НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім.О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

НІКОНЕНКО ОЛЕКСАНДР ГЕОРГІЙОВИЧ

УДК 577.35: 576.54

Роль молекул адгезії у механізмах синаптичної пластичності

03.00.02 — біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у відділі цитології Інституту фізіології

ім.О.О.Богомольця НАН України

Науковий консультант:

Офіційні опоненти: Заслужений діяч науки і техніки України,

доктор медичних наук, професор

Скибо Галина Григорівна

зав.відділом цитології Інституту фізіології

ім.О.О.Богомольця НАН України

Доктор біологічних наук, професор,

чл.-корр.НАН України

Веселовський Микола Сергійович

зав.відділом фізіології нейрональних мереж

Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України

Доктор медичних наук, професор

Яценко Валентин Порфирійович,

зав.кафедри медичної кібернетики та телемедицини

Міжуніверситетського медико-інженерного факультету

Національного технічного університету „КПІ”.

Доктор біологічних наук, професор

Корогод Сергій Михайлович

зав.кафедрою експериментальної фізики

Дніпропетровського національного університету

Провідна установа: Національний університет ім. Тараса Шевченка, кафедра
біофізики

Захист дисертації відбудеться 06.02.2007 року о 14 годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.198.01 при Інституті
фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ,

вул.акад.Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології
ім.О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ,

вул.акад.Богомольця, 4.

Автореферат розіслано 04.01.2007 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

Доктор біологічних наук

Сорокіна-Маріна З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Пластичність є важливою та невід’ємною рисою
нервової системи, яка допомагає змінювати її структуру та активність у
відповідь на дію численних факторів зовнішнього та внутрішнього
середовища. Динаміка збудження та гальмування у мережах нервових клітин
визначається передачею сигналів у синапсах, у яких вивільнення
нейромедиатору та його взаємодія з відповідними рецепторами ведуть до
виникнення локальних іонних струмів у постсинаптичній мембрані і, в
кінцевому результаті, нервового імпульсу. Для багатьох синапсів
ефективність взаємодії між нейромедиатором та відповідними
постсинаптичними рецепторами не є постійною і змінюється в залежності
від багатьох обставин (Kandel et al., 2000).

Механізми синаптичної пластичності, тобто властивості нервових клітин до
адаптивних змін функції, є одним з актуальних питань сучасної
нейрофізіології. Феномени пластичності нервової системи базуються на
модуляції передачі сигналів через синапси, або змінах кількості
синапсів. Синаптична пластичність модифікує зв’язок між конкретними
нейронами, активність локальних нейронних мереж та взаємозв’язки між
окремими системами мозку (Turrigiano, Nelson, 2004).

Існують як мінімум дві форми діяльності нервової системи, що базуються
на феноменах пластичності – навчання та розвиток. Дослідження останніх
років показали, що між цими двома процесами існує глибокий внутрішній
зв’язок, як на генетичному, так і на фізіологічному рівні. Він
проявляється у спільному характері активації генів, експресія яких
відбувається на різних етапах онтогенезу і впливає на процеси формування
коротко- та довтривалої пам’яті.

Важливою ланкою зв’язку клітин нервової системи з внутрішнім середовищем
організму є молекули адгезії. Раніше їх вплив на пластичність нервових
структур ігнорувався, головним чином тому, що молекули адгезії не
приймають безпосередньої участі у передачі нервових імпульсів, а
процеси, які протікають за їх участю, реалізуються набагато повільніше
за електричні феномени. Однак, сучасні дані свідчать про те, що молекули
адгезії є важливим компонентом багатьох сигнальних шляхів, і їх
потенційний ефект на процеси пластичності синапсів не можна
недооцінювати.

Розвиток ЦНС включає серію морфогенетичних подій, таких як проліферація
клітин, міграція клітин-попередників, координований ріст аксонів,
синаптогенез та селективна смерть нейронів (Schachner, 1997). Показано,
що у цих подіях приймають участь молекули адгезії, що знаходяться на
поверхні клітин, а також у позаклітинному матриксі. Формування зв’язків
між нейронами нервової системи хребетних залежить від експресії
молекулярних сигналів, які дозволяють аксонам, що ростуть, знаходити
відповідні місця для утворення синапсів. Роль таких сигналів можуть
виконувати молекули адгезії, які створюють демаркаційні лінії для
аксонів, що ростуть (Ranscht, 2000). Крім механічної фіксації, ці
молекули також медіюють внутрішньо- та міжклітинні сигнальні події.
Механізми таких впливів, особливо в контексті синаптичної пластичності,
залишаються в значній мірі нез’ясованими.

Білки клітинної адгезії є, як правило, трансмембранними рецепторами, що
пронизують плазматичну мембрану клітини і мають позаклітинний,
трансмембранний та внутрішньоклітинний домени (Gottardi, Gumbiner,
2001). Перший домен може зв’язуватись з поверхнею сусідньої клітини або
структурою позаклітинного матриксу. Існує декілька родин молекул
клітинної адгезії, що відрізняються за структурою та типами лігандів. Їх
основні родини включають селектини, інтегрини, імуноглобуліни та
кадгерини. Встановлено, що ці молекули, а також молекули позаклітинного
матриксу, серед яких чільне місце займають білки – тенасцини, визначають
вихідний план зв’язків у мережах нейронів в процесі онтогенетичного
розвитку (Bonhoeffer, 1996).

В той же час, дуже мало відомо про участь молекул адгезії в механізмах
пластичності нервової системи. Існують непрямі дані про те, що при
деяких захворюваннях, наприклад, шизофренії та епілепсії,
спостерігаються одночасні порушення пластичності мозку та зміни
експресії молекул адгезії (Rougon, Hobert, 2003). Тому дослідження
участі адгезійних молекул у механізмах пластичності синапсів, крім суто
наукового інтересу, може мати велике практичне значення. Розуміння
механізмів розвитку зазначених патологій нервової системи допоможе у
пошуку шляхів їх ефективного лікування.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тема
дисертаційної роботи є фрагментом науково-дослідних робіт „Молекулярні
механізми, що відповідають за специфіку функції різних мозкових
структур” (2000-2003 рр., № держ.реєстрації 0103U003467) та „Пошук
ефективних засобів впливу на молекулярні механізми, що обумовлюють
збудливість клітин” (2004 -2006 рр., № держ.реєстрації 0104U007220).

Об’єкт дослідження — гальмівні та збуджуючі синапси гіпокампу.

Предмет дослідження — участь молекул клітинної адгезії родини
імуноглобулінів, а також молекули позаклітинного матриксу тенасцина-R у
механізмах пластичності синапсів.

Методи досліджень – математичне моделювання, комп’ютерна імітація,
електронно-мікроскопічні, імуногістохімічні, молекулярно-біологічні,
електрофізіологічні та статистичні методи.

Мета роботи. Метою роботи стало вивчення ролі молекул адгезії у
механізмах пластичності синапсів гіпокампа.

Завдання дослідження.

1. Розробити методи, які б дали можливість досліджувати просторові
феномени, що корелюють з синаптичною функцією.

2. Дослідити ефект дефіциту молекули клітинної адгезії L1 на аферентацію
пірамідних нейронів зони СА1 гіпокампу та структуру гальмівних
перисоматичних синапсів.

3. Вивчити вплив дефіциту L1 на ефективность гальмівних перисоматичних
синапсів, а також на характеристики збуджуючої синаптичної передачі у
зоні СА1 гіпокампу.

4. Дослідити ефект дефіциту молекули клітинної адгезії СНL1 на
аферентацію пірамідних нейронів зони СА1 гіпокампу та цитоархітектоніку
перисоматичних синапсів.

5. Вивчити вплив дефіциту СНL1 на ефективность гальмівних перисоматичних
синапсів та характеристики збуджуючої синаптичної передачі у зоні СА1
гіпокампу.

6. Дослідити ефект дефіциту молекули клітинної адгезії NCAM на
структурні характеристики збуджуючих аксо-дендритних синасів радіального
шару зони СА1 гіпокампу.

7. Вивчити молекулярні механізми участі NCAM у формуванні
постсинаптичного ущільнення у збуджуючих синапсах.

8. Дослідити ефект дефіциту молекули позаклітинного матриксу тенасцина-R
на структуру гальмівних перисоматичних синапсів пірамідного шару та
збуджуючих аксо-дендритних синапсів радіального шару зони СА1 гіпокампу.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше запропоновано метод
інтерпретації просторового розподілу синаптичних везикул (СВ), що
базується на аналізі випадкових ультратонких зрізів, математичному
моделюванні та комп’ютерній імітації. Цей метод відкрив нові можливості
для вивчення просторової дінаміки окремих пулів СВ і запропонував
альтернативу складним та витратним методам тривимірної (3В)
реконструкції на основі серійних ультратонких зрізів та електронної
томографії.

Вперше запропоновано метод інтерпретації просторового розподілу
імунопозитивних епітопів, що базується на аналізі ультратонких зрізів,
математичному моделюванні та комп’ютерній імітації. Запропоновано
декілька модифікацій методів топографічного аналізу внутрішньоклітинних
структур, які було втілено у відповідних комп’ютерних програмах.

Вперше продемонстровано ефект дефіциту молекули клітинної адгезії L1 на
аферентацію клітин пірамідного шару зони СА1 гіпокампу та структуру
перисоматичних синапсів. Морфологічні аспекти проявляються у зменшенні
поверхневої щільності та розмірів активних зон перисоматичних синапсів,
зменшенні чисельності везикул, пришвартованих до активної зони, та більш
дифузному розподілі СВ у порівнянні з контролем.

Вперше виявлено вплив дефіциту L1 на ефективність гальмівних
перисоматичних синапсів, що полягає у зменшенні середньої амплітуди та
частоти унітарних перисоматичних гПСП, а також зменшенні частоти
мініатюрних гПСП. Виявлено, що порушення гальмівної передачі викликає
аномальну імпульсну активність клітин зони СА1 гіпокампу.

Вперше продемонстровано парадоксальний ефект дефіциту молекули клітинної
адгезії СНL1, що веде до збільшення аферентації пірамідних нейронів зони
СА1 гіпокампу та відповідних змін структури перисоматичних синапсів.

Вперше показано, що дефіцит CHL1 викликає зростання ефективності
гальмівних перисоматичних синапсів та збільшення кількості квантів
нейромедиатора, що вивільнюється у відповідь на потенціал дії. Показано,
що для CHL1-дефіцитних тварин властиве послаблення коротко- та
довготривалої потенціації збуджуючої синаптичноїі передачі.

Вперше показано вплив дефіциту NCAM на структуру аксо-дендритних
синапсів СА1 зони гіпокампу та стан їх рецепторного апарату. Відкрито
досі невідомий механізм організації постсинаптичного ущільнення у
збуджуючих синапсах, відповідно до якого NCAM сприяє збірці та підтримці
постсинаптичного цитоскелетного комплексу, сформованого на основі
спектрину.

Відкрито ефект дефіциту молекули позаклітинного матриксу — тенасцина-R
(TnR), який викликає зменшення аферентації клітин пірамідного шару СА1
зони гіпокампу та зміни структури перисоматичних синапсів, що свідчать
про зменшення їх ефективності.

Теоретичне і практичне значення отриманих результатів. Теоретичні
положення, отримані за результатами проведеної роботи, розширюють
уявлення про механізми синаптичної пластичності, що лежить в основі
важливих феноменів навчання та пам’яті. Отримані дані свідчать про те,
що молекули клітинної адгезії (МКА) родини імуноглобулінів, а також
молекула позаклітинного матриксу TnR, є важливими факторами, що
впливають на структуру та функцію синапсів та визначають діапазон їх
пластичних змін. Ці зміни зачіпають як структурні, так і функціональні
аспекти синаптичної передачі у різних ділянках гіпокампу. Дані про
участь адгезійних молекул у процесах пластичності нервової системи
можуть бути використані при дослідженні механізмів розвитку певних
патологій нервової системи, перелік яких включає епілепсію та
шизофренію, а також у пошуках шляхів їх ефективного лікування.
Запропоновані у даній роботі методи кількісної оцінки просторового
розподілу синаптичних везикул та імунопозитивних епітопів, що базуються
на оригінальній ідеології математичного моделювання та комп’ютерної
імітації, можуть бути застосовані у практиці наукових досліджень.

