НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМIЯ НАУК УКРАЇНИ

IНСТИТУТ КЛIТИННОЇ БIОЛОГIЇ ТА ГЕНЕТИЧНОЇ IНЖЕНЕРIЇ

На
правах рукопису

Овчаренко Ольга Олександрівна

УДК 577.21+575.222.7+582.683.2

Отримання міжтрибних соматичних гібридів родини brassicaceae, що містять
активну гетерологічну систему транспозонів кукурудзи SPM/DSPM

Спецiальнiсть 03.00.20 — Біотехнологія

Автореферат

дисертацiї на здобуття наукового ступеня

кандидата бiологiчних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі генетичної інженерії Інституту клітинної
біології та генетичної інженерії Національної Академії Наук України.

Науковий кеpiвник: доктор біологічних наук Кучук Микола Вікторович,

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН

України, заст. завідуючого відділу генетичної інженерії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук Парій Федір Микитович,

Інститут цукрових буряків УААН, провідний науковий

співробітник лабораторії селекції цукрових буряків

кандидат біологічних наук

Спірідонова Катерина Василівна, Інститут молекулярної

біології та генетики НАН України, старший науковий

співробітник відділу генетики клітинних популяцій

Провідна установа: Інститут фізіології рослин і генетики НАН України

Захист відбудеться 27.10.2005 р. о 14 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д.26.202.01 при Інституті клітинної біології
та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул.
aкад. Заболотного, 148

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту клітинної
біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143,
Київ-143, вул. aкад. Заболотного, 148

Автореферат розіслано23.09. 2005 р.

Вчений секретар
О.А.Кравець

спеціалізованої вченої ради

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Мобільні генетичні елементи рослин, або, як їх ще
називають, транспозони, починаючи з класичних робіт лауреата
Нобелівської премії Б. МакКлінток, являють собою унікальну генетичну
систему для вивчення мінливості та нестабільності геному. Їх
використовують для мічення та клонування генів (Aarts et al., 1993;
Cardon et al., 1993; Majira et al., 2002), створення серій трансгенних
ліній з різним геномним розташуванням трансгенів (Goldsborough et al.,
1993), отримання безмаркерних трансгенних рослин, що не несуть генів
стійкості до антибіотиків (Yoder, Goldsbrough, 1994; Ebinuma et al.,
1997). Раніше було показано, що в межах одного геному є можливою
транспозиція мобільного елемента з однієї хромосоми на іншу (B?iza et
al., 2002). Однак, транспозиція мобільних елементів між різними геномами
досі ще не виявлена. Встановлення та дослідження такого процесу має
неабияке теоретичне значення, а також може бути застосоване в практичних
дослідженнях для швидкого переносу гена, що цікавить, від рослини-донора
до різних сортів сільськогосподарських видів без руйнування їх
унікальних генетичних ознак. Але для дослідження цього процесу необхідно
створити гібриди, які містили б хромосоми двох чи більше видів, один з
яких буде донором транспозона. Для виду, який буде використаний як донор
мобільного елемента, повинна існувати надійна система генетичної
трансформації.

Представник родини Brassicaceae триби Sisymbriae Arabidopsis thaliana L.
є модельним об’єктом для генетичних досліджень, одним з двох видів
рослин, чий геном сиквеновано. Рослини цього виду легко трансформувати
як in vitro, так і in vivo. Статева гібридизація між A.thaliana та
представниками триби Brassicaе, до якої належить більшість культивованих
видів, не була успішною через значну філогенетичну віддаленість між
ними. В той же час існує ряд повідомлень про успішну соматичну
гібридизацію. Так, на сьогодні є повідомлення про отримання соматичних
гібридів A.thaliana з Brassica campestris (Gleba, Hoffman, 1980),
B.nigra (Siemens, Sacristan, 1995), B.oleracea (Нітовська, 1997),
B.napus (Bauer-Weston et al., 1993; Forsberg et al., 1994; Yamagishi et
al, 2002), Raphanus sativus (Yamagishi et al., 2003). У низці робіт
(Gleba, Hoffman, 1980; Forsberg et al., 1994; Yamagishi et al., 2003)
при соматичній гібридизації культурних видів триби Brassicaе з
A.thaliana спостерігали часткову елімінацію батьківських хромосом у ряду
гібридних клонів. Тому, використання методів соматичної гібридизації
може бути корисним при створенні систем, придатних для вивчення
міжгеномних переміщень транспозонів. При віддаленій соматичній
гібридизації можлива транспозиція мобільного елемента з одного генома на
інший та подальша втрата хромосоми виду-донора з сайтом первинної
інтеграції транспозона. Переміщення мобільного елемента можна буде
простежити за збереженням в геномі реципіента здатного до транспозиції
трансгена, оточеного послідовностями мобільного елемента, та за
відсутністю інших трансгенів, які будуть залишатися в геномі
виду-донора.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження
проводились в рамках бюджетних тем відділу цитофізіології та клітинної
їнженерії ІКБГІ НАНУ (з 2000 р. – відділ генетичної інженерії) “Вивчення
молекулярно-біологічних та генетичних процесів у трансгенних та
трансгеномних клітинних лініях та рослинах” (1999 р.), “Дослідження
біологічних процесів у генетично модифікованих рослинах” № ДР
0101U000390 (2000 – 2004 рр.) та “Створення нових генетичних конструкцій
та отримання на їх основі трансгенних рослин методами пластомної та
генетичної інженерії за допомогою високоефективних методів
трансформації” № ДР 0102U006018 (з 2002 р).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було отримання міжтрибних
соматичних гібридів у представників родини Brassicaceae та вивчення у
них активності гетерологічної системи транспозонів кукурудзи Spm/dSpm.

Згідно з поставленою метою в завдання роботи входило:

1. Методом соматичної гібридизації отримати міжтрибні гібриди у таких
комбінаціях: Brassica juncea+Arabidopsis thaliana, B.napus+A.thaliana,
Orychophragmus violaceus+A.thaliana, O.violaceus+(B.juncea+A.thaliana).

2. Провести аналіз ядерного та цитоплазматичного геномів отриманих
гібридів.

3. Дослідити активність системи мобільних генетичних елементів кукурудзи
Spm/dSpm в отриманих гібридах.

Об’єкт дослідження – активність гетерологічних мобільних генетичних
елементів у соматичних гібридах.

