НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ

ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

Кур’ята Ніна Володимирівна

УДК 579.864 : 576.52 + 57.083.3

Адгезивні та імуномодулюючі властивості бактерій роду lactobacillus

03.00.07 – мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі мікробіології і вірусології

Одеського національного університету ім. І. І. Мечникова

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, доцент, Єлинська

Наталія Олексіївна, Одеський
національний

університет ім. І.І. Мечникова,
доцент кафедри

мікробіології і вірусології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент

НАН України Коваленко Надія
Костянтинівна,

провідний науковий співробітник
відділу фізіології

промислових мікроорганізмів Інституту
мікробіології і

вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН
України

кандидат біологічних наук, старший
науковий

співробітник Рожанська Олександра
Михайлівна,

старший науковий співробітник
Технологічного

інституту молока і м’яса УААН

Провідна організація: Інститут мікробіології та імунології ім.

І.І. Мечникова АМН України

Захист відбудеться “16” березня 2005 р. о 12 годині на засіданні
спеціалізованої вченої раді Д 26.233.01 Інституту мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: м. Київ, 03143,
вул. Заболотного, 154

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: м. Київ, 03143,
вул. Заболотного, 154

Автореферат розісланий “16” лютого 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук
Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Бактерії роду Lactobacillus є невід’ємною складовою
нормальної мікробіоти організму людини. Нормальна мікробіота кишечника
відіграє значну роль у створенні високої колонізаційної резистентності
травного тракту до умовно-патогенних мікроорганізмів, а також слугує для
підтримання на оптимальному рівні метаболічних процесів та імунологічної
реактивності макроорганізму. Позитивний вплив лактобацил на стан та
діяльність шлунково-кишкового тракту зумовлена їх здатністю до
цитоадгезії, забезпеченням стабільних антагоністичних ефектів у
біоценозі завдяки продукції біологічно активних речовин та стійкості до
впливу зовнішніх чинників [Смирнов и др., 2002]. Тому при дослідженні
біологічних властивостей лактобацил важливо оцінити їх адгезивні
властивості, вплив на чинники неспецифічної резистентності та інші
параметри.

Оскільки останнім часом велику увагу приділяють антиадгезивній терапії
по відношенню до бактеріальних збудників захворювань [Коробкова, 2002],
важливою проблемою є встановлення властивостей лектинів-адгезинів
симбіотичної мікробіоти з метою оцінки можливості їх застосування при
антиадгезивній терапії, спрямованій на вилучення з мікробіоценозу
умовно-патогенних чи патогенних бактерій.

На стан та життєдіяльність нормальної мікробіоти впливає багато
фізико-хімічних та біологічних чинників шлунково-кишкового тракту
[Федоровская, Немировская, 1999]. Персистенція бактерій всередині
макроорганізму є ефективною при умові толерантності їх до чинників
неспецифічної резистентності ?Бухарин, Валышев, 1997?.

Нормальна мікробіота кишечника відіграє значну роль у створенні високої
колонізаційної резистентності травного тракту до умовно-патогенних
мікроорганізмів [Goto et al., 1999], а також слугує для підтримання на
оптимальному рівні метаболічних процесів та імунологічної реактивності
макроорганізму [Блохина, Дорофейчук, 1977]. Бактеріотерапія як галузь
біомедицини стає все більш актулаьним напрямком корекції дисбіотичних та
імунодефіцитних зрушень [Земсков, 1991], тому вивчення впливу лактобацил
на інтенсивність імунної відповіді є актуальним.

Для бактерій роду Lactobacillus добре дослідженими є такі
характеристики, як антагоністична активність та адгезивність [Брилис,
1983]. Для деяких штамів лактобацил досліджено здатність продукувати
лізоцим [Ленцнер и др., 1975], а також вплив на окремі ланки імунної
системи ссавців [Бондаренко и др., 1998]. Однак комплексного дослідження
персистентних характеристик лактобацил, включаючи механізми
міжклітинної взаємодії, синтез лізоциму, здатність протистояти чинникам
неспецифічної резистентності макроорганізму, а також вивчення
імуномодулюючої активності лактобацил, проведено не було.

Дослідження персистентних характеристик бактерій роду Lactobacillus в
організмі людини та тварин має важливе значення при раціональному доборі
ефективних бактерійних штамів – кандидатів у пробіотики.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано
у відповідності з напрямком науково-дослідних робіт кафедри
мікробіології і вірусології Одеського національного університету ім. І.
І. Мечникова в рамках проведення досліджень за кафедральними темами РК
344 „Вивчення екологічних, таксономічних, фізіолого-біохімічних та
біотехнологічних властивостей молочнокислих бактерій півдня України” та
РК 337 “Збереження мікробних ресурсів шляхом підтримування колекції
культур мікроорганізмів та їх використання в екологічній біотехнології”,
а також в рамках індивідуального проекту “Вивчення антагоністичних,
адгезивних та імуномодулюючих властивостей лактобацил з метою створення
пробіотичних препаратів” за підтримки гранту Президента України для
обдарованої молоді (Грант № 16, Указ Президента України від 1 січня 2002
року).

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи було вивчення адгезивних
та імуномодулюючих властивостей штамів бактерій роду Lactobacillus,
вилучених з шлунково-кишкового тракту дітей.

Для досягнення поставленої мети дослідження вирішували наступні задачі:

— вивчити in vitro здатність штамів лактобацил до взаємодії з клітинами
макроорганізму (адгезії та гемаглютинації) та вплив вуглеводів на ці
процеси;

— дослідити вплив фізико-хімічних та біологічних чинників макроорганізму
на адгезивні та гемаглютинуючі властивості лактобацил;

— вивчити здатність штамів лактобацил до продукції лізоциму;

— дослідити наявність антикомплементарної та антилізоцимної активності
лактобацил;

— дослідити in vivo вплив штамів лактобацил на чинники клітинної та
гуморальної імунної відповіді макроорганізму;

— визначити штами, перспективні для використання з метою колонізації
шлунково-кишкового тракту та підвищення імунорезистентності
макроорганізму;

— визначити пріоритетні чинники персистенції лактобацил в нормальному
мікробіоценозі шлунково-кишкового тракту дітей

Об’єктом дослідження були 66 штамів бактерій роду Lactobacillus,
ізольованих з кишечника здорових дітей, 7 штамів бактерій роду
Lactobacillus, ізольованих з кишечника хворих на дисбактеріоз дітей, що
мешкають в м. Одесі, а також 4 музейних штами: L. buchneri АТСС 4005, L.
fermentum ATCC 14931, L. acidophilus АТСС 33200 і L. acidophilus АТСС
4356.

