ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН

СТОЛЯР ОКСАНА БОРИСІВНА

УДК 577.352.38:577.64

Роль металотіонеїнів в детоксикації йонів міді, цинку, марганцю та
свинцю в організмі прісноводних риб і молюсків

03.00.04 – біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Львів – 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі хімії Тернопільського державного
педагогічного університету ім. Володимира Гнатюка Міністерства освіти і
науки України

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор

ГРУБІНКО Василь Васильович,

Тернопільський державний педагогічний

університет імені Володимира Гнатюка,

завідувач кафедри загальної біології,

проректор з навчальної роботи

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Сологуб Леонід Ілліч,

Інститут біології тварин УААН,

завідувач лабораторії обміну речовин

доктор біологічних наук, професор Цудзевич Борис
Олександрович,

Київський національний університет імені

Тараса Шевченка, професор кафедри біохімії

доктор біологічних наук, професор

Арсан Орест Михайлович,

Інститут гідробіології НАН України,

завідувач відділу екотоксикології

Провідна установа: Чернівецький національний університет імені Ю.
Федьковича Міністерства освіти і науки України, кафедра біохімії, м.
Чернівці

Захист відбудеться 24.02.2004 р. о 10 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01 Інституту біології тварин УААН
за адресою: 79034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин
УААН за адресою 79034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38.

Автореферат розісланий 22.01.2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Віщур О.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Сполуки важких металів є пріоритетними забруднювачами
прісних водойм України (Линник П.Н., 1999). Оцінка небезпеки цього
забруднення для гідробіонтів має здійснюватись на основі біоіндикації,
позаяк застосування гідрохімічних показників ускладнюється
багатофакторною детермінацією біодоступності металів (Саванина Я.В. и
др., 2001; Брагинский Л.П., Линник П.Н., 2003). Тому актуальним є
з’ясування специфічних механізмів детоксикації для йонів важких металів
різної природи. Серед ймовірних молекулярних мішеней зв’язування цих
йонів у клітинах у першу чергу розглядають спеціалізовані тіолові
сполуки металотіонеїни (МТ) та глутатіон (ГSH) (Кулинский В.И.,
Колесниченко Л.С., 1990; Kagi J.H.R., Shaffer A., 1988). За останнє
десятиліття показано, що вони функціонують узгоджено як форми запасання
та транспорту цинку і міді (Brouwer M., Brouwer-Hoexum T., 1992; Maret
W. et al., 1999; Ciriolo M.R. et al., 2001), детоксикації кадмію
(Klaassen C.D. et al., 1999). Показано селективність ?- і ?-доменів
металотіонеїнів до цих металів (Good M. et al., 1991), видову, тканино-
та металоспецифічну індукцію їх ізоформ за високого ступеню
консервативності первинної структури (M?nger К. et al, 1985; Moilanen
L.H. et al., 1999; Dallinger R. et al., 1997; Lemoine S. et al., 2000).

Разом з цим, методологічні підходи до використання інформації про
металотіонеїни гідробіонтів для оцінки стану забруднення середовища ще
не сформовані. Показано, що індукція синтезу металотіонеїнів є
відповіддю на дію чисельних екстремальних чинників (Хлоповская Е.И. и
др., 1997; Nishimura N. et al., 2001), причому найефективнішим і
найкраще вивченим їх індуктором серед металів у тварин є кадмій (ІІ),
тоді як забруднення цинком мало змінює їх експресію (Viarengo А. et al.,
1999). Щодо дії інших металів існують окремі несистематизовані відомості
(Fisher E.H., Davie E.W., 1998; Palmiter R.D., 1998). Порівняльна
ефективність зв’язування йонів металів з тіолами вивчена переважно в
системах in vitro (Maracine M., Segner H., 1998, Коновалов Ю.Д., 2000).
На рівні організмів відомо, що металотіонеїни до певної межі зв’язують
майже весь кадмій тканини, акумулюють ртуть (Olsvik P.A. et al., 2000;
Das K. et al., 2002) та мідь (Berntssena M.H.G. et al., 1999; Handya
R.D. et al., 1999). Функціональні взаємозв’язки між пулами
металотіонеїнів i ГSH за інтоксикації йонами важких металів, а також
конкуренція фізіологічних металів та металу-токсиканту за зв’язування
мало вивчені (Fowler B.A., Gould E., 1988; Lange A. et al., 2002).
Переважна більшість досліджень проведена на прикладі морських риб і
безхребетних, причому за умов гострої токсичності (Viarengo A. et al.,
1999; Conners D.E., Ringwood A.H., 2000), тоді як про стан
металотіонеїнів прісноводних тварин за умов екологічно реального
забруднення води немає чітких уявлень (Correlia A.D. et al., 2001;
Laporte J.M. et al., 2002). У зв’язку з цим, дослідження участі
металотіонеїнів та інших тіолових сполук прісноводних тварин у
зв’язуванні важких металів за підвищеного вмісту їх йонів у водному
середовищі є актуальною проблемою.

Іншим аспектом, пов’язаним із вивченням зв’язування важких металів з
металотіонеїнами гідробіонтів, є виявлення меж ефективності цього шляху
детоксикації. Тому представляє інтерес ідентифікувати відповідність між
ступенем зв’язування металу в тканині з металотіонеїнами та
дозо-залежними стадіями відповіді організму на його дію (Божков А.И.,
1997). Стан антиоксидантно-прооксидантної системи (АПС), як відомо,
чутливо відображає ці стадії (Котеров А.Н., Никольский А.В., 1999).

Для дослідження нами були обрані йони металів, що належать до
пріоритетних забруднювачів прісних водойм – цинк (ІІ), мідь (ІІ) і
свинець (ІІ), а також марганець (ІІ), який вважають відносно нетоксичним
металом (Barceloux D.G., 1999), але його здатність легко змінювати
ступінь окиснення і широкий спектр коливань вмісту у прісних водоймах
(Линник П.Н., 1999) викликають інтерес до вивчення його дії на
гідробіонтів. Концентраційно залежні дослідження їх впливу на
металотіонеїни прісноводних тварин не проводились. Інформація про
зв’язування марганцю і свинцю з металотіонеїнами відсутня, проте
встановлено, що їх токсичність для ссавців пов’язана зі специфічним
впливом на тіоли (Liccione J.J., Maines M.D., 1988; Rajanna B. et al.,
1991; Sandhir R. et al., 1994).

Для виявлення універсальних та видових характеристик тіолових сполук
організму за дії йонів важких металів становило інтерес розглянути їх
вплив на представників, що належать до одного біотопу, але різних за
екологічними вимогами. Значення обраних для дослідження видів
визначається тим, що короп є промисловою рибою (Воробьев В.И., 1979), а
беззубка лебедина — одним з найпоширеніших на території України видів
прісноводних двостулкових молюсків, які можуть ефективно концентрувати
метали – забруднювачі (Стадниченко А.И., 1984).

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота
виконувалась у межах держбюджетних тем кафедр хімії та загальної
біології Тернопільського державного педагогічного університету імені
Володимира Гнатюка “Молекулярні механізми впливу важких металів на
організм прісноводних риб» № держреєстрації 0196UO12314 (1996-1997 рр.),
в якій автор досліджував вміст тіолів у печінці коропа; “Дослідження
метаболічної ролі амінокислот в адаптаційно-компенсаторних процесах в
організмі тварин при екологічних стресах” № держреєстрації 0199UO02522
(1999-2000 рр.), в якій автор досліджував властивості металотіонеїнів і
вміст тіолів у печінці коропа; “Токсикоспецифічні адаптації гідробіонтів
та водних екосистем до іонів важких металів та їх регуляція” №
держреєстрації 0101UO00303 (2001-2003 рр.), в якій автор досліджував
властивості металотіонеїнів, вміст тіолів та активність ферментів
антиоксидантного захисту в печінці коропа.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було з’ясувати механізми
участі металотіонеїнів прісноводних риб і молюсків у детоксикації йонів
важких металів водного середовища (мідь (ІІ), цинк (ІІ), марганець (ІІ),
свинець (ІІ)) за умов забруднення води їх сполуками.

Завдання:

Виділити металотіонеїни з тканин коропа і беззубки та вивчити їх склад і
фізико-хімічні властивості.

З’ясувати дозо-часові та метало-специфічні ефекти впливу йонів міді,
цинку, марганцю і свинцю та їх суміші на фізико-хімічні властивості
металотіонеїнів коропа і беззубки.

Дослідити вплив йонів міді, цинку, марганцю та свинцю на їх зв’язування
з металотіонеїнами та іншими термостабільними компонентами метаболічно
активних тканин коропа і беззубки залежно від концентрації йонів, їх
природи та часу дії.

На підставі визначення показників антиоксидантно-прооксидантного стану в
експериментальних умовах встановити ступінь ураження організму за дії на
нього йонів металів та схарактеризувати металзалежну специфіку
токсичності.

З’ясувати місце металотіонеїнів та інших тіолових сполук риб і молюсків
у детермінації адаптивної відповіді організму на дію йонів міді, цинку,
марганцю і свинцю відповідно до умов цієї дії.

Здійснити порівняльний аналіз властивостей металотіонеїнів коропа та
беззубки.

Розробити тести для оцінки ступеня ураження прісноводних тварин йонами
міді, цинку, марганцю та свинцю.

Об’єкт дослідження – процеси детоксикації йонів важких металів в
організмі прісноводних тварин.

Предмет дослідження- механізми участі металотіонеїнів коропа та беззубки
в детоксикації йонів міді, цинку, марганцю та свинцю водного середовища.

Методи дослідження – розподільча та йонообмінна хроматографія,
електрофорез, спектрофотометрія, метод радіоактивних ізотопів,
статистичні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Проведено системне дослідження
детоксикаційної функції металотіонеїнів коропа і беззубки за впливу на
організм йонів важких металів (міді, цинку, марганцю і свинцю).
Встановлено видові особливості вмісту металів та ізоформного складу
металотіонеїнів. Вперше диференційовано три типи відповіді
металотіонеїнів гідробіонтів на підвищення вмісту йонів металу в
середовищі: акумуляція надлишку металу в металотіонеїнах, посилення
олігомеризації металотіонеїнів, поєднане із акумуляцією надлишку металу,
пригнічення їх металзв’язуючої функції.

