ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ІВАНА ФРАНКА

КОПАЧ ОЛЬГА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 612.014.42:612.31:591.431.2

Роль ендоплазматичного ретикулуму у регуляції внутрішньоклітинної
Са2+-сигналізації та функціонування ацинарних клітин підщелепної слинної
залози

03.00.13 – фізіологія людини і тварин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському національному університеті імені Івана
Франка Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, доцент

Федірко Наталія Вікторівна,

Львівський національний університет імені Івана Франка

Міністерства освіти і науки України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Рибальченко Володимир Корнійович,

завідувач лабораторії мембранології

Київського національного університету імені

Тараса Шевченка

доктор біологічних наук

Янчій Роман Іванович,

провідний науковий співробітник відділу імунології та

цитотоксичних сироваток

Інституту фізіології імені О.О. Богомольця НАН України

Провідна установа: Науково-дослідний інститут фармакології та
токсикології

АМН України, м. Київ

Захист відбудеться “ 26 ” грудня 2005 року о 1500 годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради К 35.051.14 у Львівському
національному університеті імені Івана Франка за адресою: 79005, м.
Львів, вул. Грушевського, 4, біологічний факультет, ауд. № 321.

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Львівського
національного університету імені Івана Франка за адресою: 79005, м.
Львів, вул. Драгоманова, 17.

Автореферат розісланий “ 13 ” листопада 2005 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради К 35.051.14,

кандидат біологічних наук, доцент
_____________________________ Манько В.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Основною функцією слинних залоз є синтез та секреція
слини – секрету, який забезпечує підтримання фізіологічного стану
органів ротової порожнини, нормальний перебіг процесу травлення, містить
біологічно-активні речовини, а відтак відіграє важливу роль у
життєдіяльності організму людини і тварин. Зменшення слиновиділення та
патологічні зміни складу слини підвищують ризик патологій слизової
оболонки ротової порожнини та органів травлення, захворювань зубів,
порушення мовлення та ін. Внутрішньоклітинні механізми, які
опосередковують процеси пов’язані із слиновиділенням, залишаються
остаточно не з’ясованими, тому дослідження шляхів регуляції функцій
слинних залоз має важливе значення для сучасної фізіології та медицини.

Функціонування слинних залоз перебуває під контролем симпатичної та
парасимпатичної іннервації, а секреція білкового та рідинного
компонентів слини реалізуються різними сигнальними механізмами:
цАМФ-генеруючим та Са2+-мобілізуючим (Ambudkar et al., 2000; Melvin et
al., 2005). Зокрема, секреція рідкого компоненту слини ацинарними
клітинами підщелепної слинної залози знаходиться виключно під
холінергічним контролем, який опосередковується шляхом підвищення
концентрації іонізованого кальцію у цитоплазмі ([Са2+]i) клітин (Putney,
1986; Baum et al., 1993; Cook et al., 1999; Skryma, 2000). В екзокринних
клітинах основним механізмом підвищення [Са2+]i є його вивільнення із
внутрішньоклітинних депо, зокрема, ендоплазматичного ретикулуму (ЕР),
та, як наслідок, активації надходження Са2+ ззовні (Park et al., 1999;
Williams, 2001; Федірко Н.В. та співавт., 2001; Petersen, 2002). Таким
чином, оскільки первинною ланкою в ініціації [Са2+]i-сигналів, які
запускають секрецію, є вивільнення Са2+ з ЕР, актуальною проблемою
сучасної фізіології є детальне дослідження механізмів активації та
регуляції цього процесу.

Необхідною умовою вивільнення Са2+ з ЕР, що відіграє ключову роль у
[Са2+]i-сигналізації, є підтримання високої концентрації Са2+ в ЕР
([Са2+]EР). Відомо, що зменшення [Са2+]EР призводить до розвитку
„ЕР-стресу”, що проявляється порушенням [Са2+]i-сигналізації,
накопиченням секреторних білків внаслідок припинення їх виведення з ЕР
та пригніченням синтезу і процессінгу білків, що може бути причиною
загибелі клітини (Skryma, 2000; Siman et al., 2001; Waris et al., 2002).
Однак, на сьогодні остаточно не з’ясованими є не лише механізми
виникнення „ЕР-стресу”, але і особливості перебігу Са2+-сигналізації в
ЕР ацинарних клітин підщелепної слинної залози за фізіологічних умов.
Для виявлення ролі ЕР у [Са2+]i-сигналізації важливим є проведення
комплексного дослідження механізмів її перебігу в ЕР на
пермеабілізованих клітинах та вкладу депонованого Са2+ у
[Са2+]i-сигналізацію в інтактних клітинах підщелепної слинної залози.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконана у рамках науково-дослідної держбюджетної теми БЛ-114Ф
“Механізми Са2+- і NO-залежної регуляції функціонування секреторних
клітин”, № держреєстрації 0103 U 001872 та за сприяння
Західно-Українського центру біомедичних досліджень.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягала у вивченні
функціонування Са2+-транспортних систем внутрішньоклітинних депо Са2+ в
ацинарних клітинах підщелепної слинної залози та з’ясуванню особливостей
їх регуляції.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні
завдання:

Провести аналіз кальцій-залежних змін функціонування ацинарних клітин
підщелепної слинної залози при активації холінорецепторів in vivo та in
vitro.

Розробити методичний підхід для реєстрації [Са2+]EР в ацинарних клітинах
та довести його адекватність для дослідження механізмів
Са2+-сигналізації в ЕР.

Вивчити властивості, шляхи регулювання та провести кінетичний аналіз
вивільнення Са2+ з інозитолтрифосфат-чутливого депо ЕР ацинарних клітин.

Виявити наявність функціонально-активних ріанодинових рецепторів в
ацинарних клітинах, вивчити їх властивості, шляхи регулювання та вклад у
[Са2+]і-сигналізацію.

Кількісно оцінити пасивний витік Са2+ з ЕР та депо-керований вхід Са2+ в
ацинарні клітини та дослідити їх механізми.

Вивчити роль мітохондрій у регуляції [Са2+]і-сигналізації в ацинарних
клітинах підщелепної слинної залози.

Об’єкт досліджень – [Са2+]і-сигналізація в екзокринних секреторних
клітинах.

Предмет досліджень – функціонування та регуляція Са2+-транспортних
систем внутрішньоклітинних депо Са2+ ацинарних клітин підщелепної
слинної залози щурів.

Методи досліджень – для досягнення поставленої мети використовували
біофізичні, біохімічні, статистичні методи досліджень, а також метод
електронної мікроскопії.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексне
дослідження механізмів функціонування Са2+-каналів мембрани ЕР ацинарних
клітин підщелепної слинної залози щурів та їх взаємодії з іншими
Са2+-транспортними системами. Розроблено експериментальні моделі для
проведення прямої реєстрації концентрації Са2+ всередині
внутрішньоклітинних органел пермеабілізованих ацинарних клітин і
доведено адекватність їх використання для дослідження механізмів
функціонування Са2+-транспортних систем. Вперше проведено реєстрацію
зміни [Са2+]ЕР в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози при
активації InsP3-чутливих рецепторів та досліджено механізми модуляції їх
активності. Зареєстровано зменшення [Са2+]ЕР в ацинарних клітинах при
активації ріанодин-чутливих рецепторів та вперше доведено їх вклад у
[Ca2+]i-сигналізацію у досліджуваних клітинах. Виявлено наявність
процесу швидкого захоплення Са2+, який вивільняється при активації
ріанодинових рецепторів, за участю мітохондрій (МХ). На основі змін
[Ca2+]i та [Са2+]ЕР, а також даних електронної мікроскопії постулюється
важлива фізіологічна роль колокалізації МХ, Са2+-АТФаз та ріанодинових
рецепторів у визначенні просторово-часових параметрів
[Ca2+]i-сигналізації. Встановлено, що в ацинарних клітинах підщелепної
слинної залози транслоконовий комплекс є основним шляхом пасивного
витоку Са2+ з ЕР. Кількісно оцінено депо-керований вхід Са2+ в ацинарні
клітини підщелепної слинної залози і вперше виявлено роль МХ у його
регуляції. Показано локалізацію МХ безпосередньо під плазматичною
мембраною (ПМ) у базальному полюсі ацинарних клітин, що визначає їх
важливу роль у підтриманні депо-керованого входу Са2+.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати розширюють
уявлення щодо механізмів функціонування Са2+-транспортних систем
внутрішньоклітинних органел ацинарних клітин слинних залоз. Вони можуть
бути теоретичною основою для подальших досліджень механізмів
Са2+-сигналізації у секреторних клітинах, причин і розвитку патологій
травних залоз та розробки методів їх фармакологічної корекції, тому
мають значення для медицини і ветеринарії. Отримані дані
використовуються при викладанні загальних курсів „Фізіологія людини і
тварин”, „Біофізика” та спецкурсів „Фізіологія травлення”, „Клітинні
механізми регуляції обміну речовин” у Львівському національному
університеті імені Івана Франка.

