.

Протеоміка Т-лімфоцитів миші дикого типу та за відсутності гена білка секурину (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
115 3074
Скачать документ

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ім. В.Н. КАРАЗІНА

ЛУТАЙ НАТАЛІЯ ВОЛОДИМИРІВНА

УДК
577.112.85:547.917:618.3:616.006

Глікозильованість фібронектинів і їх біологічна активність у нормі та
при патологічних станах

03.00.04-біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків-2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Дніпропетровській державній медичній академії МОЗ
України

(м. Дніпропетровськ).

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, професор

Бразалук Олександр Захарович,

Дніпропетровська державна медична академія МОЗ України,

завідувач кафедри біохімії та загальної хімії.

Офіційні опоненти:

– доктор біологічних наук, професор

Бондаренко Тетяна Петрівна,

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України,

завідувач відділу кріобіохімії та фармакології нейрогуморальних систем

(м. Харків);

– кандидат біологічних наук, доцент

Ушакова Галина Олександрівна,

Дніпропетровській національний університет МОН України,

доцент кафедри біофізики та біохімії (м. Дніпропетровськ).

Провідна установа: Інститут геронтології АМН України

(відділ регуляції метаболізму), м. Київ.

Захист відбудеться 02.11.2005 року о _14__ годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного
університету

ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України

(61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, біологічний факультет, ауд. 3-15).

З дисертацією можна ознайомитися в Центральній науковій бібліотеці
Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна Міністерства
освіти і науки України

(61077, м. Харків, пл. Свободи, 4).

Автореферат розісланий 30.09.2005 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради
Падалко В.І. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Великий інтерес для досліджень у галузі медицини та
біології становить вивчення фібронектинів – глікопротеїнів, що
знаходяться в біологічних рідинах і тканинах організму людини. На
сучасному етапі відомо багато структурних і функціональних особливостей
цих білків, охарактеризовані окремі ізоформи фібронектину (ФН), доведена
їхня участь у патогенезі багатьох захворювань, але на сьогодні
залишається недостатньо вивченою роль фібронектинів у процесах
проліферації та онкогенної трансформації. Субодиниці молекул ФН
складаються з функціонально активних доменів, які володіють
спорідненістю до різних молекул міжклітинного матриксу та плазми крові:
гепарину, фібрину, колагену/желатину, інтегринових рецепторів та інших
молекул (Себко Т.В., 1991, Pankov R., 2002). Ця особливість обумовлює
участь ФН у процесах адгезії, диференціюванні та проліферації клітин,
пухлинної малігнізації тканин. Дослідження, що стосуються вмісту ФН у
хворих на пухлинні захворювання, спрямовані на визначення рівня ФН у
плазмі й експресії цього білка на поверхні трансформованої клітини. Тому
перспективним є дослідження локалізації та розподілу клітинного ФН у
пухлинних тканинах (Ена Я.М., 1991, Giannini R., 2003, Shor S.L., 2003).
Прикладом може служити використання клітинного ФН, що містить унікальний
домен альтернативного сплайсингу, як маркера ангіогенезу і злоякісно
трансформованих клітин (Castellani P., 2002, Santimaria M., 2003).
Одержало розвиток також застосування ФН та його фрагментів у терапії
онкозахворювань завдяки їхній властивості пригнічувати пухлинний ріст
(Yi M., 2001).

