.

Роль металотіонеїнів в детоксикації йонів міді, цинку, марганцю та свинцю в організмі прісноводних риб і молюсків (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 4459
Скачать документ

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН

СТОЛЯР ОКСАНА БОРИСІВНА

УДК 577.352.38:577.64

Роль металотіонеїнів в детоксикації йонів міді, цинку, марганцю та
свинцю в організмі прісноводних риб і молюсків

03.00.04 – біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Львів – 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі хімії Тернопільського державного
педагогічного університету ім. Володимира Гнатюка Міністерства освіти і
науки України

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор

ГРУБІНКО Василь Васильович,

Тернопільський державний педагогічний

університет імені Володимира Гнатюка,

завідувач кафедри загальної біології,

проректор з навчальної роботи

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Сологуб Леонід Ілліч,

Інститут біології тварин УААН,

завідувач лабораторії обміну речовин

доктор біологічних наук, професор Цудзевич Борис
Олександрович,

Київський національний університет імені

Тараса Шевченка, професор кафедри біохімії

доктор біологічних наук, професор

Арсан Орест Михайлович,

Інститут гідробіології НАН України,

завідувач відділу екотоксикології

Провідна установа: Чернівецький національний університет імені Ю.
Федьковича Міністерства освіти і науки України, кафедра біохімії, м.
Чернівці

Захист відбудеться 24.02.2004 р. о 10 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01 Інституту біології тварин УААН
за адресою: 79034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин
УААН за адресою 79034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38.

Автореферат розісланий 22.01.2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Віщур О.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Сполуки важких металів є пріоритетними забруднювачами
прісних водойм України (Линник П.Н., 1999). Оцінка небезпеки цього
забруднення для гідробіонтів має здійснюватись на основі біоіндикації,
позаяк застосування гідрохімічних показників ускладнюється
багатофакторною детермінацією біодоступності металів (Саванина Я.В. и
др., 2001; Брагинский Л.П., Линник П.Н., 2003). Тому актуальним є
з’ясування специфічних механізмів детоксикації для йонів важких металів
різної природи. Серед ймовірних молекулярних мішеней зв’язування цих
йонів у клітинах у першу чергу розглядають спеціалізовані тіолові
сполуки металотіонеїни (МТ) та глутатіон (ГSH) (Кулинский В.И.,
Колесниченко Л.С., 1990; Kagi J.H.R., Shaffer A., 1988). За останнє
десятиліття показано, що вони функціонують узгоджено як форми запасання
та транспорту цинку і міді (Brouwer M., Brouwer-Hoexum T., 1992; Maret
W. et al., 1999; Ciriolo M.R. et al., 2001), детоксикації кадмію
(Klaassen C.D. et al., 1999). Показано селективність ?- і ?-доменів
металотіонеїнів до цих металів (Good M. et al., 1991), видову, тканино-
та металоспецифічну індукцію їх ізоформ за високого ступеню
консервативності первинної структури (M?nger К. et al, 1985; Moilanen
L.H. et al., 1999; Dallinger R. et al., 1997; Lemoine S. et al., 2000).

Разом з цим, методологічні підходи до використання інформації про
металотіонеїни гідробіонтів для оцінки стану забруднення середовища ще
не сформовані. Показано, що індукція синтезу металотіонеїнів є
відповіддю на дію чисельних екстремальних чинників (Хлоповская Е.И. и
др., 1997; Nishimura N. et al., 2001), причому найефективнішим і
найкраще вивченим їх індуктором серед металів у тварин є кадмій (ІІ),
тоді як забруднення цинком мало змінює їх експресію (Viarengo А. et al.,
1999). Щодо дії інших металів існують окремі несистематизовані відомості
(Fisher E.H., Davie E.W., 1998; Palmiter R.D., 1998). Порівняльна
ефективність зв’язування йонів металів з тіолами вивчена переважно в
системах in vitro (Maracine M., Segner H., 1998, Коновалов Ю.Д., 2000).
На рівні організмів відомо, що металотіонеїни до певної межі зв’язують
майже весь кадмій тканини, акумулюють ртуть (Olsvik P.A. et al., 2000;
Das K. et al., 2002) та мідь (Berntssena M.H.G. et al., 1999; Handya
R.D. et al., 1999). Функціональні взаємозв’язки між пулами
металотіонеїнів i ГSH за інтоксикації йонами важких металів, а також
конкуренція фізіологічних металів та металу-токсиканту за зв’язування
мало вивчені (Fowler B.A., Gould E., 1988; Lange A. et al., 2002).
Переважна більшість досліджень проведена на прикладі морських риб і
безхребетних, причому за умов гострої токсичності (Viarengo A. et al.,
1999; Conners D.E., Ringwood A.H., 2000), тоді як про стан
металотіонеїнів прісноводних тварин за умов екологічно реального
забруднення води немає чітких уявлень (Correlia A.D. et al., 2001;
Laporte J.M. et al., 2002). У зв’язку з цим, дослідження участі
металотіонеїнів та інших тіолових сполук прісноводних тварин у
зв’язуванні важких металів за підвищеного вмісту їх йонів у водному
середовищі є актуальною проблемою.

Іншим аспектом, пов’язаним із вивченням зв’язування важких металів з
металотіонеїнами гідробіонтів, є виявлення меж ефективності цього шляху
детоксикації. Тому представляє інтерес ідентифікувати відповідність між
ступенем зв’язування металу в тканині з металотіонеїнами та
дозо-залежними стадіями відповіді організму на його дію (Божков А.И.,
1997). Стан антиоксидантно-прооксидантної системи (АПС), як відомо,
чутливо відображає ці стадії (Котеров А.Н., Никольский А.В., 1999).

