

– обґрунтувати доцільність застосування при токсичному гепатиті,
індукованому АС, комбінації засобів, здатних інгібувати іNOS в печінці
і, водночас, забезпечувати функціональний стан eNOS в капілярах і
синусоїдах печінки.

Об’єкт дослідження – гостре токсичне ураження печінки, викликане
некрозогенним ксенобіотиком АС.

Предмет дослідження – роль NO в патогенезі токсичного ураження печінки
АС; ефект застосування інгібіторів NO-синтази і донаторів NO при
токсичному гепатиті.

Методи досліджень: біохімічний метод визначення загальної активності
NO-синтази, вмісту нітратів і нітритів, малонового діальдегіду і
модифікованих амінокислот, активності каталази, рівня церулоплазміну і
відновленого глутатіону, активності цитохромоксидази і
сукцинатдегідрогенази, амінотрансфераз, вмісту молекул середньої маси.
Електрохімічний метод визначення активності eNOS; біофізичний метод
хемілюмінесцентного (ХЛ) вивчення інтенсивності вільнорадикальних
реакцій; статистичні методи обробки одержаних результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. У результаті комплексного
дослідження ролі системи синтезу NO у патогенезі ураження печінки АС
вперше показано, що інтоксикація АС супроводжується пригніченням
ендотеліальної й активацією індуцибельної форми NO-синтази. Показано
взаємозв’язок між продукцією NO і активністю вільнорадикальних реакцій,
функціональним станом антиоксидної системи і ферментів дихального
ланцюга мітохондрій, а також ступенем некротичних змін у гепатоцитах при
отруєнні АС.

Одержано нові дані про вплив неселективного інгібітора NO-синтази L-NAME
на перебіг токсичного гепатиту. Показано, що тотальне пригнічення
NO-синтази посилює показники вільнорадикального та знижує показники
мітохондріального окиснення в ураженій токсином печінці, сприяє розвитку
деструктивних процесів у гепатоцитах.

Досліджено вплив L-аргініну – субстрату NO-синтази на перебіг гепатиту,
індукованого АС. Показано, що підвищення кальційзалежної NO-синтази при
застосуванні L-аргініну супроводжується нормалізацією патологічних змін
у гепатоцитах. Вперше виявлено позитивний ефект спонтанного донора NO
(+-)-(Е)-етил-2-[(Е)гідроксиіміно]-5-нітро-3-гексенаміду (FK409) при
токсичному гепатиті.

Практичне значення одержаних результатів. Результати проведених
досліджень доповнюють знання про механізм дії гепатотропних
некрозогенних токсинів, зокрема, їх вплив на функціонування системи
синтезу NO в печінці.

Отримані в роботі результати дозволяють науково обґрунтувати доцільність
застосування при токсичному гепатиті, викликаному некрозогенними
отрутами, препаратів, які були б здатні інгібувати іNOS в печінці.
Експериментально доведено також ефективність донорів NO при інтоксикації
некрозогенними гепатотоксинами.

Вперше виявлено ефективність селективного інгібітора
іNOS

N-(3-(амінометил)бензил)ацетамідину (1400W) при токсичному ураженні
печінки, показано, що вибіркове пригнічення даним засобом позитивно
коригує патобіохімічні зміни у печінці при її хімічному ураженні.

Запропоновано ефективну і експериментально обґрунтовану комбінацію
засобів селективний інгібітор iNOS – 1400W – і субстрат NO-синтази –
L-аргінін для корекції токсичного гепатиту, які впливають на ключові
ланки патогенезу захворювання.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно розроблено програму
дослідження, проведено біохімічні дослідження. Експерименти, в яких
досліджували інтенсивність вільнорадикальних реакцій методом ХЛ виконано
за допомогою співробітників кафедри біохімії Тернопільського медичного
університету імені І.Я. Горбачевського, досліди з вивчення
функціонального стану кальційзалежної NO-синтази виконано за участю
співробітників відділу хімії і біохімії Університету Огайо (США), за що
автор висловлює їм щиру подяку. Формулювання мети і завдань роботи та
інтерпретацію отриманих результатів і їх узагальнення здійснено спільно
із науковим керівником. Статистична обробка матеріалу і оформлення
роботи виконано дисертантом.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, включених до
дисертації, оприлюднено на науково-практичній конференції “Сучасний стан
і проблеми експериментальної та клінічної біохімії” (Тернопіль, 2004),
на VIII, ХХ Міжнародному медичному конгресах студентів і молодих учених
(Тернопіль, 2006), на XLVIII та XLIХ підсумкових науково-практичних
конференціях „Здобутки клінічної і експериментальної медицини”
(Тернопіль, 2005, 2006), у матеріалах 78-ої науково-практичної
конференції студентів і молодих учених “Теоретические и практические
аспекты современной медицины” (Симферополь, 2006), на міжнародній
науково-практичній конференції “Біологічне окиснення в нормі і
патології” (Тернопіль, 2006), на IV Львівсько-Люблінській конференції
„Експериментальної та клінічної біохімії” (Люблін, 2006).

