.

Післяопераційна лапароскопія в діагностиці та динамічний лапароскопічний адгезіолізис в лікуванні спайкової хвороби (реферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 4104
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

КОЗЛОВА ЮЛІЯ ОЛЕКСАНДРІВНА

УДК:
615.014.41:612.419:616.72-002.77:616.832-004.1

Вивчення впливу факторів кріоконсервування на клітини гемопоетичної
системи в умовах розвитку аутоімунних захворювань

03.00.19. – кріобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН
України

Науковий керівник: член-кореспондент НАН України,

доктор медичних наук, професор

Гольцев Анатолій Миколайович,

Інститут проблем кріобіології і
кріомедицини НАН

України, заст. директора з
наукової роботи ІПКіК НАН

України, м. Харків

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий

співробітник Розанов Леонід
Федорович,

Інститут проблем кріобіології та
кріомедицини НАН

України, провідний науковий
співробітник відділу

низькотемпературного
консервування,

м.Харків

доктор медичних наук, професор

Фролов Олександр Кирилович,

Запорізький національний
університет,

зав. кафедрою імунології і
біохімії,

м. Запоріжжя

Провідна установа: Національний медичний університет

ім. О.О. Богомольця МОЗ
України,

відділ експериментальної та
клінічної імунології,

м.Київ

Захист відбудеться „25” жовтня 2005 року о 13-30 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01. в Інституті проблем
кріобіології і кріомедицини НАН України, 61015, Харків – 15, вул.
Переяславська, 23

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ІПКіК НАН України за
адресою: 61015, Харків – 15, вул. Переяславська, 23

Автореферат розіслано „21” вересня 2005р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

член-кореспондент НАН України
Гольцев А.М.ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Період емпіричних досліджень у області трансплантації
лімфогемопоетичних тканин завершився успішним їхнім застосуванням при
лікуванні гемо- та імунодепресивних станів різного генезу [Абдулкадыров
К.М., 1976; Thomas E.D. et al., 1976; Kanavaros P. et al., 1999;
Грищенко В.И и др., 2002; Гольцев А.Н. и др., 2004]. Встановлений
останнім часом факт причетності дефекту стовбурових кровотворних
попередників до розвитку жорстких аутоімунних захворювань (АІЗ), які не
піддаються традиційним методам лікування, став поштовхом для проведення
такої “реконструктивної” терапії, як трансплантація кісткового мозку
(КМ), клітин ембріональної печінки, ізольованих стовбурових
гемопоетичних клітин та ін. [Tyndall A., 1999; Гольцев А.Н. и др., 2003;
Nash R.A. et аl., 2003; Snowden J.A., 2004]. Точний механізм дії терапії
– пересадження гемопоетичної тканини – залишається неясним, тим більше,
що ефект спостерігається навіть при трансплантації аутологічного, тобто
отриманого від хворих з АІЗ матеріалу [Алексеев Л.П. и др., 2000;
Ikehara S. 2001; Porta C., 2004]. Перспективним для з’ясування механізму
лікувального ефекту аутотрансплантації КМ при АІЗ є використання
експериментальних тварин з АІЗ, зокрема, такими мультифакторними
модельними патологіями, як ад’ювантний артрит (АА) і експериментальний
алергічний енцефаломієліт (ЕАЕ), що є аналогом ревматоїдного артриту
(РА) і розсіяного склерозу (РС) людини.

