АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ

Жмінько Петро Григорович

УДК 615.9+577.3+612.017+616.008+615.099.08

Роль імунної системи і неспецифічної реактивності організму в патогенезі
отруєнь фосфорорганічними пестицидами і синтетичними регуляторами росту
рослин

14.03.06 – токсикологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя
Міністерства охорони здоров’я України.

Наукові консультанти:

член-кореспондент НАН і АМН України,

доктор медичних наук, професор

Каган Юрій Соломонович,

Інститут екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя

МОЗ України, керівник відділу токсикології;

член-кореспондент АМН України,

доктор медичних наук, професор

Проданчук Микола Георгійович,

Інститут екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя

МОЗ України, директор інституту.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Коваленко Валентина Миколаївна,
Інститут фармакології та токсикології АМН України, завідувач відділу
токсикології;

доктор медичних наук, старший науковий співробітник Жирнов Віктор
Валентинович, Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України,
завідувач відділу сигнальних систем клітин;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Томашевська
Людмила Анатоліївна, Інститут гігієни та медичної екології ім. О.М.
Марзеєва АМН України, завідувач відділу токсикологічних досліджень.

Провідна установа:

Інститут медицини праці, АМН України, м. Київ.

Захист відбудеться “ 18 ” травня 2005 р. о 1300 годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 при Інституті
фармакології та токсикології АМН України (03057, м. Київ, вул. Ежена
Потьє, 14).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фармакології та
токсикології АМН України (03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє, 14).

Автореферат розісланий “ 16 ” квітня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук І.В. Данова ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА
РОБОТИ

Актуальність теми. Темпи виробництва і застосування хімічних засобів
захисту рослин весь час зростають. Значну кількість від загального
обсягу їх складають інсектициди, зокрема фосфорорганічні і пиретроїди
(R. Repetto, S.S. Baliga, 1996). На сьогодні в Україні розширюється
асортимент фосфорорганічних пестицидів (ФОП) і регуляторів росту рослин
(РРР) та спектр сільськогосподарських культур на яких вони
застосовуються (Перелік пестицидів і агрохімікатів, дозволених до
використання в Україні). Пестициди і РРР є біологічно активними
речовинами і широкомасштабне застосування їх в сільському господарстві
може негативно впливати на здоров’я людини.

Відомо, що основним в механізмі токсичної дії ФОП є блокування
холінестерази (ХЕ) і порушення функцій нервової системи (Ю.С. Каган,
1981; D.M. Maxwell, D.E. Lenz, 1992). Однак, між токсичністю і
інгібуванням активності ХЕ не завжди спостерігається пряма залежність
(С.Н. Голиков, 1972), інколи при отруєнні неспецифічні ефекти передують
специфічним (В.А. Желтов, 1980), а деякі ФОП, навіть за відсутності
інтоксикацій, викликають синдром віддаленої нейротоксичної дії (ВНД)
(M.K. Johnson, 1992; В.С. Валевский и др., 2003). Для синтетичних РРР
характерне порушення функцій центральної нервової системи і печінки
(С.П. Пономаренко, 1999), зниження імунної реактивності організму (С.Н.
Кузьминский, В.И. Попко, 1993). У працюючих з пестицидами та у
населення, яке проживає у районах з інтенсивним застосуванням засобів
захисту рослин, виявлено збільшення випадків алергічних і інфекційних
захворювань, імунодефіцит по Т-типу, тяжкий перебіг соматичної
патології, ріст ендокринопатій і онкологічних хвороб (М.З. Саидов и др.,
1990; К. Miller, 1995; B.D. Banerjee et al., 1996; I. Voccia et al.,
1999; Н.М. Недопитанська, 1999; N.T. Fear et al., 1999; В.Г. Бардов та
ін., 2000). За останнє десятиріччя збільшилось число гострих отруєнь
пестицидами, в тому числі і ФОП (M. O’Malley, 1997;

В.В. Афанасьев та ін., 1998; Г.М. Балан та ін., 2001). Негативний вплив
їх на здоров’я людей може бути пов’язаний з багатьма причинами (І.В.
Саноцький, 1998; В.Г. Бардов та ін., 1998; Л.Г. Засипка, 2001). Одною з
них є те, що токсиколого-гігієнічна регламентація їх проводиться без
урахування імунотоксичної дії, що знижує надійність раніше встановлених
нормативів. Крім того, ще недостатньо з’ясовані механізми регуляції
порушеного гомеостазу, що ускладнює прогнозування шкідливих ефектів і
розробку заходів профілактики.

Визнано, що основною системою детоксикації і збереження гомеостазу є
монооксигеназна гідроксилююча система (МОГС). В залежності від стану
МОГС метаболізм одних і тих же пестицидів може протікати різними
шляхами, направленими як на детоксикацію речовин, так і на підвищення їх
токсичності (Ю.С. Каган, 1981; Д.И. Метелица, 1982, С.С.Михайлов, И.Г.
Щербак, 1983). Поряд з МОГС важливе значення в токсичній дії
ксенобіотиків мають процеси сорбції на мембранах, зв’язування з білками
сироватки крові, депонування в ліпідах (С.Н. Голиков та ін., 1986; A.
Альберт, 1989). Білки, мембрани, ліпіди є “місцем втрат” на шляху до
мішені біологічної дії ксенобіотиків, що, в більшості випадків, сприяє
зменшенню їх токсичності (А.И. Луйк, В.Д. Лукьянчук, 1984; A. Альберт,
1989). Однак, взаємодія хімічних речовин з компонентами клітин і тканин
може мати і негативні наслідки в результаті зміни їх структури і функції
(Б.А. Курчий, 1988; T. Ogata, S. Manabe, 1990; Е.Л. Левицкий, Ю.И.
Губський, 1994; H. Racay et al., 1997; Л.Б. Бондаренко, В.М. Коваленко,
2000). Не виключено також, що зв’язування пестицидів з білками та
імунокомпетентними клітинами може викликати модифікацію імунних процесів
в організмі, що, в свою чергу, буде сприяти порушенню функції імунної
системи і розвитку патології. В зв’язку з цим, значна увага приділяється
дослідженню імунної системи, як мішені токсичної дії ксенобіотиків (L.
Koller, 1984; L.H. El-Sayed, 2001). Особливо важливою є проблема
аутоімунних уражень за дії ксенобіотиків, визначення їх механізмів,
зокрема ролі імунних комплексів у розвитку цих процесів та в формуванні
патології хімічної етіології (В.В. Сура та ін., 1980; А.Н. Климов, 1986;
D.A. Smith, D.R. Germolec, 1999; G.S. Cooper et al., 1999). Крім того,
залишається недостатньо з’ясованою роль імунної системи в токсичності,
детоксикації пестицидів і РРР, механізмах регуляції гомеостазу. Оскільки
деякі ФОП спроможні викликати ВНД, обумовлену демієлінізацією нервової
системи, то не виключено, що процесам деструкції можуть передувати
аутоімунні порушення організму. Механізм ВНД ще недостатньо вивчений, що
ускладнює пошук засобів ефективної терапії і профілактики цієї патології
(М. Lotti et al., 1986; C.D. Carrington, М.В. Abou-Donia, 1988; E.
Capodicasa, 1991; М.К. Johnson, 1992).

Висвітлені проблеми сучасної токсикології пестицидів і агрохімікатів
торкаються загальних механізмів їх токсичного дисгомеостазу, ролі
імунної системи в процесах детоксикації і патогенезі ВНД, викликаної
ФОП. Вирішення їх потребує комплексних токсикологічних досліджень і
тісно пов’язане з іншими задачами, в тому числі направленими на
профілактику патології хімічної етіології. Цим і визначається
актуальність даної роботи.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано
за основним планом науково-дослідних робіт Інституту екогігієни і
токсикології ім. Л.І. Медведя по проблемі “Екогігієна і токсикологія”:
“Изучение токсикодинамики и метаболизма новых избирательных
фосфорорганических пестицидов (циклофос, его изомеры и другие)”,

№ держреєстрації 01.83.0.079815; “Исследование механизмов избирательного
(токсического, отдаленного нейротоксического) действия
фосфорорганических и других пестицидов”, № держреєстрації 01.86.0004829;
“Токсикологическое изучение последовательного, комбинированного,
комплексного действия, процессов нитрозирования пестицидов в
интегрированной системе защиты зерновых культур”, № держреєстрації
01.880.076528; “Дослідження механізмів синергетичної дії пестицидів, що
застосовуються на Україні”, № держреєстрації 0194V017542;
“Експериментальне моделювання нейропаралітичної дії фосфорорганічних
ксенобіотиків, пошук засобів корекції цієї патології”, № держреєстрації
093V037425; “Оцінка небезпечності хімічних та біологічних засобів
захисту рослин в умовах імунодефіциту. Розробка адекватної
експериментальної моделі імунодефіциту за допомогою хімічних факторів
(циклофосфану)”, № держреєстрації 0195V025456); міждержавної НТП
фундаментальних досліджень ДКНТ “Високоефективні процеси виробництва
продовольства” за проектом 0.12.03.004 “Створення, оцінка і застосування
антистресових, біозахисних, дефоліантних та інших екологічно та
генетично безпечних регуляторів росту та розвитку рослин”; міжнародних
наукових програм (фонду Дж. Сороса, грант №653453) “Исследование
механизмов отдаленного нейротоксического действия фосфорорганических
веществ”.

Мета роботи. На основі експериментальних досліджень направленості і
вираженості порушень в імунній системі, зміни факторів неспецифічного
захисту організму при дії фосфорорганічних пестицидів і синтетичних
регуляторів росту рослин встановити їх роль в патогенезі інтоксикацій та
розробити профілактичні заходи.

Задачі дослідження. 1. Вивчити вплив ФОП (циклофоса і його ізомерів,
етафоса, гетерофоса та ін.) і синтетичних РРР (івіна, ресина, симарпа)
на імунну систему організму (клітинний і гуморальний імунітет) при
гострих, підгострих і хронічних інтоксикаціях.

2. Дослідити вплив ФОП (циклофоса і його ізомерів, етафоса, гетерофоса
та ін.) і синтетичних РРР (івіна, ресина, симарпа) на монооксигеназну
систему (1-у фазу детоксикації) при гострих, підгострих і хронічних
інтоксикаціях.

3. Визначити функціональний взаємозв’язок між показниками
монооксигеназної та імунної систем організму за умов гострої,
підгострої, хронічної дії ФОП і синтетичних РРР.

4. Встановити роль неспецифічних факторів захисту організму (зв’язування
з білками сироватки крові, імунні комплекси сироватки крові, взаємодія з
мембранами) в токсичній дії ФОП і синтетичних РРР.

5. Дослідити характер порушень в імунній системі за дії афоса і
триортокрезилфосфату. Визначити роль імунної системи в патогенезі
віддаленої нейротоксичної дії фосфорорганічних речовин.

6. Провести пошук засобів профілактики ускладнень ВНД (парезів і
паралічів) при отруєннях фосфорорганічними нейротоксикантами (афосом і
триортокрезилфосфатом).

7. Удосконалити підходи щодо встановлення безпечних рівнів ксенобіотиків
за імунологічними критеріями шкідливої дії та їх регламентування в
об’єктах навколишнього середовища із позицій імунотоксикології.

Об’єкт дослідження. Щури лінії Wistar, курки породи Leggorn за умов
отруєнь фосфорорганічними речовинами або синтетичними регуляторами росту
рослин (гострі, підгострі, хронічні інтоксикації).

Предмет дослідження. Встановлення характеру порушень імунної системи і
неспецифічних факторів захисту організму та визначення їх ролі в
патогенезі інтоксикацій, обумовлених ФОП і синтетичними РРР.

Методи дослідження. В роботі використані сучасні токсикологічні,
імунологічні, гематологічні, біохімічні, біофізичні, морфологічні,
фармакологічні, хімічні, статистичні методи досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів. Поглиблено уявлення щодо впливу
фосфорорганічних пестицидів і синтетичних регуляторів росту рослин на
монооксигеназну систему. Встановлено, що в токсикогенній стадії стресу
за умов їх гострої пероральної дії відбувається інгібування, підгострої
– індукція інтенсивності процесів деметилювання, гідроксилювання і
збільшення вмісту цитохрому Р-450. Індукція активності ферментів МОГС
призводить до активації метаболізму фосфорорганічних речовин, на що
вказує збільшення їх антихолінестеразної дії. Циклофос, симарп (хронічна
дія) та івін (субхронічна) чинять нестійкий інгібуючий ефект на процеси
деметилювання в печінці щурів.

Вперше встановлено, що рання реакція організму щурів на стресорний вплив
фосфорорганічних речовин і регуляторів росту рослин характеризується
збільшенням вмісту великодисперсних циркулюючих імунних комплексів,
функціональної активності нейтрофілів та лімфоцитів, активацією
окислювального метаболізму в нейтрофілах, що, в подальшому, забезпечує
елімінацію імунних комплексів і відновлення порушеного гомеостазу.
Виявлено функціональний взаємозв’язок між показниками монооксигеназної
та імунної систем, який має реципрокний характер і найбільш чітко
проявляються в токсикогенній стадії хімічного стресу.

Встановлено, що за умов хронічної дії циклофоса і симарпа вплив їх на
імунну систему щурів поглиблюється з часом і призводить до формування
імунодефіциту за Т-типом. На фоні хронічної інтоксикації гальмується
імунна відповідь на додатковий антигенний стимул (еритроцити барана), на
що вказує зниження титру гетерофільних гемагглютининів, рівня
циркулюючих імунних комплексів, функціональної активності нейтрофілів.

Вперше показано, що в період активного антитілогенезу у щурів знижується
імунна відповідь на вплив фосфорорганічних пестицидів (утворення
великодисперсних імунних комплексів, окислювальний метаболізм в
нейтрофілах), що призводить до збільшення їх токсичності,
антихолінестеразної і кумулятивної дії.

Вперше з’ясовано роль імунної системи в патогенезі віддаленої
нейротоксичної дії фосфорорганічних сполук. Встановлено, що у курок за
дії афоса і триортокрезилфосфату зміни в імунній системі наступають в
латентний період і прогресують з часом. Характер порушень свідчить про
розвиток аутоімунного процесу (зниження кількості Т- і В-лімфоцитів,

NK-клітин, Т-супресорів та збільшення кількості Тх, функції
В-лімфоцитів, рівня дрібнодисперсних імунних комплексів, титрів
аутоантитіл до антигену із нервових тканин). Виявлена пряма залежність
між ступенем аутоімунних порушень і вираженістю клінічних ознак ВНД.

Встановлено, що видоспецифічність ВНД обумовлена різним впливом
нейротоксикантів на імунну систему. У найменш чутливого виду (щурів), на
відміну від курок, за дії афоса і триортокрезилфосфату в крові
накопичуються великодисперсні імунні комплекси, які легко виводяться
клітинами макрофагальної системи, порушень аутоімунних реакцій, парезів
і паралічів не спостерігається, що підтверджує важливу роль імунної
системи у розвитку нейропатій.

Вперше показана можливість профілактики тяжких ускладнень ВНД за
допомогою імунодепресантів і гемокарбоперфузії. Встановлено, що
імунодепресант циклофосфан і гемокарбоперфузія (проведена в
допаралітичний період) гальмують розвиток ВНД, а саме зменшують
виразність клінічних ознак інтоксикацій і попереджають розвиток парезів
і паралічів.