У літературних джерелах є свідчення про структурні зміни молекул ФН у
складі біологічних рідин при різних типах захворювань (Carsons S., 1994,
Nabi I.R., 1998, Dennis J.W., 1999, Галич И.П., 2003, Маслак Г.С.,
2003), але практично відсутні вичерпні факти про кількісний аналіз змін
рівня ФН, його деградованость і глікозильованость у плазмі крові при
онкопатологіях. Припускають, що продукти деградації ФН активно впливають
на процеси трансформації клітини і можуть служити пухлинними маркерами
(Ена Я.М., 1991). На основі даних, наведених у літературних джерелах,
можна стверджувати, що різні захворювання, включаючи онкологічні,
супроводжуються зміною вуглеводної частини окремих глікокон’югатів та
порушенням процесів глікозильованості, наслідком чого є модифікація
міжклітинного розпізнавання, зміна асоціації та агрегації клітин,
виникнення новоутворень. Тому для подальшого розвитку уявлень про
особливість біохімічних змін, які виникають при патологічних станах,
дуже важливим є більш детальне дослідження кількісних характеристик ФН
плазми крові, його вуглеводного компоненту, фрагментованості, а також
закономірностей розподілу клітинного ФН і його глікозильованості при
онкозахворюваннях.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація
виконана в рамках науково-дослідної роботи кафедри біохімії та загальної
хімії Дніпропетровської державної медичної академії МОЗ України
“Дослідження глікокон’югатів як біохімічних маркерів патологічних
станів” (N держреєстрації 0100 U 00 05-91).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи є визначення кількісних змін та
ступеня глікозильованості плазмового ФН, а також виявлення особливостей
експресії клітинного ФН у нормі та при неоплазії.

Для виконання цієї мети були поставлені наступні задачі:

1. Отримати антисироватку до ФН плазми крові та оцінити її
специфічність.

2. Провести порівняльний аналіз рівня плазмового ФН у крові онкохворих з
різною локалізацією пухлин.

3. Визначити особливості глікозильованості фібронектинів у нормі та при
неоплазії.

4. Проаналізувати розподіл вуглеводних детермінант у проліферативно
активних тканинах.

5. Охарактеризувати особливості розподілу клітинного ФН за нормальних
умов та при пухлинному рості.

6. Виявити зв’язок між експресією клітинного ФН та проліферативною
активністю клітин.

Об’єкт дослідження. Модифікація вуглеводного компоненту ФН та
особливості експресії ФН у процесі онкогенезу.

Предмет дослідження. Ступінь глікозильованості ФН, його вміст у плазмі
крові та розподіл у тканинах людини.

Методи дослідження. Кількісний ракетний імуноелектрофорез, афінний
ракетний імуноелектрофорез, радіоімунологічний аналіз, диск-електрофорез
у ПААГ з ДСН, імуноблотинг, імуногістохімічні методи аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше було встановлено, що
ступінь глікозильованості ФН плазми крові змінюється при розвитку
доброякісних та злоякісних новоутворень щитоподібної залози. Виявлено,
що кількість реагуючих з лектином СоnA вуглеводних епітопів ФН, не
залежить від статі людини. Найбільша кількість біантенних N-гліканів
комплексного типу притаманна плазмовому ФН у нормі, а при розвитку
неоплазії їх кількість вірогідно зменшується, що можна пояснити
модифікацією олігосахаридних структур біантенних N-гліканів (появою
додаткових антенн та розділяючого GlcNAc). При розгляді впливу
оперативного лікування на ступінь глікозильованості ФН виявлено, що
через тиждень після хірургічного втручання спостерігаються незначні
зміни у глікозильованості цього глікопротеїну відносно вихідних значень
(р>0,05).

У плазмі крові хворих на рак щитоподібної залози ідентифіковані
поліпептидні фрагменти ФН з молекулярною масою 185 та 158 кДа, які не
виявляються у здорових людей.

Уперше встановлено зміни рівня плазмового ФН у динаміці лікування в
групах хворих на рак гортані та порожнини рота та в пацієнтів з
пухлинами головного мозку. Доповнені відомості про кореляцію між рівнем
плазмового ФН та рівнем тиреоїдних гормонів і тиреотропного гормону при
папілярній карциномі та доброякісних новоутвореннях щитоподібної залози.

