УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ АГРОЕКОЛОГІЇ ТА БІОТЕХНОЛОГІЇ

НАДКЕРНИЧНА ОЛЕНА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 631.461.5:576.851:155

Особливості взаємодії мікро- і макросимбіонтів в системі діазотрофи —
небобова рослина

03.00.16 — екологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

КИЇВ — 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в лабораторії біологічного азоту Інституту
сільськогосподарської мікробіології Української академії аграрних наук

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор, академік УААН
ПАТИКА Володимир Пилипович, Інститут агроекології і біотехнології УААН,
директор інституту

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор ГОЛОВКО Ераст
Анатолійович, Центральний національний ботанічний сад НАН України,
завідувач відділу алелопатії рослин

доктор біологічних наук, професор КУРДІШ Іван Кирилович, Інститут
мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач
відділу мікробіологічних процесів на твердих поверхнях

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник КОЦЬ Сергій
Ярославович, Інститут фізіології рослин і генетики НАН України,
завідувач відділу симбіотичної азотфіксації

Провідна установа: Київський національний університет ім. Тараса
Шевченка

Захист відбудеться 24 лютого 2004р. о 1400 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.371.01 при Інституті агроекології та
біотехнології УААН.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту агроекології та
біотехнології УААН.

Відгуки на автореферат у двох примірниках, завірені печаткою, просимо
надсилати за адресою: вул. Метрологічна, 12, Київ, Україна, 03143.

Автореферат розісланий 23 січня 2004р.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради, кандидат

хімічних наук Заякіна Г.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Пріоритетною проблемою сучасної агроекології є
розробка альтернативного шляху забезпечення небобових рослин доступним
азотом за рахунок використання потенціалу грунтових азотфіксуючих
мікроорганізмів (Умаров, 1986; Патика та ін., 1993; Gough et al., 1997).
Переваги біологічного азоту в порівнянні з азотом мінеральних добрив в
економічному плані загальновідомі. Але не менш важливі екологічні
аспекти застосування біологічного азоту при якому не відбувається
забруднення навколишнього середовища і не порушуються природні
біоценози. У зв’язку з цим найбільш перспективним видається створення
стійких асоціацій культурних рослин із діазотрофами, одержаними шляхом
аналітичної селекції з природних біоценозів, що є одним із важливих
заходів, направлених на збереження біологічної різноманітності і
стабільності навколишнього середовища.

Ще в 70-х роках ХХ століття було висунуто припущення, що асоціації
бактерій з рослинами можуть мати різний ступінь близькості. Ті
асоціації, де нітрогеназна активність проявляється, в основному, в
ризосферному грунті, стали називатися екзоризосферними, при локалізації
діазотрофів на коренях чи всередині них — ендоризосферними (Dobereiner,
1978). Пізніше була розроблена фундаментальна концепція, згідно з якою
всі рослини в екосистемі формують континуум асоційованих із коренями
мікроорганізмів, який розповсюджується з ризосфери в ризоплану і далі,
глибше — в рослинні тканини, включаючи епідерму, кору, ендодерму і
васкулярну систему кореня (Klein et al., 1990).

Ефективна взаємодія мікро- і макроорганізмів в асоціативній системі
діазотрофи — небобова рослина забезпечує активізацію процесу фіксації
атмосферного азоту, продукування біологічно активних сполук, під впливом
яких покращується живлення рослин, підвищується їх продуктивність,
поліпшується якість сільськогосподарської продукції (Звягинцев, 1995;
Белимов и др., 1998; Іутинська та ін., 2000; Курдиш, 2001). Але, навіть,
за цих умов частина фіксованого азоту неминуче втрачається через процеси
денітрифікації. Запобігти втратам можна шляхом перетворення асоціативних
взаємовідносин у системі діазотрофи — небобова рослина на симбіотичні,
де азот, який фіксується мікроорганізмами, повністю залучається до
складу рослини. У деяких випадках це можливо через формування штучних
симбіотичних систем діазотрофи — небобова рослина, яке відбувається під
впливом поєднаного застосування хімічних і біологічних факторів
(Ковальская и др., 2001).

Пошук мікроорганізмів, здатних виступати як біологічні нодуляційні
агенти і формувати симбіози на коренях рослин, та створення на їх основі
біопрепаратів для ефективного використання біологічного азоту є всі
підстави вважати стратегічним напрямом досліджень, що відкриває широку
перспективу підвищенню продуктивності агробіоценозів.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження
проводили за: науково-технічною програмою у 1983-1990 рр. «Генетичні
основи селекції сільськогосподарських рослин», завданням «Вивчити
взаємовідносини азотфіксуючих мікроорганізмів з рослинами та
удосконалити прийоми, що підвищують ефективність використання
біологічного азоту в сільськогосподарському виробництві», ДР
№01820077636; науково-технічною програмою з розробки систем землеробства
на 1986-1990 рр. в УРСР, завданням «Створити бактеріальний препарат на
основі асоціативних азотфіксаторів для підвищення урожаю злакових
культур», ДР №01870073833; завданням «Дослідити видову гетерогенність
злакових, круп’яних та бобових культур за їх здатністю до азотфіксації і
відібрати сорти чутливі на інокуляцію, створити нові ефективні препарати
азотфіксуючих бактерій», ДР №01950015883; завданням «Розробити прийоми
ефективного використання біологічного і мінерального азоту в технології
вирощування злакових культур», ДР №01880U081960; науково-технічною
програмою УААН на 1991-1995 рр, завданням «Дослідити видову
гетерогенність злакових, круп’яних та бобових культур за їх здатністю до
азотфіксації і відібрати сорти чутливі на інокуляцію, створити нові
ефективні препарати азотфіксуючих бактерій», ДР №01950015883;
науково-технічною програмою УААН на 1996-2000 рр. «Родючість грунтів»,
завданням «Розробити систему раціонального використання азотфіксуючих
бактерій у відновлювальних ресурсозберігаючих системах землеробства», ДР
№0198U004584; науково-технічною програмою УААН на 2001-2005 рр.
«Теоретично обгрунтувати і розробити практичні заходи щодо екологічного
використання природно-ресурсного потенціалу агроландшафтів з метою
забезпечення сталого розвитку аграрного виробництва і покращання якості
умов життя людини», завданням «Розробити теоретичні основи створення
препаратів агрономічно цінних штамів мікроорганізмів», ДР №0101U003749.

Мета і завдання досліджень. Метою досліджень було вивчити взаємодію і
взаємозумовленість азотфіксуючих мікроорганізмів і небобових рослин як
основу існування і активного функціонування асоціативної системи
діазотрофи — рослина, науково обгрунтувати можливість утворення
специфічних симбіозів діазотрофів з небобовими рослинами, а також
посилення активності процесу азотфіксації, підвищення родючості грунтів,
урожайності небобових культур, поліпшення якості сільськогосподарської
продукції за рахунок інтродукції в природний біоценоз нових штамів
діазотрофів.

Відповідно до поставленої мети було сформульовано такі завдання:

одержати високоефективні штами азотфіксуючих бактерій, спроможних
суттєво активізовувати процес фіксації атмосферного азоту в кореневій
зоні небобових рослин, підвищувати продуктивність рослин, поліпшувати
якість одержаної продукції та сприяти збереженню довкілля від
забруднення полютантами;

визначити здатність виділених діазотрофів до формування активної
асоціативної системи діазотрофи — озиме жито;

визначити вплив макросимбіонта на формування і активне функціонування
азотфіксуючого комплексу: діазотрофи — рослина;

з’ясувати природу біологічного явища — спонтанного утворення бульбочок
на коренях шовковиці;

показати принципову можливість утворення специфічних симбіозів
діазотрофів з небобовими рослинами;

науково обгрунтувати роль біологічних чинників нодуляції в індукуванні
азотфіксуючих симбіозів та посиленні процесу фіксації молекулярного
азоту у небобових рослин;

вивчити ультраструктуру бульбочок, які утворилися на коренях небобових
рослин під впливом біологічних чинників нодуляції;

створити новий мікробний препарат на основі азотфіксуючих бактерій для
підвищення урожайності і якості зерна озимого жита, визначити умови його
ефективного використання та розробити технології виробництва і
застосування.

Об’єкт досліджень: діазотрофи кореневої зони озимого жита; виділені з
бульбочок шовковиці азотфіксуючі бактерії A. brasilense 53, A.
brasilense 54, A. brasilense 62, Agrobacterium radiobacter 51, A.
radiobacter C-7; озиме жито (Secale cereale L.) 82 сортів і гібридів,
рослини шовковиці (Morus alba L.) і моркви (Daucus sativus Roehl.)
різних сортів.

Предмет досліджень: взаємодія мікро- і макроорганізмів в асоціативних і
симбіотичних системах діазотрофи — небобова рослина.

Методи досліджень: 1) мікробіологічні — для виділення діазотрофів із
природних екоценозів; 2) фізіолого-біохімічні і
культурально-морфологічні — для ідентифікації діазотрофів; 3)
генетичного маркування мікроорганізмів — для визначення ступеню
колонізації ними кореневої зони сільськогосподарських культур; 4)
газохроматографічний — для визначення азотфіксуючої активності
мікроорганізмів і їх асоціацій з рослинами; 5) ізотопний 15N2 (метод
ізотопного розбавлення) — для визначення надходження біологічного азоту
в рослину; 6) біохімічні — для визначення загального і білкового азоту в
зерні, амінокислотного складу білка; 7) електронно-мікроскопічні — для
визначення видової належності бактерій та вивчення ультраструктури
бульбочок, що утворилися на небобових культурах під впливом біологічних
факторів нодуляції; 8) вегетаційних та польових дослідів — для
визначення ефективності застосування діазотрофів і біопрепаратів на
різних сільськогосподарських культурах; 9) математично-статистичні — для
оцінки вірогідності отриманих результатів і визначення кореляційних
зв’язків.

Наукова новизна одержаних результатів. Усвідомлення взаємодії
мікроорганізмів і рослин як складного і багатогранного явища, яке
сформувалося в процесі еволюції, дозволило автору ефективно використати
можливості цього природного феномену для значного підвищення
продуктивності сільськогосподарських культур, одержання високоякісної
продукції за одночасного збереження довкілля.

Вперше вивчено структуру азотфіксуючого мікробного комплексу кореневої
зони озимого жита і шовковиці. Показано особливості взаємодії і
взаємозумовленості діазотрофів і рослин шовковиці та озимого жита різних
сортів і ліній. Ця взаємодія розглядається як основа існування мікро- і
макросимбіонтів в системі діазотрофи — небобова рослина.

