МІНІСТЕРСТВО АГРАРНОЇ ПОЛІТИКИ УКРАЇНИ

БІЛОЦЕРКІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

МАДІЧ Алла Всеволодівна

УДК 636.082.22/28:57.08

Ранній ембріональний розвиток тварин in vivo і in vitro та
біотехнологічні фактори його регуляції

03.00.20.-біотехнологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора сільськогосподарських наук

м. Біла Церква – 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті біології тварин Української академії
аграрних наук, м.Львів

Науковий консультант: — доктор сільськогосподарських наук, старший
науковий cпівробітник

Шаловило Степан
Григорович, головний науковий співробітник

Інституту біології тварин
УААН

Офіційні опоненти: — доктор сільськогосподарських наук,
професор, член-кореспондент

УААН, Безуглий Микола
Дмитрович, перший заступник міністра

аграрної політики України

— доктор
сільськогосподарських наук, професор

Шеремета Віктор
Іванович, директор навчально-наукового центру,

завідувач кафедри
генетики тварин і біотехнології Національного

аграрного університету
Кабінету Міністрів України

— доктор біологічних наук,
професор

Смолянінов Борис
Вікторович, завідувач кафедри фізіології і біохімії

сільськогосподарських
тварин Одеського державного аграрного

університету МАПУ

Провідна установа: Державний науково — дослідний контрольний
інститут ветеринарних

препаратів та кормових
добавок МАПУ, лабораторія контролю

препаратів при незаразних
захворюваннях, м.Львів

Захист дисертації відбудеться 20.05. 2004 р. о 14-30 год. на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д27.821.01 у Білоцерківському державному
аграрному університеті МАПУ за адресою: 09100, м. Біла Церква, Соборна
площа 8/1, в ауд. 14

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Білоцерківського
державного аграрного університету МАПУ.

Автореферат розісланий 16.04.2004 року.

Вчений секретар cпеціалізованої вченої ради

кандидат ветеринарних наук, доцент
Малина В.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема розробки і удосконалення методів, які
забезпечують скерування клітинних процесів та механізмів формування
цілісних систем, просторових структур і морфогенезу в ланцюгу
ембріонального розвитку від яйцеклітини до сформованого плоду, лишається
актуальною для досліджень з біології раннього розвитку, генетики тварин,
клітинної і генної інженерії. Їх застосування вже сьогодні дозволяє
одержувати тварин бажаних генотипів, прискорено розмножувати потомство
генетично цінних особин, відтворювати генотипові копії бугаїв-плідників
та корів-рекордисток (Завадовський М.М., 1961; Зубець М.В. та інш.,
1995, 1997, 2000; Буркат В.П., 1997, 1998; Безуглий М.Д., 1995, 1997;
Глазко О.Є., 1995; Кузнєцов В.Є. та інш. 1997, 1998, 1999; Willadsen
S.M., 1989, 1999; Gandolfi F. et al, 1997, 2000, 2003; Bavister B. et
al, 1997, 2000; Betteridge K.J., 2000; Greve T. et al. 1998, 2002; Robl
J.M., 2003). Нагромаджені сучасні знання свідчать, що без розуміння
складних біологічних процесів оо- та ембріогенезу, внутрішніх факторів
системи ембріон-материнський організм не можна створити загальні моделі
їх формування, а отже і розробити сучасні біотехнології для регуляції
розвитку і підтримки оптимального функціонування біологічних об‘єктів
(Мартиненко Н.А., 1971; Квасницкий А.В.и др., 1988; Эрнст Л.К.и др.,
1982, 1992; Сергеев Н.И., 1990, 1992, 1995; Осташко Ф.І., 1992; Мадисон
В.В., 1998; Шеремета В.І., 1997; Шаловило С.Г., 1999; Смолянінов Б.В.,
1995, 2000; Гузєватий О.Є., 2000; Heyman Y., 1995, 1998; Parrish J.J.,
1986, 1989, 2001; Fukui Y. et al., 1989, 1990; Brem G. 1995, 2000; Evans
A.C. et al, 2000; Wierzchos E. 2002).

Актуальним є використання різних видів тварин як моделей
ембріогенетичних досліджень, що зумовлює одержання нових теоретичних
даних з вивчення закономірностей та видових особливостей оо- і
ембріогенезу ссавців. Особливого значення набуває застосування ряду
методів клітинної інженерії у біотехнології відтворення і селекції
великої рогатої худоби і овець, яке передбачає суттєвий комерційний
інтерес. У цьому аспекті створення оптимальних умов для розуміння
механізмів дозрівання, запліднення ооцитів, розвитку химерних
ембріональних конструкцій і ранніх ембріонів тварин з групи бластомерів
з використанням фідерних культур ембріонального і маткового походження в
умовах in vitro є надзвичайно важливим.

Через новизну проблеми та недосконалість окремих методів, їх
застосування обмежується в конкретних моделях. До них відносять
блокування мітотичного дроблення ембріонів на ранніх стадіях, низьку
ефективність приживлення і розвитку половинок, чверток ембріонів та
химерних конструкцій у тварин-реципієнтів, чутливість генетичного
апарату ооцитів та ембріонів тварин до дестабілізуючої дії факторів,
пов‘язаних з культивуванням у синтетичних середовищах,
мікроманіпуляціями, заморожуванням та трансплантацією. Загальним для
всіх методів є пошук оптимальних умов для розвитку ооцитів і ембріонів
тварин in vivo та in vitro під впливом біотехнологічних факторів та
шляхів їх удосконалення, оскільки кінцевий етап і логічне завершення
досліджень — одержання нащадків з бажаними фенотипічними ознаками і
генотипом. Мінливість ефективності використання ембріобіотехнологічних
методів для практичних цілей тваринництва вимагає подальших розробок.

Зв‘язок з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота
виконувалась у відповідності з науково-технічними програмами Львівського
філіалу Інституту розведення і генетики тварин УААН за завданнями:
“Розробити нові біотехнологічні методи прискореного розмноження
високоцінних сільськогосподарських тварин” (№ держреєстрації
UA01001476Р); “Вдосконалити і впровадити системи застосування
молекулярно-генетичних, біохімічних, фізіологічних і біотехнологічних
методів у селекції сільськогосподарських тварин” (№ держреєстрації
0196U016325); та Інституту біології тварин УААН за завданнями: “Вивчити
молекулярні механізми регуляції обмінних процесів у репродуктивних
органах самиць, ооцитах і ембріонах та розробити способи стимуляції
процесів відтворення у корів і свиноматок. Удосконалити склад
інкубаційних середовищ для запліднення in vitro” (№ держреєстрації
0198U009013); “Розробити методи стимуляції ембріонального розвитку
тварин із застосуванням клон-технологій” (№ держреєстрації 0198U003431)
упродовж 1991-2002 рр.; підтримана договорами з Інститутом розведення і
генетики тварин УААН та Харківським біотехнологічним центром УААН.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було теоретичне та
експериментальне обґрунтування впливу ендо- і екзогенних факторів на
процеси оо- та ембріогенезу модельних і сільськогосподарських тварин в
умовах in vivo i in vitro, розробка й удосконалення біотехнологічних
способів їх регуляції, одержання життєздатних ембріональних форм і
нащадків з ознаками клону, химер та від запліднення in vitro.

Для реалізації мети досліджень були поставлені наступні завдання:

1. Визначити й охарактеризувати видові морфологічні особливості
доімплантаційних ембріонів норок і песців, механізми ранньої клітинної
диференціації та розвитку.

2. Розробити морфологічну шкалу оцінки доімплантаційних ембріонів норок.

3. Встановити фактори ембріонального оточення, які впливають на
доімплантаційний розвиток хутрових тварин.

4. Розробити спосіб гормональної корекції овуляторної функції неплідних
норок. Дослідити у них формування ембріонально- маткового сигналу на
ранніх стадіях ембріогенезу під дією ендо- і екзогенних гормонів.

5. Оптимізувати існуючі і розробити нові методичні підходи створення
агрегаційних та ін‘єкційних химер норок і корів з доімплантаційних
ембріонів синхронних і асинхронних стадій розвитку, з використанням
ефекту електростимуляції.

6. Удосконалити мікроманіпуляційний метод одержання ідентичних тварин з
обмеженою кількістю у клоні. Встановити ефективність використання
фідерних клітин ембріонального і маткового походження для регуляції
ембріонального розвитку половинок і чверток розморожених ембріонів
корів.

7. Підібрати оптимальні умови для одержання первинної культури фідерних
клітин яйцепроводів і матки з достатнім проліферативним ростом і
функціональною активністю, дослідити її вплив на дозрівання ооцитів
корів in vitro.

8. Встановити й охарактеризувати відмінності впливу різних біологічно-
активних речовин на морфологічні показники якості ооцитів хутрових і
сільськогосподарських тварин. Удосконалити середовище для дозрівання
ооцитів корів і овець in vitro.

9. Удосконалити метод дозрівання і запліднення in vitrо ооцитів овець.
Одержати трансферабельні ембріони та нащадків від трансплантації
розвинутих in vitro ембріонів.

Об‘єкт дослідження: процеси ооцитарного та ембріонального розвитку
тварин в умовах in vivo i in vitro.

Предмет дослідження: ооцити та ембріони норок, песців, шиншил, овець,
корів, репродуктивні органи самиць, біотехнологічні фактори.

Методи дослідження: зоотехнічні; ветеринарні; морфологічні;
гістоморфометричні; фізико-біохімічні; біотехнологічні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше розглянутий комплексний
вплив біотехнологічних факторів і методів на доімплантаційний розвиток
ембріонів тварин за умов in vivo і in vitro. Доведено доцільність
застосування хутрових тварин як лабораторних моделей для
ембріогенетичних досліджень. Розроблено і запропоновано морфологічну
шкалу оцінки ембріонів норок доімплантаційних стадій, вивчено видові
особливості їх ембріонального розвитку, зокрема регуляторні механізми
первинної диференціації бластомерів; запропоновано застосування на
норках методу оцінки якості сперми за інтенсивністю її дихання.
Встановлено біологічний годинник ембріонального розвитку песців.
Удосконалено метод хірургічного вимивання ранніх ембріонів норок та
песців попередньо визначених стадій розвитку від евтаназованих та живих
донорів з використанням загальної анестезії, одержано приплід після
хірургічної трансплантації ембріонів норок. Розроблено спосіб
гормональної корекції овуляторної функції норок. Дістали подальший
розвиток дослідження морфофункціонального стану матки тварин з різною
ембріопродуктивністю на ранніх стадіях ембріонального розвитку. Вперше
встановлено, що присутні у репродуктивних органах норок специфічні білки
мають мітогенну дію, регулюють ембріональний розвиток і диференціацію
бластомерів.

Удосконалено методи реконструкції ембріональних клітин норок і корів.
Вперше одержано химерні зародки норок з ембріонів різного віку і
нащадки-мозаїки від їх пересадки. Після застосування методу
електростимуляції на химерних ембріонах корів і їх трансплантації
одержано телята. Удосконалений і дістав подальший розвиток метод
мікроманіпуляцій для одержання ембріональних клонів трансферабельних
стадій з чверток деконсервованих ембріонів корів. Внаслідок цього
розроблені теоретичні і практичні підходи для відновлення ембріогенезу з
групи бластомерів, одержано телят.

Розроблено науково-обґрунтовані підходи до регуляції інтенсивності росту
фідерних ізольованих епітеліальних клітин яйцепроводів та ендометрію
корів, що здатні підтримувати ооцитарний і ембріональний розвиток поза
організмом, гормональними препаратами і ростовими факторами. Одержано
фідерну клітинну культуру зі стійким проліферативним ростом і збільшено
кількість морфологічно якісних, здатних до подальшого розвитку ооцитів
та половинок ембріонів корів.

Розроблено, запропоновано і експериментально перевірено ефективне
“Середовище для дозрівання ооцитів корів і овець in vitro”, яке
забезпечує одержання морфологічно якісних, дозрілих ооцитів, здатних
запліднитися і розвинутися в ембріони трансферабельних стадій поза
організмом. Наукова новизна підтверджена рішенням про видачу
деклараційного патенту. Вперше в Україні одержані ембріони овець від
дозрівання і запліднення ооцитів in vitro та життєздатний приплід від
трансплантації таких ембріонів.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено морфологічну шкалу
оцінки доімплантаційних ембріонів норок та спосіб зменшення кількості
неплідних самиць під час гону, який забезпечує одержання додаткового
приплоду від норок з порушеннями репродуктивної функції. Удосконалено
мікроманіпуляційні методи бісекції, агрегації і мікроін‘єкції
ембріональних клітин хутрових і сільськогосподарських тварин і
оптимізовано умови їх розвитку in vitro, що дозволяє збільшити кількість
морфологічно якісних і трансферабельних ембріонів з половинок і чверток
деконсервованих зародків корів і зумовлює одержання груп ідентичних
телят. Розроблено високоефективне “Середовище для дозрівання in vitro
ооцитів корів і овець”, яке забезпечує одержання дозрілих поза
організмом ооцитів від живих тварин або після їх забою. Матеріали
дисертаційної роботи увійшли до методичних рекомендацій “Інтенсифікація
хутрового звірівництва удосконаленням біотехнологічних методів
відтворення”, затверджених НТР Головного управління сільського
господарства і продовольства Львівської облдержадміністрації 15 жовтня
2003 року (протокол №2).

