КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Куцоконь Наталія Костянтинівна

УДК 575.224(577.34

Радіаційна індукція множинних хромосомних пошкоджень у рослин

03.00.01 – радіобіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті клітинної біології і генетичної інженерії
НАН України.

Науковий керівник

доктор біологічних наук, професор, академік НАН України

Гродзинський Дмитро Михайлович

Інститут клітинної біології і генетичної інженерії НАН України,

завідувач відділу біофізики та радіобіології

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор, академік УААН

Гудков Ігор Миколайович

Національний аграрний університет,

завідувач кафедри радіобіології та радіоекології

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Дьоміна Емілія Анатоліївна

Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.
Р.Є.Кавецького НАН України,

провідний науковий співробітник відділу радіобіології

Провідна установа: Інститут гідробіології НАН України, м. Київ

Захист відбудеться “ 22 ” листопада 2004 р. о 14 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного
університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул. акад.
Глушкова, 2, біологічний факультет, ауд. 433.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного
університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул.
Володимирська, 58.

Автореферат розісланий “ 19 ” жовтня 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Андрійчук Т.Р.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Важливим негативним проявом інтенсифікації
мутаційного процесу, спричиненого забрудненням довкілля, є хромосомна
нестабільність, роль якої в розвитку злоякісних новоутворень, процесах
старіння, появі вроджених вад розвитку є значною [Britt, 1996, Бариляк,
Рушковський, 2000]. В зв’язку з цим вивчення хромосомної нестабільності
є актуальною проблемою не тільки радіобіології, але й
загальнобіологічною. Одним з недостатньо вивчених проявів хромосомної
нестабільності на клітинному рівні є феномен мультиаберантних клітин
(МАК). В залежності від методичних підходів визначають різну кількість
аберацій в мультиаберантній клітині. Подібні клітини ще називають
“навантаженими”, rogue cells або клітинами з множинними абераціями
хромосом. І хоча, як правило, йдеться про один і той же феномен, подібні
розбіжності свідчать про недостатню вивченість даного питання.

Вперше детальну увагу клітинам з множинними абераціями хромосом було
приділено на початку 70 рр. в дослідженнях, проведених на лімфоцитах
американських індіанців, де було виявлено клітини з багатьма абераціями
[Neel et. al., 1992]. Пізніше МАК виявляли як у людей, умовно віднесених
до контрольних груп, так і в осіб, що зазнали впливу мутагенних чинників
радіаційної чи хімічної природи [Пилинская и др., 1994, Lazutka et al.,
1999, Чеботарев, 2002, Цыганок, Бездробная, 2003]. Але нам не вдалося
знайти робіт, де чітко було б показано зростання частоти
мультиаберантних клітин з дозою опромінення. Індукцію МАК не завжди
легко пояснити навіть тоді, коли йдеться про людей, що зазнали дії
опромінення чи іншого мутагену, а причини появи таких клітин у осіб,
віднесених до контрольних груп ще більш загадкові. Сьогодні ще не існує
чіткого експериментального підтвердження природи індуктора
мультиаберантних клітин, проте висувається ряд гіпотез, найбільш
визнаними серед яких є гіпотези про вірусне походження МАК [Neel et al.,
1996] та їх індукцію ?-випромінювачами [Sevankaev et al., 1993, Ривкинд
и др., 1996]. Але ці припущення не завжди добре пояснюють природу
мультиаберантних клітин, тому складається враження, що останні “можуть
виникати внаслідок комбінації рідкісних подій … невизначеної природи”
[Bochkov, Katosova, 1994].

Незважаючи на те, що в пошкоджених клітинах існують механізми, які
унеможливлюють їх поділи, деяка частина МАК все ж здатна ділитися. Це
робить даний феномен важливим для процесів онко-, терато- і мутагенезу
та еволюційного розвитку [Neel et al., 1992, Митрофанов, 1994].
Підтвердженням цьому є виявлений зв’язок між підвищеним рівнем МАК та
частотою злоякісних новоутворень у осіб різних категорій населення
[Zaire et al., 1997, Laghi et al., 1999], а також підвищений рівень
хромосомних аберацій інших типів у осіб з МАК [Mustonen et al., 1998,
Domracheva et al., 2000].

Практично всі дослідження феномена МАК було проведено з використанням
культури лімфоцитів периферійної крові людини, де показано, що частота
МАК, як правило, не перевищує 0,05%, і лише в деяких випадках вона є на
порядок вищою [Neel et. al., 1992, Пилинская и др., 1992]. Оскільки в
популяційних дослідженнях мультиаберантні клітини виявляються дуже
рідко, кількісно оцінити їх появу складно. Використання тест-системи
насіння рослин зробить можливим дослідження закономірностей появи МАК
при дії іонізуючих випромінювань та інших чинників мутаційного процесу.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота
виконувалась у рамках НДР “Хронічне опромінення рослин як фактор
формування нестабільності” (N державної реєстрації 0101U000394, шифр
теми 02.12/5590). Разом з тим було використано дані по НДР, що
проводилися в лабораторії мутагенезу і антимутагенезу наукового центру
медичної генетики МОЗ і АМН України( “Еколого-генетична оцінка зон
рекреації м. Києва” (N державної реєстрації 0198U005125, шифр теми ВН
6.23.98), де здобувач була відповідальним виконавцем, та “Дослідження
профілактичної дії фолієвої кислоти щодо вроджених вад розвитку нервової
трубки у новонароджених” (№ державної реєстрації 0103U005715, шифр теми
369).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи полягала у вивченні особливостей
радіаційної індукції множинних хромосомних пошкоджень в рослинній
тест-системі цибулі звичайної (Allium cepa L.). Відповідно до мети
ставили такі задачі:

1. Проаналізувати цитогенетичні показники та частоту клітин з множинними
абераціями в Allium cepa L., викликані дією ?-випромінювання.

2. Дослідити вплив ?-випромінювань 241Am на цитогенетичні показники
Allium cepa L.

3. Провести порівняльний аналіз дії радіаційних та хімічних факторів на
цитогенетичні показники та появу клітин з множинними абераціями в Allium
cepa L.

4. Дослідити видові особливості цитогенетичних змін при спонтанному
старінні насіння в клітинах Allium cepa L. та Allium fistulosum L.

Об’єкт дослідження – індукція клітин з множинними абераціями хромосом у
рослин.

Предмет дослідження – вихід клітин з множинними абераціями хромосом при
дії іонізуючих випромінювань.

Методи дослідження: радіобіологічні, цитогенетичні (анафазний аналіз
хромосомних аберацій), статистична обробка одержаних результатів,
математичний аналіз поклітинного розподілу аберацій.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проаналізовано залежність
виходу множинних хромосомних аберацій, включаючи складні невизначені,
від дози

?-опромінення у рослин та показано, що процес утворення мультиаберантних
клітин не відбувається за законом випадкових подій; додаткові аберації
з’являються у вже пошкоджених клітинах. Це вказує на те, що поява однієї
аберації в клітині може сприяти появі інших пошкоджень в ній.
Запропоновано припущення про залежність частоти аберантних клітин та
кількості аберацій на аберантну клітину від мутагенного навантаження,
згідно якого значимо більша порівняно з контролем кількість клітин з
множинними абераціями хромосом індукується на фоні високої частоти
аберантних клітин. Зважаючи на спільність процесів утворення хромосомних
аберацій в еукаріот, це припущення пояснює відсутність чітких
залежностей між дозою опромінення та появою МАК, що виявляється в
популяційних дослідженнях різними авторами. Вперше при порівнянні
динаміки цитогенетичних показників двох видів Allium показано, що
старіння насіння цибулі батун (A. fistulosum) супроводжується швидким
наростанням частоти клітин з абераціями та появою мультиаберантних
клітин, в той час як у A. cepa виявлено більш повільне наростання
мутаційного процесу, для якого поява МАК не характерна

Практичне значення одержаних результатів. Показано доцільність
використання рослинної тест-системи, зокрема Allium-тесту, для вивчення
закономірностей появи мультиаберантних клітин. Отримані результати, які
свідчать про низький спонтанний рівень мультиаберантних клітин у Allium
cepa L., обгрунтовують використання даної характеристики для оцінки
генотоксичного потенціалу мутагенних чинників різної природи, зокрема,
значних доз ?-опромінення. Виявлений у рослин низький спонтанний рівень
МАК (на рівні частоти мультиаберантних клітин у ссавців) може свідчити
про спільність процесів індукції мультиаберантних клітин у різних видів
та можливість дослідження феномену як загальнобіологічного явища.