Уперше за допомогою моноклональних антитіл 3Е2 була охарактеризована
локалізація клітинного ФН у тканинах щитоподібної залози людини і
знайдені відмінності його розподілу за умов розвитку неоплазії. У
нормальних тканинах клітинний ФН локалізується переважно у з’єднувальній
тканині; у тканинах еутиреоїдного та токсичного зобів визначається у
колоїді деяких фолікул та у складі клітин фолікулярного епітелію, у
тканинах папілярної аденокарциноми – в окремих ракових клітинах та їх
сукупностях, а також у стромі паренхіми щитоподібної залози. Теоретичне
та практичне значення одержаних результатів. Отримані результати та їх
узагальнення доповнюють і поглиблюють cучасні уявлення про особливості
глікозильованості фібронектинів, їх розподіл у проліферативно активних
тканинах. Виявлені відмінності у ступені глікозильованості та
фрагментованості плазмового ФН онкохворих порівняно з нормою свідчать
про участь цього глікопротеїну в розвитку патологічного стану. У хворих
на рак щитоподібної залози після лікування L-тироксином та радіоактивним
йодом виявляється тісний позитивний кореляційний зв’язок між рівнем
плазмового ФН та рівнем тироксину та негативний кореляційний зв’язок між
рівнем цього глікопротеїну та рівнем тиреотропного гормону, що дозволяє
вважати рівень ФН у плазмі крові за один з маркерів оцінки
функціонального стану щитоподібної залози, при дозуванні та корекції
прийому лікарських препаратів. У ході роботи виявлено відмінності у
ступені глікозильованості плазмового ФН хворих на рак щитоподібної
залози порівняно з нормою, аналіз значення ступеня його
глікозильованості за допомогою лектину ConA може слугувати основою для
створення клінічного тесту для діагностики та прогнозування перебігу
захворювань пухлинного характеру.

Особистий внесок здобувача полягає в підготовці та проведенні
експериментальних досліджень, інтерпретації одержаних результатів. Усі
експериментальні дані, використані в дисертації, отримані при
безпосередній участі автора роботи.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дослідження були
представлені на V Міжнародному медичному конгресі студентів та молодих
вчених (Тернопіль, 2002); VII Українському біохімічному з’їзді
(Чернівці, 2002); у Матеріалах Міжнародної науково-практичної
конференції “Україна наукова” (Дніпропетровськ, 2003); на IV Міжнародній
конференції студентів і молодих вчених “Медицина-здоров’я XXI сторіччя”
(Дніпропетровськ, 2003); у Матеріалах Всеукраїнської науково-практичної
конференції “Біохімія” (Дніпропетровськ, 2003); на HUPO 2nd Annual &
IUBMB XIX World Congress (Montreal, 2003); на Установчому з’їзді
Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004); у Матеріалах
науково-практичної конференції “Актуальні питання променевої діагностики
і лікування онкологічних захворювань” (Чернівці, 2004), на III
Lviv-Lublin Congress in experimental and clinical biochemistry (Lviv,
2004), на 30th FEBS Congress – 9th IUBMB Conference (Budapest, 2005).

Публікація матеріалів. За матеріалами дисертації опубліковано 16
наукових робіт, серед яких 6 статей та 10 тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 132 сторінках і
складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів
дослідження, результатів досліджень та їх обговорення, висновків, списку
літератури, що містить 135 джерел. Текст ілюстрований 16 таблицями та 42
рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Розділ складається з чотирьох підрозділів, у яких докладно розглянуто
структурні та функціональні особливості молекул фібронектинів, їх
експресію та роль у нормі та при розвитку патології. Викладено сучасний
погляд на доцільність визначення ступеня глікозильованості та рівня
плазмового ФН у біологічних рідинах, а також розподілу клітинного ФН у
тканинах для диференційно-діагностичної та прогностичної оцінки розвитку
патологічного стану.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Для дослідження використовувались: плазма здорових людей (n = 37) та
плазма хворих людей з пухлинами різної локалізації (n = 71), з яких – 30
хворих з новоутвореннями щитоподібної залози (ЩЗ), 7 – на рак слизової
порожнини рота, 8 – на рак гортані та 26 хворих з пухлиною головного
мозку; тканини пухлин ЩЗ. Деякі із досліджених груп хворих включали як
жінок, так й чоловіків, що обумовлено відсутністю вірогідних
відмінностей у рівні плазмового ФН при порівнянні цього показника у
хворих обох статей. Діагностика захворювань пацієнтів розглянутих груп
була виконана завідувачем кафедри радіології та променевої терапії ДДМА,
доктором медичних наук, професором Хворостенком М.І. Дані за групою цих
хворих подано у табл. 1.