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно розроблена дослідницька
програма; проведені більшість досліджень; огляд і аналіз першоджерел
літератури; розроблено теоретичні обґрунтування щодо механізмів
регуляції оо- і ембріогенезу у ссавців; виконано фотографії. Зроблено
статистичний аналіз отриманого цифрового матеріалу, опубліковані
результати досліджень. За участю наукового консультанта розроблено схему
й методику виконання досліджень з використанням сучасних
біотехнологічних методів. Лапароскопічне одержання ооцитів овець
проводили спільно зі співробітниками кафедри розведення овець і кіз під
керівництвом проф. Е.Вешхося (Краківська аграрна академія ім. Х.
Коллонтая, Польща); трансплантацію ембріонів корів- за участю науковців
лабораторії біотехнології відтворення Інституту біології тварин УААН;
загальну анестезія і хірургію хутрових тварин — за участю спеціалістів
кафедри загальної хірургії Львівської національної академії ветеринарної
медицини ім.С.З.Гжицького, за що автор висловлює їм щиру подяку. Із
спільних наукових дослідів і публікацій дисертант використав, за згодою
співавторів, лише свою частину результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації і
результати досліджень доповідалися на міжнародних та республіканських
науково-практичних конференціях і з‘їздах: The 1-st Polish-Ukrainian
Scientific Conference ”Animal Sciences in the XXI centure” (Краків,
Польща, 2001), The 4-th Parnas Conference “Molecular mechanisms of cell
activation: biological signals and their target enzymes“ (Вроцлав,
Польща, 2002), Міжнародна конференція присвячена пам‘яті професора
І.В.Шостаковської (Львів, 2002), “Біотехнологія в розведенні і
відтворенні нових генотипів сільськогосподарських тварин” (Харків,
1993), “Використання трансплантації ембріонів в селекції і відтворенні
сільськогосподарських тварин” (Асканія-Нова, 1997), “Сучасні проблеми
ветеринарної медицини, зооінженерії та технології продуктів тваринництва
(Львів, 1997), “Селекційно-генетичні та біотехнологічні методи
консолідації новостворених порід і типів сільськогосподарських тварин”
(Київ, 1999), “Проблеми неінфекційної патології тварин” (Біла Церква,
1998), “Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних
розробок у генетико –селекційних дослідженнях” (Одеса, 1998), “Проблеми
ветеринарного обслуговування дрібних домашніх тварин” (Київ, 1999),
“Наукові основи сучасних технологій виробництва продукції тваринництва”
(Харків 2003), обговорювалися на засіданнях вченої ради та
координаційних нарадах Інституту розведення і генетики УААН
(1991-1998рр), Інституту біології тварин УААН (1999-2002), наукових
семінарах співробітників Інституту біології тварин УААН.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 43 наукові роботи, з яких
14 одноосібних; зокрема 25 робіт у наукових фахових виданнях, 3 – у
наукових журналах і збірниках, 12 – у матеріалах і тезах конференцій та
симпозіумів, 1 довідник, 1 рекомендації, одержано 1 патент на винахід.

Структура і обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, 4 розділів,
висновків, практичних пропозицій, 7 додатків, списку літературних
джерел, який охоплює 530 найменувань, з яких 367 іноземних. Текст
дисертації викладений на 356 сторінках, включає 48 рисунків і 37
таблиць.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Експериментальна частина роботи виконана на норках, песцях, шиншилах,
великій рогатій худобі, вівцях; 1137 ооцитах і 272 доімплантаційних
ембріонах в умовах господарств „Гряда” Жовківського, „Бартатівське”
Городоцького, „Галичхутро” Сокальського, селянської спілки “Кам‘янка”
Кам’янко-Бузького районів Львівської області та лабораторії клітинної
інженерії Львівського філіалу Інституту розведення і генетики тварин
УААН та Інституту біології тварин УААН. Дослідження проводили за
загальною схемою (рис.1).

Перевірку самців норок на якість сперми здійснювали взяттям мазків з
піхви самиць та визначенням інтенсивності дихання сперміїв за
знебарвленням метиленової синьки. Самиць норок контрастних генотипів
живою масою 0,9-1,1 кг, песців 5,5-6,5 кг, шиншил 450 г використовували
як донорів ооцитів і ембріонів під час природного гону. Кількість
послідовних мітотичних циклів у зиготах норок визначали відрахуванням
годин дроблення (16-20 годин) від дня осіменіння в 2-у охоту, песців –
емпірично. Одержання ранніх ембріонів норок здійснювали на 3-5-й день,
морул — на 6-7-й, бластоцист та реекспандованих бластоцист- на 8-9-й
день (Максимовский Л.Ф., 1994), песців після 1-го спаровування на 8-11-й
день. Вимивання ембріонів виконували за методом Л.В.Козикової (1988);
М.Манка (1990) фосфатно-сольовим буфером (ФСБ) Дюльбекко з 0,4%
сироваткового альбуміну великої рогатої худоби (БСА) або 10% фетальної
сироватки телят (ФСТ) та 40 мкг/мл гентаміцину. Після промивання
репродуктивні органи евтаназованих тварин вимірювали за розмірами,
яєчники аналізували на наявність жовтих тіл, підраховували кількість
фолікулів, ембріони оцінювали морфологічно, класифікували за стадіями
розвитку. Зародки норок інтактними або після агрегації половинок
хірургічно трансплантували у верхівки рогів маток білатерально, по 3-4
ембріони, реципієнтам контрастного генотипу. Належність приплоду до того
чи інакшого генотипу визначали за забарвленням хутра.

Для стимуляції репродуктивної функції норок застосовували комплексний
гормонально-вітамінний “Препарат для стимуляції тічки у свиноматок”
В.Ю.Шавкуна, О.Б.Андрушка (ДП 44006А №7А01К67/02), який містив
гонадотропний гормон, естрадіол-17(, вітаміни, амінокислоти, донатори
SH-груп, мікроелементи та енергетичні субстанції, у сумарній дозі 24 ІО
гонадотропіну (ГСЖК) на 1 кг живої маси (3 ін‘єкції в дозі 8 ІО через 1
добу): самицям з ознаками “тихої” охоти на 5, 6 та 7-й дні після не
результативних спроб до спаровування, а тим, що не проявили ознак
еструсу – в кінці періоду гону. Тварини, які прийшли в спонтанний гін,
слугували як контроль. На 6-й день після коїтусу здійснювали контрольний
забій норок з кожної групи.

В яєчниках визначали кількість жовтих тіл та фолікулів, оцінювали
морфологічну якість і стадію розвитку ооцитів та ембріонів, виготовляли
гістологічні зрізи з верхівок рогів матки (3 мм від істмусу),
забарвлювали гематоксиліном та еозином (Афанасьєв Ю.И. и др.1967). За
рештою тварин спостерігали до щеніння, аналізували за кількістю
нащадків.

Концентрацію білка в лізатах тканин яєчників, яйцепроводів, рогів маток
норок і шиншил та у вимивному середовищі з них на ранніх стадіях оо- і
ембріогенезу (природний гін) визначали за G.Peterson (1977), розділяли
на фракції в блоках градієнтного (5-17%) поліамідакрилового гелю (ПААГ)
за U.Laemmli (1970); O.Lowry et al. (1995) і зафарбовували сріблом (Gorg
A. et al, 1985), порівнювали з білковим спектром сироватки крові.
Кількість окремих білків на електрофореграмах визначали за допомогою
комп‘ютерної програми „Image Tool”. Про молекулярну масу (Мм) окремих
білкових фракцій судили за даними електрофорезу з використанням 9
маркерів з Мм 6,5 кДа; 14,4; 21,5; 31; 45; 66; 97; 116; 200 кДа (“Broad
Range Markers”, США). Екстракцію ліпідів проводили сумішшю
хлороформ-метанол (1:1) (Штоль М.Л., 1970). Ліпіди розподіляли на класи
методом тонкошарової хроматографії. Кількість нейтральних ліпідів
визначали біхроматним методом, фосфоліпідів — за вмістом ліпідного
фосфору реакцією з 10%-им розчином фосфомолібденової кислоти в етанолі.

Мікроманіпуляції з ембріонами норок і корів виконували за допомогою
механічних маніпуляторів, мікроін’єкторів („Leitz”, Німеччина;
„Біоприлад”, Росія), мікроскопів МБС-10 та МБИ-15, відслідковували на
моніторі. Химерні ембріони норок моделювали з груп бластомерів, що
належали ембріонам контрастних генотипів синхронних і асинхронних стадій
розвитку (Манк М., 1991). Їх хірургічно трансплантували
самицям-реципієнтам і одержували приплід. Химерні ембріони корів
одержували мікроін’єкцію групи бластомерів з половинок розморожених 6-ти
денних морул симентальської породи у бластопорожнину нативних ембріонів
чорно-рябої породи (Кузнєцов В.Є.., 1991). Внутрізональну адгезію
мембран бластомерів в химерних ембріонах дослідних груп здійснювали
електричним імпульсом (одним або декількома) напругою 15, 20, 25 В з
експозицією дії 160-200 мкс у 5%-му розчині сахарози (Лісін В.І., 1997;
2000). Для цього використовували прилад для електрозлиття („Біоприлад”,
Росія) і два платинові електроди 30 і 60 мкм (Шигімага В.О., 1997).
Химерні ембріони корів трансплантували по одному телицям-реципієнтам.

Для відновлення мітотичного дроблення в половинках розморожених 7-денних
морул корів чорно-рябої породи використовували фідерні клітини
ембріонального (трофобласт) і маткового (епітеліальні клітини)
походження. Половинки дослідних груп культивували з кластерами
трофобластичних клітин розморожених і культивованих бластоцист (Манк М.,
1990), з розрахунку 4 трофобластичні везикули на 1 половинку у 1 мл
середовища ДМЕМ; або епітеліальними клітинами матки корів (Voelkel C.A.,
1984) у кількості 100 мкл суспензії клітин і 3-4- половинки у 1мл
середовища ТС-199. Половинки контрольних груп культивували без фідерних
клітин. Через 4 і кожні 12 годин культивування розвиток всіх половинок
оцінювали за морфологією, здійснювали повторний мікрохірургічний поділ,
залишали парами у власній прозорій оболонці і трансплантували
телицям-реципієнтам на 6-й день статевого циклу, або продовжували
культивувати in vitro.