Вперше показано принципову можливість утворення специфічних симбіозів
діазотрофів з небобовими рослинами.

Розширено уявлення про роль небобових рослин у формуванні і ефективному
функціонувані асоціативної системи діазотрофи — озиме жито.

Вперше з’ясовано природу біологічного явища — спонтанного утворення
бульбочок на коренях шовковиці. З бульбочок виділені нові штами бактерій
Azospirillum brasilense 53, A. brasilense 54, A. brasilense 61,
Agrobacterium radiobacter 51, A. radiobacter C-7, які можна вважати
відповідальними за утворення зазначених структур і їх високу
нітрогеназну активність.

Отримано новий консорціум агробактерій, на основі якого створено
препарат для підвищення продуктивності шовковиці.

Науково обгрунтовано і експериментально доведено можливість створення
препарату діазобактерину на основі нового штаму азотфіксуючих бактерійї
Azospirillum brasilense 18-2 для активізації процесу азотфіксації,
підвищення родючості грунтів, урожайності озимого жита і поліпшення
якості зерна.

Практичне значення одержаних результатів. Результати досліджень основних
закономірностей формування ефективних асоціативних систем діазотрофи —
небобова рослина дозволили рекомендувати сільськогосподарському
виробництву новий штам азотфіксуючих бактерій Azospirillum brasilense
18-2, який забезпечує формування ефективної асоціативної системи
азоспірили — озиме жито, при цьому активність фіксації молекулярного
азоту підсилюється у 1,2-13,0 разів в залежності від сорту рослин і
екологічних факторів, урожай зерна збільшується на 5,1-12,8 ц/га
(10,2-37,4%), сумарна кількість амінокислот у зерні підвищується на
38,9-40,0, вміст незамінних амінокислот — на 42,6-47,8%.

На основі штаму A. brasilense 18-2 створено новий мікробний препарат
діазобактерин для поліпшення азотного живлення рослин озимого жита, який
забезпечує підвищення урожаю зерна на 2,3-7,1 ц/га (9,6-24,9%).

Запропоновано новий консорціум агробактерій для підвищення
продуктивності рослин шовковиці, застосування якого дозволяє підвищити
листову масу цієї культури на 14,6-67,9% в залежності від сорту.

Нові високоефективні штами та способи підвищення урожайності озимого
жита і шовковиці захищені патентами України (№40542, 2001р.; №40549,
2001р.; №48835, 2002р.; №48836, 2002р).

Основні результати досліджень використані для розробки рекомендацій із
ефективного застосування біопрепаратів азотфіксуючих та
фосформобілізуючих бактерій в сучасному ресурсозберігаючому землеробстві
(Київ, 1997; Чернігів, 1999), та «Сільськогосподарська мікробіологія —
на допомогу аграрному виробництву» (Чернігів, 2001).

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора.
Здобувачем проаналізована відповідна література, висунута робоча
гіпотеза, розроблена програма досліджень, проведено лабораторні,
вегетаційні, польові і виробничі досліди, та статистичну обробку
одержаних даних. Аналіз результатів, їх узагальнення, інтерпретація та
формулювання основних положень і висновків, а також друковані роботи
підготовлено при безпосередній участі автора.

Дослідження комплексу асоціативних азотфіксуючих бактерій кореневої зони
озимого жита проведено спільно з к.б.н. Н.М. Мальцевою, кореляційні
зв’язки між рівнем асоціативної азотфіксації і селекційними ознаками
озимого жита вивчалися з д.с.-г.н. Скориком В.В., ультраструктура
бульбочок моркви — з ст.н.с. Мамчуром О.Є. У виконанні експериментальних
робіт і проведенні дослідів брали участь співробітники лабораторії
біологічного азоту Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН,
котрі є співавторами опублікованих робіт і яким автор висловлює глибоку
подяку.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, які викладені в
дисертаційній роботі, були представлені на V Всесоюзному біохімічному
з’їзді (Київ, 1986); Республіканській конференції «Пути повышения
эффективности факторов интенсификации сельскохозяйственного
производства» (Вільнюс, 1986); Установчому (VIII) з’їзді Українського
мікробіологічного товариства (Одеса, 1993); 9-му Баховському колоквіумі
(Пущіно, 1995); 10-th International Congress on Nitrogen Fixation
(Saint-Petersburg, 1995); International workshop on associative
interaction of nitrogen-fixing bacteria with plants (Saratov, 1995); 7-й
Міжнародній науково-практичній конференції «Нетрадиционное
растениеводство, экология и здоровье» (Алушта, 1998); II Міжнародній
конференції «Використання сучасних молекулярно-генетичних і
біотехнологічних розробок у генетико-селекційних дослідженнях» (Одеса,
1998); Міжнародній науковій конференції «Сталий розвиток агроекологічних
систем в умовах обмеженого ресурсного забезпечення» (Київ, 1998); 22-nd
Fodder Crops and Amenity Grasses Section Meeting «New Approaches and
Techniques in Breeding Sustainable Fodder Crops and Amenity Grasses»
(Saint-Petersburg, 1999); Всеросійській конференцій
«Сельскохозяйственная микробиология в XIX-XXI вв» (Санкт-Петербург,
2001); Міжнародній науково-практичній конференції «Состояние и
перспективы развития люпиносеяния в XXI веке» (Брянськ, 2001);
Міжнародній науковій конференції «Екологія і біогеохімічна діяльність
мікроорганізмів» (Одеса, 2001); Міжнародній конференції «Микробиология и
биотехнология XXI столетия» (Мінськ, 2002); Міжнародній науковій
конференції «Сталий розвиток агроекисистем» (Вінниця, 2002).

Публікації. За результатами досліджень опубліковано 46 наукових праць, з
яких 25 статті у фахових журналах і збірниках, 14 — матеріалах
конференцій, 3 — рекомендації виробництву, 4 — патенти України.

Обсяг і структура роботи. Дисертація складається із вступу, огляду
літератури, опису об’єктів і методів досліджень, шести розділів
викладення результатів досліджень, висновків, рекомендацій виробництву,
списку використаної літератури, який містить 349 першоджерел.

Загальний обсяг роботи становить 305 сторінок. Дисертація ілюстрована 58
таблицями, 50 рисунками, 2 графіками.

ЗМІСТ РОБОТИ

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

В розділі наведено сучасні погляди вітчизняних та зарубіжних дослідників
на один із пріоритетних напрямів сучасної біології, який бурхливо
розвивається в останні два десятиліття — асоціативну взаємодію
діазотрофів з рослинами. Розглядається перспективність підвищення
продуктивності агробіоценозів шляхом використання азотфіксуючих
мікроорганізмів.

ОБ’ЄКТИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об’єктами досліджень слугували: діазотрофи кореневої зони озимого жита;
виділені з бульбочок шовковиці азотфіксуючі бактерії A. brasilense 53,
A. brasilense 54, A. brasilense 62, Agrobacterium radiobacter 51, A.
radiobacter C-7; озиме жито (Secale cereale L.) сортів Харківське 78,
Харківське 79, Харківське 88, Харківське 60, Верхнячське 32, Боротьба,
Струна, Київське 86, Чулпан, Плуто, Славутич 1, Зелене 10, Брянська 8,
Раннє кормове, Вологодське, Волжанка, Краснодарське, Кіровське,
Приєкульське, Донське 2, Росянка, Заозерне, Омка, Житкінське, Долинське,
Заричанське зеленоукосне, Куштро, Добриня, Зоря, Свіча, Ясельда,
Зубровка, Новозибківське 150, Пурга, Сніжне, Жнівень, Рукай, Вересань;
рослини шовковиці (Morus alba L.) сортів Українська 1, Українська 107,
Українська 510, Харківська 11; рослини моркви (Daucus sativus Roehl.)
сорту Харківська.

Облік чисельності азотфіксуючих бактерій та їх виділення проводили за
загальноприйнятими в грунтовій мікробіології методами і з використанням
прийомів, описаних в оригінальних роботах ряду авторів (Iuzuka et al.,
1963; Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1980; Калининская и
др., 1981; Caseras, 1982).

Ідентифікацію виділених культур проводили на основі вивчення
морфологічних (фазово-контрастна та електронна мікроскопія),
культуральних і фізіолого-біохімічних ознак за визначником Берджі (1997)
і на основі порівняння з типовими штамами культур діазотрофів, які були
отримані з колекції Всеросійського науково-дослідного інституту
сільськогосподарської мікробіології. Використовували також опис бактерій
роду Azospirillum в оригінальних роботах (Caseras et al., 1982).

Азотфіксуючу активність мікроорганізмів у чистій культурі і в асоціації
з рослинами визначали ацетилен-етиленовим методом (Hardy et al., 1968;
Stewart et al., 1967) на газовому хроматографі «Chrom-4» з
полум’яноіонізаційним детектором. Колонка довжиною 370 см була заповнена
хромосорбом із ?-?’-оксидіпропіонітрилом. Температура термостату 50оС,
газ-носій — азот, витрата газів (в мл/хвилину): водню — 30, азоту — 100,
повітря — 500.

Нітрогеназну активність в асоціативній системі діазотрофи — рослина
визначали ацетиленовим методом у непорушеному моноліті грунту з коренями
(Волкогон, 1984).

Надходження біологічного азоту в рослини під впливом інокуляції
діазотрофами вивчали, застосовуючи метод ізотопного (15N2) розбавлення
(Применение метода меченых атомов в исследованиях по земледелию, 1976).
Ізотопний склад зразків визначали на мас-спектрометрі МИ-1305.

Здатність діазотрофів колонізувати ризосферний грунт, ризоплану і
гістосферу рослин вивчали резистентним методом (Методы почвенной
микробиологии и биохимии, 1980).

Вивчення ультраструктури бульбочок, які утворилися на коренях моркви під
впливом біологічних факторів нодуляції, проводили з використанням
електронно-мікроскопічних методів досліджень. Попередню фіксацію
бульбочок для електронно-мікроскопічних досліджень проводили в 5%
розчині глютарового альдегіду протягом 48 годин, після чого їх
розрізували на декілька частин у краплі 8% глютарового альдегіду і
фіксували OsO4 протягом двох годин. Матеріал послідовно зневоднювали 20,
40, 50, 70, 80, 96, 100% спиртом, а потім поміщали його на 18 годин в
70% спирт, який містив 2% урацилацетату. Для заливки використовували
суміш смол Епон-812, DDSA, MNA, ДНР-30. Ультратонкі зрізи одержували на
ультрамікротомі В5 490 А «Tesla» і переглядали на електронному
мікроскопі B5 540 «Tesla».