Для дослідження нами були обрані йони металів, що належать до
пріоритетних забруднювачів прісних водойм – цинк (ІІ), мідь (ІІ) і
свинець (ІІ), а також марганець (ІІ), який вважають відносно нетоксичним
металом (Barceloux D.G., 1999), але його здатність легко змінювати
ступінь окиснення і широкий спектр коливань вмісту у прісних водоймах
(Линник П.Н., 1999) викликають інтерес до вивчення його дії на
гідробіонтів. Концентраційно залежні дослідження їх впливу на
металотіонеїни прісноводних тварин не проводились. Інформація про
зв’язування марганцю і свинцю з металотіонеїнами відсутня, проте
встановлено, що їх токсичність для ссавців пов’язана зі специфічним
впливом на тіоли (Liccione J.J., Maines M.D., 1988; Rajanna B. et al.,
1991; Sandhir R. et al., 1994).

Для виявлення універсальних та видових характеристик тіолових сполук
організму за дії йонів важких металів становило інтерес розглянути їх
вплив на представників, що належать до одного біотопу, але різних за
екологічними вимогами. Значення обраних для дослідження видів
визначається тим, що короп є промисловою рибою (Воробьев В.И., 1979), а
беззубка лебедина – одним з найпоширеніших на території України видів
прісноводних двостулкових молюсків, які можуть ефективно концентрувати
метали – забруднювачі (Стадниченко А.И., 1984).

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота
виконувалась у межах держбюджетних тем кафедр хімії та загальної
біології Тернопільського державного педагогічного університету імені
Володимира Гнатюка “Молекулярні механізми впливу важких металів на
організм прісноводних риб” № держреєстрації 0196UO12314 (1996-1997 рр.),
в якій автор досліджував вміст тіолів у печінці коропа; “Дослідження
метаболічної ролі амінокислот в адаптаційно-компенсаторних процесах в
організмі тварин при екологічних стресах” № держреєстрації 0199UO02522
(1999-2000 рр.), в якій автор досліджував властивості металотіонеїнів і
вміст тіолів у печінці коропа; “Токсикоспецифічні адаптації гідробіонтів
та водних екосистем до іонів важких металів та їх регуляція” №
держреєстрації 0101UO00303 (2001-2003 рр.), в якій автор досліджував
властивості металотіонеїнів, вміст тіолів та активність ферментів
антиоксидантного захисту в печінці коропа.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було з’ясувати механізми
участі металотіонеїнів прісноводних риб і молюсків у детоксикації йонів
важких металів водного середовища (мідь (ІІ), цинк (ІІ), марганець (ІІ),
свинець (ІІ)) за умов забруднення води їх сполуками.

Завдання:

Виділити металотіонеїни з тканин коропа і беззубки та вивчити їх склад і
фізико-хімічні властивості.

З’ясувати дозо-часові та метало-специфічні ефекти впливу йонів міді,
цинку, марганцю і свинцю та їх суміші на фізико-хімічні властивості
металотіонеїнів коропа і беззубки.

Дослідити вплив йонів міді, цинку, марганцю та свинцю на їх зв’язування
з металотіонеїнами та іншими термостабільними компонентами метаболічно
активних тканин коропа і беззубки залежно від концентрації йонів, їх
природи та часу дії.

На підставі визначення показників антиоксидантно-прооксидантного стану в
експериментальних умовах встановити ступінь ураження організму за дії на
нього йонів металів та схарактеризувати металзалежну специфіку
токсичності.

З’ясувати місце металотіонеїнів та інших тіолових сполук риб і молюсків
у детермінації адаптивної відповіді організму на дію йонів міді, цинку,
марганцю і свинцю відповідно до умов цієї дії.

Здійснити порівняльний аналіз властивостей металотіонеїнів коропа та
беззубки.

Розробити тести для оцінки ступеня ураження прісноводних тварин йонами
міді, цинку, марганцю та свинцю.

Об’єкт дослідження – процеси детоксикації йонів важких металів в
організмі прісноводних тварин.

Предмет дослідження- механізми участі металотіонеїнів коропа та беззубки
в детоксикації йонів міді, цинку, марганцю та свинцю водного середовища.

Методи дослідження – розподільча та йонообмінна хроматографія,
електрофорез, спектрофотометрія, метод радіоактивних ізотопів,
статистичні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Проведено системне дослідження
детоксикаційної функції металотіонеїнів коропа і беззубки за впливу на
організм йонів важких металів (міді, цинку, марганцю і свинцю).
Встановлено видові особливості вмісту металів та ізоформного складу
металотіонеїнів. Вперше диференційовано три типи відповіді
металотіонеїнів гідробіонтів на підвищення вмісту йонів металу в
середовищі: акумуляція надлишку металу в металотіонеїнах, посилення
олігомеризації металотіонеїнів, поєднане із акумуляцією надлишку металу,
пригнічення їх металзв’язуючої функції.

Одержано нові дані про високу ефективність металотіонеїнів беззубки
порівняно з цими білками коропа щодо зв’язування надлишку йонів міді.
Встановлено залежність між здатністю металотіонеїнів акумулювати
надлишок міді в тканинах і активністю антиоксидантного захисту.
Виявлено, що акумуляція надлишку цинку металотіонеїнами за абсолютними
показниками також ефективніша у беззубки, ніж у коропа, однак за
відносним внеском у зв’язування цього металу у тканині менш істотна.

Уперше досліджено дію марганцю (ІІ) на металотіонеїни прісноводних
тварин і виявлено здатність металотіонеїнів коропа, на відміну від
металотіонеїнів беззубки, зв’язувати надлишок марганцю за широкого
діапазону його концентрацій у воді узгоджено із значною активацією
антиоксидантних факторів організму. Надлишок свинцю в тканинах не
акумулюється металотіонеїнами і викликає найзначніші ознаки токсичності.