Поглиблено уявлення щодо ролі нековалентного зв’язування
фосфорорганічних пестицидів з білками сироватки крові, сорбції ФОП і РРР
на мембранах в їх токсичності. Зв’язування ФОП з білками сироватки крові
зменшує їх токсичність і антихолінестеразний ефект, взаємодія з
мембранами залежить від ліпофільності молекул і за гострої дії
призводить до порушення структури і функції мембран.

Практичне значення одержаних результатів. На основі експериментальних
даних удосконалено методичні підходи щодо дослідження імунотоксичної дії
потенційно небезпечних хімічних речовин і токсиколого-гігієнічної
регламентації їх в об’єктах навколишнього середовища за імунологічними
критеріями шкідливості, що сприятиме підвищенню надійності нормативів,
зменшить імовірність їх корекції.

Розроблені способи прогнозування ВНД та профілактики тяжких ускладнень –
парезів і паралічів, які можуть бути використані при діагностиці і
лікуванні отруєнь нейропаралітичними фосфорорганічними речовинами.

Результати дисертаційної роботи впроваджені в навчальний процес на
кафедрі загальної гігієни медико-профілактичного факультету
Національного медичного університету імені О.О. Богомольця, кафедрі
біохімії біологічного факультету Київського національного університету
Тараса Шевченко, кафедрі гігієни та екології людини Київської медичної
академії післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика.

Матеріали роботи використані при реєстрації 8 пестицидів і РРР в
Україні, обгрунтуванні гігієнічних нормативів 4 речовин у повітрі
робочої зони, продуктах харчування і допустимої добової дози для людини,
що сприятиме підвищенню ефективності державного санітарного нагляду; при
розробці методичних документів, санітарних правил та норм: “Гігієнічна
класифікація пестицидів за ступенем небезпечності” (ДсанПіН
8.8.1.002-98. Київ, 1998); “Допустимі дози, концентрації, кількості та
рівні вмісту пестицидів у сільськогосподарській сировині, харчових
продуктах, повітрі робочої зони, атмосферному повітрі, воді водоймищ,
грунті” (ДСанПіН 8.8.1.2.3.4.-000-2001. Київ, 2001); Методичні
рекомендації “Дослідження імунотоксичної дії потенційно небезпечних
хімічних речовин при їх гігієнічній регламентації” МР 8.1.4.104-2003.
Київ, 2003); Інформаційний лист №130-95 “Спосіб прогнозування віддаленої
нейротоксичної дії хімічних речовин”.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто проаналізована вітчизняна і
зарубіжна література за проблемою, визначена мета і поставлені задачі,
обрані методичні підходи щодо експериментальних досліджень, проведені
експериментальні та теоретичні дослідження. Ідею щодо ролі імунної
системи в патогенезі ВНД фосфорорганічних нейротоксикантів сформовано
разом з науковим консультантом світлої пам’яті члена-кореспондента НАН
та АМН України проф. Ю.С. Кагана. Деякі дослідження виконані автором за
консультативною допомогою спеціалістів різного профілю: д.б.н. В.М.
Войціцького (дослідження на штучних фосфоліпідних мембранах), к.б.н.
Н.М. Недопитанської (патоморфологічні дослідження), к.б.н. В.Г. Шуляк та
к.м.н. В.Г. Ларіонова (гематологічні дослідження при дії циклофоса,
симарпа, ресина), к.х.н. М.В. Письменної (хроматографічний аналіз
концентрацій пестицидів в біосубстратах).

Автором самостійно здійснена статистична обробка, проведений
кореляційний, регресійний та факторний аналіз експериментальних даних,
аналіз і узагальнення отриманих результатів досліджень, сформульовані
основні положення дисертаційної роботи та висновки.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації
доповідались та обговорювались на науково-практичній конференції АН УРСР
і ВАПВО СВ (Київ, 1991); міжнародному симпозіумі “Health, Safety and
Ergonomic Aspects in Use of Chemicals in Agriculture and Forestry”
(Київ, 1994); 3-ій міжнародній конференції “Регуляторы роста и развития
растений” (Москва, 1995); XXXV Європейському конгресі токсикологів
(ЄВРОТОКС’96, Аліканте, 1996); 7-ій міжнародній конференції щодо
комбінованих ефектів факторів навколишнього середовища (ІССЕF’96,
Тампере, Фінляндія, 1996); 6-ій міжнародній конференції Neurotoxicology
Association INA-6 (Шегед, Угорщина, 1997); міжнародному симпозіумі ЕСРА
з питань Європейської системи реєстрації засобів захисту рослин (Київ,
1998); науково-практичній конференції “Актуальні проблеми екогігієни і
токсикології” (Київ, 1998); VIII міжнародному конгресі токсикологів
“Chemical Safety for the 21-th Century” (Париж, Франція, 1998);
конференції, присвяченій 75-річчю з дня народження члена-кореспондента
НАН і АМН України, професора Ю.С. Кагана “Актуальні проблеми
токсикології” (Київ, 1999); 1-му з’їзді токсикологів Росії (Москва,
1999); конгресі ЄВРОТОКС 2001 (Стамбул, Туреччина, 2001); 1-му з’їзді
токсикологів України (Київ, 2001); науково-практичній конференції
“Актуальні проблеми токсикології, гігієни та аналітичної хімії
пестицидів і агрохімікатів” (Київ, 2003); другому з’їзді токсикологів
Росії (Москва, 2003).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 29 наукових праць: 19
статей у профільних фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 1
керівництво з токсикології, 1 патент на винахід, 3 статті у збірниках
наукових праць, 5 робіт у матеріалах і тезах з’їздів, конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу,
огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, 6 розділів власних
досліджень, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних
джерел літератури. Дисертація викладена на 445 сторінках, ілюстрована
112 таблицями і 47 рисунками. Перелік літератури включає 506 джерел (168
вітчизняних і 338 зарубіжних авторів).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. В роботі використано 19 хімічних
речовин (15 – фосфорорганічних, 4 синтетичних РРР).

Дослідження проведені на 1614 статевозрілих щурах самцях лінії Wistar і
250 курках породи Leggorn, 6 кролях.

Гостру токсичність речовин (ЛД50) при введенні в шлунок розраховували за
методом В.Б. Прозоровського (С.Н. Лапач та ін., 2002). Характер гострої
дії ФОП – етафоса, гетерофоса, ЄШ-7, циклофоса та його ізомерів; РРР –
івіна, ресина, симарпа на організм щурів визначали при пероральному
надходженні в організм у дозах, відповідних 1/2 ЛД50 (одноразово),
підгострої дії – у дозах, відповідних 1/5 ЛД50 (трьохразово).
Субхронічну пероральну дію івіна досліджували у дозах, відповідних 1/10
ЛД50 при надходженні в організм упродовж 2 міс., хронічну дію циклофоса
і симарпа – у дозах, відповідних 1/100 і 1/1000 ЛД50 (6 міс.). Вибір доз
і строків досліджень обумовлений характером моделювання гострих,
підгострих, хронічних інтоксикацій.

Механізм ВНД ФОП досліджено на моделі класичних нейротоксикантів –
триортокрезилфосфату (ТОКФ) і
О,О-дифеніл-1-ацетокси-2,2,2-трихлоретилфосфонату (афос). Циклофос –
О,S-диметил-О-циклогексилтиофосфат використаний у якості негативного
контролю. Дослідження виконані на курках в ізотоксичних (за активністю
ХЕ) дозах (афос – 200 мг/кг, ТОКФ – 500 мг/кг, циклофос – 10 мг/кг) і
щурах в дозах, відповідних 1/2 ЛД50 (афос – 1500 мг/кг, ТОКФ – 750
мг/кг).

Мембранотропну дію ФОП і РРР in vitro досліджували на штучних
фосфоліпідних мембранах (ШФМ) сформованих на фільтрах “Synpor”
(Чехословаччина) з діаметром пор 0,17; 0,85 та 4,0 мкм, модельній 2-х
фазній водно-ліпідній системі (в концентраціях 1?10-4-1?10-11 моль/л) та
еритроцитах щурів (1?10-10, 1?10-6 і 1?10-4 моль/л). Стандартизацію
кількості еритроцитів проводили за вмістом гемоглобіну (5,8 г%). В
умовах in vivo вивчали стан мембран еритроцитів і мітохондрій
гепатоцитів щурів при пероральному введенні речовин в організм у дозах,
відповідних 1/2 ЛД50. Проникнення сполук через мембрани оцінювали за
величиною електричного опору (Rм), в залежності від концентрації та
діаметру пор ШФМ. Вплив на властивості границі розподілу фаз “ліпід –
вода” досліджували за зміною граничного потенціалу (??), динамічної
ємності електричного опору (?Rг), поверхневого натягу (??) (O.A. Belyeva
et al., 1982; L.A. Drachev et al., 1982). Органічну фазу формували
нашаруванням на водну поверхню розчину азолектина (суміш фосфоліпідів із
бобів сої, фірми Sigma, США) в н-декані – 10 мг/мл. Для афоса,
оксифосфоната і малаоксона досліджували їх вплив на електричний опір
бішарових ШФМ, які формували шляхом нанесення на отвори в тефлоновій
кюветі розчину азолектина в н-гептані – 20 мг/мл.

Інтенсивність перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) в еритроцитах і
мітохондріях гепатоцитів щурів визначали за вмістом малонового
диальдегіду (И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили, 1977; Г.Г. Гацко та ін.,
1982). Досліджували резистентність еритроцитів до перекису водню (А.А.
Покровский, А.А. Абраров, 1964) та температури (+50оС) за ступенем
гемолізу (D.A. Kalbhen, E. Schneider, 1972), активність
Na+,K+-АТФази за методом Ю.І. Вахнер та

І.К. Капарік (Метод. руководство, 1989). Пасивний набряк мітохондрій
визначали на спектрофотометрі по зменшенню світлорозсіювання в ізо-
(0,25 М) і гіпотонічному (0,07 М) розчинах сахарози, в яких містилися
мітохондрії, при довжині хвилі 520 нм (Х. Эллингер, 1989). Вміст білку в
мітохондріях визначали за методом O.H. Lowry et. al. (1951), активність
сукцинатдегідрогенази (СДГ) – за реакцією окислення янтарної кислоти в
фумарову, цитохромоксидази (ЦО) – за методом S.Cooperstein et al. (Р.С.
Кривченкова, 1977).

В дослідах щодо з’ясування ролі комплексоутворення ФОП з білками у їх
токсичності використані ліофілізований альбумін сироватки крові людини
(ЛСА) фірми “Reanal” (Угорщина), IgM людини фірми Sigma (США) та цільна
сироватка крові щурів, кролів, курок і людини. Ступінь зв’язування ФОП з
ЛСА і білками сироватки крові ссавців визначали за методом рівноважного
діалізу (В.Д. Лук’янчук, А.И. Луйк, 1983), а також з ЛСА і IgM – за
молярною концентрацією інгібітора (І50), яка гальмує активність ферменту
холінестерази на 50%. В дослідах використана чиста ацетилхолінестераза
(АХЕ) еритроцитів людини, АХЕ нативних еритроцитів і ХЕ сироватки крові
щурів. Активність ХЕ (в умовах in vitro і in vivo) визначали за методом
S. Hestrin (1949).

Оскільки більшість пестицидів піддаються процесам окислення (Ю.С. Каган,
1981), то вплив ФОП і РРР на МОГС печінки щурів оцінювали за
інтенсивністю процесів N-деметилювання амідопірину (I. Cochin, I.
Axelrod, 1959), інтенсивністю п-гідроксилювання аніліну (И.И. Карузина,
А.И. Арчаков, 1977). Вміст цитохрому Р-450, вільних радикалів (ВР),
залізосірчаних білків (ЗСБ) та нітрозильних комплексів в тканині печінки
визначали методом електронного парамагнітного резонансу (ЕПР) в умовах
низькотемпературної стабілізації в рідкому азоті (J. Hashimoto et. al.,
1962). Для циклофоса активність цитохрому Р-450 оцінювали за методом T.
Omura, R. Sato (1964).

При гострій і підгострій дії ФОП та РРР на організм щурів досліджували
низку показників неспецифічної резистентності організму (НРО), які
широко використовуються в сучасній імунології. Титри гетерофільних
гемагглютининів (ГГА) визначали за реакцією Пауля-Бунеля (Е.Ф.
Чернушенко, Л.С. Когосова, 1978), рівень ЦІК сироватки крові – за
здатністю їх осідати в поліетиленгліколі (ПЕГ) (Ю.А. Гриневич, А.Н.
Алферов, 1981), активність лізоциму в сироватці крові – турбідиметричним
методом (В.С. Карпенко та ін., 1977). Для деяких речовин визначали
кількість лейкоцитів, досліджували гемограму крові за допомогою
уніфікованих клініко-лабораторних методів (В.В. Меншиков, 1982),
функціональну активність нейтрофілів – за НСТ-тестом (Ю.І. Бажора та
ін., 1981), загальний білок у сироватці крові – за біуретовим методом
(Г.А. Кочетов, 1980) та фореграму білку сироватки крові – за допомогою
електрофорезу на папері (Р.П. Виноградова та ін., 1977).
Функціонально-метаболічну активність лейкоцитів оцінювали за активністю
кислої фосфатази в лімфоцитах і нейтрофілах (Ф.Г. Хейхоу, Д. Кваглино,
1983). Кількість природних кілерів (NK-клітин) визначали за
ультраструктурою лімфоцитів (Л.П. Киндзельский та ін., 1986).

В хронічних і субхронічних експериментах досліджували стан імунної
системи щурів за кількістю лейкоцитів і формених елементів крові,
активністю лізоциму, титрами ГГА, рівнем ЦІК, функціональною активністю
нейтрофілів за методами, зазначеними вище. Функціональну активність

Т-лімфоцитів вивчали за реакцією бластної трансформації лімфоцитів
(РБТЛ) на дію мітогену фітогемагглютинину (Метод. руководство, 1989).
Досліджували коефіцієнти маси тимуса і селезінки, як інтегральні
показники імунотоксичної дії ксенобіотиків, та характер змін в їх
морфоструктурі

(А. Хем, Д. Кормак, 1983). При хронічній дії циклофоса визначали
розподіл ізомерів у внутрішніх органах, в тому числі у тимусі і
селезінці, газохроматографічним методом, розробленим к.х.н. М.В.
Письменною. Для оцінки реактивності імунної системи на додатковий
антигенний стимул і встановлення порогових і недіючих рівнів хронічної
дії циклофоса та симарпа за їх впливом на імунну систему проводили
імунізацію тварин еритроцитами барана, визначали рівень ГГА і ЦІК у
сироватці крові, функціональну активність нейтрофілів.

На моделі ФОП вивчали залежність їх токсичності від стану імунної
системи інтактних і імунізованих еритроцитами барана щурів. Імунізацію
тварин проводили на 1 і 7 добу (0,5 мл суспензії еритроцитів барана,
внутрішньочеревинно). В період активного антитілогенезу (на 14 добу)
визначали ЛД50, середній час загибелі тварин (ЕТ50) (Г.Н. Красовский та
ін., 1982), індекс кумуляції (Ікум) (Б.М. Штабский, Ю.С. Каган, 1974) та
клініку гострого отруєння. При надходженні препаратів в організм
інтактних і імунізованих щурів в дозах, відповідних 1/2 ЛД50, через добу
визначали активність АХЕ еритроцитів і головного мозку, рівень ЦІК у
сироватці крові. На прикладі етафоса (при одноразовому пероральному
введенні в організм, 1/2 ЛД50), досліджена залежність специфічної дії
ФОП від стану НРО інтактних та імунізованих щурів, за методами,
зазначеними вище.