Для реалізації програм лікування АІЗ за допомогою трансплантації
кровотворних клітин необхідно створити їхні запаси і надійні способи
довгострокового збереження з застосуванням оптимальних технологій
кріоконсервування. Відзначається, що головними факторами ушкодження
клітин у процесі їх кріоконсервування є сольові і температурні
градієнти, зміна рН середовища, механічний вплив кристалів льоду та ін.
[Белоус А.М. и др., 1994; Gao D. et al., 2000; Холодный В.С. и др.,
2002]. Відомо, що кріостійкість біооб’єкта до дії факторів
низькотемпературного консервування визначається його вихідним
структурно-функціональним станом [Цуцаева А.А. и др., 1982; Дубрава
Т.Г., 1986; Гольцев А.Н и др., 1987; Zaheer H.A. et al., 1994; Balint B.
et аl., 1999]. На прикладі гемопоетичних клітин показано, що різні за
ступенем диференціювання кровотворні попередники виявляють різну
чутливість до однакових умов кріоконсервування, а різні режими
кріоконсервування по-різному впливають на ті самі властивості клітин
[Гольцев А.Н., 1988; Goltsev A.N. et al., 2001]. Крім того,
отримано результати, що підтверджують можливість використання
кріоконсервування як способу модифікації морфофункціонального статусу
кровотворних клітин [Луценко Е.Д. и др., 1995; Goltsev A.N. et al.,
2005], а також зміни імунореактивності мієлотрансплантату [Гольцев А.Н.
и др., 1994; 1996]. Однак навіть при таких особливостях взаємодії
“біологічний об’єкт – фактори кріоконсервування” у даний час
низькотемпературне консервування клітин КМ проводиться переважно за
стандартними методиками, що не враховують особливості вихідної
структурної організації мієлокаріоцитів. Є підстави вважати, що
гемопоетична система при розвитку АІЗ має спотворений
структурно-функціональний профіль [Kawamura M. et al., 1997; Гольцев
А.Н. и др., 2003; 2004]. У зв’язку з цим виникає необхідність з’ясувати
характер і причини таких змін, а також провести дослідження, які
спрямовані на розробку альтернативних методів кріоконсервування
гемопоетичної тканини донорів з патологією у вигляді АІЗ.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконана відповідно до плану НДР ІПКіК НАН України у відділі
кріопатофізіології в рамках теми №2.2.6.6. „Вивчення механізмів
корегуючої дії продуктів фетоплацентарного комплексу на
лімфогемопоетичну систему в умовах розвитку аутоімунних захворювань при
старінні”, № держреєстрації 0102U002023; теми
№2.2.6.11. „Вивчення молекулярних основ регуляції продуктами
ембріофетоплацентарного комплексу кооперативних взаємодій
імунокомпетентних клітин при аутоімунній патології”, № держреєстрації
0102U002022 і теми №2.2.6.18. „Використання кріоконсервованих
стовбурових клітин різного походження для лікування аутоімунних
захворювань”, № держреєстрації 0104U006439.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи – вивчити вплив фізико-хімічних
факторів кріоконсервування на морфофункціональні показники клітин
кісткового мозку тварин з різними формами АІЗ (АА, ЕАЕ).

Відповідно до поставленої мети передбачалося:

Провести порівняльний аналіз гематологічних, імунологічних, біохімічних
показників тварин у динаміці розвитку АА і ЕАЕ.

Дослідити структурно-функціональний стан гемопоетичної системи тварин з
АІЗ.

З’ясувати характер впливу окремих фізико-хімічних факторів (рН,
осмолярність) на життєздатність і морфофункціональні характеристики
клітин кісткового мозку тварин із зазначеними АІЗ.

Оцінити життєздатність і морфофункціональний потенціал клітин кісткового
мозку тварин з АА і ЕАЕ після експозиції з різними кріопротекторами
(гліцерин, ДМСО).

Провести порівняльну оцінку впливу різних швидкостей заморожування і
концентрацій кріопротектора на життєздатність і морфофункціональні
характеристики клітин кісткового мозку тварин з АА і ЕАЕ

Вивчити вплив різних режимів кріоконсервування на колонієутворюючу
активність кровотворних клітин-попередників різного ступеня
диференціювання тварин з АІЗ у системах in vitro та in vivo.

Об’єкт дослідження. Режими кріоконсервування з різними концентраціями
кріопротектора та швидкостями заморожування клітин кісткового мозку
здорових тварин і з АІЗ.

Предмет дослідження. Клітини кісткового мозку здорових тварин та з АІЗ
(АА та ЕАЕ).

Методи дослідження: гематологічні, імунологічні, біохімічні,
морфологічні, гістологічні, а також методи культивування клітин
кісткового мозку у системах in vitro та in vivo.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше проведено порівняльний
аналіз стану гемопоетичної системи тварин при розвитку різних АІЗ, таких
як АА і ЕАЕ. Відзначено, що зміни цього компартменту організму
обумовлені структурно-функціональною модифікацією клітинно-тканинних
субстратів імунокомпетентної сфери і вираженими змінами метаболічних
процесів. Новими є результати, що демонструють залежність
морфофункціональних перебудов у гемопоетичній системі від виду АІЗ,
різноспрямованої зміни ряду показників стану мієлокаріоцитів, а також
функціонального статусу кровотворних попередників КМ тварин при цих
формах АІЗ.

