НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ КЛІТИНИ

ВОВК ОЛЕНА ІВАНІВНА

УДК 577.15:616.379-008.64:616-008.852

Роль NO-залежних сигнальних шляхів у регуляції морфофункціонального
стану тромбоцитів за умов цукрового діабету 1-го типу

03.00.11 — цитологія, клітинна біологія, гістологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів — 2005 Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біології клітини НАН України.

Науковий керівник : кандидат біологічних наук, доцент

Сибірна Наталія Олександрівна,

Львівський національний університет ім. І.Франка,

доцент кафедри біохімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Луцик Максим Дмитрович,

Інститут біології клітини НАН України,

пров. наук. співр. відділу регуляції проліферації клітин

доктор медичних наук, професор

Скляров Олександр Якович,

Львівський державний медичний університет ім. Д.Галицького,

завідувач кафедри біохімії

Провідна установа: Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця

МОЗ України, м.Київ

Захист відбудеться “ 10 ” червня 2005 р. o 1400 годині на
засіданні cпеціалізованої вченої ради К 35.246.01 в Інституті біології
клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології клітини
НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16

Автореферат розісланий “ 6 ” травня 2005 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук
Федорович Д.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Цукровий діабет (ЦД) є однією з найважливіших
медико-соціальних проблем і належить до трійки захворювань, які
найчастіше виявляються причиною ранньої інвалідності та смертності серед
населення більшості країн світу [Gale, 2002]. ЦД супроводжується
порушеннями вуглеводного, ліпідного та білкового обмінів, що призводить
до формування ряду ускладнень, зокрема, інтенсифікації процесів зсідання
крові при одночасному гальмуванні механізмів фібринолізу [Гарбарчук,
1998]. Посилення коагуляції крові зумовлене збільшенням кількості
фібриногену, фактора Віллебранда, зростанням в’язкості крові та
активації тромбоцитів [Офозу, 2002].

Кров’яним пластинкам належить одна із провідних ролей у патогенезі
пізніх діабетичних ускладнень. Підтвердження гіпотези про первинність
порушень функціонального стану ендотеліоцитів у патогенезі ангіопатій за
умов цього захворювання та включення у комплексну терапію антиагрегантів
послужило поштовхом до дослідження молекулярних механізмів активації
тромбоцитів, опосередкованих оксидом азоту (NO), продуктами
вільнорадикального окислення і змінами в процесах сигналізації під дією
індукторів агрегації. Виявлення змін у функціонуванні протеїн- та
ліпідкіназ, з’ясування причин підвищеної чутливості кров’яних пластинок
до агоністів дозволить вести ефективний пошук нових медичних препаратів
скерованої дії для лікування діабетичних ангіопатій.

Підвищена агрегаційна здатність кров’яних пластинок при ЦД є наслідком
дії різних факторів. Так, зниження активності аденілатциклази, яке
спостерігається при високій активності фосфоліпази А2, індукує
перетворення арахідонової кислоти по циклооксигеназному шляху з
утворенням тромбоксану А2 – надзвичайно потужного індуктора агрегації.
Інгібування активності основних ферментів антиоксидантного захисту (АОЗ)
та пов’язана з цим інтенсифікація процесів перекисного окислення ліпідів
(ПОЛ) призводить до зниження плинності плазматичної мембрани [Winocour
et al., 1994; Tschoepe et al., 1997]. Зростання рівня глікозилювання
рецепторів на поверхні тромбоцитів, інтенсифікація обміну
фосфоінозитидів, зміна активності NO-синтази (NOS, КФ 1.14.13.19),
підвищення внутрішньоклітинної концентрації Са2+ спричиняє активацію
сигнальних мереж, що забезпечують реалізацію біологічних відповідей,
включаючи зміни в архітектоніці цитоскелету, адгезії і метаболізмі
клітин [Winocour et al., 1994]. Провідна роль у перебудові актинового
цитоскелету належить сигнальним шляхам, залежним від низькомолекулярних
G-білків та фосфатидилінозит-3-кінази (РІ-3-кінази, КФ 2.7.1.137) [Tapon
et al., 1997; Pigazzi et al., 1999; Soulet et al., 2001]. Порушення
функціонування сигнальних білків є однією з основних причин, що
пояснюють підвищену чутливість тромбоцитів до дії агоністів [Winocour,
1994; Fox, 1996].

За умов цукрового діабету чітко виражений зв’язок між рівнем продукції
NO в організмі і проявами оксидативного стресу, який характеризується
різким зниженням вмісту оксиду азоту в кров’яному руслі на фоні
накопичення вільних радикалів кисню і перекисів. Оскільки
вільнорадикальні процеси та реакції перекисного окислення знаходяться
серед факторів, що впливають на функцію тромбоцитів, і тісно пов’язані з
продукцією NO, актуальним було з’ясувати вплив основного субстрату
(L-Arg) та інгібіторів NO-синтази L-NAME (N?-nitro-L-arginine-methyl
ester) і AG (аміногуанідину) на вміст продуктів ПОЛ і активність
ферментів АОЗ в кров’яних пластинках щурів за умов стрептозотоцинового
діабету. З’ясування особливостей функціонування системи антиоксидантного
захисту та NO-залежних сигнальних шляхів, а також ролі PI-3-кінази у
регуляції морфофункціонального стану тромбоцитів дозволить розширити
наші уявлення про механізми виникнення і розвитку мікро- та
макроангіопатій за умов ЦД 1-го типу.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконувалась у лабораторії транспортних систем клітини Відділення
регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН
України за бюджетною темою “Дослідження механізмів регуляції
внутрішньоклітинного метаболізму піридиновими нуклеотидами в нормі і при
стрептозотоциновому діабеті” (№ держреєстрації 0198U004977) та завершена
у відділі сигнальних механізмів клітини Інституту біології клітини НАН
України у рамках співпраці з кафедрою біохімії біологічного факультету
Львівського національного університету ім. Івана Франка згідно плану
науково-дослідної роботи кафедри за темами “Діагностика та розробка
засобів корекції метаболічних порушень при цукровому діабеті” (№
держреєстрації 0193U024092) і “Структурно-функціональні та біохімічні
особливості клітин системи крові за умов цукрового діабету 1-го типу” (№
держреєстрації 0103U001909).

Мета та завдання досліджень. Метою роботи було дослідження взаємодії
системи антиоксидантного захисту і NO-залежних сигнальних шляхів у
регуляції морфофункціонального стану тромбоцитів за умов цукрового
діабету 1-го типу та пошук шляхів корекції метаболічних порушень при
даній патології.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні
завдання:

Дослідити активність NO-синтази в тромбоцитах у нормі і за умов ЦД 1-го
типу на фоні введення щурам з питною водою її субстрату (L-Arg) та
інгібіторів (L-NAME і AG).

Оцінити вплив L-Arg, L-NAME та аміногуанідину на стан системи
антиоксидантного захисту та рівень перекисного окислення ліпідів в
кров’яних пластинках контрольних тварин і на моделі експериментального
стрептозотоцинового діабету.