З метою з’ясування патогенезу ВНД афоса і ТОКФ через 3 і 7 діб
(латентний період), 14 діб (допаралітичний період) і 21 добу
(паралітичний період) вивчали стан організму курок і щурів за
клінічними, гематологічними та імунологічними показниками. Досліджували
морфологічний склад периферичної крові, визначали кількість Т-, В- і
0-лімфоцитів за активністю кислої фосфатази (Н.С. Кисляк, Р.В. Ленская,
1971), Т-хелперів (Тх) і Т-супресорів (Тс) – активністю кислої
неспецифічної естерази (J. Mueller et al., 1975), NK-клітин – за їх
ультраструктурою. Функціональну активність Т-лімфоцитів вивчали за РБТЛ
периферичної крові (И.А. Болотников, Ю.В. Конопатов, 1987), В-лімфоцитів
– титром ГГА в реакції Пауля-Бунеля, нейтрофілів – НСТ-тестом.
Досліджували рівень ЦІК в сироватці крові та їх дисперсність (П.В.
Стручков та ін., 1985). Титри аутоантитіл до антигенів із нервової
тканини інтактних курок і з ознаками ВНД та печінки визначали за
реакцією пасивної гемагглютинації за Бойденом (Метод. рекомендации,
1980). Тканеві антигени готували за методом Р.Ф. Аверкиної (1967),
хімічні антигени – за методом Г.М. Вольнової (1973). Кількість
антитілоутворюючих клітин (АУК) в периферичній крові визначали за
реакцією Ерне в модифікації Клемпарської (Метод. рекомендации, 1976).

Сенсибілізуючі властивості ТОКФ, афоса і циклофоса вивчали при
внутрішньошкірній ін’єкції (О.Г. Алексеева, Л.А. Дуева, 1978) та з
повним ад’ювантом Фрейнда (0,5 мл) при введенні в апоневроз лапок.
Тестування тварин проводили на 20 добу. Реакцію шкіри оцінювали за
п’ятибальною уніфікованою шкалою (Метод. вказівки, 1980), досліджували
реакції дегрануляції тучних клітин – РДТК (Метод. руководство, 1989),
специфічний лізис лейкоцитів (РСЛЛ), пасивну гемагглютинацію за Бойденом
(з хімічним і тканевим антигеном із нервової тканини і печінки).
Визначали титри ГГА, рівень ЦІК і проводили їх диференціацію за
дисперсністю.

Адоптивний перенос ВНД інтактним куркам проводили за допомогою
сенсибілізованих (in vitro та in vivo) лімфоцитів. В умовах in vitro
лейкоцити курок сенсибілізували афосом або ТОКФ (0,01%) упродовж 2-х
годин при 39?С в середовищі 199 з ембріональною телячою сироваткою і
глютаміном (Т.А. Кулакова, Н.В. Рудаков, 1980). Після інкубації
лейкоцити центрифугували, відмивали, підраховували їх кількість і
життєздатність за поглинанням 0,02% розчину трипанового синього.
Сенсибілізовані лейкоцити вводили куркам в кількості 6,0 млн. (для
афоса) і 5,4 млн. (для ТОКФ) в 0,5 мл фізіологічного розчину
внутрішньовенно 4 рази з інтервалом 7 діб. Реєстрували клінічні ознаки
ВНД, масу та приріст маси тіла тварин, досліджували рівень ЦІК і титр
ГГА у сироватці крові, кількість лейкоцитів, Тх та Тс, гемограму крові.
В умовах in vivo у сенсибілізованих курок забирали кров із вени,
виділяли лейкоцити, розводили фізіологічним розчином і визначали їх
життєздатність. Сенсибілізовані лейкоцити (14,5 млн. в 0,5 мл
фізіологічного розчину) вводили внутрішньовенно 4 рази з інтервалом 7
діб. Досліджували приріст маси тіла курок, поведінку, клінічні ознаки
ВНД.

Для профілактики нейропатій у курок використовували імунодепресант
циклофосфан. Вибір циклофосфану базується на тому, що він, пригнічує
активність всіх клонів імунокомпетентних клітин, зокрема Тх (Ю.К.
Наполов, К.Б. Борисов, 1991) і є ефективним при лікуванні
демієлінізуючих захворювань (розсіяного склерозу). Циклофосфан вводили
куркам внутрішньом’язово в дозі 20 мг/кг упродовж 4 діб. На 4 добу
вводили афос в дозі 100 мг/кг або 200 мг/кг, ТОКФ – 250 мг/кг. Через 3
дні після введення ФОП знову вводили циклофосфан (20 мг/кг упродовж 3
діб). Реєстрували клінічні ознаки інтоксикації, приріст маси тіла,
досліджували кількість Тх і Тс, функціональну активність Т- і
В-лімфоцитів, гемограму крові.

Для попередження виникнення парезів і паралічів при отруєннях
нейропаралітичними ФОП використовували гемокарбоперфузію для елімінації
патогенних ЦІК, аутоантитіл та корекції порушень імунної системи. ВНД
викликали афосом при пероральному введенні в організм курок в дозі 200
мг/кг. Гемокарбоперфузію проводили на 10-14 добу після отруєння. Для
гемосорбції використано твердофазний пористий вуглецевий гемосорбент
марки СКН-2к, який має високі сорбційні властивості. (В.Г. Николаев,
1984; V.V. Strelko et al., 1994). Об’єм перфузії становив 2-3 об’єму
циркулюючої крові. До гемокарбоперфузії, під час гемокарбоперфузії та на
21 день після отруєння (14 день після гемокарбоперфузії) досліджували
кількість лейкоцитів, гемограму крові, імунологічні показники: кількість
NK-клітин, функціональну активність нейтрофілів, кількість Т-, 0- і
Т-лімфоцитів, Тх і Тс, функціональну активність Т-лімфоцитів і
В-лімфоцитів, рівень ЦІК у сироватці крові за вищевказаними методами.
Реєстрували клінічні ознаки ВНД.

Результати досліджень оброблені методами параметричної статистики за
спеціальними програмами (А.М. Шевченко та ін., 1987). З’ясування
взаємозв’язків між дослідженими показниками проводили за допомогою
кореляційного та дисперсійного аналізу (О.П. Минцер та ін., 1982; С.Н.
Лапач та ін., 2002). Для аналізу всієї сукупності взаємопов’язаних
властивостей досліджуваних параметрів, з урахуванням характеру їх
зв’язків, використовували метод головних компонент (К. Иберла, 1972; Г.
Харман, 1972).

Результати досліджень та їх обговорення. Дослідження ролі
монооксигеназної і імунної систем організму в токсичній дії
фосфорорганічних пестицидів і синтетичних регуляторів росту рослин.
Встановлено, що за умов гострої пероральної дії (1/2 ЛД50) ФОП:
гетерофос, етафос, циклофос і його тіоловий ізомер, ЄШ-7 через 3-24 год.
інгібують активність АХЕ еритроцитів щурів на 86-100%. Відновлення
активності АХЕ відбувалось на 7-15 добу, за винятком етафоса, який в
кінці досліджень інгібував активність АХЕ на 23%. В період виражених
холінергічних ознак інтоксикації (1 доба) спостерігалось найбільш
значиме зниження активності N-деметилази печінки: за дії циклофоса – на
84%, інших речовин – 41-60%. Вміст цитохрому Р-450 та ЗСБ знижувався в
меншій мірі (р?0,05), ніж активність N-деметилази печінки. Відновлення
активності N-деметилази печінки відбувалось (приміром в 2 рази) швидше,
ніж АХЕ. Вплив ФОП на НРО характеризувався фазовими змінами. Збільшення
активності лізоциму превалювало над інгібуванням і в порівнянні з
контролем через 1 і 3 доби становило 11-34% (р?0,05), через 7 діб –
33-104% (р?0,05). Оскільки лізоцим інтенсивно виділяється нейтрофілами
(Р.А. Томпсон, 1983; П.Ф. Забродский, 2002), то даний факт може бути
пов’язаний з активацією метаболічних процесів в нейтрофілах крові.
Спостерігалась тенденція до збільшення титру ГГА в сироватці крові.
Найбільший рівень ЦІК виявлений у токсикогенній фазі (на 45-199%) і на 7
добу досліджень (86-193%) – в момент відновлення активності АХЕ і МОГС.

За умов підгострої пероральної дії (1/5 ЛД50) ФОП антихолінестеразний
ефект був помірно вираженим, але для гетерофоса і ЄШ-7 поглиблювався з
часом, відновлення ферменту відбувалось на 15 добу, за винятком етафоса,
який в цей період часу інгібував активність АХЕ еритроцитів в 2 рази
більше, ніж при гострій дії. Виявлено зниження активності АХЕ (на 27%) і
у тіонового ізомеру циклофоса, що пов’язано з його ізомеризацією під
впливом МОГС в тіоловий (Е.А. Ершова, П.Г. Жминько, 1989). Зміни значень
показників МОГС мали фазовий характер і не співпадали в часі. Циклофос і
його тіоновий ізомер, етафос і ЄШ-7 викликали індукцію активності
N-деметилази печінки (р?0,05) на 80%, 52%, 29%, 21% відповідно. За дії
циклофоса збільшення активності п-гідроксилази печінки у 2,6 рази було
більшим, ніж N-деметилази. Етафос викликав слабку, але стійку індукцію
МОГС. Тіоловий ізомер циклофоса інгібував активність МОГС в усі строки
досліджень на 48-59%. Підвищення вмісту ВР було незначним (10-29%), за
винятком гетерофоса – 58% і спостерігалось у той же час, що й індукція
МОГС, і це може бути пов’язано як з інтенсифікацією обміну речовин
(Ажипа Я.И., 1983), так і з генерацією активних форм кисню (О.И.
Цебржинский, 1992). Індукція активності лізоциму проявлялась через 1 або
3 доби і становила для гетерофоса, етафоса і ЄШ-7 відповідно 45%, 75% і
33%. Тіоновий ізомер циклофоса знижував активність ферменту лише через 1
добу на 76%. Максимальний рівень ЦІК спостерігався через 3 доби
(105-198%, р?0,05) і в кінці досліду приходив до норми.

РРР, як і ФОП, в залежності від дози і строків досліджень чинили
різноспрямовану дію на активність ферментів МОГС. За гострої дії симарп
і івін знижували N-деметилазну активність на 57% і 35%, п-гідроксилазну
– на 67% і 23% (р?0,05) відповідно. Ресин в токсикогенній стадії
збільшував

п-гідроксилазну активність на 73% і знижував N-деметилазну активність на
36%. Для івіна характерним було збільшення вмісту окисленої форми
цитохрому Р-450 на 73-115% і нітрозильних комплексів у 3-5 разів, яке
зберігалось на тому ж рівні і в менших дозах (12,6 і 1,26 мг/кг), що
вказує на активацію ферментативних систем, які відповідають за
денітрозування NO-попередників. Оскільки ендогенний NO виконує в
організмі важливі регуляторні функції (M.J. Szabolcs et al., 1998; T.
Sardon et al., 2004), то гіперпродукція його може призвести до розвитку
різної патології, що потребує подальших досліджень.

Зміни показників НРО за гострої дії івіна характеризувались збільшенням
абсолютної кількості нейтрофілів і їх функціональної активності в усі
строки досліджень на 36-141%. В крові виявлені плазматичні клітини.
Рівень ЦІК у сироватці крові підвищувався тільки на 7 добу на 123%. За
дії ресина в усі строки досліджень збільшувались активність кислої
фосфатази в лімфоцитах на 41-83% і нейтрофілах – на 24-51%, титри ГГА –
на 59%. Підвищення рівня ЦІК і вмісту ?-глобулінів у сироватці крові
спостерігалось тільки в токсикогенній стадії на 56% і 29% (р?0,05)
відповідно. Симарп за гострої дії упродовж доби викликав нейтрофільоз,
лімфоцитопенію. На 3 добу спостерігалась нейтропенія, яка обумовлена
руйнуванням клітин (каріоліз, хроматиноліз, вакуолізація ядра і
цитоплазми), виявлена підвищена кількість плазматичних клітин,
пролімфоцитів і атипічних лімфоцитів. Цитотоксична дія симарпа
супроводжувалась зниженням функції нейтрофілів на 52%. Їх функціональна
активність компенсувалась збільшенням загального числа нейтрофілів в
крові. Рівень великодисперсних ЦІК збільшувався на 75% і з відновленням
активності нейтрофілів приходив до норми.

При підгострій дії ресин викликав нестійку індукцію N-деметилазної
активності на 21%, п-гідроксилазної – на 73%, збільшення вмісту
цитохрому Р-450 на 48%. Івін через 3 доби інгібував N-деметилазну
активність на 48%, в подальшому спостерігалась індукція ферменту – на
90%. Їх вплив на НРО характеризувався невираженим лейкоцитозом,
нейтрофільозом і лімфоцитопенією, збільшенням рівня ЦІК на 56-78%,
функціональної активності нейтрофілів – на 55-156% та лімфоцитів –
50-225%. Збільшення вмісту ?-глобулінів – на 35% виявлено тільки за дії
івіна.

Таким чином, направленість (індукція або інгібування) і ступінь змін
активності МОГС під впливом ФОП і РРР залежать від дози і часу дії на
організм. За умов гострих і підгострих інтоксикацій, в момент
інгібування МОГС, спостерігається підвищення імунної реактивності
організму, що вказує на існування реципрокних взаємозв’язків між
вказаними системами. Метаболічна активація нейтрофілів і лімфоцитів
сприяє зменшенню рівня ЦІК, що знижує токсичну дію ксенобіотиків.
Оскільки лімфоцити і нейтрофіли є фіксаторами токсинів, а також одним із
місць метаболічних перетворень (М. Lund-Pero et. al., 1989; Є.А.
Имельбаева, 1997; А.Ф. Сафина, 1999), то виявлені зміни НРО можна
розглядати як такі, що направлені на детоксикацію і збереження
гомеостазу. Оскільки антихолінестеразна дія гетерофоса, етафоса, ЕШ-7 і
тіонового ізомеру циклофоса підвищувалась при індукції МОГС, то цей факт
можна пояснити їх активацією і утворенням більш токсичних сполук (Є.А.
Єршова та ін., 1988, 1989).

При субхронічній дії івіна в дозі 130 мг/кг зміни НРО наступали раніше,
ніж МОГС і мали фазовий характер. Через місяць спостерігались
нейтрофільоз, зниження функціональної активності нейтрофілів на 49%,
титру ГГА – на 13%, збільшення рівня ЦІК у сироватці крові – на 75%.
Через 2 місяці інгібування N-деметилазної активності становило 76%. В
цей час збільшувалась метаболічна активність нейтрофілів в 2 рази,
рівень ЦІК не відрізнявся від контролю, що вказує на їх елімінацію.
Аналогічні дані окислювального метаболізму нейтрофілів щурів виявлені
при субхронічній дії 2,4-Д кислоти (Р.Р. Абеллузіна та ін., 2000).

