Національна Академія Наук України

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії

Калініна Яна Михайлівна

УДК
576.3:580.031+57.012.4

Ріст та диференціація клітин кореня Brassica rapa L. в умовах
мікрогравітації та кліностатування

03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ — 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі клітинної біології та анатомії Інституту
ботаніки

ім. М.Г.Холодного Національної академії наук України.

Науковий керівник: чл.-кор. НАН України,

доктор біологічних наук, професор,

Кордюм Єлизавета Львівна,

Інститут ботаніки ім. М.Г.
Холодного НАН України,

завідувач відділу клітинної
біології та анатомії.

Офіційні опоненти: чл.-кор. НАН України,

доктор біологічних наук, професор,

Черевченко Тетяна Михайлівна,

Національний ботанічний сад ім.
М.М. Гришка НАН України,

почесний директор;

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник,

Ємець Алла Іванівна,

Інститут клітинної біології та
генетичної інженерії НАН України,

завідувач лабораторії клітинної
біології і біотехнології.

Захист відбудеться “22” листопада 2007 р. о 14 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.202.01 при Інституті клітинної біології
та генетичної інженерії НАН України за адресою: м. Київ, вул. акад.
Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту клітинної
біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, м. Київ,
вул. акад. Заболотного, 148.

Автореферат розісланий “ 22 ” жовтня 2007 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук
О.А. Кравець

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Рослини, як регенеранти кисню і джерело незамінних
речовин, є необхідним компонентом контрольованих екологічних систем
життєзабезпечення космонавтів в тривалих космічних польотах. Дослідження
біології рослинної клітини в умовах космічного польоту та при частковому
моделюванні невагомості за допомогою кліностатування виявили суттєвий
вплив мікрогравітації на ультраструктуру та метаболізм вищих і нижчих
рослин [Kordyum E.L., 1997]. Тому набувають актуальності дослідження
впливу мікрогравітації на процеси росту та диференціювання клітин та
пошуки шляхів їх нормалізації у разі виникнення патологічних змін.

Головна увага в дослідженнях впливу мікрогравітації та кліностатування
на ультраструктурну організацію рослинних клітин приділялася кореневому
чохлику як гравірецепторному органу [Sievers A., Volkmann D., 1977,
Сытник К.М. и др., 1982, Slocum R.D, 1984, Sack F.D., 1991, Kordyum
E.L., Guikema J.A., 2001]. Майже поза увагою лишилися аспекти впливу
мікрогравітації на ріст та диференціювання клітин власне кореня. На
особливу увагу в цих дослідженнях заслуговує зона розтягу кореня,
розташована на межі меристеми та центральної зони розтягу і не так давно
визначена як дистальна. Останнім часом дистальна зона розтягу викликає
все більший інтерес через специфічну чутливість її клітин до дії
багатьох чинників, зокрема фітогормонів, алюмінію, позаклітинного
кальцію, водного стресу і т.д. [Ishikawa H., Evans M., 1993, Ishikawa
H., Evans M., 1995, Baluska F., et al., 1996]. Тому проведені нами
дослідження ультраструктури клітин дистальної зони розтягу при
кліностатуванні і за умов реальної мікрогравітації розширюють уявлення
про роль клітин цієї ростової зони кореня в процесах розвитку і
адаптації рослин до зміни величини і напрямку вектора гравітації.

Актуальним є питання щодо особливостей просторової організації
цитоскелетних структур, оскільки ростові процеси, внутрішньоклітинний
транспорт везикул, органел та інших макромолекулярних структур
здійснюється за безпосередньої участі цитоскелету, зокрема,
мікротрубочок [Williamson R.E., 1991, Cyr R.J., 1994, Hashimoto T., Kato
T., 2006]. Мікротрубочки рослинного цитоскелету є структурами, які
характеризуються високою лабільністю і чутливістю до таких фізичних
факторів як низькі температури [Abdrakhamanova A., et al., 2003], світло
[Iwata K., Hogetsu T., 1989, Zandomeni K., Schopfer P., 1993],
осмотичний стрес [Blancaflor E.B., Hasenstein K.H., 1995], гравітація
[Hasenstein K.H.,

et al., 1999], гіпергравітації [Wymer C.L., et al., 1996], поранення
[Hush J.M., et al., 1990] та механічний тиск [Cleary AL., Hardham AR.,
1993, Zandomeni K., Schopfer P., 1994]. Тому дослідження особливостей
організації цитоскелету рослинних клітин на послідовних стадіях росту та
диференціювання клітин кореневого апексу за умов зміненої гравітації є
необхідним елементом для розуміння функціонування автотрофних організмів
за умов космічного польоту.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконувалася у рамках науково–дослідної роботи відділу клітинної
біології та анатомії Інституту ботаніки

ім. М.Г. Холодного НАН України за темою № 312 “Розробка та створення
польотного обладнання для підготовки космічних біологічних і
біотехнологічних експериментів та проведення наземних досліджень”
2003–2007 рр. (номер держреєстрації 0100U002485); грант INTAS

№ 03–51–6459 “Фосфорилювання мікротрубочок під впливом різних умов
навколишнього середовища”.

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи було з’ясування впливу
умов реальної мікрогравітації в космічному польоті та кліностатування
на процеси росту та диференціювання клітин кореня проростків Brassica
rapa L. та Arabidopsis thaliana (GFP–MAP4 та

GFP–ABD2 ). Для досягнення мети було поставлено наступні завдання:

Дослідити морфолого–анатомічні показники головного кореня проростків B.
rapa за умов кліностатування.

