ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ім. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

КОРЖ ЮЛІЯ ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 579.841: 577.114

Регуляція С2-метаболізму у Acinetobacter sp. B-7005 –Продуцента
екзополісахариду етаполану

03.00.07 – мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ — 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі біології газоокислюючих мікроорганізмів
Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного Національної
Академії Наук України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий
співробітник Пирог Тетяна Павлівна, Інститут мікробіології і вірусології
ім. Д.К. Заболотного НАН України, провідний науковий співробітник
відділу біології газоокислюючих мікроорганізмів.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Варбанець
Людмила Дмитрівна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К.
Заболотного НАН України, завідувач відділу біохімії мікроорганізмів.

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Кучмеровська
Тамара Муратівна, Інститут біохімії ім О.В. Паладіна НАН України,
провідний науковий співробітник відділу біохімії коферментів.

Провідна організація: Дніпропетровський національний університет кафедра
мікробіології і вірусології, м. Дніпропетровськ.

Захист відбудеться “21” вересня 2005 р. о 1000 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 Інституту мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: м. Київ, 03143,
вул. Заболотного, 154

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: м. Київ, 03143,
вул. Заболотного, 154

Автореферат розісланий “ 11 “ серпня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук, с.н.с. Пуріш Л. М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Мікробні полісахариди, як внутрішньоклітинні, так
і екзогенні викликають великий інтерес у дослідників – мікробіологів,
біохіміків, молекулярних біологів, біотехнологів, тощо. Цей інтерес
зумовлюється тією роллю, яку виконують полісахариди в життєдіяльності
клітини, їхнім значенням у взаємодії мікроорганізмів з навколишнім
середовищем. Щодо екзополісахаридів (ЕПС) мікробного походження, то,
завдяки унікальним фізико-хімічним властивостям, вони привертають увагу
науковців при вирішенні певних практичних завдань. Практична значущість
ЕПС зумовлена їхньою здатністю у невисоких концентраціях істотно
змінювати реологічні характеристики водних систем. Різноманітність
фізико-хімічних властивостей мікробних ЕПС визначає їхнє використання в
нафтодобувній, харчовій, хімічній промисловості, сільському
господарстві, медицині.

Здатність до синтезу ЕПС виявлено у багатьох мікроорганізмів, проте
рівень синтезу цих полімерів коливається в широких межах як для різних
продуцентів ЕПС, так і для одного продуцента в різних умовах його
культивування. Створення високоефективних технологій одержання
практично важливих метаболітів базується на цілеспрямованій регуляції
процесу біосинтезу, що в свою чергу потребує глибоких знань фізіології,
біохімії та генетики продуцентів.

Відомо, що у послідовності метаболічних реакцій, пов’язаних з утворенням
ключових інтермедіатів конструктивного метаболізму, може бути “вузьке
місце” – реакція, швидкість якої нижча від інших або пов’язана з великою
витратою енергії чи втратою вуглецю субстрату. Виявлення таких сайтів
метаболічного лімітування, розробка підходів до їхнього усунення і
визначення на основі цих знань принципів регуляції енергетичного та
конструктивного метаболізму дасть змогу реалізувати біотехнологічні
процеси з найвищою ефективністю.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертаційна робота включає дослідження, виконані згідно плану
науково-дослідних робіт відділу біології газоокислюючих мікроорганізмів
Інституту мікробіології та вірусології НАН України за темами «Вивчення
екології метилотрофних бактерій і регуляції синтезу практично важливих
метаболітів» (номер державної реєстрації 0196U003717), «Біологія і
біотехнологічні аспекти практичного використання бактерій, які ростуть
на С1-С2-субстратах» (номер державної реєстрації 0101U003059).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи полягала у визначенні шляхів
регуляції енергетичного і конструктивного метаболізму при вирощуванні
штамів Acinetobacter sp. В-7005 і В-7005 (1НГ) на С2-субстратах для
вдосконалення процесу біосинтезу екзополісахариду етаполану.

Для виконання роботи необхідно було вирішити такі завдання:

дослідити особливості метаболізму етанолу у продуцента етаполану;

виявити можливі сайти метаболічного лімітування С2-сполук і розробити
підходи до їхнього усунення;

на основі дослідження регуляції С2-метаболізму вдосконалити процес
одержання етаполану на етанолі;

визначити хімічний склад, молекулярну масу та дослідити реологічні
властивості розчинів етаполану, синтезованого за вдосконаленим способом.

Об’єкт дослідження – штами Acinetobacter sp. В-7005 і В-7005 (1НГ),
мікробний полісахарид етаполан.

Предмет дослідження – процес синтезу етаполану, регуляція
С2-метаболізму.

Методи дослідження – мікробіологічні, біохімічні, фізико-хімічні,
хімічні. Розроблено і застосовано метод одержання безклітинних
екстрактів у ЕПС-синтезувального штаму Acinetobacter sp. В-7005.

Наукова новизна роботи. На основі дослідження особливостей енергетичного
і конструктивного метаболізму у продуцента етаполану розроблені підходи
до регуляції С2-метаболізму і визначені шляхи управління процесом
біосинтезу ЕПС.

Вперше встановлено, що „вузьким” місцем метаболізму етанолу у
Acinetobacter sp. В-7005 є асиміляція ацетату, про що свідчило
інгібування іонами натрію як окиснення ацетату в інтактних клітинах, так
і активності ацетил-КоА-синтетази в безклітинному екстракті, а також
лімітування С2-метаболізму коензимом А.

Показано, що інгібіторами ацетил-КоА-синтетази є іони натрію та
інтермедіати окиснення етанолу й ацетальдегіду (НАДН і НАДФН), а
активаторами – катіони калію і магнію.

Встановлені умови культивування продуцента етаполану, що дають змогу
усунути лімітування С2-метаболізму і забезпечують однакову швидкість
окиснення етанолу, ацетальдегіду й ацетату, а також підвищення у три
рази активності ацетил-КоА-синтетази.

Вперше показано, що культивування продуцента етаполану в умовах усунення
метаболічного лімітування, пов’язаного з утворенням ацетил-КоА
(попередника жирних кислот), супроводжується синтезом переважно
ацильованого ЕПС з високою молекулярною масою (1,5 млн), яка не
знижується у процесі виділення й очистки препарату.

Практичне значення одержаних результатів. На основі досліджень регуляції
С2-метаболізму у Acinetobacter sp. В-7005 розроблено спосіб одержання
етаполану, що дає змогу реалізувати синтез ЕПС на незабуференому
середовищі і знизити в ньому загальний вміст солей у чотири рази (до
2,95 г/л). Етаполан, синтезований у таких умовах, характеризувався
покращеними реологічними властивостями, що визначають його практичну
цінність.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора.
Експериментальна робота виконана особисто здобувачем. Автором
проаналізовано наукову літературу з даної проблеми, узагальнено отримані
експериментальні дані, проведено порівняльний аналіз з існуючими
літературними даними. Автором самостійно визначено активність ферментів
метаболізму етанолу, циклу Кребса і біосинтетичних шляхів; виявлено сайт
метаболічного лімітування і підібрані умови, що дають змогу усунути
лімітування С2-метаболізму; визначено хімічний склад і реологічні
властивості отриманого в таких умовах етаполану. Планування основних
напрямків роботи, обговорення результатів та підготовка публікацій за
результатами досліджень проходило за участю наукового керівника д.б.н.
Т.П. Пирог.

Визначення молекулярно-масового розподілу ЕПС здійснювали спільно з
к.б.н. С.К. Воцелко (ІМВ НАН України).

Корж Ю.В. була відзначена стипендією НАН України (2004-2006); отримала
відзнаку учасника четвертого конкурсу науково-технічних проектів
„Інтелектуальний потенціал молодих вчених – місту Києву” за проект у
напрямі „Новітні біотехнології” (2004). Корж Ю.В. є лауреатом Премії
голови Голосіївської районної в м.Києві ради для обдарованої молоді у
номінації „За вагомі досягнення у науковій діяльності” (2004).