Антагоністичну активність азоспірил щодо фітопатогенних грибів вивчали
за допомогою методу агарових блоків (Методы экспериментальной микологии,
1982).

Для опису культуральних реакцій взаємодії фітопатогенних грибів з
азоспірилами використовували модифіковану шкалу Джексона і Карла
(Симонян, Мамиконян, 1982).

При обліку ураженості рослин кореневими гнилями використовували балову
оцінку за розробленою шкалою і формулою (Коршунова и др., 1976).

Вміст загального азоту в зерні озимого жита вивчали за методом
К’єльдаля, білкового азоту — за Барштейном (Практикум по биохимии
растений, 1985), амінокислотний склад білка — на автоматичному
аналізаторі амінокислот Т-339.

Вегетаційні досліди проводили в вегетаційному будиночку на
дерново-середньопідзолистому пилувато-супіщаному грунті, який
характеризувався наступними агрохімічними показниками: вміст гумусу
становив 1,2%; азоту, що легко гідролізується (за Тюріним і Кононовою) —
57,0-58,0; рухомих форм фосфору (за Кірсановим) — 160,0-165,0 мг Р2О5;
обмінного калію (за Кірсановим) — 110,0-112,0 мг К2О на 1кг грунту;
рНН2О — 6,0. Вологість грунту підтримували на рівні 60% від повної
вологоємності.

Польові досліди проводили на стаціонарі Козелецької держсортодільниці
Чернігівської області (грунт — світло-сірий опідзолений супіщаний, вміст
гумусу в орному шарі становив 1,5%, азоту, що легкогідролізується (за
Тюріним і Кононовою) — 23-29 мг, рухомих форм фосфору (за Кірсановим) —
140-160 мг Р2О5; обмінного калію (за Масловою) — 110-120 мг К2О на 1 кг
грунту, рНсол — 5,6-6,2), в сівозміні дослідного поля відділу
рослинництва Інституту сільського господарства нечорноземної зони
України (грунт — дерново-середньопідзолистий супіщаний на морені, вміст
гумусу — 1,1%, загального азоту — 0,06%, рухомого фосфору (за
Кірсановим) — 148-151 мг Р2О5, обмінного калію (за Кірсановим) —
83-85 мг К2О на 1 кг грунту, рНсол — 5,0), на стаціонарі Носівської
селекційної дослідної станції (грунт — чорнозем глибокий малогумусний
вилугуваний легкосуглинковий. Вміст гумусу в орному шарі — 2,8%, рухомих
форм фосфору (за Кірсановим) — 148-150 мг Р2О5, обмінного калію (за
Чириковим) — 85-88 мг К2О на 1 кг грунту, рНсол — 5,4), в сівозміні
дослідного поля Чернігівського НВО «Еліта» (грунт — дерново-підзолистий
пилувато-піщаний, вміст гумусу в орному шарі становив 1,0-1,2%,
загального азоту — 0,09-0,14%, рухомих форм фосфору (за Кірсановим) —
140-190 мг P2O5, обмінного калію (за Кірсановим) — 100-130 мг K2O на 1кг
грунту, рНсол — 5,0).

Виробничі досліди з вивчення ефективності інокуляції озимого жита
діазобактерином проводили в дослідному господарстві Інституту сільського
господарства нечорноземної зони (грунт — дерново-підзолистий супіщаний,
характеризувався такими показниками: вміст гумусу в орному шарі — 0,73%,
загальний азот — 0,07%, рухомих форм фосфору (за Кірсановим) — 80-85 мг
Р2О5, обмінного калію (за Кірсановим) — 125-130 мг К2О на 1 кг грунту,
рНсол — 4,8), на полях дослідного господарства Інституту
сільськогосподарської мікробіології протягом 1993-1994 рр. (на площі
6га), 1997-1998 рр. (23 га), 1998-1999рр (25 га) (грунт —
дерново-підзолистий пилувато-супіщаний. Вміст гумусу в його орному шарі
становив — 0,9-1,1%, загального азоту — 0,08%, рухомих форм фосфору (за
Кірсановим) — 80-100 мг Р2О5, обмінного калію (за Кірсановим) —
100-150 мг К2О на 1 кг грунту, рН водної витяжки — 6,0-6,5, рНсол —
5,2).

Планування, проведення польових дослідів, спостереження і обліки
здійснювали за методиками польового досліду, розробленими Б.А.
Доспєховим (1985). При обробці одержаних даних використовували методи
математичної статистики (Доспехов, 1985).

АЗОТФІКСУЮЧИЙ ПОТЕНЦІАЛ АСОЦІАТИВНОЇ СИСТЕМИ ДІАЗОТРОФИ — НЕБОБОВА
РОСЛИНА

Активність азотфіксації в кореневій зоні озимого жита вивчали протягом
трьох років у трьох стаціонарних дослідах на дерново-підзолистих
грунтах. Необхідність проведення досліджень впродовж тривалого періоду
викликана тим, що азотфіксація є дуже мобільним процесом, на який
впливає багато екологічних факторів (температура, вологість, фаза
розвитку рослин тобто кількість продуктів кореневого екзоосмосу) (Патика
та ін., 1993). Висока варіабельність фіксації атмосферного азоту
викликана також динамічністю процесів трансформації азоту в грунті
(денітрифікації, амоніфікації, нітрифікації) і перетворенням сполук
азоту, які виникли в результаті цих процесів (Умаров, 1986).

Одержані нами результати свідчать, що продуктивність азотфіксації в
кореневій зоні озимого жита на дерново-підзолистих грунтах Полісся в
середньому складає біля 10кг азоту на 1га за три місяці вегетаційного
періоду (від фази стеблування до повного дозрівання). В окремі строки
відбору зразків була відмічена більш висока активність азотфіксації, яка
сягала 26 і, навіть, 69кг азоту в перерахунку на 1га за вегетаційний
період.

В кореневій зоні цієї культури створюються сприятливі умови для розвитку
різних систематичних та еколого-трофічних груп діазотрофів. Найбільш
поширеними і численними є гетеротрофні аеробні бактерії, серед яких
представники родів Azotobacter, Azospirillum, Agrobacterium, Bacillus,
Enterobacter, Pseudomonas. Анаеробні гетеротрофи представлені видами
роду Clostridium.

Всього з кореневої зони озимого жита та інших сільськогосподарських
культур було виділено понад 5000 штамів азотфіксуючих бактерій, серед
яких відібрали 503 штами з високою нітрогеназною активністю, що належали
до вказаних родів.

Найбільш високою здатністю до фіксації атмосферного азоту відзначалися
бактерії роду Azospirillum. Їх нітрогеназна активність становила від 5,8
до 11,2 мкг азоту на 1 мл поживного середовища за добу. Діазотрофи родів
Azotobacter і Enterobacter також характеризувалися достатньо високим
рівнем азотфіксуючої активності — 1,02-4,12 і 3,08-5,32 мкг азоту/мл
середовища за добу відповідно. Встановлено, що 42% всіх виділених штамів
бацил можна віднести до активних діазотрофів, діапазон нітрогеназної
активності яких складав 0,63-2,53мкг азоту/мл середовища за 24 години.
Вивчення азотфіксуючої здатності флуоресціюючих псевдомонад показало, що
тільки 14% усіх виділених штамів виявляли азотфіксуючу активнісь, яка
була в межах 0,020-1,493 мкг азоту/мл середовища за добу.

Виділені агробактерії були ідентифіковані нами як Agrobacterium
radiobacter. Відомо, що бактерії роду Agrobacterium вважаються умовно
патогенними (Лутова и др., 2000). Вони здатні викликати захворювання
«волосяний корінь» і утворювати так звані гали на коренях рослин, крім
Agrobacterium radiobacter, який не викликає патологічних змін на коренях
рослин і вважається перспективним для інокуляції (Іутинська, Патика,
2000). Із виділених нами штамів Agrobacterium radiobacter лише 4
володіли азотфіксуючою активністю, але вона була незначною і становила
0,082-0,140 мкг азоту/мл середовища за добу.

Для того, щоб віднести діазотроф до асоціативних мікроорганізмів,
недостатньо грунтуватися тільки на його здатності активно фіксувати
молекулярний азот у чистій культурі на поживному середовищі. Важливою
умовою відбору мікроорганізмів — асоціативних азотфіксаторів є їх
спроможність приживатися в ризосферному грунті при інтродукції в
кореневу зону рослин і забезпечувати активізацію процесу асоціативної
азотфіксації. З цією метою у вегетаційних дослідах вивчали нітрогеназну
активність діазотрофів, які характеризувалися різним рівнем
азотфіксуючої активності в чистій культурі, в асоціації з рослинами
озимого жита. Одержані результати свідчать про те, що прямої залежності
між нітрогеназною активністю діазотрофів в чистій культурі і в асоціації
з озимим житом не виявлено (рис. 1-2).

Інокуляція озимого жита азотфіксуючими бактеріями родів Enterobacter і
Agrobacterium не призводила до збільшення нітрогеназної активності в
кореневій зоні цієї культури. Отже, використовуючи згадані бактерії, нам
не вдалося сформувати активну азотфіксуючу асоціацію діазотрофи — озиме
жито.

Інтродукція бактерій родів Azospirillum, Azotobacter, Bacillus,
Pseudomonas у кореневу зону озимого жита сприяє формуванню активної
азотфіксуючої асоціації діазотрофи — озиме жито (рис. 2). Найбільш
суттєве збільшення активності азотфіксації відмічено при використанні
представників роду Azospirillum.