Вивчити ультраструктуру клітин меристеми, дистальної та центральної зон
розтягу кореня проростків B. rapa при кліностатуванні та за умов
реальної мікрогравітації.

Дослідити організацію тубулінового цитоскелету клітин кореня B. rapa
різних ростових зон кореня при кліностатуванні.

Дослідити просторову організацію кортикальних мікротрубочок in vivo в
коренях проростків GFP–MAP4 модифікованого A. thaliana при
кліностатуванні із застосуванням інгібіторного аналізу.

Дослідити організацію актинового цитоскелету in vivo в коренях
проростків GFP–ABD2 модифікованого A. thaliana при кліностатуванні.

Об’єкт дослідження – ріст та диференціювання клітин кореня

Brassica rapa та Arabidopsis thaliana в умовах мікрогравітації та
кліностатування.

Предмет дослідження – ультраструктура та цитоскелет клітин різних
ростових зон кореня Brassica rapa та Arabidopsis thaliana під впливом
мікрогравітації та кліностатування.

Методи дослідження. Для дослідження якісних та кількісних
морфолого–анатомічних ознак коренів B. rapa та A. thaliana (GFP–MAP4)
використовували методи світлооптичної мікроскопії. Вивчення
ультраструктури клітин в різних ростових зонах коренів B. rapa проводили
за допомогою методів трансмісійної електронної мікроскопії та
морфометричного аналізу. Просторову організацію мікротрубочок в клітинах
коренів B. rapa візуалізовали за допомогою методу непрямого
імунофлуоресцентного аналізу. Дослідження in vivo GFP модифікованих
ліній A. thaliana проводили за допомогою конфокальної мікроскопії.
Статистичну обробку результатів досліджень здійснювали за стандартними
методиками.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведене дослідження
ультраструктурної організації клітин в різних ростових зонах кореня
проростків B. rapa за умов кліностатування та реальної мікрогравітації.

На підставі виявлених ультраструктурних перебудов та морфометричного
аналізу показано, що клітини дистальної зони розтягу кореня порівняно з
іншими ростовими зонами кореня є більш чутливими до умов зміненої
гравітації.

Встановлено, що за умов кліностатування відбувається дезорієнтація
кортикальних мікротрубочок в дистальній зоні розтягу коренів проростків
B. rapa та стабільно трансформованої лінії A. thaliana (GFP–MAP4).

Показано, що дезорієнтація кортикальних мікротрубочок в дистальній зоні
розтягу коренів проростків B. rapa та стабільно трансформованої лінії A.
thaliana (GFP–MAP4) викликає пригнічення анізотропного росту в
центральній зоні розтягу, яке виявляється у зменшенні довжини клітин
цієї зони.

На основі дослідів in vivo із застосуванням інгібіторного аналізу
виявлено високу динамічність дезорієнтованих кортикальних мікротрубочок
в дистальній зоні розтягу коренів проростків лінії

A. thaliana (GFP–MAP4).

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані можуть
використовуватися для подальших дослідницьких робіт у галузі визначення
молекулярних механізмів гравічутливості рослинних клітин і технологій
створення автотрофних ланок для систем життєзабезпечення космонавтів в
тривалих космічних польотах.

Результати дослідження можуть використовуватися в учбовому процесі при
підготовці спеціалістів з клітинної біології.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота являє собою самостійне
завершене дослідження, результати якого отримані здобувачем особисто.
Спільно з науковим керівником проведено вибір об’єктів, розроблено
напрямок досліджень, концепцію і структуру дисертаційної роботи.
Особистий внесок здобувача полягає в плануванні та виконанні
експериментів, обробці та інтерпретації результатів роботи, аналізі
літератури та написанні наукових статей.

Апробація результатів дисертації. Робота виконувалась у Відділі
клітинної біології та анатомії Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного

НАН України в 2001–2007 рр. Результати роботи багаторазово доповідалися
та обговорювалися на засіданнях відділу клітинної біології та анатомії.

Основні положення та результати роботи були оприлюднені на наступних
наукових з’їздах та конференціях: Третій українській конференції з
перспективних космічних досліджень (Кацивелі, Крим, 2003), 26–му та
27–му Міжнародних симпозіумах з гравітаційної фізіології (Кельн,
Німеччина, 2005, та Осака, Японія, 2006), Міжнародному симпозіумі
“Цитоскелет рослин: інструмент для біотехнології та агробіології” (Ялта,
Крим, 2006), Третій конференції європейської організації дослідження
рослин “Динаміка рослин: від молекул до екосистем” (Віжеград, Угорщина,
2006), Міжнародній конференції молодих учених–ботаніків “Актуальні
проблеми ботаніки, екології та біотехнології” (Київ, 2006), ІХ
Міжнародній молодіжній науково–практичній конференції “Людина і космос”
(Дніпропетровськ, 2007), Міжнародному симпозіумі європейської асоціації
з дослідження низької гравітації (Флоренція, Італія, 2007).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 17 наукових праць, з
них 3 статті у фахових вітчизняних журналах, які входять до переліку ВАК
України, 3 статті у закордонних журналах та 11 тез.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду
літератури, опису матеріалів та методів дослідження, результатів
дослідження, обговорення результатів дослідження, узагальнення,
висновків та списку використаних джерел, який містить 314 найменувань.
Роботу викладено на 135 сторінках комп’ютерного друку, результати
ілюстровано 16 таблицями та 54 рисунками та фотографіями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об’єктами дослідження було обрано шестидобові проростки