Порівняти динаміку транслокації регуляторної p85? субодиниці РІ-3-кінази
у детергент-нерозчинну фракцію за умов індукції агрегації кров’яних
пластинок різними концентраціями ADP та при дії селективного інгібітора
РІ-3-кінази вортманіну у нормі і при діабеті.

Вивчити вплив вортманіну на агрегаційну здатність та активність
NO-синтази тромбоцитів у нормі та за умов ЦД 1-го типу.

За допомогою трансмісійної електронної мікроскопії дослідити
ультраструктуру тромбоцитів у нормі та за умов ЦД 1-го типу після впливу
досліджуваних чинників (L-Arg, L-NAME, AG, вортманіну) in vitro та in
vivo.

Проаналізувати спектр білків лізатів тромбоцитів здорових донорів і
людей, хворих на ЦД 1-го типу, що взаємодіють in vitro з конститутивно
активованими формами (Gly12?Val) високоафінних GTPаз Rac, Rho та Cdc42.

Об’єкт дослiдження: тромбоцити контрольних щурiв та тварин із
експериментальним стрептозотоциновим діабетом, а також тромбоцити
клінічно здорових донорів та людей, хворих на цукровий діабет 1-го типу,
із наявними ангiопатiями.

Предмет дослiдження: ізоформи NOS (ендотеліальна конститутивна та
індуцибельна NO-синтаза) і ферментативна система антиоксидантного
захисту (супероксиддисмутаза (СОД), каталаза, глутатіонпероксидаза
(ГПО), глутатіонредуктаза (ГР)), рівень продукції оксиду азоту (NO2- та
NO3-) і перекисного окислення ліпідів (ТБК-позитивні продукти),
агрегаційна здатність тромбоцитів, PI-3-кіназа, низькомолекулярні GTPази
– Rac, Rho і Cdc42, ультраструктура кров’яних пластинок на фоні впливу
досліджуваних речовин in vitro та in vivo.

Методи дослiдження: визначення активності ферментів, аналіз агрегаційної
здатності тромбоцитів, преципітація in vitro GST-кон’югованими білками,
електрофорез білків в ПААГ, Вестерн-блот аналіз, трансмісійна електронна
мікроскопія.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше показано, що високий
рівень продукції оксиду азоту в тромбоцитах за умов досліджуваної
патології забезпечується активацією індуцибельної NO-синтази, посилення
експресії якої було виявлено за допомогою імуноблот-аналізу з
використанням моноклональних антитіл. Вперше досліджено динаміку
перерозподілу внутрішньоклітинного пулу ключового сигнального білка
РІ-3-кінази у тромбоцитах людей, хворих на ЦД 1-го типу, між
цитоплазматичною і цитоскелетною фракціями в процесі ADP-індукованої
агрегації. Виявлені диференційні зміни зв’язування ряду специфічних
ефекторних білків з низькомолекулярними G-білками підродини Rho за умов
даної патології. Вперше показано коригуючий вплив аміногуанідину,
інгібітора iNOS та процесів неферментативного глікозилювання, на
активність ферментів АОЗ, інтенсивність процесів ПОЛ та
морфофункціональний стан кров’яних пластинок щурів із експериментальним
стрептозотоциновим діабетом.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані у роботі дані
дозволяють охарактеризувати механізми розвитку підвищеної активності
тромбоцитів при ЦД 1-го типу як результат сукупної дії низки факторів.
Порушення співвідношення активності ізоформ NO-синтази, зміни у
функціонуванні PI-3-кінази та низькомолекулярних GTPаз підродини Rho,
інтенсифікація процесів ПОЛ, що відбуваються на фоні інгібування
ключових ферментів антиоксидантного захисту, сприяють розвитку
гіперчутливості кров’яних пластинок до дії індукторів агрегації за умов
досліджуваної патології. Оскільки введення аміногуанідину викликало
зниження рівня глюкози, глікозильованого гемоглобіну і вмісту продуктів
ПОЛ, нормалізувало активність ферментів системи антиоксидантного захисту
та здійснювало коригуючий вплив на морфофункціональний стан тромбоцитів
за умов цукрового діабету, доцільно на його основі вести пошук і
розробку нових фармакологічних препаратів, скерованих на нормалізацію
функціональної активності кров’яних пластинок.

Виявлені диференційні зміни зв’язування ряду специфічних ефекторних
білків з малими G-білками підродини Rho можуть бути покладені в основу
молекулярної діагностики генетичних передумов маніфестації і
прогресування даного захворювання. Матеріали дисертаційної роботи
використовуються на кафедрі біохімії ЛНУ ім. І.Франка при читанні
спецкурсів “Біохімія крові” та “Основи функціональної біохімії”.

Особистий внесок здобувача. У всіх серіях досліджень здобувач брала
безпосередню участь у створенні моделі стрептозотоцинового діабету,
особисто виділяла тромбоцити, досліджувала їх агрегаційну здатність,
визначала активність СОД, каталази, ГПО, ГР та рівень ПОЛ, проводила
імуноблот-аналіз, здійснювала експресію та очистку рекомбінантних
білків. Автор особисто провела пошук і проаналізувала теоретичні та
експериментальні дані за темою досліджень у вітчизняній та зарубіжній
літературі і підготувала публікації до друку. Електронно-мікроскопічні
дослідження виконано в Міжфакультетській лабораторії електронної
мікроскопії Львівського національного університету ім. І.Франка під
керівництвом завідувача лабораторії к.б.н., ст.н.сп. Кулачковського О.Р.
Співучасть співробітників кафедри біохімії ЛНУ, відділу сигнальних
механізмів клітини Інституту біології клітини та лабораторії електронної
мікроскопії у виконанні роботи відмічена у спільних публікаціях.
Здобувач висловлює щиру подяку к.б.н., доц. Дробот Л.Б. за всебічну
допомогу і корисні поради. Планування експериментальної роботи, аналіз
та обговорення результатів досліджень проведено спільно з науковим
керівником к.б.н., доц. Сибірною Н.О.

Апробація результатів досліджень. Основні положення дисертації були
представлені на науково-практичних конференціях “Международные дни
диабета” (Дніпропетровськ, 2003) і “Актуальні проблеми тромбозу і
порушень гемостазу в клінічній медицині” (Київ, 2003), на Установчому
З’їзді Українського Товариства клітинної біології (Львів, 2004), а також
на 29 конгресі Федерації Європейських біохімічних товариств (Варшава,
Польща, 2004).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 робіт, з яких 5 —
статті у фахових наукових журналах та 5 — тези доповідей у збірках
наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація містить наступні розділи:
вступ, аналітичний огляд літератури, матеріали та методи досліджень,
результати досліджень, який включає 6 розділів власних досліджень,
аналіз та узагальнення результатів досліджень, висновки та список
використаних джерел. Дисертацію викладено на 129 сторінках машинописного
тексту і проілюстровано 19 рисунками та 7 таблицями. Список цитованої
літератури містить 201 першоджерело.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури висвітлено і проаналізовано
сучасні дані стосовно виникнення і розвитку цукрового діабету 1-го типу
та експериментального стрептозотоцинового діабету, охарактеризовано
морфофункціональний стан тромбоцитів та біологічну систему
L-аргінін/оксид азоту у нормі та за умов даної патології.