Предмет дослідження – отримання соматичних гібридів між лініями ядерних
трансформантів A.thaliana, що містять Spm/dSpm систему мобільних
елементів, і рядом культивованих та диких видів: B.juncea + A.thaliana,
B.napus + A.thaliana, O.violaceus + A.thaliana,
O.violaceus+(B.juncea+A.thaliana); їх морфологічний, біохімічний і
молекулярно-біологічний аналізи, дослідження присутності та експресії
трансгенів у отриманих гібридів.

Методи дослідження – методи культивування рослин in vitro (методика
виділення та культивування протопластів, методика соматичної
гібридизації шляхом ПЕГ-опосередкованого злиття протопластів); методики
морфологічного, біохімічного та молекулярно-біологічного аналізу
отриманих соматичних гібридів (вивчення спектрів множинних форм
естерази, амілази, аспартатамінотрансферази, малатдегідрогенази,
пероксидази, ПЛР-ПДРФ, RAPD); методики аналізу присутності трансгенів та
їх експресії (ПЛР, тест на гістохімічне виявлення активності
?-глюкуронідази).

Наукова новизна.

?З використанням транспозону кукурудзи Spm вперше створено систему,
придатну для дослідження міжгеномної транспозиції мобільних генетичних
елементів рослин.

?Вперше отримано міжтрибні соматичні гібриди шляхом злиття ізольованих
протопластів у таких комбінаціях: B.juncea + A.thaliana, O.violaceus +
A.thaliana, O.violaceus+(B.juncea+A.thaliana).

?Вперше у родині Brassicaceae були отримані рослини-регенеранти при
поєднанні геномів 4 видів.

?Вперше показано активність гетерологічної системи мобільних елементів
кукурудзи Spm/dSpm у міжтрибних соматичних гібридах B.juncea +
A.thaliana, B.napus + A.thaliana, O.violaceus + A.thaliana.

Практична цінність роботи. Розроблено підходи, які дозволяють досить
швидко і легко отримувати соматичні гібриди між
філогенетично-віддаленими представниками родини Brassicaceae. Підходи
можуть бути використані для отримання гібридних рослин методом
соматичної гібридизації у інших міжвидових комбінаціях представників
цієї родини.

На основі соматичних гібридів було створено систему, яка дозволить
дослідити можливість міжгеномного переміщення гетерологічної системи
транспозонів кукурудзи Spm/dSpm.

Отримані гібридні рослини можна використати для мічення та клонування
генів. Колекція рослин, які містять активний мобільний генетичний
елемент кукурудзи Spm/dSpm, може бути використана для створення геномних
бібліотек. Послідовності мобільного елемента відіграють при цьому роль
міток, полегшуючи процес клонування генів.

Отримані в ході роботи результати використовуються у навчальному процесі
на кафедрі клітинної біології у Національному університеті ім.
Т.Г.Шевченка.

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок здобувача полягає в
розробці завдань досліджень, проведенні всіх основних експериментів і
дослідів, аналізі літератури, підготовці та написанні наукових статей.
Спільно з науковим керівником проведено вибір об’єктів і напрямку
досліджень, розробку структури дисертаційної роботи. Насіння
трансгенного арабідопсису було люб’язно надано фірмою “Icon Genetics
GmbH” (ФРН).

У проведенні досліджень та їх узагальненні частка автора складає 80%.
Всі дослідження виконувались за безпосередньою участю здобувача,
отримані результати обговорено та опубліковано в спільних публікаціях.

Апробація роботи. Матеріали дисертаційної роботи доповідались і
обговорювались на міжнародній науковій конференції “Biotechnology
approaches for exploitation and preservation of plant resources” (2002
р., Ялта, Україна), на міжнародній науковій конференції “Фактори
експериментальної еволюції” (2004 р., Алушта, Україна), на міжнародній
науковій конференції “Молекулярная генетика, геномика и биотехнология”
(2004 р., Мінськ, Бєларусь), на IХ конференції молодих дослідників,
присвяченій 100-річчю від дня народження академіка АН УРСР і ВАСГНІЛ
П.А. Власюка “Актуальні проблеми фізіології, генетики та біотехнології
рослин і грунтових мікроорганізмів” (2005 р., Київ, Україна), а також на
наукових семінарах відділу генетичної інженерії Інституту клітинної
біології та генетичної інженерії НАН України.

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 6 наукових робіт, з
них три наукові фахові статті.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із списку умовних
скорочень, вступної частини, огляду літератури, матеріалів і методів,
результатів досліджень та їх обговорення, висновків і списку літератури,
що містить 260 посилань. Робота викладена на 161 сторінках, включає 15
таблиць та 52 рисунки.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Рослинний матеріал. В роботі було використано асептичні рослини таких
видів родини Brassicaceae:

1) рослини дикого типу видів триби Brassicae: гірчиці сарептської
Brassica juncea (L.) Czern. & Coss. сорту Green in Snow, ярого ріпаку
(Brassica napus L.) (сорти Westar і Калинівський) та Orychophragmus
violaceus (L.) O.E. Schulz;

2) рослини Arabidopsis thaliana L., (триба Sisymbriae) трансформовані
конструкцією, яка містить гетерологічну систему мобільних генетичних
елементів Spm/dSpm (рис. 1). Насіння арабідопсису було люб’язно надано
фірмою “Icon Genetics GmbH” (ФРН).

Насіння B.juncea, B.napus та O.violaceus стерилізували 2 хв у 70%
етанолі та 15 хв у комерційному розчині “Білизна”. Насіння A. thaliana
витримували 1 хв в 70% етанолі і 5 хв у розчині “Білизна”. Після
стерилізації матеріал тричі відмивали в стерильній дистильованій воді,
підсушували на фільтрувальному папері та висівали на тверде живильне
середовище В5 (Gamborg et al., 1968). Насіння пророщували при
температурі 25?C, освітленості 3000 лк, фотоперіоді – 16 год. Надалі
асептичні рослини підтримували в культурі in vitro живцюванням. Для
експериментів використовували рослини віком 3 – 4 тижні.

Виділення протопластів та соматична гібридизація. Протопласти гірчиці,
ріпаку, O.violaceus та арабідопсису виділяли за описаною раніше
методикою (Овчаренко та інші, 2004). Співвідношення, у яких змішували
протопласти, дещо відрізнялися в залежності від батьківських видів.
Протопласти B.juncea, B.napus або O.violaceus змішували з протопластами
A.thaliana у співвідношенні 3:1, тоді як протопласти O.violaceus з
протопластами гібриду j56 – у співвідношенні 6:1.