Публікації. Результати дисертації опубліковані у 12 працях, у тому числі
7 статей (з них у фахових виданнях – 5, без співавторів – 3), 5 –
матеріали і тези доповідей на конференціях та симпозіумах.

Структура обсяг і дисертації. Дисертаційна робота викладена на 141
сторінках комп’ютерного набору, за відповідною структурою: вступ, огляд
літератури, опис методів і об’єкту дослідження, 4 розділи власних
досліджень, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків,
списку використаної літератури, додатків. Робота містить 35 таблиць (22
сторінки) та ілюстрована 1 рисунком (0,5 сторінки.). Бібліографічний
список складається із 287 джерел, з них 145 латиницею, та дев’яти
додатків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури проаналізовано дані про роль NO за
умови хімічного ураження печінки. Особлива увага приділена біохімічним
механізмам дії інгібіторів NO-синтаз та донорів NO при інтоксикаціях
ксенобіотиками різних груп.

Матеріали і методи дослідження. Дослiди виконано на лабораторних
безпородних білих щурах-самцях масою тiла 180-200 г, якi утримувалися на
стандартному рацiонi вiварiю. У процесі роботи всього використано 198
тварин.

Моделлю токсичного ураження печінки слугувала інтоксикація тварин АС,
який вводили внутрішньочеревно одноразово в дозі 30 мг/кг ( HYPERLINK
“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&do
pt=Abstract&list_uids=11835631&query_hl=17” Alam K. et al., 2001). Всі
піддослідні тварини були поділені на такі групи: І – інтактні тварини,
яким вводили фізіологічний розчин; ІІ – тварини, що отримували АС
(контроль); ІІІ – щури, що отримували АС, а також донор NO L-аргінін; ІV
– щури, що отримували АС, а також донор NO
(+-)-(Е)-етил-2-[(Е)гідроксиіміно]-5-нітро-3-гексенамід (FK409); V –
тварини з гепатитом, яким вводили неселективний інгібітор NO-синтази
метиловий ефір N-нітро-L-аргінін (L-NAME); VI – уражені токсином щурі,
яким вводили селективний інгібітор іNOS –
N-(3-(амінометил)бензил)ацетамідин (1400W); VIІ – щурі, що отримували
АС, яких лікували поєднанням препаратів селективного інгібітора іNOS
1400W і субстрату синтази NO L-аргініну.

L-аргінін (“Sigma”, USA) вводили в дозі 0,2 г/кг протягом 15 днів перед
призначенням АС, в день інтоксикації і в наступні дні, включно з днем
декапітації тварин (Anaya-Prado R, et al., 2003). FK409 (“Sigma”, USA)
вводили одноразово орально в дозі 10 мг/кг маси щура за 30 хв до
інтоксикації і дворазово на наступний день після інтоксикації (Kita Y.,
1994). L-NAME (“Sigma”, USA) вводили внутрішньочеревно в дозі 10 мг/кг
за 30 хв перед токсичним ураженням і на наступний день після
інтоксикації (Farghali H., et al., 2003). 1400W (“Sigma”, USA) – вводили
одноразово внутрішньочеревно за 30 хв до ін’єкції гепатотоксину у дозі
1,5 мг/кг і дворазово на наступний день після інтоксикації в аналогічній
дозі (Souza M.P., 2004).

Щурів декапітували під тіопентал-натрієвим наркозом на пешу і третю
добу з моменту інтоксикації. У дослідженні використовували тканину
печінки і кров.