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені
на Міжнародній конференції «Микробиология и биотехнология на рубеже ХХІ
столетия» (Мінськ, 2000); науковій конференції-конкурсі молодих вчених
ІМВ НАН України (Київ, 2000, 2001, 2002, 2003); Конференції молодих
вчених Інституту біохімії ім. Паладіна (Київ, 2001); 24th Symp.
Biotechnology for Fuels and Chemicals (Carlington, USA, 2002).;
Міжнародній конференції «Микробиология и биотехнология ХХІ столетия»
(Мінськ, 2002); VIII Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002);
І і ІІ Міжнародних конгресах «Биотехнология – состояние и перспективы
развития» (Москва, 2002, 2003); Міжнародній науково-технічній
конференції «Розробка і виробництво продуктів функціонального
харчування, іноваційні технології та конструювання обладнання для
перероблення сільгоспсировини, культура харчування населення України»
(Київ, 2003); 69-й і 70-й наукових конференціях молодих вчених,
аспірантів та студентів Національного університету харчових технологій
(Київ, 2003, 2004); 7-й і 8-й Міжнародній Пущинській школі-конференції
молодих вчених «Биология – наука ХХІ века» (Пущино, 2003, 2004);
Міжнародній конференції «Современное состояние и перспективы развития
микробиологии и биотехнологии» (Мінськ, 2004); Х З?їзді Товариства
мікробіологів України (Одеса, 2004); ІІ Всеукраїнській
науково-практичній конференції «Біотехнологія. Освіта. Наука» (Львів,
2004).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 19 наукових праць, із них –
5 статті у фахових виданнях та 13 тез доповідей.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 152
сторінках машинописного тексту і складається із таких структурних
частин: „Вступ”, „Огляд літератури” (2 розділи), „Результати досліджень”
(5 розділів), „Обговорення”, „Висновки”, „Список використаних джерел”,
який містить 218 посилання (з них 146 іноземних авторів). Робота містить
30 таблиць та 10 рисунків.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Розділ 1. Етаполан – екзополісахарид мультифункціонального призначення.
Представлено характеристику мікробного ЕПС етаполану і штаму-
продуцента. Проведено аналіз розроблених раніше шляхів інтенсифікації
синтезу етаполану і технологій одержання цього ЕПС на різних вуглецевих
субстратах (у тому числі на суміші ростових С2-С6-субстратів), а також
розглянуто галузі практичного використання етаполану.

Розділ 2. Метаболізм С2-сполук у гетеротрофних мікроорганізмів. Наведено
основні шляхи катаболізму С2-сполук, анаплеротичні реакції та
особливості конструктивного метаболізму при рості гетеротрофів на
С2-субстратах, а також проаналізовано відомі підходи до регуляції
метаболізму у мікроорганізмів.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА

Розділ 3. Матеріали та методи досліджень

Характеристика використаних у роботі бактерій. Основним об’єктом
досліджень був штам Acinetobacter sp. В-7005 – продуцент комплексного
екзополісахаридного препарату етаполану (Гринберг и др., 1992), а також
мутантний штам Acinetobacter sp. В-7005 (1НГ), що не утворює ЕПС, який
був одержаний з вихідного за допомогою нітрозогуанідинового мутагенезу
(Пирог и др., 2000).

Культивування бактерій. Культивування бактерій здійснювали в колбах на
качалці (220 об/хв) при 30?С, рН 6,8-7,0 впродовж 16-120 год на рідких
мінеральних середовищах такого складу (г/л). Середовище 1: KH2PO4 — 6,8;
NaOH – 0,9; NaCl — 1,05; NH4NO3 – 0,6; MgSO4 ? 7H2O – 0,4; CaCl2 ? 2H2O
– 0,1; FeSO4 ?7H2O – 0,01. Середовище 2: KH2PO4 — 6,8; КOH — 1,8; КCl —
1,4; NH4NO3 – 0,6; MgSO4 ? 7H2O – 0,4; CaCl2 ? 2H2O – 0,1; FeSO4 ?7H2O –
0,01. Середовище 3: KH2PO4 – 3,4; КOH – 0,9; NH4NO3 – 0,3; MgSO4 ? 7H2O
– 0,4; CaCl2 ? 2H2O – 0,1; FeSO4 ?7H2O – 0,01. Середовище 4: KH2PO4 –
3,4; КOH – 0,9; КCl — 4,4; NH4NO3 – 0,6; MgSO4 ? 7H2O – 0,4; CaCl2 ?
2H2O – 0,1; FeSO4 ?7H2O – 0,01. Середовище 5: KH2PO4 – 1,7; КOH – 0,45;
NH4NO3 – 0,3; MgSO4 ? 7H2O – 0,4; CaCl2 ? 2H2O – 0,1; FeSO4 ?7H2O –
0,01. Середовище 6: KH2PO4 – 2,0; КOH – 0,55; КCl – 5,6; NH4NO3 – 0,6;
MgSO4 ? 7H2O – 0,4; CaCl2 ? 2H2O – 0,1; FeSO4 ?7H2O – 0,01. Середовища
різнилися між собою молярністю фосфатного буферу, загальною кількістю
солей, наявністю Nа+, концентрацією одновалентних катіонів. Так,
молярність буферу становила (М): середовища 1 і 2 – 0,05; 3 і 4 – 0,025;
5 і 6 – 0,0125. У середовища додатково вносили 0,5 % (за об’ємом)
дріжджового автолізату та 0-0,0012 % пантотенату кальцію (вітамін В5).
Штами В-7005 і В-7005 (1НГ) є ауксотрофами за цим вітаміном.

Як посівний матеріал використовували добову культуру, вирощену на МПА
або змішаному агаризованому середовищі (МПА та сусло-агар у
співвідношенні 1:1), а також культуру з експоненційної фази росту (16-24
год), вирощену на мінеральних середовищах 1ч6 з різними джерелами
вуглецю. Джерелом вуглецю та енергії при одержанні посівного матеріалу і
біосинтезі ЕПС були: а) 0,5 % етанолу (за об’ємом); б) 1 % етанолу (за
об’ємом) за наявності або відсутності ацетату калію (0,1 % або 0,01 %);
в) 1 % етанолу (за об’ємом) у присутності фумарату калію (0,2 %); г) 1,6
% ацетату калію. Кількість посівного матеріалу становила 5 % від об’єму
середовища.

При дослідженні впливу екзогенного ацетату калію на ріст Acinetobacter
sp. В-7005 (1НГ) культивування бактерій здійснювали на середовищі 2 з 1
% етанолу до середини експоненційної фази росту (16-18 год), після чого
вносили ацетат калію (0-48 мМ).

Концентрацію біомаси визначали за оптичною густиною клітинної суспензії
з наступним перерахунком на абсолютно суху біомасу у відповідності з
калібрувальним графіком. Кількість синтезованих полісахаридів
встановлювали ваговим методом (Williams, Wimpenny, 1978) та за
концентрацією вуглеводів, що визначались колориметричним методом за
реакцією з фенолом і сірчаною кислотою (Dubois et al. 1956).
ЕПС-синтезувальну здатність визначали як відношення кількості
синтезованих ЕПС до біомаси та виражали в г ЕПС/г біомаси.

Вміст ацетату в культуральній рідині визначали ензиматично за допомогою
ацетаткінази (Криштаб, Соколов, 1985). Наявність ацетальдегіду
встановлювали за реакцією з нітропрусидом натрію та піперідином (Файгль,
1962). Концентрацію етанолу визначали методом газорідинної
хроматографії.

Константу Міхаеліса (Км) визначали графічно методом подвійних обернених
величин Лайнуівера-Берка (Диксон, Уэбб, 1980).