Злиття протопластів проводили за модифікованою методикою Menczel et al.
(1981). Протопласти культивували в темряві при 25?С протягом 7 діб на
середовищі SW1 (Sidorov et al., 1987). Після перших поділів до суспензії
протопластів додавали рівний об’єм середовища SR (Овчаренко та інші,
2004), культивували при температурі 25?C, освітленості 3000 лк,
фотоперіоді – 16 год.

У випадку, коли одним із партнерів при соматичній гібридизації були
B.juncea чи B.napus, отримані на рідкому середовищі колонії переносили
на агаризоване регенераційне середовище FH (Овчаренко та інші, 2004) з
додаванням 5,0 мг/л фосфінотрицину). Для регенерації гібридів, отриманих
за участю рослин O.violaceus макроколонії переносили на модифіковане
агаризоване регенераційне середовище B5 (Gamborg et al., 1968) з
додаванням 0,2 М маннітолу, 4,5 мг/л БАП та 5,0 мг/л фосфінотрицину. При
отриманні гібридів B.juncea+A.thaliana застосовували також середовище
K2I02 (модифіковане B5 з додаванням 2,0 мг/л Кін, 0,2мг/л ІОК та 10,0
мг/л фосфінотрицину). Регенеранти переносили на безгормональне
середовище B5 з 10,0 мг/л фосфінотрицину.

Гістохімічне виявлення експресії гена ?-?люкуронідази. Виявлення
активності GUS проводили шляхом гістохімічної реакції за методикою
Jefferson et al. (1987).

Молекулярно-біологічний і біохімічний аналіз гібридних ліній. За
допомогою ПЛР, RAPD та ПЛР-ПДРФ аналізували ділянки ядерної ДНК
гібридів. Хлоропластну та мітохондріальну ДНК аналізували за допомогою
ПЛР-ПДРФ. Присутність трансгенів у отриманих рослинах доводили за
допомогою ПЛР. Для аналізів використовували тотальну ДНК, яку виділяли з
рослинного матеріалу за методикою Cheung et al. (1993). Плазмідну ДНК,
яку використовували як позитивний контроль, виділяли з використанням
набору для виділення ДНК Qiagen tip 100 (Qiagen, ФРН), відповідно до
наданого протоколу.

Аналiз множинних молекулярних форм амілази, аспартатамінотрансферази,
естерази, малатдегідрогенази та пеpоксидази проводили за стандартними
методиками (Биохимический анализ в клеточной биологии растений. – Киев.
– 1988. – Препринт /АН УССР, Институт ботаники, 88.1).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Схеми селекції соматичних гібридів. Нами був запропонований підхід до
створення модельної системи, за допомогою якої можна буде виявити
транспозицію мобільних генетичних елементів з генома одного виду на
геном іншого. Для цього необхідно створити гібридні рослини, в геномі
яких відбувалася б втрата генетичного матеріалу одного з батьків.
Віддалена гібридизація є перспективним підходом для створення таких
рослин, адже саме у віддалених гібридах досить часто спостерігали
спонтанну втрату хромосом одного з батьківських видів (Tabaeizadeh et
al., 1985; Turpin et al., 1986; Sundberg E., Glimelius,1991; Babiychuk
et al.,1992; Ananiev et al., 1997; Yamagishi et al., 2003). Однак
статева гібридизація часто неможлива навіть між видами – представниками
різних родів однієї родини. Метод соматичної гібридизації спрощує
процедуру отримання віддалених гібридів, оскільки дозволяє поєднувати
геноми видів, несумісних при статевих схрещуваннях (Глеба Ю.Ю., Сытник
К.М., 1984; Waara S., Glimelius K., 1995).

Для дослідження процесів транспозиції нами був використаний мобільний
генетичний елемент кукурудзи Spm. Перевага системи En/Spm над
представниками інших класів ДНК-транспозонів полягає в тому, що вони
здатні переміщуватися у незчеплені локуси (Greco et al., 2004). Це
збільшує вірогідність перестрибування мобільного елемента на інший
геном. В нашій роботі ми застосували не нативний, а модифікований
генно-інженерними методами Spm елемент. Як відомо, нативний мобільний
генетичний елемент може бути представленим у двох формах: автономній
(Spm) та неавтономній (dSpm). Модифікації використаної в нашій роботі
системи Spm елементів полягали в тому, що автономний елемент був
позбавлений одного з термінальних повторів. Внаслідок цього він втрачав
здатність до транспозиції, але зберігав функції джерела транспозази.
Послідовність ДНК неавтономного елемента була обмежена до термінальних
повторів, між якими виявилося можливим вбудовування рекомбінантного гена
(bar). Зміни мобільного генетичного елемента були зроблені для спрощення
в подальшому процедури аналізів.

Крім транспозонів і гена bar, послідовність ДНК, якою був
трансформований A.thaliana, містила гени nptII та gusА (рис. 1).
Неавтономний (dSpm) елемент, що містить ген стійкості до фосфінотрицину
(bar), був потрібний для відбору інтеграції Т-ДНК та реінсерції
транспозону. dSpm знаходився між 35S промотором з віруcу мозаїки цвітної
капусти та ATG кодоном гена ?-глюкуронідази (gusА). Останній є
ексцизійним маркером для оцінки активності елемента. Транспозиція
відбувається завдяки активності Spm-транспозази, яка є фрагментом
природного Spm елемента, клонованим під контролем 35S (pIC401) або Spm
(pIC411) промотору.

Згідно зі схемами, наведеними на рис. 2 та 3, були отримані соматичні
гібриди на основі видів B.juncea, B.napus або O.violaceus, які несли
транспозон, маркований геном стійкості до фосфінотрицину (bar).

Продукти злиття відбирали шляхом селекції стійких до фосфінотрицину
клонів, оскільки рослини трансгенного A.thaliana несуть ген стійкості до
нього. На поживному середовищі, яке ми застосували для культивування
продуктів злиття, протопласти A.thaliana не здатні до поділу, тоді як у
B.juncea, B.napus або O.violaceus вони діляться з високою частотою.
Культивування вихідних форм дикого типу B.juncea, B.napus або
O.violaceus на середовищах, які містили 10 мг/л фосфінотрицину, вело до
загибелі рослин. Тому існувала велика ймовірність того, що рослини, які
регенерували на поживному середовищі з 10 мг/л фосфінотрицину, були
гібридними.