ГЕНЕТИЧНА ДЕТЕРМІНАЦІЯ НЕБОБОВИМИ РОСЛИНАМИ АЗОТФІКСУЮЧОГО КОМПЛЕКСУ З
РИЗОСФЕРНИМИ ДІАЗОТРОФАМИ

Активне функціонування асоціативної системи діазотрофи — рослина
обумовлюється рівною мірою як мікро-, так і макросимбіонтом. Асоціативні
азотфіксатори при рослинно-мікробних взаємодіях виконують різноманітні
функції, а саме: фіксують атмосферний азот, поліпшують живлення рослин
за рахунок підвищення коефіцієнту використання мінерального азоту
грунту, синтезують біологічно активні речовини, що стимулюють ріст і
розвиток кореневої системи, підвищують стійкість рослин до дії
патогенів. Рослина, в свою чергу, генетично детермінує склад, кількість
і швидкість виділення кореневих ексудатів і кореневого опаду, які
слугують джерелом енергії і живлення мікроорганізмів, синтезує
фітогормони, які впливають на життєдіяльність діазотрофів та підвищують
здатність коренів до адгезії азотфіксуючих мікроорганізмів (Шумный и
др., 1991).

Здатність рослин контролювати формування азотфіксуючого комплексу в
асоціації з ризосферними бактеріями і підтримувати цей процес визначена
як nis-ознака (Rennie, 1981).

Скринінг 52 сортів і гібридів озимого жита за ознакою асоціативної
азотфіксації показав, що існує міжсортова мінливість за даною ознакою.
Нами встановлено спектр мінливості сортів і гібридів озимого жита за
нітрогеназною активністю від 0 до 65 мкг азота/посудину за годину (рис.
3). Сорти з дуже високою і низькою азотфіксуючою активністю (більше 50 і
менше 10 мкг азоту/посудину за годину) трапляються рідко. У 75%
досліджених сортів і гібридів озимого жита нітрогеназна активність
становила 15-25 мкг азоту/посудину за годину. Між сортами виявлено
14-кратні розбіжності.

На рис. 4. представлено результати скринінгу 36 сортів і гібридних ліній
озимого жита за ознакою асоціативної азотфіксації. Середня нітрогеназна
активність у досліді становила 19,25 мкг азоту/посудину за годину, в 21
генотипі нітрогеназна активність була меншою від середньої, в 15
генотипів — переважала середню. Отже, існує реальна можливість вести
пошук сортів з підвищеною нітрогеназною активністю.

Нами показано, що поряд з міжсортовою існує внутрішньосортова мінливість
озимого жита за здатністю до асоціативної азотфіксації, яка обумовлена
як генетичною неоднорідністю сортів, так і впливом навколишнього
середовища на цю ознаку. Насиченість популяцій того чи іншого сорту
генотипами, які характеризуються високою азотфіксуючою активністю,
обумовлює високий азотфіксуючий потенціал сорту. Одночасно в кожній
популяції є рослини з низькою нітрогеназною активністю, тому при
селекційній роботі з гетерогенними за nis-ознакою сортами є реальна
можливість вести пошук генотипів-донорів високої нітрогеназної
активності.

Кореляційні зв’язки між рівнем асоціативної азотфіксації і селекційними
ознаками озимого жита вивчалися нами на сорті Струна з генами
домінантної короткостеблості HlHl і імунітету до борошнистої роси ErEr.
Результати визначення генетичних кореляцій азотфіксуючої активності з
селекційними ознаками вихідних рослин і їх сімей засвідчили, що між
висотою вихідних рослин і асоціативною азотфіксацією їх похідних сімей
мають місце істотні негативні генетичні кореляції (rG рослин, 1991р. =
-0,5507). Між висотою рослин похідних сімей і асоціативною азотфіксацією
в кореневій зоні цих рослин виявлено істотний негативний генетичний
зв’язок (rG сімей 1992р. = -0,3844).

Нами також визначався, на прикладі озимого жита сорту Струна, коефіцієнт
успадкування у вузькому розумінні (rG) здатності до асоціативної
азотфіксації. З цією метою проведено кореляційно-регересивний аналіз між
селекційними ознаками вихідних рослин (1991р.) і їх сімей (1992р.) з
асоціативною азотфіксацією в кореневій зоні їх прямих нащадків.
Результати представлені в табл. 1.

Таблиця 1

Генетичні кореляції (rG) вихідних рослин (1991р.) і їх похідних сімей
(1992р.) з асоціативною азотфіксацією в кореневій зоні їх прямих
нащадків (1993р.) озимого жита сорту Струна

Селекційна ознака rG 1991р. rG 1992р.

Висота рослин, см -0,0803 -0,1752

Продуктивна кущистість, шт. 0,1131 -0,3445*

Довжина колоса, см 0,0258 -0,0376

Число квіток у колосі, шт. -0,1899 -0,3875**

Число зерен у колосі, шт. -0,2119 -0,3801**

Озерненість колоса, % -0,1195 -0,0927

Щільність колоса -0,1786 -0,2565

Маса зерна з колоса, г -0,2493 -0,0630

Маса зерна з рослини, г -0,0184 -0,0404

Маса 100 зерен з рослини, г 0,2619 0,1618

Примітка: *, **, — Істотно при 0,05 і 0,01 рівнях відповідно.

При репродукуванні в 1993 р. популяція жита за висотою рослин приходила
до певної рівноваги і істотних генетичних кореляцій між висотою рослин
озимого жита і асоціативною азотфіксацією в кореневій зоні їх нащадків
не виявлено, хоча негативна за напрямом генетична кореляція (rG =
-0,0803) цієї ознаки залишалася. Негативна спрямованість генетичного
коефіцієнту кореляції свідчить про підвищену азотфіксацію нащадків
короткостеблових рослин озимого жита сорту Струна.

Певна негативна генетична кореляція (rG = -0,3445) продуктивної
кущистості сімей (1992 р.) з асоціативною азотфіксацією в кореневій зоні
їх прямих нащадків (1993 р.) свідчить про більш високу активність
азотфіксуючих бактерій в кореневій зоні озимого жита у нащадків рослин з
меншою кущистістю.

Відносно довжини колоса у вихідних рослин і їх сімей, то за роки
досліджень не виявлено чітко спрямованих генетичних кореляцій цього
показника з асоціативною азотфіксацією в кореневій зоні їх нащадків.

Число квіток і зерен у колосі вихідних рослин і їх сімей має негативну
кореляцію з нітрогеназною активністю в кореневій зоні прямих нащадків,
хоча вона не завжди була істотною в межах прийнятого рівня істотності.
Можна говорити про більш високу активність азотфіксаторів у зоні коренів
озимого жита з меншим числом квіток у колосі вихідних батьківських
рослин і сімей. Це підтверджується негативною генетичною кореляцією
озерненості вихідних сімей у 2002 р. (rG = -0,5008) з асоціативною
азотфіксацією в їх кореневій зоні.

Щільність колоса, маса зерна з колоса і рослини не виявили кореляції з
нітрогеназною активністю в кореневій зоні прямих нащадків.

Коефіцієнт успадкування здатності до асоціативної азотфіксації у
вузькому розумінні, визначений за подвоєним коефіцієнтом кореляції «мати
— нащадок» виявився невисоким (h2 = 0,2986). Невисоке значення цього
коефіцієнта означає, що тільки близько 30% рослин озимого жита
успадковують підвищену здатність до асоціативної азотфіксації. Тому для
проведення ефективних доборів рослин озимого жита за цією ознакою
необхідна висока інтенсивність добору з перевіркою його результатів у
прямих нащадків.

ВИКОРИСТАННЯ ДІАЗОТРОФІВ ЯК ЗАСОБІВ ПІДВИЩЕННЯ ПРОДУКТИВНОСТІ
СІЛЬСЬКОГОСПОДАРСЬКИХ КУЛЬТУР

В результаті проведення серії вегетаційних і польових дослідів
встановлено, що найбільшою нітрогеназною активністю відзначалися сорти
Харківське 78, Харківське 60, Куштро, Новозибківське 150, Боротьба,
Верхнячське 32. Мінімальну азотфіксуючу активність реєстрували в
ризоплані сортів Зоря, Заозерське, Свіча.

Здатність сортів озимого жита відзиватися на інокуляцію діазотрофами
вивчали в вегетаційних дослідах. Були використані сорти, які
характеризувалися як мінімальною активністю асоціативної азотфіксації в
ризоплані рослин, так і максимальною. Як свідчать одержані дані, сорти
Боротьба, Харківське 78, Верхнячське 32 відзначалися найбільшою
здатністю відзиватися на інокуляцію азотфіксуючими бактеріями родів
Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Pseudomonas.

Критеріями відбору сортів рослин, здатних забезпечувати ефективне
функціонування азотфіксуючої системи діазотрофи — рослина, слугували:
підвищена активність асоціативної азотфіксації в ризоплані рослини, їх
спроможність реагувати на інокуляцію діазотрофами підвищенням
нітрогеназної активності в кореневій зоні рослин та зрештою —
збільшенням урожайності.

Критеріями при селекції ефективних діазотрофів були: висока нітрогеназна
активність бактерій в чистій культурі, їх здатність активно колонізувати
кореневу зону рослин і вступати в асоціативні взаємовідносини з
рослиною, посилюючи процес фіксації атмосферного азоту в системі
діазотрофи — рослина, а також утворення в процесі життєдіяльності
біологічно активних речовин, що в цілому сприяє підвищенню урожаю
сільськогосподарських культур і поліпшенню його якості.

Вивчення динаміки колонізації кореневої зони озимого жита азоспірилами
проводили з використанням одержаного нами мутанта штаму A. brasilense
18-2, стійкого до високих доз стрептоміцину (1200 мкг/мл) (рис. 5).

Аналіз одержаних даних показав, що азоспірили здатні приживатися в
грунті ризосфери і в ризоплані озимого жита. Чисельність даних бактерій
в ризосфері складала 1-8 тис. клітин на 1 г грунту і залишалась без
істотних змін протягом усього періоду проведення досліду. В ризоплані
мало місце значне зростання вмісту A. brasilense 18-2str протягом всього
періоду досліджень. Так, через 35 діб чисельність даних бактерій
збільшилась в 20 разів у порівнянні з першим визначенням через сім діб.

З літератури відомо, що неефективне застосування азоспірил, яке інколи
трапляється, пов’язане зі слабким їх приживанням в кореневій зоні рослин
в результаті інгібування їх росту аборигенними ризосферними
мікроорганізмами (Omar, 1992). Іншими роботами показано, що азоспірили,
інтродуковані в ризосферу злакових культур, здатні не тільки
колонізувати поверхню коренів, а й проникати у внутрішню частину кореня
(Bally et al., 1983; Renu et al., 1988; Levanony et al., 1990).

Враховуючи вищезазначене, ми визначали чисельність азоспірил не тільки в
ризосфері і ризоплані, але й у внутрішніх тканинах коренів (гістосфері)
рослин озимого жита (табл. 2).