Виявлено, що за дії суміші йонів цинку, міді, марганцю і свинцю
металотіонеїни коропа і беззубки зв’язують переважно той тип йонів, який
найбільш ефективно акумулюється ними за умов окремої дії.

Уперше показано активацію металотіонеїнів та системи антиоксидантного
захисту прісноводних тварин за дії непошкоджуючих концентрацій йонів
міді та марганцю на організм. Запропоновано інтегральний показник оцінки
концентраційно залежної та видоспецифічної відповіді
антиоксидантно-прооксидантного стану, що враховує стан різних чинників
системи. Розроблено рекомендації визначення концентраційно залежної та
металоспецифічної відповіді організму на дію металів шляхом використання
спектральних характеристик металотіонеїнів.

Практичне значення одержаних результатів. Запропоновано оптимальний
методологічний підхід для аналізу і прогнозу токсичності йонів важких
металів для прісноводних тварин. На підставі одержаних результатів
розроблено рекомендації, що запроваджено при тестуванні якості води у
природних водоймах Тернопільської області. Одержані результати і
теоретичні узагальнення використовуються у викладанні курсів
“Молекулярна і біологічна хімія”, “Хімія і біохімія”, “Молекулярні
основи процесів життєдіяльності” в підготовці студентів та магістрів
спеціальностей “хімія, біологія, екологія і географія” в Тернопільському
державному педагогічному університеті імені Володимира Гнатюка.

Особистий внесок здобувача полягає у визначенні ідеї та розробки
стратегії наукового експерименту, одержанні експериментальних даних, їх
аналізі та оформленні, а також підборі і опрацюванні літературних даних.
Електрофорез фракцій термостабільних білків здійснювався у відділі
сигнальних механізмів клітини Інституту біології клітини НАН України, м.
Львів. Амінокислотний аналіз металотіонеїнів виконаний у лабораторії
“Якості та безпеки сільськогосподарської продукції” Національного
аграрного університету, м. Київ. Експерименти з радіоактивною міткою
проводились за допомогою співробітників Інституту біології тварин УААН,
м. Львів. Окремі експериментальні роботи виконувались за участю
співавторів публікацій, які були співвиконавцями науково-дослідних тем.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи доповідались на
наукових з’їздах: VII, VIII Українських біохімічних з’їздах (Київ, 1997;
Чернівці, 2002); П та ІІІ з’їздах гідроекологічного товариства України
(Київ, 1997, Тернопіль, 2001); конференціях: VП науковій конференції з
экологічної фізіології і біохімії риб, Петрозаводськ, 1992; ІХ
Всеросійській конференції “Экологическая физиология и биохимия рыб”,
Ярославль, 2000; І Всеукраїнській науковій конференції “Екологічний
стрес і адаптація в біологічних системах”, Тернопіль, 1998;
Всеукраїнській науковій конференції “Екологічна наука і освіта в
педагогічних вузах України”, Умань, 2000, І Всеукраїнській конференції
“Проблеми іхтіопатології”, Київ, 2001; Міжнародній конференції з
фізіології і біохімії тварин, присвяченій 100-річчю від дня народження
професора С. З. Гжицького, Львів, 2000; Міжнародній науково-практичній
конференції “Біологічні основи підвищення продуктивності тварин”,
присвяченій 40-річчю створення Інституту біології тварин УААН, Львів,
2002; ІІ Львівсько-Люблінській конференції з експериментальної та
клінічної біохімії, Люблін, 2002; 4-й Парнасівській конференції
“Молекулярні механізми активації клітин (4th Parnas conference:
Molecular mechanisms of cell activation: Biological signals and their
target enzymes)”, Вроцлав, 2002; Всеросійській конференції з іноземною
участю “Водна токсикологія”, Борок, 2002, щорічних звітних наукових
конференціях викладачів хіміко-біологічного (природничого) факультету
Тернопільського державного педагогічного університету імені Володимира
Гнатюка, Тернопіль, 1992 – 2002 р.р.; симпозіумах: “Metals and Genes
Symposium”, Кентербері, 1997, 2001; ІІ Міжнародному Смакуловому
симпозіумі “Фундаментальні і прикладні проблеми сучасної фізики”,
Тернопіль, 2000, 41-му конґресі Європейських товариств токсикології
“Eurotox 2003”, Флоренція, 2003.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 49 праць, у тому
числі 32 – статті в наукових журналах (з них – 12 одноосібних), 1 стаття
в збірнику наукових праць, 1 навчальний посібник, 16 – матеріали і тези
доповідей на з’їздах, симпозіумах і конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 288 сторінках
комп’ютерного набору, складається зі вступу, огляду літератури, опису
матеріалів і методів досліджень, 6 розділів, присвячених викладу
отриманих результатів, їх аналізу та узагальнення, висновків, списку
використаної літератури, 8 додатків. Робота містить 96 рисунків, 97
таблиць. Бібліографічний список складає 511 джерел, з них 372 латиною.
Загальний обсяг ілюстрацій і таблиць – 70 сторінок, списку використаних
джерел – 56 сторінок.

Основний зміст

Огляд літератури. Проаналізовано сучасну інформацію про особливості
зв’язування йонів міді, цинку, марганцю та свинцю з тіоловими сполуками
в живих організмах та їх біологічну дію. Наведено інформацію про
структуру, властивості, функцію МТ та ГSH та зміни їх вмісту за дії
йонів важких металів у тварин, у тому числі і водяних. У результаті
аналізу встановлено, що наявна інформація недостатня для визначення
участі МТ прісноводних тварин у детоксикації цих йонів. Очевидною є
необхідність формування методологічних підходів до використання МТ
прісноводних тварин у біомоніторингу забруднення водного середовища та
порівняння чутливості цих потенційних біомаркерів токсичності з іншими,
апробованими.