Аналіз активності ферментів С2-метаболізму. Визначення активності
ферментів здійснювали в безклітинних екстрактах: клітини Acinetobacter
sp. В-7005 (1НГ) руйнували ультразвуком (УЗ), одержаний дезінтеграт
центрифугували, супернатант використовували як безклітинний екстракт.
Для одержання безклітинних екстрактів бактерії вирощували до середини
експоненційної фази росту. У разі одержання безклітинних екстрактів
Acinetobacter sp. В-7005 культуральну рідину, що містить бактеріальні
клітини та ЕПС, попередньо обробляли УЗ (для розщеплення
високомолекулярних ЕПС на низькомолекулярні фрагменти), центрифугували,
осад клітин тричі відмивали від залишків середовища та ЕПС і здійснювали
ті ж самі операції, як і для штаму В-7005 (1НГ).

Активність алкогольдегідрогенази (КФ 1.1.1.1) та
ацетальдегіддегідрогенази (КФ 1.2.1.3 і КФ 1.2.1.4), аконітатгідратази
(КФ 4.2.1.3), ізоцитратдегідрогенази (КФ 1.1.1.41), малатдегідрогенази
(КФ 1.1.1.37), ізоцитратдегідрогенази (КФ 1.1.1.42), малатдегідрогенази
(КФ 1.1.1.82), 2-оксоглутаратдегідрогенази (КФ 1.2.4.2),
оксалоацетатдекарбоксилази (КФ 4.1.1.3), глутаматдегідрогенази (КФ
1.4.1.4), глутаматдегідрогенази (КФ 1.4.1.2), малатдегідрогенази
(декарбоксилювальної) (КФ 1.1.1.38 та КФ 1.1.1.40),
фосфоенолпіруваткарбоксикінази (КФ 4.1.1.49) визначали за реакцією
окиснення/відновлення НАД(Ф)Н/НАД(Ф)+, відповідно, при 340 нм.
Активність алкогольдегідрогенази (КФ 1.1.99.8), сукцинатдегідрогенази
(КФ 1.3.99.1) встановлювали за відновленням дихлорфеноліндофенолу в
присутності феназинметасульфату при 600 нм. Активність
ацетальдегіддегідрогенази ацилювальної (КФ 1.2.1.10),
ацетил-КоА-синтетази (КФ 6.2.1.1) та ацетаткінази аналізували за
утворенням ацетил-КоА та ацетилфосфату, що утворюють з гідроксиламіном
ацетилгідроксамат. Продукт реакції ацетилгідроксамату з хлорним залізом
визначали спектрофотометрично при 540 нм. Активність ізоцитратліази (КФ
4.1.3.1) встановлювали за швидкістю утворення, а малатсинтази (КФ
4.1.3.2) – за швидкістю поглинання фенілгідразону гліоксилату при 324
нм. Активність цитратсинтази (КФ 4.1.3.7) визначали за зниженням
концентрації ацетилфосфату в присутності коензиму А та оксалоацетату.
Активність фумарази (КФ 4.2.1.2) аналізували за утворенням фумарату при
250 нм. Активність піруваткарбоксилази (КФ 6.4.1.1) визначали за
швидкістю утворення оксалоацетату і окисненням НАДН при 340 нм у
спряженій реакції з малатдегідрогеназою. Активність
фосфоенолпіруватсинтетази (КФ 2.7.9.2) встановлювали за зниженням
концентрації пірувату в реакційній суміші (реакція з
2,4-динітрофенілгідразином) при 445 нм.

Визначення швидкості окиснення субстратів інтактними клітинами.
Швидкість окиснення субстратів інтактними клітинами Acinetobacter sp.
В-7005 (1НГ) встановлювали за швидкістю поглинання кисню у реакційній
суміші полярографічним методом за допомогою електроду закритого типу на
полярографі ППТ-1.

Встановлення складу і фізико-хімічних властивостей етаполану.
Комплексний полісахаридний препарат етаполан виділяли з культуральної
рідини осадженням ізопропанолом після попереднього відокремлення клітин
продуцента і діалізу. Розділення етаполану на ацильований і
неацильований компоненти здійснювали за допомогою розробленого раніше
методу (Пирог и др., 1994). Для дезацилювання здійснювали обробку ЕПС
NаОН у присутності NаВН4. Вміст вуглеводів в ЕПС визначали
колориметричним методом за реакцією з фенолом і сірчаною кислотою
(Dubois et al., 1956), піровиноградної кислоти — за реакцією з
2,4-динітрофенілгідразином (Sloneker, Orentas, 1962), уронових кислот –
за реакцією з карбазолом (Dische, 1947), жирних кислот — ваговим методом
після дезацилювання розчинів ЕПС (Пирог и др., 1994). Для визначення
вмісту мінеральних компонентів у складі етаполану здійснювали його
обробку катіонітом КУ-2-8 (Н+). Вміст нейтральних моносахаридів
визначали за допомогою вуглеводного аналізатора “Biotronik LC-2000”.
Молекулярно-масовий склад ЕПС визначали за допомогою методу аналітичного
градієнтного центрифугування в розчині хлористого натрію (Votselko et
al., 1993). Властивості розчинів етаполану оцінювали за зміною їх
в’язкості в присутності 0,1 М КCl, за рН 4-4,5 (за умови переведення ЕПС
в Н+-форму), у системі Cu2+-гліцин. В’язкість розчинів етаполану
вимірювали на скляному капілярному віскозиметрі Оствальда при 20 ?С.

Для аналізу результатів використовували методи варіаційної статистики
(Лакин, 1990).

Розділ 4. Особливості С2-метаболізму штаму Acinetobacter sp.
В-7005 (1 НГ)

У процесі дослідження основних шляхів метаболізму етанолу у
Acinetobacter sp. В-7005 (1НГ) було виявлено, що окиснення цього
субстрату до ацетальдегіду каталізується НАД+-залежною
алкогольдегідрогеназою (табл. 1). Акцепторами електронів в
ацетальдегіддегідрогеназній реакції є НАД+ і НАДФ+. Відомо, що
асиміляція ацетату у бактерій може відбуватися двома шляхами: за участю
ацетаткінази і фосфотрансацетилази або за допомогою
ацетил-КоА-синтетази. Показано, що у Acinetobacter sp. В-7005 (1НГ)
ацетат залучається до метаболізму за участю ацетил-КоА-синтетази (табл.
1).

Таблиця 1

Активність ключових ферментів метаболізму етанолу в процесі
культивування Acinetobacter sp. В-7005 (1НГ)

Ферменти Активність (нмоль / хв мг білка)

при культивуванні бактерій упродовж (год):

24

48

НАД+-залежна алкогольдегідрогеназа 365,7±19,6 289,5±17,5

НАД+-залежна ацетальдегіддегідрогеназа 119,5±7,6 93,7±6,5

НАДФ+-залежна ацетальдегіддегідрогеназа 253,7±15,7 197,3±11,3

Ацетальдегіддегідрогеназа ацилювальна 14,7±8,7 10,9±0,6

Ацетаткіназа 9,8±0,5 7,1±0,5

Ацетил-КоА-синтетаза 135,7±8,7

(74,5±5,2) 134,1±8,7

Ізоцитратліаза 130,0±7,8

(50,5±2,9) 144,9±9,4 (7,4±0,4)

Малатсинтаза 58,2±3,7 67,4±3,7

Примітки: 1. Культивування бактерій здійснювали на середовищі 1 з
0,0006 % В5.

2. При визначенні активності ацетаткінази, ацетил-КоА-синтетази,
ізоцитратліази і малатсинтази бактерії вирощували на середовищі 2 з
0,0009 % В5. У дужках наведено дані культивування штаму на середовищі 1
з 0,0006 % В5.