Таблиця 2

Колонізація озимого жита A. brasilense 18-2str (вегетаційний дослід)

Термін визначення після інтродукції штаму, діб Коренева сфера
Чисельність клітин, тис./г грунту (сирих коренів)

28 Ризосферний грунт 1,0

Ризоплана 405,0

Гістосфера 230,0

35 Ризосферний грунт 3,9

Ризоплана 1020,0

Гістосфера 400,0

Представлені дані свідчать про активну колонізацію азоспірилами
гістосфери озимого жита. Даним фактом можна пояснити те, чому
застосування культури A. brasilense 18-2 виявилося ефективним на такій
озимій культурі, як жито. Азоспірили, що проникають у внутрішню частину
коренів, знаходять більш сприятливі умови для приживання і розвитку, в
цьому випадку вони позбавлені негативного впливу аборигенних ризосферних
мікроорганізмів і від’ємних температур.

Завдяки утворенню стійких асоціацій з рослиною, інтродукований діазотроф
краще пристосовується до умов навколишнього середовища і має переваги
щодо живлення перед аборигенними мікроорганізмами. Чинники, що
обумовлюють стійкість асоціативної системи діазотрофи — небобова
рослина, різноманітні, їх функціонування сприяє створенню оптимальних
умов для партнерів. Найбільш вагомим інтегральним показником стійкості
утворених асоціативних систем, який визначає ефективність інтродукції
діазотрофів в агробіоценоз, є продуктивність рослин.

Результати трьохрічних польових дослідів, проведених на світло-сірому
опідзоленому грунті, показали високу ефективність інокуляції озимого
жита сорту Харківське 78 культурою Azospirillum sp. 18-2. Як свідчать
одержані дані (табл. 3), передпосівна обробка насіння озимого жита
суспензією клітин A. brasilense 18-2 забезпечила суттєвий приріст урожаю
зерна, який досягав 10,2-37,4%. Збільшився також вміст загального азоту
в зерні озимого жита. Активність асоціативної азотфіксації в варіантах з
інокуляцією переважала аналогічний показник контрольного варіанту в
1,2-2,8 раза.

Таблиця 3

Ефективність інокуляції A. brasilense 18-2 озимого жита сорту Харківське
78 (польовий дослід, стаціонар Козелецької держсортодільниці)

Варіант досліду Роки досліджень Урожай зерна, ц/га Приріст урожаю зерна
Вміст загального азоту, % Активність азотфіксації, мкг азоту/м2 за
годину*

ц/га %

Контроль, N60P60K60 (фон) 1986 — 1987 рр. 34,4 — — 1,74 282

Фон + інокуляція

47,2 12,8 37,4 2,02 451

НІР05

1,24

Фон 1987 — 1988 рр. 41,0 — — 1,63 395

Фон + інокуляція

46,2 5,1 12,7 1,87 478

НІР05

2,64

Фон 1988 — 1989 рр. 53,0 — — 1,71 155

Фон + інокуляція

58,4 5,4 10,2 1,99 434

НІР05

1,98

Примітка. * середня за вегетаційний період.

Важливим показником якості зерна є його амінокислотний склад. На рис. 6
і табл. 4 наведені результати аналізу вмісту амінокислот в зерні озимого
жита під впливом інокуляції азоспірилами.

Таблиця 4

Вплив інокуляції азоспірилами на амінокислотний склад зерна озимого жита
сорту Харківське 78 (польовий дослід 1988-1989 рр., стаціонар
Козелецької держсортодільниці)

Амінокислоти Без інокуляції Інокуляція A. brasilense 18-2

1988 1989 1988 1989

1 2 3 4 5

Всього амінокислот в зерні, мг/100г зерна 6346 5741 8887 7973

в тому числі:

незамінні 1751 1776 2588 2532

замінні: 4595 3965 6299 5441

в тому числі:

аланін 317 281 327 334

аспарагінова кислота 864 218 749 273

аргінін 502 718 761 946

гістидін 487 353 515 535

гліцин 199 271 329 359

глутамінова кислота 1327 1508 2436 2048

пролін 482 248 564 404

серин 241 158 448 197

тирозин 176 210 170 344

Наведені дані свідчать про значне збільшення вмісту амінокислот в зерні
озимого жита сорту Харківське 78 під впливом A. brasilense 18-2. Сумарна
кількість амінокислот у варіантах із застосуванням азоспірил зросла на
38,9-40% у порівнянні з контролем (табл. 4). Вміст глутамінової кислоти,
яка є ключовим субстратом азотного обміну, збільшився на 35,8-83,8% в
залежності від року досліджень. Слід відмітити також істотне збільшення
вмісту незамінних амінокислот — ізолейцину, лізину, трионіну,
фенілаланіну.

Таким чином, проведеними дослідженнями встановлено, що інтродукція A.
brasilense 18-2 в кореневу зону озимого жита сприяє посиленню процесу
фіксації молекулярного азоту, збільшенню вмісту загального і
біологічного азоту та амінокислот в урожаї. Зазначене є свідченням
активного функціонування асоціативної системи азоспірили — озиме жито і
її позитивної ролі в забезпеченні рослин зв’язаним азотом.

СПОНТАННЕ УТВОРЕННЯ БУЛЬБОЧОК НА КОРЕНЯХ НЕБОБОВИХ РОСЛИН

Загальновідомо, що найбільш ефективними системами біологічної фіксації
молекулярного азоту є симбіози бобових рослин з бактеріями родів
Bradyrhizobium і Rhizobium, деяких небобових (вільха, обліпиха, малина)
з актиноміцетами роду Frankia, папоротей роду Azolla з ціанобактеріями
Anabaena azolla (Smith et al., 1987). В цих системах азотфіксуючі
бактерії функціонують в спеціалізованих структурах (бульбочках), де
створюються сприятливі умови для діазотрофів.

Згідно з уявленнями більшості дослідників, асоціативні взаємовідносини
між азотфіксуючими мікроорганізмами і небобовими рослинами, на відміну
від вищезгаданих симбіозів, не призводять до утворення бульбочок або
інших морфологічно виражених структур. Однак в літературі трапляються
дані про наявність бульбочкоподібних утворень на коренях деяких
небобових рослин (Родынюк и др., 1980; Лисова и др., 1987). Водночас, у
цих роботах бракує доказів існування і активного функціонування
природних азотфіксуючих симбіозів діазотрофів з небобовими рослинами.
Невивченими залишаються питання щодо здатності різних родів діазотрофів
утворювати кореневі бульбочки на небобових рослинах, характеру їх
взаємодії з рослинами, ролі в накопиченні зв’язаного азоту і поліпшенні
режиму азотного живлення рослин.

Бульбочкоподібні утворення були виявлені на коренях шовковиці (Пилипенко
и др., 1992). Бульбочки мали діаметр 0,3-0,8 см, розміщувались на
відстані 0,2-18 см одна від одної і зовні були схожі на бульбочки
бобових рослин, зокрема гороху. Було показано тісний зв’язок між
підвищенням продуктивності рослин шовковиці і наявністю на їх коренях
бульбочок. Так, рослина шовковиці, на коренях якої утворилися бульбочки,
відзначалася інтенсивним ростом, вона у 2 рази перевищувала рослини, що
росли поряд за висотою і в 3,4 рази — за діаметром стовбура. Площа
листових пластин рослини з бульбочкоподібними структурами була в
середньому на 19,5% більша, ніж у рослин, без таких структур (Пилипенко
и др., 1994).

3/4 A A e t ? –

E

gd±-E

ae

*

,

. ae o F H ? ? //iae/Oe/Oe/E/E/Oe/3/43/43/43/4/3/43/4

dh^„

dh^„

&

dha$

aedaefae(c?ioooooooooooeaeoooooooooeUo

3/4

3/4

.

0

2

4

3/4

3/4

3/4

3/4

3/4

3/4

3/4

3/4

3/4

3/4

3/4

3/4

3/4

3/4

3/4

3/4

3/4

3/4

3/4

3/4

”y•

”y•

a$

h? aeBПроведеними нами дослідженнями показано, що бульбочки, які
спонтанно утворилися на коренях шовковиці, характеризувалися високою
нітрогеназною активністю, яку можна порівняти з активністю симбіотичної
азотфіксації бульбочок деяких видів бобових культур (рис. 7). З
поверхнево стерилізованих бульбочок, були виділені азотфіксуючі
бактерії.

Виділення в чисту культуру і вивчення культурально-морфологічних та
фізіолого-біохімічних ознак дозволило ідентифікувати їх як Azospirillum
brasilense і Agrobacterium radiobacter.

Штами Azospirillum brasilense 53, A. brasilense 54, A.brasilense 61
розрізняються за нітрогеназною активністю, а також за характерними
маркерними ознаками. Штам A. brasilense 61 стійкий до стрептоміцину і
помірно стійкий до тетрацикліну. Для стримування росту культури
необхідна концентрація стрептоміцину 200 мкг/мл, тетрацикліну — 15
мкг/мл. Штам A.brasilense 54 стійкий до стрептоміцину і не стійкий до
тетрацикліну, ріст культури припиняється при концентрації стрептоміцину
250 мкг/мл. Штам A.brasilense 53 помірно стійкий до стрептоміцину і
нестійкий до тетрацикліну. Для припинення росту культури достатня
концентрація стрептоміцину 50 мкг/мл.

Вивчення чистих культур виділених штамів азоспірил дозволило встановити,
що їх нітрогеназна активність при використанні напіврідкого малатного
середовища Доберейнер досягала 8,03-11,8 мкг азоту на 1мл живильного
середовища за добу. Агробактерії значно поступалися азоспірилам за
здатністю до азотфіксації, їх нітрогеназна активність не перевищувала
0,1мкг азоту на 1мл середовища за добу.

Однак в умовах спільного культивування штамів A. radiobacter 51 і A.
radiobacter С-7 титр кожного з них збільшувався на порядок у порівнянні
з монокультурами, підвищувалась також і активність процесу фіксації
атмосферного азоту.

Ефективність використання консорціуму агробактерій Ш-1 (який складається
із штамів A. radiobacter 51 і A. radiobacter С-7) як засобу підвищення
продуктивності шовковиці вивчали в порівнянні з штамами азоспірил,
виділених із бульбочок шовковиці (A. brasilense 54) і кореневої зони
сільськогосподарських культур (A. brasilense 18-2) (табл. 5).

