НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ім. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

Ястребова Олена Вікторівна

УДК: 579: 577.151: 576: 616.006

Позаклітинна фруктозо–1,6–бісфосфатаза bacillus subtilis 668

03.00.07 – мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі мікоплазмології Інституту мікробіології і
вірусології ім. Д.К.Заболотного Національної Академії Наук України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор, член-кор. НАН
України, Скрипаль Іван Гаврилович, Інститут мікробіології і вірусології
ім. Д.К.Заболотного НАН України, головний науковий співробітник відділу
мікоплазмології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Варбанень Людмила Дмитрівна,
Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України,
завідувач відділу біохімії мікроорганізмів

доктор біологічних наук, професор, член-кор.НАН України, Костерін
Сергій Олексійович, Інститут біохімії ім. О.В. Паладіна НАН України,
завідувач відділу біохімії м’язів

Захист відбудеться “17” жовтня 2007 р. о 1000 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 Інституту мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: м. Київ, 03143,
вул. Заболотного, 154

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: м. Київ, 03143,
вул. Заболотного, 154

Автореферат розісланий “13 “ вересня 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук, с.н.с. Пуріш Л. М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Фруктозо–1,6–бісфосфатаза (ФБФаза) є одним із
чотирьох головних ферментів глюконеогенезу, що каталізують незворотні
реакції (Choe et al., 2005). Глюконеогенез – це процес синтезу глюкози
із не вуглеводних попередників. Регуляція глюконеогенезу в клітині
відбувається шляхом контролю хімічних реакцій, що його складають. А
контроль за окремими реакціями процесу – специфічними для них факторами.
В регуляції глюконеогенезу, як і будь–якого іншого метаболічного
процесу, вирішальна роль належить ключовим ферментам і зміна кількості
цих ферментів (шляхом синтезу або деградації) чи зміна їх
внутрішньоклітинної активності в значній мірі визначає швидкість
процесів обміну (Erion, 2005). На сьогоднішній день багато робіт
присвячено дослідженню властивостей внутрішньоклітинних ФБФаз тварин,
рослин, комах, мікроорганізмів. Звертаючи увагу на існуючі результати
при дослідженні беззаперечно важливої ролі внутрішньоклітинного ферменту
в метаболічній активності організмів, визначенні взаємозв’язку
молекулярної структури ферменту і властивостей, до нинішнього часу
залишалася не виявленою і не вивченою саме позаклітинна ФБФаза: не
встановлена її наявність, не відомо класифікаційне положення, не вивчені
фізико–хімічні та біологічні властивості. За даними літератури, лише
для одного представника класу Mollicutes – Achоlерlasma laidlawii var.
granulum шт. 118 охарактеризовано позаклітинну ФБФазу (Скрипаль та
співав., 2004-2006). Бактерії роду Bacillus вважаються філогенетичними
попередниками молікутів (Woose, 1987; Kunst, 1997; Скрипаль, 2000). В
зв’язку з цим виникає особлива зацікавленість до існування і
властивостей означеного позаклітинного ферменту у бацил. Тому особливо
важливо дослідити наявність і молекулярні механізми дії позаклітинного
ферменту, механізми структурно–функціональних відносин між позаклітинним
ферментом і субстратом, які визначають ефективність і специфічність
ферментативних реакцій. Проведення зазначених досліджень дозволить
розширити уявлення про складні метаболічні шляхи, які є основою
життєзабезпечення і регуляції функцій мікробного організму. Велике
теоретичне значення має встановлення спорідненості між позаклітинними
ФБФазами бацил і молікутів. Відомо, що перехресні реакції, які засновані
на філогенетичній спорідненості, можуть бути використані як один з
підходів в класифікації різних видів мікроорганізмів додатково із
загальноприйнятими методами таксономії. Встановлення філогенетичної
спорідненості між бацилами і молікутами на фізіолого – біохімічному і
серологічному рівнях буде сприяти не лише розв’язанню питання походження
означених груп мікроорганізмів, а й допоможе більш повно розкрити їх
еволюційні зв’язки.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконувалась згідно плану наукових робіт Інституту мікробіології
і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України м. Київ (ІМВ) за темою №
14/64 “Фруктозо–1,6–бісфосфатаза молікутів та їх філогенетичних предків
— спороносних бактерій (порівняльне вивчення)”, номер держреєстрації
0101U003060 (2001–2005 pр.), що виконувалась за постановою Бюро ВББЕКФ
НАН України, протокол № 12 від 20.11.2000 р.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було виділити позаклітинну
ФБФазу у окремого представника роду Bacillus, в даному випадку B.
subtilis 668, та дослідити її фізико-хімічні, молекулярно–біологічні
та серологічні властивості.

У відповідності з поставленою метою були сформульовані наступні
завдання:

— визначити умови, за яких клітинами B. subtilis 668 в середовищі
культивування інтенсивно накопичується ФБФаза;

— виділити і очистити позаклітинну ФБФазу B. subtilis 668 до гомогенного
стану;

визначити основні фізико-хімічні властивості позаклітинної ФБФази B.
subtilis;

вивчити молекулярні та серологічні, в порівняльному аспекті з
позаклітинним ферментом молікутів, властивості позаклітинної ФБФази B.
subtilis 668;

визначити та вивчити цитотоксичну активність позаклітинної ФБФази
B. subtilis 668.

Об’єкт дослідження: Bacillus subtilis 668 ІМВ, депонований в Депозитарії
ІМВ НАН України за № В–7014.

Предмет дослідження: позаклітинна ФБФаза, фізико–хімічні, молекулярні,
серологічні та цитотоксичні властивості зазначеного ферменту.