Матеріали і методи досліджень. Експериментальний цукровий діабет у
щурів-самців масою 120-150 г викликали введенням стрептозотоцину фiрми
“Sigma” (США) з розрахунку 7 мг на 100 г маси тіла внутрішньочеревно.
Розвиток діабету контролювали за вмістом глюкози в крові, яку визначали
з використанням набору реактивів “Lachema” (Чехія) [Tringer, 1969].
Починаючи з моменту індукції діабету тваринам з питною водою вводилися
досліджувані речовини : L-аргінін (“Reanal”, Угорщина) у концентрації
1,25 г/л протягом 14 днів; L-NAME (“Beckenham”, Велика Британія) у
концентрації 70 мг/л протягом 14 днів; AG (“Sigma”, США) у концентрації
1 г/л протягом 30 днів. В експериментi використовували щурів із рівнем
глюкози 14-16 ммоль/л.

Забір крові для отримання тромбоцитів людей, хворих на ЦД 1-го типу,
проводили зранку (натщесерце і до прийому інсуліну) у силіконізовані
пробірки, що містили 1/10 об’єму 3,8%-ного розчину цитрату натрію у
якості антикоагулянту і 1,5 од/мл апірази (“Fluka”, Швейцарія).
Агрегаційну здатність кров’яних пластинок досліджували у збагаченій
тромбоцитами плазмі на автоматичному аналізаторі “Биола” (Росія) згідно
з [Gabbasov et al., 1989].

Тромбоцити виділяли шляхом диференційного центрифугування згідно
[Ferrell et al., 1989]. Лізис тромбоцитів проводили протягом 30 хв на
льодяній бані холодним буфером лізису такого складу: 10 мМ трис-HCl, 150
мМ NaCl, 1 % тритон Х-100, 5 мМ ЕДТА, 50 мМ NaF, 1 мМ
фенілметилсульфонілфторид (“Fluka”, Швейцарія), 5 мМ бензамідин
(“Sigma”), 10 мкг/мл апротиніну (“Sigma”), 10 мкг/мл лейпептину
(“Sigma”), 2 мкг/мл пепстатину (“Fluka”), 0,25 мМ Na3VO4 1:10 за
об’ємом. Детергент-нерозчинну фракцію осаджували центрифугуванням за
12000 g і 40С протягом 15 хв. Дослідження активності ферментів проводили
в супернатанті. Концентрацію білка вимірювали за методом [Peterson,
1977]. Супероксиддисмутазну активність (КФ 1.15.1.11) визначали за
допомогою реакції відновлення нітросинього тетразолію до нітроформазану
[Чевари и др., 1991]. Каталазну активність (КФ 1.11.1.6) визначали за
інтенсивністю забарвлення комплексу Н2О2 з молібдатом амонію [Королюк и
др., 1988]. Глутатіонпероксидазну активність (КФ 1.11.1.9) визначали за
допомогою методу, в основі якого лежить розвиток кольорової реакції
внаслідок взаємодії SH-груп з реактивом Еллмана [Моин, 1986]. Активність
глутатіонредуктази (КФ 1.6.4.2) оцінювали за зменшенням вмісту NADPH у
реакції з окисленим глутатіоном [Панченко и др., 1975]. Вміст сполук, що
реагують з тіобарбітуровою кислотою (ТБК-позитивні продукти), визначали
згідно [Тимирбулатов и др., 1981]. Активність NO-синтази визначали як
описано в роботі [Сумбаев, 2000] або опосередковано контролювали за
вмістом у тромбоцитах кінцевих продуктів обміну NO: нітритів за методом
Гріса [Мокроносов, 1989], нітратів за методом [Cawse, 1967]. Вміст
глікозильованого гемоглобіну визначали колориметричним методом [van
Kampen, 1983]. Статистичну обробку даних проводили згідно [Кокунин,
1975].

Для вивчення динаміки рівня регуляторної р85? субодиниці PI-3-кінази
відмиті тромбоцити ресуспендували у середовищі: 137 мМ NаСl, 2 мМ КСl, 1
мМ MgCl2, 1 мМ СаCl2, 0,4 мМ NaН2РО4, 5,6 мМ глюкози, 5 мМ HEPES
(4-(2-гідроксиетил)-1-піперазин-етансульфанілова кислота, “Sigma”, США)
(рН 7,4), 1 од/мл апірази та інкубували з різними концентраціями ADP
(“Sigma”) (0,5мкМ; 1,0мкМ; 5,0 мкМ). Індукцію зупиняли через відповідні
проміжки часу додаванням холодного двократного буферу лізису.
Вирівнювання білка за концентрацією проводили електрофоретично. Білки
лізатів тромбоцитів розділяли електрофорезом в блоках градієнтного
(5-18%) поліакриламідного гелю в присутності SDS [Laemmli, 1970] з
наступним імуноблотингом [Towbin, 1979]. Детекцію регуляторної p85?
субодиниці PI-3-кінази та індуцибельної NO-синтази на блотах
здійснювали, використовуючи моноклональні анти-р85? антитіла, люб’язно
надані д-ром І. Гутом (Людвігівський інститут ракових досліджень, Велика
Британія) і моноклональні анти-iNOS антитіла (“Sigma”), відповідно. Як
другі антитіла використовували анти-мишачі IgG, кон’юговані з
пероксидазою хрону (“Sigma”). Імунореактивні плями виявляли за допомогою
реагенту для підсиленої хемілюмінесценції (“Amersham”, Велика Британія).
Денситометричний аналіз результатів імуноблотингу здійснювали з
використанням пакету програми “Image Tool”.

Білок-білкові взаємодії вивчали in vitro з використанням кон’югованих з
глутатіон-S-трансферазою (GST) рекомбінантних форм GTPаз. Для
трансформації E.coli штаму BL-21 використовували відповідні pGEX-2T
плазмідні вектори, люб’язно надані доктором І. Гутом. Очистку
GST-кон’югованих білків із оброблених на ультразвуковому дезінтеграторі
(УЗДН-1, Росія) бактерійних лізатів здійснювали за допомогою
глутатіон-сефарози 4B (“Pharmacia Biotech”, Швеція) згідно протоколу
фірми — виробника. Стандартизовані за концентрацією білка (1 мг/мл)
лізати тромбоцитів інкубували впродовж 2 год при 40С із
глутатіон-сефарозою, асоційованою з рекомбінантними GST-білками
підродини Rho. Для визначення рівня неспецифічного зв’язування лізати
тромбоцитів інкубували з GST. Білки, що специфічно зв’язались із
глутатіон-сефарозою, розділяли електрофорезом в блоках градієнтного
(5-18%) ПААГ за присутності SDS. Зафарбовування електрофореграм
проводили за допомогою азотнокислого срібла [Wray, 1981]. Для детекції
молекулярної маси білків використовували білкові стандарти фірм
“Pharmacia” та “TRIZМA”.

Дослідження ультраструктури тромбоцитів проводили методом трансмісійної
електронної мікроскопії на зрізах за допомогою електронного мікроскопа
ПЕМ-100. Виділення, відмивання та фіксацію тромбоцитів для електронної
мікроскопії проводили за методикою [Васильева, 1982].