Уперше проведена комплексна оцінка впливу фізико-хімічних факторів, що
реалізуються у процесі кріоконсервування на морфологічні і функціональні
показники клітин КМ тварин з АІЗ у системах in vitro та in vivo.
Показано, що ідентичні умови кріоконсервування КМ здорових донорів і з
АІЗ забезпечували не тільки різну збереженість кровотворних
попередників, що реалізують функціональний потенціал in vitro та in
vivo, але й перерозподіл у цих компартментах попередників з різним
ступенем комітованості. У результаті оптимальними у відношенні
забезпечення функціональної повноцінності клітин тварин з АІЗ є різні
умови кріоконсервування. Крім того, встановлено унікальний ефект
„реставрації” функції кровотворних попередників різного рівня
диференціювання КМ тварин з АІЗ за певних умов кріоконсервування. На
підставі отриманих результатів зроблено важливий висновок, що клітини КМ
при розвитку в організмі АІЗ, тобто зі зміненим вихідним
структурно-функціональним статусом, мають принципові відмінності
відповіді на дію реалізованих у процесі кріоконсервування
фізико-хімічних факторів. Ця теза підтверджується отриманими новими
даними про істотні розходження відповіді клітин КМ здорових тварин і з
АІЗ на окремі фактори кріоконсервування в системі in vitro.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані підкреслюють
важливість і визначають необхідність обліку вихідного
морфофункціонального стану КМ, зокрема, при розвитку в організмі АІЗ,
оптимізації методів його кріоконсервування і підвищення ефективності
застосування при аутотрансплантації. Роль окремих факторів
кріоконсервування (осмолярність і рН) у зміні структурно-функціонального
стану клітин КМ тварин з АІЗ може бути врахована при аналізі механізмів
ушкодження мієлокаріоцитів і „адаптації” визначених режимів
кріоконсервування у відношенні КМ зі зміненим структурно-функціональним
станом. Установлений факт „керування” функціонального потенціалу
кровотворних клітин КМ різного ступеня диференціювання тварин з АІЗ
варіюванням умов кріоконсервування відкриває можливість у клінічній
практиці „регулювати” темп відновлення лімфогемопоезу реципієнтів у
посттрансплантаційний період.

Особистий внесок дисертанта. Винесені на захист положення і результати
отримані дисертантом особисто. Роботи, що відносяться до теми
дисертаційної роботи, опубліковані у співавторстві з науковим керівником
теми член-кор. НАН України Гольцевим А.М. та іншими співробітниками
відділу кріопатофізіології, відбивають результати загального планування
і проведення експериментів, узагальнення результатів і підготовки
матеріалів до друку. В опублікованих із співавторами працях особистий
внесок здобувача полягає:

– у роботах [1, 5, 7] в участі у теоретичній та практичній розробці
методів вивчення стану органів ЛГПС, зокрема, клітин КМ при розвитку
АІЗ;

– у роботах [2, 8, 9, 11] у вивченні змін життєздатності, адгезивної
здатності та фагоцитарної активності клітин КМ тварин з АІЗ після
експозиції їх у розчинах різної осмолярності та рН;

– у роботах [3, 4, 12, 13] у відпрацюванні методики культивування
нативних та кріоконсервованих клітин КМ щурів з АА та ЕАЕ;

– у роботах [3, 4, 10, 12, 13] у проведенні різних режимів заморожування
клітин КМ;

– у роботах [6, 14] у здійсненні визначення активності ферментів
антиоксидантної системи та рівня гідроперекисів ліпідів у гомогенатах
печінки щурів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи
доповідалися та обговорювалися на наукових форумах: конференції молодих
учених ІПКіК НАН України „Холод у біології і медицині” (Харків, 2003 і
2004 рр.); науково-практичній конференції „Наука і соціальні проблеми
суспільства: медицина, фармація, біотехнологія” (Харків, 2003 р.);
Міжнародному конгресі з кріобіології і кріомедицини „Cryobiomol-2003”
(Коімбра, 2003 р.); конференції молодих учених і студентів з
молекулярної біології та генетики „50 years of the double helix of the
DNA and 30 anniversary of the Institute of molecular biology and
genetics NAS of Ukraine” (Київ, 2003 р.); науково-практичній конференції
„Сучасні аспекти репродуктології, перинатальної медицини та
кріобіології” (Харків, 2003 р.), Міжнародному конгресі з кріобіології і
кріомедицини „The 41stAnnual Meeting of the Society for Cryobiology –
CRYO-2004” (Пекін, 2004 р.); I Українській науковій конференції
„Проблеми медичної і біологічної фізики” (Харків, 2004 р.); VIII
Міжнародній науковій екологічній конференції „Актуальные проблемы
сохранения устойчивости живых систем” (Белгород, 2004 р.).

