КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

ОСТРОВСЬКА Галина Віталіївна

УДК 577.352.2’335 +577.171.54

Первинні механізми мембраномодулюючої дії біорегуляторів природного і
синтетичного походження

03.00.02 – біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Київському національному університеті імені Тараса
Шевченка

Науковий консультант:

доктор біологічних наук, професор

Рибальченко Володимир Корнійович,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач
відділом цитофізіології біологічного факультету

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор

Зима Валентин Леонідович,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

професор кафедри біофізики

доктор біологічних наук, професор

Говорун Дмитро Миколайович,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

завідувач відділом молекулярної біофізики

доктор біологічних наук, професор

Великий Микола Миколайович,

Національний медичний університет імені О.О.Богомольця МОЗ України,

професор кафедри біоорганічної, біологічної та фармацевтичної хімії

Провідна установа: Львівський національний університет ім. Івана Франка
Міністерства освіти і науки України

Захист відбудеться «16» лютого 2005 року о 14-00 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Київського національного
університету імені Тараса Шевченка (Київ, пр. акад. Глушкова, 2,
біологічний факультет, ауд. 215)

Поштова адреса: 01033, Київ – 33 , вул. Володимирська, 64

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного
університету імені Тараса Шевченка (01033, Київ – 33, вул.
Володимирська, 58)

Автореферат розісланий «13»січня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 26.001.3 Цимбалюк О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Біологічно активні речовини (БАР), в тому числі й
лікувальні препарати, здійснюють свої ефекти через взаємодію з
специфічними мембранними рецепторами, які мають білкову природу,
внаслідок чого енергія хімічного сигналу трансформується в біологічні
ефекти. Для кожної такої події клітини мають широку різноманітність
вторинних месенджерів [Кухарь и др., 1992; Авдонин, Ткачук, 1994;
Геннис, 2001]. Проте, останніми роками встановлена здатність
біорегуляторів змінювати функціональну активність клітин завдяки
механізмам, які не включають пряме зв’язування регуляторних молекул з
білковими рецепторами [Рыбальченко, 1990; Мураневич, 1993;
Островська,1995; Bechinger,1997; Бурлакова и др.,2003]. Як правило,
відповіді на такі взаємодії трактуються як побічні ефекти індивідуальних
препаратів, і можуть бути причиною шкідливих, несприятливих і токсичних
впливів на клітинні процеси. Особливості безрецепторних взаємодій
залежать від фізико-хімічної природи діючих речовин і їх здатності в
більшій чи меншій мірі проникати в мембрану і проходити через неї, з
одного боку, і від властивостей мембранних ліпідів, з іншого [Могилевич,
1995; Островська, 1995; Przestalski et al., 2000]. БАР здатні
ініціювати біологічну відповідь, впливаючи безпосередньо на
функціональну структуру мембранних фосфоліпідів, обминаючи, таким чином,
специфічні рецептори. Ці ефекти є залежними від дози і часу і, окрім
фізологічних змін у функціях клітини, низка БАР може ініціювати індукцію
фосфоліпідозу і неспецифічні токсичні ефекти. У зв’язку з цим
необхідність детальних експериментальних досліджень, які б забезпечили
повне розуміння первинних механізмів взаємодій між БАР і мембранними
структурами клітин, не викликають сумнівів. Останнім часом в світових
дослідженнях значна увага приділяється в основному мембрано-активним
властивостям пептидів антимікробної дії і пептидам, токсичним по
відношенню до клітин ссавців [Matsuzaki et al.,1991-1999; Epand,
Vogel,1999; Huang,2000; Hancock,2001; Hof et al.,2001; Lohner,2001;
Yeaman, Yount, 2003]. Безрецепторні ефекти регуляторних пептидів (РП)
досі залишаються поза належною увагою дослідників. Проте, з’являється
все більше даних про поліфункціональність РП, яку не можна пояснити
тільки гетерогенністю рецепторів [Громов, 1992; Бурлакова и др., 2003;
Mayers,Couillard, 1990; Geffner et al., 1995; Young, 1999; Tirelli et
al., 2001; Somai et al., 2002; Guha et al., 2003; Xin-Hua et al., 2003].
Важливим при цьому є те, що широкий спектр ефектів проявляється й у
впливі більшості пептидів на процеси проліферації клітин,
психоневрологічний стан і поведінку людини та тварин [Громов, 1992;
Папсуевич и др., 1986; Berod, Rostene,2003; Geffner et al.,1995; Guha et
al., 2003; Rozengurt, Walsh, 2001; Somai et al., 2002; Young, 1999], що
може привести до виникнення непередбачених наслідків при їх застосуванні
в лікувальній практиці. Це вимагає більш детального дослідження
механізмів взаємодії БАР з клітинними мембранами. Знання первинних
механізмів мембранотропної дії сприятиме пошуку і розробці нових, більш
ефективних і селективних препаратів, в тому числі й таких, що не
руйнуються ендогенними ферментами, проте мають певну специфічність до
того чи іншого типу мембран.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана
в рамках державних наукових програм: “Розробка підходів до використання
оптимальних концентрацій і комбінацій лікувальних засобів пептидної
природи та рекомендацій щодо направленого синтезу пептидних
біорегуляторів” – тема Держкомітету України з науки і техніки (завдання
№ 1.02.01/148-93 комплексного проекту № 08.04.04/002К-95; “Встановлення
механізмів зв’язування енкефалінів, їх синтезованого аналога, ригіну і
тафцину з мембранами різного ступеня організації”, № держреєстрації
0194U017666; “Первинні механізми взаємодії лікувальних засобів пептидної
природи синтетичного та природного походження з плазматичною мембраною
клітини”, № 0193U004319; “Mембранотропна активність суфану”, №
0197U016241; “Дослідження первинних механізмів зв`язування пептидних
гормонів з мембранами різного ступеня організації”, № 0197U003105;
“Дослідження первинних процесів цитофізіологічних ефектів пестицидів як
шкідливих факторів довкілля”, № 0102U001161; “Клінічне і
експериментальне обгрунтування ефектів деяких біологічно-активних
речовин”, № 0199U003850.

Мета і завдання дослідження. Метою дослідження є встановлення активної
ролі ліпідного матриксу в реалізації ефектів біорегуляторів, здатності
регуляторних речовин природного і синтетичного походження взаємодіяти з
ліпідним матриксом мембран без залучення специфічних білкових
рецепторних структур, визначення кількісних параметрів інсерції
біологічно активних молекул у різні типи ліпідних мембран, а також
встановлення залежності між фізико-хімічними характеристиками
біорегуляторів і ліпідного матриксу мембран та особливостями їх
взаємодії.

Для досягнення зазначеної мети були визначені наступні завдання:

провести порівняльний аналіз особливостей амінокислотного складу
пептидних біорегуляторів з встановленими мембранотропними властивостями
і речовин, для яких прогнозовано мембранотропну активність;

визначити поверхневу активність біорегуляторів різної хімічної природи і
з різною біологічною дією;

встановити їх мембранотропність по відношенню до модельних ліпідних і
ліпопротеїнових мембран різного хімічного складу і різного фізичного
стану;

визначити параметри мембрано-активної дії біорегуляторів по відношенню
до різних модельних мембран – концентраційну залежність інтенсивності
змін параметрів мембран (поверхневого тиску і граничного стрибка
потенціалу), характер взаємодії (адсорбція в зоні полярних головок або
інсерція в гідрофобну зону), мінімальну ефективну концентрацію,
коефіцієнт адсорбції Гіббса, питому молекулярну площу адсорбованої
речовини в мембрані;

дослідити роль оптичної ізомерії БАР, іонного складу та іонної сили
субфази на активність пептид-мембранної взаємодії;

провести порівняльний аналіз мембранотропних властивостей досліджених
регуляторних пептидів з БАР антимікробної і цитотоксичної дії;

провести дослідження мембранотропних властивостей речовин екзогенного
походження (агрохімікати, фітопрепарати) з метою розробки тест-методу
при прогонозуванні їх біологічної активності.

Об’єкт дослідження – механізми безрецепторної взаємодії біорегуляторів
природного і синтетичного походження з мембранами.

Предмет дослідження – мембранотропні ефекти регуляторних пептидів, їх
синтетичних аналогів, речовин-похідних амінокислот, агрохімікатів,
фітопрепаратів.

Методи дослідження – біофізичні (метод моделювання і вимірювання
характеристик моношарових мембран Ленгмюра-Вільгельмі, метод вібруючого
електроду, вимірювання електричних характеристик бішарових ліпідних
мембран), біохімічні (виділення, очистка і дослідження ферментативних
властивостей фракцій плазматичних мембран, виділення фосфоліпідів для
формування модельних мембран).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлені і
охарактеризовані параметри безрецепторної взаємодії ендогенних
регуляторних пептидів з ліпідним матриксом мембран. Отримані
експериментальні підтвердження гіпотези безрецепторної взаємодії
пептидних біорегуляторів з ліпідним матриксом мембрани, запропонованої
раніше [Рыбальченко, 1990; Островська, 1995]. Проаналізована роль
ліпідного матриксу мембран в реалізації первинних механізмів взаємодії
біорегуляторів з клітиною-мішенню. Показано, що важливим чинником
взаємодії регуляторних пептидів з мембранними ліпідами є особливості
параметрів гідрофобності їх молекул, зокрема гідрофільно-гідрофобний
баланс, в залежності від чого змінюється характер і інтенсивність
пептид-мембранної взаємодії. Проведено докладний аналіз особливостей
амінокислотного складу ендогенних регуляторних пептидів і виявлені
відмінності в їх амінокислотному спектрі, зокрема в групі гідрофобних
амінокислот, що може лежати в основі різної біологічної дії цих
біорегуляторів і пептидів з цитотоксичною дією. Встановлено значення
оптичної ізомерії при безрецепторній взаємодії біорегуляторів з ліпідним
матриксом мембран. Продемонстровано універсальність механізму
безрецепторної ліганд-мембранної взаємодії для біорегуляторів різного
хімічного складу і походження.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати розширюють
уявлення про молекулярні механізми, що лежать в основі принципу
здійснення функцій біологічних мембран типу сигнальної трансдукції і
міжклітинної сигналізації, є внеском в розуміння причин побічних ефектів
біорегуляторів, фазності концентраційної залежності їх біологічних
ефектів. Результати є важливими для формування теоретичних основ для
розробки методів цілеспрямованого створення нових біорегуляторів і
лікувальних препаратів направленої дії. Отримані результати впроваджені
в навчальний процес біологічного факультету в спецкурси “Міжклітинні
взаємодії”, “Рецептори мембран”, “Цитологічні ефекти фармпрепаратів”
Київського національного університету імені Тараса Шевченка та на
кафедрі медичної біології в Медичному інституті Української асоціації
народної медицини і включені в монографію “Тканевые пептиды” (2003) та
навчальні посібники “Физиология и биохимия пищеварения человека и
животных” (2002), “Медична біологія. Практикум” (2003). Метод первинного
прогнозування біологічної активності фітопрепаратів шляхом визначення
параметрів їх мембранотропної активності зареєстровано як нововведення
Міністерством охорони здоров’я України (реєстраційний № 249/19/03).

Особистий внесок здобувача полягає у плануванні і виконанні переважного
обсягу експериментальної частини дисертації, статистичній обробці
результатів, підборі і опрацюванні даних літератури, в аналізі і
інтерпретації отриманих результатів. Загальне планування роботи і
обговорення результатів проводилось за участю наукового консультанта
проф. Рибальченка В.К. Експерименти по дослідженню мембранотропних
властивостей суфану виконувались сумісно з асп.Харчук І.В., визначення
ферементативних активностей плазматичних мембран – з асп.Яблонською С.В.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що включені до
дисертації, були представлені на: VII Українському біохімічному з’їзді
(Київ,1997); XV з’їзді Українського фізіологічного товариства (Київ,
1998), ІІ і ІІІ з’їздах Українського біофізичного товариства
(Харків,1998, Львів,2002), XVI Менделеєвському з’їзді з загальної і
прикладної хімії (С.-Петербург, 1998), IV, V і IX Міжнародних
науково-практичних конференціях “Інформотерапія: теоретичні аспекти і
практичне застосування” (Київ, 1998, 1999, 2003), Всеросійській науковій
конференції з міжнародною участю, присвяченій 150-річчю від дня
народження І.П.Павлова (С.-Петербург, 1999), V з’їзді фармацевтів
України (Харків, 1999), І Установчому з’їзді з нейрофізіології (Київ,
2000), ІІІ Національному Конгресі геронтологів і геріатрів України
(Київ, 2000), І і ІІ з’їздах токсикологів України (Київ, 2001, 2004),
Всеукраїнській науковій конференції “Актуальні проблеми
гастроентерології” (Київ,2001), ІІ і ІІІ Львівсько-Люблінських
конференціях з експериментальної та клінічної біохімії
(Люблін,Польща,2002, Львів,2004), ІІ Конгресі гепатологів України
(Київ,2002), Міжнародній науково-практичній конференції студентів,
аспірантів та молодих вчених “Шевченківська весна” (Київ,2004),
Міжнародній науковій конференції “Клітинні і субклітинні механізми
функціонування травної системи”, приуроченої до 80-річчя з дня народж.
проф.І.В.Шостаковської (Львів, 2004).

Публікації. Основні положення дисертаційної роботи висвітлені у 47
публікаціях, у тому числі 3 монографіях, 18 статтях, які опубліковані у
наукових фахових виданнях, 1 галузевому нововведенні (Міністерство
охорони здоров’я України) та у 25 тезах доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Робота викладена на 280 сторінках
основного тексту, який включає вступ, огляд літератури, матеріали і
методи, 6 підрозділів власних досліджень, обговорення отриманих
результатів, висновки. Робота ілюстрована 19 таблицями та 79 рисунками.
Список використаних джерел включає 532 найменування.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

В роботі досліджувались пептиди: 4 ізомери кіоторфіну, меланостатин
(Ін-т біоорганічної хімії і нафтохімії НАН України); Мет- і
Лей-енкефаліни і їх синтетичний аналог Љ-77, пентагастрин (Експ.завод
Ін-ту органічного синтезу АН Латвії, м.Рига); тироліберин і нейротензин
(НВО “Вектор”, м.Новосибірськ, Росія); біорегулятори непептидної
природи: гамма-аміномасляна кислота (“Reanal”, Угорщина), 2 форми
нестероїдного кардіотонічного прапарату суфан – L-cуфан і D,L-суфан (НДІ
ендокринології і хімії гормонів, м. Харків, Україна), настоянка
“Поліфітол-1” (розробка Медичного інституту УАНМ, м.Київ, виробник – ЗАТ
“Ліктрави”, м.Житомир, Україна); спиртові настоянки індивідуальних
лікарських рослин (Українська фармацевтична академія, м.Харків,
Україна), 2,4-дихлорфеноксиоцтова кислота (“Sigma”, CША), N-оксид
2,6-диметилпіридину (івін) (Ін-т біоорганічної хімії і нафтохімії НАН
України). Для формування модельних мембран використовували азолектин,
холестерол (“Serva”, Німеччина), фосфатидил-серин, фосфатидилхолін
(завод бактеріальних препаратів, м.Харків, Україна), сироватковий
альбумін (“Reanal”, Угорщина), сумарну фракцію фосфоліпідів мозку
великої рогатої худоби, фракції плазматичних мембран печінки щурів і
міоцитів кишечника кроля.