Таблиця 5

Вплив діазотрофів на масу листків рослин шовковиці сорту Харківська 11

Варіант досліду Маса листків на кущі, кг Приріст маси листків

кг %

1 2 3 4

Без інокуляції (контроль) 2,132 —- —-

Інокуляція консорціумом агробактерій Ш-1 2,690 0,558 26,20

Продовження таблиці 5

1 2 3 4

Інокуляція A. brasilense 54 2,315 0,180 8,58

Інокуляція A. brasilense

18-2 2,346 0,214 10,03

НІР05 0,112

Наведені дані свідчать, що застосування консорціуму агробактерій на
п’ятирічних насадженнях шовковиці було найбільш ефективним. Штами
азоспірил також позитивно впливали на параметри листової пластини,
структурні елементи урожаю і листову масу шовковиці, причому культура A.
brasilense 18-2 виявилася більш ефективною, ніж A. brasilense 54.

Таким чином, використання азотфіксуючих бактерій, виділених із
бульбочок, що спонтанно утворилися на коренях рослин шовковиці, для
інокуляції насіння і п’ятирічних рослин, забезпечує значне підвищення
продуктивності культури. Встановлений факт дозволяє розглядати зазначені
діазотрофи як ефективний засіб поліпшення азотного живлення рослин
шовковиці за рахунок азоту атмосфери, що дуже важливо з точки зору
збереження довкілля від надмірного забруднення хімічними засобами.

ІНДУКОВАНЕ ФОРМУВАННЯ АЗОТФІКСУЮЧОГО СИМБІОЗУ У НЕБОБОВИХ РОСЛИН

Діазотрофи, інтродуковані в агробіоценоз вступають в складні
взаємовідносини як з аборигенною мікрофлорою ризосфери і ризоплани, так
і з самою рослиною. Від їх здатності утворювати ефективні асоціації з
сільськогосподарськими культурами залежить активність процесу фіксації
атмосферного азоту, синтез біологічно активних речовин, під впливом яких
покращується живлення рослин, підвищується їх продуктивність, зростає
стійкість рослин до дії патогенів (Патика та ін., 1993).

Однак навіть при ефективній взаємодії асоціативних мікроорганізмів з
небобовими рослинами, частина фіксованого азоту неминуче втрачається
через процеси денітрифікації. Цим втратам можна запобігти, перетворивши
асоціативні взаємовідносини в системі діазотрофи — небобова рослина на
симбіотичні, де азот, що фіксується мікроорганізмами, без втрат
залучається до складу рослини.

Роботами деяких авторів показано, що асоціативні азотфіксуючі бактерії
роду Azospirillum здатні не тільки колонізувати кореневу систему та
значною мірою впливати на фізіологію і продуктивність рослин, а й
проникати у внутрішню частину кореня. Клітини азоспірил виявлені
всередині судин ксилеми, а також в міжклітинному просторі кори (Лукин и
др., 1987). Така локалізація життєздатних клітин азоспірил сприятлива
для процесу азотфіксації, так як в цих мікрозонах забезпечується низький
парціальний тиск кисню і необхідна кількість енергетичного матеріалу.
Важливою є і та обставина, що від азоспірил, що заселяють внутрішні
тканини кореня в рослину безпосередньо надходять фіксований азот і
фітогормони. Незважаючи на встановлений факт про внутрішньокореневу
локалізацію азоспірил, загальноприйнятною залишається точка зору, що
азоспірили інфікують корені небобових рослин, але при цьому не утворюють
на них морфологічно виражених структур на зразок бульбочок бобових
рослин.

В останні роки увагу дослідників привертає явище паранодуляції — штучне
ініціювання утворення псевдобульбочок на коренях небобових рослин під
впливом різних хімічних агентів (2,4-діамінної солі, гормонів рослин,
літичних ферментів), які отримали назву абіогенних факторів нодуляції
(Лобакова и др., 2001). Відомі роботи, в яких наводяться результати
одночасного застосування абіогенних факторів нодуляції та інокуляції
утворених псевдобульбочок азотфіксуючими мікроорганізмами (Ковальская и
др., 2001). Використані при цьому мікроорганізми отримали назву
біологічних агентів нодуляції.

Як було нами показано вище, азоспірили в комплексі з агробактеріями
здатні спонтанно утворювати азотфіксуючі бульбочки на коренях шовковиці,
тому цілком вірогідним можна вважати і можливість індукованого
формування азотфіксуючого симбіозу вказаних діазотрофів з небобовою
рослиною.

В зв’язку з тим, що шовковиця — це багаторічна рослина, спостереження за
процесом нодуляції якої дуже ускладнюються, перед нами постало завдання
вибору зручного об’єкта для вивчення можливості штучного утворення
бульбочок небобовою рослиною під впливом біологічних нодуляційних
агентів. Проведеними дослідженнями було виявлено, що таким об’єктом
можуть слугувати рослини моркви.

В нашій роботі щодо індукованого утворення азотфіксуючих бульбочок на
коренях моркви абіогенні фактори нодуляції не використовували. Як
біологічні нодуляційні агенти застосовували асоціативні азотфіксуючі
бактерії роду Azospirillum, які повною мірою відповідають вимогам
стосовно біологічних агентів нодуляції і є зручною моделлю при вивченні
різних аспектів асоціативної системи діазотрофи — рослина. Для
дослідження використовували культури азоспірил, які були виділені з
ризосферного грунту і ризоплани різних сільськогосподарських культур, а
також азоспірили, виділені з бульбочок шовковиці.

Проведені дослідження показали, що всі штами азоспірил, які
використовувалися в дослідах, здатні утворювати бульбочки на коренях
рослин моркви. Кількість бульбочок, що утворилися на одній інокульованій
рослині, становила 1-8 штук, маса однієї бульбочки коливалася від 1,68
до 5,15 мг. В контрольному варіанті бульбочкоподібних структур не
виявлено.

Бульбочки, що утворилися на коренях моркви внаслідок інокуляції
азоспірилами, характеризувалися значною азотфіксуючою активністю, яка
коливалася в межах від 0,55 до 5,21 мкг азоту/г бульбочок за годину.
Нітрогеназна активність невідмитих коренів рослин у контролі була значно
нижчою, ніж у варіантах з інокуляцією і складала 0,25 мкг азоту/г
коренів за годину.

Електронно-мікроскопічними дослідженнями бульбочок, які утворилися на
коренях моркви, встановлено, що їх тканини складаються з великих
овальних клітин, більшу частину яких займає центральна вакуоль.

В провідних тканинах кореня, розташованих в центральній частині
бульбочок, не виявлено ні патологічних змін, ні бактерій.

В клітинах, які безпосередньо прилягали до міжклітинника, часто
трапляються поліморфні структури, що добре фарбувалися свинцем і які ми
ідентифікували як бактерії (рис. 8). Часто трапляються бактерії, у яких
спостерігається процес поділу (рис. 9).

З однієї клітини в іншу бактерії проникають через розриви клітинної
стінки (рис. 10).

Отже, проведеними дослідженнями показано, що асоціативні діазотрофи роду
Azospirillum можуть проникати в корені рослин моркви і здатні спричиняти
утворення бульбочок, які є місцем локалізації бактерій і
характеризуються значною нітрогеназною активністю. Низькій ступінь
колонізації бактеріями азоспірил клітин моркви в поєднанні з їх високою
азотфіксуючою активністю є також свідченням того, що в природних умовах
між рослинами моркви і внесеними азоспірилами виникають симбіотичні
взаємовідносини. Цим пояснюється і висока конкурентоспроможність та
вірулентність бактерій роду Azospirillum.

Таким чином, показано принципову можливість посилення процесу фіксації
молекулярного азоту у небобових рослин за рахунок формування штучних
симбіозів з використанням бактерій роду Azospirillum.

ПРЕПАРАТ ДІАЗОБАКТЕРИН ТА УМОВИ ЙОГО ЕФЕКТИВНОГО ЗАСТОСУВАННЯ

Завершальним етапом нашої роботи було створення препарату діазобактерину
для інокуляції насіння озимого жита, біоагентом якого слугували
азоспірили.

Ефективність діазобактерину вивчали в польових і виробничих дослідах.

Відомо, що на ефективність застосування біопрепаратів суттєво впливають
хімічні засоби захисту рослин. Більшість пестицидів негативно діє на
діазотрофи, порушує окремі етапи їх взаємодії з рослинами, знижує
ефективність інокуляції. У сільськогосподарському виробництві при
вирощуванні озимого жита застосовуються фунгіциди, гербіциди і
ретарданти. При можливості необхідно максимально зменшувати негативний
вплив пестицидів на асоціативну систему діазотрофи — рослина.

В більшості випадків здоровий насіннєвий матеріал озимого жита можна не
протруювати. Якщо протруєння все ж необхідно, то з цією метою бажано
використовувати малотоксичні для азоспірил фунгіциди (фундазол,
вітавакс). Як свідчать результати лабораторних і польових дослідів, при
сумісній обробці діазобактерином і вищезгаданими фунгіцидами доцільно
подвоїти дозу діазобактерину, враховуючи те, що титр азоспірил при
безпосередньому контакті з пестицидами зменшується в 1,5-2,2 раза, але
якщо протруєння насіння вказаними пестицидами проводити завчасно (за 7
днів до інокуляції), то дозу діазобактерину можна залишити без змін.

Сумісна обробка насіння озимого жита діазобактерином і такими
середньотоксичними для азоспірил фунгіцидами як байтан, байлетон,
фітолавін не бажана, тому, що при безпосередньому контакті з ними титр
азоспірил зменшується в 4,6-10,2 раза. Протруєння насіння вказаними
фунгіцидами обов’язково необхідно проводити завчасно (за 7-10 днів до
інокуляції). Високотоксичні для азоспірил фунгіциди, а саме: ТМТД і
фентиурам слід використовувати за 15-30 днів до інокуляції
діазобактерином. Протруєння фунгіцидами, які містять ртуть, недопустиме.

При дотриманні технології застосування діазобактерину з врахуванням
сумісності біоагента препарату з пестицидами можна добитися значного
підвищення урожаю сільськогосподарських культур. Про це свідчать
результати польового досліду, проведеного на стаціонарі Інституту
сільського господарства нечорноземної зони України (табл. 6). З
наведених даних видно, що спільне використання діазобактерину і
фунгіциду фундазолу, яким було завчасно протруєне насіння, сприяло
суттєвому приросту урожаю озимого жита, що досягав 15,2-22,1 відсотка.