Brassica rapa L. та п’ятидобові проростки Arabidopsis thaliana (L.)
Heynh. для досліджень in vivo тубулінового та актинового цитоскелету
(стабільно трансформовані лінії, які експресують химерні гени GFP–MAP4
та

GFP–ABD2). Проростки вирощували в стаціонарних умовах і на повільному
горизонтальному кліностаті з частотою 2 оберти за хвилину. Для
досліджень анатомічної структури та ультраструктури проростки

B. rapa вирощували при освітленні 12000 лк (10/14 годин світла/темноти)
і

24–25єС в цукрових стаканчиках на фільтрувальному папері з додаванням
поживного середовища Хогланда. Для досліджень тубулінового цитоскелету
насінини B. rapa пророщували при освітленні 12000 лк

(10/14 годин світла/темноти) і температурі 24–25єС на 1% агарі з
додаванням 1/2 середовища Мурашиге–Скуга та 1,5 % сахарози. Проростки
стабільно трансформованих ліній A. thaliana (GFP–MAP4 та GFP–ABD2)
вирощували в трубочках з фільтрувального паперу на середовищі Хогланда
при температурі 22–23єC в темноті.

Апекси головних коренів проростків B. rapa, які вирощувалися за умов
кліностатування та в контролі, фіксували 2,5% глютаральдегідом та
дофіксовували 1%–им OsO4 на фосфатному буфері, pH 7,2. Переведення
фіксованого матеріалу в суміш епон–аралдитових смол здійснювали за
загальноприйнятими методиками. Апекси головних коренів проростків

B. rapa за умов реальної мікрогравітації вирощувалися на борту
космічного корабля “Колумбія” (87 експедиція) під час Спільного
українсько–американського експерименту (19 листопада – 5 грудня 1997
р.). Цей дослідний матеріал був отриманий від Є.Л. Кордюм у вигляді
коренів за полімеризованих у суміш епон–аралдиту. Поздовжні зрізи
виготовляли на ультрамікротомі XL (RMC, USA). Для досліджень
анатомічної будови використовували напівтонкі зрізи (завтовшки 1,5–1,8
мкм) фарбовані за Шик–реакцією. Для вимірювань анатомічних елементів та
клітин було використано окуляр–мікрометр МОВ–1–15 (ЛОМО, Росія) та
світлооптичний мікроскоп NF. Дослідження ультраструктури клітин
проводили на ультратонких зрізах (60–80 нм) в електронному мікроскопі
“JEM–1200 EX”. Матеріалом для морфометричного аналізу були негативні
знімки клітин рядів кори різних ростових зон кореня, сфотографовані при
збільшенні 5000, 6000 і 10 000. Негативи отримані за допомогою
електронного мікроскопу сканували в програмі HP Precisionscan Pro 3.1.
Морфометричний аналіз проводили на отриманих цифрових фотографіях за
допомогою програми UTHSCSA ImageTool, version 3.00 (University of Texas
Health Science Center at San Antonio, Texas).

Імунофлуоресцентну візуалізацію мікротрубочок в клітинах кореня B. rapa
проводилася на зрізах з використанням первинних моноклональних мишиних
анти–б–тубулін антитіл (Molecular Probes, USA), розведення 1:200, та
вторинних антитіл, мічених FITC (флуоресцинізотіоціанат) (Sigma, USA),
розведення 1:20. Препарати додатково фарбували розчином DAPI
(4,6–діамідіно–2–феніліндол) (Sigma, USA) для виявлення ядерної ДНК.
Препарати досліджували під конфокальним лазерним скануючим мікроскопом
LSM 5 PASCAL (Zeiss, Germany) з наступною мультиканальною конфігурацією:

1) канал для DAPI: збудження лазером 405 нм, спліт фільтр

HFT 405/514, дзеркало, фільтр емісії BP 420–480 нм.

2) канал для FITC: збудження лазером 488 нм, спліт фільтр

HFT 488, дзеркало, фільтр емісії BP 505–530 нм.

Використовували об’єктив Plan–Neofluar 100*/1.3 Oil. На основі серійних
оптичних зрізів, зроблених з інтервалом 0,4–0,5µм, будували тривимірні
моделі за допомогою програмного забезпечення Carl Zeiss Aim, version
3.0.

Трансгенні лінії арабідопсису були використані з метою досліджень

in vivo. Лінію A. thaliana (GFP–MAP4) застосовували для візуалізації
мікротрубочок, лінію A. thaliana (GFP– ABD2) використовували для
візуалізації актинових мікрофіламентів. Стабільно трансформовані лінії
A. thaliana з експресією химерних генів GFP–MAP4 та GFP–ABD2 були
надані проф. Д. Волькманом та проф. Ф. Балушкою (Інститут клітинної та
молекулярної ботаніки, м. Бонн) у рамках співробітництва в науковому
проекті INTAS № 03–51–6459.

Досліди in vivo з проростками лінії A. thaliana (GFP–MAP4) включали
обробку оризаліном. В цьому випадку проростки поміщали в поживне
середовище Хогланда, яке містило в своєму складі 5 µM/L оризалін.