У даних бактерій виявлена також ацетаткіназна активність, проте вона
була невисокою і, на нашу думку, не могла мати суттєвого значення для
метаболізму ацетату у Acinetobacter sp. В-7005 (1 НГ). Слід зазначити,
що ацетил-КоА може утворюватися не тільки з ацетату в
ацетил-КоА-синтетазній реакції, але й безпосередньо з ацетальдегіду за
участю ацетальдегіддегідрогенази ацилювальної. Виявлена в безклітинному
екстракті Acinetobacter sp. В-7005 (1НГ) активність
ацетальдегіддегідрогенази ацилювальної була невисокою (табл. 1) і, так
само, як і ацетаткіназа не могла мати суттєвого значення для метаболізму
етанолу. Під час росту бактерій на С2-сполуках анаплеротичною
послідовністю реакцій, що поповнюють пул С4-дикарбонових кислот, є
гліоксилатний цикл. У безклітинному екстракті Acinetobacter sp. В-7005
(1НГ) виявлено обидва ключові ферменти цього циклу – ізоцитратліаза і
малатсинтаза (табл. 1).

Встановлено, що швидкість дихання в присутності ацетату інтактних клітин
Acinetobacter sp. В-7005 (1НГ) і активність ацетил-КоА-синтетази у
безклітинному екстракті знижувалася у 1,3-2 рази у присутності Nа+, що
свідчить про лімітування метаболізму катіонами натрію. Показано, що
швидкість окиснення ацетату клітинами бактерій збільшувалась за
наявності пантотенату кальцію, що може бути пов’язано з лімітуванням
С2-метаболізму коензимом А.

Розділ 5. Центральний метаболізм штамів Acinetobacter sp. В-7005 та
В-7005 (1НГ), вирощених на етанолі

У процесі культивування мікроорганізмів на вуглеводних субстратах цикл
трикарбонових кислот (ЦТК) є основним джерелом НАДН, подальше окиснення
якого генерує АТФ в аеробних гетеротрофів. Крім того, ЦТК служить
джерелом ряду інтермедіатів, необхідних у конструктивному метаболізмі.
Під час росту Acinetobacter sp. В-7005 на етанолі перші реакції
окиснення цього субстрату каталізуються НАД+-залежними дегідрогеназами,
тобто є енергопостачальними, а поповнення пулу С4-дикарбонових кислот
забезпечується за рахунок реакцій гліоксилатного циклу. Окиснення малату
до оксалоацетату здійснюється НАД+ і НАДФ+-залежними ферментами. Таким
чином, функціонування повного (нерозімкненого на рівні
2-оксоглутаратдегідрогенази) ЦТК у цих бактерій не є обов’язковим. Проте
в безклітинному екстракті Acinetobacter sp. В-7005 і В-7005 (1НГ)
виявлена достатньо висока активність всіх ферментів цього циклу (табл.
2). На нашу думку, наявність обох ключових ферментів гліоксилатного
циклу, а також висока активність ізоцитратдегідрогенази,
глутаматдегідрогенази і низька активність 2-оксоглутаратдегідрогенази є
підтвердженням того, що ЦТК у Acinetobacter sp. В-7005 і В-7005 (1НГ)
при рості на етанолі виконує переважно біосинтетичну роль.

У процесі асиміляції мікроорганізмами двох- або трьохвуглецевих
субстратів або субстратів, катаболізм яких проходить через ацетил-КоА чи
інтермедіати ЦТК,

Таблиця 2

Активність ферментів циклу трикарбонових кислот та деяких біосинтетичних
шляхів у Acinetobacter sp. В-7005 та В-7005 (1НГ)

Фермент Активність, нмоль/хв мг білка

В-7005

В-7005 (1НГ)

Цитратсинтаза 405,6±21,6 421,3±25,1

Аконітаза 349,0±19,4 340,8±18,0

НАД+-залежна ізоцитратдегідрогеназа 0 0

НАДФ+-залежна ізоцитратдегідрогеназа 717,8±33,8 729,7±38,5

2-Оксоглутаратдегідрогеназа 93,4±5,3 96,2±4,8

Сукцинатдегідрогеназа 197,5±15,8 183,4±13,9

Фумараза 186,8±9,9 192,1±9,6

НАД+-залежна малатдегідрогеназа 643,1±32,1 654,2±32,7

НАДФ+-залежна малатдегідрогеназа 79,8±4,3 81,9±5,1

НАД+-залежна глутаматдегідрогеназа 653,9±33,5 642,6±31,8

НАДФ+-залежна глутаматдегідрогеназа 247,3±15,6 257,2±16,3

НАД+-залежна малатдегідрогеназа (декарбоксилювальна) 13,2±0,6 17,9±0,9

НАДФ+-залежна малатдегідрогеназа (декарбоксилювальна) 0 0

Оксалоацетатдекарбоксилаза 457,3±28,6 446,6±23,3

Піруваткарбоксилаза 173,4±7,8 160,6±12,1

Фосфоенолпіруваткарбоксикіназа 58,5±2,9 48,7±3,5

Фосфоенолпіруватсинтетаза 584,4±32,9 487,0±35,4

виникає необхідність синтезу молекул вуглеводів. Ці перетворення
здійснюються шляхом глюконеогенезу. Ензиматичні дослідження показали, що
під час росту на етанолі у Acinetobacter sp. В-7005 і В-7005 (1НГ) в
утворенні фосфоенолпірувату (ФЕП) беруть участь обидва ключові ферменти
глюконеогенезу – ФЕП-карбоксикіназа і ФЕП-синтетаза (табл. 2).

Піруват є попередником синтезу амінокислот піруватної родини, а також
входить до складу етаполану (Гринберг и др., 1992). Експерименти
показали, що при культивуванні Acinetobacter sp. В-7005 і В-7005 (1НГ)
на С2-субстратах утворення пірувату здійснюється з оксалоацетату в
оксалоацетатдекарбоксилазній реакції (табл. 2). Слід зазначити, що у
процесі культивування бактерій на етанолі була виявлена достатньо висока
активність піруваткарбоксилази – фермента, що каталізує анаплеротичну
реакцію утворення С4-дикарбонових кислот під час росту на вуглеводних
субстратах. Цілком ймовірно, що у Acinetobacter sp. В-7005 і В-7005
(1НГ) при вирощуванні на етанолі піруваткарбоксилаза також може брати
участь в утворенні пірувату (разом з оксалоацетатдекарбоксилазою).

Розділ 6. Регуляція метаболізму ацетату у штамів Acinetobacter sp.
В-7005 та В-7005 (1НГ)

Аналіз активності ключових ферментів метаболізму етанолу під час
культивування Acinetobacter sp. В-7005 (1НГ) на середовищах 1 і 2
показав, що активність ацетил-КоА-синтетази в безклітинному екстракті
була в 2,7-5 разів нижчою, ніж активність алкоголь- і
ацетальдегіддегідрогеназ (табл. 1). У процесі дослідження швидкості
окиснення С2-субстратів інтактними клітинами Acinetobacter sp. В-7005
(1НГ), вирощеними на середовищах 1 та 2, було встановлено, що після
голодування клітин упродовж 20 год швидкість дихання у присутності
етанолу й ацетальдегіду не змінювалася і становила 152,6-157,8 та
153,5-159,4 нмоль О2/хв мг клітин відповідно, а за присутності ацетату
знижувалася в 2 і 4 рази на середовищі 2 і середовищі 1 відповідно.

Отже, під час росту на етанолі в клітинах Acinetobacter sp. В-7005 і
В-7005 (1НГ) ацетат утворюється з вищою швидкістю, ніж залучається до
метаболізму. Тому наші наступні дослідження були направлені на пошук
факторів, що забезпечують однакову швидкість утворення і подальшого
метаболізму ацетату в клітинах бактерій у процесі культивування на
етанолі.