Особистий внесок здобувача полягає у виконанні всього обсягу
експериментальних досліджень, поданих у дисертаційній роботі,
статистичному опрацюванні результатів, підборі та обробці даних
літератури, а також, за участю наукового керівника, у плануванні
напрямків досліджень, розробці методик пермеабілізації ПМ ацинарних
клітин, вимірювання концентрацій іонізованого кальцію у цитоплазмі та
ЕР, аналізі одержаних результатів, формулюванні висновків.

У роботі використано обладнання, надане старшим науковим співробітником
Інституту фізіології імені О.О. Богомольця НАН України д.б.н. Войтенко
Н.В. Електронно-мікроскопічні дослідження проведено спільно із
співробітником Інституту фізіології імені О.О. Богомольця НАН України
к.б.н. Півневою Т.А.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень та основні
положення, включені до дисертації, були представлені на: VII
міжнародному медичному конгресі студентів та молодих вчених (Тернопіль,
2003 р.), I з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів,
2004 р.), науково-практичній конференції “Сечєнов та Одеська школа
фізіологів” (Одеса, 2004 р.), Міжнародній школі-семінарі IBRO
“Receptors, Channels, Messengers” (Ялта, 2004 р.), І Українській
науковій конференції “Прoблеми бiологiчної і медичної фізики” (Xapків,
2004 р.), Міжнародній конференції “Клітинні та субклітинні механізми
функціонування травної системи” (Львів, 2004 р.), регіональному
біофізичному з’їзді (Zrece, Словенія, 2005 р.), XXXV Міжнародному
Конгресі фізіологічних наук (Сан-Дієго, США, 2005 р.), III Конференції
товариства нейронаук (Донецьк, 2005 р.), XV Міжнародному біофізичному
конгресі (Монтпельєр, Франція, 2005 р.), семінарах кафедри фізіології
людини і тварин (2002-2005 рр.), щорічних звітних конференціях
біологічного факультету Львівського національного університету імені
Івана Франка (2002-2005 рр.) та на міжкафедральному семінарі
біологічного факультету у липні 2005 р.

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 5 статей у фахових
наукових журналах та 10 тез доповідей у матеріалах міжнародних та
українських наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 200
сторінках і включає вступ, огляд літератури, опис матеріалів та методів
досліджень, результатів досліджень, їх обговорення, висновки та список
використаної літератури з 313 джерел. Робота ілюстрована 81 рисунком і 7
таблицями.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Визначення показників слиновиділення підщелепною слинною залозою щурів.
Експерименти проводили на щурах-самцях лінії Вістар віком 1,5 міс.
Відбір слини проводили за модифікованою методикою, запропонованою для
привушної слинної залози щурів (Kawaguchi еt al., 2000). Перед початком
експерименту тварину наркотизували ін’єкцією кетаміну та лістенону.
Слину, яка виводилась протоками підщелепної слинної залози, відбирали
канюлею, якy впритул підводили до проток підщелепної слинної залози.
Виділення слини оцінювали за швидкістю слиновиділення, ?-амілолітичною
активністю слини, вмісту у ній загального білка та концентрації Са2+.

Ізолювання ацинарних клітин підщелепної слинної залози. Перед початком
гострого експерименту тварину наркотизували ефіром і проводили швидку
декапітацію. Ацинарні клітини підщелепної слинної залози ізолювали
шляхом піпетування тканини залози після її ферментативної обробки у
базовому зовнішньоклітинному розчині, який містив колагеназу (тип І, 270
од/мг), протягом 25-30 хв (35 оС). Базовий зовнішньоклітинний розчин
містив (у ммоль/л): NaCl – 140; KCl – 4,7; CaCl2 – 1,3; MgCl2 – 1,0;
гідроксиетилпіперазин-N-2-етансульфонову кислоту (HEPES) – 10; глюкоза –
10 ммоль/л; рН 7,4.

Визначення сумарного вмісту Са2+ у клітинах та секреції ними білка.
Сумарний вміст Са2+ в ацинарних клітинах визначали фотоколориметрично з
використанням металохромного барвника арсеназо ІІІ. Принцип методу
полягає у тому, що Са2+ утворює з арсеназо III комплекс синього кольору,
інтенсивність забарвлення якого еквівалентна концентрації Са2+ у пробі.
Вміст кальцію виражали в наномолях у перерахунку на 1 мкг білка, який
визначали за методом Лоурі (Lowry et al., 1951). Секрецію загального
білка ацинарними клітинами виражали у процентах від сумарного вмісту
білка у гомогенаті та супернатанті.

Вимірювання [Са2+]i в ацинарних клітинах. [Са2+]i в ацинарних клітинах
реєстрували з використанням мембранно-проникної форми флуоресцентного
Са2+-барвника фура-2/АМ. Для завантаження барвника суспензію клітин
інкубували у базовому розчині, який містив 5 мкмоль/л фура-2/АМ,
протягом 30-40 хв при 35?С, після чого відмивали базовим розчином і
додатково інкубували протягом 30 хв для повної деетерифікації барвника.
Для точного визначення [Ca2+]i використовували формулу Грінкевича
(Grynkiewicz et al., 1985): [Ca2+]i = Kd · B · (R – Rmin) / (Rmax – R).

Значення констант, одержані шляхом калібрування, становили: Rmin=0,9,
Rmax=19, В=26. Параметр Kd становив 224 нмоль/л (Grynkiewicz et al.,
1985).

Хімічна пермеабілізація ацинарних клітин. Ацинарні клітини
пермеабілізували дигітоніном та ?-есцином. Робочу концентрацію
детергентів та час інкубування клітин з ними підбирали експериментально.
Детергенти вносили до розчину, складом наближеного до
внутрішньоклітинного середовища (НДВ), який містив (у ммоль/л): KCl –
120; NaCl – 20; MgSO4 – 2; HEPES – 10; АТР – 3; EGTA – 1; CaCl2 – 0,75;
рН 7,2. Концентрація іонізованого Са2+, розрахована за допомогою
програми “WinMAXC v2.10”, у такому НДВ-розчині становила ~250 нмоль/л.
Тривалість інкубування клітин з дигітоніном (20 мкг/мл) становила 2-5 хв
у всіх експериментах, за виключенням окремо згадуваних, з ?-есцином (40
мкг/мл) – 3-6 хв. Пермеабілізацію клітин контролювали візуально з
використанням трипанового синього (0,4 %) під світловим мікроскопом, а у
випадку маг-фура 2/АМ-зафарбованих клітин оцінювали за падінням
флуоресцентного сигналу Са2+-барвника.

Визначення [Ca2+]ЕР у секреторних клітинах. Для моніторингу концентрації
Са2+ в ЕР, ацинарні клітини завантажували мембранно-проникною формою
низько-афінного флуоресцентного Са2+-барвника маг-фура 2/АМ. Фарбування
клітин проводили протягом 45-60 хв при 37?С, що забезпечує
компартменталізацію барвника у внутрішньоклітинних органелах (Hofer &
Machen, 1993). Зміни [Ca2+]ЕР виражали не як абсолютне значення, а як
співвідношення інтенсивності флуоресцентного сигналу маг-фура 2/АМ на
довжині хвилі збудження 360 нм до такої на 390 нм (F360/F390) і
оцінювали як прямо пропорційні до змін співвідношення F360/F390 (Hofer &
Machen, 1994).

Метод електронної мікроскопії. Ізольовані ацинарні клітини фіксували
протягом 12 год при 20?С у суміші розчинів глютаральдегіду (2 %) та
параформальдегіду (2 %), приготовлених на 0,1 моль/л фосфатному буфері
(рН 7,2-7,4). Дофіксацію проводили в 1 % розчині OsO4 у фосфатному
буфері протягом 1 год при кімнатній температурі. Зразки зневоднювали у
зростаючих концентраціях спиртів та заливали в епоксидну смолу (аралдит)
при поступовій заміні ацетону епоксидною смолою. Ультратонкі зрізи
отримували за допомогою ультрамікротому ІІІ (LKB, Швеція) і
контрастували у розчині нітрату свинцю та уранілацетату. Дослідження
проводили на електронному мікроскопі JEM 100 (JEOL, Японія) при 80 кВ із
збільшенням 5000 – 40000.