Отримані дані можуть бути використані у навчальному процесі при
викладанні курсів “Радіобіологія”, “Радіаційний мутагенез”,
“Цитогенетика”.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійним
дослідженням здобувача. Автором особисто поставлено всі експерименти,
проведено їх обробку та інтерпретацію, проаналізовано літературу,
написано наукові статті. Спільно з науковим керівником проведено вибір
напрямку досліджень та обговорення результатів роботи.

Автор висловлює щиру подяку завідувачу лабораторії біофізики сигнальних
систем Інституту клітинної біології та генетичної інженерії Рашидову
Н.М. за підтримку та допомогу під час виконання роботи, директору
наукового центру медичної генетики АМН України Бариляку І.Р. та
пров.н.с. Неумержицькій Л.В. за сприяння у проведенні частини
експериментів.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертаційної
роботи було представлено на міжнародних конференціях “European
Cytogenetic Conference” (Відень, 1999, Париж, 2002), “Генетические
последствия чрезвычайных радиационных ситуаций” (Москва, 2002), на
міжнародних симпозіумах “5th, 6th International Symposium and Exhibition
on Environmental Contamination in Central and Eastern Europe (Прага,
2000, 2003), ІІІ з’їзді з радіаційних досліджень (Київ, 2003), щорічній
науковій конференції Інституту ядерних досліджень (Київ, 2001).

Публікації. Основні результати досліджень викладені в 9 статтях та 7
тезах конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 160
сторінках машинописного тексту, складається із вступу, огляду
літератури, опису матеріалів та методики дослідження, результатів
досліджень та їх обговорення, узагальнення отриманих даних, висновків та
списку використаних джерел літератури, який включає 247 назв. Текст
дисертації ілюстрований 28 рисунками та 19 таблицями.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Для вивчення закономірностей індукції мультиаберантних клітин
використовували радіочутливу тест-систему клітин кореневої меристеми
цибулі. Експерименти проводили з використанням насіння Allium cepa L.
сорту Стригунівський, отриманому на Київській дослідній станції
Інституту садівництва і овочівництва УААН та Allium fistulosum L. сорту
Майський. Більшість дослідів було проведено на одній і тій же партії
насіння A. cepa (репродукції 2000 р.), що дозволило нам провести
порівняння ефектів без обмежень, пов’язаних з особливостями
мутабільності у насіння, отриманого за різних умов формування.

Повітряно-сухе насіння A. cepa, опромінювали в діапазоні високих (50 –
300 Гр) та нижчих (1 – 40 Гр) доз. (-Опромінення проводили від джерела
60Со на установці “Исследователь” Інституту клітинної біології і
генетичної інженерії НАН України. Потужність дози складала 0,035 Гр/с.
Для вивчення закономірностей формування множинних пошкоджень хромосом
під впливом ?-випромінювань насіння A. cepa пророщували в водних
розчинах хлориду 241Am концентрацій 1,5·10-6 – 1,5·10-4 мг/л, активності
яких становили 8,75·104 – 8,75·106 Бк/л. Визначення активності 241Am у
зразках проводили в Інституті ядерних досліджень НАН України.

Оскільки відомо, що клітини з множинними хромосомними абераціями можуть
виникати не тільки в ході радіаційного мутагенезу, але і під дією інших
мутагенних факторів, проводили порівняння закономірностей їх індукції
під впливом хімічного мутагену тіофосфаміду та старіння насіння як
біологічного мутагенного чинника. Для цього насіння A. cepa протягом
всього часу експерименту пророщували в водних розчинах тіофосфаміду
концентрацій 1–40 мг/л. Динаміку вікових змін цитогенетичних показників
при спонтанному мутаційному процесі вивчали на двох видах роду Allium:
A. cepa та A. fistulosum, пророщуючи насіння через 7 – 34 та 2 – 33,3
місяців відповідно після його збирання. Цибулю батун було використано у
зв’язку з її добре відомою високою спонтанною мутабільністю [Лазаренко,
1999]. Вивчали дію радіопротектора на вихід спонтанних та індукованих
хімічним мутагеном (тіофосфамід у концентрації 10 мг/л) аберацій у A.
cepa, в тому числі на характер розподілу хромосомних аберацій і вихід
множинних пошкоджень хромосом. Як протектор було вибрано фолієву
кислоту, дію якої вивчали, пророщуючи насіння в її водних розчинах в
концентраціях 2,5, 25 та 50 мг/л за різних експериментальних умов.

З метою визначення частоти мультиаберантних клітин у Allium cepa L. в
умовах проростання, близьких до природного середовища, насіння
пророщували в зразках води з водойм. Зразки з природних водойм м. Києва
відбирали на території 11 зон рекреації, які умовно можна вважати
слабкозабрудненими, оскільки дані території є задовільними за
санітарно-гігієнічними показниками.

В усіх дослідах контролем було насіння, яке проростало за тих же умов,
що й експериментальне, але без впливу мутагенного чинника. Пророщування
насіння проводили в термостаті при температурах 24–27? С (залежно від
досліду). Через 72 години після початку замочування визначали процент
пророслого насіння; проростки довжиною 5–10 мм фіксували в фіксаторі
Кларка. Для мікроскопічного аналізу готували тимчасові давлені препарати
меристеми коренів, пофарбовані оцеторсеїном за загальновизнаними
методиками [Паушева, 1988].

Цитогенетичний аналіз проводили анафазним методом. Обчислювали частоту
аберантних анафаз (ЧАА) як відсоток анафаз з абераціями, середню
кількість аберацій на аберантну клітину, поклітинний розподіл кількості
аберацій та мітотичний індекс на 72 годину з моменту початку проростання
насіння.. В клітинах, що містили аберації (рис. 1), обчислювали показник
середньої кількості аберацій на аберантну клітину. Було вирахувано
частку клітин, які містили 0, 1, 2, 3, 4 та 5 аберацій. Клітини, які
містили значну, але невизначену кількість хромосомних перебудов,
виділили в окремий клас клітин з “множинними невизначеними абераціями“.
При обчисленні середньої кількості аберацій на аберантну клітину всі
клітини з множинними невизначеними абераціями та ті, які містили більше
5 аберацій умовно відносили до класу з 5 абераціями. Такий
підхід, хоч він, можливо, і занижує рівень кількості

Рис. 1. Хромосомні аберації в клітинах кореневої меристеми A. cepa L.: 1
– одинарний фрагмент; 2 – два одинарні фрагменти; 3 – парний міст із
фрагментами; 4 – одинарний міст; 5 – два одинарні мости; 6 – а) одинарні
міст та фрагмент, б) два одинарні мости; 7 – невизначена кількість
мостів та фрагменти; 8 – парний фрагмент; 9 – хроматидне кільце.
Фарбування ацеторсеїном, зб. х 400.

аберацій на аберантну клітину, було використано тому, що
точна ідентифікація пошкоджень в анафазній клітині, як правило,
значно ускладнюється зі зростанням кількості аберацій в ній і стає
практично неможливою, коли їх більше ніж 5.

Встановлені експериментально розподіли аберацій по клітинах порівнювали
з очікуваними частотами, виходячи з розподілів Пуассона, геометричного
та від’ємного біномного (Корн, Корн, 1974]. Як відомо, розподіл Пуассона
описує закони рідкісних подій, геометричний та від’ємний біномний –
процеси, які включають одну чи кілька стадій взаємодії мутагену з
хромосомою (Chebotarev, Kosyakova, 2002(.