Розрахунки параметрів гідрофобності пептидів проводились за критеріями,
запропонованими Ch.Tanford і описаними в [Кантор, Шиммел, 1984]: (1) –
шкала середньої гідрофобності пептиду: Н?=??Giпер?i , де ?Giпер —
вільна енергія переносу амінокислотного залишку і-го типу між полярним і
неполярним середовищем; а ?i — мольна доля останнього; (2) –
співвідношення полярних і неполярних залишків в молекулі пептиду: R=??k
/??i, де k відповідає полярним, а і – неполярним групам; (3) –
дискримінантна функція Z, яка об’єднує два попередні параметри, Z =
–0,345R + 0,60 Н?.

Вимірювання параметрів поверхневої і мембранотропної активності речовин
проводили на базі методів Ленгмюра-Вільгельмі в модифікації Гевода В.С.
і Ксенжека О.С. [Ксенжек, Гевод,1983, Гевод, 1990]. Електрична схема
установки для вимірювання характеристик моношарів складається з двох
функціональних блоків: (1) – реєстрації поверхневого тиску (р) і (2) –
реєстрації граничного стрибка потенціалу (ГСП). Поверхневий тиск
вимірювали за методом Вільгельмі за допомогою напівзануреної платинової
пластинки, яка з’єднана перехідником з рухомим катодом механотронного
перетворювача ХМ-6. Чутливість вимірювання – 0,1 мН/м. ГСП, що виникає
поверхні розподілу фаз, вимірювали за методом динамічного конденсатора
[Богуславский, 1978]. Золота пластинка ?1 см (один з вимірювальних
електродів), вібрує у повітрі безпосередньо над поверхнею розподілу фаз
з постійною частотою 1480 Гц. Другий електрод (хлор-срібний) введений в
субфазу. Чутливість вимірювання – 2 мВ. Реєстрація обох параметрів
проводиться одночасно. За нульове значення приймаються параметри вільної
поверхні розподілу фаз електроліт-повітря.

Формування модельних ліпідних і ліпопротеїнових мономолекулярних
мембран. Ліпідні моношари формували нанесенням розчинів ліпідів в
хлороформі (1 мг/мл) на поверхню електроліту (звичайно: 0,01М KCl, 0,01
М Трис-НСl, рН 7,4) в тефлоновій кюветі (130х200х5 мм) до досягнення
необхідної величини поверхневого тиску. При формуванні ліпротеїнових
модельних мембран, використовували суміші складу (у % за ваговим
співвідношенням): (1) – азолектин – 60; холестерол – 10, сироватковий
альбумін людини – 30; (2) – азолектин – 40, холестерол – 10,
сироватковий альбумін людини – 50. Перший тип модельних мембран
наближався до показників міоцитів кишечника кроля, другий – відповідав
плазматичним мембранам кардіоміоцитів (за [Ивков, Берестовский, 1982;
Fidelio e.a. 1992]). Відповідність фізичних властивостей цих моделей і
природних мембран перевіряли порівнюванням їх ізотерм стискування.

, де Г – коефіцієнт адсорбції Гіббса, N — число Авогадро, 1018 —
коефіцієнт переводу м2 у нм2. Мінімальну діючу концентрацію БАР при
взаємодії з мембранами (Cмін) розраховували при апроксимації графіку Др
= f (Дln C) – в точці перетину функції з віссю абсцис (Др=0). При
двофазності процесу за цим же графіком, в точці перегину лінійної
функції визначали концентрацію переходу процесу до другої фази (Cпер).

, де Сі – молярна концентрація іонів і-го типу з зарядом zi. При
дослідженні впливу ступінчастого нарощування І субфази на параметри
сформованих мембран і процеси у них, концентрований розчин необхідної
кількості солі, вводили в резервуар насосу Бернулі. Наступну порцію солі
вводили після досягнення стабільних показників на межі розподілу фаз.

Формування бішарових ліпідних мембран (БЛМ) проводили за [Muller e.a.,
1963, Омельченко, 1990] на отворі ?0,8 мм у тефлоновій скляночці, що
знаходилась у кварцевій кюветі об’ємом 19 мл, з розчинів сумарної
фракції фосфоліпідів мозку великої рогатої худоби у n-декані (30 мг/мл).
Різницю потенціалів подавали на мембрану за допомогою низькочастотного
генератора Г6-15, який давав змогу одержувати постійну напругу або
напругу, що лінійно змінюється зі швидкістю 2 мВ/с. Струм крізь мембрану
вимірювали в умовах фіксації потенціалу за допомогою швидкодіючого
операційного підсилювача, який дає змогу реєструвати струм до 0,1 пА, і
реєстрували за допомогою двокоординатного самозаписувача Н-307/1.
Вимірюючи величину стаціонарного струму (І) крізь мембрану при постійній
різниці потенціалів (U), можна розрахувати опір мембрани: R = U/І або її
провідність: G = 1/R. Ємність БЛМ вимірювали за методом нестаціонарних
циклічних вольт-амперних характеристик (ВАХ) і розраховували за
рівнянням: , де Іс – ємнісний струм, – швидкість розгортки. Досліди
проводили при кімнатній температурі і постійному перемішуванні розчинів
електроліту в обох компартментах.

Виділення фракцій плазматичних мембран (ПМ) . ПМ міоцитів тонкого
кишечника кроля виділяли за [Погребной, 1986; Рыбальченко, 1988,
Слинченко и др., 1990]. Очищену і подрібнену м’язеву тканину тонкого
кишечника гомогенізували за допомогою гомогенізатора “Політрон” у 4
об’ємах буфера (20 мМ гістидин, 1 мМ ЕДТА, 0,2% NaN3, 1 мМ
меркаптоетанол, 125 мМ КС1, 0,1 мМ фенілметансульфонілфторид, 12,7 мМ
NaHCO3, рН 7,2) Центрифугували 10 хв при 3000g, надосадову рідину
нашаровували по 20 мл на градієнт щільності сахарози (6 мл 30%-ї та 5 мл
15-%-ї сахарози у середовищі гомогенізації без NaHCO3, але з 0,7 М КС1 і
2 мМ ЕГТА). Центрифугували 1 год при 105000 g. Збирали шар ПМ, розводили
суспензію середовищем гомогенізації (без КС1, NaHCO3 та ЕГТА) та
центрифугували 1 год при 105000 g. Осад ПМ суспензували у 1-2 мл
середовища складу: 130 мМ КС1, 20 мМ НЕРЕS, рН 7,4, 0,5 мМ MgCl2, 0,05
мМ СаCl2 та 2 мМ дитіотрейтолу.

ПМ гепатоцитів печінки щурів виділяли, базуючись на методі [Song et al.,
1969]. Промиту в 0,9% NaCl і подрібнену печінку гомогенізували в
скляному гомогенізаторі Даунса зі слабко притертим тефлоновим поршнем у
2 об’ємах буферу А (1мМ NаНСО3, 1мМ ЕДТА-Nа, рН 7,5) на холоді. До
гомогенату додавали 7 об’ємів буферу А, відфільтровували через 4 шари
марлі. Центрифугували при 1500g 10хв. До осаду додавали буфер А до
кінцевого об’єму (мл), що відповідає вихідній вазі сирої печінки (г),
потім – 5,5 об’ємів сахарози щільністю 1,26. В центрифужні пробірки
об’ємом 35 мл вносили 14 мл суспензії, на неї нашаровували 9 мл сахарози
щільністю 1,18 і 10 мл сахарози щільністю 1,16. Центрифугували 60 хв при
66 000g, t 2-4?С. Збирали фракцію ПМ між двома верхніми шарами сахарози,
двічі відмивали центрифугуванням (1500g 10 хв) у 4 об’ємах буферу А.
Кінцевий осад ресуспендували в 1 мл буферу. Чистоту фракцій ПМ
контролювали за активністю маркерних ферментів. Вміст білку в препараті
визначали за [Lowry et al., 1951].

Фосфоліпіди з мозку великої рогатої худоби виділяли для формування БЛМ.
Білу речовину головного мозку гомогенізували в 17 об’ємах суміші А
(хлороформ/етанол, 2:1). Гомогенат фільтрували через паперовий фільтр,
об’єм доводили до початкового і додавали 0,2 об’єми 0,9% NaСl.
Перемішували, центрифугували 20 хв при 1000 g для розподілу фаз. Верхню
фазу видаляли, нижню зливали в циліндр для більш повного розподілу і
видалення верхньої фази. Через 12 год, після відокремлення верхньої
фази, поверхню нижньої фази ретельно промивали сумішшю В
(хлороформ:етанол:58%NaCl=3:48:47 об.), випарювали до необхідної
концентрації при 60 0C.

Визначення АТФ-азних активностей ПМ. Активність високоафінної
Мg2+,Са2+-АТФази ПМ гепатоцитів визначали за різницею між АТФазними
активностями у середовищі (50 мМ Трис-НСl, 30 мкМ ЕГТА, 70 мкМ KCl, рН
7,5) з додаванням 1 мкМ СаСl2 і без нього. Вміст ПМ становив 20 мкг
білка на 0,5 мл середовища інкубації (за [Lotersztain,1981]). Реакцію
ініціювали додаванням 3 мМ АТФ, рН 7,4, інкубували 10 хв при 37єС,
зупиняли додаванням холодної ТХО (до 10%). Низькоафінну
Mg2+,Ca2+-АТФазну активність визначали в аналогічних умовах, але при
відсутності ЕГТА у інкубаційному середовищі та додаванні 300 мкМ СаСl2
для активації ферменту. Кількість продукту реакції (неорганічного
фосфату, нмоль Рн/(хв?мг білка)), визначали за [Rathbun, Betlach, 1969]
фотометрично при 660 нм.

Експериментальні дані обробляли методами варіаційної статистики.
Розраховували значення середніх арифметичних величин (М), середнє
квадратичне відхилення (?) і помилку середньогої (±m). Достовірність
різниці рядів експериментальних даних з нормальним розподілом значень
оцінювалась за t-тестом з урахуванням нерівності дисперсії.
Взаємозв’язок між ознаками оцінювали за коефіцієнтом кореляції Пірсона
r. Обробку даних проводили з використанням програм статистичного пакету
аналізу Microsoft Excel.

Результати досліджень та їх обговорення

Порівняльний аналіз амінокислотного складу досліджених мембраноактивних
регуляторних пептидів і пептидів з цитотоксичними і антибактеріальними
властивостями. Останніми роками активно досліджуються механізми
мембранолітичної дії антибактеріальних пептидів (АБП), близьких до них
за механізмами дії вірусних „пептидів злиття” і цитотоксичних пептидів з
отрут деяких членистоногих. Багато з цих пептидів в ліпідному оточенні
формують б-спіральну структуру з різною орієнтацією, мають
каналоформуючу здатність [Matsuzaki et al., 1991-1999]. При цьому
більшість з АБП діють переважно на клітини прокаріотів, майже не
впливаючи на мембрани клітини-хазяїна, що пов’язують з особливостями
біохімічного складу мембран (відносна ліпідна асиметрія з переважанням
кислих ліпідів в зовнішньому моношарі мембран прокаріотів і у
цитоплазматичному – в ПМ еукаріотичних клітин) і особливостями самих
пептидів (АБП мають високий вміст позитивно заряджених амінокислотних
залишків, що забезбечує ефективну електростатичну взаємодію з аніонними
бактеріальними мембранами, і характеризуються високою загальною
гідрофобністю, завдяки якій проникають в зону ацильних ланцюгів
ліпідного бішару).

Нами раніше були встановлені безрецепторні пептид-мембранні взаємодії
для нейрогіпофізарних гормонів і їх аналогів і показано значення
особливостей їх амінокислотного складу для реалізації прямих
пептид-мембранних взаємодій і їх інтенсивності [Островська, 1995]. Ми
припустили, що такі особливості можуть лежати в основі первинних
механізмів пептид-мембранної взаємодії і для інших ендогенних пептидів з
регуляторною дією на тваринні клітини. Виходячи з наших попередніх
досліджень і з даних по АБП і цитотоксичним пептидам [Yeaman, Yount,
2003] важливу роль повинні відігравати як гідрофобність молекул, так і
відносна кількість полярних залишків у них.

Проаналізовано вміст амінокислотних залишків (АКЗ) для послідовностей 14
РП, для яких нами встановлена мембранотропна активність (кіоторфіну,
меланостатину, тироліберину, пентагастрину, Мет- і Лей-енкефалінів, їх
аналога Љ-77, нейротензину, вазопресину, окситоцину і
дезаміноокситоцину, субстанції Р, ангіотензину І і брадикініну), у
порівнянні з амінокислотним спектром АБП (проаналізовна група з 498
пептидів з середньою довжиною 27,82 АКЗ з бази даних The Antimicrobial
Peptide Database) і загальним поширенням певних АКЗ в білках еукаріотів
цілому (за [Gilis et al., 2001]).

В амінокислотному складі мембраноактивних РП виявлено низку особливостей
(рис.1). По-перше, РП, як і мембраноактивні антибактеріальні пептиди,
містять більше гідрофобних та менше гідрофільних АКЗ порівняно з вмістом
відповідних АКЗ у білках еукаріотів (в білках гідрофобних АКЗ в
середньому 45%, тоді як в АБП їх вміст зростає до 50,8%, а в РП – до
58,5%). По-друге, спектр гідрофобних АКЗ в АБП і в РП є протилежним за
вмістом більшості залишків. По-третє, РП і АБП характеризуються
збільшеним вмістом Gly i позитивно зарядженого Arg, але вміст позитивно
зарядженого Lys, який вважається істотним для взаємодії з аніонними
ліпідами бактеріальних мембран, у складі РП знижений не тільки порівняно
з АБП, але й з білками взагалі. Гідрофільний залишок Gly належить до
найбільш розповсюджених як в АБП, так і в ендогенних РП (рис.1), він
присутній в більшості досліджених нами РП і, очевидно, має важливе
значення для ефективної взаємодії з мембранами.

Рис.1. Поширеність АКЗ в еукаріотичних білках, антибактеріальних
пептидах і досліджених мембрано-активних РП. АКЗ розташовані за
зростанням гідрофобності [Carugo, 2003].

На нашу думку, саме такі особливості спектру гідрофобних АКЗ
забезпечують різну поведінку пептидів двох функціональних груп в
ліпідному матриксі мембрани – схильність до формування б-спіралей і в-
структур при утворенні пептидних комплексів для АБП і формування інших,
унікальних конформацій для кожного з РП. Додатковий аналіз
амінокислотного спектру цих двох груп пептидів підтверджує це
припущення. На рис.2 представлено розподіл амінокислотного спектру
досліджених РП за схільністю до формування б- і в-структур відповідно
(значення параметрів Рб і Рв – наведені за [Кантор, Шиммел,1984]).
Позначення Ві відповідають залишкам, які активно заважають формуванню
відповідної структури, bi – скоріш за все заважають, ii, Ii –
індиферентні для формування даної структури, hi – схильні до формування
даної структури, Hi – активно сприяють її формуванню.

Рис. 2. Розподіл амінокислотного спектру досліджених регуляторних
пептидів за зростанням параметру Рб — схільністю до формування
б-спіралей (А) і параметру Рв — схільністю до формування в-структур (Б)
(пояснення – у тексті).

В складі досліджених РП переважають АКЗ, які перешкоджають або не
сприяють формуванню б-структур. В першу чергу, це залишки Gly, Pro i
Tyr, які найбільш широко представлені в регуляторних пептидах. Відносний
вміст АКЗ, які сприяють формуванню в-структур є більшим, що робить
формування таких структур більш ймовірним, але високий вміст залишків
Pro і Gly в РП, очевидно, часто не сприятиме формуванню і цих структур
також. В той же час, в антибактеріальних пептидах розподіл АКЗ з різною
схильністю до формування б-спіралей є більш рівномірним – в них
зменшується вміст АКЗ, що перешкоджають їх формуванню (в основному за
рахунок залишків Pro i Tyr) і, навпаки, зростає поширеність залишків,
які не заважають (Lys,Ile) або сприяють формуванню б-спіралей (Leu,
Ala). Саме за вмістом вказаних залишків і спостерігається різниця в
амінокислотному складі двох різних за функціями груп пептидів при їх
приблизно рівних параметрах гідрофобності.