Особистий внесок здобувача. Автор даної роботи зробив основний внесок у
всі стадії роботи, в тому числі у постановку задач дослідження, розробку
нових методів дослідження, включаючи розробку відповідних математичних
моделей, процедур комп’ютерної імітації та програмного забезпечення,
проведення більшості експериментів, аналіз результатів експериментів та
написання статей.

Деякі експерименти, пов’язані з культивуванням органотипових зрізів та
дисоційованих клітин гіпокампу, було проведено разом із співавторами
опублікованих робіт, співробітниками відділу цитології Інституту
фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України: д.м.н., проф. Скибо Г.Г. та
ст.наук.спів., к.б.н. Ніконенко І.Р. Експерименти, присвячені
дослідженню молекулярних механізмів участі NCAM у формуванні
постсинаптичного цитоскелетного каркасу, були проведені разом із
співавторами опублікованих робіт, співробітниками Центру молекулярної
нейробіології, Медичного факультету Університету Гамбурга (Німеччина):
ст.наук.спів., к.б.н. Ситником В.М. та ст.наук.спів., к.б.н.Лещинською
І.О.

В окремих дослідженнях, представлених у роботі, приймали активну участь
співавтори публікацій.

Апробація результатів дисертації. По усіх матеріалах дисертації зроблено
доповіді на засіданнях Сектору клітинної біології Інституту фізіології
ім. О.О.Богомольця НАН України та на Всеукраїнських та міжнародних
наукових форумах: 3-й Міжнародній конференції з комп’ютерізованої
цитологічної лабораторії у Чікаго, США (березень, 1994), 8-му
Міжнародному симпозіумі з кількісної патології у Амстердамі, Нідерланди
(вересень, 1994), 12-му Міжнародному цитологічному конгресі у Мадріді,
Іспанія (травень, 1995), 4-й Міжнародній конференції з комп’ютерізованої
цитологічної лабораторії у Чікаго, США (березень, 1996), 15-й
Міжнародній зустрічі Британської асоціації нейронаук у Хероугейті,
Великобританія (квітень, 1999), 5-му конгресі IBRO у Єрусалімі, Ізраїль
(липень, 1999), Установчій конференції Українського товариства нейронаук
у Києві, Україна (вересень, 1999); 1-й Зустрічі федерації Європейских
товариств нейронаук (FENS) у Брайтоні, Великобританія (червень, 2000),
30-й Зустрічі товариства нейронаук (SFN) у Новому Орлеані, США (жовтень,
2000), 5-й Зустрічі товариства нейронаук Німеччини у Штутгарті,
Німеччина (жовтень, 2003), 35-й Зустрічі товариства нейронаук (SFN) у
Сан Дієго, США (жовтень, 2005), 5-й Зустрічі федерації Європейских
товариств нейронаук (FENS) у Відні, Австрія (липень, 2006), 4-му з’їзді
Українського біофізичного товариства у Донецьку, Україна (грудень,
2006).

Публікації. За результатами роботи опубліковано 20 статей (4 з них
одноособові) та 13 тез доповідей, які опубліковані у профільних
вітчизняних та закордонних журналах, матеріалах з’їздів та конференцій.

Структура й обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 302
сторінках друкованого тексту і складається з вступу, основної частини,
що містить огляд літератури, опис матеріалів та методів досліджень,
результатів досліджень, аналізу й узагальнення цих результатів,
висновків, списка використаних літературних джерел, який включає 480
найменувань. Робота ілюстрована 82 рисунками.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Загальна характеристика об’єктів дослідження. В експериментах
використовували L1-дефіцитних (L1-/-) мишей, що були створені за
допомогою контрольованого тетрацикліном трансактиватора, вбудованого у
другий екзон гена L1. Також досліджували CHL1-дефіцитних (CHL1-/-)
мишей різного віку, дорослих NCAM-дефіцитних (NCAM-/-) самців миші, а
також самців тенасцин-R-дефіцитних (TnR-/-) мишей 10, 20 та 80 денного
віку. Як контроль для L1-/-, L1-/- та NCAM-/- використовували мишей
аналогічної статі дикого типу з того ж самого приплоду. Експериментальні
та контрольні групи складались як мінімум з 5 тварин. У дослідженнях
чутливості методів топографічного аналізу використовували тканину мозку
дорослих самців щура, культивовані зрізи гіпокампу від щурів 7-денного
віку, а також дисоційовані культури нейронів гіпокампу ембріонів щура.
Зрізи гіпокампу щурів 7-денного віку культивували in vitro на межі між
поживним середовищем та газовою фазою протягом 7 днів. Дисоційовані
клітини гіпокампу NCAM+/+ та NCAM-/- мишей були висіяні на скельця,
вкриті полі-L-лізіном, та вирощувались in vitro на протязі 12 днів.

Морфометричні методи дослідження. Кількість симетричних синапсів,
сформованих на тілах пірамідних нейронів зони СА1 гіпокампу, визначали
як щільність поверхні активних зон на тонких зрізах, що аналізували за
допомогою електронної мікроскопії на збільшенні Ч5000. Щільність
поверхні підраховували за методом (Baddeley et al., 1986) як відношення
площі контакту та референс-об’єму, одиницею виміру були мкм-1
(мкм2/мкм3). В деяких випадках визначали частку поверхні як відношення
поверхневих щільностей активних зон та плазматичної мембрани пірамідних
нейронів. Для визначення числової щільності асиметричних синапсів було
застосовано метод дайсектору (Sterio, 1984), з використанням тонких
зрізів, що аналізували за допомогою електронної мікроскопії на
збільшенні Ч7000. Довжину та товщину перетинів постсинаптичного
ущільнення, площу перетину пресинаптичної терміналі, довжину сегментів
перетинів перисоматичної мембрани вимірювали на випадково обраних
цифрових зображеннях, зроблених цифровою камерою MegaView II (Soft
Imaging System, Німеччина) на збільшенні Ч50000. Виміри на оцифрованих
зображеннях робили за допомогою програми UTHSCSA ImageTool версія 2
(Університет Техасу, США). Лінійну щільність перисоматичних синапсів
оцінювали як кількість активних зон на одиницю довжини перетину
плазматичної мембрани. Відстань між епітопами NCAM, поміченими
часточками колоїдного золота, оцінювали на електронограмах випадково
обраних горизонтальних тонких зрізів культивованих клітин, зроблених при
збільшенні Ч10000. Часточки колоїдного золота підраховували у
асиметричних синапсах на збільшенні Ч50000. Для оцінки просторового
розподілу пірамідних нейронів у зоні СА1 гіпокампу, а також СВ
у межах пресинаптичної терміналі було використано метод мінімального
остовного дерева (МОД) (Dussert et al., 1987). Координати об’єктів
визначали за допомогою програми ImageTool на оцифрованих
мікрофотографіях. Для оцінки просторового розподілу СВ застосовували
метод визначення відстані до 1-го найближчого сусіда (ВНС) (Clark,
Evans, 1954). Формалізм методу ВНС був використаний для розробки методу
визначення локальних характеристик просторового розподілу СВ. З метою
просторової інтерпретації двовимірних (2В) розподілів перетинів СВ, а
також розподілів імуноцитохімічних маркерів було створено відповідні
математичні моделі.

Імуногістохімічні методи дослідження. Імуногістохімічне виявлення L1,
CHL1, парвальбуміну та везикулярного ГАМК транспортера (VGAT) проводили
на фронтальних кріостатних зрізах головного мозку. З метою візуалізації
перинейрональних мереж проводили імуногістохімічне фарбування з
використанням аглютинину Wisteria floribunda. Виявлення РНК, що
відповідала позаклітинному домену CHL1, проводили за методом
гібридизації іn situ. Підрахунок перисоматичних імунопозитивних зон
проводили на пакетах зображень зрізів тканини товщиною 1 мкм, що
отримували за допомогою конфокального мікроскопа LSM 510 (Zeiss,
Німеччина). Числову щільність імунопозитивних клітинних тіл оцінювали за
допомогою методу оптичного дайсектору. Імуноцитохімічне (рreembedding)
фарбування епітопів NCAM на плазматичній мембрані проводили на
культивованих in vitro дисоційованих нейронах гіпокампу щура.
Імуноцитохімічне (рostembedding) фарбування субодиниць NMDA (NR1) та
AMPA (GluR1) рецепторів, кальмодулінкінази ІІ (CAMKII) та спектрину було
проведено на тонких зрізах тканини мозку, яку після процедури
заморожування-заміщення було інфільтровано смолою Lowicryl HM20 та
полімерізовано під ультрафіолетовим світлом.

В експериментах з дослідження ролі NCAM у механізмах формування
постсинаптичного цитоскелетного каркасу використовували поліклональні та
моноклональні антитіла проти NCAM, поліклональні антитіла проти
синаптофізину (Santa Cruz Bioteсhnology, США), поліклональні антитіла
проти спектрину еритроцитів, CAMKIIб, моноклональні антитіла проти
б-актиніну (Sigma-Aldrich, США), NR1 та NR2B (BD Biosciences,
Німеччина), моноклональні антитіла проти PSD95 (Upstate Biotechnology,
США) та CAMKII (Stressgen Biotechnologies, США).

Електрофізіологічні методи дослідження. Петч-клемп записи та реєстрацію
польових збуджуючих постсинаптичних потенціалів (зПCП) проводили на
зрізах гіпокампу, що постійно промивались аерованою карбогеном штучною
цереброспинальною рідиною. Клітини у зоні CA1 було візуалізовано за
допомогою інфра-червоної мікроскопії. Для записів синаптичних струмів
при підтримуючому потенціалі -60 мВ використовували метод петч-клемпу в
конфігурації „повна клітина”. Для запису гальмівних постсинаптичних
потенціалів (гПСП) внутрішньоклітинну концентрацію іонів Cl- було
підвищено. Мініатюрні та викликані гПСП були розділені шляхом
використання антагоністів AMPA- та NMDA-рецепторів глутамату,
відповідно, CNQX (25 мкМ) та AP-5 (50 мкМ). Для запису мініатюрних гПСП
було додатково використано блокатор Na+-каналів TTX (1 мкМ). Такі
потенціали було зареєстровано за допомогою програми AxoGraph 4 (Axon
Instruments, США), як події з відношенням сигналу до шуму більше ніж 3.
Петч-клемп записи від цілої клітини здійснювали з використанням
підсилювача EPC-9 (Heka Electronik, Німеччина). Унітарні перисоматичні
гПСП записували у відповідь на мінімальну стимуляцію. Для дослідження
залежної від використання модуляції синаптичної ефективності проводили
стимуляцію подвійними імпульсами чи імпульсами з різними інтервалами
10-20 разів. Через 200 мс після останнього стимулу серії генерували
окремий імпульс для реєстрації відновлення гПСП. Для того, щоб позбутися
впливу пресинаптичних ГАМКB-рецепторів, використовували антагоніст
ГАМКB-рецепторів CGP54626 (200 нМ). Польові зПСП записували за допомогою
скляних піпеток, що мали опір 2-3 M(. Довготривалу потенціацію (ДП)
викликали за допомогою п’яти циклів стимуляції з частотою и-ритму, що
повторювали кожні 20 с. Кожний цикл складався з 10 пакетів частотою 5
Гц. Кожен пакет складався з 4 стимулів частотою 100 Гц. Тривалість
імпульсів складала 0,2 мс. Значення ДП разраховували як максимальну
потенціацію на протязі першої хвилини після індукції ДП. Рівень ДП
розраховували як збільшення середніх амплітуд польових зПСП,
зареєстрованих через 50-60 хв після індукції ДП. Для того, щоб викликати
утворення популяцій множинних імпульсів у зоні СА1 використовували
аферентну стимуляцію колатералей Шафера з частотою 1 Гц протягом 30 с.
Колатералі Шафера стимулювали біполярним платиновим електродом у
пірамідному шарі на відстані приблизно 400 мкм від записуючого
електроду. Тривалість стимулюючих імпульсів складала 0,2 мс, а сила
стимуляції була обрана такою, щоб викликати виникнення популяції
імпульсів максимальної амплітуди. В усіх експериментах зону СА3
відокремлювали від зони СА1 за допомогою механічного перерізу, щоб
запобігти імпульсній активності, яка виникає внаслідок зворотнього
збудження зони СА3.