Для кількісної оцінки розбіжностей між виявленою в досліді частотою
клітин з множинними абераціями та частотою, очікуваною в розподілі
Пуассона, було введено коефіцієнт відхилення від розподілу Пуассона К=
Е(3)/Р(3), де Е(3) – експериментально виявлена частота, Р(3) – очікувана
в розподілі Пуассона частота клітин з багатьма абераціями, до яких
віднесено всі клітини, що містили три та більше хромосомних аберацій.
Математичну обробку даних проводили згідно загальновизнаних методик
[Лакин, 1980]. Достовірність відмінностей між дослідними варіантами і
контролем, а також перевірку гіпотез про тип розподілу здійснювали за
методом (2. Додатковим критерієм для оцінки відповідності розподілу
Пуассона використовували властивість останнього, за якою дисперсія
вибірки s2 повинна дорівнювати середньому розподілу m. При s2/ m ? 1
вважали, що виявлений розподіл відповідав розподілу Пуассона. Для
обробки отриманих результатів було створено базу даних клітин з
хромосомними абераціями в програмі Excel.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Цитогенетичні показники та частота клітин з множинними абераціями в
Allium cepa L. при ?-опроміненні. Під дією гострого ?-опромінення
насіння в клітинах проростків цибулі виявлено значні цитогенетичні
ефекти. При опроміненні в дозі 5 Гр і вище спостерігали достовірне
зростання частки клітин з абераціями (р<0,05) (рис. 2), при цьому опромінення в дозах 200 – 300 Гр індукувало кількість аберантних клітин, близьку до 100 %. В той же час, зміни кількості аберацій на аберантну клітину з дозою мали інший характер, не були такими значними, і достовірно відрізнялись від контролю лише при опроміненні насіння в діапазоні вищих доз (50 – 300 Гр). Характерною особливістю цитогенетичної дії опромінення у дозах 40 Гр і вище була поява клітин з невизначеними множинними абераціями (рис. 3). При ?-опроміненні насіння цибулі в дозах 1–30 Гр виявлено лише дві клітини з більш ніж 5 абераціями. Зі збільшенням дози ?-опромінення частка клітин з множинними невизначеними абераціями зростала і досягла 83,3 % від загальної кількості проаналізованих анафаз при дозі опромінення 250 Гр. Особливо значний “стрибок” у збільшенні кількості клітин з множинними невизначеними абераціями до 63,8 % серед аберантних клітин виявили при опроміненні насіння в дозі 150 Гр, в той час як попередня доза 100 Гр індукували появу лише 11,2 % мультиаберантних клітин (рис.4). Цікаво, що при цьому спостерігали майже однакову кількість клітин з абераціями. Рис. 2. Вплив ?-опромінення насіння у діапазоні доз 1– 40 Гр (А) та 50 – 300 Гр (Б) на утворення хромосомних аберацій в A. cepa.1 – частота аберантних анафаз( 2 – кількість аберацій на аберантну клітину. Рис. 4. Частота клітин з множинними невизначеними абераціями (МНА) серед загальної кількості аберантних клітин при ?-опроміненні насіння Allium cepa. Рис. 3. Клітини кореневої меристеми Allium cepa: 1 – нормальна анафаза; 2 – 4 – анафази з невизначеними множинними абераціями, індуковані (-опроміненням. Фарбування ацеторсеїном, зб. х 400. Для з’ясування закономірностей утворення множинних хромосомних аберацій при (-опроміненні було проведено порівняння експериментальних даних поклітинного розподілу аберацій з теоретичними розподілами. Результати показали, що за критерієм (2 виявлені частоти не відповідають теоретичним в жодному з розподілів (табл. 1). Порівняння значень середнього розподілу та дисперсії вибірки так само показало невідповідність розподілу Пуассона за всіх доз опромінення, крім однієї, де насіння опромінювали в дозі 100 Гр. Але навіть у цьому випадку, як і за інших доз опромінення, виявлено, що частка клітин з трьома та більшим числом аберацій, перевищувала очікувану в розподілі Пуассона. Про це свідчать значення коефіцієнта відхилення емпіричної частоти мультиаберантних клітин від розподілу Пуассона, який перевищував одиницю в усіх випадках, крім варіанту, де опромінення проводили в найменшій дозі 1 Гр. З табл. 1 видно, що в діапазоні нижчих доз коефіцієнт відхилення зменшується із зростанням дози. Однак, тут високі чисельні значення коефіцієнтів відхилення не свідчать про сильне зростання частоти клітин з багатьма абераціями. Дійсно, якщо теоретично очікувана частота появи клітин з множинними абераціями є набагато меншою одиниці, а в досліді виявлено хоча б одну таку клітину, то при діленні отримаємо високе значення коефіцієнта відхилення. В діапазоні високих доз (150 – 300 Гр) коефіцієнт відхилення не виявив залежності від дози, його чисельні значення показали, що кількість клітин з множинними пошкодженнями хромосом перевищувала очікувану у розподілі Пуассона приблизно в 1,5 рази. Це може свідчити про те, що поява кількох аберацій в клітині скоріше за все не є простим накопиченням випадкових подій. На нашу думку, формування кількох пошкоджень в одній і тій же клітині є взаємозалежними явищами; це й призводить до зростання чисельності клітин з багатьма абераціями. За класичною теорією мішені розподіл пошкоджень в клітинах при дії іонізуючих випромінювань повинен підлягати пуассоновому закону [Ли, 1963]. Насправді, пуассоновому розподілу може відповідати розподіл первинних розривів ДНК, які викликає ?-опромінення, але від первинного розриву ДНК до формування видимої хромосомної аберації проходить багато етапів, що можуть модифікувати первинну картину пошкоджень. Тому, як показали наші дослідження і роботи інших авторів [Лучник, 1968, Царапкин, 1972, Гераськин и др., 1995], не завжди розподіл хромосомних аберацій в опромінених клітинах відповідає розподілу Пуассона, що може обумовлюватися порушенням репараційних процесів в клітинах, які зазнали значних пошкоджень. Це призводить до появи великої кількості клітин з множинними хромосомними пошкодженнями, про що свідчать отримані нами високі значення середньої кількості аберацій на аберантну клітину при ?-опроміненні насіння в високих дозах. Результати нашого дослідження показують той же рівень доз, в якому виявляли високу частоту “навантажених” клітин при опроміненні насіння пшениці [Гераськин и др., 1995], де “аномальний характер навантаженості клітин абераціями” спостерігався при опроміненні насіння в дозі 50 Гр. Цитогенетичні показники та частота клітин з множинними абераціями в Allium cepa L. при ?-опроміненні 241Аm. Коефіцієнт накопичення (КН) 241Аm у коренях проростків цибулі, що виросли в водних розчинах AmCl3 становив 0,18±0,04. Виходячи із значення КН, а також коефіцієнта рівноважної дози для 241Аm, визначали дози, накопичені протягом трьох діб в апексі коренів (табл. 2). Таблиця 1 Розподіл числа хромосомних аберацій по клітинах при ?-опроміненні насіння A. cepa Доза, Гр Кількість проаналізованих коренів Виявлено клітин з числом аберацій s2/ m Достовірність відхилень в (2- тесті для розподілів Коефіцієнт відхилення від розподілу Пуассона 0 1 2 3 4 5 множинних невизначених пуассонового геометричного від’ємного біномного Діапазон нижчих доз 0 48 569 3 1 1 0 1,99 НЧ НЧ НЧ 1 28 702 8 4 0 1,48 НЧ НЧ НЧ 0,00 5 38 944 18 9 1 0 1,71 НЧ НЧ НЧ 98,48 10 36 701 25 18 2 1 1 1,95 НЧ * * 37,13 20 30 444 37 35 2 2 0 1,65 * * * 4,57 30 31 633 59 45 8 2 1 0 1,73 * * * 7,34 40 27 888 164 133 22 13 6 16 1,98 * * * 3,48 Діапазон високих доз 0 15 268 5 2 0 1,42 НЧ НЧ НЧ 50 17 162 97 126 64 18 3 30 1,39 * * * 1,41 100 10 16 50 39 26 10 2 16 1,02 * * * 1,23 150 17 30 35 40 10 2 2 157 1,10 * * * 1,56 200 22 8 25 29 5 145 0,75 * * * 1,54 250 17 0 2 10 0,30 НЧ НЧ НЧ 1,55 300 14 1 5 2 12 1,14 НЧ НЧ НЧ 1,54 Примітки: * – p<0,01 порівняно з контролем; НЧ – недостатнє число ступенів свободи. Вивчаючи дію радіонукліду на частоту хромосомних аберацій у проростках та середню кількість аберацій на аберантну клітину, ми не виявили істотних відмінностей від контролю (табл. 2) [Куцоконь и др., 2002]. При цьому не встановлено зміни ефектів за ЧАА та кількістю аберацій на аберантну клітину при зростанні дози внутрішнього опромінення 241Am. Аналіз поклітинного розподілу аберацій показав, що тип розподілу при збільшенні дози ?