Можна припускати, що якщо основним призначенням структури
(амінокислотного складу) антибактеріальних і цитотоксичних пептидних
молекул є утворення порових комплексів різної будови на основі
формування б-спіралей, а також в-структур, то для пептидів регуляторної
дії це буде формування специфічної, унікальної для кожного пептиду
конформації, що може сприяти його ефективній взаємодії з рецептором.

Розрахунки параметрів гідрофобності і теоретичне прогнозування
мембранотропної активності регуляторних пептидів. На основі наведених
даних зроблено припущення про важливу роль гідрофобності молекул
мембранотропних РП у забезпеченні їх здатності взаємодіяти з ліпідним
матриксом мембран. Для оцінки цієї ролі у прояві властивостей РП і
порівняння їх з мембраноактивними АБП і відомими внутрішньомембранними
білками ми застосували підхід, запропонований Ч.Тенфордом
[Nozaki,Tanford, 1971] і його послідовниками Barrantes [1975] і Raftery
et al. [1976]. За цим підходом розраховується загальна гідрофобність
молекули Нш за вільною енергією переносу її амінокислотних залишків між
полярним і неполярним оточенням (?Giпер), співвідношення полярних і
неполярних амінокислотних залишків в молекулі (показник R) і лінійна
дискримінантна функція Z, яка оптимально поєднує параметри Нш, і R для
чіткого розмежування білків з зовнішньою і внутрішньою локалізацією в
мембранах. За нашими даними, підхід дозволяє прогнозувати мембранотропні
властивості регуляторних пептидів і використаний нами також для оцінки
властивостей ряду інших ендогенних РП з потенційною мембранотропністю
(табл.1).

За параметрами гідрофобності (Нш і Z) мембранотропні РП перевищують
значення відповідних параметрів молекул внутрішньомембранних білків і
практично співпадають з параметрами АБП (рис.3). В групі пептидів з
можливою мембранотропністю Ці показники знижені, але близькі до
відповідних параметрів внутрімембранних білків.

Рис.3. Порівняння параметрів гідрофобності молекул білків і пептидів з
різними мембрано-тропними властивостями

НМБ – немембранні білки; ЗМБ – зовнішні мембранні білки; ВМБ –
внутрішні мембранні білки; АБП – антибактеріальні пептиди; Досл_РП –
досліджені мембраноактивні РП; Інші РП – регуляторні пептиди з
потенційними мембранотропними ефектами.

Проведені розрахунки свідчать не тільки про можливість теоретичного
визначення характеристик досліджених пептидів, але й дозволяють у
першому наближенні встановити ймовірне положення молекул РП у ліпідному
матриксі мембрани. Результати теоретичних розрахунків можуть бути
важливими для попереднього скринінгу потенційно активних РП та стати
підставою для проведення експериментальних досліджень взаємодії РП з
штучними та біологічними мембранами.

Таблиця 1

Параметри гідрофобності антибактеріальних і регуляторних пептидів з
встановленою і можливою мембранотропною активністю

Пептид Нш R Z

АБП 1,499±0,087 0,650±0,092 0,636±0,062

РП з встановленою нами мембранотропною активністю

Кіоторфін Tyr-Arg 1,8 1 0,735

Меланостатин Pro-Leu-Gly-NH2 1,67 0,5 0,655

Тироліберин Glu-His-Pro-NH2 1,52 2 0,222

Мет-ЕНК Tyr-Gly-Gly-Phe-Met 1,31 0,0 0,786

Лей-ЕНК Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu 1,53 0,0 0,918

Љ-77 Lys(TFA)-Tyr-D-Ala-Gly-Phe(NO2)-NH2-AcOH-2H2O 1,55 0,25 0,844

Пентагастрин Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 1,50 0,25 0,813

Нейротензин Glu-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu 1,749
1,6 0,497

Окситоцин H-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2 1,410 0,5 0,673

Вазопресин H-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2 1,193 0,8 0,448

Дезаміноокситоцин H-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly ?1,410 0,5
?0,673

Субстанція Р H-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2 1,477 1,2
0,472

Ангіотензин І Asp—Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-OH 1,926 1 0,811

Брадикінін Arg-Pro-Pro-Gly-Ser-Pro-Phe-Arg 1,499 1,7 0,313

M?m 1,539±0,052 0,843±0,169 0,634± 0,056

Інші РП з можливою мембранотропною активністю

Меланотропін, бомбезин, кальцитонін, глюкагон, АКТГ, інсулін,
?-ендорфін, кортиколіберин, M?m 1,181?0,053 1,158?0,131 0,410?0,082

Поверхнева і мембранотропна активність регуляторних пептидів.

Для низки регуляторних пептидів з різними структурними особливостями
досліджено поверхневу і мембранотропну активність. Всі досліджені
пептиди проявляють слабко виражену поверхневу активність, формуючи
локальні або розтягнуті адсорбційні моношари на поверхні розподілу фаз
електроліт–повітря. Проте всі вони в тій чи іншій мірі взаємодіють з
мембранними структурами з різними фізико-хімічними характеристиками,
впливаючи на їх властивості.

Мембранотропні властивості дипептиду кіоторфіну, вплив оптичної ізомерії
на особливості його взаємодії з мембраною. Кіоторфін (КТ) – опіоїдний
дипептид мозку (Н-Туг-Arg-OH), викликає анальгезивний ефект в 4 рази
більший, ніж HYPERLINK «000249c3.htm» мет-енкефалін , але зв’язується
з іншим видом рецептора, з двома типами афінності [Ueda et al.,
1989,2000]. Ми дослідили особливості мембранотропних властивостей КТ і
залежність їх прояву від вмісту L- і D-амінокислот в його ізомерах,
оскільки короткий дипептид є зручною моделлю для комбінування в ньому
АКЗ з різною оптичною ізомерією (D-D, D-L, L-D, L-L). Основна роль в
стереоселективності фармпрепаратів звичайно відводиться особливостям їх
взаємодії з білковими рецепторами [Алексеев, 1998], ферментами і
транспортуючими системами [Rentsch, 2002], різному розподілу в тканинах
[Zhou et al., 2002]. Практично не приділяється уваги такому фактору, як
механізми зв’язування цих ізомерів з мембранами клітин-мішеней, зокрема
ролі ліпідного матриксу в реалізації стереоселективності.

Молекула природного КТ має унікальну амфіфільну структуру – вона включає
високогідрофобний Tyr і полярний заряджений Arg. Проте, мінімальна
довжина КТ, очевидно, не може дозволити йому глибоко проникнути в
гідрофобний кор мембрани – полярний Arg, теоретично, повинен залишитися
в зоні ліпідних головок. При цьому загальні параметри гідрофобності КТ
досить високі – при рівному спввідношенні полярних і неполярних залишків
(R=1) його середня гідрофобність Н? (1,8 ккал/моль), перевищує
відповідний показник більшості інших мембраноактивних пептидів (табл.1),
а дискримінантна функція Z з урахуванням цих двох показників – 0,735.

Слабко виражену поверхневу активність виявляє лише дипептид типу L-L,
який формує розтягнуті моношари низької щільності (р=1,1 мН/м і ц=+574
мВ при концентрації дипептиду 10-5М). Інші ізомери в фізіологічних
концентраціях (10-11–10-5М) практично не утворюють власних адсорбційних
моношарів, хоча і концентруються у незначній кількості поблизу поверхні
розподілу фаз “розчин електроліту–повітря”, значно збільшуючи граничний
стрибок потенціалу (до +400 – +600 мВ ) при відсутності змін
поверхневого тиску в системі.

Наявність ліпідного моношару на межі розподілу фаз сприяє значній
інтенсифікації адсорбції дипептидів субфази і їх проникненню у моношар,
але мембранотропна активність кожного з ізомерів різна і залежить також
від початкової щільності мембрани. Найбільшою вона є при взаємодії
дипептидів з мембранами початкової щільності 4-6 мН/м. В цьому діапазоні
мембранотропна активність досліджених препаратів, достовірно
розподіляється у ряд L-L > D-L > L-D > DD (рис.4).

Рис. 4. Залежність зміни поверхневого тиску в азолектинових мембранах
від їх початкової щільності (р0) при взаємодії з ними оптичних ізомерів
кіоторфіну (КТ, 10-6М).

При ущільненні мембран вище 8 мН/м, енантіомери з D-амінокислотними
залишками практично повністю втрачають здатність взаємодіяти з
фосфоліпідними мембранами, тоді як ізомер L-L не тільки не втрачає, а
навіть продовжує збільшувати свою мембранотропну активність

Максимально модифікує азолектинові моношари ізомер із лівообертаючих
амінокислот L-L, підвищуючи тиск в щільно упакованих моношарах до 20-25
мН/м. На відміну від дипептидів D-L і L-D концентраційна залежність змін
поверхневого тиску азолектинових моношарів різної щільності
L-L-дипептидом має виражений сигмоподібний характер з максимальною
адсорбцією при концентраціях 5?10-9 – 5? 10-7 М (рис.5). Характер зміни
ГСП при цьому також відрізняється від інших оптичних ізомерів (рис.6).

Рис.5. Характер змін поверхневого тиску в азолектинових моношарових
мембранах з близькою початковою щільністю (ро= 4,7±0,2 мН/м) при
взаємодії з ними оптичних ізомерів кіоторфіну (КТ).

Рис.6. Характер концентраційної залежності зміни ГСП азолектинових
мембран з близькою початковою щільністю (ро= 4,7±0,2 мН/м, цо=175± 5 мВ)
при взаємодії з ними оптичних ізомерів кіоторфіну (КТ).

Найменшу активність виявляє форма D-D, яка навіть в концентрації 10-5 М
викликає дуже незначні зміни стану азолектинового моношару за
показниками як поверхневого тиску (рис.5), так і ГСП (рис.6). Ізомери
D-L і L-D активніше взаємодіють з азолектиновими моношарами і викликають
подібний характер змін поверхневого тиску в мембрані, але D-L в більшій
мірі підвищує щільність азолектинових моношарів, проявляючи більш
активну дію в області низьких концентрацій (10-11-10-9М). Характерним є
і значне підвищення величини стрибка потенціалу модифікованого
азолектинового моношару в області концентрацій цих двох оптичних форм
дипептиду 10-7- 10-6 М, яке може свідчити про інтенсивне накопичення
препаратів в полярній зоні мембрани.

Подібна динаміка змін характеристик ліпідного моношару під дією
L-L-ізомеру пептиду свідчить про його активне вбудовування між ліпідними
молекулами (в області гідрофобних жирнокислотних “хвостів”), тоді як
ізомери типу L-D і D-L в більшій мірі концентруються в області полярних
ліпідних головок за рахунок електростатичних взаємодій.

При взаємодії L-L-ізомера з моношарами, сформованими із ПМ міоцитів
тонкого кишківника кроля мембранотропність дипептиду знижується, а
характер змін ГСП стає подібним до змін, індукованих дипептидами типу
L-D і D-L. Проте, як і у випадку фосфоліпідних мембран зберігається
здатність L-L-ізомеру більш активно взаємодіяти з більш щільними
моношарами з ПМ, зокрема, при концентраціях КТ вище 10 –8 М.

Отже, ліпіди в складі біологічних мембран сприяють активній взаємодії
ізомера L-Tyr-L-Arg з ними, тоді як білки, які присутні в плазматичних
мембранах, очевидно, завдяки своїм зарядам або гідрофільно-гідрофобному
балансу, знижують інкорпорацію дипептиду в ділянку жирнокислотних
хвостів ліпідного матриксу, і він концентрується в області полярних
ліпідних головок, впливаючи, в основному, на електричні характеристики
мембрани. Можливо, в даному випадку важливе значення має і надзвичайно
малий розмір молекули РП, який не дає змоги гідрофобному залишку Tyr
подолати гідрофільний бар’єр білково-вуглеводного шару і досягнути
гідрофобного кору мембрани.

За зменшенням мембранотропної активності по відношенню до фосфоліпідного
матриксу досліджувані оптичні ізомери дипептиду Tyr-Arg розташовуються в
ряд: L-Tyr-L-Arg>D-Tyr-L-Arg>L-Tyr-D-Arg>D-Tyr-D-Arg, що повністю
співпадає з розподілом їх анальгетичної активності [Громов, 1992] і
свідчить, з одного боку, про значну роль оптичної активності амінокислот
в складі біорегулятора у прояві його мембранотропних властивостей, а з
другого – про важливу участь саме ліпідного матриксу мембрани в
реалізації біологічної дії і стереоселективності ряду пептидних
препаратів.

Мембранотропні властивості трипептиду меланостатину (м HYPERLINK
«00054709.htm» еланотропін-інгібуючий фактор , МІФ-1). МІФ-1 належить
до групи гіпоталамо-гіпофізарно-епіфізарних нейропептидів, як і інші
нейропептиди, проявляє поліфункціональність (натрійуретичну
[Громов,1992] і антиопіоїдну дію [ HYPERLINK «00018361.htm» Kastin et
al.,1985 ], анальгезуючі властивості [Bocheva,Lazarova,2003], високу
активність в різних поведінкових тестах [Булаев, 1987]). МІФ-1
складається з трьох незаряджених АКЗ (табл.1) і співпадає з C-кінцевим
доменом HYPERLINK «00047af9.htm» окситоцину , яка, як вважається,
відповідає за спрямовану доставку і контакт молекули гормона з
рецептором [Папсуевич и др., 1986]. Всі три АКЗ в складі МІФ-1 належать
до найбільш розповсюджених як в мембраноактивних АБП, так і в
проаналізованих нами пептидах (рис.1). МІФ-1 має високі показники
гідрофобності, які значно перевищують середні показники для
внутрішньомембранних білків, що розташовуються в зоні найвищої
гідрофобності ліпідного кору.

При формуванні ліпідних моношарів на поверхні 0,01 М КCl МІФ-1 практично
не взаємодіє з ними – не викликає змін поверхневого тиску, але веде до
повільних флуктуацій ГСП ( ±30-50 мВ). Проте, при застосуванні як
субфази фізіологічного розчину (іонна сила 0,154 г-екв/л) МІФ-1 набуває
здатності взаємодіяти з достатньо щільними азолектиновими моношарами –
при цьому значні зміни поверхневого тиску (до 2 мН/м) відбуваються вже
при концентрації МІФ-1 10–11 М (рис. 7). Розрахована мінімальна
концентрація мембранотропної дії меланостатину в таких умовах Смін =8 ·
10–15 М. Проте після досягнення наномолярних концентрацій пептиду
інтенсивність процесу адсорбції знижується в 1,6 раза (ГІ= 1,739 ? 10 -7
М/м2, вище наномолярних концентрацій ГІІ=1,094?10-7М/м2), не
спостерігаються і зміни ГСП

Рис.7. Зміни параметрів азолектинової модельної мембрани при дії
трипептиду меланостатину (МІФ)(субфаза – 0,154 М NaCl).

Таким чином, для даного пептиду роль ліпідного матриксу мембрани,
очевидно, полягає в основному в концентруванні пептиду на поверхні
клітини з набуттям ним певної конформації, що полегшує подальшу
взаємодію з специфічними рецепторами, причому пептид-мембранна взаємодія
модулюється іонною силою субфази.