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Вивчення впливу основного субстрату NO-синтази (L-Arg) та її інгібіторів
(L-NAME і аміногуанідину) на активність NOS, стан системи АОЗ та рівень
ПОЛ тромбоцитів щурів у нормі та за умов експериментального
стрептозотоцинового діабету. Як свідчать дані, приведені в табл.1,
введення аргініну у контролі викликало достовірне підвищення активності
NO-синтази на 47%. Неспецифічний інгібітор (L-NAME) знижував вихідний
рівень активності на 45%, а AG проявляв дуже слабку дію, що свідчить про
незначний вклад iNOS у сумарну активність NOS у нормі.

Таблиця 1

Умови Показники

NO-синтаза, нмоль NADPH за

1 хв на 1 мг білка

СОД,

ум. од. на

1 мг білка

Каталаза, мкмоль Н2О2 за 1 хв на

1 мг білка

ГПО,

нмоль GSH

за 1 хв

на 1 мг білка

ГР,

нмоль NADPH

за 1 хв на

1 мг білка

ТБК – позитивні продукти, нмоль на

1 мг білка

Контроль 0,38±0,05 1,85?0,03 3,80?0,10 580,20?23,50 105,11?8,56
3,98?0,25

Діабет 0,87±0,09* 1,12?0,09* 2,70?0,09* 406,14?15,10* 161,73?6,87*
7,08?0,25*

Контроль + L-Arg 0,56±0,05* 2,41?0,11* 4,03?0,28 638,22?17,42
137,69?9,73* 4,46?0,39

Діабет +

L-Arg 0,62±0,02** 1,41?0,07** 3,53?0,14** 458,94?29,71 153,64?13,45
7,61?0,08

Контроль +L-NAME 0,21±0,02* 2,22?0,08* 4,59?0,17* 661,43?51,7
129,28?10,71 4,45?0,33

Діабет +

L-NAME 0,45±0,04** 1,57?0,09** 3,46?0,29** 491,14?17,93** 108,54?9,81**
5,09?0,28**

Контроль + AG 0,33±0,03 2,09?0,13 4,74?0,39* 655,63?21,81* 122,97?11,71
4,18?0,23

Діабет +

AG 0,48±0,03** 1,57?0,12** 3,64?0,29** 507,67?19,98** 107,11?8,33**
5,06?0,44**

Активність ферментів антиоксидантного захисту та рівень перекисного
окислення ліпідів у тромбоцитах щурів за досліджуваних умов (M?m,
n=8-10)