Методи дослідження: мікробіологічні, біохімічні, імунологічні,
молекулярно–біологічні, цитологічні.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше у представника спороносних
бактерій – Bacillus subtilis 668 виявлено здатність продукувати у
середовище культивування один з головних ферментів глюконеогенезу –
ФБФазу. Виділено і очищено позаклітинну ФБФазу, встановлено її
молекулярну вагу і субодиничну структуру. Вперше доведено, що за
серологічними, фізико–хімічними і молекулярними властивостями
позаклітинна ФБФаза B. subtilis 668 є подібною тій, що функціонує в
клітині. Активність її залежить від двовалентних катіонів та регулюється
окремими природними речовинами. Вперше досліджено серологічні
властивості позаклітинних ФБФаз B. subtilis 668 та молікута Achоlерlasma
laidlawii var. granulum шт. 118: вони споріднені, але не ідентичні, що
підтверджує філогенетичні зв’язки цих мікроорганізмів. Встановлено in
vitro цитотоксичну активність позаклітинної ФБФази B. subtilis 668
відносно пухлинних клітин саркоми 37.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати
поглиблюють і уточнюють знання та уявлення про складні метаболічні
шляхи, які є основою життєзабезпечення і регуляції функцій мікробного
організму. Наявність цитотоксичної активності у позаклітинної ФБФази
надзвичайно важливо для активного втручання і керування біологічними
процесами, а також для усунення і компенсації патологічних порушень.
Встановлення філогенетичної спорідненості між ФБФазами бацил і
молікутів має значення для вирішення фундаментальних питань філогенії
мікроорганізмів, допомагає більш повно розкривати їх еволюційні зв’язки.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора.
Текст дисертації, формулювання основних положень та оформлення всіх
розділів роботи виконано безпосередньо автором. Дисертантом особисто
критично опрацьовані дані літератури за обраною темою. Всі результати
отримані особисто або за його безпосередньої участі: проведено
культивування та нарощування біомаси B. subtilis 668, відпрацьовано
спосіб очищення позаклітинної ФБФази цього мікроорганізму до гомогенного
стану, вивчено її фізіолого–біохімічні та серологічні властивості,
визначено кінетичні характеристики, вивчено молекулярні властивостей
ферменту. Проаналізовано та узагальнено результати досліджень, здійснена
статистична обробка експериментальних даних. Проведена підготовка
публікацій за результатами досліджень та здійснено їх представлення на
наукових конференціях. Вивчення фізико–хімічних властивостей здійснено
спільно з к.б.н., с.н.с. Л.П. Панченко, дослідження серологічних
властивостей позаклітинної ФБФази здійснено спільно з к.б.н., н.с. Л.П.
Маліновською (Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного
НАН України, Київ); вивчення цитотоксичної активності позаклітинної
ФБФази здійснено спільно з к.б.н., м.н.с. О.С. Дворщенко та м.н.с. Г.В.
Діденко (Інститут експериментальної патології, онкології та
радіобіології ім. Р.Е. Кавецького НАН України, Київ).

Планування експериментів, вибір методичних підходів, обговорення
результатів, формування висновків та написання наукових статей
здійснювалося під керівництвом член–кореспондента НАН України, д.б.н.,
проф. І.Г. Скрипаля.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень та
положенння дисертації доповідались та обговорювались на Конференціі
молодих учених “Сучасні проблеми фізіології рослин та біотехнології”
(Ужгород, 1-3 грудня 2005р.); 9-й Пущинській школі-конференції молодих
вчених “Биология – наука XXI века” (Пущино, 18-22 квітня 2005р.); 5-й
Парнасівській конференції “Molecular mechanisms of cellular signaling”
(Київ, 26–29 квітень 2005 р.); Науковій конференції “Стратегия и
тактика защиты растений”, присвяченій 35-річчю від дня організації РУП
“Институт защиты застений” (Мінськ, 28 лютого-2 березня 2006р.); 9-му
з”їзді Українського біохімічного товариства (Харків, 22-27 жовтня 2006
р.); Міжнародній конференції молодих дослідників (Кишинеу, Молдова, 10
листопада, 2006 р.); матеріали дисертації доповідалися на конференції
молодих вчених Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.
Заболотного НАН України (Київ, 22 – 24 лютого 2005).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 14 наукових робіт (7
статей у фахових журналах: 5 експериментальних та 2 оглядові, 7 – в
тезах доповідей).

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 126
сторінках машинописного тексту і складається зі вступу, огляду
літератури, основної частини (включає матеріали та методи досліджень,
результати досліджень та їх обговорення), аналізу і узагальнення
результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел, що
містять 221 найменувань, з них 171 – закордонних авторів. Робота
ілюстрована 7 таблицями і 28 рисунками.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Огляд літератури складається з двох підрозділів, в яких висвітлено
сучасний стан у вивченні ФБФаз, їх структур, класифікації і місці в
глюконеогенезі. Висвітлено механізми регуляції активності ФБФаз у
прокаріотів і у еукаріотів.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА

Матеріали і методи досліджень

Об’єкт дослідження: Bacillus subtilis 668 ІМВ, депонований в Депозитарії
ІМВ НАН України за № В–7014. Культивування B. subtilis 668 здійснювали
періодичним способом на качалках (220 об/хв) в колбах Ерленмейєра з
робочим об’ємом 100 мл. Температура культивування становила 37оС.
Культуру бацили вирощували на рідкому мінеральному середовищі такого
складу: 0,48 г/л сульфат магнію; 0,00453 г/л сульфат марганцю; 0,00912
г/л сульфат заліза (ІІ-го валентного); 0,4023 г/л хлориду калію; 1,7374
г/л фосфорнокислого калію; 0,5088 г/л цитрату калію; 0,0625 г/л
хлориду амонію; рН середовища 6,9 (Fujita, Freese, 1970). Крім того
клітини вирощували на рідкому середовищі Гаузе такого складу, г/л:
бульон Хоттінгера – 30,0 мл; пептон – 5,0; NaCl – 5,0; рН середовища
6,0; до якого як біостимулятор додавали 1% автолізату харчових дріжджів,
виготовленого в лабораторних умовах. Дослідні середовища вміщували як
джерело вуглецю (1% до об’єму) гліцерин, галактозу, мальтозу, глюкозу.
Матеріалом для посіву слугувала 21-но годинна, культура вирощена на МПА.
Інокулюм, що вміщував 5·109 клітин на 1 мл, вносили в середовище в
кількості 1% від об’єму. Культуральну рідину звільняли від клітин за
допомогою центрифугування при 8000 g протягом 10 хв і використовували
для одержання позаклітинної ФБФази. Бактеріальна біомаса, осаджена при
центрифугуванні, була використана для одержання клітинного ферменту.

Процес виділення ферменту складався із основних 5 етапів: одержання
культуральної рідини, фракціонування білків за допомогою (NH4)2SO4,
гідрофобної хроматографії на колонці з Тоyopearl TSK HW–60, знесолення
препаратів ферменту на колонці із Sephadex G-10, субстратзалежної
хроматографії на колонці із СМ-Sephadex.

Визначення білку на всіх стадіях виділення і очистки проводили за
методом Бредфорда (Bradford, 1976).

Визначення активності ФБФази на всіх етапах її очистки визначали за
методом Фіске–Суббароу по швидкості накопичення неорганічного фосфору
(Фн) при рН 8,6 і 300С (Fiske, Subbarow, 1925; Лурьє, 1985). Кількість
утвореного неорганічного фосфору встановлювали за допомогою
мікроколориметру МКМФ–1 при D610 нм (Калинин, 1971). Реакційна суміш (2
мл) вміщувала 0,05 М Тріс-НСl–буфер, рН 8.6, 0,01 мМ ЕДТА, 0,2 мМ
фруктозо–1,6–бісфосфату, 2 мМ MgCl2 і 20–50 мкл ферментного препарату
(35-50 мкг білку). За одиницю активності вважали таку кількість
ферменту, що забезпечувала звільнення 1,0 мкМ Фн за 1хв при 300С в
умовах досліду.