Взаємодія трипептиду тироліберину (ТРГ) з модельними мембранами. ТРГ є
одним з основних рилізинг-факторів гіпоталамуса, виявляє різнобічний
вплив на організм – має психотропну, антидепресивну активність, впливає
на процеси пам’яті, справляє позитивний вплив на перебіг алкогольного
абстинентного синдрому [Булаев, 1987; Громов, 1992], може функціонувати
як антагонист опіоїдної активності, знижувати рівень Са2+ в HYPERLINK
«..\\physiology\\000a71d0.htm» крові і гальмувати секрецію HYPERLINK
«empty\\x005aa9d.htm» панкреатичних ферментів , можлива його
цитопротективна роль при онкотрансформації, стимулює ріст HYPERLINK
«..\\immunology\\0007c621.htm» Т-лімфоцитів і структурні зміни в
мембрані еритроцита [Гендель и др.,1997, Жерновков и др.,2003,
Торчинский и др.,2003]

Серед АКЗ в складі ТРГ (табл.1) лише Pro належить до гідрофобних і
високорозповсюджених в мембранотропних пептидах. При достатньо високій
загальній гідрофобності (Нш=1,52), яка співпадає з середнім значенням
для досліджених РП, завдяки високому дольовому вмісту полярних АКЗ (R=2)
значення дискримінантної функції Z=0,222 є найнижчим серед
проаналізованих пептидів і наближається до значення, властивого для
немебранних білків (рис.2). В діапазоні концентрацій 10-12-10-6 М, на
відміну від більшості досліджених нами пептидів, для ТРГ не встановлено
проникнення в гідрофобний шар фосфоліпідної мембрани. Проте, в значеннях
ГСП виявлені особливості, відмінні від ефектів інших пептидів (рис.8).
При пікомолярних концентраціях ТРГ протягом тривалого часу (60 хв)
спостерігаються флуктуації ГСП азолектинового моношару (±30 мВ). Після
чого відмічається тривале інтенсивне зростання цього показника. При
подальшому додаванні зростаючих концентрацій пептиду флуктуації ГСП не
відмічаються і приріст значень ГСП поступово припиняється (відсутність
ефекту). При наближенні до мікромолярних концентрацій (10-7–10–6М)
зростання ГСП відновлюється, але із значно нижчим приростом, ніж при
низьких концентраціях.

Рис.8. Приклад зміни граничного стрибка потенціалу азолектинового
моношару (р0=7,8 мН/м, ц0=300 мВ) при взаємодії з ним зростаючих
концентрацій тироліберину (10-12–10–6М).

Отже, не проникаючи в матрикс мембрани ТРГ справляє значний вплив на
стан її полярної зони, причому цей вплив характеризується двофазною
концентраційною залежністю і є максимально вираженим в пікомолярних
концентраціях. Отримані концентраційні залежності мембранотропної дії
ТРГ узгоджуються з біофізичними дослідженнями його ефектів іншими
методами (вплив на термо-індуковані структурні переходи і мікров’язкість
ліпідного бішару мембрани ендоплазматичної сітки клітин печінки мишей),
де найбільший ефект спостерігався саме при низьких концентраціях ТРГ –
10-10 і 10–16 М [Жерновков и др., 2003; Торчинский и др.,2003].

Мембранотропні властивості пентагастрину (ПГ). ПГ – синтетичний пептид,
який включає С-термінальний тетрапептид, носій фізіологічної активності
природного гормону гастрину, у зв’язку з чим широко застосовується в
експериментальній і клінічній практиці. До складу ПГ (табл.1) входять 4
неполярні амінокислоти і лише одна полярна – від’ємно заряджена Asp, що
визначає високі показники гідрофобності ПГ.

Взаємодія ПГ з азолектиновим моношаром має чітко виражену двофазність із
значною активацією при наближенні концентрації пептиду до мікромолярних
значень (Спер=2,5·10-7М) (рис.9, А). Перша фаза (починаючи з
Смін=1,58·10-10М) характеризується низьким коефіцієнтом адсорбції Гіббса
ГІ=2,804·10-8 М/м2. Коефіцієнт ГІІ другої фази складає 4,306·10-7 М/м2.
Таким чином, процес адсорбції після певного періоду накопичення пептиду
в примембранній зоні інтенсифікується в 15,4 рази (ГІ/ГІІ).

Рис.9. Зміни ГСП і поверхневого тиску при взаємодії пентагастрину (ПГ) з
азолектиновими моношаровими мембранами з початковими параметрами
р0=7,5±0,3 мН/м і ГСП0= 380±20 мВ (А) і з моношаровими мембранами,
сформованими з ПМ міоцитів кишечника кроля з початковими параметрами:
р0=9,1±0,4 мН/м, ГСП0=225±21 мВ (Б).

При взаємодії ПМ з моношаровими мембранами, сформованими з везикул ПМ
міоцитів кишечника кроля, характер процесу адсорбції змінюється –
зростає Смін, необхідна для початку реєстрації змін як ГСП, так і
поверхневого тиску, відсутня фаза тривалого первинного накопичення
препарату в зоні полярних головок, проте двофазність процесу
зберігається, хоча і менш виражена (рис.9,Б), оскільки коефіцієнт
адсорбції Гіббса першої фази (ГІ=2,885·10-7 М/м2) більш як в 10 разів
перевищує показник ГІ при взаємодії ПГ з азолектиновою мембраною.
Перехід до другої фази відбувається при концентрації ПГ 1,95·10-6М.
Таким чином, співвідношення активності двох фаз (ГІ/ГІІ) адсорбції ПГ на
мембранах, сформованих з природних ПМ, складає 3,04.

Отже, ПГ проявляє мембранотропну активність по відношенню як до
фосфоліпідних мембран, так і до мембран, сформованих з матеріалу
природних ПМ міоцитів, але загальний мембраномодулюючий ефект на ПМ
нижчий – в основному за рахунок початкових етапів пептид-мембранної
взаємодії. Повільна кінетика процесу на цьому етапі, очевидно,
обумовлена наявністю від’ємно зарядженого залишку Asp в молекулі ПГ, що
веде до електростатичного відштовхування його від мембрани при взаємодії
з полярними головками одноіменно заряджених ліпідів, які в незначній
кількості присутні в азолектині [Letters,1964]. Після накопичення
критичної концентрації пептиду в примембранній зоні, відбувається досить
активне його проникнення в матрикс мембрани. При взаємодії ПГ з ПМ
початок періоду накопичення пептиду реєструється значно пізніше, проте
він є набагато коротшим у порівнянні з фосфоліпідною мембраною. Подальша
інкорпорація пептиду в матрикс мембран, сформованих з ПМ (ІІ фаза) є
навіть активнішою, ніж у випадку фосфоліпідних мембран (за показником
ГІІ), але за рахунок зниженного процесу адсорбції на І етапі загальний
ефект (??) є нижчим.

Мембранотропні властивості природних енкефалінів і їх синтетичного
аналога ?-77. Ми припустили, що для пептидів опіоїдного ряду здатність
взаємодіяти з ліпідним матриксом мембрани могла б сприяти вибору
лігандом того чи іншого типу з ряду опіоїдних рецепторів [Громов,1992]
або певного сайту зв’язування на ньому і, як наслідок, визначати ті чи
інші ефекти. На нашу думку, модифікація пептид-мембранної взаємодії
різними факторами (ліпідний склад, фізико-хімічний стан мембрани і
оточуючого її середовища тощо) може збільшувати спектр ефектів одного й
того ж регулятора, тобто визначати його поліфункціональність, властиву
для пептидних біорегуляторів взагалі

Природні енкефаліни (ЕНК) – пентапептиди, які розрізняються одним
С-кінцевим амінокислотним залишком:Tyr-Gly-Gly-Phe-Met/Leu. Їм
притаманні найвищі показники гідрофобності серед досліджених пептидів. У
складі ЕНК присутні лише неполярні, переважно високогідрофобні АКЗ.
Особливо це стосується Лей-ЕНК, в результаті чого його дискримінантна
гідрофобність (функція Z) перевищує показники більшості проаналізованих
пептидів (табл.1). Всі АКЗ в складі енкефалінів (за виключенням Met)
належать до таких, що найбільш часто зустрічаються в досліджених нами
мембранотропних пептидах.

Пентапептид ?-77 – синтетичний аналог енкефалінів – має вдвічі більш
високу анальгетичну активність, ніж природні ЕНК [Боброва, 1983]. На
відміну від них, в Љ-77 на N-кінці присутній позитивно заряджений Lys+,
який в АБП відіграє важливу роль у визначенні їх мембранотропних
властивостей, сприяючи взаємодії з від’ємно зарядженими ліпідами
бактеріальних мембран. За нашими розрахунками, середня гідрофобність Нш
пептиду Љ-77 вища, ніж у кожного з ЕНК, проте наявність зарядженого Lys
знижує значення дискримінантної функції Z. За цим параметром Љ-77 є
більш гідрофобним, ніж більшість мембранних білків, але проміжним між
Лей- і Мет-енкефалінами.

В діапазоні фізіологічних концентрацій ЕНК майже не взаємодіють з
моношарами азолектину, сформованими на воді (І=0 г-екв/л). При
збільшенні іонної сили субфази до 0,01 г-екв/л (0,01М KCl), енкефаліни
інкорпоруються в азолектинові моношари, змінюючи їх початкові параметри,
причому ці зміни залежать від типу енкефаліну.

13 мН/м його взаємодія з ліпідним моношаром, на відміну від Мет-ЕНК,
остаточно припиняється (рис.10-12). Мет-ЕНК не тільки у значно нижчих
концентраціях починає вбудовуватись у моношар, а й викликає більш значні
зміни його параметрів. Тобто, характер взаємодії енкефалінів з
азолектиновими моношарами залежить від С-кінцевого залишку молекули,
вплив якого, в свою чергу, очевидно, визначається параметрами
гідрофобності.

Рис.10. Концентраційна залежність поверхневого тиску азолектинових
моно-шарів різної початкової щільності (р0) при їх модифікації Мет- (А)
та Лей- (Б) енкефалінами

Рис.11. Концентраційна залежність змін ГСП азолектинових моно-шарів
різної початкової щільності (р0) при взаємодії з ними Мет- (А) та Лей-
(Б) ЕНК

Взаємодія енкефалінів з моношарами, сформованими з ПМ міоцитів тонкого
кишечника кроля, є менш активною, ніж з фосфоліпідними мембранами. Це
відмічається як у зростанні мінімальної ефективної концентрації, так і у
зниженні показників Др і Дц у порівнянні з відповідними параметрами при
взаємодії енкефалінів з фосфоліпідними мембранами. Відрізняється і
характер залежності ефекту Др від ро – максимальна мембранотропна
активність обох ЕНК реєструється при їх взаємодії з мембранами із
значеннями ро в діапазоні 5-7 мН/м (рис.12,Б). Проте, виявлені ефекти
також (як і в азолектинових мембранах) свідчать про процеси адсорбції
енкефалінів в зоні полярних головок мембран і подальшої їх інсерції в
гідрофобну зону (останнє більш властиве для Мет-ЕНК).

Рис. 12. Залежність зміни поверхневого тиску (Др) моношарів, сформованих
з азолектину (А) і везикул ПМ міоцитів тонкого кишечника (Б) під впливом
Мет- і Лей-ЕНК в залежності від ро мембрани.

Синтетичний аналог енкефалінів пептид ?-77 взаємодіє з азолектиновими
модельними мембранами найбільш активно в діапазоні їх початкової
щільності 5-10 мН/м (подібно до ЕНК). Проте в його адсорбції
спостерігається наявність двох різних за інтенсивністю фаз (рис.13).

Рис. 13. Зміни поверхневого тиску (А) і граничного стрибка потенціалу
(Б) при взаємодії синтетичного пептиду Љ-77 з азолектиновими
моношаровими мембранами з початковими параметрами р0=5,5±0,3 мН/м і
ГСП0= 280±20 мВ.

Отже, Љ-77 займає проміжне положення між Мет- і Лей-ЕНК як за рівнем
гідрофобності, так і за значенням Смін, необхідної для прояву
мембранотропних ефектів. Проте, кінетика процесу адсорбції значно
відрізняється – у природних ЕНК він є однофазним, тоді як у Љ-77 –
2-фазним, причому інтенсивність другої фази (за значеннями коефіцієнта
Г) значно перевищує інтенсивність адсорбції кожного з ЕНК. Проте, за
рахунок більш інтенсивної взаємодії ЕНК з мембраною в діапазоні
концентрацій 10-10-10-7 М/л (коли для Љ-77 відбувається фаза повільної
адсорбції) загальний ефект мікромолярних концентрацій природних пептидів
значно переважає відповідний ефект пептиду Љ-77.

Вплив іонів металів і іонної сили електроліту на поверхнево-активні і
мембранотропні властивості Мет- і Лей-енкефалінів. В умовах організму,
пептид-мембранна взаємодія може модифікуватися додатковими факторами,
які впливають на стан ліпідного матриксу мембрани або самих пептидів,
зокрема, іонним складом позаклітинного середовища і його іонної сили
(І). На модельних мембранах такий вплив був продемонстрований нами для
меланостатину. Ми дослідили вплив К+, Мg2+ та Са2+ на мембранотропну
активність ЕНК при різній І субфази та різних концентраційних діапазонах
пептидів, звертаючи увагу саме на зміну значень ГСП мембран, оскільки
для ЕНК вплив на цей показник є більш вираженим.

При близьких значеннях поверхневого тиску в моношарах (р=5,9?0,9 мН/м)
іони по-різному впливають на величину ГСП у них. Така різниця є більш
вираженою при І=0,01 г-екв/л, ніж при І=0,1 г-екв/л. Проте, за
інтенсивністю впливу на значення ГСП азолектинових моношарів в
дослідженому діапазоні значень іонної сили ряд Са2+>Mg2+>К+ зберігається
(рис.14). При впливі іонів на адсорбційні моношари енкефалінів, характер
впливу зростання іонної сили субфази на параметри моношарів для кожного
з двох пептидів майже не залежить від типу іона, тоді як за
інтенсивністю впливу іони розподіляються вже в інший ряд, відмінний від
ряду впливу на ліпідні моношари – Mg2+?K+>Са2+ для Лей-ЕНК і, навпаки,
Са2+ > Mg2+ ? K+ для Мет-ЕНК. Як і в інших експериментах, відповідь
Мет-ЕНК на зростання іонної сили при кожному з досліджених типів іонів
знов-таки є більш активною у порівнянні з Лей-ЕНК.

Рис.14. Вплив іонного складу і іонної сили (ІС) субфази на значення ГСП
азолектинових моношарів (р0= 5,9?0,9 мН/м)

Рис.15. Приріст ГСП при взаємодії 10-6 М енкефалінів з азолектиновими
моношарами (р0= 5,9?0,9 мН/м) на субфазах різного іонного складу і
різної іонної сили (ІС).

¤

¦

O

O

Oe

^ J

L

t

?

i

l

EHuy

|

 

c

o

oe

L N Z

\

d

f

v

x

|

?

?

EHuy

j6

X Z
!»!‚»†»?»?»‚$†$?.†.?0?0:[email protected]^H?I?IDKHKiLiLMM¬P®PFRHR?R?ROeR
ORooaeoTHoUeoOEOEOEoAeoAeoooTHoTHoooooaeoAeoooooooooooooooooooooooTHoTHo
THoTHoooooAeo1/2oooo

EHuyJередковані як їх впливом на фізико-хімічний стан ліпідів, так і на
поведінку пептидів у розчині.