Соматична гібридизація B.juncea+A.thaliana. При отриманні соматичних
гібридів досить важливим етапом є процес злиття протопластів. Нами була
взята за основу методика, розроблена Menzel et al. (1981). Ми
модифікували цю методику для можливості її застосування при злитті
мезофільних протопластів ряду видів родини Brassicaceae. Зроблені нами
модифікації стосувалися часу обробки розчином ПЕГ та буферним розчином з
високим pH. Крім того, ми змінили пропорції при додаванні цих розчинів.
Важливим моментом для покращення виживання клітин виявилося також
використання для відмивання протопластів розчину W5 замість
культурального середовища.

Основні етапи отримання гібридних рослин наведено у таблиці 1.
Ефективність поділів становила близько 80% від загальної кількості
висіяних протопластів.

Таблиця 1.

Умови культивування та морфогенезу соматичних гібридів
B.juncea+A.thaliana

Дні культивування Освітленість, Лк Середовище Етапи розвитку продуктів
злиття

0 0 SW1 Синтез клітинної стінки, перші поділи

7 2500 SR Формування мікроколоній

28 3000 FH Утворення і проростання ембріоїдів, формування органогенного
калюсу

60 3000 B5 Нормалізація морфології рослин, отриманих з ембріоїдів

60 3000 K2I02 Регенерація пагонів з калюсів, які не розвинулись в
ембріоїди

Селекцію гібридних рослин проводили на фосфінотрицині. Ген bar досить
широко застосовують для селекції при створенні трансгенних рослин,
оскільки для багатьох видів він є не тільки зручним селективним
маркером, а й господарсько-цінним геном стійкості до гербіциду біалафосу
(синонім BASTA, діюча речовина – фосфінотрицин або глюфозинат амонію)
(De Block et al., 1989). При отриманні рослин-регенерантів з продуктів
злиття нами була використана ступінчаста схема селекції. Концентрацію
селективного агента (фосфінотрицину) підвищували в два етапи від 5 до 10
мг/л. Концентрація 5 мг/л фосфінотрицину в середовищі для регенерації
була достатньою для первинного етапу селекції. Підвищення концентрації
селективного агенту до 10 мг/л дозволяло повністю позбутись регенерації
можливих нетрансгенних рослин. У проведених нами експериментах ключовими
факторами для отримання рослин-регенерантів в умовах селективного тиску
фосфінотрицину виявилися використання МЕС та культивування регенерантів
на розсіяному світлі на початку селекції.

Для того, щоб виключити можливість отримання рослин-химер, які б містили
суміш клітин батьківських видів, з ряду отриманих нами гібридів були
виділені протопласти та регенеровані рослини. Отримані рослини виявилися
стійкими до фосфінотрицину та канаміцину. Морфологічно вони були
ідентичні до вихідних гібридних ліній. Як показав подальший аналіз, їх
біохімічні та молекулярно-біологічні показники відповідали таким у
батьківських гібридних ліній. Рослин з показниками, характерними тільки
для арабідопсису або гірчиці, серед них ми не виявили, що дозволяє
стверджувати, що отримані нами шляхом соматичної гібридизації рослини
були дійсними гібридами, а не химерами. Обрана схема селекції виявилася
ефективною, оскільки подальші аналізи показали, що всі досліджені
рослини-регенеранти були гібридними.

Регенеранти, стійкі до фосфінотрицину, морфологічно відрізнялися від
арабідопсису, що дозволяло розглядати їх як гібридні. Всі отримані
рослини були морфологічно подібними до гірчиці. Цей результат виявився
досить несподіваним, оскільки при гібридизації A.thaliana та B.juncea не
застосовували методів фізичної або хімічної інактивації протопластів
арабідопсису (?-опромінення, обробка іодацетамідом, тощо), які, згідно з
літературними даними, сприяють елімінації генетичного матеріалу
обробленого виду (Dudits et al., 1980; Sidorov et al., 1981; Bates et
al., 1987; Menczel et al., 1987; Vlahova et al., 1997).

Cтійкі до фосфінотрицину гібриди були проаналізовані за допомогою
гістохімічної реакції для виявлення активності ?-глюкуронідази. Нами
було проаналізовано 290 гібридних рослин, з яких 127 забарвлення не
давали, тоді як решта 163 дали позитивну реакцію. Розмір і розташування
зон ферментативної активності змінювалися від наявності лише у кількох
клітинах досліджуваного експланту до цілком забарвлених у синій колір
листків та коренів. Для більшості ліній характерним було фарбування у
вигляді чітко окреслених синіх плям на тлі білого кольору, які вказували
на зони ферментативної активності (рис. 4). Таким чином, ми вперше
виявили можливість транспозиції мобільних генетичних елементів у
міжтрибних гібридах родини Brassicaceae.

Наявність специфічного синього забарвлення опосередковано вказувала на
присутність генетичного матеріалу арабідопсису в отриманих рослинах. Для
подальшої роботи серед регенерованих фосфінотрицинстійких рослин
відбирали ті, у яких була відсутня активність ?-?люкуронідази. Ми
сподівалися виявити серед них такі, у яких, внаслідок процесів ексцизії
та реінсерції, інтеграція dSpm елемента разом з bar геном відбулася в
локуси, не зчеплені з сайтом первинної інтеграції трансгена, та були
еліміновані хромосоми A.thaliana, які несуть стабільно інтегровані
трансгени (SpmTPase, gusA та nptII).

V

n

J h `

?

e

N

P

R

T

V

n

A

o

u

ue

th

FRFoIoIueIJ:[email protected]?MiM’Ruououououououououououououououououououououououiu
ouououououououououououououououououiuououououiu

@

$

@

$

@

$

@

$

@

Tслинах. У гібридних лініях були проаналізовані продукти ампліфікації
тотальної ДНК з використанням праймерів до генів bar (рис. 5), SpmTPase
та npt II. Аналіз підтвердив наявність цих генів у гібридних лініях.

Присутність трансгенів у рослинах, які були морфологічно подібними до
гірчиці, є додатковим доказом, що підтверджує їх гібридність. Тотальної
втрати генетичного матеріалу A.thaliana не відбувалося, на що вказувало
збереження трансгенів, не здатних до транспозиції.

Для остаточного підтвердження гібридного походження рослин ряд ліній
було відібрано для подальших молекулярно-біологічних досліджень. Аналіз
ядерного геному проводили за допомогою RAPD з застосуванням
OPA-праймерів, а також ПЛР-ПДРФ, використовуючи праймери до
мікросателітної ДНК та внутрішньої спейсерної ділянки ITS між 26S і 18S
генами рДНК. Ампліфікація ITS послідовностей та RAPD аналіз показали
наявність ядерного матеріалу як B.juncea, так і A.thaliana. Продукти
ампліфікації при використанні 5′-(TCC)*5-3′ праймерів показали наявність
у гібридних рослинах послідовностей ДНК характерних лише B.juncea. При
ампліфікації за допомогою праймерів 5′-(GACA)*4-3′ електрофоретичний
спектр ПЛР продуктів лише двох з досліджуваних гібридних ліній цілком
відповідав спектру B.juncea. Інші досліджені зразки мали меншу, ніж
B.juncea, кількість фрагментів ампліфікованої ДНК, але більшу, ніж у
A.thaliana.