Питому активність виражали кількістю одиниць ФБФази на 1 мкг білку.

Чистоту виділених препаратів позаклітинної ФБФази B. subtilis 668 та її
молекулярну масу в денатуруючих умовах визначали за допомогою
електрофорезу в поліакриламідному гелі з 0,1% додецилсульфату натрію за
методикою Laemmli (Laemmli, 1970). Визначення молекулярної маси ферменту
в нативних умовах здійснювали за допомогою його гель–фільтрації на
колонці з наповнювачем Sephadex G–200 (“Pharmacia”, Швеція).

рН–оптимум дії позаклітинної ФБФази B.subtilis 668 визначали при різних
значеннях рН від 5,5 до 10,5 в Тріс–буфері (Калинин, 1971).

Залежність активності позаклітинної ФБФази від температури проводили при
рН 8,5, в діапазоні температур від 25о С до 100о С протягом 15 хвилин.

Максимальну швидкість гідролізу і константу Міхаеліса (Кm) визначали,
використовуючи рівняння Міхаеліса–Ментен в зворотніх координатах
Лайнуівера–Берка (Кретович, 1986).

Вплив ефекторів (інгібіторів та активаторів) на активність позаклітинної
ФБФази визначали в діапазоні концентрацій реагентів від 0,1 мМ до 50 мМ
в реакційній суміші при рН 8,5. За контроль був результат реакції без
внесення в реагуючу суміш того чи іншого ефектора.

Серологічні властивості клітинної і позаклітинної ФБФаз B.subtilis 668
вивчали методом подвійної імунодифузії в агарі за
Ouchterlony (Ouchterlony, 1958).

Вивчення цитотоксичної активності позаклітинної ФБФази проводили на базі
Інституту експериментальної патології, онкології і радіології ім. Р.Е.
Кавецького НАН України, м. Київ. Цитотоксичну активність позаклітинної
ФБФази B. subtilis 668 по відношенню до пухлинних
клітин вивчали на пухлинних клітинах саркоми 37 in vitro (Takasuki,
1970). Контролем слугували здорові клітини селезінки, на які ФБФаза не
проявляла цитолітичну дію. Цитотоксичну активність препаратів оцінювали
в камері Горяєва за здатністю загиблих клітин фарбуватися вітальним
барвником — 1%-ним розчином трипанового синього.

Електрофорез білків пухлинних клітин до та після обробки позаклітинною
ФБФазою B. subtilis 668 проводили за Laemmli (Laemmli, 1970).

Статистичну обробку результатів проводили, використовуючи t – критерій
Стьюдента, рівень вірогідності становив 95%. Графічні результати, а
також розрахунок кінетичних характеристик ферменту проводили,
використовуючи комп’ютерні програми – прикладний пакет Microsoft Excel
2000 та MatCad 2000.

Результати досліджень та їх обговорення

Відомо, що до зовнішніх факторів, які впливають на біосинтетичну
активність бактерій відносяться склад поживного середовища, природа і
концентрація джерел вуглецю, а також фізико–хімічні умови (температура,
час культивування тощо). Для визначення умов, за яких клітинами B.
subtilis 668 в середовищі культивування інтенсивно накопичується ФБФаза,
були використані мінеральне середовище (Fujita, Freese, 1970) і
середовище Гаузе з різними джерелами вуглецю (галактозою, глюкозою,
мальтозою, гліцерином).

Нами встановлено, що найбільша кількість позаклітинної ФБФази
продукується клітинами досліджуваного штаму бацили при вирощуванні їх на
середовищі Гаузе з 1% гліцерину (рис.1.). Тому в подальших дослідженнях
ми використовували середовище Гаузе з 1% гліцерину, так як на цьому
середовищі спостерігається найбільший вихід позаклітинної ФБФази з
максимальною активністю.

Після встановлення факту наявності ФБФази в середовищі культивування, ми
приступили до вивчення динаміки накопичення ферменту в культуральній
рідині. Знання динаміки накопичення ФБФази дає нам можливість визначення
того оптимального часу культивування бацил, при якому утворюється
максимальна кількість ферменту.

Нами виявлено, що активність позаклітинної ФБФази B. subtilis 668
збільшувалась паралельно накопиченню біомаси. Максимальне накопичення
ферменту спостерігали у фазі уповільнення росту культури (21 год росту)
на середовищі Гаузе з 1% гліцерину як джерела вуглецю.

Відхилення температури культивування від оптимального значення (37оС),
як правило негативно впливало на біосинтетичну активність B. subtilis
668 (рис.2.).

Рис. 1. Накопичення в середовищі позаклітинної ФБФази B. subtilis 668 в
залежності від джерела вуглецю (1: мінеральне середовище + гліцерин; 2:
середовище Гаузе + гліцерин; 3: мінеральне середовище + глюкоза: 4:
середовище Гаузе + глюкоза; 5: мінеральне середовище + галактоза; 6:
мінеральне середовище + мальтоза; 7: середовище Гаузе + мальтоза; 8:
середовище Гаузе + галактоза).

Рис. 2. Біосинтез позаклітинної ФБФази B. subtilis 668 в динаміці росту
на середовищі Гаузе з 1% гліцерину при різних температурних режимах
вирощування мікроорганізму: 1 – 37 0С, 2 – 30 0С, 3 – 42 0С.

Вирощування клітин досліджуваного штаму при супраоптимальній температурі
(42оС) дещо знижувало рівень активності ізольованого ферменту ФБФази.
При субоптимальній температурі (30оС) теж спостерігали зниження
активності ферменту, але ще в більшій мірі. Температура 370С для
досліджуваного представника роду Bacillus являлась оптимальною як для
росту, так і для біосинтезу позаклітинної ФБФази.

Умови виділення та очищення позаклітинної ФБФази B. subtilis 668 ми
вибирали на основі результатів експериментальної перевірки описаних в
літературі методів отримання клітинного ферменту ФБФази B. subtilis
(Fujita, Freese, 1970). Але за основу була взята методика виділення
позаклітинної ФБФази Acholeplasma laidlawii var. granulum шт. 118
(Скрипаль та співав., 2004), яку адаптували в процесі виконання цієї
роботи для виділення позаклітинного ферменту B. subtilis 668 – на всіх
хроматографічних етапах очищення для елюції ферментного препарату з
колонок ми застосовували Na–малонатний буфер (рН 5,8), оскільки
використання забуференого фізіологічного розчину при елюції ферментного
препарату з колонки з Toyoperl TSK HW–60 (“TOYO SODA”, Японія), на наш
погляд, перешкоджало визначенню активності ферменту.