Одержано нові дані про високу ефективність металотіонеїнів беззубки
порівняно з цими білками коропа щодо зв’язування надлишку йонів міді.
Встановлено залежність між здатністю металотіонеїнів акумулювати
надлишок міді в тканинах і активністю антиоксидантного захисту.
Виявлено, що акумуляція надлишку цинку металотіонеїнами за абсолютними
показниками також ефективніша у беззубки, ніж у коропа, однак за
відносним внеском у зв’язування цього металу у тканині менш істотна.

Уперше досліджено дію марганцю (ІІ) на металотіонеїни прісноводних
тварин і виявлено здатність металотіонеїнів коропа, на відміну від
металотіонеїнів беззубки, зв’язувати надлишок марганцю за широкого
діапазону його концентрацій у воді узгоджено із значною активацією
антиоксидантних факторів організму. Надлишок свинцю в тканинах не
акумулюється металотіонеїнами і викликає найзначніші ознаки токсичності.

Виявлено, що за дії суміші йонів цинку, міді, марганцю і свинцю
металотіонеїни коропа і беззубки зв’язують переважно той тип йонів, який
найбільш ефективно акумулюється ними за умов окремої дії.

Уперше показано активацію металотіонеїнів та системи антиоксидантного
захисту прісноводних тварин за дії непошкоджуючих концентрацій йонів
міді та марганцю на організм. Запропоновано інтегральний показник оцінки
концентраційно залежної та видоспецифічної відповіді
антиоксидантно-прооксидантного стану, що враховує стан різних чинників
системи. Розроблено рекомендації визначення концентраційно залежної та
металоспецифічної відповіді організму на дію металів шляхом використання
спектральних характеристик металотіонеїнів.

Практичне значення одержаних результатів. Запропоновано оптимальний
методологічний підхід для аналізу і прогнозу токсичності йонів важких
металів для прісноводних тварин. На підставі одержаних результатів
розроблено рекомендації, що запроваджено при тестуванні якості води у
природних водоймах Тернопільської області. Одержані результати і
теоретичні узагальнення використовуються у викладанні курсів
“Молекулярна і біологічна хімія”, “Хімія і біохімія”, “Молекулярні
основи процесів життєдіяльності” в підготовці студентів та магістрів
спеціальностей “хімія, біологія, екологія і географія” в Тернопільському
державному педагогічному університеті імені Володимира Гнатюка.

Особистий внесок здобувача полягає у визначенні ідеї та розробки
стратегії наукового експерименту, одержанні експериментальних даних, їх
аналізі та оформленні, а також підборі і опрацюванні літературних даних.
Електрофорез фракцій термостабільних білків здійснювався у відділі
сигнальних механізмів клітини Інституту біології клітини НАН України, м.
Львів. Амінокислотний аналіз металотіонеїнів виконаний у лабораторії
“Якості та безпеки сільськогосподарської продукції” Національного
аграрного університету, м. Київ. Експерименти з радіоактивною міткою
проводились за допомогою співробітників Інституту біології тварин УААН,
м. Львів. Окремі експериментальні роботи виконувались за участю
співавторів публікацій, які були співвиконавцями науково-дослідних тем.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи доповідались на
наукових з’їздах: VII, VIII Українських біохімічних з’їздах (Київ, 1997;
Чернівці, 2002); П та ІІІ з’їздах гідроекологічного товариства України
(Київ, 1997, Тернопіль, 2001); конференціях: VП науковій конференції з
экологічної фізіології і біохімії риб, Петрозаводськ, 1992; ІХ
Всеросійській конференції “Экологическая физиология и биохимия рыб”,
Ярославль, 2000; І Всеукраїнській науковій конференції “Екологічний
стрес і адаптація в біологічних системах”, Тернопіль, 1998;
Всеукраїнській науковій конференції “Екологічна наука і освіта в
педагогічних вузах України”, Умань, 2000, І Всеукраїнській конференції
“Проблеми іхтіопатології”, Київ, 2001; Міжнародній конференції з
фізіології і біохімії тварин, присвяченій 100-річчю від дня народження
професора С. З. Гжицького, Львів, 2000; Міжнародній науково-практичній
конференції “Біологічні основи підвищення продуктивності тварин”,
присвяченій 40-річчю створення Інституту біології тварин УААН, Львів,
2002; ІІ Львівсько-Люблінській конференції з експериментальної та
клінічної біохімії, Люблін, 2002; 4-й Парнасівській конференції
“Молекулярні механізми активації клітин (4th Parnas conference:
Molecular mechanisms of cell activation: Biological signals and their
target enzymes)”, Вроцлав, 2002; Всеросійській конференції з іноземною
участю “Водна токсикологія”, Борок, 2002, щорічних звітних наукових
конференціях викладачів хіміко-біологічного (природничого) факультету
Тернопільського державного педагогічного університету імені Володимира
Гнатюка, Тернопіль, 1992 – 2002 р.р.; симпозіумах: “Metals and Genes
Symposium”, Кентербері, 1997, 2001; ІІ Міжнародному Смакуловому
симпозіумі “Фундаментальні і прикладні проблеми сучасної фізики”,
Тернопіль, 2000, 41-му конґресі Європейських товариств токсикології
“Eurotox 2003”, Флоренція, 2003.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 49 праць, у тому
числі 32 – статті в наукових журналах (з них – 12 одноосібних), 1 стаття
в збірнику наукових праць, 1 навчальний посібник, 16 – матеріали і тези
доповідей на з’їздах, симпозіумах і конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 288 сторінках
комп’ютерного набору, складається зі вступу, огляду літератури, опису
матеріалів і методів досліджень, 6 розділів, присвячених викладу
отриманих результатів, їх аналізу та узагальнення, висновків, списку
використаної літератури, 8 додатків. Робота містить 96 рисунків, 97
таблиць. Бібліографічний список складає 511 джерел, з них 372 латиною.
Загальний обсяг ілюстрацій і таблиць – 70 сторінок, списку використаних
джерел – 56 сторінок.

Основний зміст

Огляд літератури. Проаналізовано сучасну інформацію про особливості
зв’язування йонів міді, цинку, марганцю та свинцю з тіоловими сполуками
в живих організмах та їх біологічну дію. Наведено інформацію про
структуру, властивості, функцію МТ та ГSH та зміни їх вмісту за дії
йонів важких металів у тварин, у тому числі і водяних. У результаті
аналізу встановлено, що наявна інформація недостатня для визначення
участі МТ прісноводних тварин у детоксикації цих йонів. Очевидною є
необхідність формування методологічних підходів до використання МТ
прісноводних тварин у біомоніторингу забруднення водного середовища та
порівняння чутливості цих потенційних біомаркерів токсичності з іншими,
апробованими.

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проводились на дворічках
коропа лускатого (Cyprinus carpio L.) масою 200 – 250 г (430
екземплярів) та двостулковому молюску беззубці лебединій (Anodonta
cygnea L.) з діаметром мушлі близько 10 см і масою 8 – 12 г (90
екземплярів). Тварин адаптували до лабораторних умов протягом 7 діб.
Молюски, в яких досліджували стан показників у природних умовах, після
відбору зі ставу утримувались у відстояній воді не більше доби.
Дослідних риб виловлювали траловим методом із ставків Тернопільського
обласного рибкомбінату (урочище Залісці). Молюсків збирали в травні та
вересні на мілководній ділянці Тернопільського ставу на глибині близько
50 см.

Експериментальні дослідження проводили в басейнах об’ємом 200 л з
кількістю риб з розрахунку 1 особина на 40 л води. Вміст кисню у воді
підтримували на рівні 7,0 – 8,0 мг/л, вуглекислого газу – 2,2 – 2,8
мг/л, рН — 7,6 – 8,0. Воду відстоювали і змінювали щодві доби.
Температура води коливалась в межах 100С — 180С залежно від сезону.
Тварин не годували.

У кожному лабораторному досліді одна група була контрольною, іншій
(іншим) у воду вносили солі металів. Вміст у воді Cu2+ (CuSO4) складав
0,01; 0,1, 0,2, 0,5 або 1,0 мг/л; Zn2+ (ZnSO4) — 0,1; 2,0 або 5,0 мг/л;
Mn2+ (MnCl2) – 0,13; 2,6 або 6,0 мг/л; Pb2+ (Pb(NO3)2) — 0,01; 0,2 або
0,5 мг/л в розрахунку на катіон. При дослідженні дії суміші вказаних
йонів вміст Zn2+ складав 0,1 мг/л, Cu2+ – 0,01 мг/л, Mn2+ – 0,13 мг/л,
Pb2+ — 0,01 мг/л. Для зручності у порівнянні трьох досліджуваних
концентрацій ми позначали їх як малу концентрацію (МК), середню
концентрацію (СК) і велику концентрацію (ВК). Відповідний вміст аніонів
у воді був на один або два порядки нижчим, ніж їх дозволений вміст у
рибогосподарських водоймах (Воробьев В.И., 1979) та вміст у акваріумах.

Тривалість дослідів з рибами становила для йонів міді 2, 7 і 14 діб,
свинцю – 7 і 14 діб, цинку, марганцю та суміші йонів – 14 діб, з
молюсками – 14 діб. Власні дослідження та літературні дані (Хлебович
В.В., 1981; Романенко В.Д. и др., 1991) свідчать, що цей термін є
достатнім для аклімації водяних тварин до дії екстремальних чинників.
Для аналізу використовували у коропа передню долю печінки, ентероцити,
зяброві дуги і плазму гепаринизованої крові, взятої із серця; в молюска
– травну залозу, зябра та мантію. Всі процедури з виділення й обробки
зразків проводились на холоді. Всі реактиви, крім нижче зазначених, були
фірми “Реахим” кваліфікації “хч”.

Розчин термостабільних сполук одержували з 10%-ного гомогенату тканини в
10 мМ трис-HCl буфері, рН 8,0 шляхом його центрифугування протягом 45
хв. за 10 000 g. Отриманий надосад інкубували 5 хв за 850С і знову
центрифугували в тих самих умовах. Надосад використовували для
дослідження. Термостабільні білки (ТБ) розділяли на фракції за допомогою
гель-проникаючої хроматографії на сефадексі G-75 (“Pharmacia”) в 10 мМ
трис-HCl буфері, рН 8,0. МТ ідентифікували за спектральними ознаками
(Olsson P.E. et al, 1989). Для одержання апотіонеїну фракцію МТ
інкубували в розчині EДTA з кінцевою концентрацією 100 мМ протягом 48
год за температури 40С (Мелконян В.З. и др., 1984). Фракції ТБ
досліджували за допомогою йонообмінної хроматографії на ДЕАЕ-целюлозі в
10 мМ трис-HCl буфері, рН 8,0 (Gruber C. et al., 2000), електрофорезу в
поліакриламідному гелі (ПААГ) за методом U.K. Laemmly (1970). Визначали
амінокислотний склад фракції МТ на амінокислотному аналізаторі ААА Т
339М. Для проведення електрофорезу та амінокислотного аналізу білки
піддавали ліофільній сушці протягом 28 год. за 38-390С і 0,1 атм.