-опромінення залишався практично незмінним (рис. 5); тобто, на відміну від очікуваного, дозозалежного зростання кількості клітин з багатьма абераціями не відбувалося. Порівняння значень середнього та дисперсії виявлених розподілів свідчить про їх невідповідність розподілу Пуассона в експериментальних варіантах так само, як і в контрольних. Як видно з таблиці 2, по одній клітині з більше ніж 5 абераціями, виявлено в контрольних та дослідному варіантах, а при пророщуванні дослідного насіння при дозі внутрішнього опромінення 241Am 0,74 сГр, виявлено три клітини з множинними невизначеними пошкодженнями. Таблиця 2 Утворення хромосомних аберацій в клітинах кореневої меристеми A. cepa при ?-опроміненні 241Аm № п/п Активність розчину AmCl3, Бк/л Доза внутрішнього опромінення, сГр Проаналізо-вано корінців Проаналізо- вано анафаз Частота аберантних анафаз (%) Кількість аберацій на аберантну клітину Кількість клітин з 5 та більше абераціями s2/ m Діапазон нижчих доз 1 0 (контроль) 0,00 ± 0,00 35 1879 1,65 ± 0,29 1,41 ± 0,15 1 1,86 2 8,75 · 104 0,37 ± 0,09 33 914 2,19 ± 0,48 1,58 ± 0,21 0 2,04 3 1,75 · 105 0,74 ± 0,15 48 2154 1,81 ± 0,29 1,68 ± 0,20 3 2,57 4 8,75 · 105 3,70 ± 0,74 43 1336 2,10 ± 0,39 1,32 ± 0,12 0 1,57 Діапазон вищих доз 5 0 (контроль) 0,00 ± 0,00 23 748 3,21 ± 0,64 1,62 ± 0,24 1 2,31 6 8,75 · 105 3,70 ± 0,74 27 663 5,13 ± 0,86 1,28 ± 0,15 0 1,64 7 1,75 · 106 7,40 ±1,48 24 730 3,15 ± 0,65 1,18 ± 0,11 0 1,35 8 8,75 · 106 37,00 ± 14,80 15 525 2,86 ± 0,73 1,38 ± 0,31 1 2,19 Рис. 5. Розподіл клітин з різною кількістю аберацій при ?-опроміненні 241Аm. Цифрами позначено дози внутрішнього опромінення, сГр (див. табл. 2). Рис. 6. Поклітинний розподіл кількості аберацій при дії тіофосфаміду в Allium cepa L. За нашими спостереженнями, мультиаберантні клітини в ході спонтанного мутагенезу у A. cepa виявляються досить рідко. Тому, здається, що наявність трьох клітин з множинними абераціями в дослідному варіанті, швидше за все не можна вважати випадковою. На перший погляд, її можна пояснити впливом радіонукліду. Дійсно, незважаючи на те, що 241Аm є абіогенним елементом, і він, очевидно, в даних експериментальних умовах не проникав в рослинну клітину в кількостях, необхідних для цитогенетичних ефектів (за ЧАА та середньою кількістю аберацій на аберантну клітину), виявлення трьох мультиаберантних клітин може вказувати на те, що проникання, хоч і незначне, відбувалося, впливаючи при цьому на пошкодженість окремих клітин. Про слабке проникання в клітини пилку традесканції іншого ?-випромінювача, радону, що на відміну від 241Аm є елементом в газоподібному стані, свідчить робота [Tavera. et. al., 2002], де показано, що тільки при дуже високих концентраціях радону в повітрі спостерігався підвищений рівень мікроядер, обумовлений дифузією радону через проміжні тканини бутона до квітки. В роботі [Кальченко, 1998] спостерігали підвищення частоти клітин з абераціями в проростках гороху під впливом 241Аm, проте, використані автором концентрації радіонукліду були дещо вищими, ніж застосовані нами. Той факт, що за вивчених концентрацій 241Am нам не вдалося отримати чітку дозову залежність виходу клітин з множинними абераціями, схиляє нас до іншого пояснення причини появи мультиаберантних клітин, зважаючи на те, що всі три клітини було виявлено в одній кореневій меристемі, загальний рівень клітин з абераціями в якій був значно вищим від середнього. На нашу думку, більш імовірним є виникнення мультиаберантних клітин внаслідок появи пошкоджень в ході твірних процесів у зародковому корені в ініціальній або стовбуровій клітині, що не втратила здатності до поділу, і, таким чином, сформувався клон клітин із пошкодженнями. Отже, результати досліджень по вивченню генотоксичної дії ?-випромінювань 241Аm показують, що при тих дозах опромінення, які створюються при проникненні 241Аm у внутрішній простір клітин, спостерігається відсутність достовірного впливу на рівень частоти аберантних анафаз, середню кількість аберацій на аберантну клітину та поклітинний розподіл хромосомних аберацій. Очевидно, в умовах нашого експерименту в клітинах проростків не накопичувались кількості радіонукліду, необхідні для виявлення його впливу на цитогенетичні параметри. Це може бути пов’язане з нерівномірним розподілом радіонукліду по тканинам рослин, короткою довжиною пробігу альфа-частинок та переважною абсорбцією америцію на клітинних стінках, оскільки 241Аm, що не є біогенним елементом, може й не проникати всередину рослинної клітини. Цитогенетичні ефекти, викликані дією хімічного мутагену та протекторна дія антимутагену. При дії тіофосфаміду на клітини Allium cepa L. спостерігали дозозалежне зниження мітотичного індексу та значне зростання частоти клітин з абераціями (табл. 3). Кількість клітин з абераціями була значною вже за найнижчої концентрації мутагену і сягала 82,69 ± 5,25 %, коли концентрація тіофосфаміду була максимальною [Куцоконь та ін., 2001]. На відміну від ?-опромінення, тіофосфамід менше впливав на середній рівень пошкодженості аберантної клітини навіть при значних концентраціях, за яких спостерігалося сильне зростання ЧАА та зниження мітотичного індексу. Наростання кількості аберацій на аберантну клітину було відмінним від динаміки ЧАА і відбувалося набагато повільніше; тільки при найвищих концентраціях тіофосфамід індукував достовірно більше аберацій на пошкоджену клітину [Куцоконь та ін., 2003]. Представлені на рис. 6 розподіли клітин з різною кількістю хромосомних аберацій показують, що тіофосфамід, навіть уражуючи значний відсоток клітин (82,69 ± 5,25 %), не веде до таких сильних пошкоджень в них, що спостерігали при ?-опроміненні насіння. При дії тіофосфаміду було виявлено незначну кількість мультиаберантних клітин, ї їх частка була низькою порівняно з часткою клітин такого типу, індукованих дією ?-опромінення в дозах, що викликали еквівалентні ефекти за частотою аберантних клітин (табл. 1, 3). Порівняння поклітинних розподілів хромосомних аберацій з Таблиця 3 Вплив тіофосфаміду на утворення хромосомних аберацій в клітинах кореневої меристеми Allium cepa Концентрація тіофосфаміду, мг/л Проаналізовано корінців Проаналізовано анафазМітотичний індекс (%) Частота аберантних анафаз (%) Кількість аберацій на аберантну клітину Кількість клітин з 5 та більше абераціями Достовірність відхилень в (2- тесті для розподілів Коефіцієнт відхилення від розподілу Пуассона пуассонового геометрич-ного від’ємного біномного 0 51 2289 10,49 ± 0,27 1,49 ± 0,25 1,23 ± 0,09 0 НЧ НЧ НЧ 1 43 1294 10,04 ± 0,26 25,58 ± 1,21* 1,24 ± 0,03 0 * * 2,26 5 48 842 8,10 ± 0,23* 23,52 ± 1,46* 1,28 ± 0,04 1 * 3,09 10 35 648 7,29 ± 0,25* 39,51 ± 1,92* 1,27 ± 0,03 0 * * 0,87 20 73 311 2,80 ± 0,11* 69,77 ± 2,60* 1,72 ± 0,07* 5 * * 1,17 40 94 52 0,97 ± 0,06* 82,69 ± 5,25* 1,95 ± 0,22* 6 * * * 1,13 Примітки: * – p<0,05 порівняно з контролем; НЧ – недостатнє число ступенів свободи. теоретичними моделями показало, що на відміну від ?-радіації, кластогенну дію якої важко описати теоретичними розподілами, поява клітин з множинними абераціями хромосом при дії тіофосфаміду залежно від концентрації задовільно описується одним із використаних нами теоретичних розподілів. На нашу думку, опромінення, порівняно з впливом тіофосфаміду, може обумовлювати складнішу картину поклітинного розподілу хромосомних аберацій, оскільки воно індукує ширший спектр пошкоджень ДНК. Крім того, вважається, що деяка частина пошкоджень, викликана дією алкілувальних сполук, до яких відносять тіофосфамід, виявляється тільки після проходження другого клітинного поділу. T \ 4 ? E V X Z \ ‚ o 2 ? 8 ? E ?/?