Відомо, що активаторами ацетил-КоА-синтетази, яка функціонує в клітинах
багатьох еу- і прокаріот є катіони калію і магнію (Roughan, Ohlrogge,
1994; Preston at al., 1990; Glasemacher at al., 1997). Наші дослідження
показали, що швидкість окиснення ацетату інтактними клітинами
Acinetobacter sp. В-7005 (1 НГ), а також активність ацетил-КоА-синтетази
в безклітинному екстракті підвищувалася за присутності 100 мМ K+ і 5-10
мМ Mg2+ (табл. 3).

V z e

h)LS

EHuy

I???TH?a?< X (!1/4!O!u!oeioeiaioeiUioei?i?i?oeiEAEi?i?i?iUiEi?iEioeiUiUi Uiai3/4iEAE·E·Ei?i?iUiUiUi?iE·E ?$?Z?hAjA1/4A3/4A&A(A–A?AueAthArAtAoioioioeoaUaUaUaoNoNoEoEoNoNoioEoA»A» A»AoNoNoioEoioioNoNoNoA»Aoioioioioioi EHuy EH O EH O $ O O O $ O O ??th???афічних досліджень ми припустили, що одним із можливих шляхів регуляції метаболізму ацетату в клітинах штамів В-7005 і В-7005 (1НГ) під час росту на етанолі може бути вилучення Nа+ з середовища культивування і підвищення в ньому концентрації К+ і Мg2+. Слід зазначити, що швидкість дихання за присутності ацетату клітин, вирощених на цьому субстраті, не знижувалася у процесі голодування на відміну від клітин, вирощених на етанолі. Отже, цілком ймовірно, що інтермедіати окиснення етанолу й ацетальдегіду (НАДН і НАДФН) інгібували активність ацетил-КоА-синтетази. Встановлено, що в присутності НАДН і НАДФН активність цього ферменту знижувалася майже у 2 рази. Для усунення інгібувальної дії інтермедіатів окиснення етанолу й ацетальдегіду на активність ацетил-КоА-синтетази було знижено початкову концентрацію етанолу в середовищі з подальшою його дробною подачею в процесі культивування бактерій. Показано, що при зниженні у два рази концентрації етанолу (до 0,5 %) спостерігали підвищення швидкості дихання Таблиця 3 Вплив катіонів на швидкість дихання Acinetobacter sp. В-7005 (1 НГ) і активність ацетил-КоА-синтетази Катіони Концентра-ція катіонів, мМ Швидкість дихання інтактних клітин (нмоль О2/хв мг клітин) у присутності етанолу ацетату калію сукцинату калію Активність ацетил-КоА-синтетази в безклітинному екстракті, нмоль/хв мг білка контроль 0 78,5±4,9 40,6±2,0 63,5±3,9 43,9±2,2 К+ 10 76,9±4,6 42,4±2,7 62,4±3,7 90,0±5,4 25 78,3±3,9 45,8±2,3 64,0±4,5 93,2±5,2 50 77,5±5,2 52,2±3,0 65,3±4,5 98,5±5,9 75 79,4±4,0 59,7±3,1 64,8±3,2 103,7±5,6 100 80,5±5,6 66,8±3,3 65,9±3,3 118,9±6,4 Mg2+ 2 77,9±4,5 49,2±2,5 60,3±4,5 62,3±4,4 5 78,3±5,5 56,9±3,8 58,7±3,35 80,4±4,0 7 79,5±3,9 60,2±3,0 52,4±2,62 87,2±5,7 10 76,4±3,9 67,3±3,5 39,2±1,2 90,5±5,2 Примітки: 1. Бактерії вирощували на середовищі 2 з 1 % етанолу і 0,0009% пантотенату кальцію. 2. Визначення швидкості дихання клітин і активності ацетил-КоА-синтетази проводили в 0,05 М трис-НСl буфері. клітин за присутності ацетату, причому її величина практично не відрізнялася від швидкості окиснення етанолу й ацетальдегіду. Крім того, швидкість окиснення ацетату істотно не змінювалася у процесі тривалого голодування клітин. Слід зазначити, що за початкової концентрації етанолу 0,5 % у середовищі вміст пантотенату кальцію можна було знизити до 0,0006 %, при цьому не було необхідності у підвищенні концентрації Mg2+. У табл. 4 наведено активність ключових ферментів метаболізму етанолу у штаму Acinetobacter sp. В-7005 (1НГ), вирощеного за різних умов культивування. Встановлено, що при зниженні початкової концентрації етанолу у середовищі, відсутності сполук натрію і наявності 100 мМ К+ активність ацетил-КоА-синтетази підвищувалася у три рази. За таких умов стала можливою реалізація процесу біосинтезу етаполану на незабуферених середовищах 4 і 6 (0,025-0,125 М). Отримання аналогічного результату за початкової концентрації етанолу 1,0 % забезпечувало підвищення вмісту вітаміну В5 в середовищі до 0,0009-0,0012 % і концентрації Mg2+ до 5 мМ (за умови відсутності солей натрію і наявності 100 мМ К+). Таблиця 4 Вплив умов культивування Acinetobacter sp. В-7005 (1 НГ) на активність ключових ферментів метаболізму етанолу Умови культивування Активність, нмоль/хв мг білка концентрація В5, % концентрація Мg2+, мМ початкова концентрація етанолу, % НАД+-залежна алкогольдегідро-геназа НАД++НАДФ+-залежна альдегід-дегідрогеназа ацетил-КоА-синтетаза ізоцитратліаза 0,0006 1,6 1,0 354,8±17,7 367,3±21,2 95,0±5,6 98,4±6,3 0,0009 1,6 1,0 349,9±22,9 356,7±24,4 130,9±7,6 130,0±7,9 0,0009 5,0 1,0 359,6±17,9 349,7±24,0 180,9±9,6 185,4±11,8 0,0012 1,6 1,0 353,9±23,7 368,4±18,4 177,9±12,1 183,4±9,2 0,0009 1,6 0,5 265,9±16,1 277,9±15,4 219,8±11,0 225,4±13,8 0,0006 1,6 0,5 279,4±13,9 285,7±19,0 225,3±15,2 230,7±15,5 Примітка: Культивування бактерій здійснювали на середовищі 2 (в середовищі відсутні сполуки Nа+, вміст К+ - 100 мМ). Таким чином, у результаті досліджень регуляції активності ацетил-КоА-синтетази нам вдалося істотно знизити молярність буферу, проте не вміст солей у середовищі культивування, тобто тільки частково усунути лімітування С2-метаболізму у продуцента етаполану. Відомо, що ацетил-КоА-синтетаза є індуцибельним ферментом, індуктором якого є ацетат (Kumari at al., 1995). У зв’язку з цим ми припустили, що можна повністю зняти лімітування С2-метаболізму шляхом внесення екзогенного ацетату у середовище з етанолом або при використанні посівного матеріалу, вирощеного на ацетаті чи етанолі в присутності ацетату. Встановлено, що добавлення екзогенного ацетату при одержанні інокуляту і біосинтезі ЕПС дало змогу збільшити у 2,5-3 рази активність ацетил-КоА-синтетази та швидкість дихання у присутності ацетату і реалізувати процес синтезу етаполану на незабуферених середовищах 3 і 5, в яких загальний вміст солей був знижений у 2 і 4 рази (до 5,1 - 2,95 г/л). Відомо, що умови культивування продуцента впливають не тільки на синтез ЕПС, але й на фізико-хімічні властивості кінцевого продукту (Becker at al., 2002). У різних умовах культивування може змінюватися хімічний склад ЕПС, їхня молекулярна маса, співвідношення декількох полісахаридів, що впливає на реологічні властивості ЕПС, які визначають практичну значущість цих полімерів. Раніше було показано, що необхідною умовою для синтезу ацильованого полісахариду є наявність у середовищі культивування продуцента етаполану 100 мМ К+ (Пирог, 1999). Встановлено, що тільки етаполан з високим вмістом ацильованого компоненту (>50%)
характеризувався сукупністю реологічних властивостей, необхідних для
практичного використання. Оскільки вміст К+ у середовищах 3 і 5
становить 40 та 20 мМ відповідно, на наступному етапі досліджували
реологічні властивості синтезованого за таких умов етаполану. Згідно з
попередніми дослідженнями, такої концентрації К+ недостатньо для синтезу
ацильованого ЕПС з необхідними реологічними властивостями.