Статистичні методи. Статистичний аналіз цифрових даних виконували за
допомогою програми Statistica вер.6 (StatSoft, США). Непараметричний
дво-направлений тест Колмогорова-Смірнова використовували для визначення
статистичної вирогідності відмінностей. Вірогідними вважали розбіжності
при p<0,05. В окремих випадках проводили аналіз лінійної кореляції. Методи інтерпретації просторових феноменів, що корелюють с синаптичною функцією, було втілено у оригінальному програмному забезпеченні, написаному з використанням Turbo Pascal вер.7 (Borland International, США) та Delphi вер.5 (Borland International, США). РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ Розробка методів аналізу просторових феноменів у синапсах та на поверхні клітинних мембран. Зміни функції синапсу пов’язані з складними перебудовами його структури, і ці структурні зміни можуть бути джерелом цінної інформації щодо базових механізмів синаптичної передачі сигналів. Однак, на заваді стає відсутність відповідних методів кількісного аналізу. Тому було проведено пілотне дослідження 2В розподілів перетинів СВ за допомогою методу мозаїки Вороного, спрямоване на вивчення чутливості даного методу та його спроможності виявляти базові просторові феномени, що корелюють з синаптичною функцією. Під час пілотного дослідження було проаналізовано електронограми пресинаптичних терміналей дисоційованої культури нейронів гіпокампу щура. З метою вивчення дискримінативної сили процедури, всі терміналі було поділено на дві групи: з “дифузним” та “кластерним” розподілом органел. Аналіз показав, що метод дозволяє виявляти розбіжності у просторових розподілах СВ. Однак, значні крайові ефекти, пов’язані з невизначеністю форми полігонів, побудованих навкруги крайових точок, обмежують його чутливість. ]з та [DВНС]з ) нагадувала таку для варіанту методу без нормування та дозволяла надійно розрізняти просторові розподіли СВ in vivo та in vitro (p<0,05). ]з та [DВНС]з таких відмінностей не мали. На основі отриманих даних було зроблено висновок про те, що метод ВНС має достатню чутливість для аналізу просторових синаптичних феноменів. Застосування варіанту, що передбачає нормування до параметрів розподілу Пуассона, не є доцільним. Він не є інтуїтивним, і в жодному випадку не виявив більшої чутливості у порівнянні з вихідним варіантом методу. Формалізм ВНС було використано для розробки методу, що дозволяє визначати положення СВ по відношенню до активної зони синапсу, а також вимірювати відстань між самими везикулами. З цією метою 2В розподіл n точок, які ідеалізовано представляють СВ, розглядали як множину V={v1,v2,v3,..vN}. M точок іншої множини, A={a1,a2,a3,…aM}, які є мітками перетину плазматичної мембрани активної зони, використовували для ідеалізованого представлення активної зони синапсу. Для кожної точки з множини V визначали відстань до її першого найближчого сусіда з множини А (відстань до активної зони, ВАЗ). Відстань від кожної точки з множини V до її першого найближчого сусіда з тієї ж самої множини V (ВНС) використовували для оцінки просторових зв’язків між СВ. З метою вивчення придатності методу для аналізу просторових розподілів СВ досліджували симетричні синапси, що утворені на тілах пірамідних нейронів зони СА1 гіпокампу миші. Аналіз показав, що більше половини СВ знаходилось не далі ніж 300 нм від активних зон, в той час як для майже 75% цих органел значення ВАЗ варіювали у діапазоні від 0 до 500 нм. Кореляція між індивідуальними значеннями ВАЗ та ВНС була практично відсутня (r=+0.130). На наступному етапі вимірювали ВАЗ та ВНС для загальної популяції СВ цих синапсів та використовували індивідуальні значення ВАЗ як критерій групування СВ, що було проведено з 50 нм інтервалами. Показано, що по мірі віддалення від активних зон синапсів відбуваються закономірні зміни середніх інтервальних значень ВНС. Фактично було показано, що значення ВАЗ можна використовувати як своєрідну „координату” відносного положення везикули у пресинаптичній терміналі, а запропонований метод є достатньо чутливим для того, щоб виявляти зміни у просторовому розподілі СВ. та стандартне відхилення ?МОД) вибірки довжин гілок МОД дозволяють визначати сукупні статистичні властивості просторового розподілу СВ. ]V та [?МОД ] V). З загальної виборки терміналей було відібрано дві групи: з домінуванням кластерів та з дифузним розподілом везикул. За іншими ознаками терміналі обох груп були подібні і не мали статистично вірогідних відмінностей ні за площею перетину терміналі (р>0,05), ні за кількістю перетинів СВ
(р>0,05).

]A та [?МОД ]A), не дозволяють розрізняти кластерні та дифузні
розподіли

]V для двох груп терміналей були вірогідними (р < 0,001). Був зроблено висновок, що метод МОД є адекватним для вивчення просторового розподілу СВ і дозволяє розрізняти випадки кластерного та дифузного розподілу органел. В той же час, нормування показників МОД до площі перетину пресинаптичної терміналі не є доцільним, тому що фактично знижує чутливість методу. Модель імітації утворення випадкових зрізів клітини. Випадковий тонкий зріз неповно представляє положення СВ у внутрішньоклітинному просторі. Тому було розроблено метод, який за допомогою математичного моделювання та комп’ютерної імітації дозволяє інтерпретувати внутрішньоклітинне положення везикул на основі 2В оцінок, зроблених на випадкових зрізах. На першому етапі було створено математичну модель для перевірки принципової можливості розробки такого методу. Запропонована модель базується на таких положеннях: 1) форма терміналі та везикули апроксимована еліпсоїдом обертання; 2) положення везикули всередині терміналі може змінюватись; 3) зрізи терміналі є випадковими за положенням та орієнтацією; 4) зрізи мають нульову товщину. Рівняння еліпсоїда обертання є таким: , де a (=b) < c - піввісі. (1) Для того, щоб отримати рівняння перетину еліпсоїду площиною Щ, перепишемо рівняння (1) у координатах, трансформованих таким чином: а) перше обертання координатної системи відбувається навкруги вісі z на кут (; б) друге обертання відбувається навкруги вісі y' на кут ( ; c) координатна система зсувається вздовж вісі z" (сегмент OM) на відстань d (довжина сегменту ОМ) (Рис.1А). В результаті ми отримаємо: , де (2) , , . Таке рівняння є відмінним від канонічного тільки зи рахунок зсуву центру еліпсу на величину d·(E/D). Остання дорівнює відстані, на яку може зсуватись точка М (проекція центру еліпсоїду на зріз) по відношенню до центру самого зрізу (точка M1, Рис.1Б). З рівняння (2) є очевидним, що цей зсув (довжина відрізку MM1) може відбуватись тільки вздовж довгої вісі еліпсу зрізу терміналі. Значення цього зсуву використовується на четвертому етапі процедури трансформації координат для того, щоб визначити центр перетину терміналі, іншими словами, початок нової координатної системи. Рис.1 Схема математичної моделі, що імітує утворення зрізів терміналі та везикули. Положення зрізу терміналі визначається довжиною та орієнтацією у просторі прямолінійного вектору, OM, який є перпендикуляром до площини Щ (Рис.1A). Орієнтація вектору OM у просторі визначається кутами ц та и, що формуються між цим вектором та, відповідно, вісями x та z координатної системи. Визначено, що 0 ? ц ? 2р та 0?и?р. Довжина вектору OM (d) приймає значення у діапазоні між 0 та верхньою границею, що залежить від куту и наступним чином: Будь-який зріз еліпсоїда обертання, що представляє терміналь, є еліпсом. Коли Щ перетинає органелу, координати її центру Q на площині Щ (Рис.1A) задаються такими рівняннями: . Можуть також використовуватись відносні значення координат центру перетину органели на площині Щ, отримані шляхом нормалізації значень uQ та vQ до довжин відповідних півосей: , де U, V є півосями еліпсу та H=cos2и + (a/c)2 * sin2 и. Значення ж та з можуть змінюватись у інтервалі від 0 до 1. Для того, щоб імітувати утворення випадкових зрізів, значення d повинно бути випадковим у інтервалі: 0 ? d ? dmax. Ізотропний напрям вектору OM у просторі імітується за допомогою підстановки незалежних випадкових чисел (x1, x2) рівномірно розподілених у інтервалі (0,1) у рівняння: . Аналіз результатів, отриманих у трьох серіях комп’ютерних випробувань, показав, що статистичні характеристики вибірок координат центру перетину СВ дозволяють надійно розрізняти випадки з різним розташуванням органели у внутришньоклітинному просторі, а також те, що створена модель є математично коректною. Метод інтерпретації 2В розподілів перетинів СВ у термінах тривимірного (3В) простору. З метою інтерпретації 2В розподілів перетинів СВ, що спостерігаються на випадкових зрізах синапсів, у термінах 3В простору було розроблено метод, що базується на математичному моделюванні та комп’ютерній імітації. На першому етапі процедури кількісна оцінка 2В розподілу СВ на оцифрованій електронограмі проводиться за допомогою методу МОД. Одночасно, на тому ж зображенні оцінюється 2В щільність перетинів СВ (Щ2В). Потім відбувається імітація 3В розподілу СВ (другий етап). На третьому етапі імітується процес утворення випадкових зрізів терміналі. На четвертому етапі імітований 2В розподіл аналізується, а на п’ятому - його параметри порівнюються з параметрами експериментального розподілу. Етапи процедури від другого до п’ятого можуть циклічно повторюватись, доки не буде досягнута відповідність між імітованим та експериментальним розподілами. В останньому випадку вважають, що 3В щільність СВ (Щ3В) та відповідний 3В розподіл СВ відповідають ситуації у реальній популяції СВ. ) та log10(?МОД), з іншого боку, існував сильний негативний зв’язок (r= –0,935 та r=–0,976, відповідно, обидва p=0,05). Тести іншої серії показали, що 2В параметри моделі корелюють також з 3В розподілом СВ. Випадковий розподіл (Рис.2А,Г) та два розподіли, з „малими” (Рис.2Б, Д) та „великими” (Рис.2В, Е) кластерами везикул, було імітовано з константним значенням Щ3В. Рис.2 Імітовані 3В розподіли синаптичних везикул (А,Б,В) та відповідні МОД, побудовані на перетинах везикул на окремих випадкових зрізах (Г, Д, Е). . Наприклад, його значення було подібним для випадкового розподілу та розподілу з „малими” кластерами везикул (p>0,05). Однак, для розподілу з
„великими” кластерами значення ?МОД було на 40% меншим, якщо порівнювати
його з двома іншими випадками (p<0,05). Таким чином можна зробити висновок про те, що запропонована процедура є достатньо чутливою для дослідження 3В просторових розподілів СВ і може застосовуватись для інтерпретації просторових феноменів у реальних синапсах. Метод просторової інтерпретації даних імуногістохімічного аналізу. З метою розробки методу, який би дозволяв кількісно аналізувати імуногістохімічне фарбування з використанням колоїдного золота, було запропоновано математичну модель, що базується на таких умовах: 1) форма ділянок плазматичної мембрани, що мають незначну кривизну апроксимується евклідовою площиною; 2) мікротомний ніж відсікає від мембрани смужки заданої ширини за випадковим або систематичним сценаріями; 3) розмір часточок колоїдного золота є незмінним. Часточки золота розглядаються як елементи кінцевої множини Р, що займає обмежений 2В простір, який відповідає зовнішній поверхні плазматичної мембрани. Положення часточки рі на плазматичній мембрані визначається координатами xi та yi. Мікротомний ніж ріже мембрану на смужки товщиною W (товщина зрізу), що можуть мати довільне положення та орієнтацію. Положення часточки, що потрапила у межі такої смужки, визначається координатами x’i та y’i у системі координат, вісь x’ якої співпадає з довшим виміром смужки. Відповідність між двома системами координат визначається такими рівняннями: , , де ц - це кут, утворений між x- (x’-) та x”-вісями; a та b відповідають початку нової координатної системи. Часточка золота попадає у зріз, якщо значення її y”-координати відповідає інтервалу: 0 ? y”i ? W. Через те, що у реальній ситуації визначають не відстань між часточками, а її проекцію на поверхню зрізу, модель вимірює різницю між значеннями х”i- координати для сусідніх часточок (тобто відстань між часточками, ВмЧ). У тому випадку, коли перетин мембрани містить одну або жодної часточки, він вважається пустим та відкидається. ) знаходиться у залежності від 2В щільності (r=-0,929). Вплив характеру 2В розподілу часточок на характеристики вибірки ВмЧ досліджували у трьох тестах, у яких часточки були розподілені відповідно до різних типів розподілів, але з незмінною 2В щільністю, 10 часточок/мкм2. Використовували: 1) випадковий розподіл об’єктів, що самовідштовхуються; 2) ортогональний розподіл; 3) „рафтовий” розподіл. Було показано, що параметри вибірки ВмЧ знаходяться у значній залежності від характеру 2В розподілу і є статистично відмінними для всіх імітованих розподілів. Дослідження чутливості методу було також проведено на препаратах дисоційованих культур нейронів гіпокампу щура, які були помічені антитілами проти NCAM. Зовнішня поверхня плазматичної мембрани культивованих нейронів була помірно помічена часточками золота, що були кон’юговані з антитілами. Часточки рідко формували агрегати на соматичній мембрані і були розташовані на різній відстані одна від одної (Рис.3А). Рис.3 Імуногістохімічне фарбування плазматичної мембрани культивованих нейронів антитілами проти NCAM (А). Масштабна лінія = 500 нм. Б. Гістограми експериментальної (Б) та імітованої (В) вибірок значень ВмЧ, точковий графік 2В розподілу часточок золота (Г), що відповідає експериментальним даним. Імітації показали, що статистичні параметри експериментальної вибірки ВмЧ відповідали 2В розподілу випадково розташованих „рафтів” з рівномірно випадковим розташуванням часточок у межах „рафтів”. Рис.3 В, Г ілюструє результати окремої імітації з високою відповідністю між моделлю та експериментальними даними (у = 6,86). Було зроблено висновок про те, що запропонована процедура може бути використана для кількісної інтерпретації результатів імуногістохімічного фарбування у термінах 2В простору. Аналіз впливу МКА L1 на структуру та функцію синапсів. Загальна морфологія головного мозку та його окремих структур у L1-/- мишей не відрізнялась від таких у L1+/+ тварин. Попередній аналіз електронограм показав, що на тілах пірамідних нейронів зони СА1 гіпокампу L1-/- мишей спостерігалась менша, у порівнянні з контролем, кількість перисоматичних (гальмівних) синапсів. З метою кількісної оцінки цих синапсів визначали щільность поверхні – стереологічний параметр, що дозволяє вимірювати площу контакту між активними зонами та перисоматичною мембраною. Виявлено, що щільність поверхні активних зон у L1-/- мишей складала 0,0071±0,0006 мкм-1 і була приблизно на 30% нижча за рівень відповідного параметру у контрольних тварин, 0,0106±0,0005 мкм-1 (p<0,05) (Рис.4А). Додатково вимірювали довжину перетину активних зон перисоматичних синапсів, яка у L1-/- мутантів була на 12% меншою за відповідний показник контролю (p<0,05) (Рис.4Б). Через те, що розміри активної зони накладають фізичні обмеження на процес екзоцитозу СВ, можна вважати, що менші активні зони перисоматичних синапсів L1-/- мишей свідчать про їх знижену активність. З метою знайти додадкові докази змін активності цих синапсів визначали кількість СВ у пресинаптичній терміналі. Між середніми значеннями цього параметру у L1-/- мишей та L1+/+ тварин не було виявлено статистично вірогідних відмінностей (p>0,05) (Рис.4В). На відміну від цього, розмір
пулу СВ, готових до вивільнення (ПГВ), був меншим у синапсах L1-/-
мишей, ніж у контрольних тварин (р>0,05) (Рис.4Г).

