.

Роль імунної системи і неспецифічної реактивності організму в патогенезі отруєнь фосфорорганічними пестицидами і синтетичними регуляторами росту росл

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 5383
Скачать документ

АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ

Жмінько Петро Григорович

УДК 615.9+577.3+612.017+616.008+615.099.08

Роль імунної системи і неспецифічної реактивності організму в патогенезі
отруєнь фосфорорганічними пестицидами і синтетичними регуляторами росту
рослин

14.03.06 – токсикологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя
Міністерства охорони здоров’я України.

Наукові консультанти:

член-кореспондент НАН і АМН України,

доктор медичних наук, професор

Каган Юрій Соломонович,

Інститут екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя

МОЗ України, керівник відділу токсикології;

член-кореспондент АМН України,

доктор медичних наук, професор

Проданчук Микола Георгійович,

Інститут екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя

МОЗ України, директор інституту.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Коваленко Валентина Миколаївна,
Інститут фармакології та токсикології АМН України, завідувач відділу
токсикології;

доктор медичних наук, старший науковий співробітник Жирнов Віктор
Валентинович, Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України,
завідувач відділу сигнальних систем клітин;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Томашевська
Людмила Анатоліївна, Інститут гігієни та медичної екології ім. О.М.
Марзеєва АМН України, завідувач відділу токсикологічних досліджень.

Провідна установа:

Інститут медицини праці, АМН України, м. Київ.

Захист відбудеться “ 18 ” травня 2005 р. о 1300 годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 при Інституті
фармакології та токсикології АМН України (03057, м. Київ, вул. Ежена
Потьє, 14).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фармакології та
токсикології АМН України (03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє, 14).

Автореферат розісланий “ 16 ” квітня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук І.В. ДановаЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА
РОБОТИ

Актуальність теми. Темпи виробництва і застосування хімічних засобів
захисту рослин весь час зростають. Значну кількість від загального
обсягу їх складають інсектициди, зокрема фосфорорганічні і пиретроїди
(R. Repetto, S.S. Baliga, 1996). На сьогодні в Україні розширюється
асортимент фосфорорганічних пестицидів (ФОП) і регуляторів росту рослин
(РРР) та спектр сільськогосподарських культур на яких вони
застосовуються (Перелік пестицидів і агрохімікатів, дозволених до
використання в Україні). Пестициди і РРР є біологічно активними
речовинами і широкомасштабне застосування їх в сільському господарстві
може негативно впливати на здоров’я людини.

Відомо, що основним в механізмі токсичної дії ФОП є блокування
холінестерази (ХЕ) і порушення функцій нервової системи (Ю.С. Каган,
1981; D.M. Maxwell, D.E. Lenz, 1992). Однак, між токсичністю і
інгібуванням активності ХЕ не завжди спостерігається пряма залежність
(С.Н. Голиков, 1972), інколи при отруєнні неспецифічні ефекти передують
специфічним (В.А. Желтов, 1980), а деякі ФОП, навіть за відсутності
інтоксикацій, викликають синдром віддаленої нейротоксичної дії (ВНД)
(M.K. Johnson, 1992; В.С. Валевский и др., 2003). Для синтетичних РРР
характерне порушення функцій центральної нервової системи і печінки
(С.П. Пономаренко, 1999), зниження імунної реактивності організму (С.Н.
Кузьминский, В.И. Попко, 1993). У працюючих з пестицидами та у
населення, яке проживає у районах з інтенсивним застосуванням засобів
захисту рослин, виявлено збільшення випадків алергічних і інфекційних
захворювань, імунодефіцит по Т-типу, тяжкий перебіг соматичної
патології, ріст ендокринопатій і онкологічних хвороб (М.З. Саидов и др.,
1990; К. Miller, 1995; B.D. Banerjee et al., 1996; I. Voccia et al.,
1999; Н.М. Недопитанська, 1999; N.T. Fear et al., 1999; В.Г. Бардов та
ін., 2000). За останнє десятиріччя збільшилось число гострих отруєнь
пестицидами, в тому числі і ФОП (M. O’Malley, 1997;

В.В. Афанасьев та ін., 1998; Г.М. Балан та ін., 2001). Негативний вплив
їх на здоров’я людей може бути пов’язаний з багатьма причинами (І.В.
Саноцький, 1998; В.Г. Бардов та ін., 1998; Л.Г. Засипка, 2001). Одною з
них є те, що токсиколого-гігієнічна регламентація їх проводиться без
урахування імунотоксичної дії, що знижує надійність раніше встановлених
нормативів. Крім того, ще недостатньо з’ясовані механізми регуляції
порушеного гомеостазу, що ускладнює прогнозування шкідливих ефектів і
розробку заходів профілактики.

Визнано, що основною системою детоксикації і збереження гомеостазу є
монооксигеназна гідроксилююча система (МОГС). В залежності від стану
МОГС метаболізм одних і тих же пестицидів може протікати різними
шляхами, направленими як на детоксикацію речовин, так і на підвищення їх
токсичності (Ю.С. Каган, 1981; Д.И. Метелица, 1982, С.С.Михайлов, И.Г.
Щербак, 1983). Поряд з МОГС важливе значення в токсичній дії
ксенобіотиків мають процеси сорбції на мембранах, зв’язування з білками
сироватки крові, депонування в ліпідах (С.Н. Голиков та ін., 1986; A.
Альберт, 1989). Білки, мембрани, ліпіди є “місцем втрат” на шляху до
мішені біологічної дії ксенобіотиків, що, в більшості випадків, сприяє
зменшенню їх токсичності (А.И. Луйк, В.Д. Лукьянчук, 1984; A. Альберт,
1989). Однак, взаємодія хімічних речовин з компонентами клітин і тканин
може мати і негативні наслідки в результаті зміни їх структури і функції
(Б.А. Курчий, 1988; T. Ogata, S. Manabe, 1990; Е.Л. Левицкий, Ю.И.
Губський, 1994; H. Racay et al., 1997; Л.Б. Бондаренко, В.М. Коваленко,
2000). Не виключено також, що зв’язування пестицидів з білками та
імунокомпетентними клітинами може викликати модифікацію імунних процесів
в організмі, що, в свою чергу, буде сприяти порушенню функції імунної
системи і розвитку патології. В зв’язку з цим, значна увага приділяється
дослідженню імунної системи, як мішені токсичної дії ксенобіотиків (L.
Koller, 1984; L.H. El-Sayed, 2001). Особливо важливою є проблема
аутоімунних уражень за дії ксенобіотиків, визначення їх механізмів,
зокрема ролі імунних комплексів у розвитку цих процесів та в формуванні
патології хімічної етіології (В.В. Сура та ін., 1980; А.Н. Климов, 1986;
D.A. Smith, D.R. Germolec, 1999; G.S. Cooper et al., 1999). Крім того,
залишається недостатньо з’ясованою роль імунної системи в токсичності,
детоксикації пестицидів і РРР, механізмах регуляції гомеостазу. Оскільки
деякі ФОП спроможні викликати ВНД, обумовлену демієлінізацією нервової
системи, то не виключено, що процесам деструкції можуть передувати
аутоімунні порушення організму. Механізм ВНД ще недостатньо вивчений, що
ускладнює пошук засобів ефективної терапії і профілактики цієї патології
(М. Lotti et al., 1986; C.D. Carrington, М.В. Abou-Donia, 1988; E.
Capodicasa, 1991; М.К. Johnson, 1992).

Висвітлені проблеми сучасної токсикології пестицидів і агрохімікатів
торкаються загальних механізмів їх токсичного дисгомеостазу, ролі
імунної системи в процесах детоксикації і патогенезі ВНД, викликаної
ФОП. Вирішення їх потребує комплексних токсикологічних досліджень і
тісно пов’язане з іншими задачами, в тому числі направленими на
профілактику патології хімічної етіології. Цим і визначається
актуальність даної роботи.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано
за основним планом науково-дослідних робіт Інституту екогігієни і
токсикології ім. Л.І. Медведя по проблемі “Екогігієна і токсикологія”:
“Изучение токсикодинамики и метаболизма новых избирательных
фосфорорганических пестицидов (циклофос, его изомеры и другие)”,

№ держреєстрації 01.83.0.079815; “Исследование механизмов избирательного
(токсического, отдаленного нейротоксического) действия
фосфорорганических и других пестицидов”, № держреєстрації 01.86.0004829;
“Токсикологическое изучение последовательного, комбинированного,
комплексного действия, процессов нитрозирования пестицидов в
интегрированной системе защиты зерновых культур”, № держреєстрації
01.880.076528; “Дослідження механізмів синергетичної дії пестицидів, що
застосовуються на Україні”, № держреєстрації 0194V017542;
“Експериментальне моделювання нейропаралітичної дії фосфорорганічних
ксенобіотиків, пошук засобів корекції цієї патології”, № держреєстрації
093V037425; “Оцінка небезпечності хімічних та біологічних засобів
захисту рослин в умовах імунодефіциту. Розробка адекватної
експериментальної моделі імунодефіциту за допомогою хімічних факторів
(циклофосфану)”, № держреєстрації 0195V025456); міждержавної НТП
фундаментальних досліджень ДКНТ “Високоефективні процеси виробництва
продовольства” за проектом 0.12.03.004 “Створення, оцінка і застосування
антистресових, біозахисних, дефоліантних та інших екологічно та
генетично безпечних регуляторів росту та розвитку рослин”; міжнародних
наукових програм (фонду Дж. Сороса, грант №653453) “Исследование
механизмов отдаленного нейротоксического действия фосфорорганических
веществ”.