Результати, представлені в табл. 5, показали, що ЕПС, синтезовані на
середовищах з різним вмістом К+, характеризувалися практично
однаковими

Таблиця 5

Реологічні властивості 0,03 %-них розчинів етаполану, синтезованого за
різних умов культивування

Середовище Концентрація К+ у середовищі, мМ Відносне збільшення
в’язкості, %

у присутності 0,1 М KCl

у системі Cu2+-гліцин

2 100 325,7±21,0 1400,3±78,0

3 40 480,3±35,2 1865,0±93,2

5 20 315,6±18,8 1700,5±100,5

Примітка: Концентрація етанолу 1 %, у середовища 3 і 5 додатково вносили
0,1 %ацетату калію при одержанні інокуляту і біосинтезі ЕПС.

реологічними характеристиками. Отже, культивування продуцента на
незабуференому середовищі з низьким вмістом солей (і катіонів калію) не
впливало на властивості синтезованого етаполану. Щоб з’ясувати причини,
що зумовлюють це явище, ми детальніше дослідили хімічний склад одержаних
полісахаридів.

Розділ 7. Вплив умов культивування на фізико-хімічні властивості
етаполану

Встановлено, що незалежно від умов культивування продуцента (вміст
мінеральних компонентів, співвідношення С/N та молярність буферу в
середовищі культивування), нативні ЕПС характеризувалися практично
однаковим вмістом вуглеводів (44,5-46,7 %) і піровиноградної кислоти
(3,2-3,7 %) (табл. 6). Проте, полісахариди різнилися за кількістю
уронових (7,5-13,8 %), жирних (5,9-8,8 %) кислот, мінеральних
компонентів (6,2-28,6 %), а також за вмістом ацильованого компоненту
(70-100 %). Після дезацилювання нативних ЕПС вміст уронових кислот
збільшувався у 2-3 рази та становив 20-22 % для всіх досліджуваних
полісахаридів.

Таблиця 6

Хімічний склад нативного і дезацильованого етаполану, синтезованого

на середовищах різного складу

Компонентний склад ЕПС ЕПС Вміст складових компонентів (%) в ЕПС,
синтезованих на середовищах

1

2

3

5

Вуглеводи нативний

44,5

45,0

46,7

45,9

після дезацилювання

60,0

59,1

58,6

55,7

Піровиноградна кислота нативний

3,3

3,7

3,4

3,2

після дезацилювання

4,8

4,4

4,7

4,8

Уронові кислоти нативний

7,5

7,7

11,4

13,8

після дезацилювання

20,0

22,0

20,6

Жирні кислоти нативний

6,5

6,8

8,8

5,9

після дезацилювання

0

0

0

0

Мінеральні компоненти нативний

24,3

28,6

7,2

6,2

після дезацилювання

3,5

3,9

Примітки: 1. Концентрація етанолу 1 %, у середовище 5 додатково
вносили 0,1% ацетату калію при одержанні інокуляту і біосинтезі ЕПС.

„ – ” – не визначали.

Дезацильований ЕПС одержано в результаті лужної обробки нативного
препарату.