Предметом дослідження була здатність штамів лактобацил до адгезії та
гемаглютинації, вплив вуглеводів на ці процеси, вплив рН, протеолітичних
ферментів та лізоциму на адгезивні властивості, лізоцимна активність
лактобацил, здатність інактивувати лізоцим та комплемент, а також
імуномодулююча активність штамів бактерій роду Lactobacillus.

Матеріали та методи дослідження. Для виконання поставлених завдань
використовували мікробіологічні, цитологічні, фізико-хімічні,
біохімічні, фізіологічні та імунологічні методи дослідження.

Наукова новизна одержаних результатів.

Для групи виділених штамів вперше оцінено здатність до адгезії та
гемаглютинації, а також вплив вуглеводів на ці процеси. Виділено групу
штамів, адгезія яких не залежала від D-манози.

Встановлено вплив рН, пепсину, трипсину, хімотрипсину та лізоциму на
здатність вилучених штамів лактобацил до міжклітинної взаємодії.

Вперше досліджено антикомплементарну активність у бактерій роду
Lactobacillus та показано повну її втрату при умовах тривалого
зберігання.

Показано позитивний вплив перорального прийому живих клітин окремих
штамів лактобацил на фагоцитарну та окислювальну активність
перитонеальних макрофагів мишей, досліджено його динаміку.

Показано здатність окремих штамів лактобацил стимулювати продукцію
сироваткового інтерферону, а також готовність спленоцитів та макрофагів
до продукції інтерферонів різних класів.

Практичне застосування.

Створено колекцію інтестінальних штамів бактерій роду Lactobacillus,
здатних до цитоадгезії на клітинах організму людини.

Відібрано штами, які мали високу здатність до адгезії та одночасно були
толерантними до дії протеолітичних ферментів та лізоциму.

Модифіковано метод вивчення лізоцимної активності лактобацил.

Адаптовано методи визначення антилізоцимної та антикомплементарної
активності для вивчення цих характеристик у лактобацил

Виявлено штами, які при пероральному застосуванні підсилювали
інтенсивність фагоцитарної та окислювальної активності перитонеальних
макрофагів мишей, а також підсилювати рівень сироваткового інтерферону
та готовність макрофагів і спленоцитів мишей продукувати інтерферони
різних класів за наявності відповідних індукторів.

Відібрано штами з комплексом адгезивних та імуномодулюючих властивостей,
перспективні як кандидати у пробіотики для замісної терапії та
підвищення імунорезистентності макроорганізму.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертації самостійно виконані
літературний пошук та аналіз літературних джерел за темою дисертації,
підбір та модифікація методів дослідження, планування експериментів,
вилучення штамів з природного середовища, отримання чистих культур,
вивчення адгезивних і гемаглютинуючих властивостей штамів лактобацил,
впливу на них різних чинників, лізоцимної, антилізоцимної та
антикомплементарної активності, імуномодулюючих властивостей, а також
статистичне опрацювання, аналіз отриманих результатів і оформлення
роботи. Вилучення з вмісту ШКТ дітей штамів лактобацил проводилося
автором спільно з аспірантами Фабіянською І. В. та Янченко О. І,
дослідження впливу лактобацил на фагоцитарну аткивність перитонеальних
макрофагів – спільно з проф. кафедри мікробіології та вірусології ОНУ
ім. І. І. Мечникова Філіпової Т. О., які є співавторами відповідних
публікацій. Постановка завдань і обгрунтування науково-практичних
висновків проводились спільно з науковим керівником. Друковані роботи
підготовлено автором особисто при безпосередній участі наукового
керівника.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи було
представлено на 56-й науковій студентській конференції Одеського
державного універистету ім. І. І. Мечникова (Одеса, квітень 1999 року),
Першій Всеукраїнській конференції студентів біологічних факультетів
(Київ, 20 – 22 грудня 1998 р.), Всеукраїнському мікробіологічному з’їзді
(Чернігів, жовтень 2000 р.), міжнародній конференції “Екологія і
біогеохімічна діяльність мікроорганізмів” (Одеса, 4 – 6 вересня 2001
р.), Всеукраїнській конференції студентів, аспірантів і молодих вчених
“Біорізноманіття природних і техногенних біотопів України” (Донецьк, 19
– 22 листопада 2001 р.), 6-й Пущинській школі-конференції молодих вчених
“Биология – наука XXI века” (Росія, Пущіно, 20 – 24 травня 2002 р.), на
науковій конференції студентів, аспірантів і молодих вчених, присвяченій
180-літтю з дня народження Л. С. Ценковського “Біорізноманітя. Екологія.
Еволюція. Адаптація” (Одеса, 28 березня – 1 квітня 2003 р.), Міжнародній
студентській науковій конференції “Молодь – медицині майбутнього”
(Одеса, 24 – 25 квітня 2003 року), 58-й науковій конференції
професорсько-викладацького складу і наукових працівників ОНУ ім. І. І.
Мечникова (Одеса, 2003), Всесвітньому Мікробіологічному Конгресі FEMS –
2003 (Любляна, 29 червня – 3 липня 2003 р.) та Всеукраїнському
мікробіологічному з’їзді (Одеса, жовтень 2004 р.)

Публікації. Результати дисертаційної роботи представлено в 6-ти
статтях, опублікованих в профільних журналах, та в 7-ми тезах,
опублікованих за матеріалами з’їздів та конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 141
сторінці машинописного тексту і складається зі вступу, огляду
літератури, матеріалу і методів дослідження, експериментальної частини
(6 розділів), аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків
та списку літератури, який містить 215 найменувань, в тому числі 101
іноземною мовою. Робота містить 32 таблиці та 12 рисунків.

РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Складається з 3-х підродзілів, в яких розглянуто систематичне положення
та біологічні властивості бактерій роду Lactobacillus. Докладно
розглянуті такі чинники персистенції лактобацил в організмі людини і
тварин, як здатність до цитоадгезії, лізоцимна, антилізоцимна та
антикомплементарна активність. Також викладено наукові дані про
імуномодулюючі властивості лактобацил.

РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Матеріалом дослідження слугували 66 штамів, вилучених з фекалій
здорових та 7 штамів, вилучених з фекалій хворих на дисбактеріоз дітей,
що мешкають в Одеському регіоні, та за своїми культуральними,
морфологічними та фізіолого-біохімічними властивостями віднесених до
роду Lactobacillus, та 4 музейних штами: L. bucheri АТСС 4005, L.
fermentum ATCC 14931, L. acidophilus АТСС 33200 і L. acidophilus АТСС
4356.

Культивування лактобацил проводили на середовищі MRS [de Man et al.,
1960].

Адгезивні та гемаглютинуючі властивості штамів лактобацил вивчали на
моделі “еритроцит – лактобацила”. Адгезивні властивості досліджували за
допомогою експресного та розгорнутого методів [Брилис и др., 1986],
здатність до гемаглютинації – за допомогою реакції гемаглютинації
[Брилис, 1988].

Для виявлення впливу вуглеводів, рН середовища (рН 2,0 – 2,2 та 8,0 –
8,5) та ферментів (пепсину, трипсину, хімотрипсину та лізоциму) на
здатність лактобацил до адгезії та гемаглютинації застосовували
модифікований розгорнутий метод [Брилис, 1988]. Концентрації вуглеводів
становили 0,3 М, концентрації ферментів – 1 мг/мл.

Якісний тест на наявність продукції лізоциму проводили за методом
[Hawiger, 1968] у нашій модифікації [Кур’ята, Єлинська, 2003].

Здатність штамів лактобацил до інактивації лізоциму (антилізоцимну
активність – АЛА) визначали методами [Бухарин и др., 1997; Hawiger,
1968] у нашій модифікації .

Антикомплементарну активність (АКА) штамів лактобацил визначали за
допомогою методу [Пастер с соват., 1989] в нашій модифікації [Кур’ята,
Єлинська, 2003].

Для визначення клітинних індексів тимусу і селезінки тварин забивали
методом цервікальної дислокації, після чого діставали тимус і селезінку
і поміщали у розчин Хенкса на льоду. Тимус гомогенізували у 2 мл,
селезінку – в 4 мл розчину Хенкса. Гомогенат тимусу розводили розчином
Хенкса в 10 разів, гомогенат селезінки – в 20 разів. У планшети для
імунологічних досліджень вносили по 0,1 мл суспензії клітин і
трипанового синього, після чого клітини рахували в камері Горяєва.

Фагоцитарну активність перитонеальних макрофагів мишей досліджували
методами [Вихоть, 1982; Kaminski et al., 1985].

Окислювальну активність перитонеальних макрофагів мишей в тесті з
нітросинім тетразолієм (НСТ) досліджували методом [Вихоть, 1982;
Alfoidy, Lemmel, 1979].

Інтенсивність гіперчутливості сповільненого типу (ГСТ) вивчали за
методикою припухлості подушечки задньої лапки [Lagrange, Mackanes,
1975].

Статистичне опрацювання проводили з використанням програми „Excel XP” за
загальноприйнятими методиками з урахуванням t-критерію Стьюдента, рівень
вірогідності становив 95 % [Плохинский, 1978].

РОЗДІЛ 3. ЗДАТНІСТЬ ЛАКТОБАЦИЛ ДО ВЗАЄМОДІЇ З ЕУКАРІОТИЧНИМИ КЛІТИНАМИ

За даними проведених досліджень, всі штами, вилучені з травного тракту
здорових дітей, були здатними до адгезії в середньому (53,0 % штамів)
або високому (47 %) ступені (рис. 1). Значення середніх показників
адгезії (СПА) становили від 2,24 ± 0,21 до 7,52 ± 0,35 кл/ер. Штами,
вилучені від дітей, хворих на дисбактеріоз, були низькоадгезивними або
нездатними до адгезії взагалі. Значення їх СПА становили від 0,81 ± 0,22
до 2,85 ± 0,31 кл/ер. До гемаглютинації були здатні 56,1 % штамів
лактобацил, виділених з травного тракту здорових дітей, причому 25,8 %
мали низьку, 22,7 % — середню і 7,6 % — високу здатніcть до
гемаглютинації (рис. 2).

Оскільки до адгезії були здатні 100 % штамів, вилучених від здорових
дітей, а до гемаглютинації – 56,1 %, можна зробити припущення, що
адгезія і гемаглютинація як функції зв’язування лактобацил з поверхнею
еукаріотичних клітин забезпечуються різними групами клітинних
поверхневих детермінант. Тому за здатністю лактобацил до гемаглютинації
не можна передбачати їхню адгезивну активність.

Відомо, що на адгезію багатьох мікроорганізмів впливає D-маноза, і тому
її використовують в антиадгезивній терапії проти патогенних та
умовно-патогенних мікроорганізмів. Тому дослідження впливу цього
вуглевода на адгезію лактобацил має практичне значення з метою пошуку
штамів, придатних до застосування одночасно з антиадгезивною терапією.

Вивчення впливу D-манози на адгезію лактобацил показало, що адгезія
більшості (63,6 %) досліджуваних штамів лактобацил, виділених з травного
тракту здорових дітей, не залежала від D-манози (рис. 3).

Також було знайдено штами, які під впливом D-манози знижували або
підвищували свої адгезивні властивості. Штами, на адгезивність яких
обробка D-манозою не впливала, при подальшому дослідженні можуть бути
рекомендовані до застосування при одночасній антиадгезивній терапії,
спрямованій на патогенні та умовно-патогенні мікроорганізми.