Мета роботи. На основі експериментальних досліджень направленості і
вираженості порушень в імунній системі, зміни факторів неспецифічного
захисту організму при дії фосфорорганічних пестицидів і синтетичних
регуляторів росту рослин встановити їх роль в патогенезі інтоксикацій та
розробити профілактичні заходи.

Задачі дослідження. 1. Вивчити вплив ФОП (циклофоса і його ізомерів,
етафоса, гетерофоса та ін.) і синтетичних РРР (івіна, ресина, симарпа)
на імунну систему організму (клітинний і гуморальний імунітет) при
гострих, підгострих і хронічних інтоксикаціях.

2. Дослідити вплив ФОП (циклофоса і його ізомерів, етафоса, гетерофоса
та ін.) і синтетичних РРР (івіна, ресина, симарпа) на монооксигеназну
систему (1-у фазу детоксикації) при гострих, підгострих і хронічних
інтоксикаціях.

3. Визначити функціональний взаємозв’язок між показниками
монооксигеназної та імунної систем організму за умов гострої,
підгострої, хронічної дії ФОП і синтетичних РРР.

4. Встановити роль неспецифічних факторів захисту організму (зв’язування
з білками сироватки крові, імунні комплекси сироватки крові, взаємодія з
мембранами) в токсичній дії ФОП і синтетичних РРР.

5. Дослідити характер порушень в імунній системі за дії афоса і
триортокрезилфосфату. Визначити роль імунної системи в патогенезі
віддаленої нейротоксичної дії фосфорорганічних речовин.

6. Провести пошук засобів профілактики ускладнень ВНД (парезів і
паралічів) при отруєннях фосфорорганічними нейротоксикантами (афосом і
триортокрезилфосфатом).

7. Удосконалити підходи щодо встановлення безпечних рівнів ксенобіотиків
за імунологічними критеріями шкідливої дії та їх регламентування в
об’єктах навколишнього середовища із позицій імунотоксикології.

Об’єкт дослідження. Щури лінії Wistar, курки породи Leggorn за умов
отруєнь фосфорорганічними речовинами або синтетичними регуляторами росту
рослин (гострі, підгострі, хронічні інтоксикації).

Предмет дослідження. Встановлення характеру порушень імунної системи і
неспецифічних факторів захисту організму та визначення їх ролі в
патогенезі інтоксикацій, обумовлених ФОП і синтетичними РРР.

Методи дослідження. В роботі використані сучасні токсикологічні,
імунологічні, гематологічні, біохімічні, біофізичні, морфологічні,
фармакологічні, хімічні, статистичні методи досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів. Поглиблено уявлення щодо впливу
фосфорорганічних пестицидів і синтетичних регуляторів росту рослин на
монооксигеназну систему. Встановлено, що в токсикогенній стадії стресу
за умов їх гострої пероральної дії відбувається інгібування, підгострої
– індукція інтенсивності процесів деметилювання, гідроксилювання і
збільшення вмісту цитохрому Р-450. Індукція активності ферментів МОГС
призводить до активації метаболізму фосфорорганічних речовин, на що
вказує збільшення їх антихолінестеразної дії. Циклофос, симарп (хронічна
дія) та івін (субхронічна) чинять нестійкий інгібуючий ефект на процеси
деметилювання в печінці щурів.

Вперше встановлено, що рання реакція організму щурів на стресорний вплив
фосфорорганічних речовин і регуляторів росту рослин характеризується
збільшенням вмісту великодисперсних циркулюючих імунних комплексів,
функціональної активності нейтрофілів та лімфоцитів, активацією
окислювального метаболізму в нейтрофілах, що, в подальшому, забезпечує
елімінацію імунних комплексів і відновлення порушеного гомеостазу.
Виявлено функціональний взаємозв’язок між показниками монооксигеназної
та імунної систем, який має реципрокний характер і найбільш чітко
проявляються в токсикогенній стадії хімічного стресу.

Встановлено, що за умов хронічної дії циклофоса і симарпа вплив їх на
імунну систему щурів поглиблюється з часом і призводить до формування
імунодефіциту за Т-типом. На фоні хронічної інтоксикації гальмується
імунна відповідь на додатковий антигенний стимул (еритроцити барана), на
що вказує зниження титру гетерофільних гемагглютининів, рівня
циркулюючих імунних комплексів, функціональної активності нейтрофілів.

Вперше показано, що в період активного антитілогенезу у щурів знижується
імунна відповідь на вплив фосфорорганічних пестицидів (утворення
великодисперсних імунних комплексів, окислювальний метаболізм в
нейтрофілах), що призводить до збільшення їх токсичності,
антихолінестеразної і кумулятивної дії.

Вперше з’ясовано роль імунної системи в патогенезі віддаленої
нейротоксичної дії фосфорорганічних сполук. Встановлено, що у курок за
дії афоса і триортокрезилфосфату зміни в імунній системі наступають в
латентний період і прогресують з часом. Характер порушень свідчить про
розвиток аутоімунного процесу (зниження кількості Т- і В-лімфоцитів,

NK-клітин, Т-супресорів та збільшення кількості Тх, функції
В-лімфоцитів, рівня дрібнодисперсних імунних комплексів, титрів
аутоантитіл до антигену із нервових тканин). Виявлена пряма залежність
між ступенем аутоімунних порушень і вираженістю клінічних ознак ВНД.

Встановлено, що видоспецифічність ВНД обумовлена різним впливом
нейротоксикантів на імунну систему. У найменш чутливого виду (щурів), на
відміну від курок, за дії афоса і триортокрезилфосфату в крові
накопичуються великодисперсні імунні комплекси, які легко виводяться
клітинами макрофагальної системи, порушень аутоімунних реакцій, парезів
і паралічів не спостерігається, що підтверджує важливу роль імунної
системи у розвитку нейропатій.

Вперше показана можливість профілактики тяжких ускладнень ВНД за
допомогою імунодепресантів і гемокарбоперфузії. Встановлено, що
імунодепресант циклофосфан і гемокарбоперфузія (проведена в
допаралітичний період) гальмують розвиток ВНД, а саме зменшують
виразність клінічних ознак інтоксикацій і попереджають розвиток парезів
і паралічів.

Поглиблено уявлення щодо ролі нековалентного зв’язування
фосфорорганічних пестицидів з білками сироватки крові, сорбції ФОП і РРР
на мембранах в їх токсичності. Зв’язування ФОП з білками сироватки крові
зменшує їх токсичність і антихолінестеразний ефект, взаємодія з
мембранами залежить від ліпофільності молекул і за гострої дії
призводить до порушення структури і функції мембран.

Практичне значення одержаних результатів. На основі експериментальних
даних удосконалено методичні підходи щодо дослідження імунотоксичної дії
потенційно небезпечних хімічних речовин і токсиколого-гігієнічної
регламентації їх в об’єктах навколишнього середовища за імунологічними
критеріями шкідливості, що сприятиме підвищенню надійності нормативів,
зменшить імовірність їх корекції.

Розроблені способи прогнозування ВНД та профілактики тяжких ускладнень –
парезів і паралічів, які можуть бути використані при діагностиці і
лікуванні отруєнь нейропаралітичними фосфорорганічними речовинами.

Результати дисертаційної роботи впроваджені в навчальний процес на
кафедрі загальної гігієни медико-профілактичного факультету
Національного медичного університету імені О.О. Богомольця, кафедрі
біохімії біологічного факультету Київського національного університету
Тараса Шевченко, кафедрі гігієни та екології людини Київської медичної
академії післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика.