Публікації. За матеріалами дисертаційного дослідження опубліковано 14
робіт, з яких 5 – у спеціалізованих фахових виданнях та 1 патент на
винахід.

Обсяг і структура дисертації. Дисертацію викладено на 179 сторінках
друкованого тексту, з яких 131 сторінка основного змісту. Дисертація
складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів
досліджень, результатів власних досліджень, заключної частини,
висновків, переліку використаних джерел літератури (23 сторінки), що
включає 209 першоджерел. Дисертацію ілюстровано 12 таблицями та 44
рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження

Дослідження були виконані на білих 5-6 – місячних щурах-самцях масою
160-180 г (116 тварин) і статевозрілих мишах-самцях лінії СВА масою
19-22 г (120 тварин), що утримувалися в стандартних умовах віварію
Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України. Усі
маніпуляції з тваринами здійснювали згідно з положенням “Європейської
конвенції захисту хребетних тварин, які використовуються з
експериментальною та іншою науковою метою” (м.Страсбург, 1985 р.).

Індукцію АА здійснювали субплантарним уведенням 0,2 мл повного
ад’юванту Фрейнда, що містить 3 мг/мл Micobacterium tuberculosis, на 100
г маси тварини за методом Пірсона [Pearson C.M., 1963]. ЕАЕ індукували
уведенням у подушечки чотирьох лап щурів 0,4 мл гомогенату алогенної
тканини спинного мозку в суміші з повним ад’ювантом Фрейнда [Давыдова
Г.С., 1969]. Контролем була група здорових тварин.

Стан лімфогемпоетичної системи (ЛГПС) тварин оцінювали на 7, 14, 21 і
28-у добу після індукції патології з використанням гематологічних,
імунологічних, біохімічних, морфологічних, гістологічних методів і
культивування клітин КМ у системах in vitro та in vivo. Зокрема, за
допомогою ФІТЦ-мічених моноклональних антитіл (Galtag, США) до CD-4 і
CD-8 структур мембран [Шторх В., 1987] було визначено субпопуляційний
склад Т-клітин та імунорегуляторний індекс (ІРІ), що виражає відношення
CD-4+/CD-8+. Активність природних кілерів (ПК) спленоцитів щурів
визначали обчисленням індексу цитотоксичності [Мельников О.Ф., 1999],
рівень циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) у сироватці крові –
загальноприйнятим методом [Стручков П.В. и др., 1985]. Рівень
метаболізму тварин у динаміці розвитку АІЗ оцінювали за вмістом
гідроперекисів ліпідів (ГПЛ) у тесті з 2-тіобарбітуровою кислотою
[Mihara M. еt al., 1980]; глутатіонпероксидазну (ГПО) і
глутатіонредуктазну (ГР) активності реєстрували флуориметричним методом
на основі зменшення НАДФН2 [Zakowski J.J., 1978; Лемешко В.В., 1987].

На підставі проведених досліджень було визначено початок хронічного
перебігу даних патологій: для АА – 14-у добу, а для ЕАЕ – 21-у добу.
Установлення імунологічних ознак, що змінюються найбільш маніфестно у
цей період (зниження ІРІ та константи ЦІК), було підставою для вибору
часу забору КМ, що одержували зі стегнових кісток шляхом вимивання
середовищем 199 з додаванням 10%-ї ембріональної телячої сироватки і
2%-го цитрату натрію.

Розчини з різними осмолярностями (100, 150, 200, 600, 1200, 2400
мОсм/кг) і рН (5,0; 6,0; 8,0; 9,0) були обрані як окремі фактори, що
модифікують морфофункціональний стан клітин КМ на етапах
кріоконсервування.

На етапі еквілібрації і вибору кріопротектора використовували гліцерин і
диметилсульфоксид (ДМСО) у 5, 7, 10 і 15%-й (кінцевій) концентрації.
Експозиція клітин КМ із кріопротекторами проводилася при температурі 4°С
протягом 10 хвилин – часу, необхідного для оптимального насичення клітин
кріопротектором ?Холодный В.С., 2002?. Проведені дослідження показали,
що гліцерин у всіх вищевказаних концентраціях і 15%-й ДМСО негативно
впливали на клітини КМ. У зв’язку з цим у подальших експериментах з
оцінки впливу різних швидкостей охолодження на морфофункціональну
збереженість мієлокаріоцитів були використані 5, 7 і 10%-ї концентрації
ДМСО. Кріоконсервування суспензії КМ здійснювали на програмному
заморожувачі “Cryoson” (Німеччина) у кріоконтейнерах фірми Nunc обсягом
1 мл (6,0х106 кл/мл).