У дослідженнях з дозрівання in vitro ооцитів тварин різних розмірів і
морфології їх культивували у 100 мкл середовища ТС-199, DM-335 (“Gibco”)
або ДМЕМ з 25 Мм HEPES, 0,4% БСА, антибіотиками та 10 мкг/мл
фолікулостимулюючого гормону (ФСГ) і 1 мкг/мл естрадіолу -17? (песці);
10 мкг/мл ФСГ і 1 або 4 мкг/мл естрадіолу -17? та 0,2 мкг/мл
преднізолону (норки, шиншили); 10 мкг/мл ФСГ, 1 мкг/мл естрадіолу -17?,
0,2 мкг/мл преднізолону та 10, 20 і 50 мкг/мл лізину (корови, вівці).
Ооцити тварин морфологічно оцінювали за інтенсивним блиском кумулюсу при
поляризації світла, описували характер грануляції ооплазми, стан
дисоціації кумулюсу: песців за X.H. Wen (1994), норок за
Л.Ф.Максимовським и др. (1996), корів і овець – за Г.В.Стефановичем
(1988). Фолікулярні ооцит-кумулюсні комплекси (ОКК) норок культивували
нативними або після зберігання їх в азоті протягом 1 та 3 діб. Їх
заморожували надщвидким методом у вітрифікаційному середовищі, яке
містило 4,5М етиленгліколя, 3,4М диметилсульфоксиду (ДМСО), 5,56 мМ
глюкози, 0,33 мМ Na-пірувату та 0,4 % БСА у ФСБ Дюльбекко за методикою
для вітрифікації ооцитів м‘ясоїдних (Luvoni G., 2000). Ооцити корів
одержували аспірацією фолікулів після забою, дозрівали на клітинному
субстраті фідерних клітин з яйцепроводів і матки корів у середовищі ДМЕМ
з 25 Мм HEPES, 0,4% БСА, 40 мкг/мл гентаміцину, 0,1% розчином глюкози,
Nа –піруватом (контроль) та з 8, 10 і 12 мкг/мл ФСГ; 1; 2 і 4 мкг/мл
естрадіолу-17( та 0,2; 0,4 і 0,6 мкг/мл преднізолону у дослідних групах.
Оцінювали морфологічну якість ооцитів корів, проліферативний ріст та
функціональну активність епітеліальних клітин з яйцепроводів корів під
дією 20 мкг/мл інсуліну та 10 нг/мл епідермального ростового фактора
(ЕФР) та за умов сумісного впливу цих чинників. ОКК овець одержували
лапароскопічно вiд асканійських кросбредних вiвцематок, стимульованих в
анестральний період (Ledda S. et al., 1999), дозрiвали in vitro у
модифікованому нами “Середовищі для дозрівання in vitro ооцитів корів і
овець”. Дозрілі ооцити запліднювали розмороженою спермою баранів породи
сафолк польської селекції, капацитованою у середовищі TALP (розчин
Тіроде з альбуміном, лактатом і піруватом) з 5,0 мкг/мл гепарину
(Parrish J.J.et al, 1988). Середовище для запліднення (Fert-TALP)
виготовляли на основі середовища ДМЕМ з додаванням 5,0 мкг/мл гепарину
та 5 мМ/мл кофеїну. Презумптивні зиготи культивували у середовищі ДМЕМ
упродовж 48 годин, хірургічно трансплантували реципієнту [Cергеев Н.И.,
1998], одержували приплід. Результати документували відповідними актами
і фотографіями.

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Видові особливості доімплантаційного ембріонального розвитку