При дослідженні впливу D-манози на гемаглютинуючі властивості лактобацил
було показано, що цей моносахарид може як знижувати, так і підвищувати
гемаглютинуючу активність штамів лактобацил. Так, у 10-ти штамів (15,2
%) виявлялися нижчі, а у 6-ти штамів (9,1 %) – вищі гемаглютинуючі
властивості, ніж без цього вуглевода (рис. 4).

Вивчення впливу вуглеводів на адгезію та гемаглютинацію лактобацил
показало, що D-глюкоза, DL-галактоза, D-маноза, D-фруктоза, D-ксилоза,
D-рафіноза, L-рамноза, L-арабіноза та N-ацетил-D-глюкозамін могли як
пригнічувати, так і підсилювати дані процеси.

З отриманих результатів видно, що для штамів лактобацил, вилучених від
здорових дітей, здатність до цитоадгезії була обов’язковою, і їх СПА
мали середні й високі значення. Штами, вилучені від хворих дітей, мали
низьку або нульову здатність до цитоадгезії. Здатність до гемаглютинації
була притаманна більш, ніж половині штамів лактобацил. Більшість штамів
мали манозонезалежні адгезивні властивості. Штами з високим та середнім
ступенем адгезії, які під впливом D-манози не знижували адгезивних
властивостей, є найбільш перспективними для замісної терапії з
застосуванням D-манози як антиадгезивного засобу.

РОЗДІЛ 4. ВПЛИВ рН СЕРЕДОВИЩА ТА ФЕРМЕНТІВ НА АДГЕЗИВНІ І ГЕМАГЛЮТИНУЮЧІ
ВЛАСТИВОСТІ ЛАКТОБАЦИЛ

Досліджували вплив рН 2,0 – 2,2 та 8,0 – 8,5 і ферментів (лізоциму,
пепсину, трипсину та хімотрипсину) на адгезивні властивості лактобацил.
Проведене дослідження показало, що на адгезивність більшої частки штамів
лактобацил, вилучених від здорових дітей, вказані чинники не впливали.
При кислій та лужній реакції середовища адгезивні властивості
змінювалися тільки у 18,2 % і 16,6 % штамів відповідно, причому вони
могли як знижуватись, так і підвищуватись (рис. 5 а).

Більшість (84,8 %) штамів лактобацил, вилучених від здорових дітей, були
стійкими до дії пепсину і не змінювали під його впливом своїх адгезивних
властивостей. Тільки у 15,2 % штамів з цієї групи знижувались або
підвищувались значення СПА (рис. 5б). При дослідженні впливу трипсину та
хімотрипсину на адгезивні властивості лактобацил було показано, що
переважна більшість штамів були стійкими до дії цих ферментів і не
змінювали своїх показників адгезії. Під впливом лізоциму для більшості
штамів адгезивні властивості також залишалися незмінними, однак для 15,2
% було показано зниження значень СПА (рис. 5в). З отриманих
результатів видно, що серед чинників середовища, характерних для шлунку,
більш агресивний вплив на адгезивність лактобацил чинив пепсин, тоді як
рН середовища на показники адгезії впливало незначним чином. Серед
чинників, характерних для кишечника, навпаки, більший вплив на
адгезивність лактобацил чинили рН середовища, а трипсин та хімотрипсин
на цю властивість практично не впливали. Значно впливав на адгезивність
лактобацил лізоцим, що свідчить про його важливу роль в місцевому
неспецифічному імунітеті, яка позначається і на представниках нормальної
мікробіоти.

З усіх досліджуваних ферментів зниження адгезивності у найбільшої частки
штамів викликали пепсин та лізоцим. Це свідчить про те, що стійкість
адгезивних властивостей до впливу цих ферментів є важливим критерієм при
відборі потенційних пробіотичних штамів.

Штами, на чию адгезивність не впливали протеази та лізоцим, можна
вважати перспективними як основу пробіотичних пепаратів для заселення
травного тракту людини з метою підвищення колонізаційної резистентності
організму.

РОЗДІЛ 5. ІМУНОМОДУЛЮЮЧІ ВЛАСТИВОСТІ ШТАМІВ ЛАКТОБАЦИЛ

Дослідженя здатності штамів лактобацил до синтезу лізоциму показало, що
лізоцимну активність виявляли близько чверті штамів (25,7 %) (рис. 6).

Рівень лізоцимної активності досліджуваних штамів був еквівалентний
концентраціям яєчного лізоциму від 0,15 ± 0,04 до 6,38 ± 0,08 мкг?мл.
Отримані дані свідчать, що лізоцимну активність не можна вважати
характерною для більшості штамів, що в нормі колонізують кишечник дітей.
Низький рівень цієї активності свідчить про те, що інтестінальні штами
лактобацил здатні робити незначний внесок до місцевого імунітету
слизової оболонки кишечника.

До інактивації лізоциму не був здатен жодний штам лактобацил, вилучений
від здорових дітей.

Інактивувати комплемент в гемолітичній системі були здатні 9,1 %
досліджуваних штамів лактобацил: 2 штами (3, 0 %) мали низький ступінь
антикомплементарної активності (АКА), 4 штами (6,1 %) мали АКА
середнього ступеню (рис. 7).

Рівень АКА становив від 4,69 ± 0,15 до 5,92 ± 0,03 С1Н50-одиниць
комплементу. При зберіганні на середовищі MRS упродовж 1,5 років усі
штами лактобацил втрачали АКА.

OJPJQJ

&

?? &

I

ph

@

$

@

???????лемент свідчить про те, що вони не можуть чинити в кишечнику
будь-якої імуносупресивної дії.

Дослідження впливу лактобацил на функціональну активність перитонеальних
макрофагів мишей показали, що пероральний прийом живих клітин штамів L.
brevis 16, L. fermentum ATCC 14931, L. delbrueckii subsp. bulgaricus
432, L. reuteri 19 і L. plantarum 1005 підвищував фагоцитарну активність
перитонеальних макрофагів мишей в 1,32 – 2,72 рази (рис. 8а).

Пероральний прийом цих же штамів, а також штаму L. reuteri 132
підвищував окислювальну активність макрофагів у 2,27 – 6,45 разів (рис.
8б).