Рис.4 Щільність поверхні плазматичної мембрани, вкритої активними зонами
(А), довжина перетину активних зон (Б), загальна кількість СВ (В) та
кількість везикул ПГВ (Г) у перисоматичних синапсах L1+/+ та L1-/-
мишей.

Аналіз, проведений за допомогою програми LoClust, дозволив виявити
відмінності у просторовому розподілі СВ між двома генотипами. У L1-/-
мишей ці органели мали тенденцію до знаходження на більшій відстані від
активної зони, ніж у контрольних тварин (Рис.5). На точковому графіку
можна побачити дещо інший характер розподілу значень ВАЗ для синапсів
тварин експериментальної та контрольної груп. Складається враження, що у
L1-/- мутантів загальний пул СВ зберігає свої кількісні параметри, але
змінює свої просторові характеристики. Середнє значення ВАЗ у L1-/-
тварин було на 8% більшим за відповідний показник контролю (р<0,05). у L1-/- мишей складало 48,4±0,5 нм і було вірогідно більшим за показник L1+/+ контролю, 43,1 ±0,3 нм (p<0,05). Значення DВНС у L1-/- тварин, 335,3 нм, було вдвічі більшим за значення відповідного показника L1+/+ мишей, 175,3 нм, що вказувало на більшу гетерогенність у відстанях між індивідуальними СВ у L1-/- тварин. Рис.5 Точкові графіки, що ілюструють розподіл значень ВАЗ та ВНС для везикул перисоматичних синапсів L1+/+ (А) та L1-/- (Б) мишей. Через те, що зменшення перисоматичної аферентації пірамідних нейронів зони СА1 гіпокампу могло викликати компенсаторні зміни асиметричних синапсів радіального шару, було проведено аналіз кількості останніх за допомогою стереологічного методу дайсектор. Однак, як показав аналіз, числова щільність асиметричних синапсів не мала значних відмінностей між двома генотипами (р>0,05).

Зміни у перисоматичних синапсах L1-/- мишей можуть відбуватись внаслідок
втрати інгібіторних інтернейронів. Аналіз показав, що кількість
парвальбумін-позитивних (PV+) інтернейронів у пірамідному шарі зони СА1
не відрізняється у L1-/- та контрольних тварин (p>0,05).

Стимуляція колатералей Шафера з частотою и-ритму вела до розвитку
стійкої ДП польових зПСП, записаних у пірамідному шарі зони СА1
контрольних мишей. Середнє зростання ізольованих зПСП, записаних після
такої стимуляції, складало 139±2,3% від базового рівня. Зростання
польових зПСП, викликане нететанічною стимуляцією, не виявляло
довготривалих змін. Рівні ДП у L1-/- складали 139,1±4,1% і не мали
відмінностей від значень, знайдених у L1+/+ мишей (р>0,1). Потенціація,
що миттєво слідувала за стимуляцією з частотою и-ритму, у L1-/- тварин
також була нормальною. За допомогою методу петч-клемп записів у
конфігурації „повна клітина”, що дозволяє більш жорстко контролювати
постсинаптичну деполяризацію у процесі індукції ДП, також отримали
підтвердження індукції нормальної ДП у L1-/- мишей.

Парування низькочастотної стимуляції колатералей Шафера з
постсинаптичною деполяризацією при 0 мВ викликало стійке підвищення
амплітуди зПСП, записаних через 50 хвилин після індукції ДП як у L1-/-,
так і у L1+/+ мишей. Рівні потенціації у L1-/- та L1+/+ мишей складали,
відповідно, 188,7±13% та 191±25,2% (р>0,05).

Аналіз полегшення польових зПСП після парних імпульсів показав, що цей
параметр також не має відмінностей між двома генотипами. Рівні
полегшення викликанних постсинаптичних струмів при міжімпульсному
інтервалі у 50 мс були нормальними у L1-/- мишей, 1,64±0,06, у
порівнянні з L1+/+ тваринами, 1,66±0,10. Зв’язок між інтенсивністю
стимулу та зростанням польових зПСП були подібними у L1-/- та L1+/+
мишей, що свідчило про нормальну базальну збуджуючу синаптичну передачу
у L1-/- мишей.

Так як L1 експресують не тільки пірамідні нейрони гіпокампу, а також і
інтернейрони, у L1-/- мишей досліджено гальмівні струми. Унітарні
перисоматичні гПСП записували у присутності блокаторів CNQX та АР-5 у
відповідь на мінімальну стимуляцію перисоматичних інтернейронів. З метою
встановлення мінімальної сили стимулу, який за припущенням активує
окремий пресинаптичний нейрон, було проаналізовано графіки залежності
відповіді від інтенсивності стимулу, і для аналізу було обрано лише
відповіді у межах першого чіткого плато.

Рис.6 Розподіл амплітуд (А-Б), середня амплітуда (В), депресія після дії
парних стимулів (В), вірогідність втрат (Г) та коефіцієнт варіації (Г)
унітарних перисоматичних гПСП у L1-/- та L1+/+ мишей.

Аналіз показав, що гістограми амплітуд перисоматичних гПСП, записаних у
L1-/- мишей, були зміщені у бік меншиx значень у порівнянні з контролем
(Рис.6 А, Б), що свідчило про зменшення середньої амплітуди та
збільшення кількості втрат унітарних перисоматичних гПСП. Середня
амплітуда гПСП зменшувалась з 13,0±1,5 пА у L1+/+ мишей до 6,7±1,4 пА у
L1-/- мишей (р<0,01), тоді як вірогідність втрат збільшилась з 0,06±0,02 до 0,26±0,06 (р<0,01) (Рис.6 Б, В). Дефіцит L1 у мутантів також викликав значне збільшення коефіцієнту варіації амплітуди унітарних перисоматичних гПСП, з 22,3±1,6% у L1+/+ до 40,5±6,1% у L1-/- мишей (р<0,01) (Рис.6 Г). Відношення депресії після дії парних стимулів, записаних для унітарних гПСП з міжімпульсним інтервалом у 50 мс не мало значних відмінностей у тварин двох генотипів (Рис.6 В). З метою подальшого аналізу залежної від використання модуляції гальмівних струмів, реєстрували композитні перисоматичні гПСП у відповідь на стимуляцію парними імпульсами та коротку тетанічну стимуляцію. Стимуляція парними імпульсами з міжімпульсним інтервалом у 10 та 20 мс викликала сильну депресію, до 30-60% вихідного рівня, у тварин обох генотипів. T V ’ 3/4 E i ? H J ? 1/4 u V V ’ ” A A Ae AE E E ? B ? ? H J ’ 1/4 u ?Љ?Љ?? jl $ X Z ® ° ¶ ? 3/4 A - " $ † ? YДепресія була ще більш значною, до 20%, після тетанічної стимуляції з аналогічними міжімпульсними інтервалами, можливо завдяки тому, що після 10 імпульсів у процесі екзоцитозу зникає більша частка везикул, ніж після двох імпульсів. При використанні інтервалів у 50, 100 та 200 мс депресія була слабшою, до 80% вихідного рівня, а тетанічна стимуляція вела до 50% депресії у тварин обох генотипів. гПСП, записані через 200 мс після тетанічної стимуляції, показували відновлення до рівня 50% при всіх міжімпульсних інтервалах у тварин обох генотипів. Можна зробити висновок про те, що відмінності між L1-/- та контрольними тваринами у залежній від використання модуляції синаптичної передачі були відсутні. Для того, щоб оцінити розмір кванту гПСП, вимірювали амплітуди мініатюрних гПСП у L1-/- мишей. У мутантів було виявлено нормальну середню амплітуду мініатюрних гПСП (13,8±1,4 пА) у порівнянні з L1+/+ контролем (14,0±1,6 пА). В той же час частота цих потенціалів зменшувалась з рівня 5,0±0,5 Гц у L1+/+ мишей до 1,8±0,3 Гц у L1-/- тварин. Нормальний розмір кванту та зменшена частота унітарних перисоматичних гПСП у L1-/- тварин свідчить про те, що у відповідь на потенціал дії, що надходить у пресинаптичну терміналь, у цих тварин вивільнюється, в середньому, менша кількість квантів нейромедиатора. Далі аналізували чи може дефіцит у гальмуванні, що спостерігається у L1-/- тварин, сприяти появі множинних імпульсів у зоні СА1 у відповідь на повторну стимуляцію. Вважають, що множинні імпульси свідчать про залежне від активності дегальмування збуджуючої синаптичної передачі. Повторна стимуляція терміналей Шафера з частотою 1 Гц вела до появи вторинних імпульсів у пірамідних клітинах зони СА1 як у L1+/+, так і у L1-/- мишей (Рис.7 А). Не було виявлено значних відмінностей у кількості вторинних імпульсів між двома генотипами (р>0,05), але їх площа була значно більшою у L1-/-
мишей в порівнянні з контролем (р<0,05) (Рис.7 Б). Статистично значущі відмінності між тваринами двох генотипів спостерігали на початку і в кінці стимуляції, що вказувало на те, що дефіцит гальмування у L1-/- мишей веде до аномальної імпульсної активності пірамідних клітин зони СА1. Рис.7 Приклади синаптичних струмів, викликаних стимуляцією колатералей Шафера у L1-/- та L1+/+ мишей (А). Вторинні імпульси (стрілки). Імпульсна активність в умовах тривалої стимуляції зрізів гіпокампу (Б). Таким чином можна зробити висновок про те, що дефіцит L1 веде до зменшення перисоматичної аферентації пірамідних нейронів зони СА1 гіпокампу та зменшення ефективності гальмівних перисоматичних синапсів. В гіпокампі L1-/- тварин відбувається залежне від активності дегальмування збуджуючої синаптичної передачі, яке в свою чергу веде до аномальної імпульсної активності клітин зони СА1. Аналіз впливу МКА CHL1 на структуру та функцію синапсів. Не дивлячись на зниження рівня експресії між 1 та 3 тижнями постнатального розвитку, мРНК CHL1 спостерігали у пірамідних клітинах та інтернейронах гіпокампу мишей однорічного віку. З метою аналізу аферентації тіл пірамідних нейронів зони СА1 гіпокампу вивчали покриття перисоматичної мембрани цих клітин активними зонами симетричних синапсів, а також цитоархітектоніку цих синапсів. На відміну від ситуації, що спостерігалась у L1-/- мишей, CHL1-/- мутанти мали більше, у порівнянні з контролем, перисоматичних синапсів (Рис.8 А, Б). Кількість синапсів оцінювали як частку плазматичної мембрани, що вкрита активними зонами. Значення цього параметру у молодих CHL1-/- тварин складало 6,7±0,3% і на 50% перевищувало значення відповідного показника контролю - 4,4±0,5% (р<0,05). У старих CHL1-/- тварин частка поверхні клітини, вкрита активними зонами синапсів, була на 36% більша за відповідний показник CHL1+/+ контролю (р>0,05).