хутрових тварин

Хутрові тварини були використані як моделі для розробки і вдосконалення
окремих біотехнологічних прийомів і методів. Сперму 48 самців норок, яку
оцінили як „сумнівна” у піхвових мазках, додатково перевіряли методом
визначення інтенсивності дихання сперміїв за знебарвленням метиленової
сині. Сперма активністю 7–9 балів знебарвлювалася впродовж 15-20 хв, 5–6
балів — 25 –30 хв, рідка, малоактивна сперма нижче 5 балів — 45-50 хв.
Добру якість сперми підтверджено у 83,3% самців (p<0,05). Встановлено, що норкам і песцям властиве явище функціональної асиметрії (періодичності) яєчників. На ранніх стадіях вагітності спостерігається інтенсивна мережа кровоносних судин репродуктивних органів, потовщення і скорочення яйцепроводів, видовження роги матки, що свідчить про наявність в них ембріонів. За результатами морфологічної оцінки 143 ембріонів норок (за Максимовским Л.Ф., 1994), які одержали від 26 самиць спарованих у спонтанному еструсі, на 6-8-й день після запліднення якісними виявилися 87,4% ембріонів, дегенерованими 12,6% зародків (табл.1). Таблиця 1 - Результати морфологічної оцінки доімплантаційних ембріонів норок за стадіями розвитку Морфологічна якість і стадія розвитку Одержано ембріонів на 6-6,5-й день (n=17) на 8-й день (n=9) Всього (n=26) n % n % n % Дегенеровані 2-8-бластомерні 17 17,9 b) ** 1 2,1 b) 18 12,6 а) Якісні ембріони, 78 82,1 b) * 47 97,9 b) 125 87,4 а) з них морули, 78 82,1 b) *** 8 16,6 b) 86 60,1 а) бластоцисти, в т.ч. експандовані реекспандовані - - 39 81,3 b) 39 27,3 а) - - 10 25,6с) 10 25,6 с) - - 29 74,4 с) 29 74,4 с) Всього одержано 95 67,1 а) 48 32,9 а) 143 100 Примітка: а) % від загальної кількості ембріонів; b) % від кількості ембріонів вимитих у певний день; с) % від кількості бластоцист; (n=...)- кількість самиць –донорів ембріонів; *- р<0,05; **- p<0,01; ***- p<0,001 - вірогідність відмінностей між кількістю ембріонів вимитих у різні дні циклу. На 6-6,5 день одержали 82,1% якісних ембріонів стадії морули (р<0,001). На 8-й день якісні ембріони становили 97,9%, з них 16,6% - компактні морули, 81,3% - бластоцисти, в тому числі 74,4% - реекспандовані початку латентного періоду. Діаметр ембріонів норок до стадії компактної морули включно становив близько 140-155 мкм, а товщина прозорої оболонки дорівнювала 13-15 мкм. Разом з компактними морулами (Мо-2) і бластоцистами (Бл-1 і Бл-2) класичної морфології, на 8-й день одержали реекспандовані бластоцисти початку латентного періоду ембріональної діапаузи (Бл-3) діаметром 240-300 мкм з характерними морфологічними ознаками. Результати наших досліджень доводять, що початок латентного періоду ембріональної діапаузи у норок спостерігається на 8-й день після запліднення, а не на 9-й, як це вважалося раніше (Максимовский Л.Ф., 1994), що свідчить про прискорення темпів ембріонального дроблення. Припинення процесів первинної клітинної диференціації під час латентного періоду ембріональної діапаузи сприяє виникненню специфічних умов для дії механізмів, які відповідають за утворення гігантських реекспандованих бластоцист норок. Це супроводжується потоншенням прозорої оболонки, розширенням перивітелінового простору, змінами в характері зчеплення клітин: відбувається ретракція клітин трофобласту у напрямку до центру, бластомерна маса реекспандованих бластоцист стає максимально ущільненою, скорочується бластопорожнина. Характерне для ембріональної діапаузи накопичення рідини у перивітеліновому просторі викликає збільшення ембріонів до 240-300 мкм, що у 2 рази більше об‘єму попередніх стадій. Отже, в ембріонах норок початку латентного періоду створюються специфічні умови, які забезпечують активний перехід рідини, як з бластоцелю, так, очевидно, і ззовні, крізь прозору оболонку у перивітеліновий простір ембріона, а також гальмують виникнення факторів, які відповідають за взаємовідношення ембріон-материнський організм. Одержані нами дані опосередковано підтверджують теорію осмотичного тиску, як основної діючої сили раннього ембріогенезу, висунуту М.Д. Безуглим (1995). Хірургічна трансплантація 28-ми інтактних ембріонів норок 4 самицям-реципієнтам, привела до народження щенят-трансплантатів від 2-х тварин. Приживлення трансплантованих ембріонів становило 10,7%. Решту ембріонів норок використовували у подальших різнопланових експериментах, результати яких викладено нижче. Характерні для норок процеси функціональної асиметрії яєчників знайшли свої аналогії у песців, що узгоджується з результатами А.І.Желєзової (1993); спостерігали тенденцію до скорочення яйцепроводів і видовження рогів матки 9-ти евтаназованих самиць, які знаходилися в еструсі та метаеструсі (р<0,05; p<0,01). Темпи раннього ембріонального розвитку песців встановлювали за результатами промиванням репродуктивних органів 6 самиць. Експериментально встановлено, що біологічний годинник мітотичного дроблення ембріональних бластомерів у песців становить 16-20 годин. Отримані дані дозволяють одержувати ембріони попередньо визначених стадій: на 12-й день після осіменіння самиць песців можна очікувати формування 32-бластомерної морули, а на 14-й день – експандованої бластоцисти, що вносить елемент новизни у вивчення видових особливостей раннього ембріонального розвитку песців. Дослідження динаміки раннього ембріогенезу хутрових тварин дозволяють стверджувати, що одною з причин їх ранньої ембріональної смертності є старіння ооцитів або сперміїв у статевих шляхах самиць. У норок овуляція провокується самцем, і результативне запліднення, переважно, відбувається в 2-гу охоту, через 6-7 днів, коли ооцити знаходяться у статевих шляхах самиці в очікуванні гамет самця (в цей час спермії норок від 1-го спаровування вже гинуть, оскільки їх виживаність становить близько 48 –72 год). За цих умов фактор старіння діє у відношенні до яйцеклітин норок. Ембріональний розвиток песців, за нашими даними, відбувався за умов запліднення яйцеклітин сперміями, які залишалися життєздатними у репродуктивних органах самиць близько 7 днів в очікуванні овуляції (для песців характерна розтягнутість цього процесу у часі), що узгоджується зі спостереженнями інших авторів (Максудов Г.Ю. і Артюшкова В.А., 1989). Результати запліднення і дроблення зигот (або його припинення) у песців залежать від виживання або старіння певної частки сперміїв. Це підтверджує результати, що раніше одержані на інших видах тварин (Мартиненко Н.А., 1971; Козикова Л.В., 1988) і у людини (Rushton С., 1999). Таким чином, старіння ооцитів у норок і сперміїв у песців можуть бути одною з причин ранньої ембріональної смертності цих хутрових тварин. Спрямований вплив на овуляторну функцію яєчників і стан слизової оболонки рогів матки у норок Завдяки дії комплексного гормонально–вітамінного препарату (авт. В.Ю.Шавкун, О.Б.Андрушко), за розробленою нами схемою, 76,9% самиць з ознаками “тихої “охоти (1-ша дослідна) були спаровані з самцем, а 69,2% з них народили приплід; 41,7% самиць з відсутністю охоти (2-га дослідна) прийшли в гін і були спаровані, з них 16,7% (р<0,05) народили щенят (табл.2). Таблиця 2 - Результати спаровування і щеніння норок з різною інтенсивністю овуляторних процесів Групи тварин Кількість самиць, n Спаровані Розщенилися Одержано щенят, n Щенят на 1 гніздо n % n % Контрольна 17 17 100 15 88,2 57 3,8 1 дослідна 13 10 76,9 9 69,2 32 3,6 2 дослідна 12 5 41,7 2 16,7* 5 2,5 Примітка: *- вірогідність відмінностей по відношенню до контрольної групи. За результатами щеніння тварини контрольної (природний гін) і 1-ої дослідної груп залишалися на близькому рівні: 3,8 та 3,6 щенят на 1 гніздо відповідно. У 2-ій дослідній групі цей показник дорівнював 2,5 щенят і був у 1,5 рази нижчий за контрольну. Позитивний вплив застосованого препарату підтверджено гістоморфо-метричними дослідженнями ампульно–істмусової ділянки рогів матки норок контрольної і дослідних груп (Шавкун В.Ю., 1968; Gandolfi F., 1999). Індивідуальним аналізом репродуктивних органів евтаназованих тварин на 6-й після спаровування день встановлено стимулюючу і синхронізуючу дію препарату на фолікулярний ріст (до 16-18 антральних фолікулів в 1 яєчнику) і овуляцію яйцеклітин (до 2-5 жовтих тіл). Спостерігали збільшення величини і кількості маткових залоз, максимально до 62 і 42 у полі зору, їх загальної площі до 2,5 і 6,2 мм2 у тварин 1-ї і 2-ї дослідних груп, відповідно, за рахунок наповнення крипт матковим секретом, а також звуження каналу рогів матки. Максимальна кількість крипт у норок 1-ої дослідної групи наближалася до контролю, 62 проти 63 у полі зору. Вони були розтягнуті в діаметрі, розташовані по всій слизовій оболонці. У самиць 2-ої дослідної групи кількість маткових залоз не збільшена, максимально 42 проти 63 у полі зору, однак їх площа більша за контрольні зразки (максимально до 6,2 мм2 проти 1,2 мм2 у контролі), оскільки просвіти крипт заповнені секретом маткових залоз, що свідчить про позитивний вплив застосованого гормонального препарату на проліферативні (збільшення кількості крипт на одиницю площі) й функціональні (збільшення загальної площі крипт за рахунок наповнення їх секретом) процеси у слизовій оболонці матки. Акцентуючи увагу на одержаних гістоморфометричних даних, підтверджено стимулюючу дію використаного препарату і на приживлення ембріонів. Зокрема, у тварин 2-ої дослідної групи, які не приходили в природній гін, внаслідок дії препарату спостерігали спаровування, імплантацію зародків і народження в середньому 2,5 нащадків на 1 самицю. Формування ембріонально - маткового сигналу у норок і шиншил на ранніх стадіях оо- і ембріогенезу. Кількісна і якісна характеристика специфічних білків і ліпідів У вимивній рідині від 7 норок на 5-9-й дні після запліднення виявили 60 ембріонів доімплантаційних стадій: ранні ембріони, морули, експандовані і реекспандовані бластоцисти. Припустили, що в репродуктивних органах самиць містяться білки тотожні білкам сироватки крові і білки специфічні для цих тканин, які відіграють вирішальну роль у формуванні ембріонально-маткового сигналу і взаємовідношення мати–плід (Хомин С.П. та інш., 1997; Gandolfi F., 2000). Це знайшло своє відображення у білковому спектрі яйцепроводів, матки та вимивного середовища з них. Серед білків загальних для репродуктивних органів і сироватки крові виявили лізоцим (14,4 кДа), ангідразу (31 кДа), сироватковий альбумін (66 кДа). Групу поліпептидів з Мм 14-21 кДа, 38-41 та близько 97 кДа спостерігали у складі розчинних білків репродуктивних органів, але вони були відсутні у сироватці крові і у незначній кількості представлені у вимивній рідині. Встановлено тенденцію до збільшення кількості білків й посилення інтенсивності білкового спектру тканини маток і яйцепроводів у норок зі значною кількістю ембріонів (8-16 зародків) аналогічних стадій розвитку, в основному за рахунок групи низькомолекулярних білків, які відсутні в органах самиць зі значно меншою ембріопродуктивністю (3-5 зародків). Їх молекулярна маса знаходилася в діапазоні 7-10 кДа та 16-24 кДа, що може бути проявом функціонального зв‘язку між специфічними для репродуктивних органів молекулами або різними ростовими факторами присутніми у рідині яйцепроводів, які беруть участь у проліферації епітеліальних клітин яйцепроводів та дробленні ембріональних клітин початкового ступеня диференціації (Никольский Н.Н., 1995). Ними можуть бути білки з молекулярною масою 7-28 кДа, які спостерігали в лізатах тканин репродуктивних органів норок - донорів максимальної кількості морул та бластоцист різного ступеня диференціації. У норок евтаназованих на 5-8-й дні після запліднення білковий спектр яйцепроводів більш насичений, ніж матки; у самиць 9-го дня - навпаки. Присутність білка з Мм 33-35 кДа яскраво виражена в матках самиць - донорів реекспандованих бластоцист. Можна припустити, що він характерний для початку латентного періоду ембріональної діапаузи у норок. Виявлений в яйцепроводах овальбумін (45 кДа) свідчить про підготовку репродуктивних органів до нової хвилі овуляції, яка зазвичай наступає через 5-7 днів. Це підтверджують і дані про кількість антральних фолікулів та ооцит-кумулюсних комплексів в яєчниках. У вимивній рідині та репродуктивних органах всіх норок виявлено групу високомолекулярних білків (Мм понад 116 кДа), які відсутні у сироватці крові. Це можуть бути специфічні негліколізовані білки, які також функціонально зв’язані з ембріональним розвитком, що узгоджується з даними F.Gandolfi (1997). За даними індивідуального аналізу, кількість розчинних білків у яйцепроводах самиці на 5-й день (одержали 8 морул) склала 4,2 мг/мл; яйцепроводах норки на 7-й день (10 морул і 6 бластоцист) - 6,5 мг/мл, а матки - 7,0 мг/мл; у яйцепроводах самиці на 8-й день (4 реекспандовані бластоцисти, 1 морула) - 5,4 мг/мл, матки - 6,0 мг/мл. У вимивному середовищі з репродуктивних органів норок кількість білків становила від 1,8 до 2,9 мг/мл . Нами була використана унікальна можливість дослідити електрофореграму розчинних білків репродуктивних органів самиці шиншили через 10 днів після народження кроленят, яка перебувала в стадії проеструсу і була призначена на хутро. В результаті обстеження яєчників нараховано 22 фолікули, розтином яєчникової строми одержано 17 ОКК різної стадії дозрівання, в більшості малі і недозрілі ооцити, які були використані нами в подальших дослідженнях з культивування їх in vitro. Серед насиченого білкового спектру тканини яєчників виявлено високомолекулярні (з Мм понад 116 кДа) і низькомолекулярні (з Мм 7-21 кДа та 31-45 кДа) білки. Вимивне середовище з репродуктивних органів шиншили характеризувалося наявністю білків з Мм близько 12 кДа й 50 кДа, а його білковий спектр подібний до спектру яйцепроводів за виключенням меншої насиченості низькомолекулярними білками. У матці виявлено білки з Мм близько 12 і 17 кДа, насичений спектр в діапазоні 30-45 кДа, з інтенсивною секрецією овальбуміну (45 кДа), та вище 200 кДа, що свідчить про посилену функціональність цього органу у досліджуваний період. У репродуктивних органах норок з різною ембріопродуктивністю визначали класи ліпідів: лізофосфатиди, фосфатидилсерин, сфінгомієлін, лецитин, фосфогліцерин, N-диметил-фосфатидил етаноламін, кардіоліпін, холестерин, нейтральні ліпіди. За результатами індивідуального аналізу виявлено, що яйцепроводи і матки норок, від яких одержано значну кількість ембріонів (від 8 до 16) на 6-8-й дні після запліднення містять 5,9; 7,7 мг, максимально 9,0 мг ліпідів, серед яких основна кількість належить холестерину і нейтральним ліпідам. Особливо їх багато у репродуктивних органах самиць в період ембріональної діапаузи: на 9-й день після запліднення яйцепроводи і матки норок характеризувалися значною кількістю цереброзидів (від 76,0 до 88,6 мг), N–метил фосфатидилетаноламіну (від 82,1 до 88,0 мг), холестерину та нейтральних ліпідів (від 88,8 до 99,6 мг). Детальний аналіз характеристики нейтральних ліпідів у репродуктивних органах самиць латентного періоду ембріональної діапаузи виявив перевагу тригліцеридів. Дані наших досліджень свідчать, що кількість нейтральних ліпідів та холестерину у репродуктивних органах самиць норок може визначати їх багатоплідність. Одержані нами дані доводять, що взаємозв‘язок між ембріонами і репродуктивними органами норок упродовж перших 10-ти днів вагітності відбувається за участю неспецифічних і специфічних білків, які оточують ембріон. Можна стверджувати, що ембріони норок здатні стимулювати синтез і секрецію білків слизовою оболонкою репродуктивних органів і таким чином впливати на оптимізацію власного оточення у статевих шляхах матері ще до моменту імплантації, формуючи інтенсивність ембріонально-маткового сигналу. Це пояснює різну насиченість білкового спектру тканин репродуктивних органів. Мікроманіпуляційні методи реконструкції ембріональних клітин Внаслідок мікрохірургічного поділу і агрегації половинок 5-6-денних морул норок з синхронним розвитком від самиць коричневого (St) і сіро-голубого (Bl) генотипів було одержано 6 химерних ембріональних конструкцій, які хірургічно трансплантували двом реципієнтам, по 3 химерні ембріони в один матковий ріг. Контрольну групу склали 5 інтактних морул (Bl), які пересадили 1 реципієнту (St). Власні ембріони у тварин-реципієнтів не вимивали через ризик зменшення ембріонально- маткового сигналу. Трансплантація химерних ембріонів норок призвела до народження 1 щеня контрастного генотипу, яке успадкувало мозаїчну форму химеризму (16,7% приживлення). З інтактних ембріонів контрольної групи прижився також один (20%). З 3- і 5-денних ембріонів норок асинхронних стадій розвитку одержували химерні конструкції шляхом мікроін‘єкції групи бластомерів з 8-16-клітинних ранніх ембріонів у перивітеліновий простір цілих 32-64-бластомерних морул. Одержані таким чином 8 химерних конструкцій хірургічно трансплантували самиці-реципієнту, білатерально, по 4 ембріони в один матковий ріг, що належала до генотипу, контрастного основній групі бластомерів. Репродуктивні органи реципієнта попередньо промили від власних ембріонів. Контролем був реципієнт з 4-ма трансплантованими інтактними ембріонами. Приживлення химерних ембріонів і народження нащадків контрастного генотипу у дослідної тварини становило 37,5% (3 щенят), серед них химер за забарвленням хутра не було. В контрольній групі прижилося 50% інтактних ембріонів (2 щенят). Таким чином, вперше продемонстрована можливість конструювання і життєздатність химерних ембріонів норок з зародків синхронних і асинхронних стадій розвитку. Химерні ембріони корів одержували методом мікроін‘єкції половинок розморожених морул у бластопорожнину цілих нативних бластоцист. Внутрішньозональну адгезію мембран чужорідних бластомерів на 28 химерних ембріонах дослідних груп здійснювали електроімпульсом з різним режимом дії, який застосовували з метою відновлення міжклітинних з‘єднань і створення оптимальних умов для рівноцінного розвитку обох часток в ембріональних конструкціях. Емпірично підбирали таку напругу імпульсу і час експозиції дії, який не допускає ефекту теплового руйнування мембран, однак забезпечує їх адгезію з максимально корисним ефектом. Химерні ембріони контрольної групи не піддавали дії електроімпульса (табл.3). Таблиця 3 - Розвиток химерних ембріонів корів під дією електростимуляції Групи химерних ембріонів Кількість Режим дії електричного імпульсу Пересаджено ембріонів Реципієнтів З них тільних n % n n % Дослідна 1 5 15 В, 100 мкс, 1 імпульс 5 100 3 1 33,3 Дослідна 2 5 25 В, 200 мкс, 1 імпульс - - - - - Дослідна 3 18 20 В, 150 мкс, 2-4 імпульси 11 61,1 5 1 20,0 Контроль 7 не застосовували 7 100 7 1 14,3 Незначні зміни в морфології химерних конструкцій 1-ї групи свідчили про відсутність адекватної відповіді ембріонів на слабкий сигнал в 15 В. Імпульс напругою 25 В впродовж 200 мкс (2-га група) викликав дегенеративні явища: зміну форми ембріона, в окремих випадках явище тургору, травматичне зменшення бластопорожнини, часткову руйнацію бластомерів і утворення загальної цитоплазматичної маси внаслідок теплового пошкодження мембран. Оптимальні параметри електростимуляції виявлено при напрузі 20 В з 2-4 разовим спрямуванням електричного імпульсу та з експозицією дії кожного 150 мкс (3-тя дослідна група). При цьому найчастіше спостерігали збільшення перивітелінового простору за рахунок ущільнення бластомерної маси химерних бластоцист без зміни їх форми, дегенерації і руйнації клітин. В результаті нехірургічної трансплантації 16-ти химерних ембріонів дослідних груп по одному в кожний матковий ріг 8-ми телицям-реципієнтам та 7-ми химерних ембріонів контрольної 7-ми реципієнтам одержано 3 тільності (20,0%), в тому числі 2 від пересадки химерних бластоцист після застосування електростимуляції, які закінчилися народженням трьох телят (1 телиця–реципієнт 1-ї дослідної групи розтелилася двійнятами). Незначне підвищення приживлення химерних ембріонів у 1-й дослідній групі можна пояснити слабким електроімпульсом і відсутністю будь-яких порушень у морфологічній будові химерних ембріонів. Результати досліджень дають можливість гіпотетично стверджувати химеризм одержаних ембріональних форм. Для підвищення життєздатності поділених ембріонів корів застосовували фідерні клітини ембріонального і маткового походження. Від 47 розморожених і культивованих 9-10-денних бластоцист корів відсікали трофобластичні фрагменти за допомогою мікроманіпулятора і мануально і використовували для відновлення мітотичного дроблення 19 половинок розморожених морул корів дослідної групи. Їх пари склали контроль (табл.4). Таблиця 4 - Розвиток половинок розморожених морул корів in vitro за умов культивування з трофобластичними везикулами і без них Показники Групи Контрольна Дослідна n % n % Одержано половинок морул 19 - 19 - Компактизувалися після 12 год культивування 15 78,9 19 100 Через 24 год оцінено як ембріони 2-ої генерації 5 26,3 16 84,2** Одержано чверток і трансплантовано реципієнтам 10 52,6 32 168,4*** Використано реципієнтів, з них: 4 - 16 - прийшли в еструс в період до 24 днів 4 100 6 37,5 прийшли в еструс в період до 60 днів - - 7 43,7 розтелилося реципієнтів - - 3 18,8 Примітка: *- вірогідність відмінностей по відношенню до контрольної групи. a x z | ’ o , < >

h

E

0

a

a

– j

`„A

??????

?

j

t

?

?

?

?

,

< >

@

`„A

@Їх знову піддали бісекції методом внутрішньозональної сепарації
бластомерів на дві чвертки без підсадки в окремі прозорі оболонки і
трансплантували 20 телицям-реципієнтам зі спонтанною охотою, по дві
чвертки в один матковий ріг. Тільність від трансплантації чверток
розморожених морул, яку визначали за результатами перегулів, наприкінці
другого місяця становила 15% (3 з 20), виключно за рахунок реципієнтів
дослідної групи. Були одержані дві пари ідентичних близнюків: телички і
бички; і 1 бичок (18,8% приживлення).