Дослідження динаміки впливу лактобацил на показники фагоцитозу
(фагоцитарний індекс (ФІ), фагоцитарне число (ФЧ) та фагоцитарну
активність (ФІ)) показало, що на 1-шу добу перорального введення штамів
лактобацил у мишей відбувалося збільшення поглинальної здатності
макрофагів (ФІ) на 28,0 %, але кількість активних макрофагів (ФЧ)
становила 0,59 від контролю. На 3-тю добу спостерігалося підвищення ФІ
на 31,1 % і ФЧ в 2,25 разів, що приводило до значного підвищення ФА – в
2,95 разів відносно контролю. На 10-ту добу здатність макрофагів
поглинати стафілококи майже не відрізнялася від контрольної, однак
відсоток активних макрофагів (ФЧ) був підвищений у 1,66 разів, що і
забезпечувало в 1,59 разів вищу ФА, ніж у контрольних тварин.
Дослідження динаміки впливу перорального прийому штамів лактобацил на
окислювальну активність перитонеальних макрофагів мишей показало, що
протягом 1-ї доби вона і в спонтанному, і в активованому НСТ-тестах
зростала вдвічі. На 3-тю і 10-ту доби кількість макрофагів, що виявляли
окислювальну активність, у дослідних тварин була вищою, ніж у
контрольних на 26,7 % і 49,9 % відповідно. Прийом штаму L. plantarum
1005 приводив до збільшення функціонального резерву клітин на 11,35 %.

Дослідження впливу перорального прийому штамів лактобацил на клітинні
індекси тимусу мишей показало, що штам L. delbrueckii subsp. bulgaricus
432 призводив до зниження вмісту тимоцитів у тимусі в 2,86 рази, L.
reuteri 19 підвищував цей показник у 2,31 рази, а штами L. brevis 16,
L. fermentum ATCC 14931, L. plantarum 1005 i L. reuteri 132 на
клітинні показники тимусу не впливали.

Штам L. fermentum ATCC 14931 при пероральному веденні приводив до
зниження інтенсивності ГСТ у мишей в 1,64 рази, що може свідчити про те,
що лактобацили можуть знижувати інтенсивність запального процесу.

Досліджували вплив перорального прийому живих клітин лактобацил на
продукцію інтерферонів спленоцитами і макрофагами перитонеального
ексудату мишей, а також сироваткового інтерферону. Було показано, що у
мишей, які отримували штам L. plantarum 1005 протягом 1-ї доби,
спостерігалося підвищення продукції сироваткового інтерферону вдвічі
порівняно з контролем – 312,50 і 156,25 МО/0,1 мл, відповідно. Також
виявлено підвищену готовність МФПЕ і спленоцитів продукувати ? – і
?-інтерферон за наявності відповідних індукторів.

Отримані дані свідчать про те, що досліджувані штами лактобацил є
перспективними не тільки для корекції мікробіоти травного тракту, а й
для підвищення опірності до інфекцій, локалізованих поза його межами. Це
стосується, насамперед, штамів, здатних підвищувати функціональну
активність макрофагів та продукцію інтерферону.

РОЗДІЛ 6. ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАМІВ ЛАКТОБАЦИЛ, ПЕРСПЕКТИВНИХ ДЛЯ СТВОРЕННЯ
ПРОБІОТИЧНИХ ПРЕПАРАТІВ

Серед досліджуваних штамів лактобацил, вилучених з вмісту кишечника
здорових дітей, було виявлено такі, які здебільшого зберігали свої
адгезивні властивості під впливом чинників, характерних для травного
тракту, і водночас були здатні позитивно впливати на інтенсивність
фагоцитозу. До таких штамів віднесено L. delbrueckii subsp. bulgaricus
432, L. plantarum 1005, L. reuteri 132, L. fermentum ATCC 14931,
L. brevis 16 і L. reuteri 19 (табл. 1). Крім того, для штамів L.
plantarum 1005 і L. fermentum ATCC 14931 було показано здатність
підвищувати рівень сироваткового інтерферону та здатність до продукції
інтерферонів макрофагами і спленоцитами мишей.

Штами L. plantarum 13, L. helveticus 22, L. acidophilus 291, L.
delbrueckii subsp. lactis 123 мали так само стабільні адгезивні
властивості середнього і високого рівня, а також – лізоцимну активність,
яка в лізоцимному еквіваленті перевищувала 1мкг/мл (табл. 2).

Водночас дані штами, як і вся група в цілому, не мали антилізоцимної
активності. З цієї групи штамів тільки один мав антикомплементарну
активність, але він втрачав її протягом тривалого зберігання.

Штами L. acidophilus 295, L. brevis 144, L. casei subsp. tolerans 290,
L. delbrueckii subsp. delbrueckii 146, L. delbrueckii subsp. lactis 269,
L. delbrueckii subsp. lactis 918, L. fermentum 153, L. fermentum 169, L.
helveticus 20, L. helveticus 197, L. kefir 289, L. plantarum 130, L.
plantarum 209, L. reuteri 236, Lactobacillus spp. 15, 17, 202 i 275 мали
високі адгезивні властивості, які не знижувались під впливом пепсину,
трипсину, хімотрипсину, а також лізоциму.

Адгезивність штамів L. brevis 144, L. delbrueckii subsp. delbrueckii
146, L. delbrueckii subsp. lactis 269, L. delbrueckii subsp. lactis
918, L. fermentum 153, L. fermentum 169, L. helveticus 197,
L. plantarum 209, Lactobacillus spp. 15, 17 і 275 не пригнічувалася
D-манозою. Таблиця 1

Характеристики штамів лактобацил з адгезивними та імуномодулюючими
властивостями

Штам Адгезивність

(рівень СПА) Збереження адгезивності

під впливом

Стимуляція активності макрофагів, рази

Зміна клітинних індексів порівняно з контролем

D-манози

Пепсину

Трипсину

Хімотрипсину

Лізоциму

Фагоцитарної

Окислюавльної

Тимусу (рази)

Селезінки (%)