Довжина перетину активних зон у молодих та старих CHL1-/- тварин
приблизно на 10% перевищувала таку у контрольних мишей (р<0,05). Кількість СВ на пресинаптичну терміналь у молодих тварин варіювала у досить широких межах. Незважаючи на те, що у CHL1-/- мишей значення цього параметру на 16% перевищувало відповідне значення контроля, ця відмінність не досягала рівня статистичної вірогідності (p>0,05).
Загальна кількість СВ у перисоматичних синапсах старих CHL1-/- мутантів
була приблизно на 20% нижча за відповідний показник контролю (p>0,05).
Аналіз розміру ПГВ показав, що у синапсах молодих CHL1-/- мишей він є на
25% більшим за такий у контролі (p<0,05). На відміну від цього, у старих тварин не спостерігалось значних відмінностей між розміром ПВГ у CHL1-/- та контрольних тварин (p>0,05).

Рис.8 Електронограми перисоматичних синапсів (стрілки) CHL1+/+ (А) та
CHL1-/- (Б) мишей однорічного віку. Масштабна лінія = 500 нм.

були відсутні (p>0,05). Навпаки, значні відмінності між двома групами
було виявлено у значеннях DВНС. Цей параметр у CHL1-/- мишей дорівнював
257,7 нм і був значно меншим за відповідний параметр CHL1+/+ контроля —
439,3 нм.

для двох генотипів практично не відрізнялись (в обох випадках,
p>0,05). Не було також значних відмінностей між двома групами і у
значеннях DВНС . Цей параметр у CHL1-/- мишей дорівнював 364,2 нм і був
трохи вищим за відповідний параметр у CHL1+/+ контроля — 307,3 нм, що
вказувало на те, що кластери везикул у CHL1-/- синапсах є більш
щільними.

Рис.9 Точкові графіки, що ілюструють розподіл значень ВАЗ та ВНС для СВ
перисоматичних синапсів CHL1+/+(А) та CHL1-/- (Б) мишей тритижневого
віку.

Перисоматичну гальмівну передачу вивчали реєструючи перисоматичні
унітарні гПСП, що виникали у відповідь на мінімальну стимуляцію
інтернейронів. Записи здійснювали у присутності антагоністів глутаматних
рецепторів, CNQX та AP-5, які використовували для блокування зПСП
(Рис.10). Перісоматичні гПСП мали коротку та стабільну латентность, що
була подібною для обох генотипів. Вона складала 1,9(0,2 мс для CHL1+/+
та 2,0(0,1 мс для CHL1-/- мишей (р>0,05). Перисоматичні гПСП у тварин
обох генотипів мали подібну форму з часом зростання 1,8(0,2 мс та
1,8(0,1 мс, відповідно у CHL1+/+ та CHL1-/- мишей (р>0,05). Такі
значення є характерними для перисоматичних гальмівних струмів та
дозволяють розрізняти їх від дендритних. На відміну від згаданих
характеристик, середня амплітуда перисоматичних гПСП була значно, на
53%, вищою у CHL1-/- мишей (138±18 пA) у порівнянні з контрольними
тваринами (90±10 пA, р<0,01) (Рис.10 В). Струми стимуляції, необхідні для того, щоб викликати перисоматичні гПСП, були подібні у тварин обох генотипів. З метою оцінки розміру кванту нейромедиатору вимірювали амплітуди мініатюрних гПСП. Розподіли амплітуд мініатюрних ПСП були подібними у CHL1+/+ та CHL1-/- мишей (р>0,05). Не спостерігалось відмінностей між
двома генотипами у середній амплітуді мініатюрних гПСП (р>0,05).
Нормальний розмір кванту та збільшена середня амплітуда унітарних
перисоматичних гПСП у CHL1-/- мишей вказує на те, що кількість квантів,
що вивільнюються з пресинаптичної терміналі гальмівного синапсу у
відповідь на потенціал дії, є збільшеною у мутантів. На відміну від
викликаних гПСП, частота мініатюрних гПСП, яка відповідає вірогідності
спонтанного вивільнення, була подібною у тварин обох генотипів (р>0,05).

Рис.10 Графіки залежності відповіді від інтенсивності стимулу (А-Б),
середня амплітуда (В), інтенсивность стимулу (В) та приклади мінімальних
перисоматичних гПСП (Г) у CHL1+/+ (А) та CHL1-/- (Б) мишей.

З метою аналізу залежної від використання модуляції перисоматичної
гальмівної передачі реєстрували перисоматичні гПСП у відповідь на
стимуляцію парними імпульсами та коротку тетанічну стимуляцію.
Стимуляція парними імпульсами з інтервалом у 10 та 20 мс викликала
сильну депресію, до 30–60%, у тварин обох генотипів. Депресія була
навіть ще сильнішою після тетанічної стимуляції з тими ж інтервалами.
При інтервалах між імпульсами, що дорівнювали 50, 100 та 200 мс,
депресія досягала приблизно 80% від базового рівня, а посттетанічна
депресія доходила до рівня 50% у тварин обох генотипів. гПСП, записані
через 200 мс після тетанічної стимуляції, демонстрували приблизно 50-60%
рівень відновлення при всіх міжімпульсних інтервалах. Можна зробити
висновок про те, що у CHL1-/- мишей відсутні значні порушення у залежній
від активності модуляції гальмівної синаптичної передачі.

Було зроблено припущення, що підвищена ГАМК-ергічна передача може
викликати послаблення ДП у CHL1-/- мишей. Aeey aeine?aeaeaiiy oe???
a?iioace noeioethaaee aeniie iae?ii?a ciie CA3 oa caienoaaee iieueia?
cINI o ?aae?aeueiiio oa?? ciie CA1 a?iieaiio. sse виявилось, між CHL1+/+
та CHL1-/- була відсутня відмінність у відношенні між амплітудою
польових зПСП та інтенсивністю стимуляції (?en.11 A). Ii??aiyiiy
полегшення i?ney ae?? ia?ieo noeioe?a з різними інтервалами між
стимулами також не виявило порушень у CHL1-/- ieoae o ii??aiyii? c
eiio?ieai (?en.11 A).

Однак, короткотривала потенціація та ДП, викликана 5 серіями стимуляції
з частотою и-ритму, були слабшими у CHL1-/- тварин. Короткотривала
потенціація складала 144(4% у CHL1-/- тварин та 183(9% у CHL1+/+ мишей
(р(0,01) (Рис.11 В). ДП дорівнювала 124(3% у CHL1-/- мутантів і була
вірогідно відмінною від відповідного значення контролю, 148(5%
(р(0,01) (Рис.11Г).

Було вивчено ДП після блокування ГАМКA-рецепторів пікротоксином.
Короткотривала потенціація та ДП, записані у присутності пікротоксину,
були подібними у мишей обох генотипів. Короткотривала потенціація
складала 203(17% у CHL1-/- та 162(11% у CHL1+/+ мишей р>0,05). ДП
складало 179(12% у CHL1-/- мутантів та 162(11% у контрольних тварин
(р>0,05). Таким чином можна зробити висновок про те, що порушення ДП у
CA3-CA1 синапсах CHL1-/- мишей відбувається завдяки підвищеній
ГАМК-ергічній передачі.

Рис.11 Залежність синаптичної відповіді від сили стимулу для польових
зПСП (А). Полегшення після стимуляції парними імпульсами (Б).
Посттетанічна (В) та довготривала потенціація (Г), викликана стимуляцією
з частотою и-ритму, у CHL1+/+ та CHL1-/- тварин.

Гальмівний вплив на тіла пірамідних нейронів СА1 зони забезпечують
головним чином два типи корзинчастих клітин, один з яких ідентифікують
за експресією парвальбуміну. Тому підраховували кількість перисоматичних
плям, імунопозитивних на парвальбумін (PV+) та VGAT — маркер
ГАМК-ергічних синапсів (VGAT+). У CHL1-/- мишей лінійна щільность PV+
VGAT+ та PV- VGAT+ перисоматичних плям перевищувала таку у контрольних
тварин, відповідно на 22% та 31%. Результати імуногістохімічного аналізу
підтверджують ультраструктурні дані та свідчать, що збільшене синаптичне
покриття у мутантів забезпечується підвищеною інервацією з боку як PV+,
так і PV- інтернейронів. Загальна кількість пірамідних нейронів у зоні
СА1 була на 13% більшою у CHL1-/- тварин у порівнянні з CHL1+/+
мишами, однак, ця відмінність не була такою значною у порівнянні з
різницею у кількості PV+ інтернейронів – 94%. Таким чином,
співвідношення PV+ та пірамідних клітин було значно вищим у CHL1-/-
тварин, вказуючи на те, що окремий пірамідний нейрон інервується більшим
за нормальне числом інтернейронів.

Можна зробити висновок про те, що дефіцит CHL1 викликає підвищення
перисоматичної аферентації пірамідних нейронів зони СА1 зони гіпокампу
та зростання ефективності гальмівних перисоматичних синапсів. У цих
синапсах CHL1-/- тварин у відповідь на потенціал дії вивільнюється
більша кількість квантів нейромедиатору. Дефіцит СНL1 викликає залежне
від ГАМКА-рецепторів послаблення коротко- та довготривалої потенціації
збуджуючої синаптичної передачі.

Аналіз впливу МКА NCAM на структуру та функцію синапсів. Аналіз
морфології головного мозку NCAM-/- мишей показав, що його структура
зберігає риси, властиві контрольним тваринам. Не було знайдено значних
змін у структурі гіпокампу. Разом з тим, у NCAM-/- мутантів було
виявлено деякі відмінності у будові асиметричних збуджуючих синапсів у
радіальному шарі зони СА1 гіпокампу. Активні зони цих синапсів були
меншими за розмірами у порівнянні з такими у контрольних мишей.