-опроміненні в усьому вивченому діапазоні доз, за умов дії тіофосфаміду спостерігалася як більша, так і менша кількість аберацій даного типу порівняно з очікуваною у пуассоновому розподілі. Ми припускаємо, що притаманна тіофосфаміду цитотоксичність в більшій мірі, ніж радіація, модифікує вихід клітин з множинними абераціями хромосом. За даними літератури, поклітинний розподіл хромосомних аберацій при дії тіофосфаміду в лімфоцитах периферійної крові людей відповідає геометричному розподілу [Бочков, Чеботарев, 1989]. Однак, за виявленими нами залежностями важко однозначно встановити, який саме тип розподілу є найбільш характерним для даного мутагену. Одним з можливих пояснень цього розходження ми вбачаємо можливість індукції ефектів, відмінних в культурі тваринних клітин та рослинному організмі, що може обумовлюватися багатостадійністю та складністю процесів взаємодії мутагену з хромосомою і особливостями проникнення його в рослинну клітину внаслідок присутності в ній целюлозної клітинної стінки. Закономірності індукції хромосомних аберації при дії хімічного мутагену відрізняються від таких при впливі радіації. Сполуки з протекторною дією здатні знижувати частоту пошкоджених клітин, при цьому вони можуть впливати чи не впливати на розподіл хромосомних аберацій залежно від механізмів їх дії [Ахундова, 1974]. При дослідженні цитогенетичної дії протектора антимутагенна активність Рис. 7. Вплив фолієвої кислоти на частоту аберантних анафаз в клітинах кореневої меристеми Allium cepa L. при спонтанному (А) та індукованому мутаційному процесі: Б. При одночасній дії протектора та мутагену. В. При послідовній дії протектора та мутагену. Г. При послідовній дії мутагену та протектора. Позначення: 1 – дистильована вода; 2 – мутаген, тіофосфамід (10 мг/л); 3,6,9,12 – фолієва кислота, 2,5 мг/л; 4, 7, 10, 13 – фолієва кислота, 25 мг/л; 5, 8, 11, 14 – фолієва кислота, 50 мг/л. Рис. 8. Поклітинний розподіл кількості аберацій в клітинах кореневої меристеми проростків Allium cepa L. при дії фолієвої кислоти. Див. позначення до рис.7. фолієвої кислоти показана тільки за певних умов, залежно від послідовності обробки. Так, фолієва кислота не впливала на спонтанну частоту клітин з абераціями (рис. 7), при цьому характер поклітинного розподілу хромосомних аберацій був подібним до контрольного (рис. 8). За умов одночасного впливу з мутагеном фолієва кислота виявляла захисний ефект [Куцоконь та ін., 2003], про що свідчить встановлене нами дозозалежне зниження ЧАА та характер змін поклітинного розподілу хромосомних аберацій, який наближався до контрольного при зростанні концентрації протектора. При послідовному впливі фолієвої кислоти та тіофосфаміду і навпаки антимутагенний ефект не спостерігався. В цих варіантах поклітинні розподіли хромосомних аберацій були подібними до таких за умов дії мутагену. Поклітинний розподіл хромосомних аберацій за умов дії тіофосфаміду (10 мг/л) та при дії мутагену після фолієвої кислоти відповідав пуассоновому розподілу. Натомість, при одночасній дії фолієвої кислоти та мутагену, а також при дії фолієвої кислоти після впливу мутагену, розподіл хромосомних аберацій не можна було описати розподілом Пуассона. Під час цитогенетичного аналізу у деяких варіантах досліду, де проростки зазнавали дії мутагену, було виявлено мультиаберантні клітини. Проте, їх кількість була незначною, що не дозволило нам провести оцінку закономірностей їх появи за умов дії протектора. Ми припускаємо, що антимутагенні властивості фолієвої кислоти пов’язані з процесами так званої “десмутагенізації”, в ході яких може відбуватися нейтралізація мутагену шляхом прямої інактивації генотоксичних продуктів. Цитогенетичні особливості спонтанного старіння насіння Allium cepa L. та Allium fistulosum L. Вікову динаміку хромосомної нестабільності насіння A. cepa та A. fistulosum аналізували протягом майже трьох років. Аналіз динаміки проростання насіння при його старінні показав залежності, подібні для обох видів цибулі, коли у насіння, що зберігалося 33 місяці спостерігалось різке зниження кількості пророслого на третю добу насіння. Проте, це зниження у A. fistulosum було менш значне порівняно з A. cepa (табл. 4, 5). Відмінності у проростанні двох видів цибулі можуть пояснюватися видовими особливостями, а також різними умовами формування та дозрівання насіння, оскільки воно було отримане з різних ділянок та в різні роки, і тому може мати як різну динаміку хромосомної нестабільності [Лазаренко, 1999], так і відмінності в динаміці проростання. Із старінням насіння відбувалося поступове наростання частоти клітин з абераціями (рис. 9) у обох видів Allium. Але спонтанний мутаційний процес, виявлений як за частотою клітин з абераціями, так і за середнім рівнем кількості аберацій на аберантну клітину, набагато інтенсивніше відбувався у A. fistulosum порівняно з A. сера. При цьому обумовлена старінням динаміка середньої кількості аберацій на аберантну клітину мала більш нерівномірний характер в обох видів, особливо в A. сера (рис. 10). Дані наших попередніх досліджень, проведених на іншій партії цибулі батун, так само показали в кілька разів швидше наростання частоти клітин з абераціями у A. fistulosum порівняно з A. cepa [Куцоконь та ін., 2004]. Таблиця 4 Розподіл числа хромосомних аберацій по клітинах при старінні насіння Allium fistulosum L. Тривалість зберігання насіння, місяці Кількість пророслого насіння, % Виявлено клітин з числом аберацій s2/ m Достовірність відхилень в (2- тесті для розподілів Коефіцієнт відхилення від розподілу Пуассона 0 1 2 3 4 5 множинних невизначених пуассонового геометричного від’ємного біномного 2,0 59,5 1704 57 9 1 0 1,34 НЧ НЧ НЧ 40,99 3,7 71,5 838 22 6 1 0 1,45 НЧ НЧ НЧ 91,93 14,7 60,3 1144 157 72 20 5 5 0 1,76 * * * 7,29 25,6 70,3 1155 179 140 44 19 6 16 2,06 * * * 4,78 33,3 41,9 632 136 133 27 15 4 7 1,76 * * * 2,53 Примітки: *– p<0,001 порівняно з контролем; НЧ – недостатнє число ступенів свободи. Таблиця 5 Розподіл числа хромосомних аберацій по клітинах при старінні насіння Allium cepa L. Тривалість зберігання насіння, місяці Кількість пророслого насіння, % Виявлено клітин з числом аберацій s2/ m 0 1 2 3 4 5 множинних невизначених 7,0 29,3 590 2 0 1,00 7,5 – 471 3 0 1,00 8,0 42,2 1682 15 2 1 0 1,68 8,5 72,9 2255 25 5 1 0 1,41 11,0 68,4 569 3 1 1 0 1,99 15,5 55,6 1260 18 0 0,99 17,5 53,3 1101 18 7 1 0 1,69 22,3 51,0 673 15 6 1 1 0 2,17 22,4 59,7 1001 32 22 1 0 1,56 29,0 48,0 238 9 4 0 1,41 33,5–34,0 28,7 114 9 4 0 1,35 Частота клітин з абераціями в “старого” насіння цибулі батун, яке зберігалося 33 міс. може досягати втричі вищих значень порівняно з ЧАА в цибулі звичайної того ж терміну зберігання. При цьому насіння A. fistulosum залишається більш життєздатним, виявляючи вищий рівень проростання. З огляду на висловлене в роботі [Grant, Owens, 2001] припущення про можливу втрату здатності до проростання насіння гороху (Pisum sativum), яке містило більше 7 % клітин з абераціями, і наші дані про вікову динаміку мутабільності в A. cepa, яке показує незначну кількість пророслого насіння при 0,24 ± 2,69 % клітин з абераціями, можна зауважити, що рівень мутабільності в процесі старіння насіння в A. fistulosum може досягати вищих значень, зберігаючи при цьому здатність до проростання. Дійсно, маючи в меристемах третину аберантних клітин серед врахованих анафаз (або навіть дві третини [Куцоконь та ін., 2004]), цибуля батун здатна до проростання. Рис. 9. Хромосомні аберації в клітинах кореневої меристеми Allium fistulosum L. 1 – подвійний міст. 2 – фрагменти. Фарбування ацеторсеїном. Зб. 400Х. Протягом всього часу дослідження динаміки вікових змін в A. cepa за умов незначної кількості клітин з абераціями завжди переважали клітини, які містили тільки одну аберацію, і лише в деяких варіантах зустрічалися 1–2 клітини з трьома та більшою кількістю аберацій. В жодному з варіантів не виявлено клітин з множинними невизначеними абераціями (табл. 5). Вивчення динаміки поклітинного розподілу хромосомних аберацій у A. fistulosum показує, що переважна більшість аберантних клітин у проростків, отриманих з насіння, яке зберігалося 2 – 25,6 міс., містили по одній аберації, а серед клітин проростків, які виросли з “найстарішого” насіння, що зберігалося 33,3 міс., частки клітин з однією та двома абераціями були практично рівними (табл. 4). МАК з визначеними абераціями виявляли в клітинах проростків, отриманих з насіння, яке зберігалося 14,7 міс. і більше; клітини з множинними невизначеними абераціями виявлено тільки у проростків, отриманих з насіння, яке зберігалося 25,6 та 33,3 міс. Їх частка серед загальної кількості аберантних клітин складає 3,96 та 2, 17 % відповідно. Отже, в ході старіння насіння A. cepa клітини з багатьма абераціями практично не спостерігаються, в той же час вони виявлялися в проростках, отриманих з насіння A. fistulosum, яке зберігалося більше 14,7 міс. Рис. 10. Динаміка частоти аберантних анафаз (А) та середньої кількості аберацій на аберантну клітину (Б) у Allium fistulosum L.