Антикомплементарна активність,

анти-С1Н50

Лізоцимна активність, мкг/мл

L. delbrueckii subsp. bulgaricus 432 5,28 ± 0,44 — + + + + 2,07 6,45
0,35 — 1,0 0 2,85 ± 0,08

L. fermentum АТСС 14931 6,80 ± 0,43 + + + + + 2,72 4,71 1,42 24,0 0 0

L. plantarum 1005 6,32 ± 0,43 — — + + + 1,32 2,27 1,26 — 3,0 5,37 ± 0,02
0

L. reuteri 132 4,96 ± 0,41 + + + + + 0,86 2,22 0,75 4,0 0 0

L. brevis 16 4,68 ± 0,39 + — + + + 1,33 1,46 0,93 14,0 0 0,76 ± 0,08

L. reuteri 19 5,36 ± 0,47 + + + + — 1,58 5,64 2,31 31,0 0 0

Примітка: р ? 0,05

Таблиця 2

Характеристики штамів лактобацил з адгезивними властивостями та
лізоцимною активністю

Штам Адгезивність

(рівень СПА) Збереження адгезивності

під впливом

D-манози

Пепсину

Трипсину

Хімотрипсину

Лізоциму

Антикомплементарна активність,

анти-С1Н50

Лізоцимна активність, мкг/мл

L. plantarum 13 3,40 ± 0,33 + + + + + 0 1,02 ± 0,08

L. helveticus 22 4,00 ± 0,43 — + + + + 0 1,20 ± 0,14

L. acidophilus 291 7,52 ± 0,35 — + + + + 4,76 ± 0,18 6,38 ± 0,08

L. delbrueckii subsp. lactis 123 3,32 ± 0,44 + + + + — 0 3,81 ± 0,11

Примітка: р ? 0,05

Штами лактобацил, що були здатні підсилювати фагоцитарну і окислювальну
активність перитонеальних макрофагів мишей, стимулювали продукцію
інтерферону, а також мали високі адгезивні властивості, що зберігалися
під впливом травних ферментів та лізоциму, при подальшому дослідженні є
перспективними для застосування в імуномодулюючій терапії, спрямованій
на покращення неспецифічних захисних реакцій на рівні організму. Такі
штами зможуть ефективно закріплюватись всередині травного тракту завдяки
своїм стабільним адгезивним властивостям. Штами з стабільними
адгезивними властивостями та лізоцимною активністю при подальшому
дослідженні можуть вважатися перспективними не тільки для заселення
травного тракту і стабілізації місцевого неспецифічного захисту слизової
оболонки кишечника – зокрема, рівня лізоциму.

Штами з високими адгезивними властивостями, які не знижувались під
впливом пепсину, трипсину, хімотрипсину та лізоциму, при умові
подальшого вивчення їх біологічних властивостей є перспективними для
застосування в замісній терапії. Штами, на чию адгезивність не впливала
D-маноза, є перспективними до застосування одночасно з антиадгезивною
манозотерапією.

Отримані дані свідчать про те, що лактобацили можуть бути перспективними
для застосування не тільки з метою корекції мікробіоти травного тракту,
а й для підвищення опірності до інфекцій, локалізованих поза його
межами.

ВИСНОВКИ

Всі штами бактерій роду Lactobacillus, вилучені від здорових дітей, були
здатними до адгезії на середньому або високому рівні, здебільшого не
знижували адгезивних властивостей під впливом протеолітичних ферментів
травного тракту, не інактивували лізоциму та в більшості не мали
антикомплементарної активності. Штами, вилучені від хворих дітей, були
нездатними до адгезії або виявляли низький рівень адгезивної активності.

Здатність лактобацил до адгезії не співпадала зі здатністю до
гемаглютинації, яку виявляли 56,1 % штамів. На процеси адгезії та
гемаглютинації лактобацил впливали D-глюкоза, DL-галактоза, D-маноза,
D-фруктоза, D-ксилоза, D-рафіноза, L-рамноза, L-арабіноза та
N-ацетил-D-глюкозамін, які могли як пригнічувати, так і підсилювати дані
процеси.

Встановлено, що пероральний прийом штамів L. brevis 16, L. delbrueckii
subsp. bulgaricus 432, L. plantarum 1005, L. reuteri 132, L. reuteri 19
і L. fermentum ATCC 14931 чинив на фагоцитарну та окислювальну
активність перитонеальних макрофагів мишей стимулюючий вплив, який
здебільшого не супроводжувався різкими змінами в клітинних індексах
тимусу та селезінки.

Штами L. plantarum 1005 і L. fermentum ATCC 14931 при пероральному
прийомі приводили до підвищення рівня сироваткового інтерферону мишей та
здатності макрофагів і спленоцитів до продукції ?- та ?- інтерферонів.

Штами, які підвищували функціональну активність макрофагів, були
здатними до синтезу лізоциму, а також не знижували адгезивних
властивостей під впливом травних ферментів та лізоциму, можуть бути
перспективними для підвищення неспецифічної імунорезистентності
макроорганізму та замісної терапії.

Чинники персистенції штамів лактобацил, які в нормі виділяються з вмісту
шлунково-кишкового тракту дітей, за ступенем їх поширеності можна
розташувати наступним чином: адгезивність, стійкість до протеолітичних
ферментів та лізоциму, лізоцим на активність. Антикомплементарна і
антилізоцимна активність інтестінальним штамам лактобацил притаманні не
були.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Кур’ята Н.В., Єлинська Н.О. Вивчення здатності до цитоадгезії бактерій
роду Lactobacillus // Вісник Одеського державного університету. – 2000.
-Т. 5, вип. 1. –– С. 266 – 269. (Здобувачем проведено вилучення, видову
ідентифікацію та вивчення здатності до цитоадгезії лактобацил, а також
оформлення статті).

Кур’ята Н.В., Єлинська Н.О. Здатність штамів лактобацил продукувати
антидефенсини // Вісник Одеського національного університету. – 2003. –
Т.8, вип.1. – С.161 – 164. (Здобувачем проведено дослідження здатності
лактобацил інактивувати лізоцим та комплемент і оформлення статті).