Оригінальні записи [Ca2+]і та [Ca2+]ЕР опрацьовували за допомогою
програм Tida 5.0 (Німеччина). Статистичну обробку результатів
здійснювали з використанням Microsoft Excel, аналіз змін співвідношення
F360/F390 проводили за допомогою Microcal Origin. Достовірність змін
встановлювали за t-критерієм Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

1. Кальцій-залежні зміни функціонування ацинарних клітин підщелепної
слинної залози щурів при активації холінорецепторів

Для з’ясування кальцієвої залежності функціональних відповідей
секреторних клітин слинних залоз ми досліджували ефекти активації
холінорецепторів in vivo та in vitro. Встановлено (табл.1) виражене
зростання швидкості слиновиділення та білково-ферментного вмісту слини
після внутрішньочеревного введення тваринам М-холіноміметиків –
карбахолу (2 мкг/кг) та пілокарпіну (2 мг/кг). Агоніст
Н-холінорецепторів цитизин (2 мг/кг) спричиняв підвищення лише
амілолітичної активності слини на 88 ± 9 % (n=10; р<0,01), тоді як швидкість слиновиділення зменшувалась на 51 ± 8 % (n=12; р<0,001). Блокування холінорецепторів атропіном (2 мкг/кг) супроводжувалось зменшенням швидкості слиновиділення на 74 ± 6 % (n=17; р<0,001) та амілолітичної активності слини – на 73 ± 9 % (n=13; р<0,001), а при попередньому його введенні атропін повністю елімінував стимулюючий ефект агоністів. Одержані результати підтверджують важливу функціональну роль М-холінорецепторів у стимуляції секреції рідинного компоненту слини підщелепною слинною залозою, а також вперше показують фізіологічну роль Н-холінорецепторів, при активації яких відбувається пригнічення секреції рідкої слини, а виділяється невелика кількість слини з високим вмістом ферментів. Виведення Са2+ є важливим компонентом стимульованої секреції екзокринними клітинами і може бути зумовлено як активацією секреції електролітів, так і виведенням Са2+ разом із вмістом секреторних гранул (Liu et al., 1998). Підтвердженням цього є підвищення концентрації Са2+ у секретованій слині на 245 ± 21 % (n=8, p<0,001) при стимуляції пілокарпіном, яке не спостерігалось після попередньої атропінізації тварин. В той же час активація М-холінорецепторів in vitro супроводжувалась підвищенням сумарного вмісту кальцію в ацинарних клітинах, яке також повністю елімінувалось атропіном. Зокрема, при дії АХ (5 мкмоль/л) вміст кальцію у клітинах підвищувався на 80 ± 8 % (n=7; р<0,01), карбахолу (5 мкмоль/л) – на 60 ± 7 % (n=7; р<0,01), пілокарпіну (5 мкмоль/л) – на 22 ± 3 % (n=6; р<0,01). Отже, зміни слиновиділення in vivo та вмісту кальцію у клітинах in vitro свідчать про те, що холінергічна стимуляція слиновиділення підщелепною слинною залозою опосередковується змінами Са2+-гомеостазу в ацинарних клітинах. 2. Пермеабілізовані клітини як модель для вивчення Са2+-транспортних систем внутрішньоклітинних органел Оскільки секреція екзокринними клітинами ініціюється підвищенням [Са2+]і, опосередкованим, в основному, вивільненням Са2+ з ЕР, то для дослідження функціонування Са2+-транспортних систем внутрішньоклітинних органел ми пермеабілізували ПМ клітини з використанням неіонних детергентів дигітоніну та ?-есцину. Виявилось, що ефекти дигітоніну на вміст сумарного кальцію у пермеабілізованих клітинах та білка у середовищі їх інкубування (як інтегрального показника секреції) виражено залежали від концентрації детергенту та часу його дії. Дигітонін викликав двохфазне підвищення вмісту загального білка: у концентрації 20 мкг/мл – на 10 ? 1,3 % (n=7; p<0,05) та у концентрації 100 мкг/мл і вище – на 17 ? 2 % (n=7; p<0,01). Динаміка змін сумарного вмісту кальцію у клітинах та секреції ними білка мала дзвоноподібний вигляд з максимумом при концентрації дигітоніну 20-50 мкг/мл протягом перших 5 хв його дії. Вже через 2,5 хв дії 20 мкг/мл дигітоніну вміст білка зростав на 21 ± 0,2 % (n=6, p<0,001), сумарний кальцій – на 48 ± 16 % (n=6; р<0,05). Таке підвищення обумовлено дигітонін-індукованим порушенням ПМ та вивільненням вмісту секреторних гранул, а також накопиченням кальцію в ЕР за рахунок роботи Са2+-АТФази у АТФ-вмісному НДВ-розчині. Низхідна гілка кривої, отримана при більш тривалій інкубації клітин з дигітоніном (5-15 хв) чи високими його концентраціями (50-200 мкг/мл), обумовлена порушенням цілісності мембран внутрішньоклітинних органел та втратою ними білків і Са2+. Підтвердженням ефективної пермеабілізації ПМ дигітоніном (20 мкг/мл) є вимивання флуоресцентних Са2+-барвників із цитоплазми та зниження інтенсивності флуоресцентного сигналу у пермеабілізованих клітинах. У випадку фура 2/АМ сигнал падав практично до фонового рівня, у випадку маг-фура 2/АМ – зменшувався в середньому на 60-80 % від початкового, решта (40-20 %) відображає світіння барвника всередині депо Са2+ (рис.1). Подальша перфузія клітин НДВ-розчином, який містив 3 ммоль/л АТФ, супроводжувалась зростанням співвідношення F360/F390 (рис.1), що відповідає підвищенню [Ca2+]ЕР, тоді як за відсутності АТФ, як і при дії тапсигаргіну, спостерігалось зменшення [Ca2+]ЕР. Таким чином, тапсигаргін-інгібована АТФ-залежна акумуляція Са2+ у депо ЕР свідчить про функціональну цілісність ЕР після обробки клітин дигітоніном. Для вивчення процесів [Ca2+]і-сигналізації при активації рецепторів ПМ ми розробили модель пермеабілізації клітини за допомогою ?-есцину. Так, пермеабілізовані ?-есцином клітини, як і оброблені дигітоніном, здійснюють АТФ-залежне накопичення Са2+ в ЕР, а підтвердженням того, що ?-есцин не порушує цілісності рецептор-зв’язаних сигнальних шляхів, є зареєстрований [Ca2+]ЕР-транзиєнт при дії АХ (рис.2). Отже, пермеабілізовані клітини є адекватною моделлю як дослідження механізмів підтримання гомеостазу Са2+ у внутрішньоклітинних депо (дигітонінова модель), так і ролі ЕР у [Ca2+]і-сигналізації (?-есцинова модель). 3. Функціонування тапсигаргін-чутливого та -нечутливого депо Са2+ в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози Для виявлення гетерогенності внутрішньоклітинних депо Са2+ в ацинарних клітинах ми підібрали умови максимального спустошення ЕР тапсигаргіном та АХ. При дослідженні динаміки тапсигаргін-індукованих змін сумарного вмісту кальцію в інтактних клітинах виявлено підвищення вмісту кальцію у кальцієвмісному середовищі та зменшення – у безкальцієвому. Максимальним ефект тапсигаргіну (0,1 мкмоль/л) був після 20-ти хвилин його дії як в інтактних, так і у пермеабілізованих ацинарних клітинах. При цьому кількість кальцію, який вивільняється при блокуванні Са2+-АТФази ЕР, складало ~ 30 % від загального його вмісту у депо. АХ (5 мкмоль/л), як і тапсигаргін, викликав подібні зміни сумарного вмісту кальцію в інтактних та пермеабілізованих клітинах, однак ефект АХ максимальним був після 10 хв його дії. Для з’ясування того, чи мішенню дії тапсигаргіну і АХ є одне і те ж депо Са2+, клітини попередньо преінкубували 20 хв з тапсигаргіном, після чого інкубували 10 хв з АХ. Виявилось, що після спустошення депо тапсигаргіном АХ (5 мкмоль/л) викликав додаткове підвищення сумарного вмісту кальцію ще на 38 ? 3 % (р<0,01; n=8) в інтактних клітинах (рис.3А) і зменшення ще на 38 ? 