Аналіз хлоропластного геному проводили за допомогою рестрикції фрагмента
хлоропластної ДНК спейсерної ділянки між генами atpB – rbcL, отриманого
в результаті ампліфікації. ClaI гідроліз показав, що хлоропластний геном
гібридів походить від B.juncea. Для визначення походження
мітохондріальної ДНК гібридних рослин був проведений ПЛР-ПДРФ аналіз
послідовності ДНК гена мітохондріальної НАД-дегідрогенази (ndh4).
Гідроліз проводили з використанням рестриктних ендонуклеаз HaeIII,
HpaII, HindIII та MvaI. Гідроліз за допомогою HaeIII, HpaII та HindIII
не виявив різниці між батьківськими видами. MvaI гідроліз фрагмента гена
ndh4 показав, що у п’яти проаналізованих гібридних ліній рестриктний
спектр співпадав з A.thaliana. Три лінії при гідролізі давали основні
фрагменти, характерні для B.juncea, та додатковий – від A.thaliana.

За допомогою ізоферментного аналізу нами було проаналізовано 38
гібридних ліній. Досліджували ізозимні спектри амілази,
аспартатамінотрансферази, естерази, пероксидази та малатдегідрогенази.
Ізоферментний аналіз також підтвердив, що отримані нами рослини несли
ядерний генетичний матеріал обох вихідних видів. Слід відмітити
переважання ізоформ B.juncea (рис.6).

Соматична гібридизація за участю Orychophragmus violaceus. Під час наших
експериментів було отримано гібридні рослини в двох комбінаціях: а)
O.violaceus+A.thaliana, б) O.violaceus+гібрид (B.juncea+A.thaliana). Всі
отримані рослини мають нормальну морфологію, здатні до укорінення.

Гібрид між O.violaceus+A.thaliana був високоасиметричним, оскільки з
усіх проведених молекулярно-біологічних та біохімічних аналізів лише
ізоферментний аналіз естерази показав присутність генетичного матеріалу
A.thaliana (табл. 2, 3). Однак отриманий гібрид, на відміну від
вихідного O.violaceus, був стійким до канаміцину і фосфінотрицину, як
арабідопсис, і фарбувався при гістохімічному виявленні активності
?-глюкуронідази. Останнє вказувало на активність транспозонів. ПЛР
аналізи на виявлення генів npt II, bar, gus та Spm-транспозази
підтвердили присутність цих генів (табл. 4).

Таблиця 2.

Біохімічна та молекулярно-біологічна характеристика ядерного геному
соматичних гібридів O.violaceus+A.thaliana та
O.violaceus+(B.juncea+A.thaliana)

Рослина Естераза Амілаза ITS

O. violaceus Ov Ov Ov

A. thaliana Ath Ath Ath

B. juncea Bj Bj Bj

Oa1 Ov + Ath Ov Ov

j56 Ath + Bj Ath + Bj Ath + Bj

Oj56/1 Ov + Ath + Bj Ov + Bj Ov + Ath + Bj

Oj56/2 Ov + Ath + Bj Ov + Bj Ov + Ath + Bj

Oj56/3 Ov + Ath + Bj Ov + Bj Ov + Ath + Bj

Oj56/4 Ov + Ath + Bj Ov + Bj Ov + Ath + Bj

Примітки: Ov — O.violaceus; Ath — A.thaliana; Bj — B.juncea, Oa1 –
гібрид O.violaceus+ A.thaliana, j56 – гібрид B.juncea+A.thaliana, Oj56/1
— Oj56/4 – гібриди O.violaceus+(B.juncea+A.thaliana)

Таблиця 3.

Молекулярно-біологічна характеристика пластому та мітохондріону
соматичних гібридів O.violaceus+A.thaliana та O.violaceus+гібрид
(B.juncea+A.thaliana)

Рослина Пластиди

Мітохондрії

ClaI гідроліз atpB – rbcL

Спейсер

atpH – atpI

HaeIII гідроліз ndh4

StyI гідроліз ndh4

MvaI гідроліз ndh4

O. violaceus Ov* Ov Ov Ov Ov*

A. thaliana Ath Ath Ath** Ath** Ath

B. juncea Bj* Bj Bj** Bj** Bj*

Oa1 Ov Ov Ov Ov Ov

j56 Bj Bj Bj або Ath Bj або Ath Ath

Oj56/1 не Ath Bj Ov Ov Ov

Oj56/2 не Ath Bj Ov Ov Ov

Oj56/3 не Ath Bj Ov Ov Ath

Oj56/4 не Ath Bj Ov Ov Ath

Примітки: Ov — O. violaceus; Ath — A.thaliana; Bj — B.juncea; Oa1 –
гібрид O.violaceus+ A.thaliana, j56 – гібрид B.juncea+A.thaliana, Oj56/1
— Oj56/4 – гібриди O.violaceus+(B.juncea+A.thaliana); * спектри O.
violaceus та B. juncea співпадають; ** спектри A. thaliana та B. juncea
співпадають

У гібридній комбінації O.violaceus+(B.juncea+A.thaliana) було отримано
унікальне поєднання гібридного за трьома батьківськими видами ядра,
хлоропластів B.juncea та мітохондрій O.violaceus або
O.violaceus+A.thaliana (див. табл. 2, 3). Більш того, B.juncea є
природним алотетраплоїдом, який містить геноми B.nigra та B.campestris
(U N., 1935), тому отримані нами гібридні рослини, фактично, є
результатом поєднання чотирьох ядерних геномів. Гібриди несли гени npt
II, bar, gus та Spm-транспозази (показано ПЛР) та були стійкими до
канаміцину і фосфінотрицину, але не демонстрували активності
?-глюкуронідази (див. табл. 4). Таким чином, нами показано, що при
соматичній гібридизації таких видів, як O.violaceus та A.thaliana, а
також в такій складній гібридній комбінації, як
O.violaceus+(B.juncea+A.thaliana), не відбувалося повної елімінації
генетичного матеріалу A.thaliana. Цілковитої втрати хромосоми(-сом), де
первинно були інтегровані трансгени, не спостерігали.