Примітка. Тут і далі: * — різниця вірогідна порівняно з контролем,
р<0,05; ** - різниця вірогідна порівняно з показниками за умов діабету, р<0,05. За умов експериментального стрептозотоцинового діабету введення L-Arg призводило до зниження активності NOS на 29%. Імовірно, такий ефект можна пояснити інгібуванням активності фермента за принципом негативного зворотного зв’язку за умов значного збільшення концентрації NO. Відомо, що оксид азоту має здатність зв’язуватися з гемовою групою ферменту, знижуючи тим самим його активність [Albakri, 1996]. При введенні інгібіторів за умов стрептозотоцинового діабету спостерігалося пригнічення активності NOS в тромбоцитах щурів. Необхідно відзначити, що зниження активності цього ферменту у випадку дії AG (селективного інгібітора iNOS) за умов ЦД було утричі стрімкішим по відношенню до вихідного рівня, ніж у нормі. Це свідчить про переважаючий вклад іNOS у сумарну активність синтаз оксиду азоту за умов даної патології. Показано, що в тромбоцитах людей за умов ЦД 1-го типу в 1,9 рази зростає рівень експресії iNOS, здатної продукувати у значних кількостях NO (рис.1). Останній проявляє цитотоксичну дію, взаємодіючи з О-2, і утворює потужний оксидант пероксинітрит ONOО-, котрий індукує пошкодження ДНК та інгібує активність багатьох ферментів шляхом посттрансляційних модифікацій. Таким чином, NO з фактора фізіологічної регуляції функції клітини за умов цукрового діабету перетворюється у фактор патогенезу. Рис. 1. Рівень експресії індуцибельної NO-синтази в лізатах тромбоцитів: 1 - здорові донори, 2 - хворі на ЦД 1-го типу; А - імуноблот-аналіз, Б - графічне представлення результатів із використанням комп’ютерного денситометричного аналізу (в ум. од.). Результати дослідження антиоксидантної системи кров’яних пластинок експериментальних тварин представлено в табл.1. Зниження супероксиддисмутазної активності тромбоцитів за умов стрептозотоцинового діабету на 39% може бути зумовлене неферментативним глікозилюванням і дією ONOО-. Відомо, що в тканинах людей, хворих на ЦД, а також у щурів із стрептозотоциновим діабетом рівень глікозилювання Cu,Zn-CОД зростає більш ніж у два рази, що веде до значного пригнічення її активності [Takata et al., 1996]. ONOО-, у свою чергу, нітрифікує СОД по тирозинових залишках з утворенням стабільного протеїнзв’язаного комплексу [Ischiropoulos, 2003]. Експериментально доведено, що глікозильовані білки легше піддаються модифікації пероксинітритом [Nagai et al., 2002]. Активність каталази в тромбоцитах щурів за умов стрептозотоцинового діабету зменшувалась на 29%. Зниження активності СОД і каталази внаслідок глікозилювання та окисної модифікації слід розглядати як фактор, який безпосередньо впливає на агрегаційну здатність тромбоцитів за умов ЦД, визначаючи, таким чином, розвиток судинних ускладнень. Імовірно, низька активність цих ферментів зумовлює ініціацію процесів ПОЛ у тромбоцитарних мембранах, що призводить до порушення їх фізико-хімічних властивостей [Mazzanti et al., 1997]. Пригнічення активності ГПО може бути зумовлене алостеричним інгібуванням ферменту NADPH, зниженням концентрації відновленого глутатіону за умов даної патології, а також глікозилюванням ферменту в тромбоцитах [Di Simplicio et al., 1995]. Зростання активності ГР може бути пов’язано із обмеженням використання NADPH у біосинтезі жирних кислот та зниженням співвідношення NADP/NADPH за умов діабету [Великий и др., 1992]. Співвідношення інтенсивності ПОЛ і активності системи АОЗ, що відображає степінь ендогенної інтоксикації в організмі, значною мірою залежить від рівня продукції NO. Введення L-аргініну та інгібіторів NO-синтаз як у нормі, так і за умов ЦД супроводжувалося підвищенням активності СОД різного ступеня (див. табл.1). Каталазна активність змінювалася подібним чином. Глутатіонпероксидазна активність у випадку індукованого стрептозотоцином діабету на фоні введення L-Arg не зазнавала суттєвих змін, в той час як інгібітори NOS мали нормалізуючий вплив, тобто підвищували її активність. Введення аргініну приводило до підвищення активності ГР лише у нормі, тоді як інгібітори NO-синтаз однаковою мірою знижували цей показник лише у випадку ЦД. Продемонстровано зростання рівня ТБК-позитивних продуктів в кров’яних пластинках у щурів із експериментальним стрептозотоциновим діабетом на 78% порівняно з контролем (див. табл.1), що є наслідком збільшення вмісту активних кисневих метаболітів (АКМ) за умов інтенсифікації окисних процесів в тромбоцитах при даній патології. Виявлені зміни рівня ПОЛ в тромбоцитах при діабеті можуть бути пов’язані із модифікацією антиоксидантних ферментів як активним киснем, так і глюкозою. I ? < v " D – I * X I I ??????I < | e " ? AE O O ??????тні властивості L-NAME та AG, введення яких супроводжувалося нормалізацією співвідношення процесів ПОЛ та інактивації АКМ. Умови Показники Рівень глюкози в крові, ммоль/л Вміст HbA1c, % К (контроль) 5,6 ± 0,5 4,53 ± 0,05 К + L-Arg 5,8 ± 0,6 4,47 ± 0,11 К + L-NAME 6,9 ± 0,4* 4,60 ± 0,12 К + AG 5,2 ± 0,9 4,49 ± 0,07 Д (діабет) 12,5 ± 0,5* 8,81 ± 0,41* Д + L-Arg 14,2 ± 0,7** 9,92 ± 0,36** Д + L-NAME 12,2 ± 0,4 8,01 ± 0,47 Д + AG 8,6 ± 0,4** 6,03 ± 0,28** Дослідження впливу L-Arg та інгібіторів NOS на рівень глюкози і глікозильованого гемоглобіну в крові експериментальних тварин та ультраструктуру тромбоцитів у нормі та за умов цукрового діабету 1-го типу. Виявлено, що при введенні L-аргініну рівень глюкози в крові зростав на 14%, а вміст глікозильованого гемоглобіну (HbA1c) в еритроцитах тварин із стрептозотоциновим діабетом підвищувався на 13% (табл. 2). Введення AG знижувало ці показники на 31 та 32% відповідно за рахунок пригнічення неферментативного глікозилювання білків. Таблиця 2 Вміст глюкози та глікозильованого гемоглобіну при введенні субстрату та інгібіторів NOS щурам у нормі та за умов стрептозотоцинового діабету (М?m, n=14) Результати електронної мікроскопії свідчать, що тромбоцити за умов ЦД мають характерні ознаки активації та деградації (рис.2 і рис.3). Це проявляється втратою тромбоцитами дископодібної форми, утворенням псевдоподій. В самих клітинах спостерігається зменшення електронної густини та зниження кількості ?-гранул. Інкубація кров’яних пластинок здорових донорів з L-Arg (рис. 2(2)) не призводила до суттєвих змін їх форми чи кількості гранул. Порівнюючи ультраструктуру тромбоцитів у хворих на ЦД 1-го типу до інкубації з L-Arg (рис. 2(5)) і після (рис. 2(6)), слід відзначити наявність кров’яних пластинок з округлими псевдоподіями, що вказує на зворотну агрегацію. Введення L-аргініну щурам з експериментальним діабетом посилювало пошкодження ультраструктури кров’яних пластинок (рис. 3(6)). В той же час введення інгібіторів NO-синтази мало протекторний вплив на структуру тромбоцитів за умов цукрового діабету. Найбільш яскраво коригуючу дію виявляв аміногуанідин (рис. 3(8)). Рис. 2. Ультраструктура тромбоцитів здорових донорів та людей, хворих на цукровий діабет 1-го типу: 1. Контроль (К); 2. К + L-Arg; 3. К + L-NAMЕ; 4. К + AG; 5. Діабет (Д); 6. Д + L-Arg; 7. Д + L-NAME; 8. Д + AG. Рис. 3. Ультраструктура тромбоцитів щурів у нормі та за умов стрептозотоцинового діабету: 1. Контроль (К); 2. К + L-Arg; 3. К + L-NAME; 4. К + AG; 5. Діабет (Д); 6. Д + L-Arg; 7. Д + L-NAME; 8. Д + AG. Таким чином, застосування інгібіторів NO-синтаз як фармакологічних чинників для запобігання розвитку судинних ускладнень за умов цукрового діабету 1-го типу може розглядатися як перспективний напрямок у створенні лікарських препаратів. Вплив селективного інгібітора РІ-3-кінази вортманіну на агрегаційну здатність, активність NO-синтази та