При хронічному надходженні в організм щурів циклофос лише в дозі 6,3
мг/кг чинив виражений антихолінестеразний ефект. Зниження активності АХЕ
еритроцитів становило 79% і в 2 рази було більшим, ніж ХЕ печінки і
сироватки крові. Виявлено накопичення ізомерів циклофоса в різних
тканинах щурів, приблизно в рівному ступені. Пік накопичення тіолового
ізомеру циклофоса приходився на четвертий (в тимусі – 0,19 мкг/г, жиру
сальника і легенях – 0,08 мкг/г, печінці і селезінці – 0,04 мкг/г) і
шостий місяці досліджень (нирках – 0,39 мкг/г, головному мозку – 0,03
мкг/г, крові – 0,01 мкг/г). Накопичення ізомерів в жирових тканинах
зменшувало їх рівень в крові, що сприяло менш вираженому інгібуванню АХЕ
(на 39%), а вивільнення із жирового депо – збільшувало
антихолінестеразну дію (на 49%). Аналогічна залежність пролонгуючої
антихолінестеразної дії від накопичення в жировому депо виявлена також
для фосфаміду ФОП (Л.Г. Александрова, 1990) і фенітротіону
(Фосфорорганические инсектициды, 1990).

Циклофос і симарп у високих дозах (6,3 і 23 мг/кг відповідно) лише в
перші строки досліджень інгібували N-деметилазну активність на 29% і 38%
відповідно. Вплив на імунну систему щурів обох речовин був однотиповим і
характеризувався імунодепресивною дією. Циклофос в різні строки
досліджень викликав зниження активності лізоциму в сироватці крові на
21-47%, НСТ-тесту – на 24%, РБТЛ – на 26-33%, титру ГГА – більше на 50%.
Через 4 місяці спостерігалось збільшення абсолютної маси тимуса і
селезінки на 30%, через 6 місяців – зменшення маси тимуса на 11%
(р?0,05). Морфологічні зміни імунокомпетентних органів характеризувались
судинними та дистрофічними порушеннями, інфільтрацією
лімфогістоцитарними елементами. У тимусі виявлені мікронекрози в
мозковому шарі, у селезінці – гіпертрофію периферичної частини
фолікулів. У відновлюючий період (1 міс.) зниження РБТЛ, НСТ-тесту і
активності лізоциму становило 20-26% (р?0,05), що свідчить про
гальмування функції імунокомпетентних клітин.

Симарп через 0,5 міс. знижував титр ГГА на 55%, збільшував абсолютну
кількість нейтрофілів, їх функціональну активність на 128%, а також
рівень ЦІК – на 23% (р?0,05). В подальшому функціональна активність
нейтрофілів зростала, але через 6 місяців виявлено зниження РБТЛ на 27%,
абсолютної маси тимуса – на 16% (р?0,05). В червоній пульпі селезінки
визначались лімфоїдні вузлики, спостерігалась помірна гіперплазія білої
пульпи, гермінативні центри фолікул були розширені, серед клітинних
елементів збільшувалась кількість бластних форм. Тканина тимуса була
розрізнена невеликими долями, жирова клітковина займала більшу частину
площини зрізу. Судини клітковини були різко гіпереміровані, виявлені
геморагії. Межа між корою і мозковою речовиною була зтушована. Кількість
лімфоцитів в корі зменшувалась, в мозковій речовині виявлені
епітеліальні клітини (по 3-5 клітин в групі).

Циклофос в дозі 0,63 мг/кг інгібував N-деметилазну активність в 1,5 рази
більше, ніж в дозі 6,3 мг/кг. Через 1 і 6 місяців виявлено збільшення
функціональної активності нейтрофілів на 39% і 79% відповідно. Симарп
(2,3 мг/кг) в кінці експерименту збільшував абсолютну кількість
нейтрофілів на 104% і їх функціональну активність – на 87%.

У імунізованих еритроцитами барана щурів (рис. 1), яким перорально
вводили циклофос в дозі 6,3 мг/кг або симарп – 23 мг/кг, виявлено
зниження титрів ГГА, рівня ЦІК, функціональної активності нейтрофілів,
що свідчить про гальмування імунної відповіді на додатковий антигенний
стимул. При імунізації щурів, які отримували симарп в дозі 2,3 мг/кг
значимих змін досліджених показників не встановлено. За дії циклофоса
(0,63 мг/кг) у імунізованих щурів виявлено підвищення функціональної
активності нейтрофілів (р?0,05), але в меншому ступені (на 21%), ніж у
тварин, які не піддавались імунізації. Це свідчить про те, що істинної
адаптації імунної системи за дії циклофоса не відбувається. Тому, за
імунологічними критеріями шкідливості дозу циклофоса – 0,63 мг/кг можна
визнати пороговою, симарпа – 2,3 мг/кг – підпороговою.

Рис. 1. Імунологічні показники у щурів, отруєних циклофосом

(6,3 мг/кг) або симарпом (23 мг/кг), після імунізації еритроцитами
барана.

Тут і на рис. 2-5 * – Р?0,05 у порівнянні з контролем

Таким чином, циклофос і симарп викликають імунодепресивний ефект за
Т-типом. При оцінці шкідливої дії хімічних речовин критеріальними є
показники стану НРО та імунної системи, що підтверджує попередні
дослідження (П.Г. Жминько, 1988, 1989) та дані літератури (В.А. Желтов,
1980; I.K. Thomas, Т. Imamura, 1986). Імунізація щурів еритроцитами
барана знижує імунну реактивність і продукцію антитіл, що узгоджуються з
іншими даними (А.И. Олефир, 1978; I. Desi et. al., 1978; R. Repetto,
S.S. Baliga, 1996) і може бути використана для диференціації порогових і
недіючих рівнів засобів захисту рослин. На основі власних досліджень та
даних літератури розроблені підходи щодо регламентації хімічних речовин
в об’єктах довкілля з урахуванням імунологічних порушень, які викладені
в Методичних рекомендаціях (№356 від 25.07.2003 року). У комплексі
показників, що застосовуються для виявлення токсичного ефекту,
імунологічні показники розглядаються як інтегральні. При оцінці
порогових доз необхідно враховувати спрямованість і стійкість змін
імунологічних показників. Для диференціації адаптації організму від
пошкоджень може бути застосована імунізація тварин еритроцитами барана.

Дослідження ролі неспецифічної реактивності організму в токсичній дії
хімічних засобів захисту рослин. Вираженість токсикогенної стадії
хімічного стресу може залежати від багатьох неспецифічних ефектів, які в
сукупності з специфічним формують відповідну патологію (С.Н. Голиков,
1986). Методом рівноважного діалізу встановлено, що найбільшу
спорідненість ФОП до альбуміну мали афос, етафос і оксифосфонат (в
структурі яких є атоми хлору). Гетерофос і тіоловий ізомер циклофоса
зв’язувались з альбуміном в меншому ступені. Ступінь зв’язування з ЛСА
афоса становила 98,7%, етафоса – 78%, тіолового ізомеру циклофоса – 48%,
гетерофоса – 30,9%. Спорідненість до білків сироватки крові різних видів
тварин (табл. 1) найбільш виражена у етафоса. Ступінь зв’язування
етафоса з білками сироватки крові знижувалась в ряду – кріль, щур,
людина, курка; гетерофоса – щур, кріль, людина, курка.

Таблиця 1

Ступінь зв’язування ФОП з білками сироватки крові, %

Найменування речовин Щури Кролі Курки Людина

Етафос 81,2 87,2 67,8 75,0

Тіол-ізомер циклофоса 48,3 48,7 47,9 42,2

Гетерофос 32,4 25,2 16,9 24,9

Тіон-ізомер циклофоса 2,0 6,8 0 0

Тіоновий ізомер циклофоса не зв’язувався з білками сироватки крові.
Відмінностей в зв’язуванні з білками сироватки крові досліджених видів
ссавців у тіолового ізомеру циклофоса не виявлено. Найбільша відмінність
в зв’язуванні з білками, в залежності від виду ссавців, характерна для
гетерофоса: в порівнянні з щурами, у курок ступінь зв’язування був
меншим на 47,8%, у людини – на 23,1%, у кролів – на 22,2%.

Аналіз гострої токсичності досліджених ФОП показав, що ЛД50 гетерофоса і
етафоса для курок, у порівнянні з щурами, вища в 17,5, циклофоса – в
12,8 разів. Це вказує на те, що зв’язування з білками сироватки крові
сприяє зменшенню токсичності і, в залежності від видоспецифічності
білку, може обумовлювати видову чутливість до дії ФОП.

Між ступенем зв’язування ФОП з білками і їх антихолінестеразною дією (in
vitro) встановлено пряму залежність. Так, зв’язування ФОП з ЛСА сприяло
значному зменшенню інгібування чистої АХЕ еритроцитів людини, на що
вказує збільшення I50: за дії оксифосфоната і афоса – більше, ніж на
2,0; етафоса – на 1,6; тіолового ізомера циклофоса – на 1,05, гетерофоса
– на 0,7 порядки. I50 після зв’язування ФОП з IgM сироватки крові
людини, в порівнянні з ЛСА, була в 3-6 разів більшою. Це свідчить про
те, що ФОП зв’язуються з IgM в меншому ступені, ніж з ЛСА і узгоджується
з даними А. Альберт (1989). Після інкубації ФОП з ЛСА інгібування АХЕ
нативних еритроцитів або ХЕ сироватки крові щурів зменшувалось в
більшому ступені, ніж чистої АХЕ еритроцитів людини, що обумовлено
додатковою сорбцією їх на мембранах та взаємодією з білками сироватки
крові (імуноглобулінами, неспецифічними естеразами, ліпопротеїдами).

Оскільки ФОП зв’язуються з імуноглобулінами і природними антитілами
(А.Я. Кульберг та ін., 1986), то не виключено, що цей процес може
залежати від стану імунної системи. Встановлено, що у імунізованих
еритроцитами барана щурів в період активного антитілогенезу гостра
токсичність ФОП збільшувалась (за винятком циклофоса): ТОКФ – в 1,2;
гетерофоса і афоса – в 1,3; етафоса – в 1,4 рази. Холінергічні
симптомами інтоксикації наступали раніше і були більш виразніші, ніж у
неімунізованих щурів. Величина ЕТ50 при імунізації щурів знижувалась за
дії ТОКФ, циклофоса і гетерофоса на 26, 17 і 69%, і збільшувалась за дії
афоса і етафоса – на 24% і 130% відповідно. За дії етафоса виявлено
збільшення Iкум,, ТОКФ, циклофоса і афоса – зменшення. Це свідчить про
те, що на фоні імунізації еритроцитами барана кумулятивний ефект у
етафоса збільшується, у ТОКФ, циклофоса і афоса – зменшується.

Із даних рис. 2 видно, що у імунізованих щурів за умов гострої дії ФОП,
через добу із зменшенням рівня ЦІК зростало інгібування активності АХЕ
еритроцитів (до 20%), а також АХЕ головного мозку, особливо при дії
циклофоса – на 17,9%, афоса – на 11,4%, ТОКФ – на 12,2%, ніж у інтактних
тварин. Оскільки, у імунізованих щурів не утворювались ЦІК, то
збільшення антихолінестеразної дії ФОП можна пояснити збільшенням їх
вільної концентрації в крові. Більш виражена токсична і кумулятивна дія
етафоса може бути обумовлена тим, що взаємодія з альбуміном і
імуноглобулінами крові перешкоджають проникненню його в мозок і
реалізація токсичного ефекту відбувається на периферії.

Рис. 2. Ступінь інгібування активності АХЕ еритроцитів і рівень ЦІК
сироватки крові інтактних і імунізованих щурів при однократній дії ФОП
(1/2 ЛД50)

Для підтвердження ролі імунної системи в детоксикації ксенобіотиків (на
прикладі етафоса) показано, що при надходженні його в організм інтактних
щурів в дозі 1/2 ЛД50 функціональна активність нейтрофілів на 1 добу
забезпечувалась за рахунок збільшення кількості нейтрофілів в крові. В
подальшому (рис. 3) спостерігались збільшення рівня ЦІК та виражена
метаболічна активація нейтрофілів (у 2-3 рази), в крові накопичувались
великодисперсні ЦІК, які легко піддаються солюбілізації і виведенню з
організму за допомогою фагоцитозу.

Рис. 3. Функціональна активність нейтрофілів (НСТ-тест) і рівень ЦІК
сироватки крові інтактних і імунізованих еритроцитами барана щурів при
одноразовій дії етафоса (1/2 ЛД50)

Із збільшенням рівня ЦІК і функціональної активності нейтрофілів
зменшувався і антихолінестеразний ефект. Відновлення активності АХЕ на 3
і 7 добу становило 24% і 32%. У імунізованих щурів під впливом етафоса
рівень ЦІК не відрізнявся від контролю. Упродовж доби спостерігався
нейтрофільоз, але функціональна активність нейтрофілів була на рівні
контролю або знижувалась на 3 добу. В подальшому збільшувалась кількість
диформазан-позитивних нейтрофілів, але їх метаболічна активність
залишалась на рівні контролю. Відновлення активності АХЕ на 3 і 7 добу
становило всього 2,7% і 12,2% відповідно.

Таким чином, на фоні імунізації еритроцитами барана у щурів
спостерігається напруження реактивності імунної системи і вона
неадекватно реагує на додатковий антигенний стимул (етафоса). При цьому
спостерігається більш виражений і стійкий антихолінестеразний ефект і
більш пізнє відновлення активності АХЕ еритроцитів. Це вказує на те, що
імунна система приймає безпосередню участь у детоксикації ксенобіотиків
за допомогою утворення імунних комплексів і елімінації їх з організму
клітинами макрофагальної системи. Зниження функціональної активності
нейтрофілів сприяє порушенню гомеостазу і призводить до збільшення
токсичності і кумулятивної дії речовин. Результати досліджень
узгоджуються з даними В.І. Саноцького та ін. (1998), M.D. Fernandes et
al., (1999), Є.В. Давидової та ін. (2004), які показали, що при гострих
отруєннях ФОП для людей також характерне пригнічення функціональної
активності нейтрофілів, що корелює із ступенем важкості отруєнь і має
високе прогностичне значення.

Біологічні мембрани, як і білки сироватки крові, також можуть бути
однією із ділянок втрат ксенобіотиків на їх шляху до мішені біологічної
дії. На моделі 2-х фазної водно-ліпідної системи встановлено, що
випробувані ФОП і РРР змінюють біофізичні характеристики ШФМ – граничний
потенціал (??), поверхневий натяг (??), електричний опір (Rг) і
заповнюють границю розподілу фаз “ліпід-вода” переважно в концентраціях
1?10-6, 1?10-5 моль/л, що свідчить про їх високу мембранотропну
активність. Найбільший вплив на стан ШФМ, за вказаними показниками,
чинили сполуки, які мали в своїй структурі ліпофільні групи (Cl-, CCl3-,
CCl2-, СN). Серед ФОП – це оксифосфонат, афос, хлорофос, ДДВФ, фоксим;
РРР – хлорхолінхлорид і симарп.

За дії оксифосфонату, афоса, малаоксона більш значиме збільшення
електропровідності штучних бішарових мембран (ШБФМ) викликали
оксифосфонат і афос в концентраціях 1?10-8 – 1?10-4 М. Цей ефект в
більшій мірі виявлявся у разі, коли на мембрані відтворювали різницю
потенціалу із позитивним знаком (+100 мВ), що вказує про їх здатність
проникати через ШБФМ в електровід’ємній формі. Виявлена залежність між
зменшенням електричного опору ШФМ і діаметром пор. Показано, що фталофос
і ДДВФ мають більшу здатність проникати через пори мембран, ніж
оксифосфонат, хлорофос, фоксим.