7 % (р<0,01; n=9) – у пермеабілізованих (рис.3Б), яке повністю елімінувалось гепарином – блокатором ІnsР3-чутливого вивільнення Са2+. У зафарбованих фура 2/AM клітинах тапсигаргін викликав підвищення [Ca2+]і, максимальне на 20 хв дії, яке у кальцієвмісному середовищі було платоподібним з амплітудою 112 ± 11 нмоль (n=8, рис.4), а у безкальцієвому – транзиєнтного характеру (амплітуда 51 ± 14 нмоль/л (n=6). При аплікаціях АХ на фоні тапсигаргіну зареєстровано градуальне зменшення амплітуди [Ca2+]і-транзиєнтів у кальцієвмісному (рис. 4) та безкальцієвому розчинах. Додаткове підвищення Са2+ (сумарного та іонізованого), свідчить про те, що тапсигаргін не повністю спустошує ІnsР3-чутливе депо Са2+. Прямим доказом наявності тапсигаргін-нечутливого депо Са2+ є зменшення [Ca2+]ЕР при дії окремо АХ, ванадату (блокатору Са2+-АТФаз широкого спектру дії) чи іономіцину (іонофору, який призводить до вивільнення Са2+ у рецептор- та енергонезалежний спосіб) після попереднього спустошення ЕР тапсигаргіном. Зокрема, тапсигаргін (3 мкмоль/л) викликав зменшення [Ca2+]ЕР на 0,045 ± 0,006 (n=12), а наступна аплікація 100 мкмоль/л ванадату на фоні тапсигаргіну супроводжувалась подальшим зменшенням F360/F390 ще на 0,042 ± 0,008 (n=6). Характерно, що ефекту АХ не спостерігалось після спустошення депо тапсигаргіном та ванадатом, тоді як на фоні лише тапсигаргіну АХ (5 мкмоль/л), як і іономіцин (10 мкмоль/л), викликав виражене зменшення [Ca2+]ЕР. Отже, в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози функціонує тапсигаргін-чутливе та тапсигаргін-нечутливе депо Са2+, обоє з яких є ІnsР3-залежними. 4. Властивості та регуляція інозитолтрифосфат-чутливих рецепторів ацинарних клітин підщелепної слинної залози У незбудливих клітинах вивільнення Ca2+ через InsP3-рецептор відіграє основну роль у визначенні просторово-часових параметрів Ca2+-сигналізації (Ambudkar, 2000; Berridge, 2002). Для з’ясування механізмів ІnsР3-чутливого вивільнення Са2+ ми провели реєстрацію зміни [Са2+]ЕР при активації холінорецепторів ПМ АХ та безпосередньо InsP3-рецепторів екзогенним InsP3. Амплітуда АХ-індукованого [Ca2+]ЕР-транзиєнту становила 0,1 ± 0,02, розрахований час напівспаду – 28 ± 2 с (n=23, р<0,001, рис.2). Викликана InsP3 [Ca2+]ЕР-відповідь прямо залежала від концентрації агоніста з ефективною концентрацією InsP3 (ЕС50) – 1,3 мкмоль/л. Зменшення [Ca2+]ЕР при дії АХ та InsP3 ефективно блокувалось гепарином, отже, опосередковане активацією тільки InsP3-рецепторів. Для дослідження залежності ІnsР3-індукованого зменшення [Ca2+]ЕР від цитозольного кальцію [Ca2+]і у НДВ-розчині фіксували на рівні 30, 100, 400 і 2000 нмоль/л. Викликане ІnsР3 (1, 3, 5 мкмоль/л) зменшення [Ca2+]ЕР потенціювалося Ca2+ при фізіологічних його концентраціях (100-400 нмоль/л), а подальше підвищення [Са2+]і інгібувало вивільнення Ca2+ (табл. 2). Для багатьох об’єктів показано, що активність ІnsР3-рецептора, подібно до [Са2+]і, модулюється АТФ (Ferris & Snyder, 1992; Bezprozvanny & Ehrlich, 1993). З’ясувалось, що в ацинарних клітинах ефект АТФ на ІnsР3-індуковане зменшення [Ca2+]ЕР залежить від концентрації АТФ: є позитивно кооперативним при низьких концентраціях та негативно кооперативним – при високих. Зокрема, за наявності у НДВ-розчині 0,5, 1 та 2 ммоль/л АТФ амплітуда ІnsР3-індукованого [Са2+]ЕР-транзиєнту зростала на 14 ± 1 %, 27 ± 5 % та 28 ± 6 % (n=6), порівняно з таким при 3 ммоль/л АТФ. У присутності 10 і 20 ммоль/л АТФ спостерігалось, навпаки, зменшення [Са2+]ЕР-відповіді на 5 ± 0,3 % (p<0,05) та 15 ± 3 % (n=6, p<0,01). Виявлено також здатність кофеїну (4 ммоль/л) пригнічувати InsP3-індуковане вивільнення Са2+ на 11 ± 3 % (n=9, p<0,05), що, однак, не спостерігалось при дії InsP3 у субмаксимальній концентрації (20 мкмоль/л). Пригнічуючого ефекту кофеїну не спостерігалось і в присутності АТФ (1 ммоль/л), навпаки – потенціювання InsP3-індукованого зменшення [Ca2+]ЕР на 65 ± 12 % (р<0,01; n=8), порівняно до такого без АТФ. Отже, активація ІnsP3-рецепторів індукує дозозалежне вивільнення Ca2+ з ЕР, яке є максимальним при значенні [Са2+]і у фізіологічних межах, пригнічується кофеїном та модулюється АТФ. 5. [Cа2+]і-сигналізація при активації ріанодинових рецепторів секреторних клітин підщелепної слинної залози Молекулярно-біологічними дослідженнями виявлено (Giannini et al., 1995) наявність у тканині підщелепної слинної залози мРНК, відповідальної за експресію ріанодинових рецепторів та доведено (Lee et al., 1997) їх наявність в ацинарних клітинах цієї залози. З іншого боку, при активації ріанодинових рецепторів не виявлено змін [Cа2+]і (Seo et al., 1997), тому питання їх функціональної активності в ацинарних клітинах слинних залоз залишається відкритим. Підтвердження функціонування ріанодинових рецепторів в ацинарних клітинах. З’ясувалось, що у пермеабілізованих ацинарних клітинах кофеїн викликає дозозалежне зменшення в них сумарного вмісту кальцію на 20 ? 5 %, 31 ? 7 % та 42 ? 7,5 % (p<0,05; n=10) при дії відповідно 0,2, 0,5 та 1 ммоль/л кофеїну та 77 ? 5 %, 81 ? 10 %, 86 ? 11,5 %, 89 ? 3 % (p<0,01; n=3) при підвищенні концентрації кофеїну до 10, 20, 30 та 40 ммоль/л. Шляхом реєстрації зміни [Ca2+]ЕР нами показано кофеїн-індуковане зменшення [Ca2+]ЕР (ЕС50 по кофеїну становить 7,3 ммоль/л), яке було нечутливим до гепарину, а, отже, не опосередковується активацією ІnsP3-рецепторів. Кофеїн-індуковане зменшення [Ca2+]ЕР блокувалося високими концентраціями ріанодину (100 мкмоль/л, рис.5А) та потенціювалось ріанодином у середніх концентраціях (10 мкмоль/л, рис.5Б), що є класичними ознаками ріанодинового рецептора. Отже, в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози наявні функціонально-активні ріанодин-чутливі рецептори. Зміни [Cа2+]і при активації ріанодинових рецепторів. При аплікації кофеїну (10-40 ммоль/л) до інтактних ацинарних клітин нами, як і іншими авторами (Seo et al., 1997), не виявлено достовірних змін [Ca2+]i, причому, відсутність [Ca2+]і-відповіді не пов’язана із спустошенням депо Ca2+, оскільки наступна аплікація АХ супроводжувалась генерацією [Ca2+]і-транзиєнту значної амплітуди. Змін [Ca2+]i не спостерігалось також при аплікації кофеїну на фоні блокування Са2+-АТФаз ПМ чи Са2+-АТФаз ЕР, лише при заблокованих МХ кофеїн (30 ммоль/л) викликав незначне підвищення [Ca2+]i на 48 ? 4 нмоль/л (n=8, p<0,001). Оскільки таке підвищення [Ca2+]i не відповідало кофеїн-індукованому [Ca2+]ЕР-транзиєнту, ми припустили можливість швидкого виведення Са2+ із цитоплазми системами активного його транспорту. Дійсно, генерація [Ca2+]i-транзиєнту при дії кофеїну спостерігалась лише при одночасному попарному блокуванні МХ разом з Са2+-АТФазою ПМ чи МХ і Са2+-АТФазою ЕР. Амплітуда кофеїн-індукованого [Ca2+]i-транзиєнту на фоні ванадату (10 мкмоль/л) та СССР (10 мкмоль/л) становила 176 ? 68 нмоль/л (n=6, p<0,001), тапсигаргіну (3 мкмоль/л) та СССР – 137 ? 40 нмоль/л (n=6, p<0,001). Отже, ріанодинові рецептори, очевидно, просторово колокалізовані з МХ та Са2+-АТФазами. При цьому Са2+, який вивільняється при активації ріанодинових рецепторів, практично повністю захоплюється МХ, оскільки прикладання 10 мкмоль/л СССР одразу після кофеїну супроводжувалось різким викидом Са2+ з МХ і зростанням [Ca2+]i на 184 ? 39 нмоль/л (n=5, p<0,001, рис. 6). Електронно-мікроскопічний аналіз розташування мітохондрій в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози. Дослідження ультраструктури клітин підщелепної слинної залози щурів виявило локалізацію МХ у безпосередній близькості до ЕР, більше того, оточення МХ ламелами ЕР (рис.7В). У 36 досліджуваних клітинах щільність МХ, розташованих біля ЕР, була вищою, ніж в інших регіонах клітини, а форма МХ, оточених ламелами, – більш витягнутою, порівняно з іншими МХ, що може бути обумовлено збільшенням площі контакту між мембранами органел. Таким чином, близьке розташування МХ біля ЕР підтверджує припущення про їх колокалізацію із структурами ЕР та свідчить про можливість контактів між Ca2+-транспортними системами ЕР і МХ. ^ ` „ a ? u $ O O $ O O & ( * , . 0 J z | ? O O O O O O O O O O O 2+]i, ми припускаємо, що група МХ в області між ПМ та ЕР, очевидно, відіграє роль регуляторів входу Ca2+ через депо-керовані Са2+-канали ПМ. 6. Базальний витік Са2+ з ЕР ацинарних клітин підщелепної слинної залози У стані спокою [Ca2+]ЕР підтримується шляхом активного захоплення кальцію Са2+-АТФазою ЕР на фоні його стаціонарного пасивного витоку (Hofer et al.,1999). Витік Са2+ є характерною особливістю ЕР, однак у клітинах слинних залоз залишається невивченим. Для візуалізації та дослідження механізмів пасивного витоку Са2+ ми провели: i) перфузію ацинарних клітин безкальцієвим НДВ-розчином (1 ммоль/л EГTA) для пригнічення прямого (але не реверсивного) режиму роботи Са2+-АТФази ЕР; ii) блокування обох режимів роботи Са2+-АТФази ЕР тапсигаргіном. Сумарний вміст кальцію у пермеабілізованих клітинах зменшувався після тривалого (20 хв) інкубування їх у безкальцієвому НДВ-розчині на 30 ? 