ультраструктуру тромбоцитів за досліджуваних умов. Як свідчать отримані результати, за умов цукрового діабету змінюється функціональний стан тромбоцитів, що було зареєстровано за підвищеною здатністю до агрегації (табл.3). Інкубація збагаченої тромбоцитами плазми (ЗТП) з вортманіном у здорових донорів призводить до різкого падіння агрегаційної здатності кров’яних пластинок, тоді як у хворих на ЦД 1-го типу цей ефект не спостерігається, що може свідчити про порушення шляхів трансдукції сигналу до білків цитоскелету, опосередкованих PI-3-кіназою, в тромбоцитах людей, хворих на цукровий діабет. Збільшення концентрації кінцевих продуктів метаболізму NO - нітритів та нітратів (NO2-+NO3-) - після інкубації ЗТП з вортманіном у нормі свідчить про підвищення активності NO-синтази у тромбоцитах. Це узгоджується з даними прямого визначення вмісту NO та cGMP у тромбоцитах після інкубації з інгібіторами PI-3-кінази [Clutton et al., 2004]. За умов цукрового діабету вортманін не мав достовірного впливу на показник сумарної концентрації NO2- та NO3-. У нормі фізіологічний дезагрегувальний вплив на тромбоцити здійснює NO, який продукується в клітині за участю ендотеліальної ізоформи NOS [Mazzanti, 1997]. Є дані про складні взаємовідносини РІ-3-кінази з системою NO-синтаз, які є відмінними для кожної ізоформи зокрема [Pahan et al., 1999; Snyder, 1999]. Антиагрегаційний вплив NO здійснює щонайменше двома шляхами: активацією гуанілатциклази та інгібуванням РІ-3-кінази [Pigazzi et al., 1999]. Як свідчать отримані нами дані (див. табл.3), у нормі спостерігається адитивна дезагрегувальна дія NO та вортманіну, тоді як за умов цукрового діабету механізм корекції функціонального стану тромбоцитів є розрегульованим. Таблиця 3 Вміст нітритів і нітратів та агрегаційна здатність тромбоцитів після інкубації з вортманіном (100нМ, 30 хв) збагаченої тромбоцитами плазми здорових донорів та людей, хворих на цукровий діабет 1-го типу (М±m, n=8-10) Умови Ступінь агрегації, ум.од. Час агрегації, сек NO2-+NO3-, мкМ Контроль 23,90±0,15 220 ±20 18,87±0,67 Контроль+вортманін 7,60±0,44* 50±4* 21,61±0,45* Діабет 53,80±2,50* 54±5* 24,37±0,50* Діабет+вортманін 48,10±2,10 41±6** 23,87±0,87 Для з’ясування впливу вортманіну на стан білків цитоскелету тромбоцитів були проведені дослідження їхньої ультраструктури методом трансмісійної електронної мікроскопії. На електронограмі кров’яних пластинок здорових донорів після інкубації з вортманіном зафіксовано абсолютно інертні клітини (рис.4 (В)). ?-гранули та щільні тільця рівномірно розподіляються у цитоплазмі, тромбоцити мають округлу форму, характерну для неактивованої клітини. У хворих донорів кров’яні пластинки залишаються активованими, їхній грануломер переміщений у центр клітини, спостерігаються псевдоподії (рис.4 (Г)). Рис. 4. Ультраструктура тромбоцитів: А – здорового донора; Б – хворого на ЦД 1-го типу; В – здорового донора після інкубації з вортманіном; Г – хворого на ЦД 1-го типу після інкубації з вортманіном. Вивчення динаміки транслокації у детергент-нерозчинну фракцію регуляторної p85? субодиниці РІ-3-кінази при дії вортманіну та за умов індукції агрегації кров’яних пластинок різними концентраціями ADP. У результаті інкубації ЗТП з вортманіном у здорових донорів зростає рівень р85? у цитозольній фракції тромбоцитів (рис.5), тобто інгібітор перешкоджає інкорпорації РІ-3-кінази у цитоскелетну фракцію, що узгоджується із зниженням агрегаційної здатності кров’яних пластинок (див. табл.3). За умов ЦД 1-го типу інкубація з вортманіном теж викликає підвищення вмісту р85? у цитозольній фракції, але воно не супроводжується зміною агрегаційної здатності. На фоні зниження інкорпорації у цитоскелетну фракцію тромбоцитів РІ-3-кінази агрегаційна здатність кров’яних пластинок залишається дуже високою. Проаналізовано in vitro вплив різних концентрацій індуктора агрегації ADP на рівень p85? у цитозольній фракції кров’яних пластинок за різних часових проміжків, що дало б можливість розмежувати окремі фази агрегації. У здорових донорів (рис.6,А, доріжки 1-4) вміст р85? у тритон Х-100 розчинній фракції тромбоцитів спадає по мірі підвищення концентрації індуктора (рис. 6,Б, доріжки 1-4), а крива, яка характеризує динаміку транслокації РІ-3-кінази, що розраховувалася як відсоток від вихідного рівня, свідчить про поступально зростаючу інкорпорацію у цитоскелетну фракцію (рис. 6,В). Для хворих на ЦД 1-го типу (рис.6,А, доріжки 5-8) характерною є сповільнена інкорпорація при дії низьких концентрацій ADP (двофазна агрегація) і лише за умов дії високої концентрації агоніста агрегації (однофазна агрегація) були відмічені достовірні зміни вмісту р85? у тритон Х-100 розчинній фракції тромбоцитів та транслокації РІ-3-кінази у детергент-нерозчинну фракцію кров’яних пластинок (рис. 6,Б,В). Рис. 5. Вплив вортманіну на рівень p85? РІ-3-кінази у тритон Х-100 розчинній фракції тромбоцитів: 1 - контроль; 2 - контроль + вортманін; 3 - діабет; 4 - діабет + вортманін; A – імуноблотинг р85?; Б – рівень р85? у детергент-розчинній фракції тромбоцитів в ум. од. Аналіз робіт, присвячених впливу NO на агрегаційну функцію тромбоцитів, свідчить про те, що він здійснюється на ранніх етапах активації кров’яних пластинок, тобто ще до інтегрин-залежної інкорпорації РІ-3-кінази у цитоскелет клітини [Guinebault et al., 1995]. Уповільнена транслокація РІ-3-кінази у цитоскелетну фракцію тромбоцитів за умов ЦД 1-го типу при дії ADP у низьких концентраціях на фоні високої агрегаційної здатності може свідчити про зниження контролю NO над процесами, що забезпечують зміни морфофункціонального стану кров’яних пластинок за умов даної патології. При дослідженні постагрегаційної динаміки змін рівня р85? слід відзначити подібний профіль і фазний характер включення р85? у цитоскелетну фракцію тромбоцитів як у нормі, так і за умов цукрового діабету 1-го типу. При 4-х хвилинах інкубації з індуктором агрегації транслокація p85? спостерігалася лише за найнижчої концентрації ADP. На підставі імуноблот-аналізів вмісту регуляторної p85? субодиниці РІ-3-кінази та іNOS (рис.5(1,3) та рис.1(А) відповідно) показано, що підвищення експресії регуляторної р85? субодиниці за умов ЦД не перешкоджає індукції іNOS в мегакаріоцитах - попередниках тромбоцитів. Аналіз спектрів білків лізатів тромбоцитів здорових донорів і хворих на ЦД 1-го типу, що взаємодіють in vitro з конститутивно активованими формами високоафінних GTPаз Rac, Rho та Cdc42. При детальному аналізі отриманих електрофореграм виявлено суттєві зміни у спектрах ефекторних білків, які взаємодіють in vitro з активованими формами GST-Rho, -Rac, та -Cdc42. Білок p116 був присутній в GST-Rho-преципітатах лише в нормі, причому тільки в двох зразках. Відсутність даного білка в одному з контрольних зразків може свідчити про певні генетичні передумови для захворювання на цукровий діабет. Білок з молекулярною масою 90 кДа зв’язується з GST-Rac лише в лізатах тромбоцитів здорових донорів. Зміни у рівні зв’язування ефекторних білків з молекулярними масами 135, 155, 170, 250 і 300 кДа тільки в одному дослідженому зразку тромбоцитів, ізольованих із крові хворого на ЦД 1-го типу, може свідчити про конститутивну активацію Cdc42-залежного сигналювання. Подальша ідентифікація білків, що взаємодіють з низькомолекулярними G-білками підродини Rho, допоможе зрозуміти механізми, які залучені до регуляції морфофункціонального стану актинового цитоскелету тромбоцитів за умов цукрового діабету 1-го типу. ВИСНОВКИ Отримані результати доповнюють і розширюють уявлення про роль ферментативної системи антиоксидантного захисту і NO-залежних сигнальних шляхів у