Таблиця 6

Вплив діазобактерина і фундазола на урожай зерна озимого жита сорту
Верхнячське 32 в залежності від доз мінеральних добрив (польовий дослід
1995-1996 рр, стаціонар Інституту сільського господарства нечорноземної
зони)

Варіант досліду Урожай, ц/га Приріст урожаю

ц/га %

1 2 3 4

N45P45K45 (фон) 21,0 —- —-

Фон + діазобактерин 23,5 2,5 11,9

Фон + діазобактерин + фундазол 24,2 3,2 15,2

N90P90K90 (фон) 28,5 —- —-

Фон + діазобактерин 33,6 5,1 17,9

Продовження таблиці 6

1 2 3 4

Фон + діазобактерин + фундазол 34,8 6,3 22,1

НІР05 2,24

Що стосується гербіцидів, то при інокуляції діазобактерином бажано
використовувати безгербіцидні та малогербіцидні технології. Оскільки на
перших етапах взаємодії з рослинами азотфіксуючі бактерії найбільш
уразливі до впливу пестицидів, то використання грунтових гербіцидів
більш небезпечне, ніж гербіцидів, які застосовуються на вегетуючих
рослинах.

Ефективність бактеризації насіння озимого жита діазобактерином, при
внесенні мінеральних добрив та гербіциду діалену, вивчали в умовах
польового досліду на вищезгаданому стаціонарі. Гербіцид діален
застосовували весною в період відростання рослин. Результати проведених
досліджень свідчать, що використання діазобактерину забезпечило
вірогідний приріст урожаю зерна озимого жита як без внесення мінеральних
добрив, так і при внесенні фосфорно-калійних добрив (P90K90) та різних
доз мінерального азоту (від 45 до 135 кг/га). Підвищення урожайності
озимого жита в цілому у досліді становило 3,2-7,4 ц/га (8,0-15,5%).

Про поліпшення азотного живлення рослин за рахунок атмосферного азоту
свідчать дані, що були одержані нами при вивченні активності
асоціативної азотфіксації в кореневій зоні озимого жита. Аналіз
отриманих даних показав, що при інокуляції насіння озимого жита
діазобактерином різко підвищується активність асоціативної азотфіксації
в кореневій зоні культури. Так, у фазу цвітіння (фаза найвищої
активності процесу азотфіксації в системі діазотрофи — рослина)
нітрогеназна активність під впливом діазобактерину збільшилась в
7,1-10,5 раза в порівнянні з варіантом без інокуляції. В цілому за
вегетаційний період активність асоціативної азотфіксації у варіантах із
діазобактерином зросла в 3,4-5,0 раза.

Відомо, що внесення під озиме жито високих доз мінерального азоту може
спричиняти вилягання посівів, зазначене мало місце і в наших дослідах.
Щоб цього не трапилося, вирощування озимого жита за інтенсивними
технологіями передбачає застосування ретардантів, зокрема, кампозану.

В цьому зв’язку виникла необхідність вивчити можливість застосування
ретарданту кампозану на посівах озимого жита інокульованого
діазотрофами. Спочатку в лабораторних дослідах вивчали вплив кампозану
на азоспірили, які слугують діючою основою діазобактерину. Одержані дані
засвідчили відсутність інгібуючої дії даного ретарданту на
життєдіяльність азоспірил. Так, вирощування зазначених бактерій на
поживному середовищі з кампозаном у кількості 2 мг/мл не вплинуло на їх
ріст та розвиток, титр бактеріальних клітин при цьому був аналогічним
титру в контрольному варіанті.

Вивчення впливу кампозану на ефективність інокуляції озимого жита
діазобактерином за умов польового досліду підтвердило відсутність його
негативної дії на асоціативну систему діазотрофи — рослини озимого жита.
При застосуванні кампозану спостерігається тенденція до збільшення
приросту урожаю озимого жита, який становив 18,1-24,9 проти 11,9-17,9% в
варіанті без даного ретарданту.

Ефективність застосування діазобактерину для інокуляції насіння озимого
жита ми вивчали також в умовах виробничих дослідів протягом трьох років.
Результати трьохрічного випробування (табл. 7) на значних площах
(2-20 га) узгоджуються з даними, отриманими в численних польових
дослідах, і переконують в доцільності використання діазобактерину на
посівах озимого жита.

Таблиця 7

Ефективність інокуляції озимого жита сорту Боротьба діазобактерином у
виробничих дослідах (дослідне господарство Інституту
сільськогосподарської мікробіології)

Варіант досліду Рік проведення Площа, га Урожай, ц/га Приріст урожаю

ц/га %

Без інокуляції (контроль) 1993-1994 3 37,6 —- —-

Інокуляція діазобактерином

3 42,2 4,6 12,2

Без інокуляції (контроль) 1997-1998 3 30,0 —- —-

Інокуляція діазобактерином

20 34,2 4,2 14,0

Без інокуляції (контроль) 1998-1999 15 16,3 —- —-

Інокуляція діазобактерином

12 18,8 2,5 15,3

Таким чином, показана висока ефективність застосування новоствореного
препарату діазобактерину як засобу поліпшення азотного живлення рослин
озимого жита і підвищення урожайності культури.

ВИСНОВКИ

Теоретичні положення і результати, висвітлені в дисертаційній роботі,
дозволили розкрити особливості взаємодії мікро- і макросимбіонтів в
залежності від видів небобових рослин і мікроорганізмів, вперше науково
обгрунтувати і експериментально довести можливість утворення специфічних
симбіозів діазотрофів з небобовими рослинами, показати шляхи посилення
процесу фіксації молекулярного азоту у небобових рослин за рахунок
підвищення азотфіксуючого потенціалу асоціативної системи діазотрофи —
рослина та науково-прикладні аспекти використання селекціонованих штамів
діазотрофів, здатних суттєво активізувати процес фіксації атмосферного
азоту в кореневій зоні рослин, підвищувати їх продуктивність,
поліпшувати якість одержаної продукції за одночасного збереження
довкілля.

Встановлено, що озиме жито характеризується високою активністю
асоціативної азотфіксації. В кореневій зоні цієї культури створюються
сприятливі умови для розвитку різних таксономічних та еколого-трофічних
груп діазотрофів. Найбільш поширеними і численними є гетеротрофні
аеробні бактерії родів Azotobacter, Agrobacterium, Bacillus,
Enterobacter, Pseudomonas. Анаеробні гетеротрофи представлені родом
Clostridium.

Селекціоновано новий високоефективний штам азотфіксуючих бактерій
Azospirillum brasilense 18-2. Встановлено, що інтродукована в кореневу
зону озимого жита культура A. brasilense 18-2 здатна не тільки
приживатися в ризосферному грунті і ризоплані, але й активно
колонізувати гістосферу рослин, забезпечуючи формування активної
асоціативної системи азоспірила — рослина, при цьому активність фіксації
молекулярного азоту підсилюється в 1,2-13,0 разів, в залежності від
сорту озимого жита і екологічних факторів, урожай зерна збільшується на
5,1-12,8 ц/га (10,2-37,4%), сумарна кількість амінокислот зростає на
38,9-40%.

Скринінг сортів озимого жита за здатністю до асоціативної азотфіксації
показав, що існує широкий спектр мінливості, виявлено 14-кратні
розбіжності між сортами. Показано, що поряд з міжсортовою має місце
внутрішньосортова мінливість озимого жита за здатністю до асоціативної
азотфіксації, яка обумовлена як генетичною неоднорідністю сортів, так і
впливом навколишнього середовища на виявлення nis-ознаки. Визначено
коефіцієнт успадкування здатності до асоціативної азотфіксації (h2 =
0,2986), який свідчить, що тільки близько 30% рослин озимого жита
успадковують у потомстві підвищену здатність до асоціативної
азотфіксації.

Вперше з’ясовано природу біологічного явища — спонтанного утворення
бульбочок на рослинах шовковиці, які характеризуються високою
азотфіксуючою активністю, що дозволило показати принципову можливість
індукування утворення бульбочок на небобових рослинах з використанням
біологічних факторів нодуляції. Встановлено, що відповідальними за
процес нодуляції у шовковиці є діазотрофи родів Azospirillum і
Agrobacterium.

Одержано новий консорціум агробактерій, для підвищення продуктивності
шовковиці, застосування даного консорціуму сприяє зростанню листової
маси шовковиці на 14,6-67,9% в залежності від сорту.

Вперше на рослинах моркви під впливом бактерій роду Azospirillum було
штучно спричинено утворення бульбочок, що слугували місцем локалізації
бактерій і характеризувалися значною нітрогеназною активністю, яка в
2,2-20,8 раза переважала цей показник в контрольному варіанті.

Дослідженнями бульбочок, що утворилися на коренях моркви під впливом
інтродукованих бактерій роду Azospirillum, встановлено наявність
симбіотичних відносин між зазначеними діазотрофами і рослинами моркви.

Створено новий препарат діазобактерин на основі високоактивного і
технологічного штаму асоціативних азотфіксуючих бактерій Azospirillum
brasilense 18-2. Показана висока ефективність застосування
новоствореного препарату діазобактерину як засобу поліпшення азотного
живлення рослин озимого жита, та підвищення урожайності культури. Так, у
варіантах з діазобактерином активність процесу фіксації молекулярного
азоту в кореневій зоні рослин збільшилась в 3,4-5,0 раза, урожай зерна —
на 2,3-7,1 ц/га (9,6-24,6%).

Встановлено, що використання діазобактерину можна поєднувати з такими
малотоксичними для азоспірил фунгіцидами-протруйниками насіння як
фундазол і вітавакс, подвоївши при цьому дозу препарату, а також з
ретардантом кампазаном. Показано, що поєднане використання фунгіцидів
байтан, байлетон і фітолавін для протруєння насіння і діазобактерину для
інокуляції є недопустимим із-за токсичної дії протруйників на біоагенти
препарату.

РЕКОМЕНДАЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

Сільськогосподарському виробництву рекомендовано новий мікробний
препарат діазобактерин, який підвищує урожай зерна озимого жита на
10-25% і поліпшує його якість. Азоспірили, що складають основу
біопрепарату, виділені з природного біоценозу, вони безпечні для людей і
тварин, не забруднюють навколишнє середовище. Однією з особливостей
азоспірил є їх здатність утворювати біологічно активні речовини, які
сприяють росту і розвитку рослин озимого жита, посилюють активність
процесу азотфіксації в їх кореневій зоні. Інокуляція озимого жита
азоспірилами підвищує стійкість рослин відносно кореневих патогенів, що
сприяє схоронності посівів від сходів до збирання.