4 %, з тапсигаргіном ([Ca2+]і=100нмоль/л) – на 29 ? 4 %, з тапсигаргіном у безкальцієвому НДВ-розчині – на 36 ? 6,5 % (p<0,01; n=8). За цих умов зареєстровано також зменшення [Ca2+]ЕР. Аналіз амплітуди зменшення F360/F390, характеристичного часу (?), розрахованого шляхом апроксимації зміни F360/F390 за допомогою експоненти, та лінійної швидкості показав наявність SERCA-залежного та -незалежного компонентів пасивного витоку Са2+ (табл.3). Причому, переважаючим є витік Са2+ не опосередкований роботою Са2+-АТФази ЕР, тоді як SERCA-залежне виведення Са2+ шляхом реверсивного режиму роботи становить близько ~ 35 %. Відповідно, можна припустити, що витік Са2+ з ЕР здійснюється через Са2+-канали InsP3- і ріанодинового рецепторів, однак, зменшення [Ca2+]ЕР було нечутливим до гепарину (300 мкг/мл) та рутенієвого червоного (10 мкмоль/л), але дозозалежно потенціювалося пуроміцином – інгібітором синтезу білка. Антибіотик пуроміцин від’єднує новоутворені поліпептиди від транслоконного комплексу мембрани ЕР, в результаті чого транслоконова пора стає проникною для Са2+ (Simon & Blobel, 1991). Викликане пуроміцином (500 мкмоль/л) зменшення [Ca2+]ЕР було нечутливим до гепарину, рутенієвого червоного та тапсигаргіну, а характеристичний час достовірно не відрізнявся від викликаного тапсигаргіном (? = 244 ± 52 с), що свідчить про те, що SERCA-незалежний витік Са2+ здійснюється через транслокон. Крім того, ефект пуроміцину не спостерігався на фоні 200 мкмоль/л анізоміцину, який селективно блокує такий механізм витоку Ca2+ (рис.8). Отже, в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози базальний витік Са2+ з ЕР не опосередковується Са2+-каналами чи порушенням роботи Са2+-АТФази, а здійснюється через пору транслоконного комплексу. 7. Дослідження депо-керованого входу Са2+ у секреторні клітини підщелепної слинної залози Єдиним відомим механізмом входу Са2+ у незбудливі клітини є активація депо-керованих Са2+-каналів ПМ (Putney, 1986; Ambudkar, 2000; Shuttleworth, 2004), механізми активації та інактивації якого залишаються остаточно нез’ясованими. Ми вивчали, чи існує залежність між способом спустошення депо ЕР і тривалістю дії агоністів та активацією входу Са2+ ззовні. Для активації входу Са2+ індукували різні шляхи спустошення ЕР кальцієм: і) блокування Са2+-АТФази ЕР, іі) активація ІnsР3- чи ріанодинових рецепторів. Згідно проколу експерименту інтактні ацинарні клітини інкубували у безкальцієвому зовнішньоклітинному середовищі з відповідним агоністом, після чого перфузували клітини кальцієвмісним розчином. Блокування Са2+-АТФази ЕР тапсигаргіном призводило до активації потужного входу Са2+ у клітини з амплітудою 186 ± 50 нмоль/л (p<0,01; n=10, табл.4, рис.10), тоді як інкубування клітин у безкальцієвому середовищі без тапсигаргіну (незалежно від тривалості), не призводило до змін [Ca2+]і. Свідченням того, що зареєстрований [Ca2+]і-транзиєнт опосередкований активацією депо-керованих Са2+-каналів ПМ, є його пригнічення на 69 ? 12 % (n=3) 2-аміноетоксидифеніл боратом (50 мкмоль/л) – специфічним блокатором SOC-каналів ПМ (Bootman et al., 2002). Вхід Са2+, індукований InsP3-чутливим спустошенням ЕР, залежав від тривалості дії/кількості аплікацій АХ – найбільшої амплітуди був при тривалому (5 хв) спустошенні депо АХ та сумісній дії АХ і тапсигаргіну. Спустошення ріанодин-чутливого депо Са2+ також активувало вхід Са2+, хоча й значно меншої амплітуди. При цьому кінетика розвитку депо-керованих [Ca2+]i-транзиєнтів, яка вважається показником кількості відкритих SOC-каналів, достовірно не відрізнялась між собою, незалежно від способу спустошення ЕР (агоністами чи блокаторами), що свідчить про єдиний механізм активації входу Са2+ ззовні (табл.4). Отже, спустошення ЕР активує вхід Са2+ ззовні, незалежно від способу спустошення (InsP3-залежного чи -незалежного), а рівень входу Са2+ прямо визначається ступенем спустошення депо. 8. Роль мітохондрій у регуляції депо-керованого входу Ca2+ Функціонування [Ca2+]i-транспортних систем мітохондрій у стані спокою. Для з’ясування ролі Са2+-уніпортеру МХ у підтриманні базального рівня [Ca2+]i використовували роз’єднувач протонного градієнту на мембрані МХ карбоніл ціанід м-хлорфенілгідразон (СCCP). СССР (10 мкмоль/л) викликав підвищення [Ca2+]i на 50 ? 6,7 нмоль/л (n=8) у кальцієвмісному розчині і на 37 ? 4 нмоль/л (n=5) – у безкальцієвому (рис.9). Для підтвердження того, що така зміна [Ca2+]і обумовлена блокуванням Ca2+-уніпортеру МХ, а не пригніченням роботи Ca2+-АТФаз у результаті припинення МХ синтезу АТФ, використали ротенон (інгібітор комплексу І ланцюга транспорту електронів) та олігоміцин (інгібітор АТФ-синтази), що запобігає активації реверсивного режиму роботи АТФ-синтази (Nicholls & Budd, 2000). Оскільки ефект 10 мкмоль/л ротенону та 1 мкмоль/л олігоміцину не відрізнявся від викликаного СССР, отже, підвищення [Ca2+]i опосередковане блокуванням Са2+-уніпортеру та вивільненням Са2+ з МХ. Основним шляхом транспорту Са2+ з МХ є його виведення Na+/Ca2+-обмінником (Badcock & Hille, 1998). Виявилось, що блокування Na+/Ca2+-обмінника МХ селективним блокатором – CGP 37157 (20 мкмоль/л) не супроводжувалось змінами [Ca2+]i (n=5). Змін [Ca2+]i не виявлено також при одночасному прикладанні СССР і СGP 37157, що є свідченням того, що у спокої клітин є неактивною мітохондріальна пора проникного переміщення (permeability transition pore), яку вважають додатковим механізмом виведення Ca2+ з матриксу МХ (Zoratti & Szabo, 1995). Модуляція мітохондріями депо-керованого входу Са2+. За умови блокування акумуляції Са2+ мітохондріями виявлено пригнічення депо-керованого входу Са2+ щонайменше вдвічі та сповільнення його кінетики, як у випадку тапсигаргін-індукованого, так і агоніст-опосередкованого спустошення ЕР (табл.4). Зокрема, на фоні СССР амплітуда депо-керованого підвищення [Ca2+]i при спустошенні ЕР тапсигаргіном зменшувалась на 51 ± 15 % (p<0,01; n=5, рис. 10), АХ – на 73 ± 12 %. При дослідженні ролі транс-мітохондріального транспорту Са2+ у регуляції його входу ззовні виявлено подібне зменшення рівня депо-керованого входу Ca2+ на фоні CGP 37157. При цьому зменшувалась лише амплітуда [Ca2+]i-транзиєнту (на 53 ± 11 % (p<0,01)), тоді як час напівзростання достовірно не змінювався (табл.4, рис.11). Очевидно, пригнічення входу Са2+ при дії CGP 37157 не опосередковане зменшенням кількості відкритих SOC-каналів ПМ, а обумовлено припиненням виведення Са2+ з МХ, що супроводжується відповідно пригніченням акумуляції Ca2+ МХ і як наслідок – підвищенням [Ca2+]i, яке, в свою чергу, призводить до Са2+-залежної інактивації SOC-каналів ПМ. Отже, МХ належить важлива фізіологічна роль у підтриманні депо-керованого входу Са2+ в ацинарні клітини підщелепної слинної залози. ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ Аналіз результатів дослідження параметрів слиновиділення при активації холінорецепторів in vivo та вмісту кальцію in vitro дозволяє зробити висновок про те, що секреторна активність ацинарних клітин підщелепної слинної залози опосередкована змінами внутрішньоклітинного гомеостазу кальцію, що цілком узгоджується із даними літератури (Abe et al., 1987; Putney, 1986; Liu et al., 1998; Ambudkar, 2000). Про кальцієву залежність секреції слини свідчить як зростання концентрації Са2+ у слині при холінергічній стимуляції тварин in vivo, так і підвищення сумарного вмісту кальцію у клітинах при інкубуванні їх in vitro з агоністами М-холінорецепторів. Виявлене нами виведення Са2+ разом із вмістом секреторних гранул є важливим компонентом стимульованої секреції і, очевидно, служить для більш швидкого відновлення [Са2+]і після завершення дії стимулу, що показано й іншими авторами (Gerasimenko et al., 1996; Martinez et al., 1996). Основним механізмом підвищення [Ca2+]і для запуску секреції ацинарними клітинами є вивільнення Са2+ з ЕР, механізми якого остаточно нез’ясовані. Для дослідження перебігу та регуляції вивільнення Са2+ з ЕР ми розробили методичний підхід для прямої реєстрації зміни [Ca2+]ЕР. Падіння флуоресцентного сигналу маг-фура 2/АМ при пермеабілізації клітин детергентами (дигітоніном та ?-есцином) свідчить про опроникнення ПМ, тоді як підвищення [Са2+]ЕР при наступній перфузії клітин АТФ-вмісним НДВ-розчином підтверджує інтактність мембрани ЕР. Більше того, зареєстрований [Ca2+]ЕР-транзиєнт при аплікації АХ до ?-есцин-пермеабілізованих клітин свідчить про цілісність рецептор-зв’язаних сигнальних механізмів при пермеабілізації, що показано і на пермеабілізованих панкреацитах (Lomax et al., 2000). У секреторних клітинах основним депо Са2+ є ЕР (Ambudkar, 2000; Berridge, 2002), проте, здатністю депонувати та вивільняти Ca2+ характеризуються також секреторні гранули, МХ (Martinez et al., 1996), ядро (Gerasimenko et al., 1995) і апарат Гольджі (Pinton et al., 1998). Виявлене нами функціонування в ацинарних клітинах тапсигаргін-нечутливого іономіцин-чутливого немітохондріального депо Са2+ є фізіологічно доцільним, оскільки Са2+, локалізований в інших субклітинних компонентах секреторного шляху, зокрема, апараті Гольджі, як і Са2+ в ЕР, відіграє важливу роль у трансляції, транслокації та процессінгу секреторних білків (Lodish et al., 1992). Враховуючи це, ми припускаємо, що InsP3-чутливе депо Са2+ наявне в апараті Гольджі. Шляхом реєстрації [Ca2+]ЕР нами показано, що АХ- та ІnsР3-індуковане зменшення [Ca2+]ЕР опосередковується тільки ІnsР3-рецепторами. На основі цього ми вважаємо, що холінергічна стимуляція слиновиділення in vivo пов’язана виключно із активацією ІnsР3-рецепторів, а опосередковане ними вивільнення Са2+ з ЕР є основним механізмом запуску секреції рідкої слини. Таке ІnsР3-індуковане вивільнення Са2+ потенціюється цитозольним Са2+ (100-400 нмоль/л), що зумовлено, очевидно, зростанням ймовірності перебування ІnsР3-каналів у відкритому стані (Iino, 1990). АТФ також характеризується біфазним впливом на ІnsР3-рецептор, оскільки у високих концентраціях АТФ, як і кофеїн, є конкурентним антагоністом ІnsР3-зв’язуючого центру рецептора (Bezprozvanny & Ehrlich, 1993). Ми довели наявність в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози функціонально-активних ріанодинових рецепторів (RyR), участь яких у [Cа2+]і-сигналізації залишалась нез’ясованою. Зареєстроване кофеїн-індуковане зменшення [Ca2+]ЕР було транзиєнтного характеру, а його амплітуда залежала від [Cа2+]і. Ріанодин (100 мкмоль/л) блокував вивільнення Ca2+, а у концентрації 10 мкмоль/л – фіксував канал у відкритому стані, що є класичними характеристиками RyR (Buck et al., 1992). З іншого боку, при активації RyR не спостерігається зростання [Cа2+]і в інтактних клітинах, що ми пов’язуємо із швидким захопленням Са2+ мітохондріями, близька локалізація яких з ЕР виявлена електронно-мікроскопічно. Ґрунтуючись на отриманих даних, ми припускаємо скоординовану участь кількох Са2+-транспортних систем у формуванні кофеїн-індукованого [Cа2+]і-сигналу (рис.12): кофеїн активує RyR ? Са2+, що вивільняється, захоплюється МХ ? виведення кальцію Na+/Са2+-обмінником МХ починає переважати над процесом його захоплення Са2+-уніпортером і МХ звільняються від накопиченого Са2+ ? активуються Са2+-АТФази ПМ та ЕР, які підтримують низьку [Са2+]і. За відсутності стимуляції відбувається базальний витік Са2+ з ЕР, який можна візуалізувати шляхом блокування Са2+-АТФази ЕР (Hofer et al., 1996). Виявлене нами зменшення [Ca2+]ЕР у безкальцієвому НДВ-розчині та при дії тапсигаргіну доводить наявність пасивного витоку Са2+ в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози. Такий витік Са2+ з ЕР потенціюється пуроміцином і блокується анізоміцином, а, отже, здійснюється через пору транслоконового комплексу, участь якої у забезпеченні пасивного витоку Са2+ з ЕР показано на панкреацитах (Lomax et al., 2000). Основним шляхом перезаповнення депо кальцієм після стимуляції клітин є вхід Са2+ через депо-керовані Са2+-канали ПМ та наступний транспорт всередину ЕР Са2+-АТФазою (Putney, 1986; Ambudkar, 2000; Shuttleworth, 2004), однак механізми активації та регуляції такого входу остаточно нез’ясовані. Припускають існування кількох типів SOC-каналів, які відрізняються способами активації (без зміни ІnsР3 та за участі ІnsР3-каналів), з іншого боку, не виключають і можливості активації одного типу SOC-каналу різними шляхами (Ambudkar et al., 1992; Liu et al., 1998, 2000). На основі кількісної оцінки амплітуди та кінетики депо-керованого підвищення [Ca2+]i ми дійшли висновку, що вхід Са2+ в ацинарні клітини активується незалежно від способу спустошення ЕР (InsP3-залежного чи -незалежного), а однакова кінетика розвитку депо-керованого [Ca2+]i-транзиєнту може свідчити про єдиний механізм його активації. Виявлене драматичне зменшення та сповільнення депо-керованого входу Са2+ в ацинарні клітини при блокуванні Ca2+-транспортних систем МХ доводять їх важливу фізіологічну роль у цьому процесі. На основі експериментальних даних, а також виявленого близького розташування МХ біля базальної ПМ, ми припускаємо, що Са2+, який входить в ацинарні клітини при активації SOC-каналів, швидко захоплюється МХ (рис.12), що попереджує їх Са2+-залежну інактивацію. Блокування Na+/Ca2+-обмінника, як і Са2+-уніпортеру МХ, викликає пригнічення входу Ca2+, не опосередковане зменшенням кількості відкритих SOC-каналів. Причиною пригнічення депо-керованого входу Ca2+ може бути зростання [Ca2+] у МХ, що супроводжується припиненням акумуляції Са2+ МХ, а це, в свою чергу, призводить до підвищення [Ca2+]i та Са2+-залежної інактивації SOC-каналів ПМ. На основі отриманих результатів ми пропонуємо комплексну схему (рис. 12) взаємоузгодженого функціонування Ca2+-транспортних систем у забезпеченні Са2+-сигналізації в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози. ВИСНОВКИ У дисертації відповідно до поставленої мети та завдань проведено дослідження функціонування Са2+-транспортних систем мембран внутрішньоклітинних органел ацинарних клітин підщелепної слинної залози та з’ясовано механізми вивільнення Са2+ з ЕР, що дозволяє значно розширити уявлення про роль ЕР у Са2+-сигналізації та функціонуванні секреторних клітин слинних залоз. На основі аналізу змін параметрів слиновиділення in vivo та сумарного вмісту кальцію in vitro показано, що холінергічна стимуляція призводить до кальцій-залежних змін у функціонуванні ацинарних клітин підщелепної слинної залози щурів. Розроблено методичний підхід для реєстрації концентрації Са2+ в ЕР пермеабілізованих ацинарних клітин та доведено його адекватність для вивчення Са2+-залежних механізмів регулювання екзоцитозу, змін Са2+-гомеостазу у внутрішньоклітинних органелах, а також перебігу [Ca2+]i-сигналізації, опосередкованої активацією рецепторів ПМ. Виявлено, що в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози функціонують два типи ІnsР3-чутливого депо Са2+: тапсигаргін-чутливе та тапсигаргін-нечутливе. Активація ІnsР3-рецепторів викликає зменшення [Ca2+]ЕР (ЕС50 за ІnsР3 становить 1,3 ± 0,21 мкмоль/л), яке регулюється кальцієм з максимумом при фізіологічній [Ca2+]i (100 нмоль/л) та модулюється АТФ: посилюється АТФ у низьких концентраціях (<1 ммоль/л), пригнічується – у високих (>1 ммоль/л).