Єлинська Н.О., Кур’ята Н.В., Фабіянська І.В., Янченко О.І. Таксономічний
склад та біологічні властивості лактобацил, виділених від дітей, хворих
на дисбактеріоз // Вісник Одеського державного університету. – 2000. -Т.
5, вип. 1. — С. 260 – 265. (Здобувачем проведено вилучення чистих
культур лактобацил з природного середовища, їх видову ідентифікацію,
визначення стійкості до антибіотиків та антагоністичну активність по
відношенню до умовно-патогенних мікроорганізмів, а також оформлення
статті).

Єлинська Н.О., Кур’ята Н.В., Філіпова Т.О., Іваниця В.О. Вплив
лактобацил на функціональну активність макрофагів та реакцію
гіперчутливості сповільненого типу у мишей // Мікробіол. журн. – 2003.
— № 4. – Т. 65. – С. 23 – 28. (Здобувачем проведено дослідження впливу
перорального прийому лактобацил на інтенсивність реакцій фагоцитозу та
ГСТ у мишей, а також оформлення статті).

Кур’ята Н.В., Єлинська Н.О. Лізоцимна активність штамів лактобацил //
Вісник Одеського національного університету. – 2003. – Т. 8, вип. 6. –
С. 165 — 170. (Здобувачем проведено дослідження здатності лактобацил до
продукції лізоциму і оформлення статті).

Єлинська Н.О., Фабіянська І.В., Рульова К.С., Янченко О.І., Кур’ята Н.В.
Біологічні властивості бактерій роду Lactobacillus, виділених із
шлунково-кишкового тракту дітей // Вісник Одеського національного
університету. – 2001. -Т. 6, вип. 4., – С. 101 – 105. (Здобувачем
проведено вилучення чистих культур лактобацил з вмісту травного тракту
дітей та їх родову ідентифікацію).

Єлинська Н.О., Кур’ята Н.В., Ліманська Н.В. Вплив чинників
макроорганізму на адгезію лактобацил // Вісник Одеського національного
університету. – 2002. – Т. 6, вип. 4. – С. 98 – 100. (Здобувачем
проведено вилучення чистих культур лактобацил, дослідження адгезивних
властивостей лактобацил та впливу на них різних чинників
макроорганізму).

Барікян С.С., Кур’ята Н.В. Вплив лізоциму на адгезивні властивості
лактобацил / Ювілейна наукова конференція студентів, аспірантів і
молодих вчених, присвячена 180-річчю з дня народження Л.С. Ценковського.
Тези доповідей. Одеса, 28 березня – 1 квітня 2003 р. – Одеса, 2003. – С.
85.

Кур’ята Н.В. Біологічні властивості лактобацил, ізольованих від здорових
та хворих на дисбактеріоз дітей // Перша Всеукраїнська конференція
студентів біологічних факультетів. Тези доповідей. 20 – 22 грудня 1998.
– Київ, 1999. – С. 116 – 117.

Кур’ята Н.В. Адгезивні та гемаглютинуючі властивості лактобацил /
Матеріали Всеукраїнської конференції студентів, аспірантів та молодих
вчених “Біорізноманіття природних і техногених біотопів України”.
Донецьк, 19 – 22 листопада 2001 р. – Донецьк: ДонНУ, 2001. – С. 24 – 27.

Курьята Н.В., Елинская Н.А. Влияние пищеварительных ферментов на
адгезивные свойства лактобацилл / 6-я Пущинская международная
школа-конференция “Биология – наука 21 века”. Тезисы докладов. 19 – 24
мая, 2002. – Москва, 2002. – С. 32.

Кур’ята Н.В., Єлинська Н.О. Вплив лактобацил на функціональну активність
макрофагів / Міжнародна студентська наукова конференція “Молодь –
медицині майбутьного”. Тези доповідей. Одеса, 24 – 25 квітня 2003 р. –
Одеса, 2003. – С. 32.

Yelinska N.O., Kuryata N.V., Ivanitsa V.O. Adherence, erythrocyte
agglutination and immune modulation properties of Lactobacilli: Ist FEMS
Congress оf European Microbiologists, Slovenia, Ljubljana, June 29 –
July 3, 2003 // Abstract Book, 2003. – P. 31.

АНОТАЦІЯ

Кур’ята Н.В. Адгезивні та імуномодулюючі властивості бактерій роду
Lactobacillus. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Інститут мікробіології і
вірусології ім. Д,К. Заболотного НАН України, Київ, 2005.

Дисертація присвячена вивченню адгезивних та імуномодулюючих
властивостей штамів бактерій роду Lactobacillus, вилучених з вмісту
шлунково-кишкового тракту дітей віком від 1 до 7 років, а також штамів з
колекції АТСС.

Показано, що всі штами, вилучені від здорових дітей, були здатні до
адгезії і характеризувалися середньою та високою адгезивністю. Штами,
вилучені від дітей, хворих на дисбактеріоз, були низькоадгезивними або
нездатними до адгезії. Штами з колекції АТСС були високоадгезивними.

Здатність лактобацил до адгезії не співпадала зі здатністю до
гемаглютинації, яку виявляли 56,1 % штамів. На процеси адгезії та
гемаглютинації лактобацил впливали D-глюкоза, DL-галактоза, D-маноза,
D-фруктоза, D-ксилоза, D-рафіноза, L-рамноза, L-арабіноза та
N-ацетил-D-глюкозамін, які могли як пригнічувати, так і підсилювати дані
процеси. Дослідження впливу рН середовища, протеолітичних ферментів та
лізоциму на адгезивні властивості лактобацил показало, що на
адгезивність більшої частки штамів, вилучених від здорових дітей, дані
чинники не впливали.

Показано, що жоден штам не був здатен інактивувати лізоцим.
Інактивувати комплемент була здатна невелика частка лактобацил, однак за
1,5 роки зберігання ця властивість штамами втрачалася.

Для окремих штамів лактобацил виявлено здатність до продукції лізоциму,
а також до стимуляції функціональної активності перитонеальних
макрофагів мишей. При пероральному прийомі штаму L. plantarum 1005
показано підвищення рівня сироваткового інтерферону мишей та здатності
макрофагів та спленоцитів до продукції ?- та ?- інтерферону.

У результаті проведених досліджень відібрано штами, найбільш
перспективні для використання в імуномодулюючій та замісній терапії.