Вміст тіолів (загальних печінки і небілкових тіолів тканин та в елюаті,
одержаному при хроматографії ТБ) вимірювали за допомогою реактиву
Еллмана (5,5–дитіобіс–2–нітробензойної кислоти) (Sedlak J., Lindsay
R.H., 1968). Для визначення вмісту SH-груп у фракції МТ розчин білку
витримували у 8 М розчині сечовини в присутності NaBH4 та ЕДТА
(Торчинский Ю.М., 1977). Вміст білків (загальних, термостабільних,
розчинних в 0,6 М KCl та в елюаті при хроматографії) визначали методом
O.H. Lowry et al. (1951), використовуючи як стандарт сироватковий
альбумін (“Sigma”). Для визначення включення рівномірно міченого гліцину
в розчині ТБ та небілковому розчині печінки коропа за 3 год до аналізу
зразків тканин рибам вводили внутрішньочеревно субстрат в розрахунку 1
Мбк на 100 г живої маси. Радіоактивність зразків вимірювали на рідинному
сцинтиляційному лічильнику (LKB, Швеція).

У тканинах тварин визначали загальну активність супероксиддисмутази
(СОД) [КФ 1.15.1.1] (Чевари С. и др., 1991), в низці дослідів —
активність Mn-СОД (Floreany М. et al., 2002), активність каталази [КФ
1.11.1.6] (Королюк М.А. и др.,1988). Оцінювали інтенсивність
пероксидації ліпідів (ПОЛ) за вмістом ТБК-активних продуктів у реакції з
2-тіобарбітуровою кислотою (ТБК) (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977),
або їх утворенням за активації ПОЛ (Тимирбулатов Р.А., Селезнев Е.Н.,
1981) та окиснювальну модифікацію білків (ОМБ) (Мещишен І.Ф., 1998).

Склад середньомолекулярних пептидів плазми крові (СМП) коропа вивчали
шляхом їх гель-хроматографії на сефадексі G-25 в 0,02 М розчині СН3СООН
(Туряница И.М. и др., 1991). Калібровку колонок при розподільчій
гель-хроматографії здійснювали за допомогою сироваткового альбуміну
(67,0 кДа), цитохрому с (12,3 кДа) та інсуліну (5,8 кДа) (всі маркери
фірми “Sigma”, США), вітаміну В12 (1,35 кДа, “Pharmacia”), ГSH (0,303
кДа, “Fluka”).

Вміст металів у тканині, розчині ТБ та їх об’єднаних фракціях вимірювали
після спалювання зразків у перегнаній нітратній кислоті в співвідношенні
1:5 (маса:об’єм) на атомно-абсорбційному спектрофотометрі С-115 (цинку,
міді, марганцю і заліза) або на спектрофотометрі S-600 (свинцю) і
виражали в мкг/г сирої маси тканини.

Вміст МТ у тканині обчислювали за формулою m(MT)=(2?(Zn)+?(Cu))·M(MT)/14
(?кг/г тканини), де ? – кількість металу у фракції, мкмоль/г тканини;
М(МТ) молярна маса МТ (6800 г/моль) (Kagi J.H.R., Shaffer A., 1988), 14
– кількість одновалентних йонів, зв’язаних з молекулою МТ, виходячи з
того, що в (-кластері при гетерометалевому складі зв’язується чотири
двовалентних йони, а в (-кластері – три двовалентних, або шість
одновалентних (Good M. et al., 1991). Введена нами модифікація у формулу
(Das K. et al., 2002) пов’язана із врахуванням одновалентного стану міді
в МТ.

За результатами визначення показників АПС тканин обчислювали коефіцієнт
їх антиоксидантного стану (КАС) як відношення сум показників стану
антиоксидантних (А) і прооксидантних (П) факторів: КАС = ?А/?П. Кожний
показник визначали за формулою: 1±(Мд–Мк)/Мк, де 1 – характеристика
показника в нормі, Мд і Мк – середньоарифметичні значення показників
відповідно дослідної і контрольної серій. До “А” відносили такі
показники як активність СОД, каталази, вміст небілкових тіолів у
тканині, до “П” – вміст ТБК-активних продуктів та ОМБ. За такої
кількості даних у контролі КАС становить 1,5. Проводили кореляційний
аналіз (Дёрффель К., 1994) взаємозалежності диференційних УФ-спектрів
ТБ, для одержання яких показники подавали у вигляді (Dd-Dk)/Dk, де Dd –
оптичне поглинання дослідного зразку, а Dk – контольного зразку за
однакової довжини хвилі.

Результати визначення показників фракцій ТБ та СМП плазми крові подані
як усереднені значення двох-трьох вимірів на об’єднаних з 4-5 тварин
зразках матеріалу (Olsson P.E. et al, 1989, Das K. et al., 2002). Інші
результати подавали у вигляді M(m, n=5-6. Вірогідність відхилення двох
рядів значень обчислювали з використання t-тесту Стьюдента.

Результати досліджень та їх обговорення

Термостабільні білки коропа та беззубки. Склад та властивості. На ТБ
припадає близько 3 % від загального вмісту білків у печінці коропа і
біля 12 % у тканинах беззубки, причому їх вміст є досить консервативним
показником за умов експерименту (табл. 1, 2).

При розподільчій хроматографії ТБ зі всіх досліджуваних тканин
одержується дві головні фракції (І і ІІІ) з М близько 67 і 6 кДа (рис.
1). За спектральними ознаками високомолекулярна (І) фракція ТБ
представлена типовим білками, які мають максимум поглинання близько 280
нм. Білки низькомолекулярної (ІІІ) фракції характеризуються специфічними
для МТ спектральними ознаками: смугою вбирання з максимумом близько 254
нм, що втрачається у апоформи, і відсутністю максимума поглинання
близько 280 нм (рис. 2). За показниками УФ-спектру, специфічними для МТ
(Мелконян В.З. и др., 1984; Ang S.G., Wong V.W., 1992; Das K. et al.,
2002), відзначені спільні ознаки білків ІІІ фракції, які відрізняють її
від І фракції (табл. 3).

Таблиця 1

Вміст термостабільних білків у печінці коропа за дії на організм йонів
міді, цинку, марганцю та свинцю протягом 14 діб, мг/г тканини, M(m, n=5

Відносна концентрація йонів у воді

Мідь (ІІ)

Цинк (ІІ)

Марганець (ІІ)

Свинець (ІІ)