В ацинарних клітинах підщелепної слинної залози доведено наявність
функціонально-активних ріанодинових рецепторів (ЕС50 за кофеїном
становить 7,3 ± 1,1 ммоль/л), які є нечутливими до гепарину, блокуються
ріанодином та дозо-залежно регулюються іонізованим кальцієм з максимумом
при [Ca2+]i = 400 нмоль/л. Виявлено фізіологічну роль мітохондрій у
захопленні Са2+, що вивільняється з ЕР при активації ріанодинових
рецепторів.

Основним шляхом пасивного витоку кальцію з ЕР, який компенсується
роботою Са2+-АТФази мембрани ЕР, є транслоконова пора.

Активація депо-керованого входу Са2+ в ацинарні клітини відбувається
незалежно від способу спустошення кальцієм депо ЕР (ІnsР3-чутливого чи
тапсигаргін-індукованого). Рівень та швидкість депо-керованого входу
Са2+ зменшуються при блокуванні мітохондрій, що свідчить про їх ключову
фізіологічну роль у регуляції входу Са2+ в ацинарні клітини підщелепної
слинної залози.

Електронно-мікроскопічне дослідження ультраструктури ацинарних клітин
підщелепної слинної залози виявило розташування мітохондрій у
безпосередній близькості до ЕР та їх локалізацію під ПМ у базальному
полюсі клітини, що підтверджує важливу фізіологічну роль колокалізації
Са2+-транспортних систем у процесах перебігу внутрішньоклітинної
Са2+-сигналізації та регуляції слиновиділення.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Fedirko N., Kopach O., Kruglikov I., Kostyuk P., Voitenko N. Imaging of
intrareticular calcium concentration in permeabilized cells //
Neurophysiology. – 2003. – Т. 35, № 3/4. – С. 345-346 (Здобувач провела
дослідження по вивченню зміни сумарного вмісту кальцію в ацинарних
клітинах, брала участь в аналізі даних та їх обговоренні).

Копач О.В., Кругликов І.А., Войтенко Н.В., Костюк П.Г., Федірко Н.В.
Пермеабілізовані клітини слинних залоз, як модель для вивчення
кальцій-транспортних систем мембрани ендоплазматичного ретикулуму //
Фізіол. журнал. – 2003. – Т. 49, № 5. – С. 31-42 (Здобувач провела
дослідження зміни сумарного вмісту кальцію, брала участь в обговоренні
даних та їх узагальненні, написанні та оформленні статті).

Копач О.В., Федірко Н.В., Кругликов І.А., Войтенко Н.В., Костюк П.Г.
Зміни функціонування підщелепної слинної залози щурів за умов
експериментально-індукованого діабету // Клінічна та експериментальна
медицина. – 2004. – Т. 3, № 2. – С. 462-463 (Здобувач провела всі
дослідження та статистичну обробку даних).

Копач О., Федірко Н. Кальцій-залежні зміни функціонування ацинарних
клітин слинних залоз при дії агоністів холінергічної природи // Вісник
Львів. ун-ту, Серія біологічна. – 2004. – Вип. 37. – С. 205-212
(Здобувач провела всі дослідження та опрацювання даних, проаналізувала
літературні джерела, взяла участь у написанні статті).

Копач О.В., Кругликов І.А., Войтенко Н.В., Федірко Н.В.
Тапсигаргінчутливе та нечутливе внутрішньоклітинне кальцієве депо в
ацинарних клітинах підщелепної слинної залози щурів // Фізіол. журнал. –
2005. – Т. 51, № 1. – С. 62-70 (Здобувач провела всі дослідження та
опрацювання результатів, взяла участь у написанні статті).

Kопач O., Федірко Н. Пермеабілізовані ацинарні секреторні клітини
слинних залоз як модель вивчення Са2+-транспортних систем мембрани
внутрішньоклітинних структур // Збірник тез доповідей VII міжнародного
медичного конгресу студентів та молодих учених, 21-23 травня 2003 р., м.
Тернопіль. – Тернопіль. – 2003. – С. 202 (Здобувач провела дослідження,
взяла участь в опрацюванні даних та написанні тез, представила доповідь
на конференції).

Копач О., Федірко Н., Кругліков І., Войтенко Н., Костюк П. Пуринергічна
внутрішньоклітинна Са2+-сигналізація у ацинарних клітинах слинних залоз
щурів // Установчий з’їзд українського товариства клітинної біології,
25-28 квітня 2004 р., м. Львів. – Львів. – 2004. – С. 35 (Здобувач взяла
участь у проведенні досліджень, аналізі даних, написанні тез,
представила стендову доповідь на конференції).

Kopach O.V., Kruglikov I.A., Kostyuk P.G., Fedirko N.V., Voitenko N.V..
Caffeine- induced changes of intrareticular Ca2+ homeostasis in rat
submandibular salivary cells // IBRO-advanced school of neuroscience
“Receptors, Channels, Messengers”, September 16-28 2004, Yalta
(Ukraine). – Р. 17 (Здобувач провела дослідження та опрацювання даних,
взяла участь у написанні та перекладі тез, представила доповідь на
конференції).

Копач О.В., Федірко Н.В. Тапсигаргін-індуковані зміни Са2+-гомеостазу у
секреторних клітинах підщелепної слинної залози щурів // І Українська
наукова конференція “Прoблеми бiологiчної і медичної фізики”, 20-22
вересня 2004 р., м. Харків. – Xapків. – 2004. – С. 143 (Здобувач провела
всі дослідження, взяла участь в аналізі даних, написанні тез).

Копач О.В., Федірко Н.В., Войтенко Н.В. Функціонування кофеїн-чутливого
Са2+ депо ендоплазматичного ретикулуму у секреторних клітинах
підщелепної слинної залози щурів // Матеріали міжнародної конференції
“Клітинні та субклітинні механізми функціонування травної системи”, 7-9
жовтня 2004 р., м. Львів. – Львів. – 2004. – С. 37 (Здобувач самостійно
провела дослідження та статистичну обробку даних, взяла участь в
написанні тез, представила стендову доповідь на конференції).

Fedirko N., Kruglikov I., Kopach O., Vats J., Voitenko N.. Changes in
functioning of rat submandibular salivary gland under
streptozotocin-induced diabetes are associated with alterations of Ca2+
signaling and Ca2+ transporting pumps // XXXV IUPS Congress, 31 March-1
April 2005, San Diego, USA. (Здобувач провела частину досліджень та
статистичну обробку результатів).

Kopach O., Kruglikov I., Voitenko N., Fedirko N. Caffeine-induced
changes of Ca2+ homeostasis in rat submandibular salivary cells //
Regional Biophysics Meeting, 16-20 March 2005, Zrece, Slovenija. – P. 42
(Здобувач самостійно провела дослідження та статистичну обробку даних,
взяла участь в їх аналізі, написанні та перекладі тез).

Копач О.В., Войтенко Н.В., Федірко Н.В. Депо-керований вхід кальцію у
секреторні клітин щурів // III конференція Українського товариства
нейронаук, 22-25 травня 2005, м. Донецьк. – Нейронауки: теорет. і клін.
аспекти. – Т.1, № 1. – 2005. – С. 54. (Здобувач провел всі дослідження,
взяла участь у написанні тез).

Fedirko N.V., Kopach O.V., Kostyuk P.G., Voitenko N.V. Store-operated
Ca2+ entry is regulated by mitochondria in acinar cells of rat
submandibular salivary gland // 15-th IUPAB & 5-th EBSA International
Biophysics Congress, August 27-Sept. 1 2005, Montpellier, France. –
Europ. Biophys. J. – Vol. 34, № 6. – Р. 544. (Здобувач провела
дослідження та опрацювання даних, взяла участь в аналізі та
інтерпретації результатів).

Kopach O.V., Voitenko N.V., Fedirko N.V. Basal Ca2+ leak from
endoplasmic reticulum of sub-mandibular acinar cells // 15-th IUPAB &
5-th EBSA International Biophysics Congress, August, 27- Semp. 1 2005,
Montpellier, France. – Europ. Biophys. J. – Vol. 34, № 6. – Р. 803.
(Здобувач самостійно провела дослідження та опрацювання даних, взяла
участь в написанні тез, представила стендову доповідь на конференції).