(1) та Allium cepa L. (2) при старінні насіння. Виявлена кількість клітин з однією аберацією в обох видів цибулі була частіше нижчою від очікуваної при всіх типах розподілу – пуассоновому, геометричному та від’ємному біномному. Натомість, кількість клітин з двома абераціями в більшості варіантів часто перевищувала очікувану в теоретичних розподілах при даній кількості аберацій. При старінні насіння A. cepa відповідність поклітинного розподілу хромосомних аберацій розподілу Пуассона спостерігали тільки в кількох варіантах, де всі аберантні клітини містили лише по одній аберації (табл. 5). При старінні насіння A. fistulosum виявлено невідповідність емпіричних розподілів хромосомних аберацій по клітинах теоретичним розподілам (табл. 4). Очевидно, складний характер розподілу аберацій в клітинах протягом старіння, який часто важко описати теоретичними розподілами, пояснюється тим, що процеси старіння не можуть обумовлюватися дією одного чинника, який би якось особливо взаємодіяв з хромосомами і вплив якого на них можна було б описати одним теоретичним розподілом. Натомість, старіння насіння обумовлене різноманітними складними метаболічними процесами, що повільно протікають в ньому і індукують ушкодження ДНК. Відповідність емпіричних поклітинних розподілів хромосомних аберацій розподілу Пуассона може свідчити про випадковий характер індукції цих пошкоджень і, навпаки, виявлені відхилення від нього можуть вказувати на можливий взаємний зв’язок між появою аберацій в клітині. Як показує аналіз динаміки коефіцієнта відхилення від розподілу Пуассона у виході множинних аберацій хромосом, дослідні частоти перевищували очікувані щонайменше у 2,5 рази. Таким чином, при старінні насіння у проростках A. fistulosum, як і при дії ?-випромінювання на клітини A. cepa, частота клітин з багатьма абераціями була більшою, ніж очікувана в пуассоновому розподілі. Це наводить на думку про те, що поява однієї аберації в клітині сприяє появі інших аберацій в ній. Сумарні мутагенні забруднення середовища як фактор генотоксичного впливу на рослини. За умов спонтанного мутаційного процесу в Allium cepa практично не виявлялося клітин з множинними пошкодженнями, те саме спостерігалося і в контрольних варіантах різних дослідів. Пророщування контрольного насіння проводилося в дистильованій воді, тобто в умовах, які не можна вважати природними. Тому наступним кроком нашого дослідження було встановити, чи з’являтимуться клітини з множинними абераціями в більш природних умовах. Для цього, пророщуючи насіння, ми застосовували воду з різних водойм м. Києва (табл. 6). Результати біотестування в Allium-тесті показали наявність в деяких пробах води генотоксичних властивостей [Куцоконь та ін., 1999]. Так, зокрема, рівень ЧАА був підвищений в кількох дослідних варіантах (табл. 6), чотири з яких відібрані на території закритих водойм, один – на території р. Дніпро. Проте, середня кількість аберацій на аберантну клітину не відрізнялась достовірно від контролю в жодному з дослідних варіантів. З порівняльного аналізу кількості аберантних клітин та кількості аберацій на аберантну клітину видно, що ці показники, корелювали не завжди. Результати поклітинного розподілу аберацій хромосом в дослідних варіантах та контролі, наведені в таблиці 6, свідчать, що в жодному з варіантів виявлений розподіл не відповідав пуассоновому. При цьому кількість клітин з двома та більше абераціями завжди була вищою, ніж очікувана в будь-якому з трьох теоретичних розподілів. Тобто, зроблене раніше припущення про те, що поява однієї аберації в клітині сприяє появі інших аберацій в ній, підтверджується аналізом результатів біотестування. В усіх дослідних варіантах виявлено тільки дві клітини зі складними абераціями хромосом. Узагальнення результатів показало частоту МАК в Allium cepa 0,755 ± 0,532 % серед клітин з абераціями та 0,024 ± 0,017 % – серед загальної кількості клітин. Отже, поява МАК в умовах біотестування є рідкісною подією. Тому, імовірно, при використанні тест-системи кореневої меристеми Allium cepa L. в біомоніторингу забруднень довкілля виникнення мультиаберантних клітин у вищих від контролю кількостях може свідчити про наявність особливо небезпечних мутагенів, а з врахуванням здатності іонізуючого випромінювання індукувати МАК, виявлення останніх може вказувати на наявність радіаційної компоненти в довкіллі. Узагальнивши результати нашого дослідження про вихід цитогенетичних пошкоджень при дії мутагенних чинників різної природи, можна відзначити особливість, характерну для всіх вивчених мутагенних факторів. Частота клітин з абераціями показує високу залежність від дози у вивченому діапазоні доз, в той час як середня пошкодженість аберантної клітини таку залежність виявляє тільки при вищих дозах мутагенного чинника. Виходячи з отриманих результатів, ми припустили, що при дії мутагенних чинників, які викликають дозозалежне наростання частоти аберантних клітин, середня кількість аберацій на аберантну клітину утримується на рівні контролю до певного умовно критичного значення частоти аберантних клітин, після чого починає дозозалежно зростати. Тобто, лише за високих доз опромінення в кореневих меристемах Allium виявляється значна кількість мультиаберантних клітин; при незначних мутагенних навантаженнях ефект не має чіткої дозової залежності. Зважаючи на можливу подібність процесів формування хромосомних пошкоджень в еукаріотичних організмів, за допомогою даного припущення можна пояснити відсутність чітких залежностей між появою МАК та дозою опромінення лімфоцитів у постраждалих осіб [Sevankaev et al., 1993, Пилинская и др., 1994], що спостерігали в популяційних дослідженнях. Таблиця 6 Цитогенетичні ефекти в клітинах Allium cepa, викликані дією води з природних водойм м. Києва Місце відбирання зразка Частота аберантних анафаз Кількість аберацій на аберантну клітину Клітин з числом аберацій Кількість клітин з двома і більше абераціями 0 1 2 3 4 множинних невизначених s2/ m виявлена в досліді очікувана в розподілах пуассоно-вому геометрич-ному від’ємному біномному контроль 1,93 ± 0,45 1,29 ± 0,11 917 12 5 1,43 5,0 0,3 0,5 0,4 оз.Тельбін 3,52 ± 0,57* 1,29 ± 0,10 1013 27 6 2 1,49 8,0 0,9 1,6 1,3 оз Вербне 5,85 ± 0,75* 1,65 ± 0,11 933 29 18 6 2 1,96 26,0 3,1 5,7 4,5 оз Берізка 2,35 ± 0,56 1,29 ± 0,11 707 12 5 1,43 5,0 0,3 0,6 0,5 оз Райдуга 5,22 ± 0,86* 1,18 ± 0,07 636 28 6 1,24 6,0 1,1 2,1 1,7 оз.Пуща-Водиця 3,65 ± 0,65* 1,68 ± 0,18 793 14 12 1 1 2,14 14,0 1,0 1,9 1,5 р. Дніпро “Венеція” 3,30 ± 0,73 1,24 ± 0,18 586 15 1 1 1,63 2,0 0,3 0,6 0,4 “Дитячий” 1,39 ± 0,56 1,33 ± 0,33 427 5 1 1,74 1,0 0,1 0,1 0,1 “Центральний” 2,21 ± 0,56 1,21 ± 0,11 664 11 3 1,33 3,0 0,2 0,4 0,3 “Довбичка-2” 3,39 ± 0,56 1,35 ± 0,08 997 22 12 1,48 12,0 1,0 1,9 1,5 “Пер.