Контроль 4,13(0,41 2,36(0,28 2,36(0,28 2,36(0,28

Мала 5,10(0,36* 2,98(0,13 2,62(0,07 2,64(0,22

Контроль 3,77±0,10 3,77±0,10 3,31±0,30 3,31±0,30

Середня 3,40±0,11* 3,19±0,18* 3,75±0,40 5,34±0,56*

Контроль 4,38±0,25 2,50(0,27 2,50(0,27 2,50(0,27

Велика 3,67±0,28? 2,08(0,15 1,84(0,20 2,45(0,32

Примітки: 1. — * — тут і далі відмінність порівняно з контролем
вірогідна, p<0,05, 2. - ?/?- вірогідне зменшення/збільшення питомого вмісту компоненту в тканині У розчині ТБ печінки коропа знаходиться близько 80% міді, 30% цинку, 40% марганцю і 6% свинцю від їх загального вмісту в тканині, тоді як у розчині ТБ тканин беззубки - близько 40% міді, 10 % цинку і 0,1 % марганцю від їх загального вмісту в тканині, а свинець не виявлений. За співвідношенням вмісту цинку і міді спостерігається значна відмінність між ТБ коропа та беззубки. У коропа, особливо в печінці, в складі фракцій значно переважає цинк, а у беззубки їх вміст має однаковий порядок. Так, вміст цинку в ІІІ фракції ТБ печінки коропа становить у контролі 386(55 нмоль/г тканини, а міді – 31(8 нмоль/г тканини (n=3-5), а в ІІІ фракції з травної залози беззубки - 13(4 і 17(2 нмоль/г тканини (n=3) відповідно (де n – кількість об’єднаних зразків з тканини п’яти тварин). Таблиця 2 Вміст термостабільних білків у тканинах беззубки за дії на організм йонів міді, цинку, марганцю, суміші йонів та за існування у ставі, мг/г тканини, M(m, n=5-6 Дослідна група Тканина Травна залоза Зябра Контроль 8,6(0,8 4,9(0,8 Цинк 9,6(0,6 4,8(0,6? Марганець 9,4(0,5 4,2(0,6 Контроль 7,1(1,1 5,1(0,4 Мідь, 0,01 мг/л 11,0(0,6* 14,0(0,7*? Суміш металів 12,5(0,9* 10,6(0,8* Став 32,6(1,8* 12,1(1,3* Контроль 7,1±0,1 4,8(0,5 Мідь, 0,2 мг/л 4,6±0,5*? 0,9(0,1*? Отже, ІІІ фракція ТБ була ідентифікована як МТ за ознаками термостабільності, молекулярної маси, УФ-спектром. У коропа це Zn-MT, а у беззубки - Zn,Cu-MT. Б Рис. 1. Профілі елюції термостабільних білків тканин коропа (А) та беззубки (Б) при гель-фільтрації на колонці з сефадексом G-75 в 0,01 М трис-HCl буфері, рН 8,0: І, ІІ, ІІІ – фракції термостабільних білків, стрілками вказано об’єм елюції маркерів: 1,1 Ve/Vo - 67 кДа, 2,3 Ve/Vo –12,3 кДа, 2,5 Ve/Vo – 5,8 кДа У результаті йонообмінної хроматографії МТ тканин коропа і беззубки, як і більшість відомих МТ, утворюють дві ізоформи (МТ-1 і МТ-2). МТ коропа елюються при 0,25 і 0,37 М NaCl, а беззубки – 0,25 і 0,40 М NaCl (рис. 3А). Їх УФ-спектри мають відмінності в середньому УФ (рис. 3Б). Вміст Zn:Сu:Mn (в нмоль/г тканини) в ізоформах МТ коропа становить 180:25:4 в МТ-1 і 208:31:5 в МТ-2, а в ізоформах МТ беззубки – відповідно 11:18:2 і 10:13:3. Рис. 2. УФ-спектри фракцій термостабільних білків печінки коропа, виділених на колонці з сефадексом G-75, (1) та апоформи ІІІ фракції (2) Таблиця 3 Характеристики УФ-спектрів термостабільних білків тканин коропа і беззубки в нормі, M±m, n = 10 Показник І фракція ІІІ фракція D215/D230 2,04±0,10 2,33±0,12 D260/D230 0,48±0,07 1,05±0,04* D254/D280 1,25±0,01 1,72±0,15* D245/D295 2,34±0,24 3,77±0,46* Примітки: 1. - n – число незалежних контролів, 2. - * - відмінність між показниками двох фракцій вірогідна, p < 0,05 В Рис. 3. А. Профіль елюції металотіонеїнів печінки коропа і травної залози беззубки, одержаний при йонообмінній хроматографії на колонці з ДЕАЕ-целюлозою в градієнті NaCl в 0,01 М трис-HCl буфері, рН 8,0. Б. УФ-спектри ізоформ МТ-1 і МТ-2 коропа і беззубки. В. Електрофореграма І фракції термостабільних білків печінки коропа в ПААГ У складі продуктів І фракції ТБ за допомогою йонообмінною хроматографії та електрофорезу в ПААГ у денатуруючих умовах нами також було виявлено білок, який за УФ-спектром та молекулярною масою відповідає МТ (рис. 3В). Наявність високомолекулярних білків з ознаками МТ узгоджується з відомостями про здатність МТ до агрегації (Toyama M. et al., 2002; Wilhelmsen T.W. et al., 2002). За амінокислотним складом білки ІІІ фракції проявляють подібність до відомих МТ за високим вмістом дикарбонових кислот, лізину, гліцину та SH-груп (Muenger K. et al., 1985). Участь металотіонеїнів коропа і беззубки в детоксикації йонів міді. Загальна закономірність впливу йонів міді на МТ коропа полягає в значному посиленні їх здатності до агрегації. Протягом 2 і 7 діб інкубації тварин спектральні ознаки МТ з’являються у проміжних фракціях білків, одержаних при гель-хроматографії, обсяг яких значно зростає, а за дії протягом 14 діб – у І фракції (рис. 4, 5). У ній акумулюється і надлишок міді (рис. 6А). Збільшення вмісту високомолекулярної фракції ТБ за дії міді спостерігали і А.І. Божков та інш. у щурів (1998). У ІІІ фракції спектральні ознаки МТ у більшості випадків дії йонів міді зникають, а вміст міді зменшується. Рис. 4. Профіль елюції термостабільних білків печінки на сефадексі G-75 за дії 0,01, 0,2 і 0,5 мг/л міді на коропа протягом 7 діб Для МТ беззубки за дії МК міді характерне значне зростання вмісту міді, що супроводжується гіперхромним ефектом при довжині хвилі близько 260 нм в їх УФ-спектрі (табл. 4, рис. 6Б). За дії СК міді вміст металів в МТ близький до контролю. Б Рис. 5. Диференційні спектри термостабільних білків печінки (А) та зябер (Б) за дії йонів міді на коропа протягом 14 діб Отже, за рядом ознак - властивістю утворювати високомолекулярні МТ, участю в акумуляції надлишку міді і цинку в тканині, змінами УФ спектру залежно від концентрації металу у воді – МТ коропа і молюска демонструють дві різні моделі відповіді на зростання вмісту йонів міді в середовищі. Для тривалої дії МК міді на коропа характерне зростання вмісту небілкових тіолів і зменшення вмісту білкових тіолів (рис. 7). За дії СК і ВК у всі досліджувані терміни вміст небілкових тіолів зменшується одночасно зі значним збільшенням вмісту білкових тіолів. Це спостереження узгоджується з літературними даними, які свідчать про виняткову окиснювальну здатність міді (ІІ) по відношенню саме до небілкових тіолів в організмі та in vitro, зокрема на тлі збільшення вмісту білкових тіолів (Jensen P.Y. et al. 1999, Nagalakshmi N., Prasad M.N., 2001). Відомо, що ГSH може забезпечувати детоксикацію міді лише за нормального або підвищеного вмісту (Kachur A.V. et al., 1999), тобто лише за дії МК міді створюються сприятливі умови для цієї функції ГSH. Найчутливішим до дії міді показником АПС у коропа була активність СОД, яка значно зменшувалась вже за дії МК. Прооксидантні зміни АПС, згідно обчислення інтегрального показника (рис. 8), найбільше виражені за дії СК міді, що відповідає зростанню концентрації в тканині небілкової форми міді та втраті ознак МТ. Б Рис. 6. Вміст міді в термостабільних компонентах печінки коропа (А) та тканин беззубки (Б) за підвищеного вмісту її йонів у воді протягом 14 діб. Тут і на рис. 9: * - зміни загального вмісту металу в термостабільних компонентах порівняно з контролем вірогідні, p<0,05, M(m, n=5-6. За дії ВК міді, цинку, свинцю подано загальний їх вміст у термостабільних компонентах Рис. 7. Зміни вмісту білкових і небілкових тіолів у печінці коропа за дії йонів металів протягом 14 діб: 1 – мала концентрація, 2 – середня концентрація, 3 – велика концентрація йонів металу у воді У беззубки вміст небілкових тіолів у тканинах за дії міді в більшості випадків не змінюється, а за дії СК у зябрах значно зростає. Утворення ТБК-активних продуктів та ОМБ у травній залозі і зябрах за дії МК зменшується порівняно з контролем відповідно в два і три рази, а за дії СК наближається до контролю. Активність СОД за дії міді у беззубки значно зростає. Подібний ефект спостерігали й за вивчення довготривалої дії міді на інших безхребетних гідробіонтів (Correlia A.D. et al., 2001; Manduzio H. et al., 2003). Активність каталази в травній залозі відповідає контролю, а в зябрах зростає. У результаті інтегральний показник антиоксидантного захисту за дії міді на беззубку значно зростає порівняно з контролем (рис. 8). Отже, організм беззубки, на відміну від коропа, володіє високоефективною системою мобілізації захисних механізмів від токсичної дії міді за участю МТ. Б Рис. 8. Коефіцієнти антиоксидантного стану (КАС) печінки коропа (А) та тканин беззубки (Б) за дії на організм йонів міді, цинку, марганцю, свинцю, їх суміші та в природних умовах існування (став) Участь металотіонеїнів коропа і беззубки в детоксикації йонів цинку. Загальний вміст цинку в термостабільних компонентах печінки коропа є досить стабільним показником за дії йонів цинку на організм (рис. 9А). Однак спостерігається його перерозподіл між окремими компонентами. Зростання вмісту цинку в МТ не виявлено, а дія СК викликала навіть істотне його зменшення, тоді як в І фракції і небілкових компонентах розчину вміст цинку зростає. Значно зростає і вміст міді в термостабільних компонентах. В Рис. 9. Вміст цинку (А), марганцю (Б) і свинцю (В) в термостабільних компонентах печінки коропа за забруднення середовища їх сполуками. К - контроль У беззубки за дії цинку значно зростає загальний вміст цинку і марганцю в тканинах (в зябрах відповідно з 111(19 до 228(15 мкг/г тканини та з 149(14 до 237(34 мкг/г тканини). Зростає і вміст цинку в термостабільних компонентах, зокрема в МТ (рис. 10А), однак масштаби загальних змін вмісту цинку в тканині значно більші від зв’язуючої здатності МТ. МТ підтримують також стабільний рівень міді, не зважаючи на значне зменшення її загального вмісту в тканинах (в зябрах з 6,1(0,6 до 2,9(0,4 мкг/г тканини). Марганець у фракціях ТБ не виявляється. В УФ-спектрах ТБ коропа і беззубки за дії цинку спостерігаються специфічні для дії цього металу зміни, пов’язані із збільшенням плеча в дальньому УФ (табл. 4). Вміст небілкових тіолів у печінці коропа за дії МК відповідає контролю, а за дії СК і ВК зростає відповідно на 99 % і 41 % порівняно з ним (рис. 7). Отже гепатоцити забезпечені достатньою кількістю транспортних тіолів. Вміст білкових тіолів зменшується із зростанням концентрації йонів цинку у воді на 81 %. Дія МК цинку не викликає і змін АПС печінки коропа. За більших концентрацій активність СОД пригнічується, посилюється утворення продуктів окисної деструкції ліпідів і білків, у результаті чого КАС зменшується порівняно з контролем (рис. 8). У профілі елюції СМП плазми крові за дії СК з’являється фракція з M біля 1 кДа, що вважається однією з ознак розвитку ендогенної інтоксикації (Туряница И.