Довжина та ширина перетинів постсинаптичного ущільнення у NCAM-/- тварин
була відповідно на 10% та на 20% менше, ніж у NCAM+/+ мишей (р<0,05). Якщо апроксимувати форму ущільнення диском, то виявлені зміни відповідали зменшенню її поверхні та об’єму, відповідно, на 20% та 30%. Загальна кількість СВ на пресинаптичну терміналь у NCAM-/- мишей була на 25% меншою ніж у NCAM+/+ тварин (p<0,05), причому це зменшення відбувалось за рахунок органел пулу, що рециклює та резервного пулу. були статистично відмінними між двома генотипами (p<0,05). Комп’ютерні імітації, проведені у відповідності до 2В оцінок, показали, що NCAM-/- мутанти зберігають загальні риси розподілу везикул у пресинаптичній терміналі. Однак, можна побачити, що імітована популяція СВ у NCAM-/- синапсі (n=154) (Рис.12Б) позбавлена значної частини резервного пулу органел у порівнянні з ситуацією у синапсі контрольної тварини (n=228) (Рис.12А). Рис.12 Просторовий розподіл СВ в аксо-дендритних синапсах NCAM+/+ (А) та NCAM-/- (Б) мишей, імітований комп’ютером у відповідності до 2В параметрів реальних синапсів. Масштабна лінія =200 нм. Відомо, що NCAM накопичується в області синапсів, що формуються. Потенційну роль NCAM у сприянні накопичення спектрину в області цих структур аналізували у NCAM+/+ та NCAM-/- нейронах, що підтримували в умовах гомо- та гетерогенотипової культури протягом 4 днів та фарбували антитілами проти спектрину та МАР2. Результати показали, що у NCAM+/+ нейронах спостерігалось накопичення спектрину з характерним максимумом у центрі контакту. Накопичення спектрину у контактах з одним або обома NCAM-/- відростками, було зменшеним. Білок МАР2 в області контактів нейронів обох генотипів не накопичувався. Для того, щоб з’ясувати, чи є важливими для накопичення спектрину гомофільні взаємодії NCAM, аналізували контакти, утворені між нейронами у гетерогенотиповій культурі нейронів гіпокампу. Накопичення спектрину у таких контактах було зменшеним. Лише 32% контактів NCAM+/+ аксонів з NCAM-/- дендритами та 25,4% контактів NCAM-/- аксонів з NCAM+/+ дендритами помітно накопичували спектрин. Це свідчило про важливу роль гомофільних взаємодій між молекулами NCAM для накопичення спектрину у аксо-дендритних синапсах. На наступному етапі аналізували, чи впливає утворення кластерів NCAM на клітинній поверхні на інтеграцію інших постсинаптичних компонентів у молекулярний каркас, асоційований з NCAM. Живі культивовані нейрони інкубували з антитілами проти позаклітинного домену NCAM з метою викликати утворення кластерів білку на поверхні клітин. Ці нейрони обробляли 1% Тритоном X-100, видаляючи таким чином розчинні у детергенті молекули, але залишаючи незмінним цитоскелетний каркас. Було помічено підвищений ступінь перекривання кластерів NCAM з нерозчинними у детергенті накопиченнями спектрину, б-актиніну, PSD95, CAMKIIб та білку Shank на поверхні культивованих нейронів після дії антитіл. В той же час, утворення кластерів NCAM не впливало на розподіл тубуліну, актину та МАР2. Цікаво, що інші білки постсинаптичного каркасу, такі як PSD95 та б-актинін, локалізовані проксимально до плазматичної мембрани, а також Shank, що концентрується на цитоплазматичній поверхні постсинаптичного ущільнення, теж інтегрувались у кластери NCAM. Це свідчило про те, що NCAM не тільки впливає на утворення протеїнових кластерів, але сприяє формуванню організованої структури, що нагадує справжнє постсинаптичне ущільнення. Важливим також є те, що було виявлено перерозподіл CAMKIIб - фермента, що концентрується у постсинаптичному ущільненні. Вплив NCAM на функціональні параметри синапсів досліджували за допомогою напівкількісного аналізу рівнів NMDA- та AMPA-рецепторів у постсинаптичних ущільненнях синапсів. Аналіз результатів фарбування тонких зрізів тканини гіпокампа антитілами проти субодиниці NMDA-рецептору NR1 показав, що кількість NMDA-рецепторів у цих структурах у NCAM-/- тварин (Рис.13Б) була нижчою за відповідний показник контролю (Рис.13А). Мода розподілу кількості часточок золота на постсинаптичне ущільнення у синапсах тварин обох генотипів відповідала нульовим значенням, але у контрольних мишей вона була значно меншою (44%), ніж у NCAM-/- мутантів (63%). Рис.13 Електронограми тканини зони СА1 гіпокампу NCAM+/+ (А, В) та NCAM-/- (Б, Г) мишей, пофарбованої антитілами проти NR1 (А, Б) та GluR1 (В, Г) та гістограми розподілу активних зон за кількістю часточок колоїдного золота. Масштабна лінія = 300 нм. Аналіз імуноцитохімічного фарбування субодиниці GluR1 АМРА-рецепторів виявив, що кількість АМРА-рецепторів у двох генотипів суттєво не відрізнялась (Рис.13В,Г). Відомо, що за деякими оцінками CAMkII складає до50% загального білку у постсинаптичному ущільненні. Тому була зроблена спроба з’ясувати, чи пов’язане зменшення розміру цієї структури у NCAM-/- тварин з падінням рівню CAMkII. Фарбування антитілами проти CAMkII показало, що рівень цього білку у структурах NCAM-/- синапсів був помітно нижчим за такий у NCAM+/+ синапсах. Мода розподілу кількості часточок золота у NCAM+/+ синапсах відповідала ущільненням з однією часточкою (40%), в той час як у NCAM-/- синапсах частіше зустрічались зони, позбавлені міток (41%). Аналогічна тенденція була виявлена для білка спектрину. Мода розподілу кількості часточок золота у NCAM+/+ та NCAM-/- синапсах відповідала ущільненням, що були позбавлені міток, але у контрольних мишей вона була значно меншою (57%), ніж у NCAM-/- мишей (70%). З метою аналізу ролі спектрину у опосередкованій NCAM інтеграції білків у постсинаптичне ущільнення проводили трансфекцію нейронів гіпокампу вІ2-3-фрагментом спектрину і після цього аналізували накопичення постсинаптичних компонентів у синапсах. Для того, щоб надійно ідентифікувати трансфіковані нейрони, їх додатково трансфікували зеленим флюоресцентним білком (GFP). Після цього нейрони підтримували у культурі протягом 14 днів, а потім фарбували відповідними антитілами. Трансфекція вІ2-3-фрагментом спектрину викликала статистично вірогідне зменшення (p<0,05) накопичення NR1 у постсинаптичному сегменті. Кластери NR1 у нейронах, трансфікованих вI2-3, мали менший розмір, ніж у контролі. У цих синапсах було також виявлено зменшення накопичення білку PSD95 (p<0,05) та GluR1 (p>0,05).

Для того, щоб з‘ясувати, чи відбиває цей феномен зменшення кількості
функціональних синапсів, було проведено трансфекцію NCAM+/+ нейронів GFP
та фрагментом спектрину вI2-3 або вIN. Кількість синапсів, навантажених
фарбою FM64-4 вздовж дендритів у клітинах, трансфікованих
вІ2-3-фрагментом, виявилась на 40% меншою у порівнянні з контролем. Це
вказувало, що опосередковане NCAM накопичення спектрину та асоційованих
з ним білків є необхідним для формування синапсів.

Накопичення NR1, NR2B та PSD95 у постсинаптичному сегменті було також
зменшеним у NCAM-/- нейронах, в той час як акумуляція синаптофізину у
пресинаптичних сегментах не змінювалась (Рис.14). Аналіз виявив менший
розмір NR1 та GluR1 кластерів у постсинаптичному сегменті NCAM-/-
синапсів. Ці зміни вказують на порушення формування структур
постсинаптичного ущільнення у нейронах гіпокампу, що виникає при
дефіциті NCAM.

Було висловлено припущення, що аномальна організація постсинаптичного
ущільнення у NCAM-/- тварин може впливати на передачу сигналів,
необхідну для ДП. Дійсно, в той час як загальний рівень CAMKIIб у мозку
NCAM-/- мишей є підвищеним, вміст активної форми CAMKIIб,
аутофосфорильованої у області треоніну 286, є зменшеним, що корелює зі
зменшеними рівнями NMDA-рецепторів у постсинаптичних ущільненнях.

Активація CAMKIIб, залежна від NMDA-рецепторів, супроводжується її
переносом у постсинаптичний сегмент і регулюється кількістю ділянок,
придатних для причалювання CAMKIIб у постсинаптичному ущільненні.
CAMKIIб, аутофосфорильована по треоніну 286, у реакції
ко-імунопреципітації локалізується разом з NCAM, що свідчить про можливу
роль NCAM-асоційованого каркасу як молекулярного сигналу, що спрямовує
активовану форму CAMKIIб в область синапсу.

Рис.14 Рівні акумуляції NR1, NR2В, PSD95, GluR1 та GluR2/3 у
постсинаптичному сегменті та синаптофізину у пресинаптичному сегменті
NCAM+/+ та NCAM-/- нейронів (умовні одиниці).

З метою вивчення залежного від активності транспорта CAMKIIб у синапси
порівнювали вміст CAMKIIб у синапсах культивованих NCAM+/+ та NCAM-/-
нейронів у стані спокою та після інкубації їх з 50 мкМ глутамату разом з
5 мкМ гліцину протягом 20 с відповідно до протоколу, який викликає
залежний від NMDA-рецепторів переніс CAMKIIб до синапсів.

Нейрони було пофарбовано антитілами проти CAMKIIб та PSD95 для
ідентифікації постсинаптичних ущільнень та визначення інтенсивності
фарбування CAMKIIб у межах кластерів PSD95. У стані спокою рівні CAMKIIб
у постсинаптичному ущільненні були нижчими для NCAM-/- нейронів, у
порівнянні з контролем. Стимуляція глутаматом вела до збільшення рівня
CAMKIIб у постсинаптичних ущільненнях NCAM+/+ нейронів. Інтеграція
CAMKIIб у постсинаптичні ущільнення NCAM-/- нейронів була значно меншою.

У кільтивованих NCAM+/+ клітинах, трансфікованих siРНК вІ фрагменту
спектрину, було також загальмовано перерозподіл CAMKIIб до синапсів.
Разом ці дані свідчать про те, що NCAM-асоційований постсинаптичний
сигнальний каркас є необхідним для ефективного, залежного від активності
переносу CAMKIIб у постсинаптичне ущільнення.

Таким чином, можна зробити висновок про те, що дефіцит NCAM веде до
цілої низки змін у будові збуджуючих синапсів гіпокампу, головними з
яких є порушення постсинаптичного цитоскелетного каркасу, зменшення
рівня NMDA-рецепторів, CAMkII та спектрину у постсинаптичному ущільненні
та зменшення резервного пулу СВ. Ці зміни визначають зменшення
ефективності цих синапсів у NCAM-/- мишей.

Аналіз впливу молекули позаклітинного матриксу Tn-R на структуру та
функцію синапсів. TnR-/- миші є життєспроможними і структура їх
головного мозку та гіпокампу не має значних відмінностей від норми.
Однак, навіть на світлооптичному рівні у TnR-/- тварин можна виявити
ознаки дезорганізації пірамідного шару зони СА1.

Зменшене вивільнення ГАМК з перисоматичних терміналей в зоні СА1
гіпокампу, виявлене раніше у TnR-/- мишей, може бути наслідком дефіциту
кількості гальмівних синапсів, аномальної архітектури чи функції
індивідуальних синаптичних контактів. Для того щоб розрізнити ці
можливості, аналізували покриття тіл пірамідних нейронів активними
зонами симетричних синапсів у зоні СА1.