У роботі апробувані програми кріоконсервування зі швидкостями
охолодження:

1 єС/хв до -40°С з наступним зануренням у рідкий азот – режим 1 [Rowley
S.D., 1994];

10 єС/хв, 10- хвилинна витримка при температурі -40 ?С з наступним
зануренням у рідкий азот – режим 2 [Останков М.В., 2001];

40 єС/хв, 10- хвилинна витримка при температурі -40?С з наступним
зануренням у рідкий азот – режим 3 [Козлова Ю.А. и др., 2004].

Відігрівання суспензії проводили на водяній бані при температурі 38-40°С
протягом 40-50 с. Після кріоконсервування клітини КМ відмивали від
кріопротектора шляхом повільного додавання рівного обсягу робочого
розчину і наступного центрифугування.

До і після кріоконсервування оцінювали: життєздатність клітин КМ методом
суправітального фарбування 0,2%-м розчином трипанового синього [Костенко
Е.А., 1968]; якісний склад ядровмісних клітин на мазках, пофарбованих
азур-II-еозином; адгезивну здатність клітин КМ [Пастер Е.У и др., 1989];
фагоцитарну активність (фагоцитарний індекс (ФІ) – відсоток клітин, які
фагоцитували; фагоцитарне число (ФЧ) – число захоплених однією клітиною
мікроорганізмів; абсолютний показник фагоцитарної активності
мієлокаріоцитів – АПФАМ, що визначався за формулою: АПФАМ=ФИхФЧх(абс.
кількість кл/мкл суспензії х106)) [Александров М.Г., 1988]. Вміст
кровотворних попередників грануломоноцитопоезу (КУО-ГМ) оцінювали за
методом С.І. Шерешкова, 1974, у нативному КМ на 7-му добу, у
кріоконсервованому – на 14-ту добу культивування з урахуванням факту
тимчасової інгібіції проліферативної активності КУО-ГМ після
кріоконсервування [Дубрава Т.Г., 1986]. Інтегральний показник КУО-ГМ –
це сумарна кількість попередників, що формують структури, до 20 клітин –
кластери і більш 20 клітин – колонії [Афанасьев Б.Н. и др., 1985]. Для
оцінки розподілу в КМ кровотворних клітин з різним ступенем потентності
(менш диференційовані попередники формують колонії, більш
диференційовані – кластери [Афанасьев Б.В. и др., 1985]) був введений
індекс проліферативної активності (ІПА КУО-ГМ), що представляє собою
відношення колонієутворюючих попередників до кластероутворюючих [Гольцев
А.Н. и др., 2005]. Кровотворні попередники, що формують колонії в
селезінках летально опромінених мишей (КУОс), визначали
загальноприйнятим методом [Till J.E., 1961] на 8-у добу – КУОс-8 (більш
диференційовані) і 14-у добу – КУОс-14 (менш диференційовані) [Harris
R.A. et al., 1984] після введення КМ. Вміст колоній різних типів у
селезінках оцінювали на гістологічних зрізах [Меркулов Г.А., 1961].

З метою об’єктивізації отриманих даних щодо стану КМ тварин з АІЗ до і
після кріоконсервування було використано індекс сумарного ступеня
відхилення (ССВ) [Пат. №2004031694 Україна, 2004], що є сумою значень
відхилень від контролю всіх показників, яка розділена на 100 та виражена
в умовних одиницях. Більш задовільними були результати з меншою ССВ.
Статистичну обробку експериментальних даних проводили за методом
Стьюдента-Фішера.