Визначення вмісту плазмового ФН у крові хворих та здорових людей
проводилось методом кількісного ракетного імуноелектрофорезу з
використанням моноспецифічної поліклональної кролячої антисироватки до
ФН людини, котру одержували шляхом імунізації кролів високоочищеним
плазмовим ФН людини (Фримель Г., 1987). Специфічність отриманої
антисироватки перевіряли перехресним та ракетним імуноелектрофорезами.

Визначення ступеня глікозильованості ФН виконувалось методом афінного
ракетного імуноелектрофорезу з використанням лектину ConA, який
взаємодіє з біантенними N-гліканами комплексного типу молекули ФН.
Фрагментованість плазмового ФН вивчалась методом імуноблоту, який
здійснювався після розділення білків плазми крові за допомогою
електрофорезу в ПААГ з ДСН (Гааль Э., 1982).

Таблиця 1

Характеристика групи здорових людей та груп онкологічних хворих

Групи хворих за типом захворювання Кількість людей

Діапазон віку, роки

Вік, роки

Ж

Ч

Ж та Ч

Ж

Ч

Ж та Ч

Ж

Ч

Ж та Ч

Новоутворення ЩЗ, n = 30

Доброякісні 7 – 7 28-67 – 28-67 49 – 49

Злоякісні 13 – 13 30-61 – 30-61 51 – 51

Злоякісні після тиреоїдектомії 10 – 10 29-67 – 29-67 50 – 50

Пухлини головного мозку, n = 26

Доброякісні 4 3 7 35-63 33-57 33-63 49 48 48,5

Злоякісні 7 12 19 29-65 31-79 29-79 43 46 44,5

Рак гортані 8 – 8 – 39-70 39-70 – 58 58

Рак ротової порожнини 2 5 7 39-68 51-60 39-60 53 53 53

Здорові 17 20 37 42-71 31-70 31-71 54 47 50,5

Примітка. Ж – жінки, Ч – чоловіки.

Отримання пероксидазних кон’югатів лектинів проводилось згідно з
методом, що запропонований Луциком М.Д., 1989. Дослідження розподілу
клітинного ФН, а також сіальованих глікокон’югатів в умовно нормальних,
проліферативно активних та патологічно змінених тканинах проводилось
методами імуногістохімічного та лектингістохімічного аналізу (Луцик
М.Д., 1989). Виявлення клітинного ФН у тканинах щитоподібної залози
здійснювали за допомогою моноклональних антитіл 3Е2 (Sigma, США).

Статистична обробка результатів проводилась за допомогою Excel 97 –
додатка до пакету програм Microsoft Office 97 з використанням
непараметричних та параметричних критеріїв оцінки розбіжності між
вибірками.

У роботі застосовувалися хімічно чисті реагенти фірм Sigma (США),
Chemicon (США), Serva (США), Pharmacia (Швеція), Лектинотест (Львів),
Immunotech, (Чехія), DAKO (Данія).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Рівень плазмового фібронектину при різних типах захворювання. Наші
дослідження спрямовувалися на вивчення рівня плазмового ФН в крові
хворих з новоутвореннями ЩЗ та головного мозку, на рак гортані та
ротової порожнини порівняно з його рівнем у здорових людей, причому
вказані групи хворих досліджувалися до та після операції, а також до та
після курсу лікування.