Усі експерименти на тваринах проводили відповідно з “Правилами
використання лабораторних експериментальних тварин”(Кожем’якін Ю.М. та
ін. 2002.)

Стан еNOS у печінці досліджували за допомогою електрохімічного
визначення NO після стимуляції тканини іонофором кальцію (Malinski T. et
al., 1996). Поріг чутливості наносенсора становив приблизно 1 нмоль/л.
Сумарну активність NO-синтази печінки визначали колориметрично за її
здатністю окиснювати НАДФН у присутності L-аргініну як субстрату (Stuehr
D. et al., 1991). Загальний вміст нітратів і нітритів у печінці і крові
визначали за методом Гріса після відновлення нітратів до нітритів за
допомогою кадмію (Ridnour L., 2000). Концентрацію загального білка
визначали з використанням наборів реактивів АТ “Реагент” (Україна).

Про активність вільнорадикальних реакцій в крові і печінці судили за
інтенсивнiстю спонтанної та ініційованої перекисом водню ХЛ (Журавлев
А.К., 1985; Веселовский В.А., 1987). Активність процесів
ліпопероксидації оцінювали за вмістом в тканинах малонового діальдегіду
(МДА), який визначали за його реакцією з тіобарбітуровою кислотою
(Андреева Л.И., 1988). Про інтенсивність окиснювальної модифікації
білків (ОМБ) судили за утворенням альдегідних і кетонних груп,
які взаємодіють з

2,4-динітрофенілгідразином з утворенням забарвленого комплексу (Мещишен
І.Ф., 1998). Для характеристики функціонального стану антиоксидної
системи визначали активнiсть каталази (КТ) (Королюк М.А., и др., 1988),
вміст церулоплазмiну (ЦП) в сироватці крові (Колб В.Г., Камышников В.С.,
1982) і відновленого глутатіону SH- груп (Дж. Елман, 1959) в сироватці
крові та печінці.

Для оцінки патогенетичної ролі алкогольдегідрогенази (АДГ) в розвитку
гепатиту, індукованого АС, визначали її активність за здатністю
окиснювати етиловий спирт у присутності НАД+ з утворенням НАДН (Aasmoe
L., 1999).

Стан мітохондріального окиснення оцінювали за показниками активності
сукцинатдегiдрогенази (СДГ) (Ещенко Н.Д., 1982) та цитохромоксидази (ЦО)
(Кривченкова Р.С., 1977).

Для характеристики ступеня деструктивних процесів в сироватці крові та
печінці судили за вмістом молекул середньої маси (МСМ) згідно з
методикою (Осипович В.К., 1987) в модифікації (Луговец Л.Е., 1990).
Визначали також активність ферментів-маркерів цитолізу гепатоцитів –
аланін- і аспартатамінотрансфераз (“Lachema Diagnostica”).

Отриманий цифровий матеріал опрацьований за допомогою методів
варіаційної статистики із використанням критерію Стьюдента (Гублер Е.В.,
1978). Розраховували середню арифметичну величину, похибку середніх
арифметичних, коефіцієнт варіації, а також середнє квадратичне
відхилення. Зміни вважали достовірними при Р ? ? o ? ? o o th 6 | ~ 1/4 E o 4 6 ~ 1/4 o $ O Fу білках. Введення тваринам АС викликало окисну модифікацію як нейтральних, так і лужних амінокислот. Через одну добу після інтоксикації вміст 2,4-динітрофенілгідразонів, що визначалися при 310 нм (відображає концентрацію альдегід- і кетонопохідних нейтрального характеру) підвищився в 1,6 раза, порівняно зі здоровими тваринами, а таких, що визначалися при 430 нм (альдегід- і кетонопохідні нейтрального характеру) зріс в 1,7 раза. Селективний інгібітор призводив до поліпшення показників окисної модифікації білків. Через одну добу після введення 1400W вміст альдегід- і кетонопохідних нейтрального (ОМБ310) характеру достовірно (в 1,4 раза) зменшився, порівняно з тваринами, яким інгібітор не вводили. Застосування L-аргініну також призводило до деякого пригнічення пероксидного окиснення білків (через 24 год після введення L-аргініну вміст ОМБ знижувався на 16 % (Р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020