регуляції морфофункціонального стану тромбоцитів при цукровому діабеті 1-го типу та обгрунтовують можливості корекції метаболічних порушень за умов даної патології. Зміни в експресії та транслокації у детергент-нерозчинну фракцію регуляторної р85? субодиниці фосфатидилінозит-3-кінази, неферментативне глікозилювання та зміна функціонального стану низькомолекулярних G-білків підродини Rho є провідними молекулярними механізмами порушення морфофункціонального стану тромбоцитів за умов цукрового діабету 1-го типу, яке виступає у ролі однієї з основних причин розвитку діабетичних мікро- та макроангіопатій. За умов ЦД 1-го типу в кров’яних пластинках змінюється співвідношення активностей конститутивної та індуцибельної ізоформ NO-синтази. Посилення експресії та зростання активності iNOS на фоні інтенсифікації вільнорадикальних процесів лежать в основі розвитку оксидативного стресу і ведуть до гальмування фізіологічної регуляторної функції NO та прояву його цитотоксичної дії. У тромбоцитах при ЦД 1-го типу виявлено підвищення експресії та порушення процесу транслокації у детергент-нерозчинну фракцію регуляторної р85? субодиниці РІ-3-кінази, що може бути ланкою реципрокної регуляції активностей РІ-3-кінази та NO-синтази. Досліджено вплив L-аргініну, L-NAME, аміногуанідину і вортманіну на ультраструктуру тромбоцитів у нормі та за умов ЦД 1-го типу in vitro та in vivo. Встановлено, що аміногуанідин має найбільший протекторний ефект на структуру тромбоцитів за умов цукрового діабету. L-аргінін посилює пошкодження ультраструктури кров’яних пластинок. Вортманін проявляє виражений вплив на стан білків цитоскелету тромбоцитів у нормі, проте не викликає таких змін при ЦД. Для послаблення токсичної дії NO і корекції патологічного стану, пов’язаного з його гіперпродукцією в організмі за умов ЦД 1-го типу, доцільним є використання аміногуанідину як селективного інгібітора iNOS, антиоксиданта та інгібітора неферментативного глікозилювання. Зміни у зв’язуванні специфічних ефекторних білків з низькомолекулярними G-білками підродини Rho у тромбоцитах людей, хворих на цукровий діабет 1-го типу (р60 і р90, що зв’язуються з GTPазою Rac; р75 і р116, що взаємодіють з Rho) можуть знайти застосування у молекулярній діагностиці генетичних передумов маніфестації і прогресування захворювання. ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ Сибірна Н., Вовк О., Дробот Л. Роль фосфатидилінозит-3-кінази та індуцибельної NO-синтази у регуляції морфофункціонального стану тромбоцитів у разі інсулінозалежного цукрового діабету // Вісник Львів. ун-ту. Серія біол. - 2003. - Вип.34. - С.52-56. (Дисертанту належить опрацювання робочої схеми експерименту, аналіз літературних даних і власних результатів, участь в отриманні матеріалу, експериментальній роботі та написанні статті. Здобувач особисто провела електрофоретичне розділення білків лізатів тромбоцитів з наступним імуноблот-аналізом). Сибірна Н.О., Вовк О.І., Кулачковський О.Р., Горбачевська І.В. Вплив вортманіну на ультратонку структуру тромбоцитів у нормі та за умов цукрового діабету I типу // Експ. та клін. фіз. і біох. - 2004. - №2(26). - С.121-124. (Дисертант опрацювала дані літератури та власні результати, їй належить участь в отриманні матеріалу, експериментальній роботі та написанні статті). Сибірна Н.О., Вовк О.І., Дробот Л.Б. Зміни функціонального стану низькомолекулярних G-білків тромбоцитів за цукрового діабету 1-го типу // Укр. біохім. журнал. - 2004. - Т.76, № 2. – С.117-120. (Дисертанту належить опрацювання робочої схеми експерименту, аналіз літературних даних і власних результатів, участь у написанні та оформленні статті. Дисертант особисто здійснювала експресію та очистку GST-кон’югованих рекомбінантних GTPаз і проводила електрофоретичне розділення білків лізатів кров’яних пластинок). Сибірна Н.О., Вовк О.І., Великий М.М. Роль фосфатидилінозитол-3-кінази в регуляції агрегаційної здатності тромбоцитів за цукрового діабету 1-го типу // Укр. біохім. журнал. - 2004. - Т. 76, № 5.- С. 96-101. (Дисертанту належить опрацювання робочої схеми експерименту, аналіз літературних даних і власних результатів, участь в отриманні матеріалу, експериментальній роботі та написанні і оформленні статті). Сибірна Н., Вовк О., Бурда В., Федорович А. Вплив L-аргініну та інгібіторів NO-синтази на стан антиоксидантної системи тромбоцитів за умов цукрового діабету 1 типу // Вісник Львів. ун-ту. Серія біол. - 2004. - Вип.38. - С.50-56. (Дисертанту належить опрацювання робочої схеми експерименту, аналіз літературних і експериментальних даних, участь в отриманні матеріалу та написання і оформлення статті. Дисертант особисто визначала активності ферментів антиоксидантного захисту та рівень перекисного окислення). Сибірна Н.О., Бурда В.А., Кулачковський О.Р., Вовк О.І., Зарицька М.В. Вплив аміногуанідину на структурно-функціональні властивості тромбоцитів при стрептозотоциновому діабеті у щурів // Тез. докл. науч.-практ. конф. “Международные дни диабета”. - Днепропетровск (Украина). - 2003.- Вып.6. - С.116-117. (Здобувач брала участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні і оформленні тез доповіді). Сибірна Н.О., Бурда В.А., Вовк О.І., Біронт Н.В., Федорович А.М. Вплив аміногуанідину на систему антиоксидантного захисту та активність індуцибельної NO-синтази за умов цукрового діабету 1 типу // Тез. докл. науч.-практ. конф. “Международные дни диабета”. - Днепропетровск (Украина). - 2003.- Вып.6. - С.117-118. (Здобувач визначала активність СОД, каталази, глутатіонредуктази і глутатіонпероксидази, брала участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез доповіді). Сибірна Н., Дробот Л., Кулачковський О., Зарицька М., Вовк О. Дослідження механізмів регуляції агрегаційної здатності тромбоцитів за умов цукрового діабету 1-го типу // Матеріали наук.-практ. конф. “Актуальні проблеми тромбозу і порушень гемостазу в клінічній медицині”. – Київ (Україна). - 2003. - С.85-86. (Здобувач брала участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез доповіді). Вовк О.І., Бурда В.А., Федорович А.М., Зарицька М.В., Сибірна Н.О. Вплив інгібіторів NO-синтази на антиоксидантний статус щурів за умов стрептозотоцинового діабету // Зб. тез Установчого з’їзду Укр. Товар. клітин. біології. – Львів (Україна). - 2004. - C.214. (Дисертант визначала активність СОД, каталази, глутатіонредуктази і глутатіонпероксидази, опрацювала та проаналізувала експериментальні дані, написала та оформила тези доповіді). Sybirna N., Vovk O., Kulachkovsky O. Role of phosphoinositide 3-kinase in platelet aggregation under the type 1 diabetes mellitus // FEBS Journal.-Abstracts of 29th Meeting of the FEBS.- Warsaw (Poland).- 2004.- Vol.271, Suppl.1.-P.130. (Здобувач брала участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез доповіді). АНОТАЦІЯ Вовк О.