Як нормативні (контрольні) значення плазмового ФН приймалися усереднені
показники рівня ФН (М + m), одержані при дослідженні 37 здорових людей
(див. табл. 1). Група хворих з новоутвореннями ЩЗ була представлена
жінками. I групу склали хворі з доброякісними новоутвореннями ЩЗ (n =
7), II група включала хворих на рак ЩЗ з призначеною тиреоїдектомією (n
= 13), III група – хворі з уже зробленою тиреоїдектомією (n = 10). У
більшості хворих із II-ї та III-ї груп діагностовано папілярний рак II
стадії.

Для оцінки функціонального стану ЩЗ у хворих на доброякісні та злоякісні
захворювання ЩЗ визначалися рівні Т3, Т4 та ТТГ, що дозволило виявити
взаємозв’язок між рівнем плазмового ФН та вмістом тиреоїдних гормонів і
ТТГ. Дані щодо вмісту тиреоїдних гормонів подано у табл. 2.

Таблиця 2

Характеристика рівня тиреоїдних гормонів при новоутвореннях щитоподібної
залози

Групи Зв’язаний трийодтиронін (Т3), нмоль/л Вільний тироксин (Т4),
пмоль/л Тиреотропін (ТТГ), мМЕ/л

I, (n = 7):

до операції,

після операції 1,59 + 0,19

1,19 + 0,24 11,10 + 1,20

9,39 + 1,15 4,95 + 2,49

9,38 + 0,26***

II, (n = 13):

до операції

після операції

після лікування 1,89 + 0,38

0,80 + 0,17***

1,53 + 0,32 15,10 + 2,38

10,47 + 1,72

5,27 + 3,01* 12,81 + 5,95

30,52 + 6,83***

64,94 + 16,50***

III, (n = 10):

до лікування

після лікування 1,31 + 0,14

1,22 + 0,13 3,30 + 0,48***

12,20 + 2,63 76,95 + 12,51***

46,35 + 12,80**

Норма (n = 10) 1,31 + 0,06 11,64 + 0,45 2,14 + 0,23

Примітки: *, ** та ***– вірогідно відрізняється від норми при p0,05).

Схожі результати отримані й іншими дослідниками. Так, у пацієнтів після
повної тиреоїдектомії у ближчі строки спостереження після операції
рівень плазмового ФН був нижчим за норму, а після прийому L-тироксину
значно зростав (Watzke H., 1987). Результати, отримані при наших
дослідженнях, свідчать, що між рівнем плазмового ФН та рівнем Т4 існує
позитивна кореляція, яка спостерігається у хворих на рак ЩЗ (r = 0,82,
p`?ae? U - " $ & ( * , D F H v O O $ O O $ O $ O O O $ O O O O O ph OJPJQJ O O O O ph O O O O O $ O O ???$?тин, % Клітинний ФН PCNA Кореляція за Спірменом (клітинний ФН-PCNA) Контроль, n = 10 1,20 + 0,31 0,60 + 0,19 0,48¤ Папілярна карцинома, n = 10 4,50 + 1,77¤ 9,90 + 3,53** 0,10¤ Примітки: ¤ - вірогідно не відрізняється від норми (р>0,05); ** –
вірогідно відрізняється від норми (р0,05), що свідчить про наступне: наявність біантенних
вуглеводних структур N-гліканів ФН практично не залежить від статі
людини. У хворих з доброякісними пухлинами ЩЗ ступінь глікозильованості
ФН коливалася від 1,47 до 2,86 до операції, а після неї, у найближчий
строк спостереження, її значення становили від 1,14 до 3,22.

У хворих із злоякісними пухлинами ступінь глікозильованості ФН плазми
характеризувалася величиною від 1,06 до 4,18 в доопераційний період та
від 1,11 до 5,00 у післяопераційний період. Як свідчать дані табл. 6, у
нормі для плазмового ФН спостерігається найбільша кількість реагуючих із
ConA вуглеводних структур. У хворих з доброякісними новоутвореннями ЩЗ
та раком ЩЗ у доопераційний період плазмовий ФН крові має достовірно
нижчу за норму (р0,05).