Одним з перших етапів виділення ферменту було фракціонування білків
культуральної рідини B. subtilis 668 за допомогою (NH4)2SO4 (СА). В
культуральну рідину вносили СА до концентрації 1,6 М (40 % насичення),
витримували 6–8 год при температурі +40С. Було встановлено, що в осад
при цьому, випадали білки, що не мали ФБФазної активності. Від цих
білків звільнялися центрифугуванням при 15000 g протягом 20 хв.
Надосадову рідину наносили на колонку з Toyoperl TSK HW–60, попередньо
урівноважену Na-малонатним буфером з 40 % СА. Колонку відмивали цим же
буфером до зникнення слідів білку на її виході. Елюцію проводили
градієнтно знижуючи концентрацію СА в буфері. При хроматографії на
Toyoperl TSK HW–60 найвища активність ФБФази спостерігалась в 9–11
фракціях в діапазоні концентрації 0,8–0,9 М СА (рис.3, А). Активні
фракції, що елюювали в діапазоні концентрації сульфату амонію 0,8–0,9
М, об’єднували. Фермент з них осаджували СА до 70% насичення. Осад,
отриманий після центрифугування, розчиняли в мінімальному об’ємі (до 3
мл) Na-малонатного буферу, рН 5,8 і наносили тонким шаром (до 1 мм) на
колонку з Sephadex G-10 (”Pharmacia”, Швеція). Найбільша активність
обезсоленого ферменту була виявлена в 6–8 фракціях (рис.3, Б), які
об’єднували, наносили на колонку, заповнену СМ–Sephadex (”Pharmacia”,
Швеція). Основний пул ФБФази звільнявся з колонки, коли концентрація
субстрату (фруктозодифосфату) в елююючому буфері була 0,2 мМ. Виявилось,
що фермент з високим ступенем активності і чистоти знаходився лише в
трьох фракціях (рис.3, В).

Для визначення чистоти і молекулярної маси позаклітинної ФБФази
B. subtilis 668 в нативних умовах як молекулярне сито був
використаний Sephadex G–200 (”Pharmacia”, Швеція). Встановлено, що
молекулярна маса такого ферменту складала 230000 ± 5000 Да.

За допомогою електрофорезу очищеної позаклітинної ФБФази B. subtilis 668
в 10 %-ному поліакріламідному гелі (ПААГ) в денатуруючих умовах
(денатуруючим фактором був 0,1 % додецилсульфат натрію) виявлено одну
чітку білкову лінію, що свідчить про те, що фермент очищений до
гомогенного стану і складається з чотирьох ідентичних субодиниць
(рис.4.) з молекулярною масою субодиниці 63000±500 Да (табл.1.)

А

В

Б

Рис. 3.: А — гідрофобна хроматографія на колонці з Toyopearl TSK HW–60
позаклітинної фруктозо–1,6-бісфосфата-зи B. subtilis 668 (1 – білок, 2 –
ФБФазна активність, 3 – концентрація СА); Б – знесолення позаклітинної
ФБФази на колонці з Sephadex G-10 (1–ФБФазна активність, 2–білок); В –
субстратзалеж-на хроматографія позаклітинної ФБФази B. subtilis 668 на
колонці з CМ-Sephadex (1 – ФБФазна активність, 2 – білок).

Рис.4. Електрофорез в ПААГ гелі з додецилсульфатом натрію позак-літинної
ФБФази B. subtilis 668: 1 доріжка: маркерні білки: 97 кДа — фосфорилаза
В; 67 кДа — бичачий сироватковий альбумін; 45 кДа – овальбумін; 30 кДа –
карбоангідраза; 2 доріжка: препарат ФБФази.

Таблиця 1.

Електрофоретична рухливість (Rf) маркерних білків та позаклітинної
фруктозо-1,6-бісфосфатази B. subtilis 668 і їх молекулярні маси

Білки

Показники

Rf, мм lg молекулярної маси

Молекулярна маса

Фосфорилаза В

Бичачий сироватковий альбумін

Фруктозо-1,6-бісфосфатаза

Овальбумін

Карбоангідраза

0,320

0,488

0,480

0,740

0,926

4,986

4,819

4,799

4,653

4,477

97 000

67 000

63 000

45 000

30 000

Дослідження властивостей позаклітинної ФБФази B. subtilis 668 показали,
що активність ферменту в найбільшій мірі проявляються при рН 9,0 (рис.
5.). За цією ознакою досліджуваний фермент був віднесений нами до групи
“лужних“ ферментів. Встановлений оптимум рН позаклітинної ФБФази B.
subtilis 668 не змінювався при визначенні його як в Тріс-, так і в
гліциновому буферах. При дослідженні стабільності ферменту в залежності
від рН середовища ми визначили, що активність ферменту практично не
змінюється протягом 3–х год при оптимальних значеннях рН (9,0). Більш
ніж 40 % активності зберігається при нейтральних значеннях рН протягом 1
години.

Інтервал значень температур, при якій проявляється найбільша активність
позаклітинної ФБФази, складає 45–500 С (рис. 5.). Показано також, що
позаклітинна ФБФаза B. subtilis 668 при температурі 450 С була стабільна
протягом 1 год, а через 2 год втрачала вже 47 % від максимальної
активності. При збереженні ферменту при температурі -40 С він не втрачав
активності протягом 30 діб.

Рис. 5. Вплив рН і температури на активність позаклітинної ФБФази B.
subtilis 668.

Позаклітинна ФБФаза B. subtilis 668 гідролізує фруктозо-1,6–дифосфат.
Інгібуюча концентрація субстрату (20,0 мМ) значно перевищує
концентрації, за яких виявляється максимальна активність ферменту (2,0
мM). Проте при наявності катіонів Mg2+ , хелатуючого агента ЕДТА і рН
8,0 – 8,5, інгібування субстратом активності зменшувалось майже вдвічі.

Константу Міхаеліса вирахували шляхом апроксимації експериментальних
величин лінійною функцією у зворотних координатах Лайнуївера–Берка. Кm
для позаклітинної ФБФази B. subtilis 668 становить 3,8?10-3 М.

&

,

0

H

J

? ¬ TH oe &

X

&

(

*

,

.

0

H

????H

J

x

…T…V…F‰&?yoeeeeeeeeeeeeeUeeeooE3/4

????

\

`„A

являються більш значними активаторами ферментативної активності, ніж
катіони Mn2+ . Наявність Mg2+ в реакційній суміші в діапазоні
концентрацій від 2,0 мМ до 20,0 мМ підвищувала активність ферменту на
40%. Катіони Mn2+ в концентрації 5,0 мМ підвищували активність лише на
15%. Не виявлено впливу на активність позаклітинної ФБФази B. subtilis
668 таких катіонів як Ca2+, Fe2+, Cu2+.

Таблиця 2.