Результати досліджень та їхнє обговорення

Неодноразово зазначалося, що АІЗ є патологією всього організму
[Головизин М.В, 1993; Гольцев А.Н. и др., 2000; 2002], тим самим
підкреслюючи „зацікавленість” різних компартментів імунної системи в їх
розвитку. У зв’язку з цим на першому етапі виконання роботи було
проведено дослідження стану ЛГПС для виявлення в ній порушень при
розвитку даних патологій. Порівняльна оцінка розвитку імунозапального
процесу показала як спільність змін імунологічних, гематологічних і
біохімічних показників при АА і ЕАЕ, так і відмінності. Крім того, зміни
в імунній системі відмічалися вже на етапі доклінічної маніфестації
патологій і знову ж виявлялися в залежності від виду АІЗ. Так, при
дослідженні клітинної ланки імунітету було встановлено пригнічення
кілерної активності клітин селезінки (природні кілери – ПК) у всі
терміни розвитку АА, що узгоджується з даними літератури про дефект
цитолітичної активності ПК при наростанні активності і тяжкості РА
[Семененя И.Н., 1991]. У той же час при розвитку ЕАЕ зміна вмісту ПК
мала хвилеподібний характер: зниження на 7-у добу; зростання до 14-ї
доби і тенденція до зниження в період 21-28-ї діб у порівнянні з
контролем. Важливо, що при обох патологіях відбувалася розбалансування
співвідношення регуляторних субпопуляцій Т-хелперів і Т-супресорів в
селезінці. Причому вміст останніх знижувався значно інтенсивніше, що
характерно для розвитку АІЗ [Гольцев А.Н., 2002; Козлова Ю.А., 2004;
Рассоха И.В., 2005]. У гуморальній ланці відмічено накопичення найбільш
патогенних дрібнодисперсних ЦІК (дЦІК) у всі терміни розвитку обох
патологій, що досліджуються. Однак при розвитку АА їх накопичення було
більше, ніж при ЕАЕ. Це явище є закономірним, оскільки відомо, що дЦІК є
потенційним чинником імунного пошкодження тканин синовіальної оболонки
суглоба при РА [Яременко О.Б., 2002; Рассоха І.В., 2005]. У
гематологічному статусі вже на 7-у добу розвитку АІЗ на фоні
лейкоцитозу, зумовленого підвищенням кількості сегментоядерних
нейтрофілів, спостерігалося збільшення швидкості осідання еритроцитів в
порівнянні з контролем і зменшення вмісту гемоглобіну в крові. Ці ознаки
характерні для запального процесу [Шиффман Ф.Дж., 2000].

Аутоімунні захворювання, які протікають хронічно, характеризуються
порушенням балансу про- і антиоксидантної системи [Кочетова Е.В., 1996;
Гольцев А.Н., 2004]. При визначенні інтенсивності ПОЛ було зазначено, що
порівняльні патології мають різноспрямовану динаміку зміни вмісту ГПЛ в
печінці. Так, при АА вміст ГПЛ був знижений в порівнянні з контролем
протягом всіх термінів розвитку патології. Спостерігалася активація ГПО
на фоні зниження активності ГР в порівнянні з контролем, що може
свідчити про нездатність останньої відновлювати глутатіон. У той же час
при ЕАЕ посилення процесів ПОЛ відбувалося вже на стадії доклінічних
проявів захворювання (7 доба) з достовірним зниженням кількості ГПЛ до
14-ї доби. Зміна активності ГПО мала хвилеподібний характер протягом
всіх термінів цієї патології. Достовірне зниження активності ГР на
21-28-у добу розвитку ЕАЕ, можливо, визначається зменшенням активності
системи продукування НАДФН2 (головним чином дегідрогеназ циклу
трикарбонових кислот і пентозофосфатного шунта), а також конкуренцією з
нею за НАДФН ГПО [Кулинский В.И. и др., 1993].

Таким чином, при АА і ЕАЕ спостерігається виражена зміна стану ЛГПС
експериментальних тварин, що, очевидно, є слідством розвитку
імунно-запального процесу, порушенням цитокінового профілю і т.д.
[Демина Т.Л. и др., 1997; Столяров И.Д., 2002; Kuroda T. et al., 2002].
Важливо зазначити, що при розвитку досліджуваних патологій можна
виділити гостру фазу захворювання на 3-7-у добу після індукції АА і
7-14-у добу ЕАЕ, з подальшою фазою хронізації патологічного процесу, що
підтверджується дослідженнями клінічних ознак даних патологій, які було
отримано раніше [Гольцев А.Н. и др., 2003; Бабенко Н.Н., 2003]. Іншими
словами, весь комплекс відмічених змін є важливим чинником зміни стану
гемопоетичної системи організму.

Попередні дослідження клітинного складу КМ тварин з різними видами АІЗ
показали, передусім, зниження кількісного вмісту клітин еритроїдного
ряду та збільшення мієлоїдного і лімфоїдного в порівнянні з мієлограмами
здорових тварин.