Ключові слова: лактобацили, адгезія, гемаглютинація, фагоцитоз,
лізоцим, комплемент, інтерферон.

АННОТАЦИЯ

Курьята Н.В. Адгезивные и иммуномодулирующие свойства бактерий рода
Lactobacillus. – Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук
по специальности 03.00.07 – микробиология. – Институт микробиологии и
вирусологии им. Д,К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2005.

Диссертация посвящена изучению адгезивных и иммуномодулирующих свойств
штаммов бактерий рода Lactobacillus, выделенных из содержимого
желудочно-кишечного тракта детей в возрасте от 1 до 7 лет, а также
штаммов из коллекции АТСС.

Показано, что все штаммы, выделенные от здоровых детей,
характеризовались средней и высокой адгезивностью. Штаммы, выделенные от
детей, больных дисбактериозом, были низкоадгезивными или неспособными к
адгезии. Штаммы из коллекции АТСС были высокоадгезивными.

Способность лактобацилл к адгезии не совпадала со способностью к
гемагглютинации, которую имели 56,1 % штамів. На процессы адгезии и
гемагглютинации лактобацилл влияли D-глюкоза, DL-галактоза, D-манноза,
D-фруктоза, D-ксилоза, D-раффиноза, L-рамноза, L-арабиноза и
N-ацетил-D-глюкозамін, которые могли как угнетать, так и усиливать
данные процессы.

Исследование влияния рН среды, протеолитических ферментов и лизоцима на
адгезивные свойства лактобацилл показало, что большая часть штаммов была
толерантна к воздействию этих факторов на адгезию.

Показано, что ни один штамм не был способен инактивировать лизоцим.
Небольшая доля штаммов была способна инактивировать комплемент, однако
за 1,5 года хранения это свойство штаммами утрачивалось.

Для отдельных штаммов лактобацилл выявлена способность к продукции
лизоцима, а также к стимуляции функциональной активности перитонеальных
макрофагов мышей. При пероральном приеме штамма L. plantarum
1005 показано повышение уровня сывороточного интерферона мышей и
способности макрофагов и спленоцитов к продукции ?- и ?-интерферона.

В результате проведённых исследований отобраны штаммы, наиболее
перспективные для использования в иммуномодулирующей и заместительной
терапии.

Ключевые слова: лактобациллы, адгезия, гемагглютинация, фагоцитоз,
лизоцим, комплемент, интерферон.

ABSTRACT

Kuryata N.V. Adherence and Immune modulation properties of the genus
Lactobacillus bacteria. – Manuscript.

Thesis for the candidate’s degree by speciality 03.00.07 –
microbiology. – Institute of microbiology and virology of National
Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2005.

The work is devoted to the investigaiton of the adherence and immune
modulation properties of the Lactobacilli strains isolated from the
contents of the gastrointestinal tract of the healthy children 1 – 7
years old and those with dysbacteriosis, as well as strains from the
ATCC collection.

Lactobacillic strains’ adherence investigaiton has shown that all
strains isolated from the healthy children were characterised by the
moderate and high adherence ability. Their average adherence indices
were from 2,24 ± 0,21 to 7,52 ± 0,35 lactobacilli cells per 1
erythrocyte. Strains isolated from the dysbacteriosis were low- or
non-adhesive. АТСС strains were high-adhesive. Adherence ability in 63,6
% strains isolated from healthy children did not depend from D-manose.

Adherence ability of lactobacilli did not coincide with theirs
erythrocyte agglutination ability which was characteristic for 56,1 %
strains. D-glucose, DL-galactose, D-mannose, D-fructose, D-xylose,
D-raffinose, L-rhamnose, L-arabinose and N-acetyl-D-glucosamine
cold both increase and decrease these processes.

The investigation of the рН, proteolytic enzymes and lysozim influence
on the lactobacilli adherence ability has shown that the most strains
were tolerant to these factors’ effect. Most changes in adherence
indices pepsin caused. Under lysozim influence in 15,2 % strains lower
adherence indices were registered than without this enzyme.

The investigation of the lactobacilli anti-defensins production ability
has shown that no one strain was able to inactivate lysozim. Only 9,1 %
of strains were able to inactivate complement but in 1,5 years of
preservation they lost this activity.

The ability to produce lysozim was shown for 25,7 % of lactobacilli
strains. For 24,2 % strains it was low and was from 0,15 ± 0,04 to
3,81 ± 0,11 mkg/ml; in 1,5 % strains it was moderate and 6,38 ± 0,08
mkg/ml.

It has been shown that lactobacilli were able to stimulate the
non-specific immune responce. After alive L. fermentum ATCC 14931, L.
delbrueckii subsp. bulgaricus 432, L. reuteri 19 and L. fermentum 1005
cells intake per os the peritoneal macrophages phagocytic activity was
1,32 – 2,72 times higher, and oxidation activity was 2,27 – 6,45 times
higher. These effects were not accompanied by the decrease of the thymus
and spleen cell indices, excluding L. delbrueckii subsp. bulgaricus 432
strain which decreaesd the thymus cell index. Under L. plantarum 1005
intake the increase of the murine serum interferon has been shown as
well as the increase of macrophages and lymphocytes ability to produce
?- and ?-interferon. It has been shown the 1,64 times decrease of the
delayed hypersensitivity reaction intense after per os intake of L.
fermentum ATCC 14931 strain.

After the performed investigation two groups of strains perspective for
the probiotis preparaitons were selected. To the first we referred the
strains able to increase the non-specific immune responce activity
including phagocytosis intencification ability or lysozim production,
and also mostly tolerant to the enzymes influence on their adherence.
These strains we consider to be perspective for the immune modulation
therapy. To the second group we referred the strains with high adherence
ability tolerant to the proteolytic enzymes, lysozim and D-manose. These
strains are most perspective for the substitution therapy.

Key words: lactobacilli, adherence, erythrocyte agglutination,
phagocytosis, lysozim, complement, interferon.

PAGE \* Arabic 2

PAGE \* Arabic 2

PAGE \* Arabic 1

PAGE \* Arabic 8

PAGE \* Arabic 13

PAGE \* Arabic 17

Похожие записи