За даними Л.Г. Александрової (1990), похідні тио- і дитіофосфорної
кислоти з фенільними і алкільними радикалами мають менший ступінь
гідрофобності, ніж похідні з атомом азоту в гетероциклі та похідні
дитиофосфорної кислоти з NH-групою. Похідні тио- і дитиофосфорної
кислоти (тіоловий ізомер циклофоса, карбофос, ізомалатіон, малаоксон),
також мають незначну гідрофобність (lgPo/в становить 1,1-2,6) в
порівнянні з фоксимом і фталафосом, у структурі яких є група СN або атом
азоту в гетероциклі (lgPo/в – 4,2 і 3,2 відповідно). Високу
гідрофобність афоса, оксифосфоната і етафоса (lgPo/в 5,05, 5,04 і 4,2
відповідно) можна пояснити наявністю в їх структурі ліпофільних груп,
які можуть обумовлювати їх здатність до сорбції на мембранах.

N

r

? ® 8

f

B

D

F

H

J

L

N

P

R

??????R

j

l

n

p

r

 

c

~ ? ¬ ® u 8

j

?c=o@»N’P?RPTcU,W XaYx[u\„^th_2eUe1/4UeUeUeUeUeUeUe1/4™yUeUe

ss¦a–ia1/2???z????z???

O

@

@

?????(?

O

$

O

O

?????(?

?????(?

O

$

O

O

???????рани еритроцитів щурів показали, що як за умов in vitro, так і in
vivo спостерігаються однонаправлені зміни стану мембран, які
характеризуються зниженням активності Nа+,К+-АТФази та підвищенням
гемолізу еритроцитів до впливу температури (+50?С), що вказує на
порушення транспорту одновалентних катіонів та в’язкості ліпідного шару
мембран. За умов in vitro (рис. 4) в концентрації 1?10-4 моль/л зниження
активності Nа+,К+-АТФази було більш виражено у фоксима (84%) і дурсбана
(60%), ніж хлорофоса і афоса (39%). Ступінь гемолізу еритроцитів під
впливом температури суттєво підвищувався (р?0,05) при дії хлорофоса,
дурсбана, карбофоса, афоса. Збільшення інтенсивності ПОЛ виявлено лише у
хлорофоса (182%), що може бути причиною зміни структури мембран.
Тіоловий ізомер циклофоса не чинив мембранотоксичної дії.

Рис. 4. Вплив ФОП (1?10-4 моль/л) на мембрани еритроцитів щурів

(in vitro)

При одноразовому пероральному введенні ФОП (1/2 ЛД50) за дії хлорофосу
зміни досліджених показників були майже однакові, як і в концентрації
1?10-4 моль/л. Для карбофоса, ТОКФ і афоса більш характерним було
зниження активності Nа+,К+-АТФази (на 90%, 63% і 51% відповідно).
Підвищення ступеню гемолізу відбувалось тільки за дії карбофоса (160%) і
дурсбана (42%). Циклофос не змінював стан мембран еритроцитів. Оскільки
карбофос і афос викликали більш виражені зміни активності Nа+, К+-АТФази
та гемолізу еритроцитів в умовах in vivo, ніж in vitro, то це можна
пояснити утворенням їх токсичних метаболітів – малаоксона і
оксифосфонату відповідно (С.С. Михайлов, И.Г. Щербак, 1983; К.М.
Астанакулов, 1983). Підтвердженням цього є той факт, що дія малаоксона і
оксифосфоната на біофізичні характеристики ШФМ більш виражена, ніж у
карбофоса і афоса. За умов гострої дії (1/2 ЛД50) афос, ТОКФ, циклофос
знижують активність мембранозв’язаних ферментів мітохондрій щурів – СДГ
на 38-60% і ЦО – на 47-56%, збільшують пасивний набряк мітохондрій в
ізотонічному (до 213%) або гіпотонічному розчинах сахарози (до 117%).
Оскільки за дії циклофоса і ТОКФ спостерігалось збільшення набряку
мітохондрій лише в гіпотонічному розчині сахарози, то не виключено, що
під їх впливом відбувається збільшення розкладу фосфатидилдиетаноламінів
і кардіоліпінів в мембранах (А.В. Каргаполов, 1979). Виявлені зміни
можуть призвести до порушень структури мітохондрій, енергетичних і
окислювальних процесів в них.

РРР івін в умовах іn vitro не викликав змін стану мембран еритроцитів
щурів і людини. Не встановлено впливу його і на мембрани еритроцитів
щурів в дослідах in vivo. Вплив івіна на мембрани мітохондрій печінки
щурів не залежав від введеної дози. Так, за дії івіна в дозі 630 мг/кг
активність СДГ знижувалась на 26%, ЦО збільшувалась на 213%. В дозі 12,6
мг/кг спостерігалось підвищення активності ЦО на 56% та інтенсивності
ПОЛ на 45-81%. В дозі 1,26 мг/кг виявлено лише підвищення інтенсивності
ПОЛ в мітохондріях на 45%. Відсутність залежності “доза-ефект”, може
бути пов’язана з особливостями взаємодії івіна з рецепторами мембран та
його токсикокінетикою і потребує подальших досліджень.

Даними дослідженнями підтверджується те, що існує висока
взаємозалежність між ступенем взаємодії хімічних речовин з фосфоліпідами
ШФМ і їх спорідненістю до альбуміну. Циклофос, для якого характерне
незначне зв’язування з альбуміном, проявляє і меншу мембранотропну
активність. Афос, оксифосфонат, етафос мають високу спорідненість до
альбуміну і проявляють високу мембранотропну активність. Однак, в умовах
in vivo, ця залежність не завжди може зберігатись, що необхідно
враховувати при прогнозуванні мембранотоксичної дії ксенобіотиків.