Епітеліальні клітини маткового походження використовували для
рекомпактизації і стимуляції розвитку in vitro 22-х половинок
розморожених 7-денних морул корів дослідної групи упродовж трьох діб. Їх
пари склали контрольну групу (табл.5).

Таблиця 5 — Життєздатність половинок розморожених морул корів in vitro
за умов культивування з клітинами епітелію і без них

Групи Половинок Життєздатних половинок після культивування, год.

4 12 24 36 48 60 72

Дослідна, n

% 22 20

90,9 16

72,7 13

59,1 13

59,1 10

45,5 7

31,8 6

27,3

Контрольна, n

% 22 20 90,9 12

54,5 7

31,8 5

22,7* 3

13,6 1

4,5 1

4,5

Всього, n

% 44 40

90,9 28

63,6 20

45,4 18

40,9 13

29,5 8

18,2 7

15,9

Примітка: *- вірогідність відмінностей по відношенню до контрольної
групи.

Життєздатність та розвиток in vitro половинок залишалися задовільними
впродовж перших 12 год за умов культивування їх з клітинами епітелію у
дослідній групі (72,7%) в порівнянні з їх парами у контрольній (54,5%).
Через 36 год життєздатність половинок морул контрольної групи дедалі
зменшувалась, а дослідної лишалася на одному рівні з вірогідною різницею
між групами (р< 0,05). Через 48 годин у 54,5% половинок дослідної і 86,4% контрольної груп спостерігали явища, що не сумісні з довготривалою життєздатністю ембріональних клітин: часткової дисоціації бластомерів, відсутності достатнього рівня компактизації, часткового некрозу цитоплазми, налипання на прозорій оболонці ембріона чужорідних елементів, які свідчили про зміну її ізоелектричного потенціалу. Протягом 72 годин 27,3% половинок дослідної групи лишалися життєздатними, в той час як у контрольній групі 95,5% половинок дегенерували. Удосконалення середовища для дозрівання in vitro ооцитів тварин Стероїдні гормони, глюкокортикоїди та інсулін належать до важливих елементів системи регуляції обміну речовин і впливають на процеси проліферації, росту і диференціації клітин, перебіг реакцій синтезу і розщеплення органічних речовин (De Meyts P. et al., 1996; Wessely O. et al., 1997; Viveiros S. et al., 1999, Штапенко О.В., Розгоні І.І., 2000; Broussard J.R. et al, 2000). Оскільки молекули цих біологічно-активних речовин мають властивість зв‘язуватися зі специфічними рецепторами, які є структурними компонентами плазматичних мембран клітин кумулюсу, ми припустили, що їх додавання до культурального середовища буде покращувати морфологічну якість ооцит-кумулюсних комплексів (ОКК) тварин in vitro. Культивування in vitro ооцитів песців різних розмірів. 28 ОКК від 6 самиць (проеструс-еструс) оцінили за розмірами, грануляцією ооплазми, інтенсивним блиском кумулюсу при поляризації світла, інтенсивністю розпушення або денудації кумулюсу (часткової або повної). Через 24 і 36 годин культивування серед ооцитів діаметром 100 мкм одержано 33,3% і 44,4% морфологічно якісних, більше 100 мкм - 80,0% і 100%, відповідно. Вони характеризувалися утворенням закритого, розпушеного шару кумулюсу, що характерно для процесів його експандації, яке пов‘язане з дозріванням ОКК до метафази 2 і узгоджується з результатами Srsen V. et al. (1997). Оскільки клітини кумулюсу контролюють початок мейозу в ооцитах (Farstard W., 2000; Wen X.H., 1994), у подальших дослідженнях до середовища для дозрівання їх in vitro нами вводився преднізолон, який у встановленій концентрації міг би забезпечити достатню розпушеність кумулюсу і стимулював процеси, пов‘язані з бажаними змінами у клітинній сфері ОКК. Морфологія і культивування ооцитів шиншили. Яскраво виражене у норок та песців явище функціональної асинхронності яєчників виявилося характерним і для шиншил. Максимальна кількість фолікулів в 1 яєчнику становила 23, що вносить корекцію до результатів інших авторів (Barabasz B., 2001). Від 2-х самиць (проеструс) одержали 37 ОКК 1-ої та 2-ої категорії якості з різним ступенем дозрівання і розміром від 80 до 120 мкм, які культивували 24 год у середовищі DM 335 (“Gibco”, Англія). Додавання 0,2 мкг/мл преднізолону та 1 і 4 мкг/мл естрадіолу-17? покращило морфологічну якість у 84,6% і 75% ооцитів відповідно 1-ї і 2-ї дослідних груп проти 50% у контролі (р<0,05) за рахунок утворення розпушеного, з рівною клітинною сферою кумулюсу і чітко гранульованою ооплазмою. Решта ОКК дегенерували, що проявлялося у “відлежуванні” ооплазми, її зсуванні на бік, набуття нею серпанкової форми або міграції гранул ооплазми у перивітеліновий простір, розірваному променистому вінці, що тьмяно висвічував за умов поляризації світла. Культивування нативних і вітрифікованих ооцитів норок. 62 морфологічно якісні ОКК норок від 8 самиць (еструс) культивували 24 год нативними або розмороженими після кріоконсервування надшвидким методом (зберігання в азоті 1 і 3 доби) у ДМЕМ (контроль) з додаванням 0,2 мкг/мл преднізолону та 1 і 4 мкг/мл естрадіолу-17? у дослідних групах. Їх оцінювали за аналогічними показниками морфології кумулюсу і ооплазми. Преднізолон і естрадіол-17? у вищевказаних концентраціях стимулювали експансію клітин кумулюсу і сприяли тісному контакту мембран цих клітин з оолемою 85% нативних ооцитів, але не вплинули на покращення морфології деконсервованих. У 78,6% розморожених ооцитів, незалежно від часу перебування їх у рідкому азоті, зафіксовано погіршення морфологічної якості, яке проявлялося у руйнуванні клітин кумулюсу, зміщенні ооплазми до одного з полюсів або у загальній деформації форми, фрагментарному порушенні цитоплазми, утворенні псевдобластомерів, частковому руйнуванні ооцитарної мембрани з утворенням дірок і виходом ооплазми у середовище. Культивування in vitro ооцитів корів на культурах фідерних клітин маткового походження. Досліджували дію ФСГ, естрадіолу-17( та преднізолону в різних концентраціях на проліферацію епітеліальних клітин яйцепроводів і ендометрію корів та морфологію ооцитів. У кожному з 5-ти дослідів було використано 120 ооцитів корів, по 30 ооцитів у групі. ОКК культивували упродовж 24 год по 10 ОКК у 100 мкл середовища ДМЕМ. Найгустішу популяцію епітеліальних клітин яйцепроводів одержано у 3-й дослідній групі з найвищою концентрацією гормонів 12 мкг/мл ФСГ, 4 мкг/мл естрадіолу 17( та 0,6 мкг/мл преднізолону: 13,2(0,57х106 (р<0,001); що підтвердилося двома повторними дослідами: 14,02(0,85 (p<0,01) та 12,41( 0,33 (p<0,001) х 106 клітин/мл (рис.2). Рис.2. Проліферативний ріст фідерних клітин під дією гормональних препаратів: дослід 1 та його повтор - епітеліальних клітин яйцепроводів корів; дослід 2 та його повтор – клітин ендометрію корів; 1-контрольна група, 2, 3, 4-перша, друга і третя дослідні групи відповідно. Кількість клітин яйцепроводів була у 5-5,5 разів вище за початкову посівну концентрацію 2,0-2,5 х 106 клітин/мл (дослід 1). Найкращі результати збільшення росту і щільності клітинної популяції ендометрію одержано в 2-й і 3-й дослідній групах з середнім вмістом гормонів: 5,94(0,52х106 (р<0,01) у досліді 2 та 8,34(0,37х106 (р<0,001) клітин/мл у повторній серії, що тільки у 3 рази перевищувало початкову посівну концентрацію клітин 1,8-1,9х106/мл. Максимальне підвищення концентрації гормонів у середовищі викликало супресивний ефект і затримувало мітотичний поділ клітин ендометрію, що підтвердилося відсутністю у дослідних групах зон інтенсивної проліферації. Незначне збільшення початкової посівної концентрації клітин ендометрію з 1,8 до 1,9 х 106/мл, також як і зменшення епітеліальних клітин яйцепроводів з 2,5 до 2,0 х 106/мл, викликало суттєву різницю у їх кількості внаслідок культивування, до 1млн./мл, не тільки по групах, але й у повторних дослідах. Морфологічна якість ОКК корів на культурі епітеліальних клітин яйцепроводів була вища, ніж на клітинах ендометрію і становила 83,3 і 86,7% проти 63,3 і 53,3%, відповідно, у групах з середнім і максимальним вмістом гормонів. Після 24 год культивування кумулюсні клітини лишалися життєздатними, з високим ступенем експансії, не зафарбовувалися трипановим синім, оолема гранульованою, зернистою. Культивування in vitro ооцитів корів на фідерних клітинах під дією інсуліну та ЕФР. Клітинну суспензію епітелію яйцепроводів корів у початковій посівній концентрації 0,675х106/мл культивували у середовищі ДМЕМ (контроль), з додаванням 20 мкг/мл інсуліну пролонгованої дії (1-ша дослідна) та 10 нг/мл EФР (2-га дослідна група). Функціональність фідерних систем тестували дозріванням на них ОКК корів 1-ї і 2-ї категорій якості по 15 ооцитів в кожній групі. Підрахунок клітин в 1 мл середовища впродовж 24 год (1-й пасаж) і 48 год з початку культивування (2-й пасаж) було використано як індикатор специфічного ефекту інсуліну, EФР та сумісної дії цих чинників (табл.6). Таблиця 6 - Вплив інсуліну та EФР на проліферативний ріст культури епітеліальних клітин яйцепроводів і морфологічну якість ОКК корів, М ( m (n=3) Групи популяцій клітин Концентрація клітин, х106/мл Якісних ОКК 1 пасаж 2 пасаж n % Контроль 0,675 0,795 ( 0,052 0,265 0,436 ( 0,045 8 53,3 Дослідна 1 0,675 1,336 ( 0,177* 0,445 1,793 ( 0,055*** 13 86,7* Дослідна 2 0,675 0,830 ( 0,073 0,277 0,521 ( 0,051 10 66,7 Дослідна 3 0,675 1,867 ( 0,109*** 0,622 2,589 ( 0,067*** 14 93,3* Примітка: *, ***- вірогідність відмінностей по відношенню до контрольної групи. Через 24 год кількість клітин під дією інсуліну збільшилася в 2 рази (р<0,05), а після перепосіву у 4 рази (p<0,001), одержано 86,7% (р<0,05) якісних ОКК стадії полярного тільця. Додавання ЕФР суттєво не вплинуло на проліферативний ріст епітеліальних клітин, їх кількість збільшилася тільки у 1,2 рази після 1-го пасажу в 1,9 рази в результаті 2-го, що відобразилося і на якості 66,7% морфологічно якісних ОКК, здатних до подальшого розвитку). Найяскравіший ефект стимуляції клітинної проліферації спостерігався за умов сумісної дії чинників (3-тя дослідна група): збільшення клітинної популяції у 2,8 рази (р<0,001), а після перепосіву в 4,2 рази з високим ступенем вірогідності (р<0,001), одержано 93,3% (р<0,05) морфологічно якісних ОКК. У контролі кількість клітин збільшилася тільки у 1,2 рази а після перепосіву - у 1,6 рази з одержанням 53,3% якісних ОКК. У морфологічно якісних ОКК спостерігали характерну для них чітку грануляцію ооплазми, інтенсивний блиск кумулюсу при поляризації світла, розпушення і утворення закритої сфери клітин променистого вінця внаслідок руйнування міжклітинних з‘єднань між клітинами кумулюсу і мембраною ооцита, що підтверджує результати інших авторів (Жернокльов Г.В., 2001). Сумісна експресивна дія епідермального ростового фактору і інсуліну, що проявилася у посиленому проліферативному рості фідерних клітин і покращенні морфології ОКК, може бути пояснена активацією IФР-системи, функціональність якої є вирішальним моментом оогенезу як in vivo так і in vitro. Удосконалення середовища для дозрівання in vitro ооцитів. 