Слобідка” 3,82 ± 0,84* 1,23 ± 0,17 504 11 1 1 1,47 2,0 0,2 0,4 0,3 “Чорторий” 1,76 ± 0,50 1,75 ± 0,35 668 7 3 1 1 2,50 5,0 0,2 0,4 0,3 Примітка. * – p<0,05 порівняно з контролем. ВИСНОВКИ Вперше проаналізовано залежність виходу множинних хромосомних аберацій, включаючи складні невизначені, від дози (-опромінення у рослин. Під дією (-випромінювань хромосомні аберації в клітинах Allium cepa L. розподіляються так, що множинних аберацій утворюється більше, ніж очікується за теоретичними розподілами. Коефіцієнт відхилення виявленої частоти клітин з множинними абераціями хромосом від очікуваних значень за розподілом Пуассона в діапазоні доз опромінення, нижчих за 150 Гр, із зростанням дози зменшується. В діапазоні доз, вищих за 150 Гр, коефіцієнт відхилення не залежить від дози і приблизно дорівнює 1,5. Виявлені відхилення у виході клітин з множинними абераціями хромосом від частот, очікуваних у теоретичних розподілах, свідчать про те, що акти, які ведуть до появи аберацій в клітині, не є незалежними. При еквівалентних кількостях клітин з абераціями в меристемах A. cepa під дією тіофосфаміду виникає менша кількість клітин з множинними абераціями хромосом, ніж при (-опроміненні, і їх частоти відповідають очікуваним значенням за теоретичними розподілами. При спонтанному старінні насіння збільшується кількість клітин з множинними абераціями у Allium fistulosum L., в той час як у Allium cepa L. частота клітин з множинними абераціями хромосом від віку не залежить. Це пояснюється видоспецифічністю спонтанного мутаційного процесу, про що свідчить пов’язана з віком частота клітин з абераціями, яка у A. fistulosum щонайменше в 3 рази вища, ніж у A. cepa. Поклітинний розподіл хромосомних аберацій зазнає модифікації за умов одночасної дії фолієвої кислоти з тіофосфамідом. При цьому фолієва кислота виявляє протекторні властивості. При пророщуванні насіння A. cepa в розчині хлориду 241Am в діапазоні концентрацій 1,5·10-6 – 1,5·10-4 мг/л виявлена відсутність цитогенетичних ефектів свідчить про гетерогенність розподілу радіонукліду по тканинам рослин, при якому (-частинки не досягають клітин, що підпадають поділу. При використанні тест-системи кореневої меристеми Allium cepa L. для біомоніторингу забруднень виявлення клітин з множинними абераціями хромосом в кількостях, вищих від контролю, може свідчити про наявність радіаційної компоненти в довкіллі. СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ Куцоконь Н.К., Лазаренко Л.М., Безруков В.Ф. Оцінка мутагенних властивостей води з водогінної мережі та водойм м. Києва // Вісник Київського університету. Сер. Біологія. – 1999.– Вип. 29. – С. 28 – 30. (Здобувачем проаналізовано літературу, закладено експеримент, проведено цитогенетичний аналіз та статистичну обробку даних, написано статтю). Куцоконь Н.К., Неумержицька Л.В., Бариляк І.Р. Оцінка генетичної активності проб води, взятих на території водойм м. Києва // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології. – 1999. – Вип. 2, № 22.– С. 13 – 18. (Здобувачем розроблено експериментальну частину, відібрано зразки, здійснено цитогенетичний аналіз, статистичну обробку даних, обговорення результатів досліджень, написання статті). Куцоконь Н.К., Неумержицька Л.В., Бариляк І.Р. Цитогенетична дія тіофосфаміду в клітинах кореневої меристеми Allium cepa L. // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології. – 2001. – Вип. 5, № 37. – C. 36 – 40. (Здобувачем виконано експериментальну частину, проведено цитогенетичні аналізи, статистично опрацьовано та узагальнено результати досліджень, написано статтю). Бариляк И.Р., Неумержицкая Л.В., Куцоконь Н.К. Эколого-генетическая оценка зон рекреации г. Киева по суммарному мутагенному фону // Гигиена населенных мест. – 2001. – Вып. 38, Т. 1.– С. 97 – 100. (Здобувачем проаналізовано літературу, відібрано зразки, закладено експеримент, проведено цитогенетичний аналіз в Аllium–тесті та облік частоти мутацій в традесканції, статистичну обробку та узагальнення результати досліджень, написано статтю). Куцоконь Н.К., Гродзинський Д.М., Рашидов Н.М., Тришин В.В. Оцінка генотоксичності 241Аm в тест-системі клітин кореневої меристеми проростків Allium cepa L. // Збірник наукових праць інституту ядерних досліджень. – 2002. – Т. 17, № 1. – С. 139 – 146. (Здобувачем проаналізовано літературу, розроблено та поставлено експеримент, проведено цитогенетичний аналіз, статистичну обробку даних, здійснено обговорення результатів і написання статті). Куцоконь Н.К., Рашидов Н.М., Гродзинский Д.М. Цитогенетические эффекты 241Am в Аllium-тесте // Радиац. биология. Радиоэкология. – 2002. – Т. 42, № 6. – С. 675 – 677. (Здобувачем проаналізовано літературу, розроблено та поставлено експеримент, проведено цитогенетичний аналіз і статистичну обробку даних, здійснено обговорення результатів, написано статтю). Куцоконь Н.К., Неумержицька Л.В., Кузнєцова Г.А., Бариляк І.Р. Вплив фолієвої кислоти на рівень спонтанної та індукованої тіоТЕФ хромосомної нестабільності в клітинах Allium cepa L. // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології. – 2003. – Вип. 3, № 49. – C. 76 – 88. (Здобувачем здійснено експериментальну частину, проведено цитогенетичні аналізи, статистично опрацьовано та узагальнено результати досліджень, написано статтю). Куцоконь Н.К., Безруков В.Ф., Лазаренко Л.М., Рашидов Н.М., Гродзинський Д.М. Кількість аберацій на аберантну клітину як параметр хромосомної нестабільності 1. Характеристика дозових залежностей // Цитология и генетика. – 2003.– № 4.–C. 20–25. (Здобувачем поставлено завдання, проаналізовано літературу, здійснено експеримент, проведено цитогенетичний аналіз, статистичну обробку даних, здійснено обговорення результатів досліджень і написання статті). Куцоконь Н.К., Лазаренко Л.М., Безруков В.Ф., Рашидов Н.М., Гродзинський Д.М. Кількість аберацій на аберантну клітину як параметр хромосомної нестабільності 2. Порівняльний аналіз впливу факторів різної природи // Цитология и генетика. – 2004. – №1. – C. 55–62. (Здобувачем проаналізовано літературу, розроблено і поставлено експеримент, проведено цитогенетичний аналіз та статистичну обробку даних, здійснено обговорення результатів і написання статті). Kutsokon N.K., Lazarenko L.M., Bezrukov V.F. Evaluation of drinking water mutagenic activity in Kyiv // Cytogenetics and Cell Genetics. – 1999. – Vol. 85, № 1 – 2. – P. 101. Kutsokon N., Lazarenko L., Bezrukov V. Age-related features of chromosome instability of welsh-onion seeds grown in water samples from different sources // Int. Journal of Human and Medical Genetics. – 2001. – Vol. 44, № 1. – P. 25. Kutsokon N.K., Neumerzhitska L.V., Barilyak I.R. Assessment of the genotoxicity of reservoir waters in Kiev // Abstracts of Fifth International Symposium and Exhibition on Environmental Contamination in Central and Eastern Europe. – Prague (Czech Republic). – 2000. – P. 138. Kutsokon N., Rashidov N., Grodzinsky D.M. Cytogenetic effects of 241Am in Allium-test // Proceedings of International Conference “Genetic Consequences of Emergency Radiation Situations”. – Moscow (Russia). – 2002. – P. 146 – 148. Куцоконь Н.К., Рашидов Н.М., Гродзинський Д.М. Клітини з нерозпізнаними множинними абераціями хромосом як ознака дії ?-опромінення у Allium cepa L. // ІІІ з’їзд з радіаційних досліджень. – Київ (Україна). – 2003. – С. 97. Kutsokon N., Rashidov N., Grodzinsky D.M. Unidentified multiaberrant cells as evidence of ?-irradiation in an Allium-test // Abstracts of Sixth International Symposium and Exhibition on Environmental Contamination in Central and Eastern Europe and the Commonwealth of Independent States. – Prague (Czech Republic). – 2003. – P. 142 – 143. Rashidov N., Kutsokon N., Berezhna V., Grodzinsky D.M. Tradescantia-SH and Allium-assay as biomonitors of the radiation pollutions genotoxicity // Abstracts of Workshop on “Radiation safety problems in the Caspian region”. – Baku (Azerbaijan). – 2003. – P. 33. АНОТАЦІЇ Куцоконь Н.