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проводились на дворічках
коропа лускатого (Cyprinus carpio L.) масою 200 – 250 г (430
екземплярів) та двостулковому молюску беззубці лебединій (Anodonta
cygnea L.) з діаметром мушлі близько 10 см і масою 8 – 12 г (90
екземплярів). Тварин адаптували до лабораторних умов протягом 7 діб.
Молюски, в яких досліджували стан показників у природних умовах, після
відбору зі ставу утримувались у відстояній воді не більше доби.
Дослідних риб виловлювали траловим методом із ставків Тернопільського
обласного рибкомбінату (урочище Залісці). Молюсків збирали в травні та
вересні на мілководній ділянці Тернопільського ставу на глибині близько
50 см.

Експериментальні дослідження проводили в басейнах об’ємом 200 л з
кількістю риб з розрахунку 1 особина на 40 л води. Вміст кисню у воді
підтримували на рівні 7,0 – 8,0 мг/л, вуглекислого газу – 2,2 – 2,8
мг/л, рН – 7,6 – 8,0. Воду відстоювали і змінювали щодві доби.
Температура води коливалась в межах 100С – 180С залежно від сезону.
Тварин не годували.

У кожному лабораторному досліді одна група була контрольною, іншій
(іншим) у воду вносили солі металів. Вміст у воді Cu2+ (CuSO4) складав
0,01; 0,1, 0,2, 0,5 або 1,0 мг/л; Zn2+ (ZnSO4) – 0,1; 2,0 або 5,0 мг/л;
Mn2+ (MnCl2) – 0,13; 2,6 або 6,0 мг/л; Pb2+ (Pb(NO3)2) – 0,01; 0,2 або
0,5 мг/л в розрахунку на катіон. При дослідженні дії суміші вказаних
йонів вміст Zn2+ складав 0,1 мг/л, Cu2+ – 0,01 мг/л, Mn2+ – 0,13 мг/л,
Pb2+ – 0,01 мг/л. Для зручності у порівнянні трьох досліджуваних
концентрацій ми позначали їх як малу концентрацію (МК), середню
концентрацію (СК) і велику концентрацію (ВК). Відповідний вміст аніонів
у воді був на один або два порядки нижчим, ніж їх дозволений вміст у
рибогосподарських водоймах (Воробьев В.И., 1979) та вміст у акваріумах.

Тривалість дослідів з рибами становила для йонів міді 2, 7 і 14 діб,
свинцю – 7 і 14 діб, цинку, марганцю та суміші йонів – 14 діб, з
молюсками – 14 діб. Власні дослідження та літературні дані (Хлебович
В.В., 1981; Романенко В.Д. и др., 1991) свідчать, що цей термін є
достатнім для аклімації водяних тварин до дії екстремальних чинників.
Для аналізу використовували у коропа передню долю печінки, ентероцити,
зяброві дуги і плазму гепаринизованої крові, взятої із серця; в молюска
– травну залозу, зябра та мантію. Всі процедури з виділення й обробки
зразків проводились на холоді. Всі реактиви, крім нижче зазначених, були
фірми “Реахим” кваліфікації “хч”.

Розчин термостабільних сполук одержували з 10%-ного гомогенату тканини в
10 мМ трис-HCl буфері, рН 8,0 шляхом його центрифугування протягом 45
хв. за 10 000 g. Отриманий надосад інкубували 5 хв за 850С і знову
центрифугували в тих самих умовах. Надосад використовували для
дослідження. Термостабільні білки (ТБ) розділяли на фракції за допомогою
гель-проникаючої хроматографії на сефадексі G-75 (“Pharmacia”) в 10 мМ
трис-HCl буфері, рН 8,0. МТ ідентифікували за спектральними ознаками
(Olsson P.E. et al, 1989). Для одержання апотіонеїну фракцію МТ
інкубували в розчині EДTA з кінцевою концентрацією 100 мМ протягом 48
год за температури 40С (Мелконян В.З. и др., 1984). Фракції ТБ
досліджували за допомогою йонообмінної хроматографії на ДЕАЕ-целюлозі в
10 мМ трис-HCl буфері, рН 8,0 (Gruber C. et al., 2000), електрофорезу в
поліакриламідному гелі (ПААГ) за методом U.K. Laemmly (1970). Визначали
амінокислотний склад фракції МТ на амінокислотному аналізаторі ААА Т
339М. Для проведення електрофорезу та амінокислотного аналізу білки
піддавали ліофільній сушці протягом 28 год. за 38-390С і 0,1 атм.

Вміст тіолів (загальних печінки і небілкових тіолів тканин та в елюаті,
одержаному при хроматографії ТБ) вимірювали за допомогою реактиву
Еллмана (5,5–дитіобіс–2–нітробензойної кислоти) (Sedlak J., Lindsay
R.H., 1968). Для визначення вмісту SH-груп у фракції МТ розчин білку
витримували у 8 М розчині сечовини в присутності NaBH4 та ЕДТА
(Торчинский Ю.М., 1977). Вміст білків (загальних, термостабільних,
розчинних в 0,6 М KCl та в елюаті при хроматографії) визначали методом
O.H. Lowry et al. (1951), використовуючи як стандарт сироватковий
альбумін (“Sigma”). Для визначення включення рівномірно міченого гліцину
в розчині ТБ та небілковому розчині печінки коропа за 3 год до аналізу
зразків тканин рибам вводили внутрішньочеревно субстрат в розрахунку 1
Мбк на 100 г живої маси. Радіоактивність зразків вимірювали на рідинному
сцинтиляційному лічильнику (LKB, Швеція).