Таблиця 4.

Характеристика присутності трансгенів та їх експресії в гібридних
рослинах O.violaceus+A.thaliana та O.violaceus+(B.juncea+A.thaliana)

Рослина ПЛР аналіз присутості трансгенів

Експресія трансгенів

bar

nptII

SpmTPase

gusA

bar

nptII

gusA

O. violaceus — — — — — — —

A. thaliana + + + + + + +

B. juncea — — — — — — —

j56 + + + + + + +

Oa1 + + + + + + +

Oj56/1 + + + + + + —

Oj56/2 + + + + + + —

Oj56/3 + + + + + + —

Oj56/4 + + + + + + —

Примітки: Ov — O.violaceus; Ath — A.thaliana; Bj — B.juncea, Oa1 –
гібрид O.violaceus+ A.thaliana, j56 – гібрид B.juncea+A.thaliana, Oj56/1
— Oj56/4 – гібриди O.violaceus+(B.juncea+A.thaliana)

Cоматична гібридизація Brassica napus+A.thaliana. В результаті дослідів
по соматичній гібридизації було відібрано 382 калюси при злитті B.napus
cv. Westar+A.thaliana та 78 калюсів – B.napus cv.
Калинівський+A.thaliana, стійких до 5 мг/л фосфінотрицину. З них вдалося
регенерувати 34 пагони у гібридів з сортом Westar та 8 пагонів з сортом
Калинівський. Ефективність регенерації гібридів була 8,9 та 10,2%,
відповідно. При культивуванні отриманих пагонів на безгормональному
середовищі вони були здатні спонтанно укорінюватись. Форма листків
отриманих рослин цілком була подібною до ріпаку.

На основі морфології та за допомогою біохімічних і
молекулярно-біологічних методів аналізу нами була доведена присутність
генетичного матеріалу обох батьківських видів та трансгенів в отриманих
рослинах (табл. 5). Повної елімінації ядерного генетичного матеріалу
A.thaliana не відбувалося протягом трьох років. Збереження генетичного
матеріалу A.thaliana та трансгенів при тривалому розмноженні отриманих
пагонів шляхом живцювання виключає їх химерне походження. Пластом
гібридних рослин був успадкованим виключно від B.napus, а мітохондріон
– від будь-якого з батьківських видів.

Гени bar, npt II, Spm-транспозази і gusA зберігалися в рослинах та
відбувався активний процес транспозиції dSpm елемента з bar геном.
Присутність генетичного матеріалу A.thaliana з сайтом первинної
інтеграції ускладнює виявлення реінсерції мобільного елемента в геном
ріпаку.

Таблиця 5.

Біохімічна та молекулярно-біологічна характеристика соматичних гібридів
B.napus+ A.thaliana

Рослина GUS аналіз Ізоферментний аналіз

ПЛР аналіз

ПЛР-ПДРФ аналіз

Естераза

Амілаза

bar

nptII

SpmTPase

gusА

ITS

Мікросателітна ДНК1

Мікросателітна ДНК2

B.napus — Bn Bn — — — — Bn Bn Bn

A.thaliana + Ath Ath + + + + Ath Ath Ath

R2 + Bn+Ath Bn + + + + Bn+Ath Bn Ath

R3 + Bn+Ath Bn+Ath + + + + Bn+Ath Bn Bn

R4 + Bn+Ath Bn + + + + Не визн. Не визн. Не визн.

K4 + Bn+Ath Bn+Ath + + + + Bn+Ath Bn Ath

K6 + Bn+Ath Bn+Ath + + + + Bn+Ath Bn Ath

K8 + Bn+Ath Bn+Ath + + + + Не визн. Не визн. Не визн.

W2 +/- Bn+Ath Bn+Ath + + — + Bn+Ath Bn Bn

Примітки: »+», «-» — позитивна або негативна реакція; Ath — походить
від A.thaliana; Bn — походить від B.napus; 1 — праймери 5′-(TTC)?5-3′;
2- праймери 5′-(TTTAGGG)?3-3′.

Отже, в роботі запропоновано новий підхід до дослідження можливості
міжгеномної транспозиції мобільних генетичних елементів. У міжтрибних
соматичних гібридах родини Brassicaceae була виявлена активність
гетерологічної системи мобільних генетичних елементів Spm/dSpm
кукурудзи, перенесеної шляхом агробактеріальної трансформації в рослини
одного з батьківських видів.

ВИСНОВКИ

1. За допомогою методу соматичної гібридизації створена система для
вивчення переносу транспозонів між геномами різних видів.

2. Вперше отримано такі міжтрибні соматичні гібриди: Brassica
juncea+Arabidopsis thaliana, Orychophragmus violaceus+A.thaliana та
O.violaceus+(B.juncea+A.thaliana).

3. Виявлено можливість регенерації рослин при поєднанні у соматичному
гібриді O.violaceus+(B.juncea+A.thaliana) чотирьох геномів: O.violaceus,
A.thaliana та B.nigra з B.campestris, які складають геном B.juncea.

4. Показано активність гетерологічної системи мобільних генетичних
елементів кукурудзи Spm/dSpm у міжтрибних соматичних гібридах
B.juncea+A.thaliana, B.napus+A.thaliana, O.violaceus+A.thaliana.

5. Експериментально доведено, що при міжтрибній соматичній гібридизації
селективний ген (bar), який транспозується за рахунок Spm-транспозази
виду-донора, зберігається у гібридах, які подібні за фенотипом до
виду-реципієнта.

6. Ядерний матеріал A.thaliana в усіх отриманих соматичних гібридів
зберігався протягом 3 років, що доведено шляхом дослідження
ізоферментних спектрів та ПЛР-аналізів присутності послідовностей ДНК
ряду ядерних маркерів і селективних генів.

7. Показано, що у проаналізованих соматичних гібридів
(B.juncea+A.thaliana, B.napus+A.thaliana, O.violaceus+A.thaliana,
O.violaceus+(B.juncea+A.thaliana)) зберігався пластом лише одного з
батьків, тоді як успадкування мітохондріону відбувалося випадковим
чином.

СПИСОК РОБІТ ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Овчаренко О.О., Комарницький І.К., Череп М.Н., Глеба Ю.Ю., Кучук М.В.
Отримання міжтрибних соматичних гібридів Brassica juncea+Arabidopsis
thaliana та дослідження поведінки трансгенних ознак // Цитология и
генетика. – 2004. – Т. 38, № 3. – С. 3 – 8.