М. и др., 1991). Найбільш істотні ознаки токсичності цинку для коропа, які спостерігаються за дії його СК, відповідають максимальному пригніченню функції МТ. Б Рис. 10. Вміст цинку, міді і марганцю в термостабільних компонентах тканин беззубки за забруднення води сполуками цинку (А) та марганцю (Б): 1 – травна залоза, 2 – зябра У тканинах беззубки за дії МК йонів цинку вміст небілкових тіолів не зазнає змін порівняно з контролем. Виникають зміни показників АПС, що, згідно обчислення КАС, компенсовані (рис. 8). Однак зменшення активності СОД та зростання утворення ТБК-активних продуктів, що спостерігаються вже за такої порівняно низької концентрації цинку у воді, узгоджуються з незначною участю МТ беззубки в зв’язуванні цинку. Порівнюючи вплив йонів цинку на коропа і беззубку можна узагальнити, що ступінь ураження організму залежить від розподілу цинку та редокс-активних металів між МТ та іншими компонентами тканин. Участь металотіонеїнів коропа і беззубки в детоксикації йонів марганцю. У коропа за дії йонів марганцю профіль елюції ТБ при хроматографії зазнає істотних змін з утворенням проміжних фракцій і зменшенням об’єму елюції головних. В УФ-спектрах І, ІІІ та проміжних фракції ТБ відзначено гіперхромний ефект з максимумом близько 260 нм, характерний для МТ (табл. 4). Отже марганець, подібно до міді, викликає у коропа утворення олігомерів МТ, однак серед досліджуваних металів він виявився єдиним, який посилює спектральні ознаки МТ у коропа за дії порівняно великих доз. У печінці коропа за дії всіх доз йонів марганцю його вміст у термостабільних компонентах істотно зростає (рис. 9Б). Причому це відбувається навіть за умов його зменшення в тканині. Особливо зростає вміст марганцю в МТ. За дії СК зростає також і його вміст у небілковому розчині. У беззубки дія на організм йонів марганцю не викликала істотних змін вмісту, профілю елюції ТБ та їх спектрів у середньому УФ. У тканинах та у розчині ТБ помітно зростає вміст марганцю, особливо в зябрах (рис. 10Б). Однак, це зростання пов’язане не з МТ, як у коропа, а з небілковими компонентами. Разом з тим у МТ зростає вміст цинку і міді. Специфічною ознакою дії марганцю на тіоли у коропа є значне збільшення вмісту білкових тіолів за незмінного вмісту небілкових тіолів (рис. 7). Вплив марганцю на АПС у печінці коропа має антиоксидантну спрямованість, найбільше виражену за дії СК (рис. 8), що відповідає найвищому вмісту вільної форми марганцю в тканині. Пригнічення ПОЛ спостерігали й у ссавців за тривалої дії марганцю і довели його неферментний механізм (Shukla G.S., Chandra S.V., 1981). У беззубки дія йонів марганцю викликає істотні зміни показників АПС, причому за активністю СОД і каталази та за утворенням продуктів ПОЛ вони мають прооксидантний характер, хоча в цілому зміни показників АПС у тканинах беззубки збалансовані (рис. 8). Oe P ? ? Oe oeoeoeoeoeoeoeoeoeeoeoeoeoeoeoeoeoeoeoeoeoeoeoeoe Oe F ? TH * v ? „@ dh]„yy^„@ v z ? ? OUe-nna*II??????????FF „yy]„yy „@ „?]„yy^„@ „O ]„yy^„O „@ ]„yy^„@ `„? & _o [email protected] ?IIIaIaIaeI?I&IooMAAA h j? h pkd h h h h ]„`„ 5kd3 h h h h h h ¬ ® yoiaaaiyaaOIyOOOooAAo `„ ® h h h h h h h h h $ у коропа він у великому діапазоні доз акумулюється в МТ і активує антистресові системи організму, то у беззубки він накопичується в небілковому розчині і пригнічує антиоксидантний захист. Участь металотіонеїнів коропа в детоксикації йонів свинцю. За дії йонів свинцю характерними змінами профілю елюції ТБ печінки на сефадексі G-75 є посилення їх гетерогенності за рахунок фракцій середньої маси, які не мають ознак МТ. Білки з високим показником D254/D280 містяться у І фракції, тоді як ІІІ фракція за дії СК йонів свинцю втрачає ознаки МТ (табл. 4). За дії МК зростає вміст свинцю в І фракції ТБ та в небілковому розчині, але не в МТ. За дії СК у фракціях ТБ він не виявляється, хоча в тканині спостерігається його накопичення (рис. 9В). У печінці під впливом йонів свинцю відбуваються зміни вмісту тіолів, які залежать від концентрації металу і часу його дії. Вміст небілкових тіолів відповідає нормі або збільшується. Дослідження дії свинцю на вміст ГSH у тканинах морських риб (Thomas P., Juedes M.J., 1985, 1992) також свідчать, що збільшення цього показнику є характерною відповіддю організму до порогового вмісту свинцю 1 мкг/г тканини. Вміст білкових тіолів у більшості випадків істотно зменшується (рис. 7). Блокування білкових тіолів вважають головним чинником у пригніченні Са2+-залежних процесів і фосфорилювання білків у клітинах за свинцевої інтоксикації (Gurer H., Ercal N., 2000). Йони свинцю викликають у коропа оксидативний стрес вже за дії МК (рис. 8). Одночасно зменшується активність СОД і каталази, що вважається чутливою реакцією на свинцеву інтоксикацію (Sandhir R. et al., 1994). За дії вищих концентрацій зміни активності цих ферментів розбалансовані. Істотного оксидативного ураження зазнають ліпіди і білки. Спостерігається зростання гетерогенності СМП плазми крові, однак вихід фракції з М близько 1,5 кДа, характерної для “гострофазної” відповіді, незначний. Отже, результати дослідження дають підставу зробити висновок про те, що в печінці коропа відсутні механізми детоксикації надлишку свинцю, пов’язані з функцією МТ. Б Рис. 11. Вміст цинку, міді, марганцю та свинцю в термостабільних компонентах печінки коропа (А) та тканин беззубки (Б) за впливу на організм суміші їх йонів: К – контроль, Д – дія суміші йонів, 1- травна залоза, 2 – зябра. На рис. А реальні одиниці виміру вмісту менші від зображених для міді в 20, марганцю - в 100, свинцю - в 1000 разів Участь металотіонеїнів коропа і беззубки в детоксикації йонів важких металів за дії на організм їх експериментальної та природної сумішей. Оскільки найбільші адаптивні можливості МТ були виявлені за дії МК металів, ми використали в дослідженні комбінованої дії саме такі концентрації кожного з металів. За дії суміші йонів металів на коропа в профілі елюції ТБ при хроматографії на сефадексі G-75 спостерігається поява проміжної фракції, а в УФ-спектрах фракцій - істотні зміни поглинання, не пов’язані з ознаками МТ (табл. 4). Вміст цинку в термостабільних компонентах зростає, міді - зменшується в три рази, а марганцю і свинцю - не змінюється порівняно з контролем (рис. 11А). При цьому частка цинку в термостабільних компонентах від загального вмісту в тканині зростає порівняно з контролем з 29 до 46%, а міді і свинцю помітно зменшується (відповідно з 60 до 17% і з 44 до 21%). Надлишок цинку акумулюється переважно у І фракції і меншою мірою в МТ. Вміст міді в МТ зменшується до слідового, а в І фракції залишається без істотних змін. Зростає вміст тіонеїнзв’язаної форми марганцю. Свинець у складі ТБ не виявляється. Отже, кожний з металів за дії їх суміші виявив такі закономірності розподілу між МТ та іншими компонентами тканини, які характерні для його індивідуальної дії в двадцять і п’ятдесят разів вищих концентраціях. У тканинах молюсків за дії суміші зростає вміст ТБ (табл. 2). Їх склад стає більш гетерогенним, причому важкі фракції ТБ виявляють спектральні ознаки МТ (табл. 4). У беззубки ми спостерігали утворення олігомерів МТ лише за дії суміші, а з літератури відомо про появу у молюсків такої фракції за дії кадмію (Mackay E.A. et al., 1993). У тканинах збільшується вміст цинку, що пов’язано з його акумуляцією в ТБ. Створюється і надлишок міді, однак її вміст в ТБ не зазнає змін (рис. 11Б). Вміст марганцю в складі ТБ незначний, а свинець не виявляється. Вміст МТ в тканинах за дії суміші металів зростає в два рази. При порівнянні дії металів в суміші та індивідуально на коропа і беззубку видно, що здатність МТ у обох видів зв’язувати мідь в присутності інших металів значно погіршується. Разом з цим, у беззубки за дії суміші все ж підтримується нормальний вміст міді в МТ, а у коропа він значно зменшується порівняно з контролем, тоді як для акумуляції марганцю в МТ коропа, на відміну від МТ беззубки, створюються пріоритетні умови. Рис. 12. Вміст цинку, міді та марганцю в термостабільних компонентах тканин беззубки за умов перебування у природній водоймі: К – контроль, Д – став, 1- травна залоза, 2 – зябра За дії суміші йонів у коропа спостерігається одночасне зменшення активності СОД і каталази в печінці, однак вміст небілкових тіолів та продуктів окисної деструкції білків і ліпідів не зазнає змін порівняно з контролем. У тканинах молюсків дія суміші викликає помітну активацію ферментів антиоксидантного захисту. Особливо зростає активність каталази в зябрах, а утворення продуктів ПОЛ та ОМБ досить сильно пригнічується. В результаті інтегральний показник КАС у двох видів тварин істотно відрізняється (рис. 8). Отже організм молюска має значно досконаліші механізми для вироблення адаптивної відповіді, ніж коропа, причому їх прояви подібні за дії міді і її суміші. У термостабільних компонентах тканин беззубки зі ставу вміст цинку і марганцю більший, ніж у контролі. Однак, цей надлишок не акумулюється в ІІІ фракції (рис. 12). Вміст МТ у тканинах тварин менший, ніж у контролі, а їх спектральні ознаки зникають. Неефективність МТ гідробіонтів у зв’язуванні металів в умовах природного забруднення водойм відзначають й інші автори (Hamza-Chaffai A. et al., 1997; Olsvik P.A. et al., 2000). Разом з цим, зміни АПС тканин беззубки зі ставу мають добре виражену антиоксидантну спрямованість (рис. 8) за рахунок активації каталази та зростання вмісту небілкових тіолів. Отже, адаптація молюска до впливу досліджуваної природної суміші забруднювачів пов’язана з мобілізацією системи АПС і, зокрема, небілкових тіолів, тоді як металзв’язуюча функція МТ пригнічується. Аналіз одержаних результатів показує, що існує видова специфічність відповіді МТ коропа і беззубки на йони металу певноїв природи. Так МТ беззубки, на відміну від МТ коропа, здатні зв’язувати надлишок міді в тканині, причому частка цієї форми міді є досить значною. МТ коропа зв’язують також надлишок марганцю, істотно впливаючи на розподіл цього металу в тканинах. За дії суміші металів видова специфічність мідь- та марганець-зв’язуючої функції МТ проявляється яскравіше, ніж за окремої дії. У літературі ми не зустріли пояснень такої відмінності, хоча порівняно низька токсичність міді для безхребетних тварин відзначається й іншими авторами (Nassiri Y. et al., 2000). Серед досліджених властивостей МТ видову специфічність має співвідношення вмісту в них цинку і міді, що указує на відмінність МТ за ?