Схема експерименту:

А. Стаціонарні умови вирощування:

– проростки, які росли вертикально;

– проростки, які росли вертикально, а потім піддавалися короткотривалим
обробкам оризаліном;

– проростки, які росли вертикально в середовищі з оризаліном.

Б. Горизонтальне кліностатування:

– кліностатовані проростки;

– кліностатовані проростки, з наступними короткотривалими обробками
оризаліном;

– кліностатовані проростки, вирощені в середовищі з оризаліном.

Дослідження коренів проростків ліній A. thaliana (GFP–MAP4 та GFP–ABD2)
проводили під конфокальним мікроскопом LSM 5 PASCAL (Zeiss, Germany) з
наступною конфігурацією: збудження лазером 488 нм, спліт фільтр HFT 488,
пластинка, фільтр емісії LP 505, об’єктив Plan–Neofluar 40*/0,75. У
випадку короткотривалих обробок оризаліном робили кілька серійних
оптичних зрізів з інтервалом до 0,8–1,0 µм кожні 15, 30, 60 та 120 хв.
На основі серійних оптичних зрізів будували тривимірні моделі за
допомогою програмного забезпечення Carl Zeiss Aim, version 3.0. В цій же
програмі проводили вимірювання розмірів клітин різних ростових зон
кореня проростків лінії A. thaliana (GFP–MAP4).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Анатомо–морфологічна структура головного кореня проростків B. rapa за
умов кліностатування.

Розглянуто структуру головного кореня проростків B. rapa в контролі та
за умов кліностатування (рис. 1). За умов кліностатування виявлено
достовірне зменшення довжини меристеми власне кореня (порівняно з
контролем на 38%), дистальної зони розтягу (на 50%) та центральної зони
розтягу (на 64%). Показано значне зменшення кількості клітин в
повздовжніх рядах протодерми (на 41%) та периблеми (в зовнішньому ряді
на 50%, у внутрішньому на 47%) за умов кліностатування. Лінійні розміри
меристематичних клітин при кліностатуванні не змінюються (рис. 2).
Зменшення довжини ростових зон кореня за умов кліностатування
відбувається за рахунок зменшення кількості клітин в зоні меристеми та
уповільнення росту клітин розтяганням.

Рис. 2. Довжина клітин кореня проростків B. rapa: 1–протодерма, 2–перший
ряд периблеми, 3–другий ряд периблеми, 4,7–епідерма, 5,8–перший ряд
кори, 6,9–другий ряд кори; 1–3 – меристема, 4–6 – дистальна зона
розтягу, 7–9 – центральна зона розтягу.

Рис. 1. Напівтонкі зрізи апексів B. rapa:

А – контроль,

Б – кліностатування. Масштаб 10 мм.

Ультраструктура клітин в різних ростових зонах кореня B. rapa в умовах
зміненої гравітації. Представлено дані досліджень ультраструктури клітин
кори та епідерми в різних ростових зонах кореня B. rapa в контролі, в
умовах кліностатування та мікрогравітації, та їх морфометричного
аналізу. Показано, що ультраструктурна організація клітин є типовою для
меристематичних та паренхімних клітин. Виявлено ультраструктурні
перебудови, спектр яких ширший за умов мікрогравітації ніж при
кліностатуванні.

Встановлено, що клітини різних ростових зон кореня мають різний ступінь
чутливості до умов мікрогравітації та кліностатування. Найбільш чутливою
є дистальна зона розтягу кореня, наприкінці якої відбувається перехід
від ізотропного до анізотропного росту клітин. Саме в цій ростовій зоні
кореня спостерігається найбільша кількість ультраструктурних перебудов,
які виникають під впливом зміненої гравітації. Перш за все вони
стосуються мітохондрій, що свідчить про зміну енергетичного статусу
клітин за умов зміненої гравітації. За умов мікрогравітації в клітинах
дистальної зони розтягу виявлено появу великої кількості мітохондрій з
глибокими інвагінаціями (рис 3.).

Рис. 3. Фрагменти клітин дистальної зони розтягу кореня B. rapa за умов
мікрогравітації: Я –ядро, М – мітохондрія, П – пластида, АГ – апарат
Гольджі, В – вакуоль, КО – клітинна оболонка, ЕР – ендоплазматичний
ретикулум. Масштаб 500 nm.

? ’ E

i

i

?

N

’ ” A Ae ^

E

&

AE

„A`„A

першому ряді кори та достовірно збільшується у другому ряді клітин кори
до 0,5±0,03 мm2. Порівняно з контролем, за умов кліностатування значно
зростає кількість мітохондрій – 37,5±6,7 у першому ряді та 27,1±4,5 у
другому ряді клітин кори. Підвищується їх парціальний об’єм в клітині.

Таким чином, реакція мітохондрій при кліностатуванні та в умовах
мікрогравітації відрізняється. Якщо при кліностатуванні спостерігається
велика гетерогенність популяції мітохондрій, появу великих розбухлих
мітохондрій та збільшення їх парціального об’єму, то за умов
мікрогравітації відбувається прискорення швидкості їх оновлення шляхом
ділення, внаслідок чого збільшується кількість мітохондрій менших за
розміром у порівнянні з контролем.