Результати достовірні при р<0,05. Співвідношення глюкози, манози, галактози та рамнози у складі всіх ЕПС було однаковим і становило 3:2:1:1. Дослідження молекулярної маси етаполану, синтезованого за різних умов культивування, показало, що середня молекулярна маса полісахаридів, одержаних на середовищах 3 та 5, практично не змінювалася в процесі виділення й очистки і становила 1,5 млн (табл. 7). Це можна пояснити тим, що отримані полісахариди є високоацильованими, а в результаті ацилювання вуглеводного ланцюга формується міцна структура ЕПС, яка залишається без змін у процесі обробки розчинів етаполану органічними розчинниками. Таблиця 7 Молекулярна маса етаполану, синтезованого за різних умов культивування Середовище Випарений концентрат ЕПС ЕПС після осадження і висушування середня молекулярна маса, млн фракції з молекулярною масою до 2 млн, % середня молекулярна маса, млн фракції з молекулярною масою до 2 млн, % 1 1,44 31,7±2,19 0,48 82,7±4,89 2 1,44 29,9±1,92 0,50 71,2±3,56 3 1,61 23,7±1,59 1,54 25,7±1,80 5 1,57 25,4±1,27 1,48 27,8±1,39 Примітка: Концентрація етанолу 1 %, у середовище 5 додатково вносили 0,1% ацетату калію при одержанні інокуляту і біосинтезі ЕПС. Дослідження реологічних властивостей ЕПС показало, що розчини етаполану, синтезованого на середовищі 5 з 20 мМ К+, на всіх етапах його виділення й очистки характеризувалися вищою в’язкістю в присутності 0,1 М КСl і в системі Cu2+-гліцин (1200 та 1500-2000 % відповідно) у порівнянні з ЕПС, синтезованими на середовищі з 100 мМ К+ (1000 та 800-1000 % відповідно). Таким чином, на основі досліджень особливостей енергетичного й конструктивного метаболізму у штаму Acinetobacter sp. В-7005 і В-7005 (1НГ) визначені шляхи регуляції С2-метаболізму, що дало змогу розробити новий спосіб одержання етаполану на незабуференому середовищі мінімального складу. Етаполан, синтезований у таких умовах, характеризувався необхідними для практичного використання реологічними властивостями. ВИСНОВКИ Визначено особливості енергетичного й конструктивного метаболізму С2-субстратів у Acinetobacter sp. В-7005 і В-7005 (1НГ), виявлені сайти метаболічного лімітування і розроблені підходи до їхнього усунення. Встановлено, що окиснення етанолу й ацетальдегіду здійснюється НАД+ і НАДФ+-залежними дегідрогеназами, ацетат залучається до метаболізму за участю ацетил-КоА-синтетази. Анаплеротичною послідовністю реакцій, що поповнює пул С4-дикарбонових кислот в клітинах Acinetobacter sp. В-7005 і В-7005 (1НГ), є гліоксилатний цикл, а цикл трикарбонових кислот виконує переважно біосинтетичну роль. Синтез фосфоенолпірувату забезпечується двома ключовими ферментами глюконеогенезу – ФЕП-карбоксикіназою і ФЕП-синтетазою. Вперше показано, що „вузьким” місцем метаболізму етанолу у Acinetobacter sp. В-7005 і В-7005 (1НГ) є асиміляція ацетату (реакція, що каталізується ацетил-КоА-синтетазою, є швидкість-лімітувальною). Встановлено, що інгібіторами ацетил-КоА-синтетази є катіони натрію та інтермедіати окиснення етанолу й ацетальдегіду (НАДН і НАДФН), а активаторами – катіони калію і магнію. Показана можливість підвищення активності ацетил-КоА-синтетази при внесенні в середовище з етанолом екзогенного ацетату. На основі дослідження регуляції С2-метаболізму розроблено спосіб одержання етаполану, ключовими елементами якого є: відсутність у середовищі культивування катіонів натрію, підвищення у ньому концентрації пантотенату кальцію до 0,0009 %, а також наявність 0,1 % ацетату калію при одержанні інокуляту і біосинтезі полісахариду. Це дало змогу здійснити без зниження показників синтезу процес одержання етаполану на незабуференому середовищі, в якому вміст солей знижено у 4 рази (з 11 до 2,95 г/л). Вперше показано, що за умов усунення лімітування С2-метаболізму, молекулярна маса етаполану становила 1,5 млн і не знижувалася у процесі його виділення й очистки, а вміст жирних кислот в ацильованому полісахариді досягав 15 %. Підвищений вміст жирних кислот у складі етаполану і висока молекулярна маса зумовлюють покращення реологічних властивостей, що визначають практичну цінність цього полісахариду. СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ 1. Пирог Т.П., Соколов И.Г., Кузьминская Ю.В.*, Малашенко Ю.Р. Некоторые особенности метаболизма этанола у мутантного штамма Acinetobacter sp., не образующего экзополисахариды // Микробиология. 2002, 71, № 2. С 222-229. (Здобувачем особисто досліджено активність ключових ферментів метаболізму етанолу і підібрані умови для визначення активності ацетил-КоА-синтетази). 2. Пирог Т.П., Кузьминская Ю.В.* Регуляция метаболизма ацетата у штамма Acinetobacter sp., растущего на этаноле // Прикладная биохимия и микробиология. – 2003. – 39, № 2. – С. 180-188. (Здобувачем виявлено “вузьке місце” метаболізму ацетату: реакція, що каталізується ацетил-КоА-синтетазою є швидкість-лімітувальною; виявлені інгібітори й активатори цього ферменту). 3. Пирог Т.П., Кузьминская Ю.В.* Особенности центрального метаболизма штамма Acinetobacter sp, растущего на этаноле // Микробиология. – 2003. – 72, № 4. – С. 459-465. (Здобувачем особисто визначено активність ферментів циклу Кребса та ключових ферментів гліоксилатного циклу і глюконеогенезу, а також досліджено швидкість дихання інтактних клітин Acinetobacter sp. у присутності органічних кислот циклу Кребса). 4. Пирог Т.П., Кузьмінська Ю.В.* Вплив умов культивування мікроорганізмів-продуцентів екзополісахаридів на їхній синтез та фізико-хімічні властивості // Біополімери і клітина. – 2003. - 19, № 5. - С. 393-413. (Здобувач особисто підбирала й аналізувала літературні дані і брала участь в експериментальних дослідженнях і готувала матеріали статті до друку). 5. Кузьмінська Ю.В.*, Пирог Т.П. Регуляція метаболізму С2-сполук у штаму В-7005 – продуцента екзополісахариду етаполану // Наукові праці національного університету харчових технологій. – 2004. – №15. – С.31-32. (Здобувачем особисто проведені дослідження основних етапів метаболізму етанолу у штаму В-7005; встановлено умови культивування, що дають змогу підвищити активність і синтез ацетил-КоА-синтетази). 6. Pirog T.P., Kuzminska*Yu.V. Some metabolic characteristic of Acinetobacter sp. used to produce etapolan exopolysaccharide on C2-substrates // In: Biotechnology and Industry (Ed. G.E. Zaykov). – New York: Nova Science Publishers.Inc, 2004. – P.11-18. (Здобувачем особисто досліджено вплив С4-дикарбонових кислот на активність ферментів гліоксилатного циклу і глюконеогенезу). 7. Пирог Т.П., Кузьминская Ю.В.* Некоторые особенности метаболизма этанола у мутантного штамма Acinetobacter sp. – продуцента экзополисахарида этаполана // Междун. конф. “Микробиология и биотехнология рубеже ХХI столетия” (Минск, 1-2 июня 2000), С. 73-74. 8.Пирог Т.П., Кузьмінська Ю.В.* Регуляція активності ацетил-КоА-синтетази у мутантного штаму Acinetobacter sp., що не утворює екзополисахариди // Український біохімічний журнал. 2002, Т.74, № 1. С.121. 9. Пирог Т.П., Кузьминская Ю.В.* Регуляция активности ацетил-КоА-синтетазы у мутантного штамма Acinetobacter sp., не образующего экзополисахариды // Междун. конф. “Микробиология и биотехнология ХХI столетия” (Минск, 21-25 мая 2002), С. 58-59. 10. Пирог Т.П., Кузьминская Ю.В.* Роль катионов калия в регуляции С2-метаболизма у Acinetobacter sp. 12S – продуцента экзополисахарида этаполана // VIII Украинский биохимический съезд (Черновцы, 1-3 октября 2002). - Укр. биохим. журнал, 2002, Т.74, № 4б. С. 165-166. 11. Игнатова Е.А., Пирог Т.П., Кузьминская Ю.В.* Регуляция С2-метаболизма у штамма Acinetobacter sp. – продуцента экзополисахарида этаполана // 1-й Международный конгресс “Биотехнология – состояние и перспективы развития” (Москва, 14-18 октября 2002 г.). М.: ЗАО “ПИК “Максима”, РХТУ им. Д.И.Менделеева, 2002. С. 241. 12. Кузьминская Ю.В.*, Пирог Т.П. Центральный метаболизм штамма Acinetobacter sp – продуцента экзополисахарида этаполана // 7-я Пущинская школа-конференция молодых ученых (14-18 апреля 2003 г.), Пущино, 2003. - С. 112. 13. Рибальченко Г.Ю., Пирог Т.П., Кузьмінська Ю.В.* Особливості С2-метаболізму продуцента мікробного екзополісахариду етаполану // 69-а наукова конф. молодих вчених, аспірантів і студентів НУХТ (22-24 квітня 2003 р.), Київ, НУХТ, 2003 . – С. 72. 14. Пирог Т.П., Кузьминская Ю.В.* Особенности метаболизма Acinetobacter sp. – продуцента экзополисахарида этаполана при выращивании на С2-субстратах // 2-й Международный конгресс “Биотехнология – состояние и перспективы развития” (Москва, 10-14 ноября 2003 г.). М.: ЗАО “ПИК “Максима”, РХТУ им. Д.И.Менделеева, 2003. С. 57 15. Корж Ю.В., Пирог Т.П. Регуляция синтеза ацетил-КоА-синтетазы у штамма Acinetobacter sp. // 8-я Пущинская школа-конференция молодых ученых (17-21 мая 2004 г.), Пущино, 2004. - С. 57. 16. Пирог Т.П., Корж Ю.В. Биохимические аспекты синтеза микробного экзополисахарида этаполана на С2-субстратах // Межд. конф. “Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии” (Минск, 26-28 мая 2004). - С.94-96. 17. Рибальченко Г.Ю., Пирог Т.П., Корж Ю.