В цілому, отримані результати дозволяють віднести енкефаліни до ряду
пептидів, для яких мембранотропна активність є важливою умовою прояву їх
біологічної дії. Очевидно, для енкефалінів, через їх низьку власну
поверхневу активність, не властиві такі безрецепторні ефекти як
безпосередня взаємодія з транспортними АТФазами і іншими мембранними
білками, каналоутворююча здатність тощо. Проте Мет-ЕНК більш активно
модифікує фосфоліпідні мембрани, проникаючи в їх матрикс, тоді як ефекти
Лей-ЕНК більш обмежені поверхневою зоною мембрани. Така різниця в
мембранотропних ефектах, обумовлена єдиним АКЗ, може забезпечувати
подальшу селективність ЕНК у виборі підтипу рецептора. Вважається, що
Лей-ЕНК переважно є лігандом д-рецепторів, акцепторні сайти яких
розташовані на зовнішній поверхні ПМ, тоді як Мет-ЕНК може взаємодіяти
як з м- (акцепторні сайти – в гідрофільній зоні мембрани), так і з
д-типами (гідрофобна зона) [Громов, 1992]. Отже, різна ступінь
гідрофобності і різна мембранотропна активність двох енкфалінів (ступінь
їх проникності в мембрану), а також її модуляція додатковими факторами,
зокрема іонним складом середовища, вже на найперших етапах їх взаємодії
з ПМ може сприяти вибору різних підтипів рецепторів і забезпечувати
поліфункціональність дії данного пептиду.

Мембранотропні властивості нейротензину (НТ). Тридекапептид НТ (табл.1)
залучений у цілий ряд ефектів в центральній і периферичній нервовій
системі [Martin et al., 1999]. Він також відомий як один з найбільш
потужних антиноцицептивних препаратів [Vincent et al., 1997]. Доведена
його участь в процесах, що мають відношення до таких хвороб, як
шизофренія, хвороби Паркінсона і Альцгеймера [Громов, 1992].

В складі НТ гідрофобні домени рознесені по кінцевих ділянках молекули, а
центральна частина є гідрофільною і позитивно (+3) зарядженою.
Співвідношення R (полярні/неполярні залишки) у НТ дуже високе (1,6) за
рахунок великої кількості полярних АКЗ – вище, ніж у немембранних
(R=1,26) або зовнішніх мембранних (R=1,37) білків. В той же час, завдяки
тому, що неполярні амінокислотні залишки в його складі мають найвищі
показники ДGпер, загальний рівень гідрофобності НТ (Нш=1,749), перевищує
відповідний показник мембранних білків і більшості регуляторних пептидів
(табл.1) Внаслідок цього Z, як лінійна комбінація показників R і Нш,
наближена до значень в групі внутрішньомембранних білків. Отже, молекулу
НТ можна охарактеризувати як структуру з яскраво вираженими аміфільними
властивостями, яка повинна активно взаємодіяти своєю центральною
частиною з гідрофільною зоною полярних головок, тоді як кінцеві ділянки
будуть занурюватися в гідрофобну зону ацильних ланцюгів, або згортатися
всередину молекули.

НТ проявляє незначну власну поверхневу активність і не формує на
поверхні субфази суцільних адсорбційних моношарів навіть при досить
високих концентраціях (10-7-10-6 М). Ліпопротеїновий моношар (60%
азолектин, 10% холестерол, 30% сироватковий альбумін людини, за
ваг.спів.) сприяє не тільки концентруванню молекул НТ в полярній зоні
мембрани, про що свідчать зростання значень ГСП, а й інсерції молекул
пептиду в моношар (зростають значення поверхневого тиску р). Активність
такої взаємодії залежить від щільності моношару. Показово, що в
дослідженому діапазоні поверхневого тиску (до 10 мН/м) активність
зростає із збільшенням щільності мембран (що наближує їх до властивостей
біологічних мембран). Достовірне проникнення пептиду в гідрофобний
матрикс відбувається при початковій щільності мембрани вище 9 мН/м (рис.
16,А).

Рис.16. Зміни поверхневого тиску (А) і ГСП (Б) в ліпопротеїнових
моношарових мембранах з різною початковою щільністю (р0) при адсорбції
НТ.

Крім того, з ущільненням мембрани: (1) – процес набуває чітко вираженої
двофазності, що також свідчить про збільшення афінності
пептид-мембранної взаємодії; (2) – знижується мінімальна діюча
концентрація НТ (С мін) і питома площа на молекулу НТ при максимальній
адсорбції; (3) – зростає коефіцієнт адсорбції Гіббса (Г) і загальний
ефект пептиду на стан мембрани, який виражається в її ущільненні (??),
що свідчить про збільшення кількості пептиду зв’язаного з мембраною.
Зростання величини ГСП (Дц) є дуже незначним і не має чіткого розподілу
на 2 фази (рис.16, Б), що також свідчить про те, що молекули НТ при
адсорбції практично не затримуються поблизу поверхні мембрани, а
переважно інкорпоруються між її молекулами.

Отримані факти виступають одним з доказів того, що досліджуваний процес
не є простою фізичною адсорбцією, а може розглядатися певною мірою як
спеціфічна взаємодія НТ з мембранною структурою, оскільки для
біологічних досліджень має значення характер взаємодії пептиду саме з
більш щільними мембранами, параметри яких наближені до клітинних
мембран.

При взаємодії НТ з азолектиновими мембранами показники адсорбції
(коефіцієнт Гіббса і зростання поверхневого тиску, Др) перевищують
відповідні показники його взаємодії з ліпопротеїновими мембранами.
Інтенсивність взаємодії НТ з моношарами азолектину також залежить від
початкової щільності ліпідного моношару і зростає при її збільшенні. Але
в даному випадку особливості адсорбції дещо відрізняються від процесів,
досліджених на ліпопротеїнових мембранах. По-перше, Смін, необхідна для
початку інкорпорації пептиду в ліпідний матрикс, при взаємодії НТ з
азолектиновими мембранами значно перевищує аналогічний показник для
ліпопротеїнових мембран. Крім того, на відміну від ліпопротеїнових
мембран, з ущільненням мембрани він зростає. По-друге, взаємодія з
фосфоліпідним азолектиновим матриксом у всьому дослідженому діапазоні
початкових щільностей (р0) проявляє двофазний характер (рис.17). Перехід
до активної фази (у всьому дослідженому діапазоні р0) відбувається при
концентраціях НТ біля 0,5 мкМ.

Проте з ущільненням мембрани зростає як інтенсивність адсорбції в кожній
з фаз (Г), так і співвідношення між їх показниками ГІІ/ГІ (рис.18).

Рис.17. Зміни поверхневого тиску в азолектинових мембранах при
інкорпорації в них молекул нейротензину.

Рис.18. Зміни співвідношення коефіцієнтів адсорбції Гіббса (Г) при
взаємодії нейротензину з азолектиновими моношарами при зростанні р0
модельної мембрани

.

З аналізу значень питомої молекулярної площі, що припадає на 1 молекулу
НТ в мембрані при максимальній адсорбції, витікає, що НТ здатний
вбудуватися в щільні азолектинові мембрани в кількості, що майже в 3
рази перевищує його інкорпорацію в тих же умовах в ліпопротеїнову
мембрану.

Таким чином, якщо ліпопротеїнова модельна мембрана, яка за своїми
властивостями більш повно відповідає ПМ тваринної клітини, сприяє більш
ефективному початку процесу пептид-мембранної взаємодії, то мембрана,
сформована тільки з фосфоліпідів, в значній мірі сприяє розвитку
наступної стадії – інкорпорації нейротензину поміж ліпідними молекулами.

Припускається, що одним з головних факторів, що визначають адсорбцію
позитивно заряджених молекул пептиду на мембранах є звичайна
електро-статична взаємодія з негативними полярними групами окремих
мембранних ліпідів. Для перевірки цього припущення ми дослідили
особливості взаємодії високозарядженого НТ з мембранами, сформованими
тільки з негативно зарядженого фосфатидилсерину (ФС) в різному діапазоні
початкової щільності.

У всіх діапазонах щільності НТ починає вбудовуватись в ФС-мембрани у
концентраціях, нижчих, ніж у випадку з ліпопротеїновими та
азолектиновими мембранами (рис.19,А). З зростанням щільності ФС-мембрани
Смін пептиду знижується. Це обумовлено зростанням загального заряду на
одиницю площі мембрани, що забезпечує більш ефективне концентрування
позитивно-заряджених молекул НТ біля її поверхні. При взаємодії НТ з
ФС-мембранами встановлена також на порядок нижча концентрація переходу
(Спер) процесу адсорбції до другої, інтенсивної фази. Але, незважаючи на
ранній початок процесу, подальша інкорпорація молекул НТ у ФС-мембрани
не тільки менш ефективна у порівнянні з азолектиновими моношарами, але й
її інтенсивність (коефіцієнт Гіббса) знижується з наростанням щільності
мембрани. Оскільки при взаємодії НТ з ФС-моношаром відбувається взаємна
нейтралізація заряду, значних змін ГСП не реєструється – відповідні
показники в середньому в 1,5 рази нижчі, ніж при взаємодії з
нейтральними азолектиновими мембранами. Проте зберігається залежність –
з ущільненням мембрани зменшуються зміни ГСП, які викликаються
взаємодією пептиду з такою мембраною.

Таким чином, наявність заряду на ліпідних молекулах не тільки сприяє
активації адсорбції НТ в області полярної зони мембрани при низьких
концентраціях, але й затримує молекули пептиду в цій ділянці, знижуючи
їх подальше проникнення в гідрофобний матрикс мембрани.

Співставлення процесів взаємодії НТ з трьома дослідженими типами мембран
дозволяє зробити висновок, що як хімічний склад, так і фізичний стан (в
даному випадку – щільність упакування молекул-компонентів мембрани)
відіграє важливу роль у модуляції характеру взаємодії пептиду з
мембраною. Загальний ефект НТ на стан мембрани, виміряний за зростанням
поверхневого тиску у ній при інкорпорації пептидних молекул, більш
виражений у азолектинових мембранах (рис.19, Б). Проте мінімальні
ефективні концентрації є значно нижчими в ліпопротеїнових і, особливо,
ФС-мембранах. В ліпопротеїнових мембранах низької щільності ефект є
найнижчим серед досліджених моделей, але із зростанням початкової
щільності мембран, яке активізує процес інкорпорації НТ у всіх
досліджених нами системах, інтенсивність вбудовування біорегулятора
максимально активується саме в фосфоліпід-холестерол-білкових мембранах.

Отримані дані, очевидно, можуть бути пояснені тим, що у ліпопротеїновій
мембрані крім негативно-заряджених фосфоліпідів додатково присутні
білки, гідрофільні ділянки яких виступають у позамембранне середовище.
Цей фактор сприяє концентруванню пептиду поблизу поверхні мембрани (і
низьким значенням Смін). З іншого боку, невисока (порівняно з
фосфатидилсериновими мембранами) наявність кислих фосфоліпідів у такій
мембрані не перешкоджає реалізації другого етапу взаємодії – активному
проникненню пептиду у гідрофобну ділянку ліпідного матриксу. Проте
холестерол, який присутній в ліпопротеїновій мембрані і знижує
конформаційну рухомість ацильних ланцюгів ліпідів, гальмує і процес
проникнення НТ в гідрофобну зону такої мембрани – результатом цього і є
знижений загальний мембранотропний ефект (Др) нейротензину у ЛП
мембранах.

Рис.19. Залежність початкової (мінімальної) концентрації вбудовування,
Смін (А) молекул нейротензину і його загального мембранотропного ефекту,
Др (Б) від початкової щільності упаковки (р0) моношарових мембран
різного складу: АЛ – азолектинова, ФС – фосфатидилсеринова, ЛП –
ліпопротеїнова.

Вплив НТ на характеристики БЛМ. Досліджено вплив НТ в діапазоні
концентрацій 10-9- 2·10-5 М на електричну ємність і провідність БЛМ,
сформованих з сумарної фракції фосфоліпідів мозку бика. Середня питома
ємність немодифікованих мембран – 0,3 мкФ/см2, електропровідність – 27,3
пСм при 25єС. Збільшення концентрації НТ в розчині веде до зростання
обох показників (рис.20), але в більшій мірі змінюється інтегральна
провідність мембран (достовірний приріст – з 10-7 М НТ), тоді як зміни
ємності виражені менше. Проте, збільшення ємності мембран лише у 1,5–2
рази вже є досить суттєвим. Ємність мембрани може бути розрахована за
формулою для ємності плоского конденсатора: С=SмD/L, де Sм – площа БЛМ,
D – ефективна діелектрична проникність неполярної частини бішару, L –
товщина мембрани. З рівняння видно, що, оскільки збільшення ємності
мембрани у 1,3 – 1,4 рази, яке спостерігається в експерименті при
фізіологічних концентраціях НТ, не може пояснюватися збільшенням площі
та/або зниженням товщини бішару, головною причиною зростання цього
параметру мембрани слід вважати зростання діелектричної проникності
гідрофобної зони мембрани під впливом пептиду. Таке збільшення
діелектричної проникності має призвести до збільшення коєфіцієнту
розподілу неорганічних іонів між водним розчином і неполярною зоною
мембрани та, як наслідок, до росту провідності БЛМ.

Рис.20. Відносні зміни електроємності (С/С0) та електропровідності
(G/G0) БЛМ з сумарної фракції фосфоліпідів мозку бика при дії НТ.
Субфаза 0,15 М КCl-трис-НСl, рН=6,8, t=25 єC

Раніше [Рибальченко та ін., 1990] нами встановлений активний вплив
окситоцину на показники БЛМ з формуванням канальних структур. Для інших
досліджених РП зміни параметрів БЛМ не перевищували 10-20%.

Мембранотропні властивості біорегуляторів — похідних амінокислот.
Оскільки одним з визначаючих факторів мембранотропної дії пептидних
біорегуляторів є їх амінокислотний склад, можливо, що й біорегулятори,
які є похідними окремих амінокислот, здатні в тій чи іншій мірі
реалізувати свої біологічні ефекти через етап взаємодії з ліпідним
матриксом мембрани-мішені. Ми дослідили мембранотропні ефекти природного
амінокислотного біорегулятора гамма-аміномасляної кислоти (ГАМК) і
нового вітчизняного синтетичного кардіотонічного препарата – суфану,
який є похідним бурштинової кислоти і амінокислоти триптофану.

ГАМК – гідрофільна амінокислота, що є продуктом декарбоксилювання
глутамінової кислоти, не входить до складу білків і є медіатором
нервової системи. В концентраціях 10-10-10-4 М ГАМК не проникає в
матрикс ліпідних мембран, але адсорбуєтся на його поверхні, впливаючи на
орієнтацію полярних груп, про що свідчить зміна ГСП, починаючи з
концентрацій, вище 10-10 М. При цьому приріст значень ГСП при різних
концентраціях ГАМК в субфазі відбувається з різною інтенсивністю
(рис.21). Максимальний ефект ГАМК відзначається при концентрації 10 -6 М
– при цій концентрацій найвищою є як швидкість приросту ГСП в часі, так
і абсолютна зміна цього показника. При подальших збільшеннях
концентрації препарату приріст значень ГСП стає менш вираженим.

Рис.21. Швидкість приросту ГСП (V) на азолектиновій мембрані при
ступінчастому нарощуванні концентрацій ГАМК в субфазі.

Таким чином, ефект взаємодії ГАМК із ліпідним матриксом обмежується
концентруванням препарату на поверхні мембрани, що є важливою умовою
подальшої ефективної ліганд-рецепторної взаємодії.