За умов мікрогравітації виявлено зміни в ультраструктурі клітин
дистальної зони розтягу, що полягають в появі закручених профілів
диктіосом (рис. 4) та великої кількості ЕР–тілець – розширень
гранулярного ендоплазматичного ретикулуму з гомогенним вмістом середньої
електронної щільності (рис. 5а).

Рис. 4. Фрагмент клітин дистальної зони розтягу кореня B. rapa за умов
мікрогравітації. Відмічено апарат Гольджі (АГ). Масштаб 500 nm.

Ці компартменти, згідно останніх досліджень [Matsushima R., et al.,
2002], селективно акумулюють PYK10 – в–глюкозідазу з сигналом розширення
цистерн ендоплазматичного ретикулуму. Вважається, що тільця
ендоплазматичного ретикулуму, є стрес індукованими.

За умов мікрогравітації спостерігаються мієліноподібні структури –
складні інвагінації цитоплазматичної мембрани, різні за розміром та
формою, що містять в центрі містять багатошарові закручування, а на
периферії переважно везикулярні елементи неоднакового діаметра

(рис. 5б).

а б

Рис. 5. Фрагменти клітин дистальної зони розтягу кореня

B. rapa за умов мікрогравітації:

а – ЕР–тільця (ЕР),

б – мієліноподібна структура. Масштаб 1 мm.

За умов мікрогравітації прискорюється диференціювання клітин, що
проявляється в появі ядер з лопатевими виростами в клітинах меристеми
(рис. 6).

Рис. 6. Фрагменти меристематичних клітин кореня B. rapa за умов
мікрогравітації: Я – ядро, Яд – ядерце. Масштаб 1 мm.

Тубуліновий цитоскелет в клітинах епідермісу та кори кореня

B. rapa за умов кліностатування. Викладено результати дослідження
просторової будови тубулінового цитоскелету в клітинах епідермісу та
кори кореня B. rapa в контролі та за умов кліностатування. Тубуліновий
цитоскелет представлений ендоплазматичними мікротрубочками, які
розташовуються по всьому об’єму цитоплазми та радіально розходяться від
ядра в напрямку периферійних шарів цитоплазми, та кортикальними
мікротрубочками, представленими щільними компактними паралельними
рядами, розташованими безпосередньо біля цитоплазматичної мембрани. За
умов кліностатування, топографія ендоплазматичних мікротрубочок в
різних ростових зонах кореня подібна до такої в контролі. Форма та
локалізація ядер за умов кліностатування не змінюється.

Показано, що за умов кліностатування відбувається порушення просторової
орієнтації кортикальних мікротрубочок в клітинах епідермісу та кори
дистальної зони розтягу головного кореня B. rapa (рис. 7), що призводить
до уповільнення швидкості анізотропного росту в центральній зоні розтягу
(рис. 2). Внаслідок цього довжина клітин в цій зоні зменшується
порівняно з контролем на 16% в першому ряді і на 20% в другому ряді
кори.

Рис. 7. Тубуліновий цитоскелет в клітинах ДЗР кореня B. rapa:

а–контроль, б–кліностатування. Масштаб 10 µm.

In vivo дослідження цитоскелету в трансгенних лініях A. thaliana за
умов кліностатування. Наведені результати досліджень in vivo актинового
та тубулінового цитоскелету в трансгенних лініях A. thaliana у контролі
та за умов кліностатування. Дослідження тубулінового цитоскелету в
клітинах кореня лінії A. thaliana (GFP–MAP4) показали поступову зміну
просторової організації кортикальних мікротрубочок у процесах росту та
диференціювання клітин епідерми та кори. Кортикальні мікротрубочки в
меристематичних клітинах та у клітинах дистальної зони розтягу в
основному орієнтовані поперечно до довгої осі кореня. З припиненням
розтягання клітин кортикальні мікротрубочки поступово змінюють
орієнтацію на поздовжню (рис. 8).

Рис. 8. Зміна орієнтації кортикальних мікротрубочок під час
диференціювання клітин кореня A. thaliana (GFP–MAP4). Масштаб 20 мм.

При кліностатуванні орієнтація кортикальних мікротрубочок в клітинах
меристеми та центральної зони розтягу подібна до такої в стаціонарних
умовах вирощування. В дистальній зоні розтягу за умов кліностатування
відбувається поява дезорієнтованих мікротрубочок (рис.9).

Рис. 9. Кортикальні мікротрубочки в дистальній зоні розтягу кореня A.
thaliana (GFP–MAP4): А–контроль, Б–кліностат. Масштаб 15 мм.

Проведені виміри клітин кореня A. thaliana (GFP–MAP4) показали, що при
кліностатуванні зменшується довжина клітин в центральній зоні розтягу
порівняно з контролем (табл. 1).

Обробка коренів проростків оризаліном протягом 15, 30, 60 та

120 хв. показала, що ступінь руйнації мікротрубочок залежить від
тривалості дії оризаліну та ростової зони кореня. Найбільш чутливими до
оризаліну виявилися кортикальні мікротрубочки в клітинах дистальної зони
розтягу. В клітинах кліностатованих проростків дезорієнтовані
кортикальні мікротрубочки швидко зникали вже після 15 хв. дії оризаліну
(рис. 10).

Рис. 10. Поступова деполімеризація дезорієнтованих кортикальних
мікротрубочок в кліностатованих проростках A. thaliana (GFP–MAP4)

(5 µM/L оризалін 5, 10, 15 хв.). Масштаб 10 мм.