Підрахунок кількості активних зон персоматичних синапсів на одиницю
довжини контакту між терміналлю та перетином тіла нейрону не виявив
різниці між генотипами та віковими групами (в усіх випадках p>0,05).
Навпаки, кількість активних зон на одиницю довжини перетину тіла нейрону
була значно нижчою у TnR-/- мишей ніж у контрольних тварин. Розбіжності
варіювали у діапазоні 30-40% у різних вікових групах (р<0,05). Значення частки поверхні для активних зон симетричних синапсів також суттєво розрізнялось між контрольними та мутантними мишами (Рис.15А). Показник був приблизно на 45% нижчий у TnR-/- мишей ніж у контрольних тварин у всіх досліджених вікових групах (р<0,05). Рис.15 Частка поверхні пірамідних нейронів, вкритої активними зонами симетричних синапсів (А), та довжина перетину активних зон цих синапсів (Б) у зоні СА1 гіпокампу TnR+/+ та TnR-/- мишей 10-, 20- та 80-денного віку. Крім цього, аналізували деякі аспекти архітектури перисоматичних синапсів. Довжина перетинів активних зон у TnR-/- тварин була приблизно на 8-14% меншою за відповідний показник контролю (Рис.15Б) (p<0,05). Цікаво відмітити, що загальна кількість СВ була вищою у перисоматичних синапсах 80-денних TnR-/- мишей у порівнянні з відповідним контролем (p<0,05). Розмір ПГВ у TnR-/- мишей складав 9,2±0,7 і не мав статистично вірогідних відмінностей від контроля, 10,9±0,8 (p>0,05). Кількість СВ, що були далі
за 100 нм від активної зони синапсу, у TnR-/- мишей була на 75% вищою
ніж у контроля (p<0,05). Везикули у синапсах TnR-/- мишей демонстрували просторовий розподіл, відмінний від такого у контрольних тварин (Рис.16). Рис.16 Точкові графіки, що ілюструють розподіл значень ВАЗ та ВНС для СВ перисоматичних синапсів TnR+/+ (А) та TnR-/- (Б) мишей 80-денного віку. дорівнювало 58,6±0,2 нм у TnR-/- синапсах та 55,5±0,3 нм у синапсах контрольних тварин (p<0,05). Разом ці дані вказували на те, що у перисоматичних синапсах TnR-/- мишей більш численні СВ розташовані більш дифузно та гомогенно. Комп’ютерні імітації, проведені у відповідності до 2В оцінок, показали, що TnR-/- мутанти мають 3В розподіл везикул у пресинаптичній терміналі, відмінний від такого у контрольних тварин. Імітований розподіл органел у TnR-/- синапсі (n=503) ілюструє надмірне накопичення СВ у резервному пулі та порушення кластеру органел, що відповідає пулу, що рециклює (Рис. 17 Б), у порівнянні з ситуацією у синапсі контрольної тварини (n=230) (Рис.17 А). Також було перевірено, чи супроводжувались зміни у пірамідному шарі зони СА1 гіпокампу відповідними перебудовами синаптичного апарату радіального шару. Аналіз показав відсутність суттєвих розбіжностей між щільністю асиметричних синапсів між TnR-/- та контрольними мишами в усіх досліджених вікових групах (р>0,05). Ситуація з асиметричними синапсами,
що мали перфоровану постсинаптичну щільність, різко відрізнялась. В усіх
досліджених вікових групах було виявлено підвищення щільності таких
синапсів у TnR-/- тварин (р<0,05). Рис.17 Просторовий розподіл СВ в перисоматичних синапсах TnR+/+ (А) та TnR-/- (Б) мишей, імітований комп‘ютером у відповідності до 2В параметрів реальних синапсів. Масштабна лінія =200 нм. Разом отримані результати показують, що дефіцит молекули TnR викликає зміни зони СА1 гіпокампу, які проявляються у вигляді зменшеного покриття клітинних тіл пірамідних нейронів активними зонами симетричних синапсів, менших розмірів активних зон цих синапсів, аномальної кількості та просторового розподілу СВ в перисоматичних синапсах. В радіальному шарі зони СА1 гіпокампу TnR-/- тварин спостерігається збільшена, у порівнянні з контролем, кількість асиметричних синапсів з перфорованим постсинаптичним ущільненням. Узагальнюючи отримані результати можна зазначити, що дефіцит молекул клітинної адгезії L1, CHL1, NCAM та їх партнера по зв’язуванню – TnR веде до значних змін структури та функції синапсів гіпокампу. Так, мутації, що ведуть до втрати L1 або TnR викликають зменшення, а дефіцит CHL1 – збільшення перисоматичної аферентації пірамідних нейронів СА1 зони гіпокампу та відповідні зміни у ефективності перисоматичних синапсів. Дефіцит NCAM порушує структуру постсинаптичного цитоскелетного каркасу та викликає зменшення ефективності збуджуючих синапсів радіального шару зони СА1 гіпокампа. Отримані дані свідчать про те, що молекули адгезії є важливими чинниками підтримки нормальної структури та функції гальмівних та збуджуючих синапсів гіпокампу та відіграють важливу роль у феноменах синаптичної пластичності. ВИСНОВКИ Молекули адгезії грають важливу роль у процесах передачі інформації між поза- та внутрішньоклітинним середовищем. Участь молекул клітинної адгезії та молекул позаклітинного матриксу у системах передачі сигналів у нервовій тканині є важливим чинником адаптивних змін синаптичних контактів. 1. Молекула клітинної адгезії L1 є одним з компонентів гальмівних перисоматичних синапсів зони СА1 гіпокампу, що визначають їх структуру та функцію. Дефіцит L1 викликає зменшення кількості та розмірів активних зон цих синапсів, кількості синаптичних везикул, що готові до вивільнення, а також порушує просторову структуру кластерів везикул. Для аналізу просторового розподілу синаптичних везикул було розроблено принципово новий метод, що базується на математичному моделюванні та комп’ютерній імітації. 2. Дефіцит L1 веде до зменшення ефективності гальмівних перисоматичних синапсів. У L1-дефіцитних мишей виявлено зниження середньої амплітуди та частоти унітарних перисоматичних гПСП. Розмір кванту нейромедіатора у L1-дефіцитних тварин залишався нормальним, в той час як вірогідність спонтанного вивільнення нейромедіатора зменшувалась. 3. Дефіцит L1 не впливає на характеристики залежної від активності модуляції гальмівної та збуджуючої синаптичної передачі. В той же час, для L1-дефіцитних властиве збільшення розмірів вторинних імпульсів, які генерують пірамідні нейрони зони СА1 гіпокампу у відповідь на стимуляцію колатералей Шафера. 4. Молекула клітинної адгезії СНL1 є одним з важливих компонентів гальмівних перисоматичних синапсів зони СА1 гіпокампу, що визначають їх структуру та функцію. Дефіцит СНL1 викликає збільшення кількості та розмірів активних зон цих синапсів, та кількості синаптичних везикул, що готові до вивільнення. 5. Дефіцит СНL1 веде до збільшення ефективності гальмівних перисоматичних синапсів. Кількість квантів нейромедиатору, що вивільнюються у відповідь на потенціал дії, у перисоматичних синапсах CHL1-дефіцитних мишей є збільшеною, в той час як розмір кванту та вірогідність спонтанного вивільнення нейромедиатора відповідають нормі. 6. Дефіцит СНL1 не впливає на характеристики залежної від активності модуляції гальмівної передачі, однак викликає послаблення коротко- та довготривалої потенціації збуджуючої синаптичної передачі у зоні СА1 гіпокампу, які нормалізуються при блокаді ГАМКА-рецепторів. 7. Молекула клітинної адгезії NCAM є одним з компонентів збуджуючих аксо-дендритних синапсів зони СА1 гіпокампу, що визначають їх структуру та функцію. Дефіцит NCAM викликає зменшення розмірів активної зони, кількості NMDA-рецепторів, CAMkII та спектрину у постсинаптичному ущільненні цих синапсів, а також зменшення резервного пулу синаптичних везикул. 8. NCAM сприяє збірці та підтримці постсинаптичного протеїнового каркасу на базі спектрину і, таким чином, забезпечує досі невідомий механізм організації постсинаптичного ущільнення у збуджуючих синапсах. Зміни постсинаптичного цитоскелетного каркасу у синапсах NCAM-дефіцитних тварин блокують залежне від активності накопичення CAMkІІ, яке необхідне для довготривалих змін ефективності синапсів. 9. Молекула позаклітинного матриксу тенасцин-R є одним з компонентів позаклітинного матриксу, що визначають структуру та функцію гальмівних синапсів зони СА1 гіпокампу. Дефіцит тенасцину-R викликає зменшення кількості та розмірів активних зон гальмівних синапсів, а також аномальне накопичення синаптичних везикул резервного пулу, яке свідчить про порушення балансу між екзо- та ендоцитозом синаптичних везикул. 10. Молекули клітинної адгезії L1, CHL1, NCAM, а також молекула позаклітинного матриксу тенасцин-R є важливими чинниками підтримки нормальної структури та функції гальмівних та збуджуючих синапсів зони СА1 гіпокампу, які відіграють значну роль у механізмах синаптичної пластичності. СПИСОК СТАТЕЙ ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ 1. Никоненко А.Г. Применение имитационных вычислительных моделей в морфологическом исследовании нейроцитов гипоталамуса // Межведом. науч. сб. “Проблемы физиологии гипоталамуса”. Нац.университет им. Т.Шевченко. – К: Либідь, 1992. – Вып. 26. - С.58-62. 2. Nikonenko A.G. The Cell Sectioning Model. Nuclear/cytoplasmic ratio studied by computer simulation // Analyt.Quant.Cytol.Histol. – 1996. - Vol.18, №1. - Р.23-34. 3. Nikonenko A.G. Computer simulation as a tool in evaluating intracellular spatial arrangement of an organelle using random section data // Microsc.Res.Techn. – 1998. – Vol.42, №6. – Р.451-458. 4. Никоненко А.Г., Никоненко И.Р., Скибо Г.Г. Количественный анализ пространственного распределения синаптических везикул с помощью метода минимального остовного дерева // Доп. НАНУ. – 1999. №11, С.156-161. 5. Ніконенко О.Г., Шейченко А.В., Скибо Г.Г. Просторовий розподіл везикул у синаптичних терміналях: комп’ютерна імітація // Нейрофізіологія. – 1999. – Т.31, №4. - С.332-336. 6. Никоненко А.Г., Шейченко А.В., Никоненко И.Р., Никандрова Е.А., Скибо Г.Г. Анализ пространственного распределения везикул в пресинаптических терминалях гиппокампа in vivo и in vitro с помощью метода ближайшего соседа // Нейрофизиология. – 2000. – Т.32, №5. – С.300-304. 7. Nikonenko A.G., Nikonenko I.R., Skibo G.G. Computer simulation approach to the quantification of immunogold labelling on plasma membrane of cultured neurons // J.Neurosci.Meth. – 2000. – Vol.96, №1. - Р.11-17. 8. Nikonenko A., Schmidt S., Skibo G., Brьckner G., Schachner M. (2003) Tenascin-R–deficient mice show structural alterations of symmetric perisomatic synapses in the CA1 region of the hippocampus // J.Comp.Neurol. – 2003. – Vol.456, №4. – Р.338–349. 9. Law J.W.S., Lee A.Y.W., Sun M., Nikonenko A.G., Chung S.K., Dityatev A., Schachner M., Morellini F. Decreased anxiety, altered place learning, and increased CA1 basal excitatory synaptic transmission in mice with conditional ablation of the neural cell adhesion molecule L1 // J.Neurosci. – 2003. – Vol.23, №32. – Р.10419-10432. 10. Nikonenko A.G. Technique to study three-dimensional spatial arrangement of synaptic vesicles using data from single sections // Microsc.Res.Tech. – 2003. – Vol.62, №3. – Р.201-210. 11. Saghatelyan A.K., Nikonenko A.G., Sun M., Rolf B., Putthoff P., Kutsche M., Bartsch U., Dityatev A., Schachner M. Reduced GABAergic transmission and number of hippocampal perisomatic inhibitory synapses in juvenile mice deficient in the neural cell adhesion molecule L1 // Mol.Cell. Neurosci. – 2004. – Vol.26, №1. – Р.191-203. 12. Nikonenko A.G., Skibo G.G. Technique to quantify local clustering of synaptic vesicles using single section data // Microsc.Res.Tech. – 2004. – Vol.65, №6. – Р.287-291. 13. Ніконенко О.Г., Скібо Г.Г. Локальні особливості просторового розподілу синаптичних везикул у перисоматичних синапсах зони СА1 гіпокампу мишей // Доп. НАНУ. – 2006. №4. - С.158-162. 14. Nikonenko A.G., Sun M., Lepsveridze E., Apostolova I., Petrova I., Irintchev A., Dityatev A., Schachner M. Enhanced perisomatic inhibition and impaired long-term potentiation in the CA1 region of juvenile CHL1 deficient mice // Eur.J.Neurosci. – 2006. – Vol.23, №7. – Р.1839-1852. 15. Anderson R.B., Turner K.N., Nikonenko A.G., Hemperly J., Schachner M., Young H.M. The cell adhesion molecule L1 is required for chain migration of neural crest cells in the developing mouse gut // Gastroenterology. – 2006. – Vol.130, №4. – Р.1221-32. 16. Никоненко А.Г., Скибо Г.Г. Оценка количества синаптических везикул в асимметричных синапсах гиппокампа // Нейрофизиология. – 2006. – Т.38, №3. – С.219-223. 