К. Радіаційна індукція множинних хромосомних пошкоджень у рослин. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.01 – радіобіологія. – Київський національний університет імені Тараса Шевченка. Київ, 2004. Дисертацію присвячено вивченню особливостей радіаційної індукції множинних хромосомних пошкоджень у рослин. Досліджено вплив радіації ((-випромінювання, (-випромінювання 241Am), хімічного (тіофосфамід) та біологічного (старіння насіння) мутагенних чинників на цитогенетичні показники в клітинах цибулі (Allium L.). Проаналізовано залежність виходу клітин зі складними невизначеними абераціями хромосом від дози ?-опромінення у A. cepa та показано, що при цьому індукується більше клітин з множинними хромосомними абераціями, ніж очікувалося в теоретичних розподілах. Це свідчить про те, що акти, які ведуть до появи аберацій в клітині, не є незалежними. Тіофосфамід викликає меншу кількість пошкоджень в аберантних клітинах порівняно з дією (-опромінення, при цьому появу клітин з множинними абераціями хромосом можна описати теоретичними розподілами. При пророщуванні насіння цибулі в розчині хлориду 241Am концентрацій 1,5 · 10-6 – 1,5 · 10-4 мг/л виявлена відсутність цитогенетичних ефектів свідчить про гетерогенність розподілу радіонукліду по тканинам рослин, при якому (-частинки не досягають клітин, що підпадають поділу. Встановлено, що динаміка частоти клітин з абераціями протягом старіння насіння у A. cepa і A. fistulosum відрізнялася, при цьому старіння насіння A. cepa не впливало на частоту клітин з множинними абераціями, в той час як частота клітин з множинними абераціями хромосом у A. fistulosum в ході старіння збільшувалася. Зроблено висновок про те, що при використанні тест-системи кореневої меристеми Allium cepa L. для біомоніторингу забруднень виявлення клітин з множинними абераціями хромосом в кількостях, вищих від контролю, може свідчити про наявність радіаційної компоненти в довкіллі. Ключові слова: іонізуюче випромінювання, 241Am, аберації хромосом, мультиаберантні клітини, поклітинний розподіл аберацій хромосом, Allium cepa L., Allium fistulosum L., тіофосфамід, старіння насіння, біомоніторинг. Куцоконь Н.К. Радиационная индукция множественных хромосомных повреждений у растений. – Рукопись. Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.01 – радиобиология. – Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко. Киев, 2004. Диссертация посвящена изучению особенностей радиационной индукции множественных хромосомных повреждений у растений. Исследовали влияние радиации ((-излучение, (-излучение 241Am), химического (тиофосфамид) и биологического (старение семян) мутагенных факторов на цитогенетические показатели в клетках корневой меристемы лука (Allium L.). Анализ зависимости появления клеток со сложными нераспознанными аберрациями хромосом при (-облучении семян показал постепенное нарастание частоты таких клеток с увеличением дозы (до 83 %). Поклеточное распределение количества аберраций не соответствовало теоретическим распределениям (пуассоновскому, геометрическому и отрицательному биномиальному), при этом частота клеток с множественными аберрациями хромосом превышала ожидаемую в теоретических распределениях. Предполагается, что установленные отклонения свидетельствуют о том, что акты, ведущие к появлению аберраций в одной клетке, не являются независимыми событиями. При индукции эквивалентных количеств клеток с аберрациями тиофосфамид индуцировал меньшее количество клеток с множественными аберрациями хромосом по сравнению с (-излучением, а поклеточное распределение количества хромосомных аберраций при действии тиофосфамида в зависимости от концентраций возможно было описать теоретическими распределениями. При проращивании семян Allium cepa L. в растворе хлорида 241Am концентраций 1,5 · 10-6 – 1,5 · 10-4 мг/л установлено отсутствие цитогенетического действия, что указывает на гетерогенность распределения радионуклида по растительным тканям, при которой (-частицы не достигают делящихся клеток. Клетки с множественными аберрациями хромосом образуются при спонтанном старении семян, однако этот процесс, вероятно, является видоспецифичным. Установлено, что старение семян не влияло на частоту клеток с множественными аберрациями хромосом у Allium cepa L., в то же время у Allium fistulosum L. частота клеток с множественными аберрациями хромосом при старении увеличивалась. Такие изменения были установлены на фоне различной динамики частоты аберрантных клеток, которая у A. fistulosum всегда была выше, чем у A. cepa. Установлено, что при одновременном действии фолиевой кислоты и тиофосфамида поклеточное распределение хромосомных аберраций модифицируется, причем фолиевая кислота проявляет протекторные свойства. Результаты проведенных исследований показывают, что только при облучении семян в высоких дозах наблюдается значительное количество мультиаберрантных клеток; при незначительных мутагенных нагрузках не установлены четкие дозовые зависимости эффекта. Учитывая возможное подобие процессов формирования хромосомных повреждений в клетках эукариотических организмов, данный факт позволяет объяснить отсутствие четких зависимостей между появлением мультиаберрантных клеток и дозой облучения лимфоцитов у пострадавших людей, наблюдающееся в популяционных исследованиях. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что при использовании тест-системы корневой меристемы Allium cepa L. для биомониторинга загрязнений появление клеток с множественными аберрациями хромосом в количествах, превышающих контрольные уровни, может указывать на присутствие радиационной компоненты в окружающей среде. Ключевые слова: ионизирующее излучение, 241Am, аберрации хромосом, мультиаберрантные клетки, поклеточное распределение аберраций хромосом, Allium cepa L., Allium fistulosum L., тиофосфамид, старение семян, биомониторинг. Kutsokon N.K. Radiation induction of “rogue cells” in plants. – Manuscript. Thesis on PhD degree in speciality 03.00.01 – radiobiology. – National Taras Shevchenko university of Kyiv, Kyiv, 2004. The dissertation is devoted to research of “rogue cells” induction by irradiation in plants. Cytogenetical effects of (-irradiation, (-irradiation of 241Am, thiotepa and seeds ageing on Allium L. cells were studied. The level of cells with unidentified plural aberrations was increased with dose of (-irradiation increasing. (-Irradiation induced more “rogue cells” in A. cepa root meristems than expected in theoretical distributions, whereas thiotepa induced fewer amounts of such the cells and their frequencies were often in accord with expected. We supposed dependency of chromosome aberrations origin in the same cell after ?-irradiation. We didn’t reveal clear cytogenetical effects on A. cepa cells then seeds were grown in 241AmCl3 solution (1,5 · 10-6 – 1,5 · 10-4 mg/l) due to supposed heterogeneity of radionuclide distribution in plant. Comparative analysis of dependencies of spontaneous level of chromosomal aberrations in cells of A. cepa and A. fistulosum was studied and revealed the absence of “rogue cells” during ageing in A. cepa and their presence in A. fistulosum. Based on the results of experiments we conclude that the presence high level of “rogue cells” (in comparison with the control) could dedicate radiation pollution in environment then Allium cepa L. root tip cells as bioassay are used. Key words: ionizing radiation, 241Am, chromosomal aberrations, multiaberrant cells, cellular distribution of chromosome aberrations, Allium cepa L., Allium fistulosum L., thiotepa, seed aging, biomonitoring. PAGE 1 A Б В Г

Похожие записи