Вплив деяких хімічних реагентів на ФБФазну активність ферментного
препарату B. subtilis 668

Реагент Оптимальна концентрація,

мМ Залишкова активність,

%

Контроль

Mg2+

Mn2+

Zn2+

K+

Li+

NH4+

Na+

Tl+

ЕДТА

цитрат

гістидин

5,0

0,1

5,0

1,0

5,0

0,01

0,05

0,05

1,0

1,0

1,0 100

142±3,9

106±3,3

36,6±2,5

113±3,5

91±2,9

120±3,7

115±3,6

108±3,4

72±2,3

105±3,3

104±3,3

Zn2+ в залежності від рН та наявності іонів Mg2+ по-різному впливав на
активність ФБФази (рис. 6.). При низьких концентраціях іонів Zn2+
(2,0–4,0 мМ) ми спостерігали активацію ферменту при лужному рН
середовища. За відсутності катіонів Mg2+ цинк виступав як інгібітор
позаклітинної ФБФази B. subtilis 668 при цьому ж рН (рис.6.). При
низьких концентраціях в кислому рН катіони цинку проявляють себе
активаторами активності позаклітинної ФБФази. Але в тих же умовах в
присутності катіонів магнію цинк проявляє себе як інгібітор. Цікаво, що
в присутності Mg2+ і ЕДТА, Zn2+ збільшує активність ферменту майже в 2
рази в кислому рН порівняно з дослідами при лужному рН.

Моновалентні катіони Tl+, Na+, K+ i NH+4 виявилися незначними
активаторами активності позаклітинної ФБФази при низьких концентраціях,
а при високих — вони виступали як інгібітори (рис. 6, А). Так, K+
підвищував ферментативну активність ФБФази B. subtilis 668 на 13% при
концентрації катіонів 1 мМ, а при подальшому збільшенні концентрації
катіону в реагуючій суміші дія його як активатора помітно зменшувалась.
Найбільше зростання активності ФБФази (до 20%) спостерігали під впливом
NH4+ при концентрації його 0,01 мМ. Li+ в концентрації 1,0 мМ на 4%
інгібував активність ферменту, а при концентрації 5,0 мМ – майже на 10%.

Рис. 6. Вплив двовалентних металів на активність ФБФази (1 – катіони
Zn2+ і Mg2+ при кислому рН, 2 – катіони Zn2+ при кислому рН, 3 – катіони
Zn2+ при лужному рН, 4 – катіони Zn2+ і Mg2+ при лужному рН);

Рис. 6, А. Вплив катіонів одновалентних металів на активність ФБФази
B. subtilis 668 (1 – катіони натрію, 2 – талію, 3 – амонію).

Аденозинмонофосфат (АМФ) в концентрації 0,2 мМ інгібував активність
ферменту на 46%. Внесення ж в реакційну суміш фосфоенолпірувату (ФЕП) в
тих же кількісних співвідношеннях, “знімало” інгібуючу дію АМФ (рис.
7.). Катіони магнію в концентрації 5,0–7,0 мМ знижували чутливість
позаклітинної ФБФази B. subtilis 668 до АМФ.

Гістидин і цитрат (в концентрації 1,0–2,5 мМ) активували позаклітинну
ФБФазу В. subtilis 668 на 4–8 %, при цьому не спостерігали зміни
оптимуму рН. ЕДТА має інгібуючий вплив на активність позаклітинної
ФБФази В. subtilis 668 (рис. 7, А.). Так, в концентрації 0,1 мМ ЕДТА
інгібував позаклітинну ФБФазу на 44%, а в концентрації 1мМ – на 28%.

Отже, найкращими активаторами активності позаклітинної ФБФази виступають
катіони магнію, амонію і натрію, а інгібіторами – ЕДТА, катіони цинку і
літію.

Рис. 7. Вплив ФЕП і АМФ на активність ФБФази (1– АМФ, 2 – АМФ+ФЕП).

Рис. 7, А. Залежність активністі позаклітинної ФБФази B. subtilis 668
від концентрацій імідазолу і ЕДТА (1 – імідазол, 2 – ЕДТА).

Відомо, що перехресні реакції, які грунтуються на філогенетичній
спорідненості можуть бути використані додатково до загальноприйнятих
методів таксономії як один з підходів в класифікації різних видів
мікроорганізмів. З цією метою ми вивчили серологічну спорідненість двох
різних за походженням позаклітинних ферментів – молікутів і бацил,
оскільки бактерії роду Bacillus вважаються філогенетичними предками
молікутів, в тому числі і роду Acholeplasla (Woose, 1980, 1987;
Weisburg, 1989; Скрипаль, 2000).

Реакція преципітації в гелі за методом подвійної дифузії за Оухтерлоні
виявила антигенну ідентичність досліджуваних препаратів клітинної та
позаклітинної ФБФаз B. subtilis 668 (рис. 8, А).

Те, що позаклітинна і клітинна ФБФази цього мікроорганізму є одним і тим
же ферментом, свідчить також їх однакове реагування з антисироваткою до
ФБФази Acholeplasma laidlawii var. granulum шт. 118 (рис. 8, Б.). З рис.
8 (Б) видно, що ці ферменти є однаковими за антигенним складом і
серологічно ідентичними.

Встановлено, що позаклітинні ФБФази Acholeplasma laidlawii var. granulum
шт. 118 і B. subtilis 668 подібні, але неідентичні (рис. 8, В.),
оскільки, крім спільних для них антигенів, вони мають також
індивідуальні антигени для кожного з них.

.

А

Рис. 8.: А – реакція подвійної дифузії в агарі за Оухтерлоні:
центральна лунка (Аc) – позаклі-тинна ФБФаза B. subtilis 668; 1 –
антисироватка до клітинного ферменту бацил; 2 – антисиро-ватка до
позаклітинного ферменту бацил; 3 – контрольна донорська сироватка; 4, 5,
6 – пусті.

Б

В

Б – Реакція подвійної дифузії в агарі за Оухтерлоні: центральна лунка –
антисироватка до позаклітинної ФБФази Acholeplasma laidlawii var.
granulum шт.118; 1,2,3 – позаклітинна ФБФаза Acholeplasma laidlawii var.
granulum шт.118; 4,6 – клітинна ФБФаза B. subtilis 668; 5 –
позаклітинна ФБФаза B. subtilis 668.

В – Перехресна реакція подвійної дифузії в агарі за Оухтерлоні:
центральна лунка – клітинна ФБФаза B. subtilis 668; 1,2,5 –
антисироватка до позаклітинної ФБФази Acholeplasma laidlawii var.
granulum шт.118; 3,4,6 – антисироватка до позаклітинної ФБФази B.
subtilis 668.