120 ОКК корів 1-ї, 2-ї і 3-ї категорій морфологічної якості культивували в середовищі ТС-199 (контроль) з додаванням 10, 20 і 50 мкг/мл лізину у дослідних групах. Очікували покращення морфологічної якості і дозрівання ооцитів корів in vitro, оскільки лізин є першою незамінною амінокислотою у синтезі білків та важливий у багатьох процесах метаболізму і ядерного синтезу. У 1-й, 2-й і 3-й дослідних групах спостерігали значне підвищення морфологічної якості ОКК: 66,7%; 86,7% (р<0,01); і 73,3%, відповідно, проти 33,3% у контрольній, яке проявлялося гомогенністю ооплазми, розташуванням багатошарового кумулюсу навколо мембран ооцитів без дегенеративних змін. Для визначення комплексного впливу преднізолону і лізину на морфологічну якість ОКК корів проводили дозрівання 60 ооцитів 1-ї, 2-ї та 3-ї категорій морфологічної якості у вищевказаному середовищі з додаванням преднізолону і лізину у дослідній групі, що дозволило одержати 86,7% (р<0,05) морфологічно якісних ОКК проти 60,0% у контролі. Представлені дані дозволили оформити їх у вигляді Деклараційного патенту 52177 А ”Середовище для дозрівання ооцитів in vitro корів та овець”. Дозрівання ооцитів овець в удосконаленому середовищі, одержання ембріонів in vitro, їх трансплантація і одержання приплоду Лапароскопічно одержані від 8-ми кросбредних вівцематок 27 якісних ОКК різної морфології і ступеня зрілості культивували упродовж 24 год у модифікованому нами середовищі для дозрівання ооцитів, що містило NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2 6H2O, NaH2PO4, NaHCO3, фенол червоний, хепес (HEPES), гентаміцин, естральну сироватку овець, ФСГ+ЛГ, Na піруват і гепарин (модифіковане ДМЕМ), до якого додатково ввели преднізолон і лізин. Після морфологічної оцінки 81,5% ОКК виявилися якісними, здатними до запліднення і подальшого розвитку: 51,9% 1-ї категорії якості з чітко ідентифікованими полярними тільцями, 25,9% 2-ї категорії з залишками одношарового кумулюсу, 1 ОКК з частково некротичною ооплазмою 3-ї категорії. (табл.7). Таблиця 7 - Результати дозрівання, запліднення і дроблення in vitro ооцитів овець Категорія якості ооцитів Початкова кількість Культивували in vitro Дозрілих in vitro Розпочали дроблення n % n % n % n % 1-ша 27 75,0 27 - 14 51,9 14 63,6 2-га - - - - 7 25,9 - - 3-тя 9 25,0 - - 1 3,7 - - Всього 36 100 27 - 22 81,5 14 63,6 Капацитацію розмороженої сперми барана породи саффолк польської селекції проводили упродовж 30 хв у розчині TALP (Parish J.J. et al, 1988), запліднення дозрілих in vitro ооцитів у середовищі ДМЕМ з додаванням 5,0 мкг/мл гепарину і 5 мМ /мл кофеїну (Fert-TALP) капацитованою спермою у концентрації 1 млн/мл упродовж 18 годин. Презумптивні зиготи переносили у модифіковане ДМЕМ для мітотичного дроблення і подальшого розвитку. Через 24 і 48 годин культивування стадію розвитку зигот визначали підрахунком в них кількості бластомерів: 14 зигот (63,6%) розпочали дроблення і через 48 годин знаходилися на ранніх стадіях розвитку з утворенням макро- і мікробластомерів, з них 13 зигот розвинулися до стадії 8-16-ти бластомерного ембріона, 1 зупинився на 4-6-бластомерній стадії. Хірургічна трансплантація 3-х ранніх ембріонів одержаних in vitro вівці-реципієнту, яка раніше була використана як донор ооцитів при їх лапараскопічному одержанні, закінчилася на 171-й день народженням ягнички живою масою 5420 г за кличкою Діана. Різниця в тривалості пренатального періоду її розвитку у порівнянні з ягнятами - напівсібсами становила 21 день. Однак, це не вплинуло на живу масу Діани при народженні. Цей феномен можна пояснити збільшенням тривалості доімплантаційного розвитку ембріонів одержаних in vitro, оскільки після трансплантації реципієнту вони потребують додаткового часу для компенсації необхідної клітинної маси внаслідок певної кількості циклів мітотичного дроблення, що віддаляє імплантацію і таким чином, очевидно, збільшує загальний термін вагітності реципієнтів. Це опосередковано підтверджує попередні дані S.Iwasaki et al (1990), T.H.Thompson et al (1995), В.Е.Щербак (1997) про достовірно меншу питому масу ембріонів одержаних поза організмом. ВИСНОВКИ У дисертації теоретично узагальнено сучасне вирішення наукового завдання використання біотехнологічних методів, що сприяють одержанню нових даних щодо вивчення закономірностей та видових особливостей оо- і ембріогенезу тварин за умов розвитку in vivo і in vitro, дозволяють зберегти цінний ембріональний матеріал, підвищують потенціал плідності самиць. Експериментально вивчено механізми клітинної регуляції, які проявляються у компенсації ембріонами клітинних втрат, відновленні мітотичного дроблення, стимуляції процесів дозрівання ооцитів. Обґрунтована можливість створення in vitro таких умов, які були б максимально наближені до специфічного маткового середовища на ранніх стадіях ембріогенезу. 1. Застосований нами у норок метод визначення якості сперміїв за інтенсивністю їх дихання дозволяє внести корекцію в оцінку самців основного стада. Сперма активністю 7-9 балів знебарвлюється упродовж 15-20 хв, 5-6 балів – 25-30 хв, нижче 5 балів – через 40-45 хв. 2. Встановлено закономірності і видові особливості раннього ембріонального розвитку хутрових тварин, що полягає у наступному: - початок латентного періоду ембріональної діапаузи у норок спостерігається на 8-й день після запліднення, а не на 9-й, як це вважалося раніше, що свідчить про прискорення темпів ембріонального дроблення і супроводжується змінами в характері зчеплення бластомерів реекспандованих бластоцист; - біологічний годинник мітотичного дроблення ембріональних бластомерів у песців складає 16-20 годин. Згідно розробленої схеми, на 12-й день після осіменіння самиць песців можна очікувати формування ранньої 32-бластомерної морули, а на 14-й день – експандованої бластоцисти, що вносить елемент новизни у вивчення видових особливостей їх раннього ембріонального розвитку; - існує суттєва різниця в темпах доімплантаційного розвитку норок і песців: для норок характерна ембріональна діапауза зі специфічними морфологічними ознаками в будові реекспандованої бластоцисти; ембріонам песців притаманний динамічний розвиток. На основі цього розроблена шкала морфологічної оцінки доімплантаційних ембріонів норок, яка дозволяє здійснити селекцію зародків за стадіями розвитку; - висунуто і експериментально доведено концепцію внутрішніх причин ранньої ембріональної смертності хутрових тварин, яка базується на принципах біологічного “старіння” ооцитів норок і сперміїв песців. 3. Комплексний гормонально-вітамінний “Препарат для стимуляції тічки у свиноматок“ (ДП № 44006А. 7 А01К676/02.-авт. В.Ю.Шавкун, О.Б.Андрушко) у загальній дозі 24 ІО ГСЖК за розробленою схемою може бути застосований для стимуляції овуляції у норок, що сприяє спаровуванню самиць в кінці періоду гону, створює оптимальні умови в матці для розвитку ембріонів за рахунок збільшення кількості крипт, наповнення їх матковим секретом і призводить до імплантації зародків у неплідних самиць та народження 2,5 нащадків на гніздо. 4. Інтенсивність секреції специфічних білків репродуктивними органами норок знаходиться у прямому зв‘язку з кількістю ембріонів та стадією їх розвитку: на 5-8-й дні після запліднення білковий спектр яйцепроводів самиць насиченіший, ніж тканин матки; на 9-й – навпаки, що пов‘язано з функціональністю цього органа в латентний період ембріональної діапаузи. Одночасний розвиток значної кількості ембріонів з їх первинною диференціацією супроводжується в яйцепроводах присутністю групи низькомолекулярних білків (7-10 кДа та 16-24 кДа), що характерна для специфічних поліпепетидів та ростових факторів, які беруть участь в процесах ембріогенезу і володіють мітогенною дією. Початок латеного періоду у норок співпадає з наявністю специфічного білка з Мм 33-35 кДа. Кількість нейтральних ліпідів та холестерину у репродуктивних органах самиць норок на ранній стадії вагітності може визначати їх багатоплідність. 5. Ранні зародки норок володіють механізмом регуляції перерозподілу примордіальних зародкових клітин і здатні компенсувати свій розвиток in vivo після мікрохірургічного втручання і агрегації недиференційованих бластомерів синхронного і асинхронного (в межах 3-х мітотичних дроблень) розвитку з приживленням химерних ембріонів 16,7% і 37,5% відповідно. 6. Оптимальні параметри неушкоджуючого електростимулюючого впливу на химерні ембріони корів, що одержані мікроін‘єкцією групи бластомерів розморожених морул у нативні бластоцисти, знаходяться в межах 15-20 В з 2-4 - разовим імпульсом експозицією 100-150 мкс. За цих умов досягається внутрішньозональна адгезія мембран чужорідних бластомерів без їх теплового пошкодження з життєздатністю і приживленням химерних ембріонів у телиць-реципієнтів. 7. Застосування культур клітин ембріонального і маткового походження доцільно для підтримки розвитку поділених навпіл ембріонів корів, зокрема для збільшення кількості трансферабельних ембріонів 2-ої генерації або для одержання ембріональних клонів за рахунок бісекції попередньо культивованих in vitro половинок. Цей прийом забезпечує 18,8% приживлення чверток розморожених морул корів, що в перерахунку на половинку розмороженого ембріона становить 37,6%, а на цілий ембріон- 75,2%, значно підвищує ефективність методу трансплантації та забезпечує одержання ембріональних клонів і груп ідентичних тварин. 8. Мікроманіпуляції з ембріонами, довготривале культивування in vitro та взаємодія цих факторів в цілому дестабілізуюче впливають на життєздатність і подальший розвиток in vitro половинок розморожених морул. Проте, їх морфологічну якість можна підвищити культивуванням з епітеліальними клітинами маткового походження, що в 1,9 рази підвищує їх життєздатність упродовж 24 годин, у 3,3 рази через 48 годин і в 6 разів через 72 годин (27,3% половинок ембріонів лишаються морфологічно якісними). 9. Висока інтенсивність утворення і одночасного дозрівання декількох фолікулів у хутрових тварин забезпечується періодичною функціональною активністю яєчників. Ступінь фолікулярного дозрівання, розмір і морфологія ооцитів норок, песців і шиншил можуть бути тестом їх здатності до подальшого розвитку in vitro. Культивування у середовищі з додаванням ФСГ, естрадіолу -17? та преднізолону стимулює експансію клітин кумулюсу у 80-85% ооцитів і в окремих випадках сприяє розшаровуванню з‘єднань між клітинами променистого вінця і цитоплазматичною мембраною ооцита. 10. Додавання до культурального середовища ФСГ, естрадіолу-17?, преднізолону у малих дозах (0,2-0,6 мкг/мл) забезпечує одержання моношару епітеліальних клітин яйцепроводів і ендометрію та пов‘язано з активуванням ендокринного механізму регуляції клітинної проліферації. Ізольовані клітини епітелію яйцепроводів реагують на підвищення концентрації гормонів у середовищі збільшенням щільності клітинної популяції у 5 –5,5 разів з 2,0 - 2,5 млн. до 13,2 ( 0,57 (р<0,001); 14,02 ( 0,85 (p<0,01) та 12,41 ( 0,33 (p<0,001) млн. клітин в 1 мл, а клітини ендометрію - у 3 рази, з 1,8 – 1,9 млн. до 5,94 ( 0,52 (р<0,01) та 8,34 ( 0,37 млн. клітин в 1 мл. Підвищенння концентрації гормонів ФСГ до 12 мкг/мл, естрадіолу-17( - 4 мкг/мл, преднізолону - 0,6 мкг/мл веде до затримки процесів мітотичного дроблення клітин ендометрію. 11. Первинна культура фідерних клітин маткового походження стимулює процеси дозрівання in vitro ооцитів корів, а ооцит-кумулюсні комплекси можуть бути тест- системами функціональної активності фідерних культур. Ко-культивування з фідерними клітинами під впливом ФСГ, естрадіолу-17? і преднізолону підвищує кількість морфологічно якісних ооцитів корів до 83,3% (р<0,05) і 86,7% (р<0,001) на моношарі епітеліальних клітин яйцепроводів і 53,3% і 63,3% на моношарі клітин ендометрію. 12. Додавання до культурального середовища 20 мкг/мл інсуліну та 10 нг/мл епідермального ростового фактору прискорює процес вирощування фідерного клітинного субстрату і дозрівання ооцитів. Щільність клітинної популяції епітеліальних клітин яйцепроводів під дією інсуліну і ЕФР через 24 години збільшується у 2,8 рази, а після пере посіву - у 4,2 рази. Це дозволяє одержувати 86,7% морфологічно якісних ооцитів під дією інсуліну, 66,7% при культивуванні з ЕФР, а за умов сумісної дії чинників – 93,3%, проти 53,3% у контролі. 13. Застосування модифікованого “Середовища для дозрівання ооцитів корів і овець in vitro” забезпечує дозрівання 86,7% ооцитів корів і 81,5% ооцитів овець. 