Кардіотонік суфан (дикалієва сіль N-сукциніл-триптофану), клінічні
випробування якого тривають, виробляється у вигляді L-форми, що містить
тільки L-триптофан та D,L-форми, яка є рацемованою сумішшю двох
ізомерів. Нами встановлено, що ліпідна фаза мембрани відіграє активну
роль в процесі взаємодії з нею оптичних ізомерів суфану. Наявність
фосфоліпідного моношару модулює мембранотропні властивості препаратів
суфану таким чином, що менш поверхнево-активний L-суфан при низьких
концентраціях (до 10-6 М) виявляється більш мембраноактивним по
відношенню до мембран різного складу, ніж D,L-суфан Проте, при
подальшому збільшенні концентрації препарату в субфазі взаємодія
L-суфану припиняється, тоді як для D,L-форми – продовжується, внаслідок
чого при високих концентраціях в ряді випадків загальний ефект цієї
форми навіть перевищує ефект L-ізомеру. Аніонні ліпіди перешкоджають як
початку процесу адсорбції (ведуть до збільшення Смін), так і подальшій
інкорпорації речовини (особливо L-форми) в мембрану. При взаємодії з
цвіттеріонним фосфатидилхоліном D,L-форма виявилась більш активною – її
ефект перевищує ефект L-форми 1,93 рази (р<0,02) і наближений до ефекту при інкорпорації в азолектинові мембрани (рис.22). При взаємодії суфану з ліпопротеїновою мембраною змінюється кінетика процесу, характерна для взаємодії препаратів з фосфоліпідними мембранами. Для D,L-суфану зникає двофазність інкорпорації, а для L-суфану при такому ж максимальному ефекті, як і при його взаємодії з азолектиновою мембраною, процес розтягується у часі. Наявність білків і холестеролу, очевидно, створює додатковий бар’єр для проникнення як L-, так і D,L-суфану. Проте, при взаємодії з ліпопротеїновою мембраною (на відміну від фосфоліпідних) загальний ефект L-суфану значно переважає ефект D,L-форми (в 10,25 раза, р<0,001) і практично співпадає з ефектом на азолектинових мембранах. Рис.22. Порівняння загального ефекту (за зростанням поверхневого тиску) L- і DL-форм суфану (10 –5 М) при їх взаємодії з модельними мембранами різного складу (р0= 9,0±0,5 мН/м): АЛ - азолектинова; ФС - фосфатидилсеринова; ФХ - фосфатидилхолінова; ЛП-ліпопротеїнова мембрана Отже, ці дослідження можуть пояснювати і більш високу ефективність L-ізомеру порівняно з рацематом в медико-біологічних і клінічних дослідженнях і дозволяють стверджувати, що в прояві біологічної дії і, зокрема, стереоселективності суфану активна роль належить його безрецепторним взаємодіям з ліпідним матриксом мембрани. Мембранотропні властивості екзогенних біорегуляторів. Встановлено, що мембранотропна активність гербіциду 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти (2,4-Д) є нижчою порівняно з пептидними біорегуляторами і її дія обмежується поверхневою зоною мембрани за рахунок концентрування на поверхні ліпідного матриксу, що узгоджуються з встановленими в нашому колективі ефектами 2,4-Д на БЛМ [Бычко, 2002] і з її впливом на стан мембрани еритроцитів [Suwalsky et al., 1996]. Процес має слабковиражену двофазність. Для регулятора росту рослин івіну (N-оксид 2,6-диметилпіридину), як і для ендогенних РП, властивий двофазний характер взаємодії з мембраною, який, проте, має якісні і кількісні відмінності від особливостей пептид-мембранних взаємодій. Концентраційна залежність має вигляд кубічної параболи, яка не зустрічається для інших досліджених нами ліганд-мембранних взаємодій. На першому етапі (10–11-10-8 М) молекули івіну адсорбуються переважно в полярній зоні, але на орієнтацію полярних груп впливають в незначній мірі (зміни ГСП не перевищують +20-30 мВ), частково вбудовуючись в мембранний матрикс. При концентрації івіну близко 10-8М досягається стан насиченості з виходом концентраційної залежності на плато (відсутнє при пептид-мембранних взаємодіях). Проте, процес посилюється при наближенні до мікромолярних концентрацій. При цьому при взаємодії з більш щільно упакованими мембранами івін не тільки інтенсивніше вбудовується в гідрофобну зону мембрани, а й активніше впливає на орієнтацію її заряджених компонентів (за змінами ГСП). Обидва ксенобіотики впливають на Mg2+,Ca2+-АТФазну активність везикул ПМ гепатоцитів в умовах, коли виключається можлива взаємодія з рецепторами (рис.23). Ефекти 2,4-Д на обидва типи Mg2+,Ca2+-АТФазної активності мають подібний (параболічний) характер концентраційної залежності і більш виражені для високоафінної АТФази, яка є основним компонентом Ca2+-насосу ПМ. Під впливом івіну не відбувається достовірних змін в активності обох форм Mg2+,Ca2+-АТФази, хоча зберігається тенденція до параболічної концентраційної залежності його впливу на ферментативну активність і більш виражена відповідь високоафінної форми Mg2+,Ca2+-АТФази. Рис.23. Концентраційна залежність відносної високоафінної та низькоафінної Mg2+, Ca2+-АТФазної активності фракції ПМ клітин печінки щурів під впливом 2,4-Д (А) і івіну (Б). Мембранотропні властивості фітопрепаратів. На даний час значна кількість фітопрепаратів підбирається емпіричним шляхом. Актуальним залишається добір тестових систем, які допомогли б, в залежності від потреб, зупинитися на більш поліфункціональних або, навпаки, селективних рецептурах. Враховуючи отримані нами факти про тісний зв’язок біологічної дії БАР з характером їх мембранотропної активності, ми припустили, що одним з таких ефективних тестів активності фітопрепаратів, може бути аналіз їх мембранотропної дії в модельних системах. Нами встановлена висока мембранотропна активність і охарактеризовані її параметри для ряду фітопрепаратів з радіо- і гепато-протективною дією - спиртових екстрактів квіток і трави ехінацеї пурпурової, кореневища цикорію і лепехи звичайної, трави деревію, багатокомпонентної фітонастоянки вітчизняного виробництва “Поліфітол-1”, в хімічному складі якої переважають поліфеноли. Всі досліджені препарати є мембранотропними агентами, які, високоймовірно, здатні справляти вплив на мембрани різних клітин організму, не потребуючи обов’язкової наявності специфічних білкових рецепторів до молекул його складових, а взаємодіючи безпосередньо з ліпідним матриксом мембрани. Найвищу поліфункціональність дії серед представлених препаратів повинні проявляти препарати з найвищими показниками мембранотропності – аїру і трави ехінацеї. Показана залежність прояву мембранотропної активності від особливостей отримання препарату, що може бути застосовано при подальшому пошуку природних мембраностабілізаторів. Пряма взаємодія компонентів фітопрепаратів з ліпідним матриксом мембрани додатково підтверджує універсальність безрецепторного “ліпідного” механізму реалізації біологічної активності речовин різної хімічної природи. Метод попереднього експрес-визначення біологічної активності фітопрепаратів за показниками їх мембранотропної активності застосований при доборі фітозборів з гепатопротективною активністю сумісно з кафедрою фітотерапії Медичного інституту Української асоціації народної медицини. Його ефективність підтверджена в клінічних дослідженнях у пацієнтів з різними формами гепатитів [Гарник, 2004]. Метод зареєстровано МОЗ України як нововведення в галузі охорони здоров’я (2003, реєстраційний № 249/19/03). Узагальнення. Взаємодія всіх досліджених біорегуляторів з ліпідними мембранами розпочинається, а в ряді випадків обмежується (ГАМК, тироліберин, МІФ) їх накопиченням в зоні полярних головок ліпідів. Інтенсивність і концентраційні характеристики цього етапу взаємодії пов’язані як з особливостями структури біорегулятора, так і з особливостями модельної мембрани, зокрема складом її полярної зони. Мінімальні діючі концентрації (Смін) спостерігаються при взаємодії біорегуляторів з від’ємно зарядженими мембранами з фосфатидилсерину. На ФС-мембранах з вищим ступенем щільності значення Смін ще більше знижується, що легко пояснюється одночасним зростанням щільності зарядів на мембрані і, як наслідок, збільшенням електростатичної взаємодії. При застосуванні модельних ліпопротеїнових мембран або природних ПМ значення Смін звичайно є проміжним – кількість від’ємно заряджених ліпідів в них складає 20-30 %, проте додатково присутні білкові домени, які додають свій внесок в електростатичні взаємодії. Якщо ж в складі самого біорегулятора присутні від’ємно заряджені групи, одноіменний заряд ФС-мембран, навпаки, гальмує їх накопичення на поверхні мембрани. Наявність таких груп знижує мембранотропну активність біорегуляторів і по відношенню до азолектину, який в цілому нейтральний, але містить в своєму складі також фосфатидилсерин і фосфатидилетаноламін [Letters, 1964]. Крім того, аніонні ліпіди, а також, очевидно, заряджені амінокислотні залишкі на білкових ланцюгах в складі модельних ліпопротеїнових і природних ПМ не тільки сприяють первинному концентруванню більшості біорегуляторів на поверхні мембрани, але й частково перешкоджають їх подальшому проникненню в гідрофобний матрикс, утримуючи молекули біорегуляторів за рахунок електростатичних сил в зоні полярних головок. При взаємодії з такими мембранами загальний мембранотропний ефект завжди значно нижчий, ніж при взаємодії з азолектиновими моношарами. Ще більше зниження загального ефекту (але не його повне пригнічення!) спостерігається і при взаємодії препаратів з ліпопротеїновими мембранами, що, очевидно, обумовлено додатковою наявністю холестеролу в їх складі, який знижує конформаційну рухомість ацильних ланцюгів мембранних ліпідів. Активність адсорбції і загальний ефект досліджених БАР є найвищими при їх взаємодії з мембранами з азолектину. Більше того, в ряді випадків ефективність інкорпорації молекул в ці мембрани зростає з їх ущільненням до певного рівня, демонструючи, таким чином, підвищену афінність мембранотропних речовин до мембран з сумарної фосфоліпідної фракції. Для мембран різного ліпідного складу, як і для різних пептидів, навіть з незначними відмінностями за вмістом АКЗ (наприклад, енкефалінів), характер залежності інтенсивності інкорпорації від щільності мембрани є різним. Зниження Смін із збільшенням щільності мембрани характерно тільки для аніонних мембран і викликається збільшенням до певного ступеня щільності зарядів, яке сприяє більш швидкому концентруванню пептидів на поверхні мембрани. Для мембран, які мають в цілому нейтральний заряд, із збільшенням їх щільності потребується більша початкова концентрація біорегуляторів, але і проникнення в їх гідрофобну зону відбувається більш активно, оскільки електростатичні сили не затримують ліганд в полярній ділянці мембрани. Ефективність інкорпорації пептидних біорегуляторів в азолектинові мембрани тісно, але не завжди прямо, пов’язана з рівнем їх гідрофобності. Всі проаналізовані пептиди, за виключенням тироліберину, характеризуються високими показниками параметрів гідрофобності – вони вищі, ніж навіть у внутрішньо мембранних клітинних білків і практично співпадають з відповідними показниками мембранотропних антибактеріальних і цитотоксичних пептидів (рис. 1). Раніше [Островська, 1995] для трьох пептидів – вазопресину, окситоцину і дезаміноокситоцину ми отримали пряму залежність взаємозв’язку показників гідрофобності пептиду (зокрема дискримінантної функції Z) і його мембранотропного ефекту. Проте, дослідження і аналіз їх вкорочених і подовжених фрагментів, які мали близькі показники гідрофобності, але різну кількість полярних і, зокрема, заряджених груп, показали, що, очевидно, більш важливе значення має поєднання цих параметрів. Представлене дослідження підтверджує це припущення. Достовірний ефект проникнення в ліпідний матрикс (Др? 2 мН/м) виявляють пептиди, у яких показник лінійної дискримінантної функції Z перевищує 0,3 (рис. 24). З подальшим зростанням значення Z до 0,8 ефект збільшується (коефіцієнт лінійної кореляції r =0,862). При перевищенні цього значення (що відбувається при поєднаннї високої загальної гідрофобності і зменшеного вмісту полярних амінокислотних залишків) мембранотропний ефект різко знижується. Вирівнювання отриманого емпірічного ряду за методом Чебишева дозволило знайти теоретичну залежність мембранотропного ефекту від значення Z, представлену на рис. 24 суцільною кривою, яка наближена до параболи другого порядку. Рис.24. Залежність ефективності інкорпорації регуляторних пептидів (за зміною поверхневого тиску в мембрані) від значення лінійної дискримінантної функції Z. Концентрація пептидів у субфазі – 10-6 М, мембрани – моношари азолектину, р0 – від 5до 7 мН/м). В цілому механізм ефектів пептидних і інших біорегуляторів за участю ліпідного матриксу мембрани можна уявити таким чином (рис.25): На першому етапі біорегулятори адсорбуються на мембрані за рахунок електростатичних зв’язків. Це сприяє їх концентруванню і набуттю певної конформації (фолдингу). Вже на цьому етапі взаємодія БАР з мембраною сприятиме зв’язуванню біорегулятора з поверхневими акцепторними сайтами рецептора. Наступним етапом є інкорпорація молекули біорегулятора в гідрофобну зону ліпідного матриксу. Набуваючи остаточної, єдино можливої конфігурації в гідрофобному оточенні, молекули біорегуляторів стають здатними ефективно зв’язуватись з внутрімембранними акцепторними сайтами відповідних рецепторів, безпосередньо взаємодіяти з мембранними білками (АТФазами, G-білками і ін.) або впливати на їх функціонування через локальні зміни фізико-хімічного стану ліпідів, утворювати іон-провідні структури, можливо, виступають субстратами для утворення внутрімембраних і внутріклітинних месенджерів (наприклад, пептидної природи). Здатність біорегулятора до реалізації того чи іншого етапу пептид-мембранних взаємодій, з представлених на рис. 25, залежить від його первинної структури, яка й визначає його фізико-хімічні властивості. Особливості таких взаємодії залежатимуть і від фізико-хімічних властивостей самої мембрани. Слід нагадати, що ці властивості можуть бути різними не тільки для мембран клітин різних тканин, але й при змінах стану одних і тих же клітин, зокрема, при апоптозі, онкотрансформації тощо [Azuma et al., 2002]. Виходячи з цього, можна припускати існування відносної специфічності безецепторних пептид-ліпідних мембранних взаємодій. Рис. 25. Можливі шляхи дії пептидних біорегуляторів на клітину з урахуванням їх мембранотропної активності І – попередня адсорбція на поверхні ліпідного матриксу мембрани, яка забезпечує набуття пептидом біологічно активної конформації, необхідної для взаємодії з рецептором. Наслідком цього може бути: 1.1 – зміна стану полярної зони ліпідного матриксу; 1.2 – забезпечення ефективної взаємодії з поверхневими акцепторними сайтами рецепторів; ІІ – різні ступені проникнення пептидної молекули в ліпідний матрикс мембрани, в результаті чого може відбуватися: 2.1 – взаємодія біорегулятора з гідрофобним внутрімембранним акцепторним сайтом рецептора 2.2 - зміна фізико-хімічного стану оточуючих ліпідів, яка може приводити до зміни функціонування мембрано-зв’язаних білків, зокрема транспортних АТФаз; 2.3 – безпосередній вплив біорегуляторів на активність таких білків; 2.4 – формування іонних каналів. В цілому біологічне значення безрецепторної взаємодії регуляторних пептидів з мембранним матриксом може полягати в таких аспектах: 1. Накопичення ліганду на поверхні мембрани, створення більш ефективної діючої концентрації. Це може бути одним з пояснень ефективності дії ультрамалих доз біорегуляторів. Крім асиметрії в ліпідному складі між двома моношарами мембран спостерігається також нерівномірне розташування різних ліпідів в межах одного моношару (утворення доменів) [Rodgers, Glaser,1991], що також може мати значення для накопичення певного регуляторного пептиду або іншого біорегулятора в тій чи іншій зоні мембрани [Bandrowich-Picuіa, 2000]. 2. Опосередкування вибору підтипу рецептору (наприклад, у випадку енкефалінів, нейрокінінів). 3. Забезпечення безпосередньої взаємодії з мембранними регуляторними структурами – АТФазами (нейрогіпофізарні гормони), G-білками (пептид мастопаран з отрути оси) тощо. 4. Формування пептидних іонних каналів з наступною зміною іонного статусу клітини – як один з механізмів впливу на скорочення міоцитів (нейрогіпофізарні гормони) чи реалізація антибактеріальної дії ряду антибіотиків. 5. Зміна фізико-хімічного стану самого ліпідного матриксу, а через це – активності мембранних ферментів, транспортних і інших білків, функціонуваня яких, як відомо, в значній мірі визначається станом анулярних ліпідів. Наші дослідження мембрано-активних властивостей похідних амінокислот, екзогенних речовин-ксенобіотиків і фітопрепаратів підтверджують універсальність механізму ліпідного шляху реалізації біологічної дії біорегуляторів. І, нарешті, встановлені нами безрецепторні ефекти окремих біорегуляторів (тироліберин, 2,4-Д), коли ефект проявляється в малих дозах і зменшується або зникає при збільшенні концентрації речовини, очевидно, можуть виступати підставою для залучення ліпідного компоненту в пояснення механізмів такого явища як “парадоксальна токсичність”, при якому менші дози БАР виявляють вищий ефект [Бурлакова,2003; Криштопенко, 2001]. ВИСНОВКИ Регуляторні пептиди з різними структурно-функціональними властивостями (оптичні ізомери кіоторфіну, тироліберин, меланостатин, пентагастрин, Мет- і Лей-енкефаліни, їх синтетичний аналог S-77, нейротензин), похідні амінокислот (гамма-аміномасляна кислота і кардіотонік суфан), ксенобіотичні речовини (2,4-дихлорфеноксиоцтова кислота і N-оксид диметил-піридину) і фітопрепарати здатні взаємодіяти з ліпідним матриксом мембран без попереднього залучення специфічних білкових рецепторів. Взаємодії біорегуляторів з мембранами опосередковуються ліпідним складом і залежать як від електростатичних, так і від гідрофобних ефектів. Аніонні ліпіди сприяють концентруванню БАР на поверхні мембрани, більш ефективне проникнення регуляторних пептидів спостерігається в мембрани, що складаються з нейтральних фосфоліпідів, тоді як холестерол і білки знижують активність взаємодії біорегуляторів з мембранним матриксом. Ефективність пептид-мембранної взаємодії залежить від гідрофільно-гідрофобного балансу пептидної молекули. Високі показники загальної гідрофобності при наявності полярних амінокислотних залишків (Z=0,3-0,8) сприяють активній інкорпорації пептидів в ліпідний матрикс. В той же час, такі ж або вищі показники гідрофобності при відсутності полярних залишків ведуть до істотного зниження активності пептид-мембранної взаємодії. При цьому мембранотропні властивості малих (2-13 амінокислотних залишків) регуляторних пептидів не мають прямої залежності від довжини молекули. Мембраноактивні регуляторні пептиди, подібно антибактеріальним пептидам, характеризуються зниженним вмістом гідрофільних амінокислот, за виключенням Gly, Arg+ та Gln і підвищенням сумарного вмісту гідрофобних амінокислот. Спектри гідрофобних амінокислотних залишків в РП і в антибактеріальних пептидах характеризуються протилежними тенденціями за вмістом більшості залишків. В регуляторних пептидах, на відміну від антибактеріальних, збільшений вміст залишків, що перешкоджають формуванню б-спіралей. Ці відмінності можуть лежати в основі мембраноселективності і різної дії двох класів пептидів. Різна гідрофобність енкефалінів, обумовлена єдиним С-кінцевим амінокислотним залишком, веде до різного прояву їх мембранотропної активності (Лей-енкефалін діє переважно в поверхневій зоні мембрани, тоді як молекули Мет-енкефаліну інкорпоруються в її матрикс), що може лежати в основі біологічного механізму вибору підтипу опіатного рецептора. Пептид-ліпідна взаємодія модулюється вмістом оптичних ізомерів амінокислот в їх молекулах. Встановлена достовірна різниця в пептид-мембранних взаємодіях між різними ізомерними формами дипептиду кіоторфіну і пряма залежність між активністю їх взаємодії з фосфоліпідним матриксом в ряду L-Tyr-L-Arg > D-Tyr-L-Arg ? L-Tyr-D-Arg >
D-Tyr-D-Arg і анальгетичною активністю цих форм.