17. Никоненко О.Г., Скібо Г.Г. Порівняльний аналіз просторової організації пулів синаптичних везикул у симетричних та асиметричних синапсах гіпокампу // Доп.НАНУ. – 2006. - №10. - С.163-167. 18. Коваленко Т.М., Осадченко І.О., Сможаник К.Г., Ніконенко О.Г., Скибо Г.Г. Ультраструктурні основи відстроченої загибелі нейронів гіпокампу після експериментальної ішемії мозку // Вісник наукових досліджень (Тернопіль). – 2006. - №3. – С.42-44. 19. Sytnyk V., Leshchyns’ka I., Nikonenko A.G., Schachner M. NCAM promotes assembly and activity-dependent remodeling of the postsynaptic signaling complex // J.Cell Biol. – 2006. - Vol.174, №7. - P.1071-1085. 20. Ніконенко О.Г., Скибо Г.Г. Вікові зміни пулів синаптичних везикул в аксо-соматичних синапсах на пірамідних нейронах зони СА1 гіпокампа миші // Нейрофизиология. – 2006. – Т.38, №5-6. – С.407-411. ТЕЗИ ДОПОВІДЕЙ 1. Nikonenko A.G. Algorithm for computer simulation of cell cutting process // Anal.Quant. Cytol.Histol. – 1994. - V.16, №1. - P.61-62. 2. Nikonenko A.G. Histograms' interpretation algorythm for DNA ploidy analysis in tissue sections // Abstracts of 8th Int. Symp. on Diagn. Quant. Pathol., Amsterdam, 14-16 September, 1994. - P.179 3. Nikonenko A.G. Evaluation of intracellular position of an organelle on random sections with the help of computer simulation // Acta Cytologica. – 1995. - V.39, №2. - P.337. 4. Nikonenko A.G. Simulational modeling as a tool of computerized morphometry // Anal.Quant. Cytol.Histol. – 1996. - V.18, №1. - P.87. 5. Nikonenko A.G., Sheichenko A.V., Nikonenko I.R., Nikandrova Y., Skibo G.G. Spatial arrangement of synaptic vesicles in synaptic terminals of hippocampal neurons analysed with computer simulation // Abstracts of 15th British Neuroscience Association Meeting, Harrogate, 11-14 April, 1999. - P.88. 6. Ushakova G.A., Nikonenko I.R., Nikonenko A.G., Skibo G.G. Free heparin in substrates takes part in the regulation of neurite outgrowth // Abstracts of 15th British Neuroscience Association Meeting, Harrogate, 11-14 April, 1999. – Р.46. 7. Nikonenko A.G., Nikonenko I.R., Nikandrova Y.A., Skibo G.G. 3D spatial distribution of synaptic vesicles can be quantified in random sections using computer simulation // Abstracts of 5th IBRO Congress, Jerusalem, 11-15 July, 1999. - Р.166. 8. Skibo G.G., Nikonenko A.G., Nikandrova Y.A., Sheichenko A.V., Nikonenko I.R. Comparative study of vesicle spatial pattern in rat hippocampal synapses in vivo and in vitro // Abstracts of FENS Meeting, Brighton, 24-28 June, 2000. - Р.388. 9. Nikonenko A.G., Nikonenko I.R., Skibo G.G. Spatial dimensions of synaptic vesicle cycle studied in organotypic hippocampal slice culture // Abstracts of SFN Meeting, New Orleans, 4-9 November, 2005. – P. 437. 10. Bukalo O., Nikonenko O., Schachner M., Dityatev A. Mice deficient for the extracellular matrix glycoprotein tenascin-R show increased hippocampal polyspiking activity and shifted thresholds for induction of long-term potentiation and depression // Proceedings of 5th Meeting of German Neuroscience Society, Stuttgart, 2003. – P.708-709. 11. Bukalo O., Nikonenko O., Schachner M., Dityatev A. Gabaergic inhibition and metaplasticity: insights from analysis of mice deficient in the extracellular matrix glycoprotein tenascin-R // Abstracts of SFN Meeting, San Diego, 12-16 November, 2005. – P. 304. 12. Bukalo O., Nikonenko O., Schachner M., Dityatev A. Regulation of perisomatic inhibition and synaptic plasticity by the extracellular matrix glycoprotein tenascin-R // Abstracts of 5th FENS Meeting, Vienna, 8-12 July, 2006. – P.205. 13. Ніконенко О.Г. Вплив дефіциту молекул клітинної адгезії L1 та CHL1 на структуру та функцію гальмівних синапсів // Тези доповідей IV з'їзду Укр.Біофізичного Товариства, Донецьк, 19-21 грудня, 2006. – С. АНОТАЦІЯ Ніконенко О.Г. Роль молекул адгезії у механізмах синаптичної пластичності. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика. Інститут фізіології ім О.О.Богомольця НАН України, Київ, 2007. Дисертація присвячена дослідженню ролі молекул адгезії у механізмах адаптивних перебудов гальмівних та збуджуючих синапсів. В роботі запропоновані нові методи аналізу просторових феноменів, що корелюють з синаптичною функцією. Вперше показано, що дефіцит молекул клітинної адгезії L1 та СНL1 веде до значних змін структури та функції гальмівних перисоматичних синапсів та модифікації імпульсної активності пірамідних нейронів зони СА1 гіпокампу. Зменшення ефективності перисоматичних синапсів у L1-дефіцитних тварин визначається зменшенням кількості квантів нейромедиатора, який вивільнюється у відповідь на потенціал дії. Встановлено, що гальмівна перисоматична передача у CHL1-дефіцитних мишей є підвищеною, що викликає у цих тварин послаблення коротко- та довготривалої потенціації збуджуючих синапсів. Відкритий досі невідомий механізм, завдяки якому NCAM сприяє формуванню постсинаптичного протеїнового каркасу і, таким чином, визначає організацію постсинаптичного ущільнення у збуджуючих синапсах. Вперше показано, що молекула позаклітинного матриксу тенасцин-R впливає на структуру та функцію гальмівних та збуджуючих синапсів зони СА1 гіпокампу. Дефіцит тенасцину-R викликає зменшення гальмівної аферентації пірамідних нейронів зони СА1. Встановлено, що молекули адгезії є важливими чинниками формування та підтримки нормальної структури та функції синапсів, які відіграють значну роль у феноменах синаптичної пластичності. Ключові слова: гіпокамп, молекули адгезії, синаптична пластичність, синаптична функція, хімічний синапс. АННОТАЦИЯ Никоненко А.Г. Роль молекул адгезии в механизмах синаптической пластичности. – Рукопись. Диссертация на соискание научной степени доктора биологических наук по специальности 03.00.02 – биофизика. Институт физиологии им.А.А.Богомольца, Киев, 2007. Диссертация посвящена исследованию роли молекул клеточной адгезии и адгезивных молекул внеклеточного матрикса в механизмах адаптивных перестроек тормозных и возбуждающих синапсов. В работе предложены новые методы интерпретации пространственных феноменов, коррелирующих с синаптической функцией, которые основаны на идеологии математического моделирования и компьютерной имитации. Эти методы, нацеленные на анализ пространственного распределения везикул в синапсах гиппокампа и иммунопозитивных эпитопов на плазматической мембране нервных клеток, воплощены в оригинальном программном обеспечении. Изучено влияние дефицита молекулы клеточной адгезии L1 на тормозную афферентацию клеток пирамидного слоя зоны СА1 гиппокампа и ультраструктуру перисоматических синапсов. Впервые показано, что дефицит L1 приводит к значительным физиологическим и структурным аномалиям тормозных синапсов, которые модифицируют импульсную активность пирамидных нейронов в зоне СА1. У мутантов происходит уменьшение количества и размеров активных зон перисоматических синапсов, а также уменьшение размера пула везикул, готовых к выбросу нейромедиатора. Впервые выявлены уменьшение амплитуды и частоты унитарных тПСП, большая вариабельность амплитуды, а также уменьшение частоты миниатюрных тПСП у этих животных. Показано, что в ответ на потенциал действия, который приходит в пресинаптическую терминаль, у L1-дефицитных животных происходит освобождение меньшего числа квантов нейромедиатора. Впервые установлено, что молекула клеточной адгезии СНL1 является важным компонентом тормозных синапсов, который в значительной степени определяет их структуру и функцию. Ее дефицит вызывает увеличение количества и размеров активных зон тормозных синапсов на телах пирамидных нейронов в зоне СА1 гиппокампа. Пространственное распределение СВ свидетельствует о повышенной активности перисоматических синапсов, что подтверждается большей амплитудой унитарных тормозных постсинаптических потенциалов. Для СНL1-дефицитных животных свойственно уменьшение долговременной потенциации в СА3-СА1 синапсах. В работе изучен эффект дефицита молекулы клеточной адгезии NCAM на структуру возбуждающих синапсов радиального слоя зоны СА1 гиппокампа, а также на постсинаптический цитоскелетный каркас и рецепторный аппарат постсинаптических плотностей асимметричных синапсов. Показано, що дефицит NCAM приводит к уменьшению размеров активной зоны, уровней NMDA- рецепторов, CAMkII и спектрина в постсинаптической плотности, а также резервного пула синаптических везикул. Открыт неизвестный ранее механизм формирования постсинаптического цитоскелета при участии, NCAM, который определяет структуру постсинаптической плотности. Исследовано влияние дефицита молекулы внеклеточного матрикса тенасцина-R на структуру пирамидного слоя зоны СА1 гиппокампа, афферентацию пирамидных нейронов и ультраструктуру перисоматических синапсов. Выявлено, что дефицит тенасцина R вызывает уменьшение активных зон симметричных синапсов, а также аномальное накопление синаптических везикул в резервном пуле. Установлено, что молекулы адгезии являются важным фактором формирования и поддержки нормальной структуры и функции тормозных и возбуждающих синапсов. Сделан вывод о том, что молекулы клеточной адгезии и адгезивные молекулы внеклеточного матрикса нервной ткани играют значительную роль в механизмах синаптической пластичности. Ключевые слова: гиппокамп, молекулы адгезии, синаптическая пластичность, синаптическая функция, химический синапс. ANNOTATION Nikonenko A.G. Role of adhesion molecules in the mechanisms of synaptic plasticity. – Manuscript. Thesis for a degree of Doctor of Biological Sciences in specialty 03.00.02 – Biophysics. – Bogomoletz Institute of Physiology, Kiev, 2007. The thesis focuses on the issue of cell adhesion playing the role in synaptic plasticity. Within the frame of this study, new methods were developed to analyze vesicles’ spatial patterns in hippocampal synapses, as well as distribution of immunopositive epitopes on plasma membrane. The effect of cell adhesion molecule L1 deficiency on inhibitory input to hippocampal CA1 pyramidal cells was analyzed. It was revealed that L1 deficiency leads to major physiologic and ultrastructural abnormalities of inhibitory synapses modifying spіking patterns of hippocampal CA1 pyramidal cells. Fewer and smaller active zones of inhibitory synapses, reduced readily releasable pool (RRP) size and unitary iPSPs amplitude were observed. Higher amplitude variability, larger number of release failures as well as the decrease in frequency but not in the amplitude of miniature iPSPs were also typical of L1-/-animals. It was shown that CHL1 deficiency induces changes both in the size and number of active zones of symmetric synapses formed on hippocampal CA1 pyramidal cell bodies. Spatial distribution of vesicles and larger RRP size indicating the increased activity of perisomatic synapses were confirmed by the increase in unitary iPSP amplitude. Decrease in LTP of CA3-CA1 synapses was typical of СНL1-/- animals. The effect of NCAM deficiency on the structure of asymmetric synapses in hippocampal CA1 stratum radiatum as well as on postsynaptic cytoskeletal scaffold and receptors was studied. It was shown that NCAM deficiency leads to the decrease in active zone size, levels of NMDA-receptors, CAMkII and spectrin in postsynaptic density, as well as in reserve vesicle pool size. The effect of deficiency in extracellular matrix protein - tenascin-R -on the inhibitory afferentation of CA1 pyramidal cells and structure of perisomatic synapses was investigated. It was revealed that tenascin-R deficiency results in the decrease of coverage of pyramidal cell bodies by active zones. It was concluded that cell adhesion molecules and extracellular matrix molecules present an important link between extra- and intracellular media, and property of these molecules to react to extracellular environment changes is indispensable factor of synaptic plasticity. Keywords: cell adhesion, chemical synapse, hippocampus, synaptic function, synaptic plasticity. PAGE 1

Похожие записи