Матеріали роботи використані при реєстрації 8 пестицидів і РРР в
Україні, обгрунтуванні гігієнічних нормативів 4 речовин у повітрі
робочої зони, продуктах харчування і допустимої добової дози для людини,
що сприятиме підвищенню ефективності державного санітарного нагляду; при
розробці методичних документів, санітарних правил та норм: “Гігієнічна
класифікація пестицидів за ступенем небезпечності” (ДсанПіН
8.8.1.002-98. Київ, 1998); “Допустимі дози, концентрації, кількості та
рівні вмісту пестицидів у сільськогосподарській сировині, харчових
продуктах, повітрі робочої зони, атмосферному повітрі, воді водоймищ,
грунті” (ДСанПіН 8.8.1.2.3.4.-000-2001. Київ, 2001); Методичні
рекомендації “Дослідження імунотоксичної дії потенційно небезпечних
хімічних речовин при їх гігієнічній регламентації” МР 8.1.4.104-2003.
Київ, 2003); Інформаційний лист №130-95 “Спосіб прогнозування віддаленої
нейротоксичної дії хімічних речовин”.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто проаналізована вітчизняна і
зарубіжна література за проблемою, визначена мета і поставлені задачі,
обрані методичні підходи щодо експериментальних досліджень, проведені
експериментальні та теоретичні дослідження. Ідею щодо ролі імунної
системи в патогенезі ВНД фосфорорганічних нейротоксикантів сформовано
разом з науковим консультантом світлої пам’яті члена-кореспондента НАН
та АМН України проф. Ю.С. Кагана. Деякі дослідження виконані автором за
консультативною допомогою спеціалістів різного профілю: д.б.н. В.М.
Войціцького (дослідження на штучних фосфоліпідних мембранах), к.б.н.
Н.М. Недопитанської (патоморфологічні дослідження), к.б.н. В.Г. Шуляк та
к.м.н. В.Г. Ларіонова (гематологічні дослідження при дії циклофоса,
симарпа, ресина), к.х.н. М.В. Письменної (хроматографічний аналіз
концентрацій пестицидів в біосубстратах).

Автором самостійно здійснена статистична обробка, проведений
кореляційний, регресійний та факторний аналіз експериментальних даних,
аналіз і узагальнення отриманих результатів досліджень, сформульовані
основні положення дисертаційної роботи та висновки.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації
доповідались та обговорювались на науково-практичній конференції АН УРСР
і ВАПВО СВ (Київ, 1991); міжнародному симпозіумі “Health, Safety and
Ergonomic Aspects in Use of Chemicals in Agriculture and Forestry”
(Київ, 1994); 3-ій міжнародній конференції “Регуляторы роста и развития
растений” (Москва, 1995); XXXV Європейському конгресі токсикологів
(ЄВРОТОКС’96, Аліканте, 1996); 7-ій міжнародній конференції щодо
комбінованих ефектів факторів навколишнього середовища (ІССЕF’96,
Тампере, Фінляндія, 1996); 6-ій міжнародній конференції Neurotoxicology
Association INA-6 (Шегед, Угорщина, 1997); міжнародному симпозіумі ЕСРА
з питань Європейської системи реєстрації засобів захисту рослин (Київ,
1998); науково-практичній конференції “Актуальні проблеми екогігієни і
токсикології” (Київ, 1998); VIII міжнародному конгресі токсикологів
“Chemical Safety for the 21-th Century” (Париж, Франція, 1998);
конференції, присвяченій 75-річчю з дня народження члена-кореспондента
НАН і АМН України, професора Ю.С. Кагана “Актуальні проблеми
токсикології” (Київ, 1999); 1-му з’їзді токсикологів Росії (Москва,
1999); конгресі ЄВРОТОКС 2001 (Стамбул, Туреччина, 2001); 1-му з’їзді
токсикологів України (Київ, 2001); науково-практичній конференції
“Актуальні проблеми токсикології, гігієни та аналітичної хімії
пестицидів і агрохімікатів” (Київ, 2003); другому з’їзді токсикологів
Росії (Москва, 2003).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 29 наукових праць: 19
статей у профільних фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 1
керівництво з токсикології, 1 патент на винахід, 3 статті у збірниках
наукових праць, 5 робіт у матеріалах і тезах з’їздів, конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу,
огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, 6 розділів власних
досліджень, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних
джерел літератури. Дисертація викладена на 445 сторінках, ілюстрована
112 таблицями і 47 рисунками. Перелік літератури включає 506 джерел (168
вітчизняних і 338 зарубіжних авторів).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. В роботі використано 19 хімічних
речовин (15 – фосфорорганічних, 4 синтетичних РРР).

Дослідження проведені на 1614 статевозрілих щурах самцях лінії Wistar і
250 курках породи Leggorn, 6 кролях.

Гостру токсичність речовин (ЛД50) при введенні в шлунок розраховували за
методом В.Б. Прозоровського (С.Н. Лапач та ін., 2002). Характер гострої
дії ФОП – етафоса, гетерофоса, ЄШ-7, циклофоса та його ізомерів; РРР –
івіна, ресина, симарпа на організм щурів визначали при пероральному
надходженні в організм у дозах, відповідних 1/2 ЛД50 (одноразово),
підгострої дії – у дозах, відповідних 1/5 ЛД50 (трьохразово).
Субхронічну пероральну дію івіна досліджували у дозах, відповідних 1/10
ЛД50 при надходженні в організм упродовж 2 міс., хронічну дію циклофоса
і симарпа – у дозах, відповідних 1/100 і 1/1000 ЛД50 (6 міс.). Вибір доз
і строків досліджень обумовлений характером моделювання гострих,
підгострих, хронічних інтоксикацій.

Механізм ВНД ФОП досліджено на моделі класичних нейротоксикантів –
триортокрезилфосфату (ТОКФ) і
О,О-дифеніл-1-ацетокси-2,2,2-трихлоретилфосфонату (афос). Циклофос –
О,S-диметил-О-циклогексилтиофосфат використаний у якості негативного
контролю. Дослідження виконані на курках в ізотоксичних (за активністю
ХЕ) дозах (афос – 200 мг/кг, ТОКФ – 500 мг/кг, циклофос – 10 мг/кг) і
щурах в дозах, відповідних 1/2 ЛД50 (афос – 1500 мг/кг, ТОКФ – 750
мг/кг).

Мембранотропну дію ФОП і РРР in vitro досліджували на штучних
фосфоліпідних мембранах (ШФМ) сформованих на фільтрах “Synpor”
(Чехословаччина) з діаметром пор 0,17; 0,85 та 4,0 мкм, модельній 2-х
фазній водно-ліпідній системі (в концентраціях 1?10-4-1?10-11 моль/л) та
еритроцитах щурів (1?10-10, 1?10-6 і 1?10-4 моль/л). Стандартизацію
кількості еритроцитів проводили за вмістом гемоглобіну (5,8 г%). В
умовах in vivo вивчали стан мембран еритроцитів і мітохондрій
гепатоцитів щурів при пероральному введенні речовин в організм у дозах,
відповідних 1/2 ЛД50. Проникнення сполук через мембрани оцінювали за
величиною електричного опору (Rм), в залежності від концентрації та
діаметру пор ШФМ. Вплив на властивості границі розподілу фаз “ліпід –
вода” досліджували за зміною граничного потенціалу (??), динамічної
ємності електричного опору (?Rг), поверхневого натягу (??) (O.A. Belyeva
et al., 1982; L.A. Drachev et al., 1982). Органічну фазу формували
нашаруванням на водну поверхню розчину азолектина (суміш фосфоліпідів із
бобів сої, фірми Sigma, США) в н-декані – 10 мг/мл. Для афоса,
оксифосфоната і малаоксона досліджували їх вплив на електричний опір
бішарових ШФМ, які формували шляхом нанесення на отвори в тефлоновій
кюветі розчину азолектина в н-гептані – 20 мг/мл.

Інтенсивність перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) в еритроцитах і
мітохондріях гепатоцитів щурів визначали за вмістом малонового
диальдегіду (И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили, 1977; Г.Г. Гацко та ін.,
1982). Досліджували резистентність еритроцитів до перекису водню (А.А.
Покровский, А.А. Абраров, 1964) та температури (+50оС) за ступенем
гемолізу (D.A. Kalbhen, E. Schneider, 1972), активність
Na+,K+-АТФази за методом Ю.І. Вахнер та

І.К. Капарік (Метод. руководство, 1989). Пасивний набряк мітохондрій
визначали на спектрофотометрі по зменшенню світлорозсіювання в ізо-
(0,25 М) і гіпотонічному (0,07 М) розчинах сахарози, в яких містилися
мітохондрії, при довжині хвилі 520 нм (Х. Эллингер, 1989). Вміст білку в
мітохондріях визначали за методом O.H. Lowry et. al. (1951), активність
сукцинатдегідрогенази (СДГ) – за реакцією окислення янтарної кислоти в
фумарову, цитохромоксидази (ЦО) – за методом S.Cooperstein et al. (Р.С.
Кривченкова, 1977).