Так, на підставі одержаних результатів ми зробили висновок, що
позаклітинна і клітинна ФБФази B. subtilis 668 є одним і тим же
ферментом. Позаклітинні ФБФази B. subtilis 668 і Acholeplasma laidlawii
var. granulum шт. 118 є філогенетично спорідненими на що вказує
наявність у них спільних антигенів, що є полідетермінантними, а
антисироватки до них, відповідно – поліклональними

Оскільки, позаклітинна ФБФаза B. subtilis 668 має молекулярну масу рівну
молекулярній масі речовин з цитотоксичною активністю, що продукуються
B. subtilis АБ 56 (Потебня та співавт., 1999, 2002; Диденко та співавт.,
2003), нам цікаво було перевірити, чи проявляє позаклітинна ФБФаза B.
subtilis 668 цитоксичну дію на пухлинні клітини саркоми 37. При цьому
було встановлено, що препарат позаклітинної ФБФази B. subtilis 668
проявляє активну цитолітичну дію при співвідношенні 30 мкг препарату на
106 пухлинних клітин саркоми 37.

На представленій електрофореграмі (рис.9.) і денситограмах (рис. 10, А;
10, Б; 10, В.) видно, що після інкубації клітин саркоми 37 протягом
однієї години з позаклітинною ФБФазою, з пухлинних клітин “знімається”
комплекс антигенів з молекулярними масами від 4 до 80 кДа, які
переходять в розчин (рис. 9.) Точку відшарування антигенів добре видно
на елекрофореграмі (рис.9) під номером 4.

Рис. 9. Електрофореграма антигенного спектру клітин саркоми 37 до та
після обробки позаклітинною ФБФазою B. subtilis 668 1 – антигенний
спектр клітин саркоми 37 до обробки препаратом; 2 – антигенний спектр
клітин саркоми 37 після обробки препаратами протягом 1 години; 3 –
антигенний спектр препарату після інкубації з пухлинними клітинами
саркоми 37 протягом 1 години).

Примітка: 67 kDa – БСА, 45 kDa – овальбумін, 14,3 kDa – лізоцим.

Рис.10. Денситограма антигенного спектру клітин саркоми 37:
А – до
обробки препаратом позаклітинної ФБФази B. subtilis 668;
Б – після обробки препаратом
позаклітинної ФБФази протягом 1 години; В –
після інкубації з пухлинними клітинами протягом 1 години.

Примітка: “Pixel Intensity”(вісь “У”) – інтенсивність піку, “Pixel
Position”(вісь “Х”) – позиція піку.

Дослідження процесу цитолітичної дії на клітини саркоми 37 позаклітинної
ФБФази B. subtilis 668 в динаміці показало, що протягом першої години
дії ФБФази, відбувається збільшення пухлинної клітини у розмірі (Рис.11,
б).

Рис. 11. Клітини саркоми 37: контроль (а); після взаємодії з препаратом
ФБФази B. subtilis 668 протягом 1 год (б), 1,5 год (в), 2 год (г).

Вакуолізація цитоплазми, розсмоктування ядерця та майже у всіх клітин
спостерігається вип’ячування мембрани (мішкоподібні утвори) (Рис.11, б).
Протягом наступних 30 хв спостерігається подальший процес фрагментації
цитоплазми клітин саркоми 37 з утворенням апоптичних тілець та загибель
пухлинних клітин (Рис.11, в, г). Під кінець другої години дії препаратів
відбувається розрив оболонки пухлинної клітини з виходом її вмісту в
зовнішнє середовище (Рис.11, г).

Таким чином, позаклітинна ФБФаза у представників роду Bacillus може бути
одним з чинників, що згубно діє на злоякісні клітини.

ВИСНОВКИ

1. Вперше у представника спороносних бактерій – Bacillus subtilis 668
виявлено здатність продукувати у середовище культивування фермент,
класифікований як фруктозо-1,6-бісфосфатаза.

2. Позаклітинна ФБФаза В. subtilis 668 очищена у 165 разів до
гомогенного стану і має питому активністю 52,9 од/мг білку.

3. Встановлено, що позаклітинна ФБФаза В. subtilis 668 має молекулярну
масу 230000±5000 Да в нативному стані і є тетраметром, що складається з
рівноцінних субодиниць з молекулярною масою 63 000 Да.

Показано, що позаклітинна ФБФаза В. subtilis 668 має високу афінність і
специфічність до субстрату, що доведено за допомогою субстратзалежної
елюції. Її активність залежить від наявності двовалентних катіонів та
регулюється фосфоенолпіруватом та АМФ.

Чутливість ФБФази В. subtilis 668 до дії АМФ, ФЕП, двовалентних і
моновалентних катіонів, молекулярна вага дали підставу віднести її до
ІІІ класу ФБФаз. Вона віднесена до групи “лужних” ФБФаз.

Визначено, що за серологічними, фізико–хімічними і молекулярними
властивостями позаклітинна ФБФаза В. subtilis 668 є подібною тій, що
функціонує в клітині, забезпечуючи основні етапи гліколізу і
глюконеогенезу.

Порівняльним вивченням серологічних властивостей встановлено, що ФБФази
В. subtilis 668 і його філогенетичного нащадка молікута A. laidlawii
var. granulum шт. 118 подібні, але не ідентичні, що вказує на зміну
фенотипових ознак цих мікроорганізмів в процесі еволюції.

Вперше встановлено цитотоксичну активність in vitro позаклітинної ФБФази
B. subtilis 668 відносно клітин саркоми 37. Її
препарати знімають пухлиноасоційовані антигени з поверхні клітини.

9. Запропонований метод одержання препаратів позаклітинної ФБФази
В. subtilis 668 створює можливість її біотехнологічного
напрацювання в необхідних кількостях для наукових цілей, відпрацювання
способів регуляції її активності у людей хворих на діабет ІІ–типу, та
вирішення проблем злоякісного росту клітин.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Панченко Л.П., Ястребова О.В., Скрипаль І.Г. Позаклітинна
фруктозобісфосфатаза Вacillus subtilis: виділення та очищення // Допов.
нац. акад. наук Укр. – 2006.- № 6 – с.171 – 174. (Здобувачем особисто
проведено виділення і очистка препарату ферменту з культурального
фільтрату, підготовлено матеріали статті до друку).

Yastrebova O.V., Panchenko L.P., Korobkova K.S., Skripal’ I.G.
Extracellular fructose bisphosphatase of Bacillus subtilis: purification
and some properties // Наук. вісн. Ужгород. універ., сер.
Біологія.–2006. – вип. 18. – стор. 187-191. (Здобувачем особисто
проведено виділення і очистка препарату ферменту з середовища
культивування, досліджено вплив деяких інгібіторів і активаторів на
ферментативну активність позаклітинної фруктозо–1,6–бісфосфатази
Bacillus subtilis, проаналізовано отримані результати, підготовлено
матеріали статті до друку).

Ястребова О.В., Панченко Л.П., Коробкова К.С., Скрипаль І.Г. Молекулярні
та імунологічні властивості позаклітинної фруктозо–1,6–бісфосфатази
Bacillus subtilis // Наук. вісник Чернівец. універ. – 2006. – вип. 297.
– стор.143–149. (Здобувач безпосередньо приймав участь у плануванні
експерименту, та обробляв отримані дані, досліджено деякі імунологічні
властивості позаклітинного ферменту, встановлено молекулярні властивості
в нативних і денатурованих умовах).