14. Удосконалено технологію запліднення in vitro ооцитів овець, яка гарантує 63,6% дроблення запліднених яйцеклітин овець та одержання життєздатного молодняку. ПРАКТИЧНІ ПРОПОЗИЦІЇ 1. Видані методичні рекомендації “Інтенсифікація хутрового звірівництва удосконаленням біотехнологічних методів відтворення”, які можуть бути використані у науковій роботі і у практиці звірівництва та в навчальному процесі у ВУЗах. 2. Рекомендується одержувати ембріони норок доімплантаційних стадій для культивування і ембріобіотехнологічних досліджень до 8-го дня розвитку, оскільки в зародках старшого віку розпочинається період ембріональної діапаузи, а ембріони песців – на 12-14–й дні, коли ембріони досягають компактних стадій. 3. Використовувати комплексний гормонально-вітамінний “Препарат для стимуляції тічки у свиноматок” для стимуляції овуляції у самиць норок з відсутністю природного гону шляхом 3-разової ін‘єкції його через 1 добу в загальній кількості 24 ІО ГСЖК, що також сприяє створенню оптимальних умов в матці для розвитку ембріонів, призводить до народження нащадків у неплідних норок. 4. Рекомендується з метою одержання ідентичних близнюків від високопродуктивних корів застосовувати метод проміжного культивування половинок ембріонів з наступним поділом їх на чвертки. Для стимуляції ембріонального розвитку розморожених ембріонів зі зменшеною клітинною масою обґрунтовано використання попередньо культивованих трофобластичних везикулів з 9-10-ти денних розморожених бластоцист у співвідношенні 4 трофобластичні фрагменти на 1 половинку ембріона або клітин ендометрію корів з розрахунку 100 мкл клітинної суспензії на 3-4 половинки в 1 мл культурального середовища. 5. Обґрунтовано використання фідерних моношарів епітеліальних клітин яйцепроводів у in vitro- та клон-технологіях для стимуляції процесів оогенезу і одержання трансферабельних ембріональних клонів тварин. 6. Рекомендується використовувати ”Середовище для дозрівання ооцитів in vitro корів та овець” (ДП №52177А. - МКИ UA 7 А61D19/04. -№2002031913), яке забезпечує одержання ембріонів жуйних з метою інтенсивного відтворення поголів’я за технологією in vitro та відпрацювання окремих етапів клон-технологій. СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ Монографії 1. Буркат В.П., Влізло В.В., Кравців Р.Й., Шаловило С.Г., Мадіч А.В., Шаран М.М., Пасіцький М.Д., Гамота А.А., Мадісон Л.В., Мадісон В.В., Яремчук І.М., Дудчак В.О. Довідник з репродуктивної біотехнології великої рогатої худоби //Львів. –2004. –150с. Брошури 2. Мадіч А.В. Інтенсифікація хутрового звірівництва удосконаленням біотехнологічних методів відтворення. Методичні рекомендації //Інститут біології тварин, Львів. –2003. –30с. Статті у наукових фахових виданнях 3. Мадіч А.В. Культивування та мікроманіпуляції з відтаяними ембріонами корів. //Тваринництво України. –1998. -№3. -С.12-13. 4. Мадіч А.В. Стимуляция раннего эмбрионального развития. //Молочное и мясное скотоводство. –1998. -№2. -С.21-23. 5. Мадич А.В. Применение эффекта электрошока для возобновления межклеточных соединений в химерных эмбрионах коров. //Зоотехния. –1998. -№7. -С.28-29. 6. Мадіч А.В. Доімплантаційний розвиток ранніх ембріонів норок. //Вісник Аграрної науки. –1999. -№1. -С.51-53. 7. Мадіч А.В. Цитологічна і морфологічна характеристика ембріонів норок. //Розведення і генетика тварин. Міжвідомчий тематичний науковий збірник. –Київ: Аграрна наука. –1999. -№31. -С.147-148. 8. Мадіч А.В. Морфологічна якість фолікулярних та яйцепровідних ооцитів песця. //Науково-технічний бюлетень Інституту землеробства і біології тварин УААН: Серія “Фізіологія і біохімія”, Львів. –1999. -Вип.1 (3). -С.223-226. 9. Мадіч А.В. Особливості преімплантаційного ембріогенезу песців. // Розведення і генетика тварин. Міжвідомчий тематичний наук. збірник. – Київ: Аграрна наука. –2000. -№33. -С.70-76. 10. Madich A.V. Forming of embryo-uterine signal in mink at early embryogenesis. //Біологія тварин. –2002. –Т.4. -№1-2. –С.228-235. 11. Мадіч А.В., Шаловило Л.Є. Ідентичні близнюки як додатковий фактор підвищення плодючості. //Тваринництво України.-1992. -№2. -С.24-26. (Дисертант теоретично обґрунтував концепцію, узагальнив результати, оформив роботу до друку). 12. Шаловило С.Г., Мадіч А.В., Бец М.Й., Шаран М.М. Біотехнологія відтворення у скотарстві. //Сільські обрії. –1997. - №10-12. – С.35 (Дисертант теоретично обґрунтував концепцію, узагальнив результати, оформив роботу до друку). 13. Мадіч А. В., Саєнко І.М., Шаловило Л. Є. Розвиток половинок мишачих ембріонів отриманих поділом на мікроманіпуляторі та вручну. //Розведення і генетика тварин: Міжвідомчий тематичний наук. збірник. Київ: Аграрна наука. –1998. -№30. - С.116-119. (Дисертант розробив схему і провів ряд досліджень, узагальнив результати, оформив роботу до друку). 14. Мадіч А.В., Федько М.В. Отримання здорового молодняка норки при застосуванні деяких біотехнологічних прийомів. //Вісник Білоцерківського ДАУ, Біла Церква. -1998. –В.5. –Ч.2. -С.53-55. (Дисертант розробив схему експерименту, особисто провів дослідження, підготував роботу до друку). 15. Мадіч А.В., Шаран М.М., Ігліцький І.І. Особливості хірургії у норок. //Ветеринарна медицина України. –1998. –№11-12. -С.40. (Дисертант брав участь у плануванні і проведенні експерименту, підготував роботу до друку). 16. Шичкін В.П., Мадіч А.В. Застосування новітніх біотехнологій у тваринництві. //Сільські обрії. –1998. -№3. –С.23-24. (Дисертант теоретично обґрунтував концепцію, узагальнив результати, оформив роботу до друку). 17. Мадіч А.В., Шаловило Л.Є. Перші результати трансплантації ембріонів норок в Україні. //Розведення і генетика тварин. Міжвідомчий тематичний науковий збірник. – Київ: Аграрна наука. –1999. -№32. -С.149-150. (Дисертант теоретично обґрунтував схему досліду, провів морфологічні дослідження, узагальнив результати, оформив роботу до друку). 18. Мадіч А.В., Ігліцкий І.І., Шаловило С.Г., Шаловило Л.Є., Дєдова А.І. Експериментальні химери у норок. //Науковий вісник НАУ. Збірник наукових праць, Київ: Національний аграрний університет. - 1999. – Вип.16. – С.121-124. (Дисертант особисто провів експериментальні дослідження з агрегації ембріонів, підготував роботу до друку). 19. Мадіч А.В., Шаловило С.Г. Соціальні проблеми ембріонального клонування. //Тваринництво України. -2000. -№ 3-4. –С.12-14. (Дисертант розробив концепцію, провів теоретичний аналіз досліджень, оформив роботу до друку). 20. Шичкін В.П., Мадіч А.В. Використання та можливості застосування гібридних клітин у репродуктивній біотехнології. //Вісник Полтавського державного сільськогосподарського інституту, Полтава. -2001.-№2-3. –С.10-11. (Дисертант теоретично обґрунтував концепцію, підготував роботу до друку). 21. Мадіч А.В., Гевкан І.І., Чорненький Т.Я., Сливчук Ю.І., Шаловило Л.Є., Ільницька О.М. Використання методу in vitro запліднення ооцитів овець та перші практичні результати трансплантації зигот. //Науково-технічний бюлетень Інституту біології тварин, Львів. –2001. –Вип.1-2. –С.273-276. (Дисертант розробив схему і особисто провів ряд досліджень, узагальнив результати, підготовив роботу до друку). 22. Мадіч А., Сливчук Ю., Чорненький Т., Гевкан І., Шаран М., Муравський М. Вона називається Діана. Одержання життєздатного молодняку від хірургічної трансплантації отриманих in vitro ембріонів овець. //Тваринництво України. –2002. -№10. –С.12-14. (Дисертант розробив схему експерименту, особисто провів ряд досліджень, узагальнив результати, підготував роботу до друку). 23. Мадіч А.В., Яремчук І.М. Життєздатність та компетенція до подальшого розвитку вітрифікованих ооцитів норок. //Вісник Сумського національного аграрного університету: Серія Тваринництво, Суми. –2002. –Вип.6. –С.426-430. (Дисертант розробив схему експерименту, особисто провів ряд досліджень, узагальнив результати, підготував роботу до друку). 24. Андрушко О.Б., Мадіч А.В., Шаловило С.Г. Удосконалення методики капацитації сперміїв та запліднення яйцеклітин в умовах in vitro. //Науково-технічний бюлетень Інституту біології тварин. –Львів. –2002. –Вип.4.–№1. –С.19-24. (Дисертант брав участь у підготовці і проведенні експерименту, оформленні роботи до друку). 25. Мадіч А.В., Андрушко О.Б., Шаловило С.Г., Гевкан І.І.. Розгоні І.І.. Шавкун В.Ю. Гормональна стимуляція репродуктивної функції у норок //Біологія тварин. –2003. –Т.5. -№1-2. –С.320-329. (Дисертант особисто планував і проводив дослідження, узагальнив результати, підготував роботу до друку). 26. Федорова С.В., Мадіч А.В. Вплив інсуліну та епідермального фактора росту на проліферацію культури фідерних клітин та дозрівання ооцитів корів in vitro //Науково- технічний бюлетень Інституту тваринництва, Харків. –2003. -№85. –С.123-126. (Дисертант розробив схему досліджень, визначав концентрацію клітин, провів статистичну обробку даних та узагальнення результатів). 27. Ігліцький І.І., Дудчак І.П., Надопта (Мадіч) А.В. Хірургічна пересадка ранніх ембріонів у норок //Сільський господар. –2003. -№5-6. –С.20. (Дисертант брав участь у плануванні і проведенні експерименту, особисто виконав хірургічну трансплантацію ембріонів норок). Патенти 28. Деклараційний патент на винахід 52177 А Україна, МКИ UA 7 А61D19/04. Середовище для дозрівання in vitro ооцитів корів та овець. І.І. Гевкан, А.В. Мадіч, Т.Я. Чорненький, І.І. Розгоні (Україна); Держ. Деп. Інтел. Власності. -№2002031913; Заявл. 07.03.02; Опубл. 16.12.02; Бюл. №12. –3с. Статті у наукових журналах і збірниках 29. Мадіч А.В. Ооцит - кумулюсні комплекси корів як тест-системи функціональної активності фідерних клітин. //Вісник Львівського університету. Серія Біологічна. –2003. –Вип..32. –С.186-194. 30. Мадіч А.В. Додатковий метод визначення якості сперми самців норок. //Аграрна наука – виробництву. Науково-інформаційний бюлетень завершених наукових розробок. –Київ: Аграрна наука. –2001. –№1. –С.19. 31. Мадіч А.В., Ігліцький І.І., Гамота А.А. Метод загальної анестезії норок і песців. //Аграрна наука – виробництву. Науково-інформаційний бюлетень завершених наукових розробок. – Київ: Аграрна наука. -2001. -№-3. -С.21. (Дисертант брав участь у розробці методу, оформив роботу до друку). Тези конференцій і симпозіумів 32. Мадіч А.В. Методичні підходи для одержання химерних ембріонів корів інєкційним способом. //”Сучасні проблеми ветеринарної медицини, зооінженерії та технологій продуктів тваринництва”. Збірник матеріалів наук.-практ. конференції, Львів: ЛАВМ ім. С.З. Гжицького. –1997. -С. 521-523. 33. Мадіч А.В. Можливість застосування культури трофобластичних кластерів для підвищення життєздатності поділених морул. //“Використання трансплантації ембріонів в селекції і відтворенні сільськогосподарських тварин”. Матеріали міжнародної наук.-вир. конференції; Київ, Асканія-Нова: УААН. –1997. -С.51-52. 34. Madich A. Chinchilla laniqer: aspiration of ripened preovulatory follicles and morphology of oocytes. //“Animal Sciences in the XXI century”. Proc. of 1-st Polish –Ukrainian Scientific Conference. –Poland, Krakow. –2001. –P.121-123. 35. Мадіч А.В., Саєнко І.М. Вивчення впливу мікрохірургії на цитоструктуру ранніх ембріоннів мишок. //“Біотехнологія в розведенні і відтворенні нових генотипів сільськогосподарських тварин”. Матеріали наук.–практ. конф., Харків. –1993. -С.132-133. 36. Саенко И.Н., Мадич А.В. Сравнительная характеристика приспособлений для разделения ембрионов. //“Біотехнологія в розведенні і відтворенні нових генотипів сільськогосподарських тварин”. Матеріали наук.–практ. конф, Харків.– 1993. -С.131. 37. Мадіч А.В., Саєнко І.М. Порівняльна характеристика техніки створення агрегаційних та інєкційних химер від ембріонів різних порід ВРХ. //“Біотехнологія в розведенні і відтворенні нових генотипів сільськогосподарських тварин”. Матеріали наук.