В дослідах щодо з’ясування ролі комплексоутворення ФОП з білками у їх
токсичності використані ліофілізований альбумін сироватки крові людини
(ЛСА) фірми “Reanal” (Угорщина), IgM людини фірми Sigma (США) та цільна
сироватка крові щурів, кролів, курок і людини. Ступінь зв’язування ФОП з
ЛСА і білками сироватки крові ссавців визначали за методом рівноважного
діалізу (В.Д. Лук’янчук, А.И. Луйк, 1983), а також з ЛСА і IgM – за
молярною концентрацією інгібітора (І50), яка гальмує активність ферменту
холінестерази на 50%. В дослідах використана чиста ацетилхолінестераза
(АХЕ) еритроцитів людини, АХЕ нативних еритроцитів і ХЕ сироватки крові
щурів. Активність ХЕ (в умовах in vitro і in vivo) визначали за методом
S. Hestrin (1949).

Оскільки більшість пестицидів піддаються процесам окислення (Ю.С. Каган,
1981), то вплив ФОП і РРР на МОГС печінки щурів оцінювали за
інтенсивністю процесів N-деметилювання амідопірину (I. Cochin, I.
Axelrod, 1959), інтенсивністю п-гідроксилювання аніліну (И.И. Карузина,
А.И. Арчаков, 1977). Вміст цитохрому Р-450, вільних радикалів (ВР),
залізосірчаних білків (ЗСБ) та нітрозильних комплексів в тканині печінки
визначали методом електронного парамагнітного резонансу (ЕПР) в умовах
низькотемпературної стабілізації в рідкому азоті (J. Hashimoto et. al.,
1962). Для циклофоса активність цитохрому Р-450 оцінювали за методом T.
Omura, R. Sato (1964).

При гострій і підгострій дії ФОП та РРР на організм щурів досліджували
низку показників неспецифічної резистентності організму (НРО), які
широко використовуються в сучасній імунології. Титри гетерофільних
гемагглютининів (ГГА) визначали за реакцією Пауля-Бунеля (Е.Ф.
Чернушенко, Л.С. Когосова, 1978), рівень ЦІК сироватки крові – за
здатністю їх осідати в поліетиленгліколі (ПЕГ) (Ю.А. Гриневич, А.Н.
Алферов, 1981), активність лізоциму в сироватці крові – турбідиметричним
методом (В.С. Карпенко та ін., 1977). Для деяких речовин визначали
кількість лейкоцитів, досліджували гемограму крові за допомогою
уніфікованих клініко-лабораторних методів (В.В. Меншиков, 1982),
функціональну активність нейтрофілів – за НСТ-тестом (Ю.І. Бажора та
ін., 1981), загальний білок у сироватці крові – за біуретовим методом
(Г.А. Кочетов, 1980) та фореграму білку сироватки крові – за допомогою
електрофорезу на папері (Р.П. Виноградова та ін., 1977).
Функціонально-метаболічну активність лейкоцитів оцінювали за активністю
кислої фосфатази в лімфоцитах і нейтрофілах (Ф.Г. Хейхоу, Д. Кваглино,
1983). Кількість природних кілерів (NK-клітин) визначали за
ультраструктурою лімфоцитів (Л.П. Киндзельский та ін., 1986).

В хронічних і субхронічних експериментах досліджували стан імунної
системи щурів за кількістю лейкоцитів і формених елементів крові,
активністю лізоциму, титрами ГГА, рівнем ЦІК, функціональною активністю
нейтрофілів за методами, зазначеними вище. Функціональну активність

Т-лімфоцитів вивчали за реакцією бластної трансформації лімфоцитів
(РБТЛ) на дію мітогену фітогемагглютинину (Метод. руководство, 1989).
Досліджували коефіцієнти маси тимуса і селезінки, як інтегральні
показники імунотоксичної дії ксенобіотиків, та характер змін в їх
морфоструктурі

(А. Хем, Д. Кормак, 1983). При хронічній дії циклофоса визначали
розподіл ізомерів у внутрішніх органах, в тому числі у тимусі і
селезінці, газохроматографічним методом, розробленим к.х.н. М.В.
Письменною. Для оцінки реактивності імунної системи на додатковий
антигенний стимул і встановлення порогових і недіючих рівнів хронічної
дії циклофоса та симарпа за їх впливом на імунну систему проводили
імунізацію тварин еритроцитами барана, визначали рівень ГГА і ЦІК у
сироватці крові, функціональну активність нейтрофілів.

На моделі ФОП вивчали залежність їх токсичності від стану імунної
системи інтактних і імунізованих еритроцитами барана щурів. Імунізацію
тварин проводили на 1 і 7 добу (0,5 мл суспензії еритроцитів барана,
внутрішньочеревинно). В період активного антитілогенезу (на 14 добу)
визначали ЛД50, середній час загибелі тварин (ЕТ50) (Г.Н. Красовский та
ін., 1982), індекс кумуляції (Ікум) (Б.М. Штабский, Ю.С. Каган, 1974) та
клініку гострого отруєння. При надходженні препаратів в організм
інтактних і імунізованих щурів в дозах, відповідних 1/2 ЛД50, через добу
визначали активність АХЕ еритроцитів і головного мозку, рівень ЦІК у
сироватці крові. На прикладі етафоса (при одноразовому пероральному
введенні в організм, 1/2 ЛД50), досліджена залежність специфічної дії
ФОП від стану НРО інтактних та імунізованих щурів, за методами,
зазначеними вище.

З метою з’ясування патогенезу ВНД афоса і ТОКФ через 3 і 7 діб
(латентний період), 14 діб (допаралітичний період) і 21 добу
(паралітичний період) вивчали стан організму курок і щурів за
клінічними, гематологічними та імунологічними показниками. Досліджували
морфологічний склад периферичної крові, визначали кількість Т-, В- і
0-лімфоцитів за активністю кислої фосфатази (Н.С. Кисляк, Р.В. Ленская,
1971), Т-хелперів (Тх) і Т-супресорів (Тс) – активністю кислої
неспецифічної естерази (J. Mueller et al., 1975), NK-клітин – за їх
ультраструктурою. Функціональну активність Т-лімфоцитів вивчали за РБТЛ
периферичної крові (И.А. Болотников, Ю.В. Конопатов, 1987), В-лімфоцитів
– титром ГГА в реакції Пауля-Бунеля, нейтрофілів – НСТ-тестом.
Досліджували рівень ЦІК в сироватці крові та їх дисперсність (П.В.
Стручков та ін., 1985). Титри аутоантитіл до антигенів із нервової
тканини інтактних курок і з ознаками ВНД та печінки визначали за
реакцією пасивної гемагглютинації за Бойденом (Метод. рекомендации,
1980). Тканеві антигени готували за методом Р.Ф. Аверкиної (1967),
хімічні антигени – за методом Г.М. Вольнової (1973). Кількість
антитілоутворюючих клітин (АУК) в периферичній крові визначали за
реакцією Ерне в модифікації Клемпарської (Метод. рекомендации, 1976).

Сенсибілізуючі властивості ТОКФ, афоса і циклофоса вивчали при
внутрішньошкірній ін’єкції (О.Г. Алексеева, Л.А. Дуева, 1978) та з
повним ад’ювантом Фрейнда (0,5 мл) при введенні в апоневроз лапок.
Тестування тварин проводили на 20 добу. Реакцію шкіри оцінювали за
п’ятибальною уніфікованою шкалою (Метод. вказівки, 1980), досліджували
реакції дегрануляції тучних клітин – РДТК (Метод. руководство, 1989),
специфічний лізис лейкоцитів (РСЛЛ), пасивну гемагглютинацію за Бойденом
(з хімічним і тканевим антигеном із нервової тканини і печінки).
Визначали титри ГГА, рівень ЦІК і проводили їх диференціацію за
дисперсністю.