В. Вплив умов культивування на фізико-хімічні властивості екзополісахариду етаполану // 70-а наукова конф. молодих вчених, аспірантів і студентів НУХТ (20-21 квітня 2004 р.), Київ, НУХТ, 2003 . – С. 65. 18. Корж Ю.В., Пирог Т.П. Регуляція С2-метаболізму у Аcinetobacter sp. В-7005 – продуцента екзополісахариду етаполану // Х з’їзд Товариства мікробіологів України (Одеса, 15-17 вересня 2004). – Одеса: Астропринт. – 2004. – С. 59. 19. Пирог Т.П., Корж Ю.В. Регуляція С2-метаболізму продуцента мікробного екзополісахариду етаполану // II Всеукраїнська наук.-практ. конф. “Біотехнологія. Освіта. Наука” (Львів, 6-8 жовтня 2004). – С. 64. * - прізвище Кузьмінська змінено на Корж. АНОТАЦІЯ Корж Ю.В. Регуляція С2-метаболізму у Аcinetobacter sp. В-7005 – продуцента мікробного екзополісахариду етаполану. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2005. Дисертаційна робота присвячена дослідженню основних етапів асиміляції С2-сполук у Аcinetobacter sp. В-7005, виявленню „вузьких” місць С2-метаболізму і розробці підходів до їхнього усунення з метою вдосконалення процесу одержання мікробного екзополісахариду етаполану. У клітинах штаму Acinetobacter sp. В-7005, вирощеного на етанолі, визначено активність ключових ферментів С2-метаболізму, циклу трикарбонових кислот, а також анаплеротичних і деяких біосинтетичних шляхів. Показано, що „вузьким” місцем метаболізму етанолу у Acinetobacter sp. В-7005 є асиміляція ацетату: реакція, що каталізується ацетил-КоА-синтетазою є швидкість-лімітувальною. Встановлено, що інгібіторами ацетил-КоА-синтетази є іони натрію, НАДН і НАДФН, а активаторами – катіони калію й магнію. Показано можливість усунення лімітування С2-метаболізму у Acinetobacter sp. В-7005 при внесенні в середовище з етанолом екзогенного ацетату. На основі досліджень регуляції С2-метаболізму встановлено умови культивування бактерій, що дають змогу підвищити в 3 рази активність ацетил-КоА-синтетази. За таких умов синтезується високоацильований етаполан зі ступенем ацилювання 3 – 15%. Середня молекулярна маса полісахариду становить 1,5 млн і не змінюється в процесі виділення й очистки препарату. Підвищений вміст жирних кислот і висока молекулярна маса етаполану зумовлюють покращення реологічних властивостей його розчинів, що визначають практичну значущість цього ЕПС. Ключові слова: метаболізм етанолу, регуляція С2-метаболізму, ацетил-КоА-синтетаза, екзополісахариди, біосинтез, фізико-хімічні властивості. АННОТАЦИЯ Корж Ю.В. Регуляция С2-метаболизма у Аcinetobacter sp. В-7005 – продуцента микробного экзополисахарида этаполана. – Рукопись. Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 – микробиология. – Институт микробиологии и вирусологии им.Д.К.Заболотного НАН Украины, Киев, 2005. Диссертация посвящена изучению основных этапов ассимиляции С2-соединений у Acinetobacter sp. В-7005, выявлению узких мест С2-метаболизма и разработке подходов к их устранению с целью усовершенствования процесса получения микробного полисахарида этаполана. Установлено, что окисление этанола до ацетальдегида у бактерий осуществляется НАД+-зависимой алкогольдегидрогеназой с оптимумом рН 9,0. Акцепторами электронов в ацетальдегиддегидрогеназной реакции являются НАД+ и НАДФ+, оптимум рН 9,0 . Вовлечение ацетата в метаболизм у Acinetobacter sp. В-7005 происходит при участии ацетил-КоА-синтетазы, которая акцептирует коензим А с образованием ацетил-КоА. Анаплеротической последовательностью реакций, которые восполняют пул С4-дикарбонових кислот в клетках штамма, является глиоксилатный цикл, о чем свидетельствует наличие у бактерий изоцитратлиазы и малатсинтазы. Несмотря на наличие глиоксилатного цикла у Acinetobacter sp. В-7005 функционирует полный цикл трикарбонових кислот, который выполняет преимущественно биосинтетическую роль. При росте бактерий на этаноле образование пирувата происходит в оксалоацетатдекарбоксилазной реакции, а синтез фосфоенолпирувата (ФЕП) обеспечивается двумя ключевыми ферментами глюконеогенеза - ФЕП-карбоксикиназой и ФЕП-синтетазой, соотношение которых изменяется при переходе бактерий из экспоненциальной в стационарную фазу роста. Показано, что „узким" местом метаболизма этанола у Acinetobacter sp. В-7005 является ассимиляция ацетата, о чем свидетельствовало ингибироваие окисления ацетата интактными клетками и активности ацетил-КоА-синтетазы в бесклеточном экстракте ионами натрия, а также лимитирование С2-метаболизма коензимом А. Установлено, что ингибиторами ацетил-КоА-синтетазы являются ионы натрия, а также интермедиаты окисления этанола и ацетальдегида - НАДН и НАДФН. Активаторами фермента являются катионы калия и магния. Снижение нчальной концентрации этанола в среде с 1,0 до 0,5 % (с последующим внесением 0,5 % этанола в середине экспоненциальной фазы роста бактерий), отсутствие соединений натрия в среде культивирования и наличие 100 мМ К+ дало возможность обеспечить практически одинаковую скорость окисления этанола, ацетальдегида и ацетата в интактных клетках бактерий, в три раза повысить активность ацетил-КоА-синтетазы в бесклеточном экстракте и реализовать биосинтез этаполана на практически незабуференной среде. Получение аналогичного результата при начальной концентрации этанола 1,0 % обеспечивалось повышением содержания витамина В5 в среде до 0,0012 % и концентрации Mg2+ до 5 мМ (при условии отсутствия солей натрия и наличии 100 мМ К+ в среде культивирования). Показана возможность устранения лимитирования С2-метаболизма у Acinetobacter sp. В-7005 при внесении в среду с этанолом 0,1 % экзогенного ацетата при получении инокулята и биосинтезе ЭПС, что дало возможность осуществить без снижения показателей процесс синтеза этаполана на незабуференной среде, в которой общее количество солей снижено до 2,95 г/л. В таких условиях синтезируется высокоацилированный этаполан со степенью ацилирования 3 – 15 %. Средняя молекулярная масса полисахарида составляет 1,5 млн и не изменяется в процессе выделения и очистки препарата. Повышенное содержание жирных кислот и высокая молекулярная масса этаполана обуславливают увеличение вязкости его растворов в присутствии одновалентных катионов и в системе Cu2+-глицин. Установлено, что независимо от условий культивирования продуцента (содержание минеральных компонентов, соотношение С/N и молярность буфера в среде), нативные ЭПС характеризовались практически одинаковым содержанием углеводов и пировиноградной кислоты, однако отличались по количеству уроновых и жирных кислот, минеральных компонентов, а также содержанием ацилированного компонента. Таким образом, на основании исследований особенностей энергетического и конструктивного метаболизма у штамма Acinetobacter sp. В-7005 и В-7005 (1НГ) определены механизмы регуляции С2-метаболизма, что позволило разработать новый способ получения этаполана на незабуференной среде минимального состава. Этаполан, синтезованный в таких условиях, характеризовался необходимыми для практического использования реологическими свойствами. Ключевые слова: метаболизм этанола, регуляция С2-метаболизма, ацетил-КоА-синтетаза, экзополисахариды, биосинтез, физико-химические свойства. SUMMARY Korzh J.V. Regulation of C2-metabolism in an Аcinetobacter sp. В-7005 – producer of microbial exopolysaccharide ethapolan. – Manuscript. Thesis for a candidate’s degree by speciality 03.00.07 – microbiology. – The Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Sciense of Ukraine, Kiev, 2005. The thesis is devoted to study of the basic stages of С2-compounds assimilation in Аcinetobacter sp. В-7005, to reveal „bottleneck” of С2-metabolism and to develop of approaches to their removal to improve process of microbial exopolysaccharide (EPS) ethapolan synthesis. The ethanol-grown cells of Acinetobacter sp. В-7005 were analyzed for the activity of С2-metabolism key enzymes, tricarboxylic acids cycle, anaplerotic and some biosynthetic pathways enzymes. Ethanol metabolism in Acinetobacter sp. В-7005 is limited by the rate of acetate assimilation in a reaction catalyzed by acetyl-CoA-synthetase, was shown. Effects of ions (sodium, potassium and magnesium), intermediates of ethanol and acetaldehyde oxidation (NADH and NADPH) on this enzyme were studied (sodium, NADH and NADPH inhibited acetyl-CoA-synthetase; potassium and magnesium acted enzyme activators). The exogenic acetate addition into ethanol containing medium abolished limitation of С2-metabolism in Acinetobacter sp. В-7005. Basing on the investigations of С2-metabolism regulation the cultivation conditions were developed which allowed to increase the acetyl-CoA-synthetase activity in Acinetobacter sp. В-7005. Ethapolan synthesized under these conditions was characterized by high level of acylation (3 - 15%). Molecular mass of this polysaccharide was 1,5 million and was not changed during purification. Improved reological properties of ethapolan were associated with high molecular mass and increasing fatty acids content. Key words: metabolism of ethanol, regulation of С2-metabolism, acetyl-CoA-synthetase, exopolysaccharides, biosynthesis, physical and chemical properties. PAGE \* Arabic 1 PAGE \* Arabic 25

Похожие записи