Суфан (дикалієва сіль N-сукциніл-триптофану) проявляє мембранотропну
активність по відношенню до ліпідних моношарових мембран. L-форма суфану
є більш активною у порівнянні з D,L-формою. Провідна роль у виявленні
мембранотропних властивостей суфану належить фосфоліпідам. Білки і
холестерол знижують інтенсивність інкорпорації суфану, в першу чергу,
D,L-форми, що співпадає з результатами клінічних досліджень.

Пептид-мембранні взаємодії різноспрямовано модулюються іонним складом і
іонною силою субфази. В ряді Са2+> Mg2 > K+ відбувається пригнічення
взаємодії Лей-енкефаліну з полярною зоною фосфоліпідних мембран і
активація взаємодії Мет-енкефалінів, що може бути обумовлено різною
гідрофобністю двох енкефалінів. Підвищення іонної сили субфази до
фізіологічних значень активує пептид-мембранну взаємодію і інкорпорацію
меланостину в матрикс фосфоліпідної мембрани.

Гідрофільна гамма-аміномасляна кислота не здатна самостійно проникати в
матрикс мембрани, але інтенсивно адсорбується в зоні полярних ліпідних
головок. Максимальний ефект спостерігається при дії мікромолярних
концентрацій ГАМК. Роль взаємодії ГАМК із ліпідним матриксом обмежується
концентруванням препарату на поверхні мембрани, що є важливою умовою
ефективної подальшої ліганд-рецепторної взаємодії.

Досліджені мембранотропні властивості ксенобіотиків
2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти (2,4-Д) і N-оксид 2,6-диметилпіридину
(івіну). Взаємодія івіну з фосфоліпідними мембранами характеризується
швидким проникненням його в гідрофобний матрикс мембрани, тоді як 2,4-Д
переважно взаємодіє з полярними групами ліпідів мембран, що пояснюється
її аніонними властивостями. Двофазність процесів їх взаємодії з ліпідним
матриксом реалізується в параболічній концентраційній залежності їх
безрецепторного впливу на Mg2+,Ca2+-АТФазну активність плазматичних
мембран клітин печінки щура.

Встановлена висока мембранотропна активність і охарактеризовані її
параметри для ряду фітопрепаратів з радіо- і гепато-протективною дією.
Показана залежність змін мембранотропної активності від особливостей
отримання фітопрепарату, що може бути застосовано при подальшому пошуку
природних мембраностабілізаторів.

Запропоновано схему механізму реалізації ефектів пептидних і інших
біорегуляторів за участю ліпідного матриксу мембрани. На першому етапі
біорегулятори адсорбуються на мембрані за рахунок електростатичних
зв’язків. Наступним етапом є інкорпорація молекули біорегулятора в
гідрофобну зону ліпідного матриксу. Набуваючи єдиної конфігурації в
гідрофобному оточенні, молекули біорегуляторів ефективно взаємодіють з
мембранними рецепторами, утворюють іон-провідні структури, безпосередньо
взаємодіють з мембранними білками (АТФазами, G-білками і ін.), можливо є
субстратами для утворення внутрімембраних і внутріклітинних месенджерів
(наприклад, пептидної природи), локально змінюють фізико-хімічний стан
ліпідного матриксу, що приводить до зміни активності мембранних
ферментів і переходу мембрани як системи до іншого стаціонарного стану.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Рыбальченко В.К., Островская Г.В. Мембранотропная активность
нейрогипофизарных гормонов. – Луганськ, “Елтон-2”. – 1998. – 82 с.

Физиология и биохимия пищеварения человека и животных/ В.К.Рыбальченко,
Т.В. Береговая, М.Ю.Клевец, Е.А.Кондратюк, Г.В.Островская,
Т.В.Рыбальченко, А.Я.Скляров; Под ред.В.К.Рыбальченко. – К.:
Фитосоциоцентр, 2002. – 366 с.

Рыбальченко В.К., Островская Г.В., Рыбальченко В.К. Активная роль
липидного матрикса плазматических мембран в реализации эффектов
регуляторных пептидов //Тканевые регуляторные пептиды. Теоретические
аспекты и перспективы практического применения/ Веснина Л.Э., Гаркович
А.Л., Грицай Н.Н. и др.: Под общ.ред. И.П.Кайдашева, В.П.Мищенко, В.К.
Рыбальченко. – К.: “Здоров’я”, 2003. – С.309-330.

Могилевич Б.Р., Рыбальченко В.К, Островская Г.В. Теоретический подход к
определению мембранотропной активности регуляторных
пептидов//Биофизика.– 1995. – Т.40, №1. –С.95-97.

Островская Г.В., Рыбальченко В.К., Порало И.В. Взаимодействие
нейротензина с модельными мембранами // Вестн.пробл. биол.и мед. – 1996.
– №12. – С.21-26.

Коршак О.Л., Коцюба В.Л., Островська Г.В., Рибальченко В.К. Вплив мет- і
лей-енкефалінів на стимульовану пентагастрином шлункову секрецію //
Вісн. Київ. Ун-ту. Ін-т фізіол. – 1996. – Вип.2. – С.53-60.

Островська Г.В., Мельник Ю.М., Рибальченко В.К. Порівняльна
характеристика мембранотропної активності мет- і
лей-енкефалінів//Вісн.Київ.ун-ту. Пробл. регул. фізіол. функцій. – 1998.
– Вип.3. – С.65-69.

Порало І.В., Островська Г.В., Ковальчук Т.О. Поверхнева і мембранотропна
активність препаратів суфану різного складу (l- i
d,l-суфану)//Вісн.Київ.ун-ту.Пробл.регул.фізіол. функцій.– 1999.–
Вип.4.– С.34-38.

Мельник Ю.М., Островська Г.В., Цівінська С.М. Мембранотропна активність
оптичних ізомерів
кіоторфіну//Вісн.Київ.ун-ту.Пробл.регул.фізіол.функцій. – 1999. – Вип.4.
–С.57-60.

Рибальченко В.К., Порало І.В. Островська Г.В., Рибальченко Т.В., Мельник
Ю.М. Мембранотропна активність нейропептиду кіоторфіну та
кардіотонічного препарату суфану // Нейрофизиология. 1999. – Т.31, №3. –
С.266-269.

Гарник Т.П., Островська Г.В., Рибальченко В.К. Характеристика
мембранотропних властивостей спиртових настоянок
фітопрепаратів//Зб.наук. праць. співр. КМАПО ім. П.Л. Шупика. К., 2000.
– Вип.9, Кн.2, – С.189-199.

Рибальченко Т.В., Островська Г.В., Кондратюк Е.А., Мельник Ю.Н., Гурняк
О.М., Рибальченко В.К. Безрецепторная межклеточная химическая
сигнализация // Нейрофизиология. – 2000. – Т.32, №3. – С.281-282.

Порало І.В., Островська Г.В. Рибальченко В.К. Мембранотропні ефекти
неглікозидного кардіотонічного препарату суфан//Доп. НАН України.
Біологія. – 2000. – № 4. – С.195-198.

Чекман І., Горчакова Н., Олійник С., Середенко М., Гудивок Я., Барабой
В., РибальченкоВ., Островська Г., Порало І., Ніженковська І.. Динаміка
перекисного окислення ліпідів в органах щурів при опроміненні та
антиоксидантний ефект суфану // Галицьк. лікарськ. вісник. – 2000. –
Т.7, №2. – С.85-88.

Гарник Т.П., Островська Г.В., Рибальченко В.К. Мембранотропна активність
трав’яних зборів з гепатопротекторними властивостями//Гастроентерологія.
– 2000. –Вип.31. –С.375-380.

Кучеренко М.Є., Рибальченко Т.В., Островська Г.В., Рибальченко В.К.
Миготлива модель молекулярної організації плазматичної мембрани//Доп.НАН
України. Біологія. – 2001. – №7. – С.149-152

Островська Г.В., Поканевич В.В., Гарник Т.П., Філінська О.М.,
Рибальченко В.К. Мембранотропна активність фітопрепарату
Поліфітол-1//Вісн.Київськ.ун-ту. Пробл. регул. фізіол. ф-цій. – 2001. –
Вип.7. – С.41-44.

Островська Г.В., Поканевич В.В. Гарник Т.П. Рибальченко В.К.
Характеристика мембранотропних властивостей спиртових екстрактів
фітопрепаратів//Доп. НАН України. Біологія. – 2001. – №8. – С.152-156.

Ostrovska G., Rybalchenko V., Rybalchenko T., Filinska O. Decrease of
hepatotoxic effect of herbicide 2,4-D by plant growth regulator
ivin//Ann.Universitatis Mariae Curie-Skіodowska Lublin-Polonia – 2002. –
Vol.XV. – N36. – P.425-428.

Рибальченко В.К., Островська Г.В., Рибальченко Т.В. Мембранотропні
ефекти біорегуляторів: 1. Ендогенні пептиди//Фітотерапія. – 2002. – №
1-2. – С.53-59.

Островська Г.В., Яблонська С.В., Філінська О.М., Рибальченко Т.В., Бабіч
Л.В. Гепатотоксичні ефекти тривалого інтрагастрального введення щурам
2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти й регулятора росту рослин
івіну//Вісн.Київськ.ун-ту.Пробл.регул.фізіол.ф-цій. – 2004. –Вип.9. –
С.56-57.

Нова методика добору співвідношення компонентів фітозборів на основі їх
мембранотропних властивостей Реєстр. № 249/19/03 /Гарник Т.П.,
Островська Г.В., Рибальченко В.К., Рибальченко Т.В./Реєстр галузевих
нововведень МОЗ України. –К., 2003. –Вип.18-19. –С.174-1 75.

Рибальченко В.К., Островська Г.В., Могилевич Б.Р., Демченко І.Б.
Використання модельних мембран у дослідженнях ефектів біологічно
активних речовин//II наук.-практ.конф.з народ. та нетрад. мед. – К.,
1996. – С.55-56.

Островська Г.В., Рибальченко В.К., Порало І.В., Мельник Ю.М.
Мембранотропні властивості бальзаму “Поліфітол-1”//ІІІ
наук.-практ.конф.з нетрад.медиц. – К., 1997.- С.60-61.

Островська Г.В., Рибальченко В.К., Мельник Ю.М. Вплив іонів металів і
іонної сили електроліту на мембранотропні властивості мет- і
лей-енкефалінів //VII Укр.біохім. з’їзд. К., 1997.– Ч.1. – С.48.

Островська Г.В., Рибальченко В.К. Характеристика мембранотропних
властивостей бальзаму “Поліфітол-1”//”Поліфітол-1”. – К.: КМІ УАНМ,
1998. – С.8-12.

Островська Г.В., Рибальченко В.К., Мельник Ю.М., Порало І.В.,
Рибальченко Т.В. Роль оптичної ізомерії в мембранотропній активності
кіоторфіну// XV з’їзд Укр. фізіол.т-ва. — Київ, 1998. / Фізіолог.журн. –
1998. – Т.44, №3. – С.11.

Рибальченко В.К., Островська Г.В., Могилевич Б.Р., Ковальчук Т.О.,
Порало І.В., Цівінська С.М., Рибальченко Т.В. Коцюба В.Л., Кондратюк
О.А., Мельник Ю.М., Савчук О.М., Бичко А.В. Роль мембранних ліпідів в
міжклітинній хімічній сигналізіції // ІI з’їзд Укр. біофіз.тов-ва. –
Харків, 1998. – С.90.