У тканинах тварин визначали загальну активність супероксиддисмутази
(СОД) [КФ 1.15.1.1] (Чевари С. и др., 1991), в низці дослідів –
активність Mn-СОД (Floreany М. et al., 2002), активність каталази [КФ
1.11.1.6] (Королюк М.А. и др.,1988). Оцінювали інтенсивність
пероксидації ліпідів (ПОЛ) за вмістом ТБК-активних продуктів у реакції з
2-тіобарбітуровою кислотою (ТБК) (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977),
або їх утворенням за активації ПОЛ (Тимирбулатов Р.А., Селезнев Е.Н.,
1981) та окиснювальну модифікацію білків (ОМБ) (Мещишен І.Ф., 1998).

Склад середньомолекулярних пептидів плазми крові (СМП) коропа вивчали
шляхом їх гель-хроматографії на сефадексі G-25 в 0,02 М розчині СН3СООН
(Туряница И.М. и др., 1991). Калібровку колонок при розподільчій
гель-хроматографії здійснювали за допомогою сироваткового альбуміну
(67,0 кДа), цитохрому с (12,3 кДа) та інсуліну (5,8 кДа) (всі маркери
фірми “Sigma”, США), вітаміну В12 (1,35 кДа, “Pharmacia”), ГSH (0,303
кДа, “Fluka”).

Вміст металів у тканині, розчині ТБ та їх об’єднаних фракціях вимірювали
після спалювання зразків у перегнаній нітратній кислоті в співвідношенні
1:5 (маса:об’єм) на атомно-абсорбційному спектрофотометрі С-115 (цинку,
міді, марганцю і заліза) або на спектрофотометрі S-600 (свинцю) і
виражали в мкг/г сирої маси тканини.

Вміст МТ у тканині обчислювали за формулою m(MT)=(2?(Zn)+?(Cu))·M(MT)/14
(?кг/г тканини), де ? – кількість металу у фракції, мкмоль/г тканини;
М(МТ) молярна маса МТ (6800 г/моль) (Kagi J.H.R., Shaffer A., 1988), 14
– кількість одновалентних йонів, зв’язаних з молекулою МТ, виходячи з
того, що в (-кластері при гетерометалевому складі зв’язується чотири
двовалентних йони, а в (-кластері – три двовалентних, або шість
одновалентних (Good M. et al., 1991). Введена нами модифікація у формулу
(Das K. et al., 2002) пов’язана із врахуванням одновалентного стану міді
в МТ.

За результатами визначення показників АПС тканин обчислювали коефіцієнт
їх антиоксидантного стану (КАС) як відношення сум показників стану
антиоксидантних (А) і прооксидантних (П) факторів: КАС = ?А/?П. Кожний
показник визначали за формулою: 1±(Мд–Мк)/Мк, де 1 – характеристика
показника в нормі, Мд і Мк – середньоарифметичні значення показників
відповідно дослідної і контрольної серій. До “А” відносили такі
показники як активність СОД, каталази, вміст небілкових тіолів у
тканині, до “П” – вміст ТБК-активних продуктів та ОМБ. За такої
кількості даних у контролі КАС становить 1,5. Проводили кореляційний
аналіз (Дёрффель К., 1994) взаємозалежності диференційних УФ-спектрів
ТБ, для одержання яких показники подавали у вигляді (Dd-Dk)/Dk, де Dd –
оптичне поглинання дослідного зразку, а Dk – контольного зразку за
однакової довжини хвилі.

Результати визначення показників фракцій ТБ та СМП плазми крові подані
як усереднені значення двох-трьох вимірів на об’єднаних з 4-5 тварин
зразках матеріалу (Olsson P.E. et al, 1989, Das K. et al., 2002). Інші
результати подавали у вигляді M(m, n=5-6. Вірогідність відхилення двох
рядів значень обчислювали з використання t-тесту Стьюдента.

Результати досліджень та їх обговорення

Термостабільні білки коропа та беззубки. Склад та властивості. На ТБ
припадає близько 3 % від загального вмісту білків у печінці коропа і
біля 12 % у тканинах беззубки, причому їх вміст є досить консервативним
показником за умов експерименту (табл. 1, 2).

При розподільчій хроматографії ТБ зі всіх досліджуваних тканин
одержується дві головні фракції (І і ІІІ) з М близько 67 і 6 кДа (рис.
1). За спектральними ознаками високомолекулярна (І) фракція ТБ
представлена типовим білками, які мають максимум поглинання близько 280
нм. Білки низькомолекулярної (ІІІ) фракції характеризуються специфічними
для МТ спектральними ознаками: смугою вбирання з максимумом близько 254
нм, що втрачається у апоформи, і відсутністю максимума поглинання
близько 280 нм (рис. 2). За показниками УФ-спектру, специфічними для МТ
(Мелконян В.З. и др., 1984; Ang S.G., Wong V.W., 1992; Das K. et al.,
2002), відзначені спільні ознаки білків ІІІ фракції, які відрізняють її
від І фракції (табл. 3).