–практ. конференції, Харків. –1993. -С.134. 38. Саєнко І.М. Мадіч А.В., Шаловило Л.Є. Порівняльна характеристика розвитку in vitro половинок мишачих ембріонів, одержаних різними методами бісекції. //”Сучасні проблеми ветеринарної медицини, зооінженерії та технологій продуктів тваринництва”. Збірник матеріалів наук.-практ. конференції, Львів: ЛАВМ ім. С.З.Гжицького. –1997. -С.385-387. 39. Мадіч А.В. Саєнко І.М., Шаловило Л.Є. Оцінка розвитку поділених ембріонів корів з використанням культуральної системи in vitro. //“Використання трансплантації ембріонів в селекції і відтворенні сільськогосподарських тварин”. Матеріали міжнародної наук.-вир. конференції; Київ, Асканія-Нова: УААН. –1997. -С.53-54. 40. Мадіч А.В., Шаловило Л.Є. Визначення якості сперми самців норок за інтенсивністю її дихання. //”Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико –селекційних дослідженнях”. Збірник матеріалів 2-ї Міжнародної конференції, Одеса. –Київ: Аграрна наука. –1998. -С.118-119. 41. Мадич А.В., Гамота А.А. Использование кетамина и ксилазина в эмбриогенетических экспериментах на норках и песцах. //”Проблеми ветеринарного обслуговування дрібних домашніх тварин”. Збірник матеріалів 4-ої міжнародної наук. – практ. конференції, Київ. –1999. -С.70-74. 42. Madich A., Hevkan I., Chornenky T., Slyvchuk Yu. Effect of Various Hormonal Preparations on proliferation and Functional Activity of Feeder Cells. //“Molecular Mechanisms of Cell Activation: Biological Signals And Their Target Enzymes”. Proc. of 4-th Parnas Conference –Poland: Wroclaw. – September, 2002. –P.65. 43. Мадіч А.В., Гевкан І.І.. Чорненький Т.Я., Сливчук Ю.І. Вплив фолікотропіна, естрадіола та преднізолона на проліферативний ріст та функціональну активність фідерних клітин. //Мат. міжн. конф. присвяч. пам‘яті проф. Шостаковської І.В. –Львів. –2002. –С.102. АНОТАЦІЯ Мадіч А.В. Ранній ембріональний розвиток тварин in vivo і in vitro та біотехнологічні фактори його регуляції.- Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.20.- біотехнологія. – Білоцерківський державний аграрний університет, Біла Церква, 2004. Дисертацію присвячено питанням стимуляції раннього ембріонального розвитку тварин in vivo і in vitro та підвищення ефективності ембріобіотехнологічних методів для розуміння механізмів дозрівання, запліднення ооцитів, розвитку химерних ембріональних конструкцій і трансферабельних ембріонів тварин з групи бластомерів. Це наукове завдання вирішене шляхом теоретичного і практичного обґрунтування можливості створення in vitro таких умов, які були б максимально наближені до специфічного маткового середовища на ранніх стадіях ембріогенезу, і використання таких факторів, складників, середовищ, які здатні стимулювати ооцитарний і ембріональний розвиток. Розроблено і запропоновано морфологічну шкалу оцінки доімплантаційних ембріонів та спосіб гормональної корекції відтворної функції норок, досліджено закономірності і видові особливості ембріонального розвитку норок і песців. Удосконалено методи одержання химерних конструкцій з ембріонів синхронних і асинхронних стадій у норок із застосуванням електростимуляції агрегації мембран чужорідних бластомерів у корів. Удосконалений і дістав подальший розвиток метод мікроманіпуляцій для одержання чверток деконсервованих морул і нащадків після їх трансплантації. Розроблено і експериментально перевірено “Середовище для дозрівання ооцитів корів і овець in vitro”, яке забезпечує одержання дозрілих, здатних до запліднення in vitro ооцитів тварин. Ефективність запропонованого середовища підтверджена одержанням ембріонів овець поза організмом та життєздатного приплоду від їх трансплантації. Ключові слова: норки, песці, шиншили, корови, вівці, ооцити, ембріони, біотехнологічні методи, фідерні клітини, дозрівання in vitro. АННОТАЦИЯ Мадич А.В. Раннее эмбриональное развитие животных in vivo и in vitro и биотехнологические факторы его регуляции.- Рукопись. Дисертация на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук за специальностью 03.00.20.- биотехнология. – Белоцерковский государственный аграрный университет, Белая Церковь, 2004. Диссертация посвящена изучению вопросов стимуляции раннего эмбрионального развития животных in vivo и in vitro и повышению эффективности эмбриобиотехнологических методов для раскрытия механизмов дозревания, оплодотворения ооцитов, развития химерных эмбриональных конструкций и трансферабельных эмбрионов животных с группы бластомеров. Эта научная проблема решена благодаря теоретическому и практическому обоснованию возможности создания in vitro таких условий, которые были бы максимально приближены к специфической среде репродуктивных органов самок на ранних этапах эмбриогенеза и использования таких факторов, питательных сред и добавок, которые способны стимулировать ооцитарное и эмбриональное развитие. Представлены новые данные о закономерностях и видовых особенностях доимплантационного развития пушных животных клеточного содержания, которые в связи з многоплодностью могут быть успешно использованы как модельные животные в различных биологических исследованиях. В частности установлено, что латентный период эмбриональной диапаузы у норок начинается на 8-й день после оплодотворения и сопровождается характерными изменениями в морфоструктуре реэкспандированных бластоцист, изучены механизмы первичной дифференциации бластомеров, разработана морфологическая шкала оценки эмбрионов норок доимплантационных стадий. Сформулирована и эспериментально доказана концепция внутренних причин ранней эмбриональной смертности пушных животных, которая основана на принципах биологического “старения” ооцитов норок и смермиев песцов. Разработан способ гормональной коррекции овуляторной функции у норок комплексным гормонально-витаминным “Препаратом для стимуляции течки у свиноматок” в суммарной дозе 24 ИЕ ГСЖК по 3-дневной схеме, что позволяет увеличить число покрытых самок маточного стада и получить приплод от бесплодных норок в количестве 2,5 потомка на 1 гнездо. Установлено, что интенсивность секреции специфических белков репродуктивными органами норок находиться в прямой связи с количеством эмбрионов и стадией их развития. Одновременное развитие значительного числа эмбрионов и процесс их первичной дифференциации сопровождаются присутствием в яйцепроводах и матке низкомолекулярных белков с Мм в диапазоне 7-10 кДа и 16-24 кДа, начало латентного периода совпадает с наличием в них специфичного белка с Мм 33-35 кДа. Впервые в Украине получен молодняк от трансплантации интактных и химерных эмбрионов норок, агрегированных с зародышей синхронных и асинхронных стадий (приживляемость 16,7% и 37,5% соответственно); установлены параметры электростимуляции внутризональной адгезии мембран чужеродных бластомеров в химерных эмбрионах коров, получены телята-мозаики. Усовершенствован и получил дальнейшее развитие метод микроманипуляций, рекомендуемый для получения эмбрионов 2-й генерации с половинок розмороженных морул коров, которые способны к воссозданию морфоструктуры и развитию in vivo после повторной микрохирургической бисекции на четвертинки благодаря ко-культивированию их с фидерными клетками эмбрионального (трофобласт) и маткового (ендометрий) происхождения. Этот прийом позволяет 27,3% половинкам деконсервированых эмбрионов коров оставаться жизнеспособными в культуре на протяжении 72 часов, обеспечивает 18,8% имплантации четвертинок и получение груп идентичных животных. Разработаны научно-обоснованные подходы к регуляции интесивности роста фидерных клеточных культур, которые связаны с активированием эндокринного механизма клеточной пролиферации. Это дало возможность получить клеточные популяции эпителия яйцепроводов коров, которые способны увеличивать свой пролиферативный рост в 5-5,5 раза от 2,0 - 2,5 млн. до 13,2(0,57 (р<0,001); 14,02 (0,85 (p<0,01) и 12,41 ( 0,33 (p<0,001) млн. /мл; а клеток эндометрия в 3 раза от 1,8 – 1,9 млн. до 5,94(0,52 (р<0,01) и 8,34(0,37 млн. /мл. Установлено, что первичная культура фидерных клеток маткового происхождения стимулирует процеси дозревання in vitro ооцитов коров, которые в свою очередь могут быть тест-системами функциональной активности фидерных культур. Ко-культивирование ОКК коров с фидерными клетками под действием ФСГ, эстрадиола-17? и преднизолона повышает морфологическое качество и количество способных к оплодотворению ооцитов. В присутствии преднизолона, в концентрации 0,2-0,6 мкг/мл, 83,3% (р<0,05) и 86,7% (р<0,001) ооцитов на моношаре эпителиальных клеток яйцепроводов, а так же 53,3% и 63,3% ооцитов на моношаре клеток эндометрия коров приобретают закрытую сферу лучистого венца и отличаются высоким уровнем экспандации кумулюса за счет чего достигается их дозревание in vitro. Разработана и експериментально проверена эффективная “Среда для дозревания ооцитов коров и овец in vitro ”, которая обеспечивает получение морфологически качественных, дозревших ооцитов, способных к оплодотворению и развитию в эмбрионы трансферабельных стадий. Научная новизна подтверджена решением о выдаче декларационного патента 52177А. Впервые в Украине получены эмбрионы овец от дозревания и оплодотворения ооцитов in vitro и здоровый приплод от трансплантации таких эмбрионов. Разработаные способы высокоэффективны и доступны для использования в селекции животных. Ключевые слова: норки, песцы, шиншиллы, коровы, овцы, ооциты, эмбрионы, биотехнологические методы, фидерные клетки, дозревание in vitro. ANNOTATION Madich A.V. Early embryo development in vivo also in vitro and biotechnological factors for its regulation. – Manuscript. Thesis for a scientific degree the doctor of agricultural sciences to speciality 03.00.20. – biotechnology. – Bilotserkivskiy State Agricultural University, Bila Tserkva, 2004. Thesis is devoted to the inssues of the stimulation for early embryo development in vivo also in vitro and to increase of the efficient embryo biotechnological methods for realizing of oocytes maturation and fertilization mechanisms, the development of chimeric embryo constructions and blastomeric groups to transferable embryos. The scientific problem decided by theoretic and practice basis about creation such conditions that will be maximum approach to specific uterum environment and elaboration the factors, ingredients, mediums that promote to stimulation of the oo- and embryogenesis. There was working out and proposed the morphological scale for evaluation preimplantation embryos and method of hormonal correct reproductive function in mink, was researching the regularities and species peculiarities embryo development in mink and polar fox. It had been improved the method for production of chimeric embryos from synchronic and asyncronic zygotes in mink and with electrostimulation in bovine. It had been improved and received further progress the method of micromanipulation for production quarters from thaw outed morulae and calves after their transfer. Worked and experimental examinated of medium for maturation oocytes bovine and sheep in vitro guarantees the receipt of maturated oocytes with ability to further fertilization in vitro. The effective of the medium was acknowledged by receipt of sheep embryos in vitro and viable offspring. Key words: mink, polar fox, chinchilla, cows, sheep, oocytes, embryos, biotechnological methods, feeder cells, in vitro maturation. __________________________________________________________________ Підписано до друку 15.03.2004 р. Формат 60х90/16. Ум. друк. арк. 2,0. Обл.-вид. арк. 2,0. Тираж 100. Зам.405. Друк ПП “Нові перспективи” Львів-2004 PAGE 1

Похожие записи