Адоптивний перенос ВНД інтактним куркам проводили за допомогою
сенсибілізованих (in vitro та in vivo) лімфоцитів. В умовах in vitro
лейкоцити курок сенсибілізували афосом або ТОКФ (0,01%) упродовж 2-х
годин при 39?С в середовищі 199 з ембріональною телячою сироваткою і
глютаміном (Т.А. Кулакова, Н.В. Рудаков, 1980). Після інкубації
лейкоцити центрифугували, відмивали, підраховували їх кількість і
життєздатність за поглинанням 0,02% розчину трипанового синього.
Сенсибілізовані лейкоцити вводили куркам в кількості 6,0 млн. (для
афоса) і 5,4 млн. (для ТОКФ) в 0,5 мл фізіологічного розчину
внутрішньовенно 4 рази з інтервалом 7 діб. Реєстрували клінічні ознаки
ВНД, масу та приріст маси тіла тварин, досліджували рівень ЦІК і титр
ГГА у сироватці крові, кількість лейкоцитів, Тх та Тс, гемограму крові.
В умовах in vivo у сенсибілізованих курок забирали кров із вени,
виділяли лейкоцити, розводили фізіологічним розчином і визначали їх
життєздатність. Сенсибілізовані лейкоцити (14,5 млн. в 0,5 мл
фізіологічного розчину) вводили внутрішньовенно 4 рази з інтервалом 7
діб. Досліджували приріст маси тіла курок, поведінку, клінічні ознаки
ВНД.

Для профілактики нейропатій у курок використовували імунодепресант
циклофосфан. Вибір циклофосфану базується на тому, що він, пригнічує
активність всіх клонів імунокомпетентних клітин, зокрема Тх (Ю.К.
Наполов, К.Б. Борисов, 1991) і є ефективним при лікуванні
демієлінізуючих захворювань (розсіяного склерозу). Циклофосфан вводили
куркам внутрішньом’язово в дозі 20 мг/кг упродовж 4 діб. На 4 добу
вводили афос в дозі 100 мг/кг або 200 мг/кг, ТОКФ – 250 мг/кг. Через 3
дні після введення ФОП знову вводили циклофосфан (20 мг/кг упродовж 3
діб). Реєстрували клінічні ознаки інтоксикації, приріст маси тіла,
досліджували кількість Тх і Тс, функціональну активність Т- і
В-лімфоцитів, гемограму крові.

Для попередження виникнення парезів і паралічів при отруєннях
нейропаралітичними ФОП використовували гемокарбоперфузію для елімінації
патогенних ЦІК, аутоантитіл та корекції порушень імунної системи. ВНД
викликали афосом при пероральному введенні в організм курок в дозі 200
мг/кг. Гемокарбоперфузію проводили на 10-14 добу після отруєння. Для
гемосорбції використано твердофазний пористий вуглецевий гемосорбент
марки СКН-2к, який має високі сорбційні властивості. (В.Г. Николаев,
1984; V.V. Strelko et al., 1994). Об’єм перфузії становив 2-3 об’єму
циркулюючої крові. До гемокарбоперфузії, під час гемокарбоперфузії та на
21 день після отруєння (14 день після гемокарбоперфузії) досліджували
кількість лейкоцитів, гемограму крові, імунологічні показники: кількість
NK-клітин, функціональну активність нейтрофілів, кількість Т-, 0- і
Т-лімфоцитів, Тх і Тс, функціональну активність Т-лімфоцитів і
В-лімфоцитів, рівень ЦІК у сироватці крові за вищевказаними методами.
Реєстрували клінічні ознаки ВНД.

Результати досліджень оброблені методами параметричної статистики за
спеціальними програмами (А.М. Шевченко та ін., 1987). З’ясування
взаємозв’язків між дослідженими показниками проводили за допомогою
кореляційного та дисперсійного аналізу (О.П. Минцер та ін., 1982; С.Н.
Лапач та ін., 2002). Для аналізу всієї сукупності взаємопов’язаних
властивостей досліджуваних параметрів, з урахуванням характеру їх
зв’язків, використовували метод головних компонент (К. Иберла, 1972; Г.
Харман, 1972).

Результати досліджень та їх обговорення. Дослідження ролі
монооксигеназної і імунної систем організму в токсичній дії
фосфорорганічних пестицидів і синтетичних регуляторів росту рослин.
Встановлено, що за умов гострої пероральної дії (1/2 ЛД50) ФОП:
гетерофос, етафос, циклофос і його тіоловий ізомер, ЄШ-7 через 3-24 год.
інгібують активність АХЕ еритроцитів щурів на 86-100%. Відновлення
активності АХЕ відбувалось на 7-15 добу, за винятком етафоса, який в
кінці досліджень інгібував активність АХЕ на 23%. В період виражених
холінергічних ознак інтоксикації (1 доба) спостерігалось найбільш
значиме зниження активності N-деметилази печінки: за дії циклофоса – на
84%, інших речовин – 41-60%. Вміст цитохрому Р-450 та ЗСБ знижувався в
меншій мірі (р?0,05), ніж активність N-деметилази печінки. Відновлення
активності N-деметилази печінки відбувалось (приміром в 2 рази) швидше,
ніж АХЕ. Вплив ФОП на НРО характеризувався фазовими змінами. Збільшення
активності лізоциму превалювало над інгібуванням і в порівнянні з
контролем через 1 і 3 доби становило 11-34% (р?0,05), через 7 діб –
33-104% (р?0,05). Оскільки лізоцим інтенсивно виділяється нейтрофілами
(Р.А. Томпсон, 1983; П.Ф. Забродский, 2002), то даний факт може бути
пов’язаний з активацією метаболічних процесів в нейтрофілах крові.
Спостерігалась тенденція до збільшення титру ГГА в сироватці крові.
Найбільший рівень ЦІК виявлений у токсикогенній фазі (на 45-199%) і на 7
добу досліджень (86-193%) – в момент відновлення активності АХЕ і МОГС.

За умов підгострої пероральної дії (1/5 ЛД50) ФОП антихолінестеразний
ефект був помірно вираженим, але для гетерофоса і ЄШ-7 поглиблювався з
часом, відновлення ферменту відбувалось на 15 добу, за винятком етафоса,
який в цей період часу інгібував активність АХЕ еритроцитів в 2 рази
більше, ніж при гострій дії. Виявлено зниження активності АХЕ (на 27%) і
у тіонового ізомеру циклофоса, що пов’язано з його ізомеризацією під
впливом МОГС в тіоловий (Е.А. Ершова, П.Г. Жминько, 1989). Зміни значень
показників МОГС мали фазовий характер і не співпадали в часі. Циклофос і
його тіоновий ізомер, етафос і ЄШ-7 викликали індукцію активності
N-деметилази печінки (р?0,05) на 80%, 52%, 29%, 21% відповідно. За дії
циклофоса збільшення активності п-гідроксилази печінки у 2,6 рази було
більшим, ніж N-деметилази. Етафос викликав слабку, але стійку індукцію
МОГС. Тіоловий ізомер циклофоса інгібував активність МОГС в усі строки
досліджень на 48-59%. Підвищення вмісту ВР було незначним (10-29%), за
винятком гетерофоса – 58% і спостерігалось у той же час, що й індукція
МОГС, і це може бути пов’язано як з інтенсифікацією обміну речовин
(Ажипа Я.И., 1983), так і з генерацією активних форм кисню (О.И.
Цебржинский, 1992). Індукція активності лізоциму проявлялась через 1 або
3 доби і становила для гетерофоса, етафоса і ЄШ-7 відповідно 45%, 75% і
33%. Тіоновий ізомер циклофоса знижував активність ферменту лише через 1
добу на 76%. Максимальний рівень ЦІК спостерігався через 3 доби
(105-198%, р?0,05) і в кінці досліду приходив до норми.

РРР, як і ФОП, в залежності від дози і строків досліджень чинили
різноспрямовану дію на активність ферментів МОГС. За гострої дії симарп
і івін знижували N-деметилазну активність на 57% і 35%, п-гідроксилазну
– на 67% і 23% (р?0,05) відповідно. Ресин в токсикогенній стадії
збільшував

п-гідроксилазну активність на 73% і знижував N-деметилазну активність на
36%. Для івіна характерним було збільшення вмісту окисленої форми
цитохрому Р-450 на 73-115% і нітрозильних комплексів у 3-5 разів, яке
зберігалось на тому ж рівні і в менших дозах (12,6 і 1,26 мг/кг), що
вказує на активацію ферментативних систем, які відповідають за
денітрозування NO-попередників. Оскільки ендогенний NO виконує в
організмі важливі регуляторні функції (M.J. Szabolcs et al., 1998; T.
Sardon et al., 2004), то гіперпродукція його може призвести до розвитку
різної патології, що потребує подальших досліджень.