Таблиця 1

Вміст термостабільних білків у печінці коропа за дії на організм йонів
міді, цинку, марганцю та свинцю протягом 14 діб, мг/г тканини, M(m, n=5

Відносна концентрація йонів у воді

Мідь (ІІ)

Цинк (ІІ)

Марганець (ІІ)

Свинець (ІІ)

Контроль 4,13(0,41 2,36(0,28 2,36(0,28 2,36(0,28

Мала 5,10(0,36* 2,98(0,13 2,62(0,07 2,64(0,22

Контроль 3,77±0,10 3,77±0,10 3,31±0,30 3,31±0,30

Середня 3,40±0,11* 3,19±0,18* 3,75±0,40 5,34±0,56*

Контроль 4,38±0,25 2,50(0,27 2,50(0,27 2,50(0,27

Велика 3,67±0,28? 2,08(0,15 1,84(0,20 2,45(0,32

Примітки: 1. – * – тут і далі відмінність порівняно з контролем
вірогідна, pP?? Oe oeoeoeoeoeoeoeoeoeeoeoeoeoeoeoeoeoeoeoeoeoeoeoeoe Oe F?TH* v ? „@ dh]„yy^„@ v z ? ? OUe-nna*II??????????FF „yy]„yy „@ „?]„yy^„@ „O ]„yy^„O „@ ]„yy^„@ `„? & _o [email protected] ?IIIaIaIaeI?I&IooMAAA h j? h pkd h h h h ]„`„ 5kd3 h h h h h h ¬ ® yoiaaaiyaaOIyOOOooAAo `„ ® h h h h h h h h h $ у коропа він у великому діапазоні доз акумулюється в МТ і активує антистресові системи організму, то у беззубки він накопичується в небілковому розчині і пригнічує антиоксидантний захист. Участь металотіонеїнів коропа в детоксикації йонів свинцю. За дії йонів свинцю характерними змінами профілю елюції ТБ печінки на сефадексі G-75 є посилення їх гетерогенності за рахунок фракцій середньої маси, які не мають ознак МТ. Білки з високим показником D254/D280 містяться у І фракції, тоді як ІІІ фракція за дії СК йонів свинцю втрачає ознаки МТ (табл. 4). За дії МК зростає вміст свинцю в І фракції ТБ та в небілковому розчині, але не в МТ. За дії СК у фракціях ТБ він не виявляється, хоча в тканині спостерігається його накопичення (рис. 9В). У печінці під впливом йонів свинцю відбуваються зміни вмісту тіолів, які залежать від концентрації металу і часу його дії. Вміст небілкових тіолів відповідає нормі або збільшується. Дослідження дії свинцю на вміст ГSH у тканинах морських риб (Thomas P., Juedes M.J., 1985, 1992) також свідчать, що збільшення цього показнику є характерною відповіддю організму до порогового вмісту свинцю 1 мкг/г тканини. Вміст білкових тіолів у більшості випадків істотно зменшується (рис. 7). Блокування білкових тіолів вважають головним чинником у пригніченні Са2+-залежних процесів і фосфорилювання білків у клітинах за свинцевої інтоксикації (Gurer H., Ercal N., 2000). Йони свинцю викликають у коропа оксидативний стрес вже за дії МК (рис. 8). Одночасно зменшується активність СОД і каталази, що вважається чутливою реакцією на свинцеву інтоксикацію (Sandhir R. et al., 1994). За дії вищих концентрацій зміни активності цих ферментів розбалансовані. Істотного оксидативного ураження зазнають ліпіди і білки. Спостерігається зростання гетерогенності СМП плазми крові, однак вихід фракції з М близько 1,5 кДа, характерної для “гострофазної” відповіді, незначний. Отже, результати дослідження дають підставу зробити висновок про те, що в печінці коропа відсутні механізми детоксикації надлишку свинцю, пов’язані з функцією МТ. Б Рис. 11. Вміст цинку, міді, марганцю та свинцю в термостабільних компонентах печінки коропа (А) та тканин беззубки (Б) за впливу на організм суміші їх йонів: К – контроль, Д – дія суміші йонів, 1- травна залоза, 2 – зябра. На рис. А реальні одиниці виміру вмісту менші від зображених для міді в 20, марганцю - в 100, свинцю - в 1000 разів Участь металотіонеїнів коропа і беззубки в детоксикації йонів важких металів за дії на організм їх експериментальної та природної сумішей. Оскільки найбільші адаптивні можливості МТ були виявлені за дії МК металів, ми використали в дослідженні комбінованої дії саме такі концентрації кожного з металів. За дії суміші йонів металів на коропа в профілі елюції ТБ при хроматографії на сефадексі G-75 спостерігається поява проміжної фракції, а в УФ-спектрах фракцій - істотні зміни поглинання, не пов’язані з ознаками МТ (табл. 4). Вміст цинку в термостабільних компонентах зростає, міді - зменшується в три рази, а марганцю і свинцю - не змінюється порівняно з контролем (рис. 11А). При цьому частка цинку в термостабільних компонентах від загального вмісту в тканині зростає порівняно з контролем з 29 до 46%, а міді і свинцю помітно зменшується (відповідно з 60 до 17% і з 44 до 21%). Надлишок цинку акумулюється переважно у І фракції і меншою мірою в МТ. Вміст міді в МТ зменшується до слідового, а в І фракції залишається без істотних змін. Зростає вміст тіонеїнзв’язаної форми марганцю. Свинець у складі ТБ не виявляється. Отже, кожний з металів за дії їх суміші виявив такі закономірності розподілу між МТ та іншими компонентами тканини, які характерні для його індивідуальної дії в двадцять і п’ятдесят разів вищих концентраціях. У тканинах молюсків за дії суміші зростає вміст ТБ (табл. 2). Їх склад стає більш гетерогенним, причому важкі фракції ТБ виявляють спектральні ознаки МТ (табл. 4). У беззубки ми спостерігали утворення олігомерів МТ лише за дії суміші, а з літератури відомо про появу у молюсків такої фракції за дії кадмію (Mackay E.A. et al., 1993). У тканинах збільшується вміст цинку, що пов’язано з його акумуляцією в ТБ. Створюється і надлишок