При дослідженні функціональних показників відмічена чітка залежність
характеру та міри зміни адгезивних і фагоцитарних властивостей клітин КМ
від виду патології (рис. 1) Так, при артриті ФЧ було достовірно нижче за
контроль, а ФІ і кількість адгезуючих клітин (АК) істотно перевищували
його рівень. У результаті АПФАМ тварин з АА не відрізнявся від контролю.
У той же час при ЕАЕ дані показники були значно нижчими за контроль.
Підвищення рівня фагоцитарної активності і адгезивної здатності клітин
КМ при АА може бути наслідком збільшення при даній патології синтезу
ІЛ-8, а зниження при ЕАЕ – підвищення експресії іншого цитокину –
трансформуючого чинника ? [Демина Т.Л., 1997], інгібітора багатьох
функцій клітин [Возианов А.Ф. и др., 1998].

Оцінка вмісту в КМ кровотворних попередників, що формують in vitro
гранулоцитарно-макрофагальні колонії (КУО-ГМ), показала, що у тварин з
АА і ЕАЕ їх кількість знижувалася в рівній мірі і складала відповідно
57,43±3,56 і 51,23±2,78% від контролю. Таке зниження може бути пов’язано
зі зменшенням продукції колонієстимулюючих чинників при даних
патологіях [Гембицкий Е.В., 1991].

Рис.1. Функціональні показники кісткового мозку тварин з АІЗ:

а – фагоцитарна активність

б – вміст адгезуючих клітин

У компартменті КУОс КМ тварин із АА на фоні збільшення в 1,3 разу вмісту
клітин з більш високим проліферативним потенціалом (КУОс-14) знижувалася
в 2,5 рази кількість КУОс-8, що може бути слідством реалізації
компенсаторних механізмів у гемопоетичній системі [Гольцев А.Н. и др.,
2003].

Jl?

Oe

R

T

V

X

Z

\

^

`

b

d

°

?¤?¤???°

HJ¶F

Oe

O

hoA}

?¤?¤???ріоцитів тварин з АІЗ, що визначає необхідність як в
теоретичному, так і прикладному аспекті вивчення особливостей відповіді
цих клітин на дію фізико-хімічних чинників, що реалізуються в процесі
кріоконсервування. Вже на попередньому етапі оцінки в системі in vitro
було показано чіткі відмінності відповіді клітин КМ здорових тварин і з
АІЗ на дію окремих чинників кріоконсервування (рН, осмолярність),
причому в залежності від виду патології (АА і ЕАЕ). Так, оцінка
кількості АК після експозиції КМ в розчинах з різними рН і осмолярністю
свідчить про збільшення адгезивного потенціалу мієлокаріоцитів здорових
тварин і з ЕАЕ в порівнянні з такою при рН 7,2 і осмолярністю 300
мОсм/кг, тоді як при АА цей показник знижувався (рис. 2). Дані зміни
можуть бути слідством модифікації конформаційної організації мембрани
мієлокаріоцитів з експансією „прихованих” рецепторів у випадку ЕАЕ і зі
„сходженням” (shedding) структур глікокаліксу при АА. Виходячи із даного
тесту, для клітин КМ здорових тварин і з АІЗ у більшій мірі стресорними
є гіперосмолярні середовища.

У середовищах з різним рН клітини КМ контрольної групи і з ЕАЕ найбільш
чутливі до кислих значень рН, а з АА – до лужних. Отже, розвиток
патології сприяє створенню умов специфічного сприйняття мієлокаріоцитами
фізико-хімічних чинників кріоконсервування, які можуть виявляти свою
активність як ізольовано, так і діяти комплексно.

Рис.2. Вміст адгезуючих клітин у суспензії клітин КМ здорових тварин
(контроль) і з АІЗ після експозиції в середовищах з різним рН (а) та
осмолярністю (б)

Дослідження впливу типу і концентрації кріопротекторів на
життєздатність, адгезивні і фагоцитарні властивості мієлокаріоцитів
здорових тварин і з АІЗ за допомогою інтегрального показника сумарного
ступеня відхилення (ССВ) продемонстрували перевагу 5, 7 і 10%-го ДМСО в
порівнянні з гліцерином в аналогічних концентраціях (табл. 1). Причому в
цьому випадку в меншій мірі модифікуються морфофункціональні
характеристики КМ тварин з АА, ніж з ЕАЕ.