/?- ?кладом доменів (Valls M. et al., 2001) і може мати прогнозуюче значення для виявлення типу відповіді організму на той чи інший вид токсиканту за дії окремо або в суміші. Металспецифічні склад і відповідь МТ коропа і беззубки можуть бути пояснені еволюційними особливостями комплексного механізму регуляції метаболічно активної форми того чи іншого металу, важливого для життєдіяльності. Це припущення підтверджується встановленою нами високою чутливістю і видоспецифічністю відповіді на дію міді СОД, яка виконує буферну функцію для міді у взаємозв’язку з МТ і ГSH (Ciriolo M.R. et al., 2001). Встановлено зв’язок між детоксикаційною функцією МТ та ступенем антиоксидантного захисту організму. Для властивостей МТ та АПС печінки коропа виявлені чіткі ознаки концентраційно залежної відповіді організму на токсиканти. Їх активізація, або “Hormesis” (Stebbing A.R.D., 1981) проявляється за дії МК металів як посилення спектральних ознак МТ та/або акумуляції ними металів у всіх дослідних групах. Більшість показників АПС за цих умов відповідають нормі, або їх зміни мають антиоксидантну спрямованість. За дії СК йонів металів вміст МТ та їх здатність зв’язувати метал-токсикант значно зменшуються, а спектральні ознаки послаблюються. За цих умов певне компенсаторне значення можуть мати олігомерні форми МТ, які акумулюють надлишок металів, що дозволяє оцінити СК як стадію компенсованого підвищення активності стресових систем. Цій концентрації відповідає найбільший діапазон відхилень від контролю показників АПС. За дії ВК йонів металів спостерігається зростанням вмісту продуктів пероксидації ліпідів та білків у тканині і зменшенням активності антиоксидантних ферментів, що свідчить про фазу вичерпання антистресових систем організму. Дослідження ТБ за цих умов свідчить про посилення їх олігомеризації. Надлишок металів за цих умов зв’язується з термолабільними компонентами тканин. Отже, ступінь ефективності зв’язування металів з МТ є показником їх токсичності. Використання інтегрованого показника КАС дозволило диференціювати ступінь змін АПС залежно від концентрації металу та виду організму. За розбалансування окремих компонентів АПС зміни КАС у обох організмів вірогідно корелюють із змінами активності СОД (r=0,85 при r(0,95, 21)=0,42). Таблиця 4 Типи змін диференційних спектрів І і ІІІ фракцій термостабільних білків тканин коропа і беззубки в експериментальних умовах: ? - “дзвоноподібна”, ? - “висхідна діагональ”, \ - “нисхідна діагональ”, ? -“зміщення” піку, - – не визначали, * - еталони, r(21, 0,99)=0,54 Чинни-ки Відносна концентра-ція йонів у воді Короп Беззубка Печінка Зябра Енте-роцити Травна залоза Зябра І ІІІ І ІІІ І І ІІІ І ІІІ Cu2+ Мала ? ?* - - - ?\ ? \ ? Середня \* ?* ? ? - ? ? ? ? Велика ? - - - - - - - - Zn2+ Мала ? ? - - - ? ? ? ? Середня ? ? ? - ? - - - - Mn2+ Мала ? \ - - - ? ? ? ? Середня ? ? ? ? ? - - - - Велика ? \ - - - - - - - Pb2+ Мала ? ? - - - - - - - Середня ? ? - - - - - - - Суміш Мала ? ? - - - ? ? \ ? Для всіх досліджених нами металів та їх суміші послаблення здатності МТ зв’язувати їх у малотоксичні комплекси супроводжується появою ознак токсичності, зокрема активацією ПОЛ. Свинець, який не акумулюється МТ, посилює ПОЛ вже за дії МК. Подібну дію має і мідь у коропа, тоді як у беззубки вона пригнічує ПОЛ. Марганець значно пригнічує ПОЛ у коропа, але посилює його у беззубки. Певні ознаки токсичності металів дозволяють поділити їх на групи. Так, відмінність впливу металів на білкові і небілкові тіоли узгоджується з їх належністю до відносно м’яких і жорстких основ і відповідає їх поведінці в системі in vitro (Maracine M., Segner H., 1988). Дія марганцю і свинцю особливо позначається на процесах, залежних від забезпечення йонами заліза. Мідь і цинк здатні викликати відповідь по типу “гострої фази” у плазми крові, мають подібний дозо-залежний вплив на СОД відповідно до подібних рис їх гомеостазу в печінці. При інтерпретації результатів варто також враховувати, що дія кожного металу викликає значні і специфічні зміни у гомеостазі інших металів, які можуть в свою чергу впливати на сигнальні механізми відповіді на стрес – індукцію стресорних білків – МТ, СОД тощо, діючи або безпосередньо на геном, або через генерацію активних форм кисню. Причому антагонізм між марганцем і міддю найкраще виявляється на рівні зв’язування з МТ. Аналіз одержаних результатів свідчить, що ефективним показником концентраційно-залежної і металспецифічної дії металів виявились диференційні спектри ТБ. За експериментальних умов спостерігалось чотири типи їх змін (табл. 4). “Дзвоноподібна” форма спектру низькомолекулярної фракції ТБ відповідає активізації відповіді з боку МТ, така ж форма високомолекулярної фракції ТБ свідчить про утворення олігомерів МТ. Всі три метали, яки виявили здатність до утворення високомолекулярних форм МТ - мідь, марганець і свинець - відомі здатністю каталізувати процеси аутоокиснення біомолекул із залученням їх SH-груп (Shen X.M., Dryhurst G., 1998; Velez-Pardo C. et al., 1995). “Дзвоноподібна” форма спектру в більшості випадків узгоджується із збільшенням у фракції вмісту металів, що відповідає відомостям про більшу ємність олігомерної форми МТ до металів, ніж мономерної (Wilhelmsen T.W. et al., 2002) і підтверджується кореляційним аналізом. Форма спектру у вигляді “висхідної діагоналі” узгоджується з втратою ознак метал-тіолатних кластерів. Рідко зустрівана форма “нисхідної діагоналі” виникає за дії таких сильних окисників як мідь і марганець у білків І фракції. “Зміщення” піку специфічне для дії цинку. Отже, проведене нами дослідження дозволяє зробити висновок про залежність детоксикаційної здатності прісноводних тварин щодо йонів міді, цинку, марганцю і свинцю від ефективності їх зв’язування металотіонеїнами у малотоксичні комплекси та визначити показники, які адекватно і кількісно відображають її. ВИСНОВКИ Здійснено системне дослідження участі металотіонеїнів коропа і беззубки в детоксикації йонів міді, цинку, марганцю і свинцю, в результаті якого з’ясовано зміни фізико-хімічних властивостей металотіонеїнів за підвищення вмісту металу-токсиканту в середовищі, а також показано наявність зв’язку між здатністю металотіонеїнів акумулювати токсикант та станом антиоксидантно-прооксидантної системи організму залежно від виду тварин, природи йонів металів, їх концентрації та часу дії. З тканин коропа і беззубки виділені металотіонеїни як термостабільні білки з молекулярною масою близько 6 кДа й ідентифіковані за спектральними ознаками, амінокислотним складом та утворенням ізоформ МТ-1 і МТ-2 при йонообмінній хроматографії. За спектральними ознаками та поведінкою при електрофорезі виявлені олігомерні форми металотіонеїнів. За складом металів металотіонеїни коропа належать до Zn-МТ, а металотіонеїни беззубки - до Zn,Cu-МТ. Металотіонеїни коропа і беззубки відіграють важливу роль у зв’язуванні міді в тканинах, але проявляють видову специфічність щодо участі в її детоксикації. Металотіонеїни коропа не зв’язують надлишок міді і зазнають олігомеризації за зростання її вмісту у складі термостабільних компонентів тканин (p<0,05). Металотіонеїни беззубки за дії 0,01 мг/л міді зв’язують на 100 – 300% більше міді порівняно з контролем. Вплив йонів цинку на коропа не приводить до істотних змін вмісту цинку в металотіонеїнах за зростання його вмісту в термостабільних компонентах печінки в 1,9 разів (p<0,05). У беззубки вплив йонів цинку на організм викликає істотне зростання вмісту цинку в металотіонеїнах. Проте його загальний вміст в тканинах беззубки на порядок вищий від акумулюючої здатності металотіонеїнів та в умовах досліду зростає в 1,5 – 2,0 разів проти контролю (p<0,05). Металотіонеїни коропа зв’язують порівняно велику частку марганцю від його загального вмісту в тканинах коропа (близько 40% загального вмісту в печінці в контролі). За дії на організм йонів марганцю його вміст у металотіонеїнах та їх олігомерних формах зростає. У беззубки металотіонеїни не беруть істотної участі у зв’язуванні надлишку марганцю в тканинах. Показано, що металотіонеїни коропа та беззубки не беруть істотної участі у зв’язуванні свинцю в контролі і, особливо, за його підвищеного вмісту в середовищі. За впливу суміші йонів міді, цинку, марганцю і свинцю на коропа та беззубку видова специфічність детоксикаційної функції металотіонеїнів зберігається. В складі металотіонеїнів коропа особливо зростає вміст марганцю і зменшується - міді. У металотіонеїнах беззубки міститься підвищена кількість цинку, підтримується стабільний вміст міді, але зменшується вміст марганцю, що відповідає напряму вірогідних змін вмісту цих металів у тканинах (p<0,05). За змінами властивостей металотіонеїнів коропа визначено три концентраційно-залежні стадії дії металів: активації металзв’язуючої функції; посилення утворення олігомерів та зв’язування ними надлишку метал-токсиканту; виснаження металзв’язуючої функції. Встановлено зворотню залежність між здатністю металотіонеїнів акумулювати метал-токсикант та проявами його прооксидантної дії. Найбільший рівень антиоксидантного захисту, який вірогідно корелює зі зростанням активності супероксиддисмутази та пригніченням пероксидації ліпідів, виявлено у коропа за дії марганцю і у беззубки - за дії міді. Найвищий рівень активації пероксидації ліпідів та розбалансування ферментної системи антиоксидантного захисту спостерігається у коропа за дії свинцю. Найістотніші видові відмінності показників антиоксидантно-прооксидантного стану спостерігаються за дії міді та її суміші. Зменшення здатності металотіонеїнів печінки коропа зв’язувати метал-токсикант супроводжується проявами специфічних ознак токсичності його йонів, такими як зміни вмісту небілкових і білкових тіолів, активності супероксиддисмутази та каталази в тканинах, складу середньомолекулярних пептидів плазмі крові. У беззубок, які знаходились в умовах комплексного забруднення природної водойми, спостерігали пригнічення металзв’язуючої функції металотіонеїнів, але активацію інших ендогенних захисних систем організму – ферментів антиоксидантного захисту та зростання вмісту небілкових тіолів. Спостерігались зміни вмісту в складі металотіонеїнів та інших компонентів тканин міді, цинку, марганцю та заліза, навіть за умов постійного вмісту в них металу-токсиканту. Здебільшого цинк і марганець – синергісти, а мідь і марганець – антагоністи за акумуляцією в термостабільних білках. Практичні рекомендації На підставі узагальнення одержаних результатів можна рекомендувати низку критеріїв для оцінки ступеня ураження організму прісноводних тварин важкими металами: визначення типу металотіонеїнів (Zn-MT або Zn,Cu-МТ) за співвідношенням вмісту в них цинку і міді для прогнозу толерантності організму щодо дії міді, цинку і марганцю; кореляційний аналіз диференційних УФ-спектрів термостабільних білків для кількісної оцінки метало- та концентраційно-специфічних змін властивостей металотіонеїнів, зокрема олігомеризації; обчислення інтегрального показника антиоксидантно-прооксидантного стану – КАС для порівняльної оцінки токсичної дії металів залежно від природи, концентрації, а також тканинної і видової специфіки відповіді; визначення вмісту білкових і небілкових тіолів у тканинах та їх співвідношення для встановлення моделі дії токсичної концентрації металу. Основні публікації за темою дисертації Столяр О.