міді, однак її вміст в ТБ не зазнає змін (рис. 11Б). Вміст марганцю в складі ТБ незначний, а свинець не виявляється. Вміст МТ в тканинах за дії суміші металів зростає в два рази. При порівнянні дії металів в суміші та індивідуально на коропа і беззубку видно, що здатність МТ у обох видів зв’язувати мідь в присутності інших металів значно погіршується. Разом з цим, у беззубки за дії суміші все ж підтримується нормальний вміст міді в МТ, а у коропа він значно зменшується порівняно з контролем, тоді як для акумуляції марганцю в МТ коропа, на відміну від МТ беззубки, створюються пріоритетні умови. Рис. 12. Вміст цинку, міді та марганцю в термостабільних компонентах тканин беззубки за умов перебування у природній водоймі: К – контроль, Д – став, 1- травна залоза, 2 – зябра За дії суміші йонів у коропа спостерігається одночасне зменшення активності СОД і каталази в печінці, однак вміст небілкових тіолів та продуктів окисної деструкції білків і ліпідів не зазнає змін порівняно з контролем. У тканинах молюсків дія суміші викликає помітну активацію ферментів антиоксидантного захисту. Особливо зростає активність каталази в зябрах, а утворення продуктів ПОЛ та ОМБ досить сильно пригнічується. В результаті інтегральний показник КАС у двох видів тварин істотно відрізняється (рис. 8). Отже організм молюска має значно досконаліші механізми для вироблення адаптивної відповіді, ніж коропа, причому їх прояви подібні за дії міді і її суміші. У термостабільних компонентах тканин беззубки зі ставу вміст цинку і марганцю більший, ніж у контролі. Однак, цей надлишок не акумулюється в ІІІ фракції (рис. 12). Вміст МТ у тканинах тварин менший, ніж у контролі, а їх спектральні ознаки зникають. Неефективність МТ гідробіонтів у зв’язуванні металів в умовах природного забруднення водойм відзначають й інші автори (Hamza-Chaffai A. et al., 1997; Olsvik P.A. et al., 2000). Разом з цим, зміни АПС тканин беззубки зі ставу мають добре виражену антиоксидантну спрямованість (рис. 8) за рахунок активації каталази та зростання вмісту небілкових тіолів. Отже, адаптація молюска до впливу досліджуваної природної суміші забруднювачів пов’язана з мобілізацією системи АПС і, зокрема, небілкових тіолів, тоді як металзв’язуюча функція МТ пригнічується. Аналіз одержаних результатів показує, що існує видова специфічність відповіді МТ коропа і беззубки на йони металу певноїв природи. Так МТ беззубки, на відміну від МТ коропа, здатні зв’язувати надлишок міді в тканині, причому частка цієї форми міді є досить значною. МТ коропа зв’язують також надлишок марганцю, істотно впливаючи на розподіл цього металу в тканинах. За дії суміші металів видова специфічність мідь- та марганець-зв’язуючої функції МТ проявляється яскравіше, ніж за окремої дії. У літературі ми не зустріли пояснень такої відмінності, хоча порівняно низька токсичність міді для безхребетних тварин відзначається й іншими авторами (Nassiri Y. et al., 2000). Серед досліджених властивостей МТ видову специфічність має співвідношення вмісту в них цинку і міді, що указує на відмінність МТ за ?/?- ?кладом доменів (Valls M. et al., 2001) і може мати прогнозуюче значення для виявлення типу відповіді організму на той чи інший вид токсиканту за дії окремо або в суміші. Металспецифічні склад і відповідь МТ коропа і беззубки можуть бути пояснені еволюційними особливостями комплексного механізму регуляції метаболічно активної форми того чи іншого металу, важливого для життєдіяльності. Це припущення підтверджується встановленою нами високою чутливістю і видоспецифічністю відповіді на дію міді СОД, яка виконує буферну функцію для міді у взаємозв’язку з МТ і ГSH (Ciriolo M.R. et al., 2001). Встановлено зв’язок між детоксикаційною функцією МТ та ступенем антиоксидантного захисту організму. Для властивостей МТ та АПС печінки коропа виявлені чіткі ознаки концентраційно залежної відповіді організму на токсиканти. Їх активізація, або “Hormesis” (Stebbing A.R.D., 1981) проявляється за дії МК металів як посилення спектральних ознак МТ та/або акумуляції ними металів у всіх дослідних групах. Більшість показників АПС за цих умов відповідають нормі, або їх зміни мають антиоксидантну спрямованість. За дії СК йонів металів вміст МТ та їх здатність зв’язувати метал-токсикант значно зменшуються, а спектральні ознаки послаблюються. За цих умов певне компенсаторне значення можуть мати олігомерні форми МТ, які акумулюють надлишок металів, що дозволяє оцінити СК як стадію компенсованого підвищення активності стресових систем. Цій концентрації відповідає найбільший діапазон відхилень від контролю показників АПС. За дії ВК йонів металів спостерігається зростанням вмісту продуктів пероксидації ліпідів та білків у тканині і зменшенням активності антиоксидантних ферментів, що свідчить про фазу вичерпання антистресових систем організму. Дослідження ТБ за цих умов свідчить про посилення їх олігомеризації. Надлишок металів за цих умов зв’язується з термолабільними компонентами тканин. Отже, ступінь ефективності зв’язування металів з МТ є показником їх токсичності. Використання інтегрованого показника КАС дозволило диференціювати ступінь змін АПС залежно від концентрації металу та виду організму. За розбалансування окремих компонентів АПС зміни КАС у обох організмів вірогідно корелюють із змінами активності СОД (r=0,85 при r(0,95, 21)=0,42). Таблиця 4 Типи змін диференційних спектрів І і ІІІ фракцій термостабільних білків тканин коропа і беззубки в експериментальних умовах: ? - “дзвоноподібна”, ? - “висхідна діагональ”, \ - “нисхідна діагональ”, ? -“зміщення” піку, - – не визначали, * - еталони, r(21, 0,99)=0,54 Чинни-ки Відносна концентра-ція йонів у воді Короп Беззубка Печінка Зябра Енте-роцити Травна залоза Зябра І ІІІ І ІІІ І І ІІІ І ІІІ Cu2+ Мала ? ?