Зміни показників НРО за гострої дії івіна характеризувались збільшенням
абсолютної кількості нейтрофілів і їх функціональної активності в усі
строки досліджень на 36-141%. В крові виявлені плазматичні клітини.
Рівень ЦІК у сироватці крові підвищувався тільки на 7 добу на 123%. За
дії ресина в усі строки досліджень збільшувались активність кислої
фосфатази в лімфоцитах на 41-83% і нейтрофілах – на 24-51%, титри ГГА –
на 59%. Підвищення рівня ЦІК і вмісту ?-глобулінів у сироватці крові
спостерігалось тільки в токсикогенній стадії на 56% і 29% (р?0,05)
відповідно. Симарп за гострої дії упродовж доби викликав нейтрофільоз,
лімфоцитопенію. На 3 добу спостерігалась нейтропенія, яка обумовлена
руйнуванням клітин (каріоліз, хроматиноліз, вакуолізація ядра і
цитоплазми), виявлена підвищена кількість плазматичних клітин,
пролімфоцитів і атипічних лімфоцитів. Цитотоксична дія симарпа
супроводжувалась зниженням функції нейтрофілів на 52%. Їх функціональна
активність компенсувалась збільшенням загального числа нейтрофілів в
крові. Рівень великодисперсних ЦІК збільшувався на 75% і з відновленням
активності нейтрофілів приходив до норми.

При підгострій дії ресин викликав нестійку індукцію N-деметилазної
активності на 21%, п-гідроксилазної – на 73%, збільшення вмісту
цитохрому Р-450 на 48%. Івін через 3 доби інгібував N-деметилазну
активність на 48%, в подальшому спостерігалась індукція ферменту – на
90%. Їх вплив на НРО характеризувався невираженим лейкоцитозом,
нейтрофільозом і лімфоцитопенією, збільшенням рівня ЦІК на 56-78%,
функціональної активності нейтрофілів – на 55-156% та лімфоцитів –
50-225%. Збільшення вмісту ?-глобулінів – на 35% виявлено тільки за дії
івіна.

Таким чином, направленість (індукція або інгібування) і ступінь змін
активності МОГС під впливом ФОП і РРР залежать від дози і часу дії на
організм. За умов гострих і підгострих інтоксикацій, в момент
інгібування МОГС, спостерігається підвищення імунної реактивності
організму, що вказує на існування реципрокних взаємозв’язків між
вказаними системами. Метаболічна активація нейтрофілів і лімфоцитів
сприяє зменшенню рівня ЦІК, що знижує токсичну дію ксенобіотиків.
Оскільки лімфоцити і нейтрофіли є фіксаторами токсинів, а також одним із
місць метаболічних перетворень (М. Lund-Pero et. al., 1989; Є.А.
Имельбаева, 1997; А.Ф. Сафина, 1999), то виявлені зміни НРО можна
розглядати як такі, що направлені на детоксикацію і збереження
гомеостазу. Оскільки антихолінестеразна дія гетерофоса, етафоса, ЕШ-7 і
тіонового ізомеру циклофоса підвищувалась при індукції МОГС, то цей факт
можна пояснити їх активацією і утворенням більш токсичних сполук (Є.А.
Єршова та ін., 1988, 1989).

При субхронічній дії івіна в дозі 130 мг/кг зміни НРО наступали раніше,
ніж МОГС і мали фазовий характер. Через місяць спостерігались
нейтрофільоз, зниження функціональної активності нейтрофілів на 49%,
титру ГГА – на 13%, збільшення рівня ЦІК у сироватці крові – на 75%.
Через 2 місяці інгібування N-деметилазної активності становило 76%. В
цей час збільшувалась метаболічна активність нейтрофілів в 2 рази,
рівень ЦІК не відрізнявся від контролю, що вказує на їх елімінацію.
Аналогічні дані окислювального метаболізму нейтрофілів щурів виявлені
при субхронічній дії 2,4-Д кислоти (Р.Р. Абеллузіна та ін., 2000).

При хронічному надходженні в організм щурів циклофос лише в дозі 6,3
мг/кг чинив виражений антихолінестеразний ефект. Зниження активності АХЕ
еритроцитів становило 79% і в 2 рази було більшим, ніж ХЕ печінки і
сироватки крові. Виявлено накопичення ізомерів циклофоса в різних
тканинах щурів, приблизно в рівному ступені. Пік накопичення тіолового
ізомеру циклофоса приходився на четвертий (в тимусі – 0,19 мкг/г, жиру
сальника і легенях – 0,08 мкг/г, печінці і селезінці – 0,04 мкг/г) і
шостий місяці досліджень (нирках – 0,39 мкг/г, головному мозку – 0,03
мкг/г, крові – 0,01 мкг/г). Накопичення ізомерів в жирових тканинах
зменшувало їх рівень в крові, що сприяло менш вираженому інгібуванню АХЕ
(на 39%), а вивільнення із жирового депо – збільшувало
антихолінестеразну дію (на 49%). Аналогічна залежність пролонгуючої
антихолінестеразної дії від накопичення в жировому депо виявлена також
для фосфаміду ФОП (Л.Г. Александрова, 1990) і фенітротіону
(Фосфорорганические инсектициды, 1990).

Циклофос і симарп у високих дозах (6,3 і 23 мг/кг відповідно) лише в
перші строки досліджень інгібували N-деметилазну активність на 29% і 38%
відповідно. Вплив на імунну систему щурів обох речовин був однотиповим і
характеризувався імунодепресивною дією. Циклофос в різні строки
досліджень викликав зниження активності лізоциму в сироватці крові на
21-47%, НСТ-тесту – на 24%, РБТЛ – на 26-33%, титру ГГА – більше на 50%.
Через 4 місяці спостерігалось збільшення абсолютної маси тимуса і
селезінки на 30%, через 6 місяців – зменшення маси тимуса на 11%
(р?0,05). Морфологічні зміни імунокомпетентних органів характеризувались
судинними та дистрофічними порушеннями, інфільтрацією
лімфогістоцитарними елементами. У тимусі виявлені мікронекрози в
мозковому шарі, у селезінці – гіпертрофію периферичної частини
фолікулів. У відновлюючий період (1 міс.) зниження РБТЛ, НСТ-тесту і
активності лізоциму становило 20-26% (р?0,05), що свідчить про
гальмування функції імунокомпетентних клітин.

Симарп через 0,5 міс. знижував титр ГГА на 55%, збільшував абсолютну
кількість нейтрофілів, їх функціональну активність на 128%, а також
рівень ЦІК – на 23% (р?0,05). В подальшому функціональна активність
нейтрофілів зростала, але через 6 місяців виявлено зниження РБТЛ на 27%,
абсолютної маси тимуса – на 16% (р?0,05). В червоній пульпі селезінки
визначались лімфоїдні вузлики, спостерігалась помірна гіперплазія білої
пульпи, гермінативні центри фолікул були розширені, серед клітинних
елементів збільшувалась кількість бластних форм. Тканина тимуса була
розрізнена невеликими долями, жирова клітковина займала більшу частину
площини зрізу. Судини клітковини були різко гіпереміровані, виявлені
геморагії. Межа між корою і мозковою речовиною була зтушована. Кількість
лімфоцитів в корі зменшувалась, в мозковій речовині виявлені
епітеліальні клітини (по 3-5 клітин в групі).

Циклофос в дозі 0,63 мг/кг інгібував N-деметилазну активність в 1,5 рази
більше, ніж в дозі 6,3 мг/кг. Через 1 і 6 місяців виявлено збільшення
функціональної активності нейтрофілів на 39% і 79% відповідно. Симарп
(2,3 мг/кг) в кінці експерименту збільшував абсолютну кількість
нейтрофілів на 104% і їх функціональну активність – на 87%.

У імунізованих еритроцитами барана щурів (рис. 1), яким перорально
вводили циклофос в дозі 6,3 мг/кг або симарп – 23 мг/кг, виявлено
зниження титрів ГГА, рівня ЦІК, функціональної активності нейтрофілів,
що свідчить про гальмування імунної відповіді на додатковий антигенний
стимул. При імунізації щурів, які отримували симарп в дозі 2,3 мг/кг
значимих змін досліджених показників не встановлено. За дії циклофоса
(0,63 мг/кг) у імунізованих щурів виявлено підвищення функціональної
активності нейтрофілів (р?0,05), але в меншому ступені (на 21%), ніж у
тварин, які не піддавались імунізації. Це свідчить про те, що істинної
адаптації імунної системи за дії циклофоса не відбувається. Тому, за
імунологічними критеріями шкідливості дозу циклофоса – 0,63 мг/кг можна
визнати пороговою, симарпа – 2,3 мг/кг – підпороговою.