Б. Збірник вправ і задач з біохімії. Навчальний посібник. Вид. друге, доп. і переробл. – Тернопіль: Редакц.-видавничий відділ ТДПУ, 2003. – 87 с. (Рекоменд. Міністерством освіти України). Столяр О.Б. Спектральна характеристика металотіонеїнів гепатопанкреасу коропа при інкубації з йонами важких металів in vitro // Наукові записки Тернопільського педуніверситету. Серія: Біологія. - 2000.- №1(8). - С. 53-56. Столяр О.Б. Окиснювальна модифікація білків гепатопанкреасу і плазми крові коропа за інтоксикації важкими металами // Наукові записки Тернопільського педуніверситету. Серія: Біологія. - 2001. - №2(13).-С. 44-49. Столяр О.Б. Стан тіолів і низькомолекулярних білків гепатопанкреасу коропа при дії сублетальної концентрації міді // Біологія тварин. – 2000. – Т. 2, № 2. – С. 157 – 163. Столяр О.Б. Низькомолекулярні термостабільні білки гепатопанкреасу коропа як індикатори забруднення організму важкими металами // Наукові записки Тернопільського педуніверситету. Серія: Біологія. - 2001. - №3(14). - С. 231 - 232. Столяр О.Б. Роль глутатіону в гомеостазі та детоксикації йонів важких металів в організмі // Наукові записки Тернопільського педуніверситету. Серія: Біологія. - 2002. - №3(18). - С. 166-175. Столяр О.Б. Вплив іонів цинку, марганцю та свинцю на термостабільні білки печінки коропа // Укр. біохім. журн. – 2003. – Т. 75, № 1. – С. 85 – 89. Столяр О.Б. Металотіонеїни у зябрах коропа за дії йонів міді // Наукові записки Тернопільського педуніверситету. Серія: Біологія. - 2003. - №1(20).-С. 89 - 94. Столяр О.Б. Термостабільні білки тканин коропа за дії йонів марганцю (ІІ) // Біологія тварин. – 2003. – Т. 5, № 1 - 2. – С. 207 - 211. Столяр О.Б. Склад середньомолекулярних пептидів плазми крові коропа за дії на організм йонів цинку, міді, марганцю та свинцю // Експеримент. та клінічна фізіологія і біохімія. – 2003. - № 4. – С. 82 – 87. Столяр О.Б. Роль металотіонеїнів у зв’язуванні цинку і міді в тканинах коропа за дії на організм цинку // Медична хімія. – 2003. – Т. 5, № 4. – С. 71 – 74. Столяр О.Б. Металотіонеїни в організмі водних тварин // Біологія тварин. – 2003. – Т. 5, № 1 - 2. – С. 9 - 22. Столяр О.Б., Курант В.З., Балабан Р.Б. Влияние ионов меди на тиоловые соединения в печени карпа // Гидробиол. журн. – 1998. – Т. 34, № 3. - С. 87 – 91. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, планування та постановка експерименту, визначення вмісту тіолів в печінці коропа, виділення металотіонеїнів та їх спектральний аналіз, написання статті). Столяр О.Б., Зіньковська Н.Г. Вплив йонів свинцю і марганцю на активність антиоксидантних ферментів та перекисне окиснення ліпідів у коропа // Наукові записки Тернопільського педуніверситету. Серія: Хімія. - 1999. - №3. - С. 51-55. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, планування та постановка експерименту, визначення продуктів перекисного окиснення ліпідів та активності ферментів в печінці коропа, написання статті). Вплив іонів міді на вміст тіолових сполук і білків в організмі коропа / О.Б. Столяр, Н.Г. Зіньковська, В.В. Грубінко, В.М. Зінчук, О.В. Рудик, О.В. Хоміцька // Науково-технічний бюллетень інституту землеробства і біології тварин. Серія: Фізіологія і біохімія. – Львів, 1999. – Вип. 1(3). – С. 276 – 279. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, планування та постановка експерименту, визначення продуктів перекисного окиснення ліпідів та активності ферментів в печінці коропа, написання статті). Вплив йонів міді і цинку на перекисне окиснення ліпідів і антиоксидантний статус в організмі коропа / О.Б. Столяр, Н.Г. Зіньковська, В.В. Грубінко, В.М. Зінчук, О.В. Рудик // Біологія тварин. – 1999. – Т. 1, № 2. – С. 84 – 89. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, планування та постановка експерименту, визначення вмісту тіолів та білків в печінці коропа, участь в аналізі результатів, написання статті). Влияние сублетальных концентраций свинца на содержание тиоловых соединений и белков в организме карпа / О.Б. Столяр, В.З. Курант, В.А. Хоменчук, Р.Б. Балабан // Гидробиол. журн. – 1999. – Т. 35, № 6. - С. 63 – 68. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, участь у плануванні експерименту, визначення вмісту тіолів та білків в печінці коропа, виділення та аналіз металотіонеїнів, участь в аналізі результатів, написання статті). Антиоксидантно-прооксидантний статус організму коропа при дії сублетальної концентрації міді (ІІ) / О.Б. Столяр, Н.Г. Зіньковська, А.Є. Мудра, О.В. Водвуд, О.М. Марчук, С.М. Шепетюк // Наукові записки Тернопільського педуніверситету. Серія: Біологія. - 2000.-№3(10).-С. 72-78. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, планування експерименту, участь у його виконанні, аналіз результатів і написання статті). Роль низькомолекулярних сірковмісних сполук гепатопанкреасу коропа у зв’язуванні іонів міді / О.Б. Столяр, В.О. Хоменчук, В.О. Арсан, В.В. Грубінко // Доп. НАН України. – 2001. - № 3. – С. 198 – 203. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, планування та постановка експерименту, визначення вмісту тіолів та білків в печінці коропа, виділення та аналіз металотіонеїнів, участь в аналізі результатів і написанні статті). Вплив сублетальних концентрацій йонів цинку на метаболічну функцію та антиоксидантно-прооксидантний статус гепатопанкреасу коропа / О.Б. Столяр, А.Є. Мудра, О.Л. Клебан, С.А. Костюк // Наукові записки Тернопільського педуніверситету. Серія: Біологія. - 2001. - №1(12) .- С. 97 - 100. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, планування експерименту, визначення продуктів перекисного окиснення ліпідів та активності ферментів в печінці коропа, аналіз результатів і написання статті). Столяр О.Б., Балабан Р.Б. Вміст марганцю в низькомолекулярних сполуках гепатопанкреасу коропа та їх властивості при дії марганцю (ІІ) на організм // Наукові записки Тернопільського педуніверситету. Серія: Біологія. - 2001. - №1(12). - С. 90 – 93. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, планування та постановка експерименту, визначення вмісту тіолів та білків в печінці коропа, виділення та аналіз металотіонеїнів, написання статті). Мудра А.Є., Столяр О.Б. Вплив сублетальної концентрації йонів міді на метаболічну активність та прооксидантно-антиоксидантний стан гепатопанкреасу коропа // Наукові записки Тернопільського педуніверситету. Серія: Біологія. - 2001. №3(14). - С. 218 - 219. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, планування експерименту, визначення вмісту продуктів перекисного окиснення ліпідів та активності ферментів в печінці коропа, участь в аналізі результатів і написання статті). Свойства низкомолекулярных термостабильных белков и содержание тиолов в гепатопанкреасе карпа при воздействии сублетальных концентраций ионов свинца и марганца / О.Б. Столяр, В.З. Курант, В.А. Хоменчук, В.В. Грубинко // Гидробиол. журн. – 2001. – Т. 37, № 5. - С. 73 – 80. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, участь у плануванні та постановці експерименту, визначення вмісту тіолів, термостабільних білків, вмісту в них металів та їх радіоактивності, виділення металотіонеїнів, участь в аналізі результатів, написання статті). Столяр О.Б., Зіньковська Н.Г., Мудра А.Є. Антиоксидантно-прооксидантний статус тканин коропа при дії на організм сублетальної концентрації марганцю (ІІ) // Науково-технічний бюллетень інституту біології тварин – Львів, 2001. – Вип. 1 - 2. – С. 263 – 267. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, планування експерименту, визначення вмісту продуктів перекисного окиснення ліпідів та активності ферментів в печінці коропа, участь в аналізі результатів і написання статті). УФ-спектроскопія та високоефективна рідинна хроматографія в аналізі металотіонеїнів гепатопанкреасу коропа при дії йонів важких металів / О. Столяр, В. Курант, В. Грубінко, П. Горбовий // Фізичний збірник НТШ. – 2001. – 4. – С. 423 – 429. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, планування експерименту, виділення металотіонеїнів та їх УФ-спектроскопія, участь в аналізі результатів, написання статті). . Прооксидантна та антиоксидантна дія марганцю (ІІ) на організм коропа (Cyprinus carpio L.) / О.Б. Столяр, А.Є. Мудра, Н.Г. Зіньковська, В.В. Грубінко // Біологія тварин. – 2002. – Т. 4, № 1 - 2. – С. 193 – 199. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, планування експерименту, визначення вмісту продуктів перекисного окиснення ліпідів та активності ферментів в печінці коропа, аналіз результатів і участь у написанні статті). Столяр О.Б., Арсан В.О., Хоменчук В.О. Акумуляція свинцю низькомолекулярними термостабільними білками гепатопанкреасу коропа та їх властивості за інтоксикації свинцем (ІІ) // Доп. НАН України. – 2002. - № 4. – С. 192 – 196. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, планування та постановка експерименту, визначення вмісту термостабільних білків та металів в них, участь в аналізі результатів, написання статті). Stolyar O., Mudra A. The effects of lead on the antioxidant status and lipid peroxidation in carp hepatopancreas // Annales Universitatis Marie Curie-Sklodowska. – Lublin (Polonia). – 2002. – Vol. XV, N 31. – P. 391 – 394. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, планування та постановка експерименту, участь в експерименті та аналізі результатів, написання статті). Столяр О.