4. Скрипаль І. Г., Малиновська Л.П., Токовенко І.П., Ястребова
О.В.,Панченко Л.П. Порівняльне вивчення фруктозобісфосфатаз Bacillus
subtilis та збудника блідо–зеленої карликовості зернових культур в
реакції подвійної дифузії в гелі за Оухтерлоні // Мікробіол. журн. –
2007. – т. 69, № 2. – с. 9–15. (Здобувач безпосередньо приймав участь у
плануванні експерименту, проводив вакцинацію тварин, особисто проводив
реакції подвійної дифузії в гелі за Оухтерлоні).

Діденко Г.В., Дворщенко О.С., Ястребова О.В., Потебня М.Г., Панченко
Л.П., Скрипаль І.Г. Протипухлинні властивості позаклітинної
фруктозо–1,6– бісфосфатази Bacillus subtilis 668 та препарату,
виділеного з культуральної рідини B. subtilis В 7025 // Мікробіол. журн.
– 2007. – т. 69, № 3. – с.68–73. (Здобувачем особисто проведено
визначення цитотоксичної активності препаратів позаклітинної ФБФази,
підготовлено матеріали статті до друку).

Скрипаль І. Г., Ястребова О. В. Фруктозо-бісфосфатаза мікроорганізмів //
Мікробіол. журн. — 2002. — 64, № 2. — С.84-104.

Ястребова О.В. Особливості функціонування у мікроорганізмів
фруктозо-1,6-бісфосфатази — головного ферменту глюконеогенезу // Укр.
біохім. журн.- 2002.- 74, № 4.- С.24 — 32.

Ястребова О.В., Панченко Л.П., Скрипаль І.Г. Молекулярно–біологічні
властивості позаклітинної фруктозо–1,6–бісфосфатази Bacillus subtilis //
Тези. Конференція молодих учених “Сучасні проблеми фізіології рослин та
біотехнології”, 1-3 грудня 2005р, Ужгород. – Наук. вісн. Ужгород.
універ. – 2005. — с. 135.

Ястребова Е.В., Панченко Л.П. Характеристика внеклеточной
фруктозобисфосфатазы Bacillus subtilis // Тезисы. 9-я международная
Пущинская школа–конференция молодых ученых “Биология — наука XXI века”,
18-22 апреля 2005 г., Пущино. – Сб. тезисов. – с. 106

Yastrebova O.V., Panchenko L.P., Skripal I.G. Extracellular fructose
bisphosphatase of Bacillus subtilis: purification and some properties
// 5th Parnas conference “Molecular mechanisms of cellular signaling”,
26 – 29 april 2005, Kyiv. — Укр. біохім. журн. – 2005. — т. 77. — с.
152.

И.Г. Скрипаль, Е.С. Коробкова, Л.П. Панченко, Л.П. Малиновская, И.П.
Токовенко, Е.В. Ястребова. Внеклеточная фруктозобисфосфатаза моликутов и
спороносных бактерий как маркер их филогенетического родства //
Материалы научной конференции, посвященной 35-летию со дня организации
РУП “Институт защиты растений” НАН Беларуси / 28 февраля – 2 марта 2006
г, Минск. — Сб. научн. трудов. – 2006. — вып. 30, ч. 1. “ Стратегия и
тактика защиты растений”. — стр. 47-52.

12. Панченко Л.П., Ястребова О.В., Коробкова К.С.,Скрипаль І.Г. Вплив
окремих ефекторів на ферментативну активність позаклітинної
фруктозо–1,6–бісфосфатази Bacillus subtilis 668 // Матеріали ІХ
Українського біохімічного з”їзду, 24 – 27 жовтня 2006р., Харків. – с.
159-160.

13. Ястребова Е.В., Диденко Г.В., Дворщенко Г.С. Цитотоксическая
активность внеклеточных фруктозо–1,6–бисфосфатазы Bacillus subtilis 668
и гликопротеида B. subtilis В 7025 // International conference of young
researchers IV edition (Chiєinоv, November 10, 2006.) – Chiєinоv,
Moldova, — 2006, — с. 58.

14. Tokovenko I.P., Skripal I.G., Jastrebova E.V., Malinovskaja L.P.,
Panchenko L.P. Comparative studing fructosebisphosphatases of the
Bacillus subtilis 668 and the activator pale–green dwarf grain crops in
reaction of double diffusion in gel by Ouchterlony // International
conference of young researchers IV edition (Chiєinоv, November 10,
2006.) – Chiєinоv, Moldova, — 2006, — с. 60.

АНОТАЦІЯ

Ястребова О.В. Позаклітинна фруктозо–1,6–бісфосфатаза Bacillus subtilis
668. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.07. – мікробіологія. – Інститут мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2007.

Дисертація присвячена виділенню та дослідженню властивостей
позаклітинної фруктозо–1,6–бісфосфатази (ФБФази) Bacillus subtilis 668.

Розроблено спосіб очищення цього ферменту за допомогою фракціонування
сульфатом амонію її препаратів з культуральної рідини, та гідрофобної та
субстратзалежної хроматографії . Встановлено вплив джерел вуглецю і
температури на динаміку накопичення і активність ферменту. Здійснена
очистка у 165 разів до гомогенного стану та отримано ферментний препарат
позаклітинної ФБФази з активністю 52,9 од/мг білку.

Досліджені фізико–хімічні та молекулярні властивості, кінетичні
параметри взаємодії позаклітинної ФБФази з субстратом з метою
класифікувати фермент. Встановлено, що позаклітинна ФБФаза B. subtilis
668 відноситься до “лужних” фосфатаз, активність якої залежить від
двохвалентних катіонів металів та регулюється АМФ і ФЕП. Позаклітинна
ФБФаза – тетраметр, з молекулярною масою субодиниці 630000 Да.
Чутливість ФБФази В. subtilis 668 до дії АМФ, ФЕП, двовалентних і
моновалентних катіонів, розміру субодиниці та інших факторів дали
підставу віднести її до ІІІ класу ФБФаз.

Встановлено серологічну спорідненість між позаклітинними ФБФазами
B. subtilis 668 та молікута Achоlерlasma laidlawii var.
granulum шт. 118, що підтверджує філогенетичні зв”язки цих
мікроорганізмів. Показано, що позаклітинна і клітинна ФБФази B. subtilis
668 серологічно ідентичні.

Виявлено цитотоксичну активність in vitro позаклітинної ФБФази
B. subtilis 668 відносно пухлинних клітин саркоми 37. Даний
ферментний препарат знімає пухлиноасоційовані антигени з поверні
клітини.

Ключові слова: фруктозо–1,6–бісфосфатаза, хроматографічні та
фізико–хімічні властивості, каталітична активність, дія активаторів,
цитотоксична активність, серологічна спорідненість, Bacillus subtilis.