Вирощування проростків в середовищі з оризаліном протягом 5–ти діб
значно впливало на ріст проростків, що виявлялося в уповільненні росту
та свелінгу коренів. Спостерігалися суттєві пошкодження структури
кортикальних мікротрубочок, про що свідчила відсутність кортикальної
сітки та поява флуоресцентних плям.

При вирощуванні проростків в середовищі з оризаліном, як в контролі, так
і при кліностатуванні, клітини центральної зони розтягу приблизно
однаково зазнавали розбухання, що виявлялося в збільшенні їх ширини та
зменшення довжини (табл. 1). При цьому індекс форми клітин збільшувався
з 0,42(0,03 в контролі до 0,66(0,04 в досліді оризалін+контроль і до
0,68(0,03 в досліді оризалін+кліностатування.

Дослідження актинового цитоскелету в клітинах кореня стабільно
трансформованої лінії A. thaliana (GFP–ABD2) не виявило видимих змін у
просторовому розташуванні актинових мікрофіламентів в різних ростових
зонах кореня в умовах кліностатування.

Таблиця 1.

Розміри клітин меристеми, дистальної та центральної зон розтягу коренів
A. thaliana (GFP–MAP4) в контролі, при кліностатуванні та при
вирощуванні проростків в присутності оризаліну (в контролі та при
кліностатуванні)

(µm, M±m; n=150)

Варіант досліду меристема дистальна зона розтягу центральна зона розтягу

довжина ширина довжина ширина довжина ширина

контроль 5,91±1,21 14,03±4,02 15,64±4,78 14,59±3,12 31,10±2,55
13,14±1,11

кліностатування 6,78±1,99 13,94±3,67 13,81±3,98 13,87±3,91 24,06*±3,2
13,45±3,36

контроль +

оризалін 6,06±1,39 11,20±1,95 12,79±2,26 13,23±3,16 25,52*±2,59
16,79*±1,82

кліностатування + оризалін 6,17±1,49 12,08±2,13 13,51±2,98 15,19±2,03
24,40*±2,37 16,58*±1,91

Примітка. * – різниця достовірна при p ( 0.05

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі викладено результати досліджень ультраструктурної
організації та цитоскелету клітин в різних ростових зонах головних
коренів проростків B. rapa та A. thaliana за умов кліностатування та
мікрогравітації.

1. Встановлено, що клітини різних ростових зон кореня мають різний
ступінь чутливості до умов мікрогравітації та кліностатування. Найбільш
чутливою є дистальна зона розтягу кореня, наприкінці якої відбувається
перехід від ізотропного до анізотропного росту клітин.

2. В умовах мікрогравітації відбувається прискорення диференціювання
клітин кореня, про що свідчить поява ядер з лопатевими виростами у
клітинах меристеми.

3. Спектр ультраструктурних перебудов органел ширший за умов
мікрогравітації порівняно з кліностатуванням. Поява в клітинах
дистальної зони розтягу закручених профілів діктіосом, мієліноподібних
структур та великої кількості ЕР–тілець вказує на стресовий характер
впливу мікрогравітації на рослинні клітини.

4. Зменшення довжини ростових зон кореня за умов кліностатування
відбувається за рахунок зменшення кількості клітин в зоні меристеми та
уповільнення росту клітин розтяганням.

5. Показано, що, на відміну від контролю, за умов кліностатування
відбувається дезорієнтація кортикальних мікротрубочок в клітинах
дистальної зони розтягу головного кореня B. rapa та

A. thaliana (GFP–MAP4).

6. Дезорієнтація кортикальних мікротрубочок в клітинах дистальної зони
розтягу призводить до уповільнення швидкості анізотропного росту, що
виявляється у зменшенні довжини клітин в центральній зоні розтягу
коренів B. rapa та A. thaliana (GFP–MAP4) за умов кліностатування.

7. На основі дослідів in vivo з застосуванням інгібіторного аналізу,
виявлено високу динамічність дезорієнтованих кортикальних мікротрубочок
в клітинах дистальної зони розтягу кореня лінії

A. thaliana (GFP–MAP4), яка обумовлює специфічну чутливість клітин
дистальної зони розтягу до умов зміненої сили тяжіння.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Калініна Я.М. Структурні зміни головного кореня проростків Brassica rapa
L. за умов кліностатування // Український ботанічний журнал. – 2004. –
Т. 61, № 1. – С. 82– 89.

Калініна Я.М. Тубуліновий цитоскелет в клітинах епідермісу та кори
кореня Brassica rapa за умов кліностатування // Цитология и генетика. –
2006.– Т. 40, № 5. – С. 21– 27.

Калініна Я.М. Ультраструктура кортикальних клітин різних ростових зон
кореня Brassica rapa за умов кліностатування // Вісник Львівського
університету: Серія біологічна. – 2007. – Т.43. – С. 221 – 227.

Kalinina Ya. The influence of clinorotation on root cell differentiation
in Brassica rapa seedlings // Journal of Gravitational Physiology. –
2005. – Vol. 12, № 1. – P. 199 – 200.

Kalinina Ia., Kordyum E. Clinorotation affects the microtubule
organization in root epidermis and cortex cells in Brassica rapa
seedlings // Journal of Gravitational Physiology. – 2006. –Vol.13, №1.–
P. 109 – 110.