Б., Михайлів Р.Л., Міщук О.В. Акумуляція металів та антиоксидантний захист в тканинах двостулкового молюска Anodonta cygnea з Тернопільського ставу // Наукові записки Тернопільського педуніверситету. Серія: Біологія. - 2003. - №2(21). - С. 94 - 97. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, планування та постановка експерименту, хроматографічний аналіз металотіонеїнів, визначення вмісту в них металів та утворення продуктів окисних модифікацій білків і ліпідів, написання статті). Столяр О.Б., Курант В.З., Хоменчук В.А., Грубинко В.В. Состояние низкомолекулярных серосодержащих соединений гепатопанкреаса карпа при загрязнении среды солями меди и цинка / О.Б. Столяр, В.З. Курант, В.А. Хоменчук, В.В. Грубінко // Гидробиол. журн. – 2003. – Т. 39, № 4. - С. 91 – 98. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, планування та постановка експерименту, визначення вмісту тіолів, термостабільних білків, вмісту в них металів та радіоактивності, виділення металотіонеїнів, участь в аналізі результатів, участь у написанні статті). Влияние условий существования на связывание тяжелых металлов и окислительную деструкцию биомолекул в тканях пресноводного двустворчатого моллюска Anodonta cygnea / О.Б. Столяр, В.В. Грубинко, Р.Л. Мыхайлив, Е.В. Мищук // Гидробиол. журн. – 2003. – Т. 39, № 6. – С. 73 – 82. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, планування та постановка експерименту, участь в експерименті і аналізі результатів, участь у написанні статті). Stolyar O.B. The metal-binding capacity of carp metallothionein under the influence of a mixture of heavy metal ions on the organism // 4th Parnas conference: Molecular mechanisms of cell activation: Biological signals and their target enzymes (Wroclaw, September 15 - 17 2002): Programme & Abstracts. Wroclaw, 2002, p. 125. Столяр О.Б. Роль термостабільних білків гепатопанкреасу коропа у зв’язуванні йонів марганцю // Матеріали VШ Українського біохімічного з’їзду 1-3 жовтня 2002 р., м. Чернівці:Укр. біохім. журн. – 2002. – Т. 74, № 4б (додаток 2). – С. 105. Effect of copper and lead on the nucleoproteins and thiol in tissues of carp (Cyprinus carpio) / V.Z. Kurant, O.B. Stolyar, R.B. Balaban, V.O. Homenchuk // Metals and Genes Symposium Canterbury: Materiale, University of Kent, Canterbury 7- 11 April 1997. - Abstracts animal and cell biology, 1997. – P. 86 – 87. Роль тіолових сполук в захисті організму прісноводних риб від іонів свинцю і міді / О.Б. Столяр, В.З. Курант, Р.Б. Балабан, В.О. Хоменчук // VП Укр. біохім. з’їзд: Тези доп., Київ, жовт. 1997 р. – К.: Видавництво НАУ, 1997. – Ч. П. – С. 42 –43. The role of low weight proteins and thiols of hepatopancreas in the protection of carp organs from copper uptake / O.B. Stolyar, N.Z. Zin’kovs’ka., A.Y. Mudra, V.O. Khomenchuk, V.V. Grubinko // Metals and Cell Symposium Canterbury: Materiale, Universitty of Kent at Canterbury, 2-6 April. 2001. – P. 45. Столяр О.Б., Грубінко В.В. Акумуляція цинку низькомолекулярними сполуками гепатопанкреасу коропа та їх властивості в умовах забруднення води цинком (ІІ) // Проблеми іхтіопатології. – Матер. І Всеукр. конф. Київ, 23 – 27 жовтня 2001. – С. 110 – 113. Анотація Столяр О.Б. Роль металотіонеїнів в детоксикації йонів міді, цинку, марганцю та свинцю в організмі прісноводних риб і молюсків. - Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія, Інститут біології тварин УААН, Львів, 2004. Дисертацію присвячено дослідженню властивостей металотіонеїнів (МТ) у тканинах коропа (Cyprinus carpio L.) та двостулкового молюска беззубки лебединої (Anodonta cygnea L.) за дії на організм Cu2+, Zn2+, Mn2+, Pb2+ та їх суміші. Механізми детоксикаційної функції МТ пов’язані з акумуляцією надлишку металу-токсиканту ними та їх олігомерними формами. Встановлено, що МТ проявляють видову специфічність за здатністю до детоксикації міді і марганцю відповідно до належності до Zn- (МТ коропа), або Zn,Cu- (МТ беззубки) типу. Для дії цинку характерна відносно висока стабільність функції МТ. Свинець не акумулюється МТ. Виснаження функції МТ призводить до специфічних проявів токсичності металів. Виведено критерії для оцінки ступеню та специфіки ураження організму металами: визначення типу МТ, інтегрального показника антиоксидантного захисту, співвідношення вмісту білкових і небілкових тіолів, кореляційний аналіз УФ-спектрів МТ. Ключові слова: короп, беззубка, мідь, цинк, марганець, свинець, токсичність, металотіонеїни, антиоксидантний захист. Аннотация Столяр О.Б. Роль металлотионеинов в детоксикации ионов меди, цинка, марганца и свинца в организме пресноводных рыб и моллюсков. – Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия, Институт биологии животных УААН, Львов, 2004. Диссертация посвящена исследованию свойств металлотионеинов (МТ) в тканях карпа (Cyprinus carpio L.) и двухстворчатого моллюска беззубки лебединой (Anodonta cygnea L.) при действии на организм Cu2+, Zn2+, Mn2+, Pb2+ и их смеси. Механизмы детоксикационной функции МТ связаны с аккумуляцией избытка металла-токсиканта ими и их олигомерными формами. Установлено, что МТ проявляют видовую специфичность за способностью к детоксикации меди и марганца соответственно их типу: Zn-МТ (карпа), или Zn,Cu-МТ (беззубки). Для действия цинка характерна относительно высокая стабильность функции МТ. Свинец не аккумулируется МТ. Исчерпание функции МТ приводит к специфичным проявлениям токсичности металлов. Выведены критерии для оценки степени и специфики поражения организма металлами: определение типа МТ, интегрального показателя антиоксидантной защиты, соотношения содержания белковых и небелковых тиолов, корреляционный анализ УФ-спектров МТ. Ключевые слова: карп, беззубка, медь, цинк, марганец, свинец, токсичность, металлотионеины, антиоксидантная защита. Summary Stolyar O.B. The metallothioneins role in the detoxication of the copper, zinc, manganese and lead in the organism of freshwater fishes and molluscs. - Manuscript. Thesis for a doctor’s degree in the field of biological sciences in speciality 03.00.04 – biochemistry, Institute of animal biology UAAS, Lviv, 2004. The thesis is devoted to the investigation of carp (Cyprinus carpio L.) and Bivalvia mollusc Anodonta cygnea L. metallothioneins (MTs) investigation under the Cu2+, Zn2+, Mn2+, Pb2+ and its mix action on the organism, have been represented. Carp and molluscs represent an important element of freshwater ecosystems. However, little is known about its MTs function in the accumulation of most widen metals – contaminats of water. The objective of the present study was to perform a comparative analysis of the effects of sublethal to slightly lethal metal concentrations on MTs properties in the tissues of carp and mollusc. Carp MTs reveale to be the Zn-MTs and Anodonta ones – Zn,Cu-MTs. Both of them had apparent molecular masses of 6 kDa and were shown to comprise of two groups of isoforms (MT-1 and MT-2) after the ion exchange chromatography. Evidence is put forward that MTs develop oligomers with molecular mass up to 60 kDa, which behaved electrophoretically identical to light MTs. The mechanism of the MTs detoxificity function in the tissues of the freshwater animals was bound with the accumulation of metals excess to MT and/or with the nonspecifical increasing of its content in the tissues at the metal concentrations that are within ranges common to natural waters. In metal excess binding situation the intensification of its oligomerization is observed. It was determined the animal specias specifity in the MTs properties of the metal ions detoxification. It depends on MTs tipe (Zn-МТs or Zn,Cu-МТs). Carp’s MTs successfully bind the manganese excess but not a copper. The Anodonta MTs bind the copper excess but it didn’t take significant part in the manganese excess binding. The zinc action accompanies with comparatively stable MTs function of both the organisms in it homeostasis. The lead doesn’t accumulated in MTs of both animals species. Under the metals mix action both organisms reveale the features of copper effect, whilst the poisoning of carp was increased but the defense of mollusc was rather effective. It was observed the weakening of the molluscs MTs function but the antioxidant defense increasing in the native conditions of animals being. The depletion of MTs binding properties provokes the specifical metal action in the organisms. The highest level of antyoxidant defense revealed for the manganese action on carp and for the copper and its mix action on Anodonta. The highest level of lipid peroxidation was observed after the lead action. The action of each of metal induses the changes of another metals content in the termostable compounds of the tissues, whilst the content of metal-toxicant isn’t change. Three concentration-dependent stages of metals action were determined according to effectively of metal binding to MTs and to the integrative index of the anthioxidant protection in carp liver. The first one is the activation stage (“Hormesis”), in which MTs can expose metals in the nontoxical form and antioxidant processes are activated. At the compensatory stage the intensification of MTs oligomerization and the most remarkable changes and disbalanse of the antyoxidant-prooxidant status are observed. The stage of the stress systems depletion is according to elevate the metal content in the forms capable to initiating oxidative destruction of lipids and proteins. Under the exceeding of MTs metal-binding capacity each ion type demonstrated the specifically features of toxicity. It is revealed in the changing the ratio of protein and nonprotein thiols content and the formation of the “acute” type answer of blood plasma peptides in carp. The generalization of results leads to formation of the criteria’s of the estimation of metal specifity and concentration strength effect on the freshwater animals: the determination of the MTs type (Zn-MTs or Zn,Cu-МТs), the correlative analysis of MTs differential spectra; the encounting of the integrative index of antyoxidant-prooxidant state, which include the changes of main antyoxidant and prooxidant factors, and of protein and nonprotein thiols ratio. Кey words: carp, bivalvia mollusc, copper, zinc, manganese, lead, toxicity, metalothioneins, antioxidant protection. PAGE 34

Похожие записи