Горчакова Н.О., Рибальченко В.К., Островська Г.В, Олійник С.А.,
Ніженковська І.В. Поверхнева та мембранотропна активність препаратів
суфану різного складу (l- i d,l-суфану) // ІI з’їзд Укр. біофіз.тов-ва.
– Харків, 1998. – С.107.

Островская Г.В., Рыбальченко В.К. Физико-химические особенности
пептидной молекулы определяют мембранотропные свойства биорегулятора
//XVI Менделеевский съезд по общ. и прикл. химии. – С.-Пб., 1998. –
С.105.

Рыбальченко В.К., Островская Г.В. Липидный путь химической межклеточной
сигнализации//XVI Менделеевский съезд по общ. и прикл. химии. – С.-Пб.,
1998. – С.124.

Островська Г.В., Рибальченко В.К., Порало І.В. Мембранотропна активність
спиртового екстракту кореневища лепехи звичайної (Acorus calamus)//IV
Міжнар.конф. “Інформо-терапія:теор.асп. і практ.застосув.” К., 1998 /
Інформ.та негентр.мед. – 1998. – Вип.1. – С.24.

Рибальченко В.К., Островська Г.В., Могилевич Б.Р., Ковальчук Т.О.,
Рибальченко Т.В., Порало І.В., Цівінська С.М., Бичко А.В. Інформаційні
аспекти взаємодії регуляторних пептидів з мембранами// IV Міжнар.конф.
“Інформотерапія:теор.асп. і практ.застосув.” К., 1998 / Інформ.та
негентр.мед. – 1998. – Вип.1. – С.28.

Островська Г.В., Порало І.В., Ковальчук Т.О., Ніженковська І.В.,
Рибальченко В.К. Первинні механізми взаємодії кардіотонічного препарату
суфану з мембранами // V Міжнар.конф. “Інформотерапія: теор.асп. і
практ.застосув.” К., 1999 / Інформ.та негентр. мед. – 1999. – Вип.1. –
С.74-75.

Рибальченко В.К., Островська Г.В., Рибальченко Т.В. Роль липидов в
рецепции химических информационных сигналов // V
Міжнар.конф.“Інформотерапія: теор. асп. і практ.застосув.” К., 1999 /
Інформ.та негентр.мед. – 1999. – Вип.1. – С.78-79

Порало И.В., Островская Г.В., Рыбальченко В.К. Мембранотропные эффекты
негликозидного кардиотонического препарата суфан// Всерос.науч.конф. с
муждунар. участием, посв.150-летия со дня рожд. И.П. Павлова. – С.-Пб.,
1999. – С.245.

Гарник Т.П., Островська Г.В., Рибальченко В.К., Поканевич В.В. Вивчення
механізму дії засобів рослинного походження щодо корекції
функціонального стану гепатобіліарної та гастродуоденальної системи//V
з’їзд фармац.України. – Харків, 1999. – С.113.

Гарник Т.П., Островська Г.В., Рибальченко В.К., Поканевич В.В.
Гепатопротекторна дія препаратів ехінацеї пурпурової (Echinacea
purpurea) у відновно-реабілітаційній терапії хворих різних вікових груп
//ІІІ Нац.Конгр. геронтологів і геріатрів Укр.– К., 2000. – С.31.

Островська Г.В., Рибальченко В.К., Боровикова Г.С., Пономаренко С.П.,
Рибальченко Т.В. Взаємодія регулятора росту рослин Івіну з модельними
фосфоліпідними мембранами// І з’їзд токсикологів України. –К., 2001. –
С.62.

Харчук І.В., Островська Г.В., Рибальченко В.К. Мембранотропні,
цитолого-гістологічні та біохімічні ефекти кардіотонічного засобу суфану
— похідної сполуки бурштинової кислоти //Всеукр. Наук.конф. “Актуальні
пробл. гастроентерології” – Київ, 2001. – С.55.

Островська Г.В., Решетнік Є.М, Долгова О.М., Рибальченко Т.В
Фізіологічна і мембранотропна активність природних енкефалінів і пептиду
љ-77 – їх синтетичного аналогу// ІІІ з’їзд Укр.біофіз.т-ва. – Львів,
2002. – С.80.

Островська Г.В., Рибальченко В.К., Яблонська С.В., Філінська О.M.
Дослідження механізмів сумісної дії гербіциду 2,4-Д і регулятора росту
рослин івіну //ІІІ з’їзд Укр.біофіз.т-ва. – Львів, 2002. – С.118.

Островская Г.В., Бычко А.В., Карпезо Н.О., Мацюх О.С., Рыбальченко В.К.,
Сютикова О.В. Взаимодействие ивина с липидными мембранами и базисные
механизмы реализации биологической активности препарата// ІХ
Міжнар.конф. “Інформотерапія: теор.асп.і практ.застосув.” К., 2003 /
Інф.та негентр. мед. – 2003. – Вип.1. – С.81-82.

Яблонська С., Островська Г., Рибальченко Т., Філінська О. Порівняльний
аналіз впливу гербіциду 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти на дві форми
Mg2+, Ca2+-АТФазної активності плазматичної мембрани гепатоцитів щурів//
Міжнар. Наук-практ.конф. студ., асп. та молод. вчених “Шевченківська
весна”, присв.190-річчю з дня народж.Т.Шевченка та 170-річчю заснування
Київського ун-ту. – Київ, 2004. Вип.ІІ. . – С. 39-40.

Яблонська С., Островська Г., Рибальченко Т., Зеленюк В., Філінська О.
Вплив неорганічних іонів на взаємодію енкефалінів з ліпідними
мембранами// Міжнар. Наук-практ.конф. студ., асп. та молод. вчених
“Шевченківська весна”, присв.190-річчю з дня народж.Т.Шевченка та
170-річчю заснуванняКиївського ун-ту. – Київ, 2004. Вип.ІІ.– С. 42-43.

Островська Г.В., Рибальченко В.К., Рибальченко Т.В. Особливості
взаємодії пентагастрину з ліпідним матриксом мембран //
Міжнар.наук.конференція “Клітинні і субклітинні механізми функціонування
травної системи”, приуроч. до 80-ліття з дня народж. проф.
І.В.Шостаковської. – Львів, 2004. – С.57-58.

Яблонська С.В., Островська Г.В., Рибальченко Т.В., Зеленюк В.О.,
Філінська О.М., Рибальченко В.К. Порівняння ефектів гербіциду
2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти та регулятора росту рослин івіну на дві
форми Mg2+, Ca2+-АТФазної активності плазматичних мембран гепатоцитів
щурів//ІІ з’їзд токсикологів Укр. – К., 2004. – С.72-73.

АНОТАЦІЇ

Островська Г.В. Первинні механізми мембраномодулюючої дії біорегуляторів
природного і синтетичного походження. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за
спеціальністю 03.00.02 – біофізика. – Київський національний
університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2004.

Дисертація присвячена з’ясуванню первинних механізмів мембраномодулюючої
дії біорегуляторів природного і синтетичного походження і активної ролі
ліпідного матриксу мембран в цих процесах. Досліджено особливості
взаємодії бірегуляторів з модельними ліпідними і ліпопротеїновими
мембранами різного складу. Показано, що досліджені речовини з різною
ефективністю здатні взаємодіяти з ліпідним матриксом мембран без
попереднього залучення специфічних білкових рецепторів. Ефективність цих
процесів залежить від електростатичних і гідрофобних взаємодій.
Пептид-ліпідна взаємодія модулюється вмістом оптичних ізомерів
амінокислотних залишків в їх молекулах, іонним складом і іонною силою
субфази. Не виявлено прямої залежності мембранотропних властивостей
регуляторних пептидів від довжини молекули. Пояснюється роль ліпідної
фази у виборі підтипу рецептора при взаємодії пептидів з мембраною.
Провідна роль в прояві мембранотропних властивостей досліджених
біорегуляторів належить фосфоліпідам, тоді як білки і холестерол
знижують інтенсивність їх інкорпорації. Встановлена висока
мембранотропна активність і охарактеризовані її параметри для ряду
фітопрепаратів з радіо- і гепато-протективною дією. Показана залежність
змін цієї активності від особливостей отримання фітопрепарату, що може
застосовуватись при подальшому пошуку природних мембраностабілізаторів.
Запропоновано схему механізму реалізації ефектів пептидних і інших
біорегуляторів за участю ліпідного матрикса мембрани.

Ключові слова: Регуляторні пептиди, ліпідний матрикс, мембранотропність,
безрецепторні ефекти, модельні мембрани, плазматичні мембрани, похідні
амінокислот, фітопрепарати, ксенобіотики.

Островская Г.В. Первичные механизмы мембраномодулирующего действия
биорегуляторов природного и синтетического происхождения. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по
специальности 03.00.02 – биофизика. – Киевский национальный
университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2004.

Диссертация посвящена выяснению первичных механизмов
мембраномодулирующего действия биорегуляторов и активной роли липидного
матрикса мембран в этих процессах. Изучены особенности взаимодействия
ряда регуляторных пептидов (киоторфин и его оптические изомеры,
тиролиберин, меланостатин, пентагастрин, Мет- і Лей-енкефалины, их
синтетический аналог S-77, нейротензин), производных аминокислот
(гамма-аминомасляная кислота и дикалиевая соль N-сукцинил-триптофана –
суфан), ксенобиотиков (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота и N-оксид
диметил-пиридина) и фитопрепаратов с модельными мембранами. Показано,
что исследованные вещества в различной степени способны
взаимодействовать с липидным матриксом мембран без вовлечения
специфических белковых рецепторов. Мембранотропные регуляторные пептиды
(РП) характеризуются сниженным содержанием гидрофильных аминокислотных
остатков, за исключением Gly, Arg и Gln, и повышеннием суммарного
содержания гидрофобных остатков по сравнениею со средними значениями в
белках эукаритов. В спектре гидрофобных аминокислотных остатков в РП
отмечаются противоположные тенденции по сравнению с мембраноактивными
антибактериальными пептидами, что может лежать в основе
мембраноселективности и разного действия двух классов пептидов.
Связывание эндогенных биорегуляторов с мембранами зависит как от
электростатических, так и от гидрофобных взаимодействий с липидным
матриксом и модулируется ионным составом и ионной силой субфазы. Более
эффективно РП встраиваются в нейтрально заряженные мембраны. Однако, при
взаимодействии с кислыми липидами значительно снижается минимальная
действующая концентрация биорегуляторов. Эффективность
пептид-мембранного взаимодействия зависит от гидрофильно-гидрофобного
баланса пептидной молекулы. Высокие показатели общей гидрофобности при
наличии полярных аминокислотных остатков способствуют активной
инкорпорации пептидов в липидный матрикс. Однако, такие же или высшие
показатели гидрофобности при отсутствии полярных остатков ведут к
снижению активности или полной инактивации пептид-мембранного
взаимодействия. Наличие холестерола и белков в составе мембран снижают
эффективность взаимодействия биорегуляторов с мембранным матриксом. На
примере энкефалинов показана возможная роль липидной фазы в выборе
подтипа рецептора этими биорегуляторами. Пептид-липидные взаимодействия
модулируются содержанием оптических изомеров аминокислот в их молекулах.
Установлено достоверное различие во взаимодействиях изомерных форм
дипептида киоторфина с фосфолипидным матриксом, соответствующее различию
в их анальгетической активности. Суфан также проявляет мембранотропную
активность по отношению к липидным монослойным мембранам, при этом
L-форма суфана более активна по сравнению с D,L-формой. Ведущая роль в
проявлении мембранотропных свойств суфана принадлежит фосфолипидам,
тогда как белки и холестерол снижают интенсивность его инкорпорации, в
первую очередь, D,L-формы, что совпадает с результатами клинических
исследований. Гидрофильная гамма-аминомасляная кислота, не проникая в
матрикс мембраны, интенсивно адсорбируется в зоне полярных липидных
головок, с максимальным эффектом при микромолярных концентрациях. Роль
взаимодействия ГАМК с липидным матриксом ограничивается
концентрированием препарата на поверхности мембраны, что является важным
условием дальнейшего эффективного лиганд-рецепторного взаимодействия.
Исследованы мембранотропные свойства гербицида 2,4-дихлорфеноксиуксусной
кислоты и регулятора роста растений ивина (N-оксид 2,6-диметилпиридина).
Показано, что взаимодействие ивина с фосфолипидными мембранами
характеризуется его быстрым проникновением в гидрофобный матрикс.
Процесс активируется с увеличением плотности упаковки в мембране и имеет
тенденцию к двуфазности. 2,4-Д взаимодействует преимущественно с
полярными группами мембранных липидов. Оба препарата оказывают
двухфазное влияние на АТФазные активности ПМ клеток печени. Установлена
высокая мембранотропная активность и охарактеризованы ее параметры для
ряда фитопрепаратов с гепатопротективным действием. Показана ее
зависимость от особенностей получения фитопрепарата, что может
применяться при дальнейшем поиске природных мембраностабилизаторов.
Предложена схема механизма реализации эффектов пептидных и других
биорегуляторов при участии липидного матрикса мембраны. На первом этапе
биорегуляторы адсорбируются на мембране за счет электростатических
взаимодействий. Следующим этапом является инкорпорация молекулы
биорегулятора в гидрофобную зону липидного матрикса. Приобретая единую
конформацию в гидрофобном окружении, молекулы биорегуляторов эффективно
взаимодействуют с мембранными рецепторами и другими мембранными белками,
образуют ион-проводящие структуры, возможно, служат субстратами для
образования внутримембранних и внутриклеточных мессенджеров (например,
пептидной природы), локально изменяют физико-химическое состояние
липидного матрикса, что ведет к изменению активности мембранных
ферментов и переходу мембраны как системы к другому стационарному
состоянию.

Ключевые слова: Регуляторные пептиды, липидный матрикс,
мембранотропность, безрецепторные эффекты, модельные мембраны,
плазматические мембраны, производные аминокислот, фитопрепараты,
ксенобиотики.

Ostrovska G.V. Primary mechanisms of membrane modulating action of
bioregulators of nature and synthetic origine. – Manuscript.

Dissertation for scientific degree of doctor the biological sciences
03.00.02 – biophysics. – Taras Shevchenko Kyiv National University,
Kyiv, 2004.

The thesis is devoted to finding-out of primary mechanisms of membrane
modulating action of natural and synthetic bioregulators and to active
role of a membrane lipide matrix in these processes. The features of
interaction of bioregulators with model lipide and lipoprotein membranes
of different composition are investigated. It was displaied, that the
studied substances are capable to interact with a lipide matrix of
membranes with different efficiency without precursor involving of
specific protein receptors. The efficiency of these processes depends on
electrostatic and hydrophobic interpaсtions. The peptide-lipide
interactions are modulated by the contents of optical isomers of
aminoacidic residues in their moleculas, by ionic composition and ionic
strength of a subphase. It is not revealed direct relation of
membrane-tropic properties of the regulator peptides from length of
their molecula. The role of a lipide phase in selection of a subtype of
a receptor at peptide-membrane interaction is explained. The leading
role in a display of membrane tropic properties of investigated
bioregulators belongs to the phospholipids, whereas the proteins and
cholesterol reduce intensity of their incorporation. The high
membrane-tropic activity for a series of hepatoprotective phytomedicine
is established and its parameters are described. The relation of changes
of this activity to features of phytomedicine obtaining is displayed. It
can be applied by further search of natural membrane stabilizers. It is
offered the scheme of the mechanism of realization of bioregulators
effects with assistance of membrane lipide matrix.

Keywords: Regulator peptides, lipide matrix, membrane tropic activity,
unreceptor effects, model membrane, plasma membrane, amino acid
derivates, phytomedicine, xenobiotics.

PAGE \* Arabic 32

PAGE \* Arabic 32

Похожие записи