Ефективність аутотрансплантації кріоконсервованого КМ визначається мірою
збереження різних його клітинних популяцій, але перш за все стовбурових
кровотворних клітин. Порівняльна оцінка їх життєздатності показала, що
після кріоконсервування КМ здорових тварин зі швидкістю охолодження
1?С/хв (режим 1) колонієутворююча активність КУО-ГМ підвищувалася та
досягала максимального рівня (92,02±3,68 від контролю) при 10%-й
концентрації ДМСО (табл. 2).

На відміну від КМ здорових тварин збереження КУО-ГМ і ІПА КМ тварин з АА
і ЕАЕ у режимі 1 залишалися на рівні показників до кріоконсервування
тільки при використанні 7%-го ДМСО. Дві інші концентрації ДМСО були менш
ефективні. Однак враховуючи ІПА, кріоконсервування КМ тварин з АІЗ
забезпечувало збереження КУО-ГМ з більшим проліферативним потенціалом
(формуючі колонії).

Збільшення швидкості заморожування до 10°С/хв (режим 2) супроводжувалось
зниженням збереження КУО-ГМ КМ здорових тварин при використанні всіх
концентрацій ДМСО в порівнянні з режимом 1 (табл. 2.). Проте і в цьому
випадку 10%-й ДМСО забезпечував максимальне збереження КУО-ГМ
(64±3,21%), а ІПА був в 1,3 рази вище, ніж в контролі, що свідчило про
перевагу кровотворних попередників з колонієутворюючою функцією.

Таблиця 1

ССВ показників КМ здорових тварин (контроль) і з АІЗ після експозиції в
розчинах з різною концентрацією кріопротекторів

Група ССВ показників Концентрація ДМСО, %

Концентрація гліцерину, %

5

7

10

15

5

7

10

15

Контроль Цілість, умов.од.

0,06

0,07

0,02

0,18

0,26

0,20

0,21

0,17

АК, умов.од.

0,82

0,74

0,95

1,80

2,08

1,59

1,24

0,82

АПФАМ, умов.од.

0,44

0,25

0,02

0,67

0,61

0,64

0,66

0,52

?ССВ, умов.од.

1,32

1,06

0,99

2,65

2,95

2,43

2,11

1,51

АА Цілість, умов.од.

0,12

0,03

0,01

0,09

0,18

0,13

0,12

0,17

АК, умов.од.

0,33

0,07

0,11

0,56

0,77

0,44

0,38

0,25

АПФАМ, умов.од.

0,82

0,29

0,21

0,33

0,43

0,41

0,77

0,81

?ССВ, умов.од.

1,27

0,39

0,33

0,98

1,38

0,98

1,27

1,23

ЕАЕ Цілість, умов.од.

0,04

0,01

0,04

0,13

0,19

0,17

0,12

0,13

АК, умов.од.

2,23

0,96

0,74

3,55

3,81

2,96

2,76

1,83

АПФАМ, умов.од.

4,22

2,52

2,2,97

3,13

4,11

4,98

4,93

6,38

?ССВ, умов.од.

6,49

3,49

3,75

6,81

8,11

8,11

7,81

8,34

Залежність вмісту КУО-ГМ КМ тварин з АА від концентрації кріопротектора
після заморожування в режимі 2 практично повторювала таку ж залежність
при режимі 1. Судячи по ІПА, на відміну від КМ здорових тварин
підвищення швидкості заморожування явно інгібіювало функціональний
потенціал клітин-попередників, що формують колонії, причому при
збільшенні концентрації протектора в більшій мірі.

Після кріоконсервування КМ тварин з ЕАЕ (режим 2) зниження вмісту КУО-ГМ
складало 38-46%, а в КМ тварин з АА – 29-32,8% в порівнянні з початковим
рівнем життєздатності кровотворних попередників нативних
мієлокаріоцитів. Слід зазначити, що при використанні 7%-ї концентрації
ДМСО серед кровотворних попередників, які підлягали зберіганню,
переважали колонієутворюючі попередники, в той час як в КМ тварин з АА –
кластероутворюючі.

Максимальна кількість кровотворних попередників у кріоконсервованому зі
швидкістю 40°С/хв (режим 3) КМ здорових тварин зберігалася при
використанні не 10%, а 7%-го ДМСО (табл. 2). Цей показник практично був
ідентичним отриманому при використанні цієї ж концентрації ДМСО в режимі
1. Однак, незважаючи на те, що він був кращим при режимі 2 (64,00±3,21%,
р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020