Дослідження взаємозв’язків між показниками імунної і монооксигеназної
систем організму при інтоксикаціях фосфорорганічними пестицидами і
синтетичними регуляторами росту рослин. При гострій дії ФОП виявлено
високу кореляцію (р<0,05) між показниками АХЕ і ДА для етафоса і тіолового ізомеру циклофоса (r=+0,82), ЄШ-7 (r=+0,94); підгострій дії – між АХЕ і ДА для тіолового ізомеру циклофоса (r= 0,96), ЄШ-7 (r=-0,82) і гетерофоса (r=-0,97), АХЕ і цитохромом Р-450 для гетерофоса (r=-0,80), що вказує на залежність їх антихолінестеразної дії від активності МОГС. При підгострій дії ФОП спостерігалась висока кореляція між показниками АХЕ і ГГА для етафоса (r=-0,88) і ЄШ-7 (r=-0,80), АХЕ і лізоциму для тіонового ізомера циклофоса (r=+0,86) і ЄШ-7 (r=+0,88); АХЕ і ЦІК для ЄШ-7 (r=-0,94) і гетерофоса (r =-0,98). Наявність оберненої кореляції між показниками АХЕ і ЦІК вказує на те, що антихолінестеразна дія цих речовин зменшується при збільшенні рівня ЦІК і це може свідчити про участь імунних комплексів в детоксикації. Між показниками МОГС і імунної системи спостерігалась переважно від’ємна середня кореляція. При гострій дії РРР виявлена висока кореляція (р<0,05) між показниками МОГС і імунної системи: для ресину між ГА (гідроксилюванням аніліну) і ЦІК (r=+0,97), симарпа – ГА і НСТ-тестом (r=+0,97), цитохромом Р-450 і НСТ-тестом (r=-0,83) та підгострій дії для івіна між ДА і ЦІК (r=-0,87), ДА і НСТ-тестом (r=-0,83). Отримані результати свідчать про те, що при дії ФОП і РРР між окремими показниками МОГС і імунної системи прослідковуються реципрокні взаємовідношення, які залежать від дози і часу дії ксенобіотиків. Для проведення факторного аналізу використані змінні всіх досліджених показників при різних дозових навантаженнях ФОП (1/2 і 1/5 ЛД50). Установлено, що виміряні значення змінних корелюють слабо. Показано наявність позитивної кореляції змінних ХЕ – ДA і негативної кореляції ХЕ – ЦIK по рівню значимості 0,1. Діаграми розсіювання візуально не вказували на існування значимого зв’язку між змінними, тому регресійний аналіз був малоінформативним. Аналіз часових рядів показав, що всі залежності (за винятком ХE і ЦIK) мають нерегулярний характер. Коефіцієнти розкладання (zmn), що визначають внесок кожного параметру у відповідну головну компоненту, свідчать, що перші дві головні компоненти вичерпують біля 70% сумарної дисперсії, тобто вони є найбільш інформативні. Компонента А1 визначається ЦIK (zmn=0,9446) з деяким позитивним внеском ГГA (zmn=0,1641) і лізоциму (zmn= 0,1625) та негативним внеском ХЕ (zmn=-0,1978). Для компоненти А2 значущими є ХE (zmn=0,7505), ДA (zmn= 0,5678), цитохром P-450 (zmn=0,3152). Аналіз діаграм показав відмінності в дії препаратів на об’єкти як в залежності від дози, так і в залежності від речовини. По компоненті А1 чітко проявляється дозова залежність, по компонентам А2 і А3 спостерігається розподілення об’єктів за типом речовини, якісно виділене областями простору ознак. Оскільки компонента А1 практично повністю корелює з дозовим навантаженням досліджених речовин, імовірно, її можна вважати загальним показником стану організму. Компоненти А2 і А3 у сукупності визначають тип речовини, тобто характерні зміни організму, які викликані дією агента. Основний внесок в розподілення об’єктів за дозовим навантаженням вносить параметр ЦIK, тоді як розподілення по типу діючої речовини обумовлено значеннями змінних ЦIK, лізоцима та ХЕ. Для РРР в якості змінних були цитохром Р-450, ДA, ГA, ЦIK, ГГA, НСТ-тест. Встановлено, що досліджені РРР утворюють в просторі чітко розподілені кластери, що свідчить про різний характер їх дії. Основний внесок в компоненту А1 дають НСТ-тест (zmn=-0,7489) і цитохром Р-450 (zmn=-0,6463). При хронічній дії циклофоса виявлена негативна кореляція між ХЕ сироватки крові і ЦІК за рівнем значимості 0,1. Характерним для циклофоса є наявність високої позитивної кореляції між ХЕ і імунологічними показниками (лізоцимом, ГГА, РБТЛ, НСТ-тест), що може свідчити про залежність імунодепресивної дії від його антихолінестеразного ефекту. Компонента А1 визначає дозове навантаження циклофосом, регулярної залежності від строків досліджень не виявлено. Дослідження ролі імунної системи в патогенезі віддаленої нейротоксичної дії фосфорорганічних речовин. Встановлено, що при внутрішньошкірній сенсибілізації курок афос у 43%, ТОКФ – у 37,5% тварин викликали позитивну реакцію шкіри. У сенсибілізованих афосом курок підвищувались РСЛЛ на 12,3%, РДТК до афоса – на 250% і тканинного антигену із головного та спинного мозку інтактних курок – на 150%, тканинного антигену головного мозку курок із клінікою ВНД – на 231%, відбувалось накопичення дрібнодисперсних ЦІК (Кд/в становив 1,6-7,0), що свідчить про алергізацію організму і розвиток аутоімунного процесу. У сенсибілізованих курок ТОКФ виявлено вірогідне підвищення РДТК до антигенів головного і спинного мозку інтактних курок на 245%, накопичення в крові середньодисперсних ЦІК (Кд/в = 1,2), зниження рівня ГГА – 20%. Циклофос не чинив сенсибілізуючої дії на організм курок. Сенсибілізація ТОКФ і афосом з повним ад’ювантом Фрейнда призводила до більш виражених аутоімунних порушень в організмі курок, у деяких тварин спостерігались ознаки ВНД – м’язова слабкість, адинамія, атаксія, а також зниження маси тіла, яке прогресувало з часом. При дії обох речовин на 21 добу підвищувались титр ГГА в 1,3 рази, рівень дрібнодисперсних ЦІК (за дії ТОКФ на 87%, афоса – на 46%), РДТК до тканинного антигену головного мозку інтактних курок – на 547 і 230% відповідно. За дії ТОКФ у курок збільшувався титр аутоантитіл до аутоантигену із спинного і головного мозку інтактних тварин на 821 і 130%, афоса – на 543 і 309% відповідно. На 42 добу зміни імунної системи курок поглиблювались. Спостерігалось підвищення титрів ГГА і рівня ЦІК більше, ніж у 2 рази. Кд/в був більше 1,6. Рівень РДТК залишався таким, як і на 21 добу, аутоантитіл до аутоантигену із головного мозку складав за дії ТОКФ – 522%, афоса – 298%. При внутрішньовенному введенні куркам лімфоцитів, сенсибілізованих афосом і ТОКФ в умовах in vitro і in vivo, не вдалося викликати ВНД. Морфологічний склад периферичної крові, кількість імунокомпетентних клітин і їх функціональна активність не змінювались. Клінічних ознак ВНД не спостерігалось. При введенні куркам лімфоцитів, сенсибілізованих in vivo, за дії афоса на 21 добу виявлено лише зменшення приросту маси тіла в порівнянні з фоном на 207 г. При одноразовому пероральному введенні афоса в дозі 200 мг/кг і ТОКФ в дозі 500 мг/кг у курок виявлені характерні зміни морфологічного складу периферичної крові, які були більш виражені в паралітичному періоді (21 доба): зниження абсолютної кількості лейкоцитів на 22 і 27%, відносної – на 22 і 37% і абсолютної кількості лімфоцитів – на 39 і 62%, збільшення відносної кількості нейтрофілів – на 54 і 75% відповідно. Спостерігались морфологічні зміни у цитоплазмі лімфоцитів (вакуолізація), у крові деяких курок виявлені плазматичні клітини і макрофаги. Кількісна і якісна зміна клітин крові може бути пов’язана з імунною перебудовою. Крім того, за дії ТОКФ через 7 діб збільшувалась абсолютна кількість еозинофілів у 3,7 рази і зменшувалась абсолютна кількість базофілів у 6 разів, більшість їх були дегранульовані, що може вказувати на його сенсибілізуючу дію. Кількісна зміна імунокомпетентних клітин наступала вже у допаралітичний період (7 доба). ТОКФ і афос знижували відносну кількість В-лімфоцитів на 22-29%, NK-клітин – на 46%. За дії ТОКФ знижувались абсолютна кількість В-лімфоцитів на 51%, відносна кількість Т-лімфоцитів – на 38%, абсолютна кількість Тх і Тс – на 43%. Коефіцієнт Тх/Тс не різнився від контролю. Афос знижував відносну кількість Тс на 19,3% та збільшував відносну кількість Тх – на 7,3% (р?0,05). Коефіцієнт Тх/Тс становив 3,03 і був у 1,3 рази вищим за контроль. В період розвитку паралічу (рис. 5) характерним було значне зниження кількості Т- і В-лімфоцитів, Тс і NK-клітин. Коефіцієнт Тх/Тс для афоса становив 3,44, ТОКФ – 4,42, що вказує на аутоімунні порушення в організмі (Б.С. Утешев, 1995). Упродовж всього досліду афос знижував метаболічну активність нейтрофілів на 28-55%, яка була виражена в більшому ступені, ніж у ТОКФ. Функціональна активність нейтрофілів на 14 і 21 добу компенсувалась збільшенням їх кількості у крові. Загальний рівень ЦІК поступово знижувався і на 21 добу був меншим, у порівнянні з контролем, за дії афоса у 20, ТОКФ – у 6 разів. Кд/в для афоса становив 1,6, ТОКФ – 1,38, що свідчить про накопичення у крові дрібнодисперсних і середньодисперсних ЦІК. Оскільки при зменшенні функціональної активності нейтрофілів в крові відбувається зменшення загальної кількості ЦІК, це може вказувати на їх осідання на стінках судин, клітинних мембранах або проникнення через тканинні бар’єри. За дії афоса і ТОКФ виявлена активація гуморальної ланки імунітету. Титр ГГА (lg2) на 21 добу за дії афоса збільшувався на 61% і був на 32% нижчим, ніж у ТОКФ. Спостерігалось збільшення числа АУК до тканевого антигену із головного мозку курок за дії афоса у 3,2, ТОКФ в 1,9 рази (р?0,05). Вірогідне збільшення аутоантитіл до антигену із головного мозку інтактних курок виявлено лише за дії афоса. У 8 паралізованих курок із 10 середній титр становив 1:126. Загальна кількість позитивних сироваток склала 33% – до антигену головного мозку інтактних курок і 73% – до антигену із головного мозку курок із клінікою ВНД. Виражені клінічні прояви ВНД спостерігались у курок, в яких виявлено збільшення рівня дрібнодисперсних ЦІК і аутоантитіл до антигену із головного мозку. Циклофос, який не чинить ВНД, через 7 діб викликав абсолютний нейтрофільоз, незначну відносну лімфоцитопенію, знижував абсолютну кількість В-лімфоцитів на 38%, відносну кількість 0-лімфоцитів – на 19%, збільшував відносну кількість Т-лімфоцитів – на 14% (р?0,05). Функціональна активність Т-лімфоцитів знижувалась на 34%, нейтрофілів – на 25%. Виявлені зміни були не стійкими (рис. 5), за винятком збільшення абсолютної кількості Тс. Коефіцієнт Тх/Тс становив 1,43, що свідчить про його імунотоксичну дію. Збільшення рівня ЦІК у сироватці крові відбувалось переважно за рахунок великоодисперсних ЦІК і на 14 добу перевищував контрольні значення в 1,8 рази. На 21 добу відбувалось відновлення функціональної активності нейтрофілів і зниження рівня ЦІК. Це свідчить про те, що вони виводяться із організму і не чинять пошкоджуючої дії на тканини. Функціональна активність Т-лімфоцитів вірогідно підвищувалась на 22%, В-лімфоцитів – на 133%, аутоімунних порушень не спостерігалось. Рис. 5. Абсолютна кількість імунокомпетентних клітин (%) курок в стадії параліча при дії афоса, ТОКФ і циклофоса в ізотоксичних дозах Таким чином, за дії афоса і ТОКФ відбуваються однотипові зміни морфологічного складу периферичної крові курок (лейкопенія, лімфопенія, нейтрофільоз), зниження метаболічної активності нейтрофілів, кількості NK-клітин, накопичення середньо- та дрібнодисперсних ЦІК, дефіцит клітин Тс, збільшення аутотіл і БУК до аутологічних антигенів із нервової тканини, що вказує на розвиток аутоімунних порушень в організмі і може мати важливе значення в патогенезі ВНД. Циклофос чинить транзиторну імунотоксичну дію. Вплив його на імунорегуляторні Т-клітини був протилежним, накопичення ЦІК відбувалось за рахунок великодисперсних форм, які виводились з організму, що направлено на відновлення порушеного гомеостазу. При пероральному надходженні в організм щурів афос (1500 мг/кг) і ТОКФ (725 мг/кг) викликали еозинопенію і нейтрофільоз. Морфологічних змін клітин крові не виявлено. В допаралітичний період збільшувалась абсолютна кількість ДПН (на 60-69%), що свідчить про підвищення метаболічної активності нейтрофілів. За дії ТОКФ на 3 добу збільшувалась абсолютна кількість NK-клітин (на 62%). Рівень ЦІК у сироватці крові збільшувався лише за дії афоса на 3 і 7 добу досліджень (на 39-59%). Кд/в становив 1,03-1,19, що свідчить про накопичення великодисперсних ЦІК. В паралітичний період за дії афоса встановлено незначне зниження (р?0,05) відносної кількості Т-лімфоцитів на 4,9% і Тх – на 19,1%, збільшення кількості В-лімфоцитів на 13,2%. Таким чином, за дії афоса і ТОКФ у щурів, на відміну від курок, підвищується НРО і відбувається елімінація великодисперсних ЦІК, кількість імунорегуляторних Т-клітин, аутоімунні процеси в організмі не порушуються, що і обумовлює їх видову специфічність ВНД. Виходячи з власних досліджень та узагальнення даних літератури, можна вважати, що механізм ВНД ФОП є складним і полівалентним. Інгібування активності нейротоксичної естерази лімфоцитів, головного і спинного мозку, розглядається як специфічний ефект і пусковий механізм розвитку ВНД (M.K. Johnson, 1977, 1992; M.L. Bleecker, M. Maroni, 1983). Відомо, що лімфоцити на своїх мембранах мають як рецептори до ацетилхоліну, так і фермент ацетилхолінестеразу. Ацетилхолін, який виділяється нервовими клітинами в мікрооточення лімфоїдних клітин, може бути фактором регуляції їх активності, а фермент АХЕ – фактором, який обмежує імуномодулюючу дію нейромедіатора (Н.В. Гущін та ін., 1991). Крім того, у функціональній активності нервової системи важливу роль відіграють циклічні нуклеотиди, які виступають як медіатори синаптичної передачі і регулятори метаболічних процесів (A.R. Akopyan et al., 1980). Показано, що ТОКФ і афос є інгібіторами АХЕ і нейротоксичної естерази (W.J. Hayes, 1982; Н.В. Кокшарьова та ін., 1990). За умов дії афоса на організм курок в період паралічу у різних відділах нервової системи та м’язах виявлено значне зниження концентрації цАМФ, дисбаланс катехоламінів в гіпоталамусі, поглиблення функціональних і структурних змін в нервовій системі (У.А. Кузьминская и др., 1986). При прогресуючому розсіяному склерозі, для якого характерна демієлінізація, також виявлені зміни концентрації цАМФ в крові і спинномозковій рідині, які супроводжувались зниженням числа Т-супресорів (О.А. Хондкаріан та ін., 1987). Виходячи з цього, не виключено, що з моменту надходження афоса і ТОКФ в організм відбувається модифікація як імунних, так і нервових процесів. Порушення балансу взаємодії імунної і нервової систем, внаслідок розладу функцій нейрогуморальних і медіаторних систем, може призвести до патологічних змін, які спостерігаються за дії ФОП. Активація гуморальної ланки імунітету сприяє утворенню дрібнодисперсних ЦІК, які можуть проникати через гематоенцефалічний бар’єр (ГЕБ), осідати на клітинах і тканинах нервової системи. Про можливість проникнення афоса через ГЕБ вказують зміни двошарових штучних мембран, збільшення інгібування активності АХЕ головного мозку при імунізації щурів еритроцитами барана, а також підвищення проникливості стінок судин головного мозку морських свинок (K.M. Астанакулов, 1983). Не виключено, що саме ураження нервових тканин афосом або імунними комплексами провокує утворення аутоантитіл, а прогресуюче зниження числа NK-клітин та зміни співвідношення Т-регуляторних клітин сприяють розвитку аутоімунного процесу. Видоспецифічність і патогенез ВНД може бути також обумовлений відмінностями у активності МОГС тварин і метаболізмі ФОП. За даними У.А. Кузьмінської (1988) афос інгібує активність МОГС курок. Завдяки повільному метаболізму афос проникає в мозок, де він виявляється упродовж 7 діб, а його метаболіт оксифосфонат – 1 доби. У щурів спостерігається індукція активності МОГС, метаболізм афоса протікає швидко, у спинному і головному мозку він знаходиться тільки упродовж 6-и годин, а оксифосфонат не виявляється. Для ТОКФ і лептофоса також характерно накопичення в нервових тканинах (Т. Yamanchi et al., 1989; Е. Srwita, М.