2. Овчаренко О.О., Комарницький І.К., Череп М.Н., Рудас В.А., Кучук М.В.
Отримання міжтрибних соматичних гібридів дигеномного (Orychophragmus
violaceus+Arabidopsis thaliana) та тетрагеномного (Orychophragmus
violaceus +Brassica juncea+Arabidopsis thaliana) походження та їх
використання для вивчення поведінки гетерологічної системи транспозонів
Spm/dSpm // Біополімери та клітина. – 2005. – Т. 21, № 1. – С. 35 – 41.

3. Овчаренко О.О., Комарницький І.К., Череп М.Н., Кучук М.В. Отримання
соматичних гібридів Brassica napus+Arabidopsis thaliana та їх
використання для дослідження активності гетерологічної системи
транспозонів Spm/dSpm // Фактори експериментальної еволюції. Збірник
наукових праць. – Т. 2. – С. 166 – 171. / За ред. М.В. Роїка. – К.:
КВІЦ, 2004. – 416 с.

4. Ovcharenko O.O., Komarnitski I.K., Kuchuk M.V. Production of
intertribal somatic hybrids between Arabidopsis thaliana and cultivated
species Brassica juncea. // Abstracts of international symposium
“Biotechnology Approaches for Exploitation and Preservation of Plant
Resources”, Ukraine, Yalta, 26–31 May 2002. – P. 74.

5. Овчаренко О.А., Комарницкий И.К., Череп Н.Н., Рудас В.А., Кучук Н.В.
Получение межтрибных соматических гибридов дигеномного (Orychophragmus
violaceus+Arabidopsis thaliana) и тетрагеномного (Orychophragmus
violaceus+Brassica juncea+Arabidopsis thaliana) происхождения и их
использование для изучения поведения гетерологической системы
транспозонов Spm/dSpm. // Молекулярная генетика, геномика и
биотехнология. Международная научная конференция, Минск, 24-26 ноября
2004 г.: Материалы конференции. – С. 171 – 172. / Ред. кол. Н.А. Картель
и др. – Минск, 2004 г. – 356 с.

6. Овчаренко О.А. Анализ пластома и митохондриона соматических гибридов
Brassica napus+Arabidopsis thaliana // Актуальні проблеми фізіології,
генетики та біотехнології рослин і грунтових мікроорганізмів. Тези
доповідей IХ конференції молодих дослідників, присвяченої 100-річчю від
дня народження академіка АН УРСР і ВАСГНІЛ П.А. Власюка. Київ, 24 – 25
лютого 2005. – С. 69.

АНОТАЦІЯ

Овчаренко О. О. Отримання міжтрибних соматичних гібридів родини
Brassicaceae, що містять активну гетерологічну систему транспозонів
кукурудзи Spm/dSpm. – Рукопис.

Дисертацiя на здобуття наукового ступеня кандидата бiологiчних наук за
спецiальнiстю 03.00.20 – біотехнологія. — Інститут клітинної біології та
генетичної інженерії НАН України, Київ, 2005.

У дисертаційній роботі запропоновано новий підхід для створення системи,
придатної для дослідження міжгеномної транспозиції мобільних генетичних
елементів рослин з використанням транспозону кукурудзи Spm/dSpm. Підхід
полягає у створенні міжтрибних соматичних гібридів між модельним
об’єктом для генетичних досліджень з сиквенованим геномом Arabidopsis
thaliana L., що містить гетерологічну систему транспозонів Spm/dSpm, та
рядом культурних (Brassica juncea (L.) Czern & Coss., B.napus L.) і
дикорослих (Orychophragmus violaceus (L.) O.E. Schulz.) видів
представників родини Brassicaceae, з подальшим вивченням активності
Spm/dSpm. В ході роботи методом соматичної гібридизації були отримані
міжтрибні гібриди у таких комбінаціях: B.napus + A.thaliana, B.juncea +
A.thaliana, O.violaceus + A.thaliana, O.violaceus + (B.juncea +
A.thaliana). З них три останні комбінації отримані вперше. У соматичних
гібридах O.violaceus+(B.juncea+A.thaliana) виявлено можливість
регенерації рослин при поєднанні чотирьох геномів: O.violaceus,
A.thaliana та B.nigra і B.campestris, які складають геном B.juncea.
Гібридне походження отриманих рослин було підтверджено за допомогою
морфологічного аналізу, ПЛР-ПДРФ, RAPD та аналiзу множинних молекулярних
форм ферментiв. У гібридах не відбувалося повної елімінації генетичного
матеріалу арабідопсису, а трансгени стабільно підтримувалися. Було
доведено, що при міжтрибній соматичній гібридизації селективний ген
(bar), який транспозується за рахунок Spm-транспозази виду-донора,
зберігався у гібридах, подібних за фенотипом до виду-реципієнта.
Показано, що в усіх проаналізованих гібридних комбінаціях зберігався
пластом лише одного з батьків, тоді як успадкування мітохондріону
відбувалося випадковим чином. Вперше показано активність гетерологічної
системи мобільних генетичних елементів кукурудзи Spm/dSpm у міжтрибних
соматичних гібридах B.juncea+A.thaliana, B.napus+A.thaliana,
O.violaceus+A.thaliana.

Ключові слова: міжтрибна соматична гібридизація, Brassicaceae,
Arabidopsis thaliana, Brassica juncea, B.napus, Orychophragmus
violaceus, гетерологічна система транспозонів Spm/dSpm.

АННОТАЦИЯ

Овчаренко О. А. Получение межтрибных соматических гибридов семейства
Brassicaceae, содержащих активную гетерологическую систему транспозонов
кукурузы Spm/dSpm. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.20 – биотехнология. — Институт клеточной биологии и
генетической инженерии НАН Украины, Киев, 2005.

В диссертационной работе предложен новый подход к созданию системы,
пригодной для исследования межгеномной транспозиции мобильных
генетических элементов растений с использованием транспозона кукурузы
Spm/dSpm. Суть подхода состоит в создании межтрибных соматических
гибридов между Arabidopsis thaliana L. – модельным объектом генетических
исследований, чей геном сиквенирован на сегоднешний день, и рядом
культурных (Brassica juncea (L.) Czern & Coss., B.napus L.) и
дикорастущих (Orychophragmus violaceus (L.) O.E. Schulz.) видов
семейства Brassicaceae. Использование Arabidopsis thaliana,
трансформированного вектором, содержащим гетерологическую систему
транспозонов Spm/dSpm, а также гены npt II, bar, gusА даст возможность
исследовать активность мобильных генетических элементов в таких
гибридах. При отдаленной соматической гибридизации возможна транспозиция
мобильного генетического элемента с одного генома на другой и
последующая утрата хромосом вида-донора с сайтом первичной интеграции
транспозона, содержащего источник транспозазы. Перемещение мобильного
элемента можно проследить по сохранению в геноме реципиента трансгена
(bar), окруженного последовательностями транспозона, и отсутствию других
трансгенов (npt II, gusА, SpmTPase), элиминируемых вместе с геномом
вида-донора.