АНОТАЦІЇ

Копач О.В. Роль ендоплазматичного ретикулуму у регуляції
внутрішньоклітинної Са2+-сигналізації та функціонування ацинарних клітин
підщелепної слинної залози. – Рукопис.

Дисертація присвячена комплексному дослідженню механізмів вивільнення
Са2+ із внутрішньоклітинних депо ацинарних клітин підщелепної слинної
залози щурів.

В умовах досліду in vivo та in vitro показано кальцієву залежність
секреторних відповідей ацинарних клітин підщелепної слинної залози при
активації М-холінорецепторів. Розроблено експериментальні моделі для
реєстрації [Са2+]ЕР у пермеабілізованих ацинарних клітинах та доведено
їх адекватність для дослідження гомеостазу Са2+ у внутрішньоклітинних
депо та Са2+-залежного екзоцитозу. Шляхом реєстрації зміни [Са2+]ЕР
досліджено властивості та регуляцію InsP3-чутливих та ріанодинових
рецепторів ЕР. Доведено участь ріанодинових рецепторів у
[Ca2+]i-сигналізації в ацинарних клітинах. Показано, що в ацинарних
клітинах підщелепної слинної залози основним шляхом пасивного витоку
Са2+ з ЕР є транслоконовий комплекс. Кількісно оцінено депо-керований
вхід Са2+ в ацинарні клітини та виявлено важливу фізіологічну роль
мітохондрій у його регуляції. Проведено ультраструктурний аналіз
ацинарних клітин підщелепної слинної залози та виявлено локалізацію
мітохондрій у безпосередній близькості до ЕР та у базальному полюсі
клітини. Постулюється важлива фізіологічна роль колокалізації
мітохондрій, Са2+-АТФаз та ріанодинових рецепторів у визначенні
просторово-часових параметрів [Ca2+]i-сигналізації.

Ключові слова: [Са2+]і-сигналізація, ендоплазматичний ретикулум,
ІnsР3-чутливі рецептори, ріанодинові рецептори, мітохондрії,
депо-керований вхід Са2+, ацинарні клітини, підщелепна слинна залоза.

Копач О.В. Роль эндоплазматического ретикулума в регуляции
внутриклеточной Са2+-сигнализации и функционирования ацинарных клеток
подчелюстной слюнной железы. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.13 – физиология человека и животных. – Львовский
национальный университет имени Ивана Франко, Львов, 2005.

Дисертация посвящена исследованию механизмов высвобождения Са2+ из
внутриклеточных депо ацинарных клеток подчелюстной слюнной железы крыс.

В експериментах in vivo и in vitro показано Са2+-зависимость секреции
ацинарных клеток подчелюстной слюнной железы при активации
М-холинорецепторов. Разработано экспериментальные модели для прямой
регистрации [Са2+]ЭР в пермеабилизированных ацинарных клетках и доказано
их адекватность для исследования механизмов Са2+-гомеостаза и
Са2+-зависимого экзоцитоза. Проведено измерение [Са2+]ЭР при активации
InsP3- и рианодиновых рецепторов ЭР, исследовано их свойства и механизмы
регуляции. Доказано участие рианодиновых рецепторов в
[Ca2+]i-сигнализации в ацинарных клетках. Показано, что пассивная утечка
Са2+ из ЭР ацинарных клеток подчелюстной слюнной железы осуществляется
через пору транслоконного комплекса мембраны ЭР. Проведено
количественную оценку депо-управляемого входа Са2+ в ацинарные клетки и
установлено важную роль митохондрий в его регуляции.
Электронно-микроскопический анализ ацинарных клеток подчелюстной слюнной
железы показал локализацию митохондрий вблизи ЭР и в базальном полюсе
ацинарных клеток. Предполагается важная физиологическая роль
колокализации митохондрий, Са2+-АТФаз и рианодиновых рецепторов в
определении пространственно-временных параметров внутриклеточной
[Ca2+]i-сигнализации.

Ключевые слова: [Са2+]і-сигнализация, эндоплазматичний ретикулум,
ІnsР3-чувствительные рецепторы, рианодиновые рецепторы, митохондрии,
депо-управляемый вход Са2+, ацинарные клетки, подчелюстная слюнная
железа.

Kopach O.V. Role of endoplasmic reticulum for the regulation of
intracellular Са2+ signaling in acinar cells of rat submandibular
salivary gland – Manuscript.

Thesis for Ph.D. degree on the specialty 03.00.13 – Human and Animals
Physiology. – Ivan Franko National University of Lviv. Lviv, 2005.

Dissertation is devoted to a complex study of Ca2+ release from the
intracellular Ca2+ stores in acinar cells of rat submandibular salivary
gland.

In vivo and in vitro experiments showed that activation of
m-cholinoreceptors leaded to the complex of Ca2+-dependent changes in
the functioning of rat submandibular gland. Cholinergic stimulation in
vivo leaded to rise of salivation rate, saliva amylase activity, protein
content as well as secretion of Ca2+. In vitro administration to
m-cholinoreceptors agonists caused increase of total calcium content and
[Ca2+]i in isolated acinar cells.

Since activation of cholinoreceptors leads to release of Ca2+ from the
endoplasmic reticulum (ER) we have elaborated methods for direct
measurements of Ca2+ inside the ER. We have found that
digitonin-permeabilized cells posses Са2+-dependent protein secretion
and ATP-dependent Са2+ transport suggesting their acceptability for
studying Са2+-dependent exocytosis and functioning of Ca2+ stores.
Besides we have shown that ?-escin permeabilized cells posses Ca2+
release from ER upon the activation of m-cholinoreceptors.

We have elucidated heterogeneity of intracellular Ca2+ stores in the
acinar cells. Inhibition of Ca2+ ATPase of the ER with thapsigargin (Tg)
resulted in the release ~ 30 % of total ER Ca2+ but subsequent
application of Ach further release Ca2+ from Tg-discharged stores in
permeabilized cells. Thus, the acinar cells posses the ІnsP3-dependent
Tg-sensitive and -insensitive Ca2+ stores. Exogenous ІnsP3 decreased
[Ca2+]ER with EC50 1,3 ? 0,21 ?M. Such a release was amplified by Са2+
(100-400 nM), decreased by caffeine (2 mM). ATP (<1 mM) enhanced Ca2+ release but in high concentrations – suppressed it. Inhibition of ІnsP3-induced Ca2+ release by caffeine was eliminated by high concentration of InsP3 (20 ?M) and ATP (1 mM) indicating caffeine competition with InsP3 receptor domains. We also established a contribution of ryanodine receptors (RyRs) to the Са2+ signaling in acinar cells. Caffeine-induced decrease of [Ca2+]ER in permeabilized cells (ЕС50 = 7.3 ± 1.1 мМ) was insensitive to heparin and blocked by ryanodine (100 ?М). Although in the intact cells, caffeine (10-30 mM) did not cause any changes of [Ca2+]i. [Ca2+]і transient appealed when caffeine was applied under the pair-blocked mitochondria and SERCA or PMCA. We also shown that addition of CCCP following the caffeine application leaded to a rapid increase [Ca2+]і. Thus, on the base of data obtained and electron-microscopy data we suggest that mitochondria entirely captures Са2+ released during activation of RyRs. We elucidated passive Ca2+ leak from the ER of acinar cells. Such Са2+ leak is not mediated by InsP3- or RyRs receptors. Puromycin (0,1–1 mM), that removes nascent polypeptides from ribosomes, increased Са2+ leak independently of SERCA, InsP3- or RyRs receptors. Thus, we conclude that passive Са2+ leak from ER in acinar cells occurs through a translocon pore in ER membrane. Store-operated Ca2+ entry is a major pathway for refilling of ER that’s activated by emptying of intracellular Ca2+ stores. We have shown that emptying the stores by Tg or ACh leaded to activation of Ca2+ entry. We also found that mitochondria are required to support of Ca2+ entry in the acinar cells. The rate of Ca2+ influx and amplitude of [Ca2+]і transient were significantly lower when mitochondrial Ca2+ accumulated was prevented. Besides, inhibition of mitochondrial Ca2+ release also suppressed of store-operated [Ca2+]і rise. We concluded that trans-mitochondrial Ca2+ transport could have a crucial physiological role for support store-operated Ca2+ entry into acinar cells of rat submandibular salivary gland. Кey words: [Са2+]і signaling, endoplasmic reticulum, ІnsР3-receptors, ryanodine receptors, mitochondria, store-operated Са2+entry, acinar cells, submandibular salivary gland. Підписано до друку 5.11. 2005 р. Формат 60*90/16. Друк на різографі. Папір офсетний. Умовних друк. арк. 1,0. Тираж 100 прим. Замовл. № 27 ПП „Арк-Сервіс” м. Львів, вул. Драгоманова 14/16, к.3

Похожие записи