І. Роль NO-залежних сигнальних шляхів у регуляції морфофункціонального стану тромбоцитів за умов цукрового діабету 1-го типу. - Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.11 - цитологія, клітинна біологія, гістологія. - Інститут біології клітини НАН України, Львів, 2005. Дисертаційна робота присвячена вивченню молекулярних механізмів, які опосередковують зміни морфологічного і функціонального стану тромбоцитів за умов цукрового діабету 1-го типу, та розробці способів корекції метаболічних процесів, які призводять до виникнення і розвитку ускладнень при даній патології. Показано, що однією із причин зміни структурно-функціонального стану кров’яних пластинок за умов цукрового діабету (ЦД) 1-го типу є порушення співвідношення активностей конститутивної та індуцибельної ізоформ NO-синтази (iNOS). Посилення рівня експресії та зростання активності iNOS на фоні інтенсифікації вільнорадикальних процесів лежать в основі розвитку оксидативного стресу та метаболічної інтоксикації за умов ЦД 1-го типу і трансформують ефекти NO із захисних у цитотоксичні. Зміни в експресії та порушення у процесах транслокації із цитозольної в цитоскелетну фракцію регуляторної р85? субодиниці фосфатидилінозит-3-кінази, неферментативне глікозилювання та зміна функціонального стану низькомолекулярних G-білків підродини Rho є провідними молекулярними механізмами порушення функціонального стану тромбоцитів за умов цукрового діабету 1-го типу і ведуть до розвитку мікро- та макроангіопатій. Запропоновано на основі аміногуанідину вести пошук і розробку нових препаратів, які запобігатимуть розвиткові ЦД або коригуватимуть діабетичні ускладнення. Ключові слова: цукровий діабет 1-го типу, тромбоцити, агрегація, антиоксидантний захист, перекисне окислення ліпідів, NO-синтаза, PI-3-кіназа. АННОТАЦИЯ Вовк Е.И. Роль NO-зависимых сигнальных путей в регуляции морфофункционального состояния тромбоцитов при сахарном диабете 1-го типа. - Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.11 – цитология, клеточная биология, гистология. – Институт биологии клетки НАН Украины, Львов, 2005. Диссертационная работа посвящена изучению молекулярных механизмов, опосредующих изменения морфологического и функционального состояния тромбоцитов при сахарном диабете 1-го типа, и разработке способов коррекции метаболических процессов, вызывающих возникновение и развитие осложнений при данной патологии. Показано, что одной из причин изменений структурно-функционального состояния кровяных пластинок при сахарном диабете (СД) 1-го типа является нарушение соотношения активностей конститутивной и индуцибельной изоформ NO-синтазы (iNOS). Усиление экспрессии и возрастание активности iNOS на фоне интенсификации свободнорадикальных процессов лежат в основе развития оксидативного стресса и метаболической интоксикации при СД 1-го типа и трансформируют эффекты NO из защитных в цитотоксические. Изменения в экспрессии и нарушения в процессах транслокации из цитозольной в цитоскелетную фракцию регуляторной p85? субъединицы фосфатидилинозитол-3-киназы, неферментативное гликозилирование и изменения функционального состояния низкомолекулярных G-белков семейства Rho являются ведущими молекулярными механизмами нарушения функционального состояния тромбоцитов при СД 1-го типа и ведут к развитию микро- и макроангиопатий. Предложено на основе аминогуанидина вести поиск и разработку новых препаратов для предупреждения развития сахарного диабета или коррекции его осложнений. Ключевые слова: сахарный диабет 1-го типа, тромбоциты, агрегация, антиоксидантная защита, перекисное окисление липидов, NO-синтаза, PI-3-киназа. SUMMARY Vovk O.I. Role of NO-dependent signalling in the regulation of morphology and functional state of platelets under type 1 diabetes mellitus. - Manuscript. Thesis for a degree of Doctor of Philosophy (Ph.D) in Biology, speciality 03.00.11 - cytology, cell biology, histology. - Institute of Cell Biology of National Academy of Sciences of Ukraine, Lviv, 2005. Dissertation is devoted to the investigation of molecular mechanisms controlling changes in morphology and functional state of platelets under type 1 diabetes mellitus (DM) and the approaches to correct metabolic disorders leading to occurrence and development of diabetic complications. It was found that changes in structure and functional state of platelets under type 1 diabetes mellitus are caused by changes in proportion between activities of constitutive and inducible isoforms of nitric oxide synthase (iNOS). Increased expression and activity of iNOS together with intensification of free radical processes induce development of oxidative stress and metabolic intoxication under type 1 DM and transform NO effects from protective to cytotoxic. Changes in expression and impairment in translocation from cytosolic to cytoskeletal fraction of р85? regulatory subunit of phosphatidylinositol-3-kinase (PI-3-kinase), non-enzymatic glycosylation as well as changes in functional state of Rho family small GTPases, are the principal molecular mechanisms of impairment in functional state of platelets leading to micro- and macroangiopathies. Using western immunoblots of platelet proteins of healthy persons and patients suffered from type 1 DM, increased expression of iNOS and p85? regulatory subunit of PI-3-kinase was observed in diabetic platelets. It was shown that incubation of platelet rich plasma with wortmannin, an irreversible selective inhibitor of PI-3-kinase, leads to a marked decrease in platelet aggregation ability in healthy persons, while in patients with type 1 diabetes mellitus this effect was less manifested or not detected at all. Translocation dynamics of PI-3-kinase regulatory subunit into cytoskeletal fraction during ADP-induced platelet aggregation and after wortmannin treatment was studied. Reciprocal interaction of endothelial constitutive NO synthase with PI-3-kinase in mechanisms of platelet functional state regulation in normal and pathological conditions had been analyzed. Platelets from healthy donors and patients with type 1 diabetes mellitus were examined for proteins specifically interacting in vitro with GST-fused constitutively active (Val12) forms of small GTPases Rac, Rho and Cdc42. Obtained results suggest that signalling pathways mediated by Rho GTPases are altered under type 1 diabetes mellitus. Such changes of actin cytoskeleton regulation may contribute to higher level of platelet aggregation, which appear to be the etiological background of the late diabetic complications. Increased content of thiobarbituric acid reactive substances in diabetic platelets may occur partially due to decrease of the antioxidant enzyme activities. Decrease in the activity of superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase may occur as a result of their modification by reactive oxygen species or/and non-enzymatic glycosylation. The obtained data demonstrated that L-NAME (N?-nitro-L-arginine methyl ester) and aminoguanidine exhibit antioxidant effects. Electron microscopy was used to study the effect of main substrate (L-Arg) and inhibitors of NO synthase (L-NAME and aminoguanidine) as well as wortmannin on ultrastructural changes of platelets in vitro and in vivo in the normal state and under DM. The protective effect of aminoguanidine on the platelet structure under insulin-dependent diabetes mellitus was observed. We propose that aminoguanidine may be used to search for new drugs for treatment and prevention of vascular complications under type 1 diabetes mellitus. Key words: type 1 diabetes mellitus, platelets, aggregation, antioxidant defense, lipid peroxidation, NO synthase, phosphatidylinositol 3-kinase. 1 2 iNOS 1 2 Рівень iNOS в ум.од. 0 500 1000 1500 2000 2500 А Б * Б В А 30 0 10 20 40 50 0 0,5 1,0 5,0 концентрація ADP (мкМ) % від вихідного рівня контроль діабет p85? концентрація ADP (мкМ) 1 2 3 4 5 6 7 8 0 0,5 1,0 5,0 0 0,5 1,0 5,0 ум. од. 0 10 20 30 40 50 60 70 1 2 3 4 5 6 7 8 * * * ** * Рис. 6. Вплив різних концентрацій індуктора агрегації (ADP) на рівень p85? у тритон Х-100 розчинній фракції тромбоцитів (час інкубації 2 хв); A – імуноблотинг p85? тромбоцитів здорових донорів (треки 1-4) та хворих на ЦД 1-го типу (треки 5-8); Б – динаміка рівня p85? у детергент-розчинній фракції тромбоцитів в ум.од.; В – динаміка транслокації p85? у цитоскелетну фракцію тромбоцитів.

Похожие записи