Рис. 1. Імунологічні показники у щурів, отруєних циклофосом

(6,3 мг/кг) або симарпом (23 мг/кг), після імунізації еритроцитами
барана.

Тут і на рис. 2-5 * – Р?0,05 у порівнянні з контролем

Таким чином, циклофос і симарп викликають імунодепресивний ефект за
Т-типом. При оцінці шкідливої дії хімічних речовин критеріальними є
показники стану НРО та імунної системи, що підтверджує попередні
дослідження (П.Г. Жминько, 1988, 1989) та дані літератури (В.А. Желтов,
1980; I.K. Thomas, Т. Imamura, 1986). Імунізація щурів еритроцитами
барана знижує імунну реактивність і продукцію антитіл, що узгоджуються з
іншими даними (А.И. Олефир, 1978; I. Desi et. al., 1978; R. Repetto,
S.S. Baliga, 1996) і може бути використана для диференціації порогових і
недіючих рівнів засобів захисту рослин. На основі власних досліджень та
даних літератури розроблені підходи щодо регламентації хімічних речовин
в об’єктах довкілля з урахуванням імунологічних порушень, які викладені
в Методичних рекомендаціях (№356 від 25.07.2003 року). У комплексі
показників, що застосовуються для виявлення токсичного ефекту,
імунологічні показники розглядаються як інтегральні. При оцінці
порогових доз необхідно враховувати спрямованість і стійкість змін
імунологічних показників. Для диференціації адаптації організму від
пошкоджень може бути застосована імунізація тварин еритроцитами барана.

Дослідження ролі неспецифічної реактивності організму в токсичній дії
хімічних засобів захисту рослин. Вираженість токсикогенної стадії
хімічного стресу може залежати від багатьох неспецифічних ефектів, які в
сукупності з специфічним формують відповідну патологію (С.Н. Голиков,
1986). Методом рівноважного діалізу встановлено, що найбільшу
спорідненість ФОП до альбуміну мали афос, етафос і оксифосфонат (в
структурі яких є атоми хлору). Гетерофос і тіоловий ізомер циклофоса
зв’язувались з альбуміном в меншому ступені. Ступінь зв’язування з ЛСА
афоса становила 98,7%, етафоса – 78%, тіолового ізомеру циклофоса – 48%,
гетерофоса – 30,9%. Спорідненість до білків сироватки крові різних видів
тварин (табл. 1) найбільш виражена у етафоса. Ступінь зв’язування
етафоса з білками сироватки крові знижувалась в ряду – кріль, щур,
людина, курка; гетерофоса – щур, кріль, людина, курка.

Таблиця 1

Ступінь зв’язування ФОП з білками сироватки крові, %

Найменування речовин Щури Кролі Курки Людина

Етафос 81,2 87,2 67,8 75,0

Тіол-ізомер циклофоса 48,3 48,7 47,9 42,2

Гетерофос 32,4 25,2 16,9 24,9

Тіон-ізомер циклофоса 2,0 6,8 0 0

Тіоновий ізомер циклофоса не зв’язувався з білками сироватки крові.
Відмінностей в зв’язуванні з білками сироватки крові досліджених видів
ссавців у тіолового ізомеру циклофоса не виявлено. Найбільша відмінність
в зв’язуванні з білками, в залежності від виду ссавців, характерна для
гетерофоса: в порівнянні з щурами, у курок ступінь зв’язування був
меншим на 47,8%, у людини – на 23,1%, у кролів – на 22,2%.

Аналіз гострої токсичності досліджених ФОП показав, що ЛД50 гетерофоса і
етафоса для курок, у порівнянні з щурами, вища в 17,5, циклофоса – в
12,8 разів. Це вказує на те, що зв’язування з білками сироватки крові
сприяє зменшенню токсичності і, в залежності від видоспецифічності
білку, може обумовлювати видову чутливість до дії ФОП.

Між ступенем зв’язування ФОП з білками і їх антихолінестеразною дією (in
vitro) встановлено пряму залежність. Так, зв’язування ФОП з ЛСА сприяло
значному зменшенню інгібування чистої АХЕ еритроцитів людини, на що
вказує збільшення I50: за дії оксифосфоната і афоса – більше, ніж на
2,0; етафоса – на 1,6; тіолового ізомера циклофоса – на 1,05, гетерофоса
– на 0,7 порядки. I50 після зв’язування ФОП з IgM сироватки крові
людини, в порівнянні з ЛСА, була в 3-6 разів більшою. Це свідчить про
те, що ФОП зв’язуються з IgM в меншому ступені, ніж з ЛСА і узгоджується
з даними А. Альберт (1989). Після інкубації ФОП з ЛСА інгібування АХЕ
нативних еритроцитів або ХЕ сироватки крові щурів зменшувалось в
більшому ступені, ніж чистої АХЕ еритроцитів людини, що обумовлено
додатковою сорбцією їх на мембранах та взаємодією з білками сироватки
крові (імуноглобулінами, неспецифічними естеразами, ліпопротеїдами).

Оскільки ФОП зв’язуються з імуноглобулінами і природними антитілами
(А.Я. Кульберг та ін., 1986), то не виключено, що цей процес може
залежати від стану імунної системи. Встановлено, що у імунізованих
еритроцитами барана щурів в період активного антитілогенезу гостра
токсичність ФОП збільшувалась (за винятком циклофоса): ТОКФ – в 1,2;
гетерофоса і афоса – в 1,3; етафоса – в 1,4 рази. Холінергічні
симптомами інтоксикації наступали раніше і були більш виразніші, ніж у
неімунізованих щурів. Величина ЕТ50 при імунізації щурів знижувалась за
дії ТОКФ, циклофоса і гетерофоса на 26, 17 і 69%, і збільшувалась за дії
афоса і етафоса – на 24% і 130% відповідно. За дії етафоса виявлено
збільшення Iкум,, ТОКФ, циклофоса і афоса – зменшення. Це свідчить про
те, що на фоні імунізації еритроцитами барана кумулятивний ефект у
етафоса збільшується, у ТОКФ, циклофоса і афоса – зменшується.

Із даних рис. 2 видно, що у імунізованих щурів за умов гострої дії ФОП,
через добу із зменшенням рівня ЦІК зростало інгібування активності АХЕ
еритроцитів (до 20%), а також АХЕ головного мозку, особливо при дії
циклофоса – на 17,9%, афоса – на 11,4%, ТОКФ – на 12,2%, ніж у інтактних
тварин. Оскільки, у імунізованих щурів не утворювались ЦІК, то
збільшення антихолінестеразної дії ФОП можна пояснити збільшенням їх
вільної концентрації в крові. Більш виражена токсична і кумулятивна дія
етафоса може бути обумовлена тим, що взаємодія з альбуміном і
імуноглобулінами крові перешкоджають проникненню його в мозок і
реалізація токсичного ефекту відбувається на периферії.

Рис. 2. Ступінь інгібування активності АХЕ еритроцитів і рівень ЦІК
сироватки крові інтактних і імунізованих щурів при однократній дії ФОП
(1/2 ЛД50)

Для підтвердження ролі імунної системи в детоксикації ксенобіотиків (на
прикладі етафоса) показано, що при надходженні його в організм інтактних
щурів в дозі 1/2 ЛД50 функціональна активність нейтрофілів на 1 добу
забезпечувалась за рахунок збільшення кількості нейтрофілів в крові. В
подальшому (рис. 3) спостерігались збільшення рівня ЦІК та виражена
метаболічна активація нейтрофілів (у 2-3 рази), в крові накопичувались
великодисперсні ЦІК, які легко піддаються солюбілізації і виведенню з
організму за допомогою фагоцитозу.

Рис. 3. Функціональна активність нейтрофілів (НСТ-тест) і рівень ЦІК
сироватки крові інтактних і імунізованих еритроцитами барана щурів при
одноразовій дії етафоса (1/2 ЛД50)

Із збільшенням рівня ЦІК і функціональної активності нейтрофілів
зменшувався і антихолінестеразний ефект. Відновлення активності АХЕ на 3
і 7 добу становило 24% і 32%. У імунізованих щурів під впливом етафоса
рівень ЦІК не відрізнявся від контролю. Упродовж доби спостерігався
нейтрофільоз, але функціональна активність нейтрофілів була на рівні
контролю або знижувалась на 3 добу. В подальшому збільшувалась кількість
диформазан-позитивних нейтрофілів, але їх метаболічна активність
залишалась на рівні контролю. Відновлення активності АХЕ на 3 і 7 добу
становило всього 2,7% і 12,2% відповідно.