В. Abou-Donia, 1990). Виходячи з власних досліджень та даних літератури, розроблена концептуальна схема розвитку ВНД (рис. 6), за якою ФОП нейротоксичної дії після абсорбції в кров піддаються активації в печінці під дією МОГС. Нейротоксиканти або їх гаптени зв’язуються з альбуміном і імуноглобулінами, мембранами або рецепторами імунокомпетинтних клітин, інгібують НТЕ в клітинах та утворюють дрібнодисперсні ЦІК, що сприяє модифікації імунних процесів в організмі, порушенню аутоімунітету і продукції аутоантитіл до нервових тканин, в результаті чого розвивається демієлінізація. Не виключено також, що ураження нервових тканин може відбуватись і іншим шляхом. Після метаболічної активації ФОП проникають в головний та спинний мозок, інгібують нейротоксичну естеразу, порушують обмін в нервових тканинах, в результаті чого виникає синтез нових білків, що також сприяє порушенню аутоімунітету і демієлінізації нервових тканин. Профілактика ускладнень ВНД за допомогою імунодепресанту циклофосфана та гемокарбоперфузії. Встановлено, що після введення куркам афоса в дозі 100 мг/кг з 14 по 17 добу відмічались легкі ознаки нейропаралітичної дії – м’язова слабкість, адинамія, порушення координації рухів, які проходили через 2-3 тижні. Афос, введений куркам в дозі 200 мг/кг, чинив виражену нейротоксичну дію. На 21-22 добу розвивались парези і паралічі. Одна курка загинула. Після введення циклофосфана, афос в дозі 100 мг/кг не викликав клінічних ознак ВНД. За дії афоса в дозі 200 мг/кг на фоні імунодепресанту циклофосфана перші клінічні ознаки ВНД з’являлись на 19 добу після введення афоса і характеризувались м’язовою слабкістю, незначним порушенням координації рухів. На 25 добу в 2 курок із 6 ознаки ВНД підсилювались, 40-42 добу в 4 курок спостерігалась м’язова слабкість, тварини при ходьбі завалювались на бік. Парези і паралічі не розвивались. Адсорбція і надходження в кров Метаболічні перетворення в печінці під дією МОГС Зв’язування ФОП з альбуміном і імуноглобулінами, утворення ЦІК Зв’язування з мембранами і рецепторами імунокомпетентних клітин, інгібування нейротоксичної естерази Проникнення через гематоенцефалічний бар’єр в мозок, інгібування НТЕ Модифікація імунних процесів. Інгібування клітинного і активація гуморального імунітету Порушення біохімічних процесів нервових тканин. Синтез білку de novo Порушення аутоімунних процесів Пошкодження клітин і тканин нервової системи: розвиток процесу демієлінізації периферичної і центральної нервової системи, виникнення парезів і паралічів Рис. 6. Схема розвитку віддалених нейротоксичних ефектів за дії фосфорорганічних сполук ТОКФ, введений інтактним куркам (250 мг/кг), викликав виражену клініку ВНД. Перші ознаки ВНД з’являлись на 10 добу. На 21 добу м’язова слабкість збільшувалась, відмічались парези ніг. Паралічі не розвивались. За дії ТОКФ на фоні циклофосфана клінічні ознаки спостерігались на 14 діб пізніше і були виражені в меншій мірі, ніж у курок, які отримували тільки ТОКФ. Слабкі парези розвивались у 2 із 6 курок на 42 добу досліджень. Вплив на імунну систему курок за дії циклофосфана (доза і схема наведені в матеріалах і методах досліджень) характеризувався помірним лейкоцитозом, нейтрофільозом, моноцитозом, лімфоцитопенією, збільшенням відносної кількості Т-лімфоцитів на 17% (р?0,05), зменшенням відносної і абсолютної кількості В-лімфоцитів на 63 і 65% відповідно. Виявлена тенденція до зменшення кількості Тх, Тс, NK-клітин. Функціональна активність Т- і В-лімфоцитів була знижена на 87 і 79% відповідно. Результати досліджень свідчать, що циклофосфан чинить помірний імунодепресивний ефект. Афос у дозі 200 мг/кг на фоні циклофосфана викликав незначний нейтрофільоз і абсолютний моноцитоз, зменшував відносну кількість Тх на 20% і збільшував кількість Тс на 41% (р?0,05). Співвідношення Тх/Тс становило 1,16. Функціональна активність Т- і В-лімфоцитів була знижена відносно фонових показників на 53% і 28%, по відношенню до циклофосфана вона збільшувалась на 268% та 234% відповідно. ТОКФ в дозі 250 мг/кг на фоні циклофосфана не викликав значимих змін морфологічного складу периферичної крові курок. Спостерігалось вірогідне відносне і абсолютне зменшення кількості NК-клітин на 44% і 48% відповідно, відносне збільшення Т-лімфоцитів на 7%, Тх – на 15% і зменшення Тс на 31%. Функціональна активність Т-лімфоцитів була вірогідно зменшена по відношенню до контролю на 41%, В-лімфоцитів – на 67%. Співвідношення Тх/Тс становило 3,8, що вказує на розвиток аутоімунного процесу. Таким чином, циклофосфан послаблює перебіг патологічного процесу, який обумовлений нейропаралітичними речовинами. Ефективність циклофосфану залежала від дози нейротоксиканта. З метою профілактики ускладнень ВНД куркам, отруєним афосом в дозі 200 мг/кг, проведена гемокарбоперфузія. Встановлено, що до перфузії (на 10-14 день після введення афоса) у курок спостерігався (р?0,05) лейкоцитоз і нейтрофільоз, зменшувалась відносна кількість NK-клітин на 37%, метаболічна активність нейтрофілів – на 50%. Виявлено підвищення абсолютної кількості Т- і 0-лімфоцитів на 56% і 69% відповідно, абсолютної кількості Тх – на 67%; зниження відносної кількості Тс – на 19% та РБТЛ – на 46%. Співвідношення Тх/Тс становило 2,8 проти контролю – 2,27. Рівень ЦІК вірогідно підвищувався на 64%, Кд/в становив 1,29, у деяких тварин – 1,44-1,5, що свідчить про накопичення в організмі середньо- і дрібнодисперсних ЦІК. Після гемоперфузії у курок (по відношенню до контролю) спостерігалось зменшення загальної кількості лейкоцитів, нейтрофілів, еозинофілів (р?0,05). Зміни кількісного складу периферичної крові курок можна пояснити за рахунок часткової їх сорбції на сорбенті, а також лізисом внаслідок механічного ушкодження під час гемосорбції. Після гемоперфузії відбувались позитивні зміни імунологічних показників – збільшення числа диформазан-позитивних нейтрофілів, але їх метаболічна активність залишалась на тому ж рівні, що і до перфузії. Абсолютна кількість Т- і 0-лімфоцитів збільшувалась на 27-40%, але в меншому ступені (в 2 рази), ніж до перфузії. Відносна кількість В-лімфоцитів і субпопуляцій Т-лімфоцитів залишалась на тому ж рівні. РБТЛ була зниженою на 33% по відношенню до контролю і на 26% по відношенню до висхідного рівня. Рівень ЦІК і ГГА у сироватці крові після перфузії не відрізнявся від контролю. На 14 день після гемоперфузії виявлено відносний нейтрофільоз, відносну і абсолютну моноцитопенію, збільшення метаболічної активності нейтрофілів, але їх загальна кількість була на 24% нижче, ніж у контролі. Кількість 0-лімфоцитів була зменшеною на 31% по відношенню до контролю. Найбільш вагомим наслідком гемосорбції було видалення дрібнодисперсних ЦІК, нормалізація функції нейтрофілів, співвідношення Тх/Тс за рахунок зменшення числа Тх. Отже, після гемоперфузії відбувається корекція найважливіших показників імунної системи, які відповідають за аутоімунний процес в організмі. Оскільки під впливом гемосорбції гальмується розвиток аутоімунних порушень в організмі, то наслідком цього є послаблення перебігу ВНД. За період експерименту позитивний ефект виявлено у всіх тварин. У 2 із 8 курок (25%) спостерігались парези, але вони з’являлись на 1-3 тижні пізніше і були менш виражені, ніж у контрольних тварин, у 6 із 8 курок (75%) парези і паралічі не розвивались, інші ознаки ВНД не прогресували. Таким чином, на прикладі афоса доведена висока ефективність гемокарбоперфузії для попередження парезів і паралічів. На основі результатів досліджень розроблено і запропоновано спосіб профілактики ускладнень нейропатій, викликаних отруєнням ФОП, який може бути застосований в комплексній терапії ВНД (Патент України №38876 А від 15.05.2001 р.). ВИСНОВКИ У роботі наведено експериментально-теоретичне узагальнення і нове вирішення нагальної проблеми токсикології щодо ролі імунної системи і неспецифічних факторів захисту організму в токсичній дії фосфорорганічних пестицидів і синтетичних регуляторів росту рослин. З’ясовано характер імунних порушень і їх місце в патогенезі віддаленої нейротоксичної дії фосфорорганічних сполук, обґрунтовано підходи щодо профілактики віддалених нейропатій і регламентування пестицидів в об’єктах навколишнього середовища за імунологічними критеріями шкідливої дії. 1. За умов гострої пероральної дії (1/2 ЛД50, одноразово) фосфорорганічні пестициди і синтетичні регулятори росту рослин у токсикогенній стадії інгібують активність монооксигеназної системи печінки щурів, що проявляється зниженням N-деметилазної активності на 36-84%, п-гідроксилазної активності на 30-67%, вмісту цитохрому Р-450 – на 30-66% (р?0,05). В подальшому спостерігається відновлення цих ферментативних активностей або їх індукція. 2. Фосфорорганічні пестициди (циклофос, його тіоновий ізомер, етафос, ЄШ-7) і регулятор росту рослин ресин, введені перорально в дозі 1/5 ЛД50, трьохразово, в токсикогенній стадії викликають індукцію N-деметилазної і п-гідроксилазної активностей на 21-80%, збільшення вмісту цитохрому Р-450 – на 17-48% і вільних радикалів – на 10-51% (р?0,05). Індукція ферментів МОГС призводить до активації метаболізму зазначених ФОП, про що свідчить збільшення їх антихолінестеразної дії. За умов хронічної дії циклофос в дозі 6,3 мг/кг, симарп – 23 мг/кг, упродовж 6 місяців та івін – 130 мг/кг, упродовж 2 місяців, чинять нестійкий інгібуючий ефект на інтенсивність процесів деметилювання в печінці щурів, відповідно на 29%, 38% і 76% (р?0,05). 3. Реакція організму щурів на вплив фосфорорганічних речовин і регуляторів росту рослин (за умов гострої і підгострої дії) характеризується збільшенням вмісту великодисперсних циркулюючих імунних комплексів на 56-260%, функціональної активності нейтрофілів на 55-156% та лімфоцитів на 50-225%. Активація клітин макрофагальної системи сприяє елімінації імунних комплексів. Між показниками імунної і монооксигеназної систем реципрокний функціональний зв’язок більш чітко проявляється в токсикогенній стадії. 4. Характерним для хронічної дії циклофоса і симарпа є імунодепресивний ефект за Т-типом, на що вказує зниження функціональної активності Т-лімфоцитів на 33-27% (р?0,05), маси тимуса – на 11-16% (р?0,05), а також наявність морфологічних порушень в імунокомпетентних органах (дистрофія, мікронекрози, зменшення кількості лімфоцитів у корі тимуса). Зміни функціональної активності В-лімфоцитів та нейтрофілів носять фазовий характер. Імунізація еритроцитами барана щурів, яким упродовж 6 місяців вводили циклофос і симарп (1/100 ЛД50), призводить до зниження реактивності імунної системи, зокрема, функціональної активності нейтрофілів на 43 і 37% (р?0,05), титру гетерофільних гемагглютининів – на 24% і 37% (р?0,05) і рівня циркулюючих імунних комплексів – на 44% і 19% (р?0,05) відповідно. 5. Ступінь зв’язування фосфорорганічних пестицидів з альбуміном у 3-6 разів більший, ніж з IgМ сироватки крові людини. Найбільша спорідненість їх до білків сироватки крові різних видів ссавців характерна для етафоса (68-87%), а найменша – для тіонового ізомеру циклофоса (до 7%). Взаємодія ФОП і синтетичних РРР з штучними фосфоліпідними мембранами залежить від їх ліпофільності. За умов гострої дії ФОП змінюється в’язкість і структура мембран: підвищення гемолізу еритроцитів (на 42-160%) і набрякання мітохондрій печінки щурів (р?0,05), що призводить до інгібування активності мембранозв’язаних ферментів: Nа+,К+-АТФази еритроцитів (51-90%), сукцинатдегідрогенази і цитохромоксидази мітохондрій гепатоцитів (до 60%). 6. У імунізованих щурів в період активного антитілогенезу за гострої дії ФОП гальмується утворення великодисперсних імунних комплексів, збільшується гостра токсичність (в 1,4 рази), антихолінестеразний ефект (до 20%, р?0,05), що пов’язано зі зниженням імунної відповіді на додатковий антигенний стимул. 7. Сенсибілізація курок фосфорорганічними сполуками нейротоксичної дії – афосом і триортокрезилфосфатом, призводить до порушень аутоімунних реакцій організму. При введенні їх з повним ад’ювантом Фрейнда аутоімунний процес поглиблюється: збільшуються рівень дрібнодисперсних ЦІК (Кд/в=1,6), ступінь дегрануляції тучних клітин на 230-547%, титри аутоантитіл до аутоантигенів із нервових тканин на 298-522%, з’являються клінічні ознаки ВНД. 8. Характерним у дії нейротоксикантів на організм курок є розвиток лейкопенії і лімфоцитопенії, нейтрофільозу, збільшення в крові кількості плазматичних клітин і макрофагів. Виразність клінічних проявів ВНД корелює із змінами імунної реактивності: лімфоцитопенією, зниженням кількості Т- і В-клітин на 30% (р?0,05), Тс – на 50%, NK-клітин – на 90% і окислювального метаболізму в нейтрофілах – на 55% (р?0,05), збільшенням рівня дрібнодисперсних імунних комплексів (Кд/в=1,6), титру аутоантитіл (до 1:126) та кількості антитілоутворюючих клітин в периферичній крові до антигену із нервових тканин – до 219% (р?0,05), що свідчить про аутоімунні порушення в організмі. 9. ТОКФ і афос, введені перорально щурам (1/2 ЛД50), не викликають клінічних ознак ВНД. Їх вплив на імунну систему щурів, у порівнянні з курками, має протилежну направленість і характеризується збільшенням рівня великодисперсних ЦІК та окислювального метаболізму в нейтрофілах на 59%, кількості NK-клітин – на 62%, зниженням кількості Тх на 19% (р?0,05), що обумовлює видову специфічність і підтверджує роль імунної системи в патогенезі ВНД. 10. Імунодепресант циклофосфан (20 мг/кг чотирьохразово до введення і трьохразово після введення нейротоксикантів) віддаляє появу клінічних ознак ВНД у курок за дії афоса на 19 діб, а ТОКФ – на 14 діб, зменшує виразність клінічної картини інтоксикацій, запобігає розвитку паралічів. Застосування гемокарбоперфузії у курок, отруєних афосом в дозі 200 мг/кг, попереджає розвиток паралічів, зменшує кількість парезів на 75%, що обумовлене елімінацією ЦІК та нормалізацією функцій імунокомпетентних клітин. ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ 1. При токсиколого-гігієнічній регламентації потенційно небезпечних хімічних речовин в об’єктах навколишнього середовища необхідно враховувати їх імунотоксичні властивості. Для встановлення порогових і недіючих рівнів слід застосовувати додаткові навантаження антигеном (еритроцитами барана, бактеріальними клітинами тощо). 2. Експериментально обґрунтована доцільність застосування імунодепресантів і гемокарбоперфузії в комплексній терапії ВНД для запобігання тяжких ускладнень – парезів і паралічів. 3. Для прогнозування тяжкості перебігу отруєнь фосфорорганічними речовинами, які спроможні чинити ВНД, слід проводити дослідження рівня циркулюючих імунних комплексів сироватки крові (з визначенням їх дисперсності), функціональної активності нейтрофілів, титрів аутоантитіл до антигену із нервової тканини, кількість антитілоутворюючих клітин, Т-хелперів, Т-супресорів. СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ 1. Каган Ю.С., Кокшарева Н.В., Жминько П.Г. Блокаторы холинэстеразы // Общая токсикология / Под ред. проф. Б.А. Курляндского, проф. В.А. Филова. - М.: Медицина. - 2002. - С. 176-236. (Дисертантом узагальнені власні та літературні дані щодо біологічних властивостей фосфорорганічних речовин, написання розділу книги). 2. Каган Ю.С., Ершова Е.А., Леоненко О.Б., Клисенко М.А., Жминько П.Г., Зейналова Т.А. Роль монооксигеназной системы в метаболизме и механизме действия некоторых пестицидов // Вестник АМН СССР. - 1988. - №1. - С. 70-76. (Здобувачем виконані експериментальні дослідження щодо впливу циклофоса на МОГС щурів, аналіз отриманих результатів, підготовка статті до друку). 3. Ершова Е.А., Жминько П.Г., Каган Ю.С., Барабанов В.И., Талан В.А., Макушенко В.М., Гареев Р.Д., Иванов Н.И. Синтез и физиологическая активность нового отечественного инсектоакарицида циклофоса // Физиол. актив. вещества. - 1988. - Вып. 20. - С. 79-82. (Здобувачем виконані експериментальні дослідження щодо антихолінестеразної активності циклофоса та його впливу на МОГС печінки щурів, статистичний аналіз та узагальнення даних, підготовлена стаття до друку). 4. Ершова Е.А., Жминько П.Г. Определение обратимого связывания ксенобиотиков с белками сыворотки крови методом равновесного диализа // Методическое руководство “Биохим., иммунол., биофиз. методы в токсикологическом эксперименте”. - Киев, 1989. - С. 179-184. (Дисертантом розроблені підходи щодо використання методу рівноважного діалізу для водонерозчинних ксенобіотиків, удосконалений метод та підготовлена стаття до друку). 5. Клисенко М.А., Александрова Л.Г., Ершова Е.А., Письменная М.В., Жминько П.Г. Особенности накопления и выведения фосфорорганических соединений у крыс // Известия АН СССР. Серия биол. - 1990. - №2. - С. 227-235. (Дисертантом проведені дослідження токсичності гетерофоса, етафоса, ЄШ-7, підготовлені біосубстрати до газохроматографічного аналізу, проаналізовані і обговорені результати досліджень, підготовлені матеріали до друку). 6. Жминько П.Г., Войцицкий В.М., Каган Ю.С., Дубовенко Е.А. Влияние некоторых фосфорорганических пестицидов на характеристики 2-фазной водно-липидной системы // Физиол. актив. вещества. - 1992. - Вып. 24. - С. 19-22. (Дисертантом сплановані експерименти, виконано експериментальні дослідження щодо впливу ксенобіотиків на штучні фосфоліпідні мембрани, проаналізовані отримані дані, підготовлена стаття до друку). 7. Астанакулов Р.С., Жминько П.Г., Шуляк В.Г., Недопитанская Н.Н., Каган Ю.С. Токсикологическая характеристика нового регулятора роста растений симарпа // Физиол. актив. вещества. - 1993. - Вып.25. - С. 101-105. (Дисертант спланував експерименти, керував експериментальними дослідженнями та дослідив вплив симарпу на МОГС і імунну систему щурів, проаналізував отримані дані, підготовив статтю до друку). 8. Жминько П.Г., Ларионов В.Г., Янкевич М.В. К механизму токсического действия ресина – регулятора роста сахарной свеклы // Гигиена и санитария. - 1993. - №6. - С. 47-50. (Дисертантом сплановані та виконані експериментальні дослідження щодо впливу ресину на МОГС і імунну систему щурів, проведена статистична обробка і аналіз даних, підготовлена стаття до друку). 9. Zhminko P.G. Membranotoxycity as a criterion for the assessment of adverse effect and level of pesticide hazard // Health, Safety and Ergonomic Aspects in Use of Chemicals in Agriculture and Forestry. Proceedings of the 12 Joint CIGR, IAAMRH, IUFRO Inter. symp. 8-11 June 1993, Kiev, Ukraine. Institute for occupational Health. - Kiev, 1994. - Р. 234-238. 10. Kagan Yu.S., Leonenko O.B., Zhminko P.G., Avramenko V.G., Lepeshkin I.V. Prognosing of pesticide combined action // Archives of Complex Environmental Studies.