Shevchenko G., Kalinina Ya., Kordyum E. Interrelation between
cytoskeleton elements in root cells of Arabidopsis–GFP–MAP4 seedlings
under clinorotation // Journal of Gravitational Physiology. – 2006. –
Vol.13, №1.– P.107 – 108.

Shevchenko G.V., Kalinina Ya.M., Kordyum E.L. Interrelation between
microtubules and microfilaments in the elongation zone of Arabidopsis
root under clinorotation // Advances in Space Research. – 2007. – Vol.
39. – P.1171 – 1175.

Калініна Я.М. Морфолого–анатомическая структура главного корня
проростков Brassica rapa в условиях клиностатирования // Третья
украинская конференция по перспективным космическим исследованиям. ?
Кацивелі, Крим , 2003. – С. 79.

Калініна Я.М. Зміни тубулінового цитоскелету в клітинах кореня Brassica
rapa за умов кліностатування // Актуальні проблеми дослідження та
збереження фіторізноманіття. Матеріали конференції молодих
учених–ботаніків, м. Умань. – К: 2005. – С. 154 – 155.

Калініна Я.М. Просторова орієнтація кортикальних мікротрубочок в
клітинах кореня Brassica rapa за умов кліностатування //Актуальні
проблеми ботаніки, екології та біотехнології. Матеріали міжнародної
конференції молодих учених–ботаніків, м. Київ. – К: Фітосоціоцентр,
2006. – С.189 – 190.

Калініна Я.М. Вплив кліностатування на орієнтацію кортикальних
мікротрубочок в клітинах кореня Brassica rapa // Матеріали XII з’їзду
Українського ботанічного товариства. – Одеса, 2006. – С. 445.

Калініна Я.М. Ультраструктура клітин кореня Brassica rapa в умовах
мікрогравітації та кліностатування // Людина і космос. Матеріали ІХ
Міжнародної молодіжної науково–практичної конференції. –
Дніпропетровськ, 2007. – С. 218.

Kalinina Ya.M. The influence of clinorotation on root cell
differentiation in Brassica rapa seedlings // Abstracts of the 9th
European Symposium on Life Research in Space, 26th Annual International
Gravitational Physiology Meeting. – Cologne, Germany, 2005. – P. 250.

Kalinina Ia., Kordyum E. Clinorotation affects the microtubule
organization in root epidermis and cortex cells in Brassica rapa
seedlings // Proceedings of the 27th Annual Gravitational Physiology
Meeting. – Osaka, Japan, 2006. – P. 159.

Shevchenko G., Kalinina Ya., Kordyum E. Interrelation between
cytoskeleton elements in root cells of Arabidopsis-GFP-MAP4 seedlings
under clinorotation // Proceedings of the 27th Annual Gravitational
Physiology Meeting.– Osaka, Japan, 2006 – P.149.

Kalinina Ia. Tubulin cytoskeleton alterations in cells of Brassica rapa
roots under clinorotation // Abstracts of the 3rd EPSO Conference

“Plant Dynamics: from Molecules to Ecosystems”. – Visegrad, Hungary,
2006. – P. 119.

Kalinina Ia., Shevchenko G., Kordyum E. Oryzalin sensitivity of cortical
microtubules in Arabidopsis thaliana root cells under clinorotation //
Abstracts of the International Symposium “The Plant Cytoskeleton:
Genomic and Bioinformatic Tools for Biotechnology and Agriculture”.–
Yalta, Crimea, 2006. – P. 47–48.

Kalinina Ia. Microtubules spatial alterations in root cells of Brassica
rapa under clinorotation // Abstracts of the International Symposium
“The Plant Cytoskeleton: Genomic and Bioinformatic Tools for
Biotechnology and Agriculture”. – Yalta, Crimea, 2006. – P. 49–51.

Shevchenko G., Kalinina Ya., Kordyum E. Role of cytoskeleton in
gravisensing of the root elongation zone in Arabidopsis thaliana plants
// Abstracts of the International Symposium “The Plant Cytoskeleton:
Genomic and Bioinformatic Tools for Biotechnology and Agriculture”.–
Yalta, Crimea, 2006. – P. 86–88.

Kalinina Ia.M., Shevchenko G.V. Kordyum E.L. Rearrangement of
microtubule cortical arrays in plants under clinorotation // Proceedings
of the 28th Annual Gravitational Physiology Meeting. – San Antonio, TX,
USA, 2007. – P. 108.

Kalinina Ia., Shevchenko G., Kordyum E. Sensitivity of cortical
microtubules in Arabidopsis thaliana root cells under clinorotation //
Abstracts of the Keystone symposia “Plant Cell Biology”.– Idaho, USA,
2007. – P. 53.

АНОТАЦІЯ

Калініна Я.М. Ріст та диференціація клітин кореня

Brassica rapa L. в умовах мікрогравітації та кліностатування. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія. –
Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ,
2007.

У дисертаційній роботі викладено результати досліджень ультраструктурної
організації та цитоскелету клітин в різних ростових зонах коренів
Brassica rapa та Arabidopsis thaliana (стабільно трансформовані лінії
GFP–MAP4 та GFP–ABD2) в контролі, за умов горизонтального
кліностатування (2 об/хв.) та реальної мікрогравітації на борту
“Колумбія” під час 87–ої експедиції (1997 р.). Використано методи
імуноцитохімії, світлооптичної, електронної та конфокальної мікроскопії.