Таким чином, на фоні імунізації еритроцитами барана у щурів
спостерігається напруження реактивності імунної системи і вона
неадекватно реагує на додатковий антигенний стимул (етафоса). При цьому
спостерігається більш виражений і стійкий антихолінестеразний ефект і
більш пізнє відновлення активності АХЕ еритроцитів. Це вказує на те, що
імунна система приймає безпосередню участь у детоксикації ксенобіотиків
за допомогою утворення імунних комплексів і елімінації їх з організму
клітинами макрофагальної системи. Зниження функціональної активності
нейтрофілів сприяє порушенню гомеостазу і призводить до збільшення
токсичності і кумулятивної дії речовин. Результати досліджень
узгоджуються з даними В.І. Саноцького та ін. (1998), M.D. Fernandes et
al., (1999), Є.В. Давидової та ін. (2004), які показали, що при гострих
отруєннях ФОП для людей також характерне пригнічення функціональної
активності нейтрофілів, що корелює із ступенем важкості отруєнь і має
високе прогностичне значення.

Біологічні мембрани, як і білки сироватки крові, також можуть бути
однією із ділянок втрат ксенобіотиків на їх шляху до мішені біологічної
дії. На моделі 2-х фазної водно-ліпідної системи встановлено, що
випробувані ФОП і РРР змінюють біофізичні характеристики ШФМ – граничний
потенціал (??), поверхневий натяг (??), електричний опір (Rг) і
заповнюють границю розподілу фаз “ліпід-вода” переважно в концентраціях
1?10-6, 1?10-5 моль/л, що свідчить про їх високу мембранотропну
активність. Найбільший вплив на стан ШФМ, за вказаними показниками,
чинили сполуки, які мали в своїй структурі ліпофільні групи (Cl-, CCl3-,
CCl2-, СN). Серед ФОП – це оксифосфонат, афос, хлорофос, ДДВФ, фоксим;
РРР – хлорхолінхлорид і симарп.

За дії оксифосфонату, афоса, малаоксона більш значиме збільшення
електропровідності штучних бішарових мембран (ШБФМ) викликали
оксифосфонат і афос в концентраціях 1?10-8 – 1?10-4 М. Цей ефект в
більшій мірі виявлявся у разі, коли на мембрані відтворювали різницю
потенціалу із позитивним знаком (+100 мВ), що вказує про їх здатність
проникати через ШБФМ в електровід’ємній формі. Виявлена залежність між
зменшенням електричного опору ШФМ і діаметром пор. Показано, що фталофос
і ДДВФ мають більшу здатність проникати через пори мембран, ніж
оксифосфонат, хлорофос, фоксим.

За даними Л.Г. Александрової (1990), похідні тио- і дитіофосфорної
кислоти з фенільними і алкільними радикалами мають менший ступінь
гідрофобності, ніж похідні з атомом азоту в гетероциклі та похідні
дитиофосфорної кислоти з NH-групою. Похідні тио- і дитиофосфорної
кислоти (тіоловий ізомер циклофоса, карбофос, ізомалатіон, малаоксон),
також мають незначну гідрофобність (lgPo/в становить 1,1-2,6) в
порівнянні з фоксимом і фталафосом, у структурі яких є група СN або атом
азоту в гетероциклі (lgPo/в – 4,2 і 3,2 відповідно). Високу
гідрофобність афоса, оксифосфоната і етафоса (lgPo/в 5,05, 5,04 і 4,2
відповідно) можна пояснити наявністю в їх структурі ліпофільних груп,
які можуть обумовлювати їх здатність до сорбції на мембранах.

N

r

?®8

f

B

D

F

H

J

L

N

P

R

??????R

j

l

n

p

r

 

c

~?¨u8

j

[email protected]”N’P?RPTcU,W XaYx[u\„^th_2eUe1/4UeUeUeUeUeUeUe1/4™yUeUe

ss¦a–ia1/2???z????z???

O

@

@

?????(?

O

$

O

O

?????(?

?????(?

O

$

O

O

???????рани еритроцитів щурів показали, що як за умов in vitro, так і in
vivo спостерігаються однонаправлені зміни стану мембран, які
характеризуються зниженням активності Nа+,К+-АТФази та підвищенням
гемолізу еритроцитів до впливу температури (+50?С), що вказує на
порушення транспорту одновалентних катіонів та в’язкості ліпідного шару
мембран. За умов in vitro (рис. 4) в концентрації 1?10-4 моль/л зниження
активності Nа+,К+-АТФази було більш виражено у фоксима (84%) і дурсбана
(60%), ніж хлорофоса і афоса (39%). Ступінь гемолізу еритроцитів під
впливом температури суттєво підвищувався (р?0,05) при дії хлорофоса,
дурсбана, карбофоса, афоса. Збільшення інтенсивності ПОЛ виявлено лише у
хлорофоса (182%), що може бути причиною зміни структури мембран.
Тіоловий ізомер циклофоса не чинив мембранотоксичної дії.

Рис. 4. Вплив ФОП (1?10-4 моль/л) на мембрани еритроцитів щурів

(in vitro)

При одноразовому пероральному введенні ФОП (1/2 ЛД50) за дії хлорофосу
зміни досліджених показників були майже однакові, як і в концентрації
1?10-4 моль/л. Для карбофоса, ТОКФ і афоса більш характерним було
зниження активності Nа+,К+-АТФази (на 90%, 63% і 51% відповідно).
Підвищення ступеню гемолізу відбувалось тільки за дії карбофоса (160%) і
дурсбана (42%). Циклофос не змінював стан мембран еритроцитів. Оскільки
карбофос і афос викликали більш виражені зміни активності Nа+, К+-АТФази
та гемолізу еритроцитів в умовах in vivo, ніж in vitro, то це можна
пояснити утворенням їх токсичних метаболітів – малаоксона і
оксифосфонату відповідно (С.С. Михайлов, И.Г. Щербак, 1983; К.М.
Астанакулов, 1983). Підтвердженням цього є той факт, що дія малаоксона і
оксифосфоната на біофізичні характеристики ШФМ більш виражена, ніж у
карбофоса і афоса. За умов гострої дії (1/2 ЛД50) афос, ТОКФ, циклофос
знижують активність мембранозв’язаних ферментів мітохондрій щурів – СДГ
на 38-60% і ЦО – на 47-56%, збільшують пасивний набряк мітохондрій в
ізотонічному (до 213%) або гіпотонічному розчинах сахарози (до 117%).
Оскільки за дії циклофоса і ТОКФ спостерігалось збільшення набряку
мітохондрій лише в гіпотонічному розчині сахарози, то не виключено, що
під їх впливом відбувається збільшення розкладу фосфатидилдиетаноламінів
і кардіоліпінів в мембранах (А.В. Каргаполов, 1979). Виявлені зміни
можуть призвести до порушень структури мітохондрій, енергетичних і
окислювальних процесів в них.

РРР івін в умовах іn vitro не викликав змін стану мембран еритроцитів
щурів і людини. Не встановлено впливу його і на мембрани еритроцитів
щурів в дослідах in vivo. Вплив івіна на мембрани мітохондрій печінки
щурів не залежав від введеної дози. Так, за дії івіна в дозі 630 мг/кг
активність СДГ знижувалась на 26%, ЦО збільшувалась на 213%. В дозі 12,6
мг/кг спостерігалось підвищення активності ЦО на 56% та інтенсивності
ПОЛ на 45-81%. В дозі 1,26 мг/кг виявлено лише підвищення інтенсивності
ПОЛ в мітохондріях на 45%. Відсутність залежності “доза-ефект”, може
бути пов’язана з особливостями взаємодії івіна з рецепторами мембран та
його токсикокінетикою і потребує подальших досліджень.

Даними дослідженнями підтверджується те, що існує висока
взаємозалежність між ступенем взаємодії хімічних речовин з фосфоліпідами
ШФМ і їх спорідненістю до альбуміну. Циклофос, для якого характерне
незначне зв’язування з альбуміном, проявляє і меншу мембранотропну
активність. Афос, оксифосфонат, етафос мають високу спорідненість до
альбуміну і проявляють високу мембранотропну активність. Однак, в умовах
in vivo, ця залежність не завжди може зберігатись, що необхідно
враховувати при прогнозуванні мембранотоксичної дії ксенобіотиків.

Дослідження взаємозв’язків між показниками імунної і монооксигеназної
систем організму при інтоксикаціях фосфорорганічними пестицидами і
синтетичними регуляторами росту рослин. При гострій дії ФОП виявлено
високу кореляцію (р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020