В ходе нашей работы с помощью метода соматической гибридизации были
получены межтрибные гибриды в следующих видовых комбинациях:
B.napus+A.thaliana, B.juncea+A.thaliana, O.violaceus+A.thaliana,
O.violaceus+(B.juncea+A.thaliana). Три последние гибридные комбинации
получены впервые. На примере соматических гибридов
O.violaceus+(B.juncea+A.thaliana) нами была обнаружена возможность
регенерации растений при объединении четырех геномов: O.violaceus,
A.thaliana и B.nigra с B.campestris, составляющих геном B.juncea.
Гибридное происхождение полученных растений было доказано с помощью
морфологического, ПЦР-ПДРФ, RAPD и изоферментного анализов. Хотя при
создании гибридов нами не были использованы специальные методы
способствующие элиминации генетического материала A.thaliana, полученные
растения B.napus+A.thaliana, B.juncea+A.thaliana и
O.violaceus+A.thaliana были морфологически подобны B.napus, B.juncea и
O.violaceus, соответственно. Гибриды O.violaceus+(B.juncea+A.thaliana)
имели промежуточные морфологические признаки B.juncea и O.violaceus.
Молекулярно-биологический и изоферментный анализы показали, что,
несмотря на схожесть с видом-реципиентом, у гибридов не происходило
полной элиминации генетического материала арабидопсиса. Для исключения
возможной химерности растений было проведено длительное расхимеривание
путем культуры протопластов, либо черенкования, которое показало, что
полученные растения были истинными гибридами.

Для более полной характеристики полученых гибридов был проведен анализ
ДНК органелл. Показано, что во всех проанализированных гибридных
комбинациях сохранялся пластом только одного из родителей: пластом
A.thaliana не был унаследован ни одним из гибридов. Наследование
митохондриона происходило случайным образом, как от одного, так и от
другого родительского вида.

Нами было показано, что при межтрибной соматической гибридизации
селективный ген (bar), транспозирующийся за счет транспозазы
вида-донора, сохранялся в гибридах, фенотипически схожих с
видом-реципиентом. Хотя селекцию гибридных растений проводили только с
использованием фосфинотрицина, все полученные растения были устойчивыми
как к фосфинотрицину, так и к канамицин-сульфату благодаря перенесенным
от A.thaliana трансгенам. Активность ?-?люкуронидазы, являющаяся
маркером активности мобильного генетического элемента была обнаружена в
гибридах B.napus+A.thaliana, B.juncea+A.thaliana и
O.violaceus+A.thaliana и отсутствовала в растениях
O.violaceus+(B.juncea+A.thaliana). Однако, ПЦР анализ показал сохранение
всех трансгенов и в этих гибридах.

С помощью гистохимического определения активности gusA гена нами впервые
была показана активность гетерологической системы мобильных генетических
элементов кукурузы Spm/dSpm в межтрибных соматических гибридах
B.juncea+A.thaliana, B.napus+A.thaliana, O.violaceus+A.thaliana.

Ключевые слова: межтрибная соматическая гибридизация, Brassicaceae,
Arabidopsis thaliana, Brassica juncea, B.napus, Orychophragmus
violaceus, гетерологическая система транспозонов Spm/dSpm.

SUMMARY

Ovcharenko O.O. Production of intertribal somatic hybrids with active
heterologous maize transposable element Spm/dSpm within the Brassicaceae
family. – Manuscript.

Thesis for PhD degree (Biology) by speciality 03.00.20 – biotechnology.
– Institute of Cell Biology and Genetic Engineering of National Academy
of Science, Kyiv, 2005.

The thesis is devoted to production of a system for investigation of
intergenomic transposition using maize transposable element Spm/dSpm.
Approach is based on production of intertribal somatic hybrids between a
model object of genetic studies Arabidopsis thaliana L., transformed
with heterologous maize transposable element Spm/dSpm and some
cultivated (Brassica juncea (L.) Czern & Coss., B.napus L.) or wild
species (Orychophragmus violaceus (L.) O.E. Schulz.) from Brassicaceae,
for further investigation of Spm/dSpm activity. We have produced such
combinations of intertribal somatic hybrids: B.napus + A.thaliana,
B.juncea + A.thaliana, O.violaceus + A.thaliana, O.violaceus + (B.juncea
+ A.thaliana). The last three of them were produced for the first time.
In somatic hybrids O.violaceus+(B.juncea+A.thaliana) we found
opportunity to regenerate plants when four genomes are combined:
O.violaceus, A.thaliana and B.nigra with B.campestris, which form genome
of B.juncea. Hybrid nature of obtained plants was confirmed by
morphology, PCR-RFLP, RAPD and analysis of isozymes. There was no
complete elimination of A. thaliana genetic material in hybrids and
transgenes were stably maintained. It was demonstrated that selective
gene (bar), transposed by Spm-transposase of donor species have been
maintained in hybrids similar phenotypic to recipient species. In all
analyzed hybrid combinations plastome was inherited only from one of the
parents while origin of mitochondrion was casual. Activity of
heterologous maize transposable element Spm/dSpm in intertribal somatic
hybrids B.juncea+A.thaliana, B.napus+A.thaliana, O.violaceus+A.thaliana
have been shown for the first time.

Key words: intertribal somatic hybridization, Brassicaceae, Arabidopsis
thaliana, Brassica juncea, B.napus, Orychophragmus violaceus,
heterologous maize transposable element Spm/dSpm.

Автор висловлює глибоку вдячність своєму керівнику д.б.н. Кучуку М.В. за
підтримку і увагу, проявлені при виконанні дисертаційної роботи.
Висловлюю щиру подяку к.б.н. Комарницькому І.К. та Черепу М.Н. за
допомогу у проведенні аналізів. Висловлюю величезну вдячність всім
співробітникам відділу генетичної інженерії ІКБГІ НАНУ за розуміння,
підтримку та цінні поради при обговоренні результатів роботи та її
написанні. Особливу вдячність висловлюю своєму чоловіку і колезі к.б.н.
Рудасу В.А.

Похожие записи