АННОТАЦИЯ

Ястребова Е.В. Внеклеточная фруктозо–1,6–бисфосфатаза Bacillus subtilis
668. – Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.07.– микробиология. – Институт микробиологии и
вирусологии им. Д. К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2007.

Диссертация посвящена выделению и изучению свойств ферментного препарата
внеклеточной фруктозо–1,6–бисфосфатазы (ФБФази) Bacillus subtilis 668.

Было изучено влияние источников углерода и температуры на динамику
накопления и активность внеклеточного фермента. Выделено внеклеточную
ФБФазу В. subtilis 668 с активностью 52,9 ед/мг и очищенной в 165 раз.
Разработанный метод очистки фермента состоит из последовательных этапов
фракционирования и осаждения белков из культуральной жидкости с помощью
(NH4)2SO4, гидрофобной хроматографии на колонке с Toyopearl TSK HW-60,
десальтации на колонке с Sephadex G-10 и субстратзависимой хроматографии
на колонке с CM-Sephadex.

Были изучены физико–химические и молекулярные свойства, кинетические
параметры взаимодействия внеклеточной ФБФазы с субстратом с целью
классифицировать фермент. Установлено, що внеклеточная ФБФаза В.
subtilis 668 относиться к “щелочным” фосфатазам; интервал значений
температур, при которых проявляется наибольшая активность ФБФазы,
находится в пределах 45–500С. Максимум активности фермента наблюдали при
концентрации субстрата (фруктозоди-фосфата) 2х10-3М. Активность
внеклеточной ФБФазы абсолютно зависима от двухвалентных катионов Mg2+
или Mn2+. При этом на активность ФБФазы в большей степени влияли
катионы Mg2+ чем Mn2+, активность также регулируется АМФ и ФЕП. Цинк в
зависимости от рН и присутствия катионов Mg2+ по-разному влиял на
активность внеклеточной ФБФази. При низких концентрациях катионов Zn2+
(2,0–4,0 мМ) наблюдается активация фермента в щелочном рН среды. В
отсутствии катионов Mg2+ при этом же рН цинк ингибирует активность
ФБФазы B. subtilis 668. При низких концентрациях в кислом рН катионы
цинка проявляют себя как активаторы. Но в этих же условиях в присутствии
катионов магния цинк выступает как ингибитор. В присутствии катионов
Mg2+ и ЕДТА, цинк увеличивает активность внеклеточного фермента почти в
2 раза при кислом рН. При концентрации 10-4 М катионы тяжелых металлов
не ингибиторовали активность ФБФазы в присутствии катионов Mg2+.
Установлено, что моновалентные катионы только в низких концентрациях
являются незначительными еффекторами внеклеточной ФБФазы.

Из-за чувствительности внеклеточной ФБФазы В. subtilis 668 к АМФ, ФЕП,
двухвалентным и одновалентным катионам металлов, а также размера
субъединицы она отнесена к ІІІ классу ФБФаз.

Фермент представляет собой тетрамер. Молекулярная масса субъединицы,
определенная методом электрофореза в ПААГ с DS–Na, составляет 63000 Да.
При гель-фильтрации на колонке с Sephadex G–200 молекулярная масса
составляет 230000±5000 Да.

Серологические свойства внеклеточных ФБФаз B. subtilis 668 и молликута
Achоlерlasma laidlawii var. granulum шт. 118 были изучены в
сравнительном аспекте с помощью реакции двойной диффузии в геле по
Оухтерлони. Установлено, що в серологическом отношении их внеклеточные
ферменты представлены гомологичными молекулами, состоящими из двух
антигенов, один из которых является подобным для этих микроорганизмов, а
второй проявляет частичную идентичность. На это указывает то, что в
антисыворотках к этим ферментам есть антитела как к общим детерминантам
антигенов, которые сравниваются, так и к детерминанте, отсутствующей у
каждого из них. Исходя из результатов сделан взвод, что внеклеточная
ФБФаза B. subtilis 668 серологически родственна, но не идентична
внеклеточной ФБФазе Achоlерlasma laidlawii var. granulum шт. 118.
Внеклеточная и клеточная ФБФазы B. subtilis 668 не имеют серологических
отличий.

Установлено, что внеклеточная ФБФаза B.subtіlіs 668 проявляет іn vіtro
цитотоксическую активность по отношению к опухолевым клеткам саркомы 37.
Показано, что данный ферментый препарат снимает опухольассоциированные
антигены с поверхности опухолевых клеткок.

Ключевые слова: фруктозо–1,6–бисфосфатаза, хроматографические и
физико–химические свойства, каталитическая активность, влияние
активаторов, цитотоксическая активность, серологическое родство,
Bacillus subtilis.

SUMMARY

Yastrebova O.V. Extracellular fructose bisphosphatase of Bacillus
subtilis 668. – Manuscript.

Thesis for a candidate’s degree in biology speciality 03.00.07. –
microbiology. – The Institute of Microbiology and Virology of National
Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2007.

Candidat’s thesis is focused on the isolation and investigation the
properties of extracellular fructose bisphosphatase (FBFase) of
Bacillus subtilis 668.

The purification method of this enzyme by means of hydrophobic and
substratspecific chromatography from cultural liquid with 40% satiation
of (NH4)2SO4 was elaborated. Influence carbon sources and temperature on
accumulate dynamics and enzyme activity was studied. Extracellular
FBPase was purified about 165–fold to homogeneous state and specific
activity of enzyme preparation were 52,9 un/mg of protein.

Physico–chemically and molecular properties, kinetic characteristic
interaction of extracellular FBPase with substrate in order for
clasificated enzyme was investigated. It was established that
extracellular FBPase of B. subtilis 668 is related to the group of the
“alkaline” of these enzymes. The extracellular FBPase is dependent of
bivalent cations (Mg2+, Mn2+), was regulated AMP and PEP. Extracellular
FBPase are a tetramer with molecular weight of subunit equal to 63 kDa.
Sensitivity of extracellular FBPase of B. subtіlіs 668 to influence
AMP, PEP, bivalent and monovalent cations, subunit size and another
factors for reasons given refer to a class III FBFases.

Was established serologically related between of
extracellular FBFase of B. subtіlіs 668 and mollicut
Achоlерlasma laidlawii var. granulum st. 118, what confirm genetical
relation of this microorganisms. Extracellular and intracellular FBFases
of B. subtіlіs 668 serologically identical was shown.

The extracellular FBPase of B. subtіlіs 668 shows citotoxicity activity
in relation to tumors cells of as the sarcoma 37 іn vіtro. It is shown
that the preparations remove TA antigenes from a surface of a tumors
cell.

Key words: fructose bisphosphatase, chromatographical and
physical–chemically properties, catalytic activity, effect of
activators, serological affinity, citotoxity activity, Bacillus
subtilis.

Похожие записи