Припускаємо, що зниження зв’язуючої активності ФН плазми крові хворих на
пухлинні захворювання ЩЗ із ConA свідчить про модифікацію його
вуглеводної структури, яка приводить до зменшення кількості вуглеводних
детермінант, що розпізнаються вищезгаданим лектином, тобто біантенних
N-гліканів комплексного типу. Отримані результати узгоджуються з даними
інших авторів (Guo J.M., 2001), котрі виявили, що при раку сечового
міхура зв’язуюча активність ФН сечі з ConA складає лише 18,1 % від
зв’язуючої активності в нормі. У той же час ФН сечі ракових хворих мав у
3,34 та 3,26 разів більшу активність до DSA (лектину дурману) та WGA
(лектину зав’язів пшениці) відповідно. Це свідчіть про те, що
модифікації у структурі вуглеводного компоненту ФН при розвитку раку
приводять до появи у N-гліканів додаткових олігосахаридних гілок та
поділяючого GlcNAc, які не розпізнаються ConA.

ВИСНОВКИ

У роботі охарактеризовані зміни в основних ізоформах фібронектину, які
визначалися показниками ступеня глікозильованості плазмового
фібронектину, його вмісту, концентрації, розподілом та локалізацією
клітинного фібронектину у нормі та при розвитку процесів новоутворення
та проліферації тканин різних органів.

Зменшення рівня плазмового ФН у крові, модифікація його вуглеводного
компонента, а також підвищення експресії клітинного ФН у клітинах
пухлинних тканин спостерігається при розвитку неоплазії.

Уміст плазмового ФН вірогідно менший за норму при новоутвореннях
щитоподібної залози, при злоякісних пухлинах головного мозку в
доопераційний період, при раку гортані та порожнини рота. Більшість
пацієнтів у групах хворих на рак гортані та рак порожнини рота (до 75%)
мали низький рівень плазмового ФН (100-300 мкг/мл).

Тісний позитивний кореляційний зв’язок рівня плазмового ФН з рівнем
тироксину (r = 0,82, p0,05).

Ключевые слова: плазменный фибронектин, клеточный фибронектин,
гликозилированность, ConA, онкозаболевания.

SUMMARY

Lutay N.V. Glycosylation of fibronectins and their biologycal activity
in norm and under pathologycal condition. – Manuscript.

Thesis for a scientific degree of candidate of biological sciences by
speciality 03.00.04 – biochemistry.-V.N. Karazin Kharkov National
University, Kharkov, 2004.

The dissertation is devoted to research of structural and quantitative
changes of blood plasma fibronectin and the features of cell fibronectin
distribution in normal and pathological tissues. Neoplasm development
accompanied with decrease of plasma fibronectin level in blood and
modification of this one’s carbohydrate component. The quantity of
plasma fibronectin carbohydrate determinants recognized by lectin ConA
in thyroid neoplasms was valid reduced, that may be related to
alteration of carbohydrate structure. The high fragmentation of plasma
fibronectin in blood of the patients with thyroid cancer was marked. The
distinctions in distribution and localization of cell fibronectin in
thyroid diseases were shown. The content of cell fibronectin in thyroid
tissues does not depend on cells proliferative activity.

Keywords: plasma fibronectin, cell fibronectin, glycosylation, ConA,
tumor diseases.

Підписано до друку 2005 р. Формат 60х90 1/16. Папір офсетний.

Друк плоский. Ум. друк. арк. 0,9. Тираж 100 прим. Замовлення № 1517

Друкарня ООО ЕК “Advance”. 49038, м. Дніпропетровськ, вул. Пастера, 10

тел. (0562)32-38-13, (0562)32-38-14

ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ

ДСН – додецил сульфат натрію

ПААГ – поліакриламідний гель

ФН – фібронектин

ЩЗ – щитоподібна залоза

ConA – конканавалін А

Gal – галактоза

GlcNAc – N-ацетилглюкозамін

МАА – лектин маакії амурської

Man – манноза

NeuAc – нейрамінова кислота

PAGE \* Arabic 23

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020