Встановлено, що дистальна зона розтягу є більш чутливою до умов
кліностатування та мікрогравітації порівняно з іншими ростовими зонами
кореня. Показано, що за умов кліностатування відбувається дезорієнтація
кортикальних мікротрубочок в клітинах дистальної зони розтягу B. rapa та
A. thaliana (GFP–MAP4). Це призводить до уповільнення швидкості
анізотропного росту клітин в центральній зоні розтягу за умов
кліностатування. Дезорієнтовані кортикальні мікротрубочки, які
з’являються в клітинах дистальної зони розтягу A. thaliana (GFP–MAP4)
при кліностатуванні, виявляють гіперчутливість до оризаліну, що свідчить
про їх високу динамічність. Обґрунтовується, що саме висока динамічність
кортикальних мікротрубочок обумовлює специфічну чутливість клітин
дистальної зони розтягу до умов зміненої сили тяжіння.

Ключові слова: гравічутливість, ультраструктура клітин, цитоскелет,
дистальна зона розтягу, мікрогравітація, кліностатування.

АНОТАЦИЯ

Калинина Я.М. Рост и дифференциация клеток корня

Brassica rapa L. в условиях микрогравитации и клиностатирования. –
Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.11 – цитология, клеточная биология, гистология. –
Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев,
2007.

В диссертационной работе представлены результаты исследования
ультраструктуры и цитоскелета клеток корня Brassica rapa и

Arabidopsis thaliana (стабильно трансформированные линии GFP–MAP4 и
GFP–ABD2) в условиях горизонтального клиностатирования (2 об/мин.) и
реальной микрогравитации на борту “Колумбия” во время 87–ой экспедиции
(1997г.). Использованы методы иммуноцитохимии, светооптической,
электронной и конфокальной микроскопии.

Установлено, что дистальная зона растяжения наиболее чувствительна к
влиянию микрогравитации и клиностатирования по сравнению с другими
ростовыми зонами корня. Показано, что в условиях клиностатирования
происходит дезориентация кортикальных микротрубочек в клетках дистальной
зоны растяжения B. rapa и

A. thaliana (GFP–MAP4). Это приводит к замедлению скорости анизотропного
роста клеток в центральной зоне растяжения. Дезориентированные
кортикальные микротрубочки, которые появляются в клетках дистальной зоны
растяжения A. thaliana (GFP–MAP4) при клиностатировании, проявляют
гиперчувствительность к оризалину, что свидетельствует об их высокой
динамичности. Обосновывается, что именно высокая динамичность
кортикальных микротрубочек обуславливает высокую чувствительность клеток
дистальной зоны растяжения к условиям измененной силы тяжести.

Ключевые слова: гравичувствительность, ультраструктура клеток,
цитоскелет, дистальная зона растяжения, микрогравитация,
клиностатирование.

ABSTRACT

Kalinina Ia.M. Root tip cell growth and differentiation in

Brassica rapa seedlings under microgravity and clinorotation conditions.
– Manuscript.

A thesis for the candidate of biological sciences degree (specialty
03.00.11 – cytology, cell biology, histology).– Institute of Cell
Biology and Genetic Engineering, National Academy of Sciences of
Ukraine, Kyiv, 2007.

The thesis is devoted to questions on gravisensitivity of plant cells
not specialized to gravity perception. To elucidate the gravisensitivity
of root apex cells during their growth and differentiation, we
investigated the ultrastructural organization and cytoskeleton in cells
of root growth zones in Brassica rapa and Arabidopsis thaliana (stably
transformed lines GFP–MAP4 and GFP–ABD2) seedlings grown at 1g, under
horizontal clinorotation (2rpm) and in real microgravity on board the
shuttle «Columbia» in the frame of the Collaborative US/Ukrainian
Experiment during STS–87 (1997 y.). Clinorotation was used to simulate
some effects of microgravity. Methods of immunocytochemistry, light,
electron and confocal microscopy were used.

The distal elongation zone has been shown to be the most sensitive to
microgravity and clinorotation in comparison with other root growth
zones. We showed that spaceflight conditions induced a wider range of
rearrangement in the organelle ultrastructure than clinorotation. Some
changes in cell ultrastructure in microgravity, especially increasing
the volume of ER–bodies, which represent dilatation of granular
endoplasmic reticulum, indicate its stress influence. In microgravity
and under clinorotation, an acceleration of cell differentiation occurs,
that is revealed in an appearance of lociniate nuclei in meristematic
cells in the distal elongation zone.

An appearance of disoriented cortical microtubules in cells of the
distal elongation zone in B. rapa and A. thaliana (GFP–MAP4) roots under
clinorotation has been observed. The significant decrease in a cell
length in the central elongation zone, i.e. declining in an anisotropic
growth, is suggested to connect with microtubule disorientation in the
distal elongation zone.

Based on in vivo experiments with A. thaliana (GFP–MAP4) we present data
that disoriented microtubules appeared in the distal elongation zone
under clinorotation are hypersensitive to oryzalin, that indicates
increasing the rate of their dynamic turnover. A dynamics of cortical
microtubule is assumed to cause high sensitivity of the distal
elongation zone to altered gravity.

Key words: gravisensitivity, cell ultrastructure, cytoskeleton, distal
elongation zone, microgravity, clinorotation.

Похожие записи