* - - - ?\ ? \ ? Середня \* ?* ? ? - ? ? ? ? Велика ? - - - - - - - - Zn2+ Мала ? ? - - - ? ? ? ? Середня ? ? ? - ? - - - - Mn2+ Мала ? \ - - - ? ? ? ? Середня ? ? ? ? ? - - - - Велика ? \ - - - - - - - Pb2+ Мала ? ? - - - - - - - Середня ? ? - - - - - - - Суміш Мала ? ? - - - ? ? \ ? Для всіх досліджених нами металів та їх суміші послаблення здатності МТ зв’язувати їх у малотоксичні комплекси супроводжується появою ознак токсичності, зокрема активацією ПОЛ. Свинець, який не акумулюється МТ, посилює ПОЛ вже за дії МК. Подібну дію має і мідь у коропа, тоді як у беззубки вона пригнічує ПОЛ. Марганець значно пригнічує ПОЛ у коропа, але посилює його у беззубки. Певні ознаки токсичності металів дозволяють поділити їх на групи. Так, відмінність впливу металів на білкові і небілкові тіоли узгоджується з їх належністю до відносно м’яких і жорстких основ і відповідає їх поведінці в системі in vitro (Maracine M., Segner H., 1988). Дія марганцю і свинцю особливо позначається на процесах, залежних від забезпечення йонами заліза. Мідь і цинк здатні викликати відповідь по типу “гострої фази” у плазми крові, мають подібний дозо-залежний вплив на СОД відповідно до подібних рис їх гомеостазу в печінці. При інтерпретації результатів варто також враховувати, що дія кожного металу викликає значні і специфічні зміни у гомеостазі інших металів, які можуть в свою чергу впливати на сигнальні механізми відповіді на стрес – індукцію стресорних білків – МТ, СОД тощо, діючи або безпосередньо на геном, або через генерацію активних форм кисню. Причому антагонізм між марганцем і міддю найкраще виявляється на рівні зв’язування з МТ. Аналіз одержаних результатів свідчить, що ефективним показником концентраційно-залежної і металспецифічної дії металів виявились диференційні спектри ТБ. За експериментальних умов спостерігалось чотири типи їх змін (табл. 4). “Дзвоноподібна” форма спектру низькомолекулярної фракції ТБ відповідає активізації відповіді з боку МТ, така ж форма високомолекулярної фракції ТБ свідчить про утворення олігомерів МТ. Всі три метали, яки виявили здатність до утворення високомолекулярних форм МТ - мідь, марганець і свинець - відомі здатністю каталізувати процеси аутоокиснення біомолекул із залученням їх SH-груп (Shen X.M., Dryhurst G., 1998; Velez-Pardo C. et al., 1995). “Дзвоноподібна” форма спектру в більшості випадків узгоджується із збільшенням у фракції вмісту металів, що відповідає відомостям про більшу ємність олігомерної форми МТ до металів, ніж мономерної (Wilhelmsen T.W. et al., 2002) і підтверджується кореляційним аналізом. Форма спектру у вигляді “висхідної діагоналі” узгоджується з втратою ознак метал-тіолатних кластерів. Рідко зустрівана форма “нисхідної діагоналі” виникає за дії таких сильних окисників як мідь і марганець у білків І фракції. “Зміщення” піку специфічне для дії цинку. Отже, проведене нами дослідження дозволяє зробити висновок про залежність детоксикаційної здатності прісноводних тварин щодо йонів міді, цинку, марганцю і свинцю від ефективності їх зв’язування металотіонеїнами у малотоксичні комплекси та визначити показники, які адекватно і кількісно відображають її. ВИСНОВКИ Здійснено системне дослідження участі металотіонеїнів коропа і беззубки в детоксикації йонів міді, цинку, марганцю і свинцю, в результаті якого з’ясовано зміни фізико-хімічних властивостей металотіонеїнів за підвищення вмісту металу-токсиканту в середовищі, а також показано наявність зв’язку між здатністю металотіонеїнів акумулювати токсикант та станом антиоксидантно-прооксидантної системи організму залежно від виду тварин, природи йонів металів, їх концентрації та часу дії. З тканин коропа і беззубки виділені металотіонеїни як термостабільні білки з молекулярною масою близько 6 кДа й ідентифіковані за спектральними ознаками, амінокислотним складом та утворенням ізоформ МТ-1 і МТ-2 при йонообмінній хроматографії. За спектральними ознаками та поведінкою при електрофорезі виявлені олігомерні форми металотіонеїнів. За складом металів металотіонеїни коропа належать до Zn-МТ, а металотіонеїни беззубки - до Zn,Cu-МТ. Металотіонеїни коропа і беззубки відіграють важливу роль у зв’язуванні міді в тканинах, але проявляють видову специфічність щодо участі в її детоксикації. Металотіонеїни коропа не зв’язують надлишок міді і зазнають олігомеризації за зростання її вмісту у складі термостабільних компонентів тканин (p

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020