- 1996.- Vol. 8. - №3-4.- Р. 57-66. (Дисертантом виконані експериментальні дослідження щодо мембранотоксичної дії пестицидів, проаналізовані отримані дані, брав участь у підготовці статті до друку). 11. Жминько П.Г. Нарушение функции системы иммунитета под воздействием пестицидов и некоторые задачи иммунотоксикологии на современном этапе (обзор) // Современные проблемы токсикологии. - 1998. - №2. - С. 53-58. 12. Ponomarenko S.P., Jutinskaja G.A., Zhminko P.G., Katja Nowick, Wolfgang Nowick. Plant growth regulators – a technology for ecological orientated agriculture production // Scientific Reports Wissenschaftliche Berichte // Journal of the University of Applied Sciences Mittweida Wissenschaftliche Zeitschrift der Hochschule Mittweida (FH). - Saterra’99. - 1999. - №3. - Р. 305-311. (Дисертантом узагальнені дані щодо фізіологічної активності і токсичної дії регуляторів росту рослин (івіна та ін.), обговорені матеріали та підготовлена стаття до друку). 13. Жминько П.Г. Роль иммунной системы в патогенезе отдаленной нейротоксичности некоторых фосфорорганических соединений // Современные проблемы токсикологии. - 1999. - №4. - С. 18-24. 14. Жминько П.Г. Состояние монооксигеназной системы печени и неспецифической резистентности организма при действии некоторых фосфорорганических пестицидов // Современные проблемы токсикологии. - 2001. - №2. - С. 34-40. 15. Жмінько П.Г., Проданчук М.Г., Янкевич М.В. Видові особливості імунної реактивності організму при дії нейропаралітичних фосфорорганічних речовин // Современные проблемы токсикологии. - 2002. - №1. - С. 46-51. (Дисертантом сплановані і виконані експериментальні дослідженні. Узагальнені власні дослідження видових відмінностей щодо впливу нейротоксикантів на імунну систему щурів і курок. Підготовлена стаття до друку). 16. Жмінько П.Г., Лобода Ю.І Токсичність і антихолінестеразна дія деяких фосфорорганічних пестицидів в залежності від їх сорбції на протеїнах сироватки крові // Современные проблемы токсикологии. - 2003. - №1. - С. 18-21. (Дисертантом виконані експериментальні дослідження, узагальнені дані і написана стаття до друку). 17. Жмінько П.Г., Давиденко А.В., Лобода Ю.І., Хижняк С.В. Скринінг пестицидів щодо проникливості через мембрани і накопичення в ліпідах на моделі штучних фосфоліпідних мембран // Вісник біології. - 2003. - Вип. 39. - C. 15-17. (Дисертантом виконані експериментальні дослідження, узагальнені дані і написана стаття до друку). 18. Жмінько П.Г., Лобода Ю.І. Дослідження ефективності циклофосфана в попередженні парезів і паралічів при віддаленій нейротоксичній дії фосфорорганічних речовин // Современные проблемы токсикологии. - 2003. - №2. - С. 72-73. (Дисертантом виконані експериментальні дослідження, узагальнені дані і написана стаття до друку). 19. Жмінько П.Г. Токсична дія фосфорорганічних речовин на фоні активного антитілогенезу при імунізації еритроцитами барана // Буковинський медичний вісник. - 2003. - №2. - С.142-147. 20. Жмінько П.Г. Імунна реактивність організму щурів при хронічній дії циклофосу // Современные проблемы токсикологии.- 2004.- №3.- С. 34-39. 21. Жмінько П.Г., Король В.М., Коляденко В.Г., Проданчук М.Г. Спосіб профілактики ускладнень віддалених нейропатій, викликаних нейропаралітичними фосфорорганічними речовинами // Патент на винахід №38876 А від 15.05.2001 р. (Дисертантом виконані експериментальні дослідження, розроблений спосіб профілактики ускладнень віддалених нейропатій, підготовлені заявка на патент і матеріали до друку). 22. Жминько П.Г. Роль иммунных комплексов в патогенезе нейротоксического действия фосфорорганического пестицида афоса // Пробл. экол. и пути их решения. Мат. науч.-практ. конф., проведенной АН УССР и ВАПВО СВ. Изд. академии. К., 1991. - С. 42-43. 23. Жминько П.Г., Лысенко Е.А., Янкевич М.В., Каган Ю.С. К механизму избирательного действия регулятора роста растений N-оксид-2,6-лутидина // 3 Междун. конф. “Регуляторы роста и развития растений” Тез. докл. 27-28 июня 1995. - М., 1995. - С. 68-69. 24. Zhminko P.G. The role of non-specific defence factors in toxicity of some organophosphorоus compounds // EUROTOX`97 “Pharmacology and Toxicology”. Diversification in toxicology: Man and environment. - Aarhus, Denmark, June 25-28. - 1997. - Р. 106. 25. Жминько П.Г. Некоторые подходы к гигиенической регламентации пестицидов с позиций иммунотоксикологии // Сучасні наукові підходи до реєстрації пестицидів. Матеріали науково-практ. семінарів / Проект ПРООН/АОС США по удосконаленню практики використання пестицидів. - К.: ЗАТ “ДКТ”. - 1998. - С. 33-37. 26. Жминько П.Г. Роль иммунной системы в детоксикации некоторых фосфорорганических соединений // 1 съезд токсикологов России. Тез. докл. 17-20 ноября 1998 года. - М., 1998. - С. 240. 27. Жминько П.Г. Особенности токсического действия некоторых фосфорорганических соединений при иммунизации организма // Актуальные проблемы токсикологии / Тез. докл. научн. конф., посвященной 75-летию со дня рождения член-корр. НАН, АМН Украины, проф., д.м.н. Ю.С. Кагана. - К., 1999. - С. 40. 28. Zhminko P.G., Prodanchuk N.G., Korol V.N. Use of hemocarboperfusion for prevention of delayed neurotoxic effects of aphos // Toxicology Letters, Suppl. 1/123, 2001, Р. 55 // Abstracts of EUROTOX 2001, 13-16 September 2001. - Military Museum, Istambul, Turkey. 29. Жминько П.Г., Шуляк В.Г., Недопитанская Н.Н. Влияние симарпа на иммунную систему организма // Тезисы докладов 2-го съезда токсикологов России. - М.: Российский регистр потенциально опасных химических и биологических веществ Минздрава России, 2003. - С. 106-107. АНОТАЦІЯ Жмінько П.Г. Роль імунної системи і неспецифічної реактивності організму в патогенезі отруєнь фосфорорганічними пестицидами і синтетичними регуляторами росту рослин. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 14.03.06 – токсикологія. – Інститут фармакології і токсикології АМН України, Київ, 2005. Дисертація присвячена експериментально-теоретичному обгрунтуванню ролі імунної системи і неспецифічних факторів захисту організму в токсичній дії фосфорорганічних пестицидів (ФОП) і синтетичних регуляторів росту рослин (РРР), патогенезі віддаленої нейротоксичної дії (ВНД) фосфорорганічних речовин, підходів щодо профілактики віддалених нейропатій і регламентуванні пестицидів в об’єктах навколишнього середовища за імунологічними критеріями шкідливої дії. Встановлено, що ФОП і РРР в залежності від дози і часу дії чинять різнонаправлену дію на активність ферментів монооксигеназної системи (МОГС) і вміст цитохрому Р-450 в печінці щурів. За умов гострих і хронічних інтоксикацій характерна інгібуюча дія на МОГС, підгострої дії – індукуюча. Показано, що в токсикогенній стадії реакція імунної системи на стресорний вплив ФОП і РРР полягає в утворенні великодисперсних циркулюючих імунних комплексів, метаболічній активації нейтрофілів і елімінації імунних комплексів клітинами макрофагальної системи. В період активного антитілогенезу у щурів знижується імунна відповідь на вплив ФОП, що призводить до збільшення їх токсичності, антихолінестеразної і кумулятивної дії. За умов хронічної дії ФОП – циклофос і РРР – симарп викликають імунодефіцит за Т-типом, гальмують імунну відповідь на додатковий антигенний стимул (еритроцити барана). Встановлено, що патогенез ВНД афоса і триортокрезилфосфата обумовлений порушенням аутоімунних реакцій організму (зниження кількості Т- і В-лімфоцитів, NK-клітин, Т-супресорів, збільшення кількості Тхелперів, функціональної активності В-лімфоцитів, рівня дрібнодисперсних імунних комплексів, титрів аутоантитіл до антигену із нервових тканин). Виявлена пряма залежність між ступенем аутоімунних порушень і вираженістю клінічних ознак ВНД. Показано, що імунодепресант циклофосфан і гемокарбоперфузія гальмують розвиток ВНД, а саме зменшують виразність клінічних ознак інтоксикацій і попереджають розвиток парезів і паралічів. Поглиблено уявлення щодо ролі нековалентного зв’язування ФОП з білками сироватки крові, сорбції на мембранах ФОП і РРР в їх токсичності. Обґрунтовані підходи щодо регламентації хімічних речовин в об’єктах навколишнього середовища за імунологічними критеріями шкідливої дії. Ключові слова: фосфорорганічні пестициди, синтетичні регулятори росту рослин, інтоксикації, неспецифічна реактивність, імунна і монооксигеназна системи, віддалена нейротоксична дія, патогенез, профілактика віддалених нейропатій. АННОТАЦИЯ Жминько П.Г. Роль иммунной системы и неспецифической реактивности организма в патогенезе отравлений фосфорорганическими пестицидами и синтетическими регуляторами роста растений. – Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 14.03.06 – токсикология. – Институт фармакологии и токсикологи АМН Украины, Киев, 2005. Диссертация посвящена экспериментально-теоретическому обоснованию роли иммунной системы и неспецифических факторов защиты организма в токсическом действии фосфорорганических пестицидов (ФОП) и синтетических регуляторов роста растений (РРР), патогенезе отдаленного нейротоксического действия (ОНД) фосфорорганических веществ, подходов к профилактике отдаленных нейропатий и регламентации пестицидов в объектах окружающей среды с учетом иммунологических критериев вредного действия. В исследованиях использовано 15 фосфорорганических веществ: циклофос и его изомеры, этафос, гетерофос, ЕШ-7, афос, оксифосфонат, хлорофос, карбофос и др., 4 – синтетических РРР: симарп, ресин, ивин, хлорхолинхлорид. Изучено влияние ФОП и РРР на искусственные фосфолипидные мембраны, мембраны эритроцитов и митохондрий печени крыс, связывание ФОП с белками сыворотки крови. При остром (1/2 ЛД50, однократно), подостром (1/5 ЛД50, трехкратно), субхроническом (1/10 ЛД50 в течение 2 месяцев), хроническом воздействии (1/100 и 1/1000 ЛД50, 6 месяцев) исследовано влияние некоторых ФОП и РРР на иммунную и монооксигеназную системы (МОГС). На модели триортокрезилфосфата (ТОКФ) и афоса изучена роль иммунной системы в патогенезе ОНД и возможность использования циклофосфана и гемокарбоперфузии для профилактики парезов и параличей. Установлено, что в зависимости от дозы и времени воздействия ФОП и РРР оказывают разнонаправленный эффект на МОГС. При остром отравлении в токсикогенной стадии характерно ингибирование интенсивности процессов деметилирования, гидроксилирования, снижение содержания цитохрома Р-450, подостром – индукция, хроническом – ингибирование МОГС. При острых и подострых интоксикациях ФОП и РРР в токсикогенной стадии повышается неспецифическая резистентность организма (активность лизоцима, уровень иммунных комплексов, функциональная активность нейтрофилов). Накопление циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) происходит за счет крупнодисперсных растворимых форм, которые выводятся клетками макрофагальной системы. На фоне активного антителогенеза токсичность, антихолинэстеразное и кумулятивное действие ФОП усиливаются, что связано с торможением иммунного ответа на дополнительный антигенный стимул и снижением уровня ЦИК. При хроническом действии циклофос и симарп вызывают иммунодефицит по Т-типу и фазовые изменения неспецифической резистентности организма, тормозят иммунный ответ на дополнительный антигенный стимул. Факторный анализ результатов исследований показал, что дозовые нагрузки при действии ФОП определяются уровнем ЦИК и активностью холинэстеразы, РРР – цитохромом Р-450 и НСТ-тестом. Между показателями иммунной и монооксигеназной систем установлены реципрокные взаимоотношения, которые в большей степени проявляются в токсикогенной стадии стресса. Установлено, что ТОКФ и афос являются умеренными аллергенами. При сенсибилизации кур ТОКФ и афосом с полным адъювантом Фрейда выявлены аутоиммунные нарушения. Показано, что в патогенезе ОНД особая роль принадлежит иммунной системе. Уже в допаралитический период в организме кур под влиянием нейротоксикантов формируются мелкодисперсные (патогенные) иммунные комплексы, повышается уровень аутоантител к антигенам из нервной ткани. Тяжесть проявлений ОНД в паралитический период коррелирует с изменениями иммунной реактивности (лимфоцитопенией, снижением количества NK-клеток, Т-супрессоров и увеличением количества Т-хелперов, антителообразующих клеток в периферической крови и уровнем аутоантител к антигену из нервных тканей), что свидетельствует об интенсификации аутоиммунного процесса. Установлены видовые различия в действии нейротоксикантов на иммунную систему. В отличие от кур, у крыс повышается уровень крупнодисперсных ЦИК, НСТ-тест, количество NK-клеток, снижается относительное количество Т-хелперов, аутоиммунных нарушений не выявлено, клинических признаков ОНД не отмечалось. Показано, что иммунодепрессант циклофосфан и гемокарбоперфузия тормозят развитие ОНД: снижают выраженность клинических проявлений интоксикации, предупреждают появление парезов и параличей. Иммунодепрессанты и гемокарбоперфузия могут быть использованы для профилактики параличей в комплексной терапии ОНД. Установлено также, что связывание ФОП с белками сыворотки крови уменьшает их токсичность и антихолинэстеразный эффект. Взаимодействие ФОП и РРР с искусственными фосфолипидными мембранами зависят от наличия в их структуре липофильных группировок (Cl-, CCL3-, СN-). Повреждающее действие их на мембраны эритроцитов крыс обусловлено ингибированием активности Nа+,К+-АТФазы, снижением резистентности к повышенной температуре и интенсификацией перекисного окисления липидов (ПОЛ); на митохондрии гепатоцитов – повышением проницаемости мембран, ингибированием активности мембраносвязанных ферментов митохондрий, интенсивностью процессов ПОЛ. На основании результатов исследований разработана концептуальная схема развития ОНД при действии ФОП, разработаны подходы к токсиколого-гигиенической регламентации средств защиты растений в объектах окружающей среды с учетом иммунологических критериев вредного действия. Ключевые слова: фосфорорганические пестициды, синтетические регуляторы роста растений, интоксикации, неспецифическая реактивность, иммунная и монооксигеназная системы, отдаленное нейротоксическое действие, патогенез, профилактика отдаленных нейропатий. SUMMARY Zhminko P.G. Role of the immune system and unspecific reactivity of organism in pathogeny of poisonings by organophosphorous pesticides and synthetic plant growth regulators. – The Manuscript. The Dissertation on the receiving of a scientific degree of Doctor of Biological Sciences according to speciality 14.03.06 – toxicology. – Institute of Pharmacology and Toxicology of АМS of Ukraine, Kyiv, 2005. The Dissertation is devoted to the experimentally-theoretical substantiation of a role of the immune system and unspecific factors of organism protection in toxic action of organophosphorous pesticides (OPP) and synthetic plant growth regulators (PGR), in pathogenesis of delayed neurotoxic effect (DNE) of organophosphorous substances, approaches to prevention of delayed neuropathies and regulation of pesticides in environmental objects at immunological criteria of harmful action. It’s established that OPP and PGR depending on a dose and time of action cause the different-directions effects to enzyme activity of the monooxigenase system (MOGS). The inhibiting action is characteristic for acute and chronic intoxication, whereas inducing effect is characteristic for subacute intoxication. It is shown that the reaction of immune system on stress influence of OPP and PGR at toxicogenic stage consists in formation of macrodispersed circulatory immune complexes (CIC), metabolic activation of neuthrophiles, elimination of CIC by the cells of the macrophage system. Study on rats shows the decreasing of immune response on the OPP influence in the period of active antibody genesis, that leads to increasing of anticholinesterasic, toxic and cumulative action of OPP. Under condition of chronic influence the OPP – cyclophos and PGR – simarp cause Т-type immunodeficiency. It is shown the clearly manifested functional reciprocal interrelation between MOGS and the immune system parameters at toxicogenic stage of chemical stress. It’s established that pathogenesis of DNE of the aphos and threeortocresilphosphate is conditioned by violations of autoimmune reactions of organism (decreasing of the Т- and В-lymphocytes amount, NK-cells, Т-suppressors, increasing of В-lymphocytes function activity, microdispersed CIC level, titre of antybodies to nervous tissues antigen). It is shown that immunodepressor cyclophosphane and hemocarboperfusion brake the DNE development, diminish severity of clinical signs and prevents paresises and paralyses development. Approaches are substantiated in relation to regulation of chemical substances in environmental objects by immunological criteria of harmful action. Key words: organophosphorous pesticides, synthetic plant growth regulators, intoxication, unspecific reactivity, immune and monooxigenase systems, delayed neurotoxicity, pathogenesis, prevention of delayed neuropathy. PAGE \* Arabic 1

Похожие записи