Для селекційної роботи з озимим житом запропоновано сорти-донори високої
азотфіксуючої активності: Харківське 78, Харківське 60, Куштро,
Новозибківське 150, Боротьба, Струна, Верхнячське 32, які відзначаються
підвищеним азотфіксуючим потенціалом і сприяють активізації процесу
фіксації молекулярного азоту в їх кореневій зоні та формуванню
ефективної системи діазотрофи — озиме жито.

Запропоновано новий консорціум агробактерій для підвищення
продуктивності шовковиці, застосування даного консорціуму сприяє
зростанню листової маси шовковиці на 14,6-67,9% в залежності від сорту.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Статті у наукових виданнях

Надкерничная Е.В., Надкерничный С.П., Колибаба В.В. Изучение
нитрогеназной активности и динамики образования клубеньков люпина в
лабораторной модели //Бюллетень Всесоюзного НИИ с.-х. микробиологии. —
1986. — №43. — С.34-37. (Планування дослідів, обговорення результатів,
текст статті).

Надкерничная Е.В. Влияние некоторых фитотоксинов грибного происхождения
на азотфиксирующую активность клубеньков люпина //Микробиол. журн. —
1986. — Т.48, №1. — С.21-24.

Надкерничная Е.В., Колибаба В.В., Мамчур А.Е., Зарицкий Н.М. Влияние
фитотоксического гликолипида на нитрогеназную активность и
ультраструктуру клубеньков люпина // Микробиол. журн. — 1986. — Т.48,
№4. — С.8-15. (Планування дослідів, проведення досліджень, обговорення
результатів, формування висновків, текст статті).

Надкерничная Е.В., Мамчур А.Е., Лохова В.И. Образование клубеньков на
корнях моркови, инокулированной азоспириллами // Микробиол. журн. —
1989. — Т.51, №5. — С.11-16. (Планування дослідів, проведення
досліджень, обговорення результатів, формування висновків, текст
статті).

Мальцева Н.Н., Волкогон В.В., Надкерничная Е.В., Лохова В.И., Лемешко
С.В. Азотфиксирующая активность азоспирилл в ассоциации с растениями
некоторых видов злаковых культур //Труды Всесоюзного НИИ с.-х.
микробиологии. — 1991. — Т.61. — С.66-73. (Проведення досліджень,
обговорення результатів, формування висновків).

Мальцева Н.Н., Надкерничная Е.В., Волкогон В.В., Ушакова М.А. Активность
азотфиксации и азотфиксирующие микроорганизмы ризосферы озимой ржи
//Микробиол. журн. — 1992. — Т.54, №6. — С.10-16. (Планування дослідів,
проведення досліджень, обговорення результатів, формування висновків).

Надкерничная Е.В., Ушакова М.А., Майстер А.А., Волынчук Н.К.
Эффективность предпосевной обработки семян озимой ржи азотфиксирующими
бактериями //Вісник аграрної науки. — 1994. — №8. — С.93-98. (Планування
дослідів, проведення досліджень, обговорення результатів, формування
висновків, текст статті).

Скорик В.В., Надкернична О.В., Сальник В.П. Вивчення генетичної
детермінації ознаки азотфіксуючої активності в кореневій зоні озимого
жита //Цитология и генетика. — 1994. -Т.28, №6. — С.61-65. (Планування
дослідів, проведення досліджень, обговорення результатів, формування
висновків).

Мальцева Н.Н., Надкерничная Е.В., Канивец Н.А., Любинецкий Н.Н., Бакун
А.И., Майстер А.А., Волынчук А.К. Биологическая фиксация молекулярного
азота в ризосфере озимой ржи при внесении азотных удобрений //Физиология
и биохимия культурных растений. — 1994. — Т.26, №3. — С.288-293.
(Планування дослідів, проведення досліджень, обговорення результатів,
формування висновків).

Мальцева Н.Н., Волкогон В.В., Надкерничная Е.В. Азотфиксирующие
ассоциации азоспирилл и некоторых видов злаковых культур //Мікробіол.
журн. — 1995. — Т.57, №1. — С.24-31. (Планування дослідів, проведення
досліджень, обговорення результатів, формування висновків).

Пилипенко Б.Ф., Мальцева Н.Н., Надкерничная Е.В., Сальник В.П.
Азотфиксирующие клубеньки на корнях шелковицы // Микробиол. журн. —
1996. — Т.58, №5. — С.93-95. (Проведення досліджень, формування
висновків).

Надкерничная Е.В., Ушакова М.А., Скорик В.В. Способность к азотфиксации
бактерий рода Pseudomonas и их использование для повышения урожайности
озимой ржи //Бюл. Института с.-х. микробиологии. — 1997. — №1. —
С.20-22. (Планування дослідів, проведення досліджень, обговорення
результатів, формування висновків, текст статті).

Патика В.П., Надкернична О.В., Скорик В.В., Сень О.В. Кореляційні
зв’язки між рівнем асоціативної азотфіксації і селекційними ознаками
озимого жита //Збірник наукових праць Інституту землеробства УААН. — К.:
Нора Прінт — 1999. — Вип.1-2. — С.144-150. (Планування дослідів,
проведення досліджень, обговорення результатів, формування висновків,
текст статті).

Надкерничний С.П., Надкернична О.В. Бактерії Azospirillum brasilense як
фактор підвищення імунітету рослин до збудників кореневих гнилей //Бюл.
Інституту с.-г. мікробіології. — 1999. — №4. — С.14-17. (Планування
дослідів, проведення досліджень, формування висновків).

Надкернична О.В. Використання азотфіксуючих бактерій Azospirillum
brasilense для поліпшення якості зерна озимого жита // Бюл. Інституту
с.-г. мікробіології. — 2000 — №8. — С.18-20.

Патика В.П., Надкернична О.В., Толкачов М.З., Скорик В.В. Азотфіксуючий
потенціал сільськогосподарських рослин і його використання в селекції
//Вісник аграрної науки. — 2000. — №2. — С.43-46. (Планування дослідів,
проведення досліджень, обговорення результатів, формування висновків,
текст статті).

Надкерничная Е.В., Майстер А.А. Эффективность бактериального препарата
диазобактерина на загрязнённой радионуклидами дерново-подзолистой почве
при внесении различных доз минеральных удобрений и пестицидов
//Агроекологічний журнал. — 2001. — №1. — С.38-40. (Планування дослідів,
проведення досліджень, обговорення результатів, формування висновків,
текст статті).

Надкерничная Е.В., Ковалевская Т.М. Влияние свободноживущих
азотфиксирующих бактерий на формирование и функционирование
бобово-ризобиального симбиоза у некоторых сельскохозяйственных культур
//Физиология и биохимия культурных растений. — 2001. — Т.33., №4. —
С.355-362. (Планування дослідів, проведення досліджень, обговорення
результатів, формування висновків, текст статті).

Надкернична О.В. Азотфіксувальні бульбочки на коренях моркви при
інокуляції її азоспірилами //Вісник Одеського національного
університету. — 2001. — Т.6, №4. — С.216-219.

Булатова Ю.О., Надкернична О.В., Ушакова М.А., Олексійченко Н.О. Вплив
азотфіксуючих бактерій на біометричні показники сіянців і гібридних
насаджень шовковиці //Агроекологічний журнал. — 2003. — №1. — С.57-59.
(Планування дослідів, обговорення результатів, формування висновків,
текст статті).

Надкернична О.В. Здатність діазотрофів до формування асоціативних систем
з рослинами озимого жита // Агроекологічний журнал. — 2003. — №3. —
С.17-20.

Надкернична О.В., Ушакова М.А., Олексійченко Н.О., Бабаєва Г.І.,
Пилипенко Б.Ф. Ефективне бактеріальне добриво для шовковиці //Аграрна
наука — виробництву. — Українська академія аграрних наук. — 2003. — Вип.
3. — С.6. (Планування дослідів, проведення досліджень).

Надкернична О.В. Штучне бульбочкоутворення на рослинах моркви //Вісник
аграрної науки. — 2003. — №10. — С.15.

Надкернична О.В. Генетичний поліморфізм озимого жита за здатністю до
асоціативної азотфіксації //Агроекологічний журнал. — 2003. — №4. —
С.62-65.

Надкернична О.В. Азотфіксуючі бактерії бульбочок, що утворилися на
коренях шовковиці //Наукові записки Тернопільського державного
педагогічного університету ім. Володимира Гнатюка. Серія: біологія. —
2003, №3 (22). — С.71-74.

Патенти

Пат. 40549 Україна, МКИ A01C1/00 C05F11/08. Спосіб передпосівної обробки
насіння озимого жита О.В. Надкернична, В.І. Лохова (Україна). Заявл.
02.01.1990; Опубл. 16.07.2001, Бюл. №6. (Планування дослідів, проведення
досліджень, аналіз одержаних результатів, формула винаходу, текст
винаходу).

Пат. 40542 Україна, МКИ C05F11/08 C12N1/20. Штам бактерій Azospirillum
brasilense для виробництва бактеріального добрива під гречку. В.І.
Лохова, О.В. Надкернична (Україна). Заявл. 02.11.1987; Опубл.
16.07.2001, Бюл. №6. (Планування дослідів, проведення досліджень, аналіз
одержаних результатів, формула винаходу, текст винаходу).

Пат. 48836 А Україна, МКИ С12N1/20. Консорціум штамів агробактерій для
виготовлення бактеріального добрива під шовковицю. О.В. Надкернична,
М.А. Ушакова, Н.О. Олексійченко, Г.І. Бабаєва, Б.Ф. Пилипенко (Україна).
Заявл. 19.12.2001; Опубл. 15.08.2002, Бюл. №8. (Планування дослідів,
проведення досліджень, аналіз одержаних результатів, формула винаходу,
текст винаходу).

Пат. 48835 А Україна, МКИ A01G29/00. Спосіб підвищення урожайності
листової маси шовковиці. О.В. Надкернична, Н.О. Олексійченко, М.А.
Ушакова, Ю.О. Булатова (Україна). Заявл. 19.12.2001; Опубл. 15.08.2002,
Бюл. №8. (Планування дослідів, проведення досліджень, аналіз одержаних
результатів, формула винаходу, текст винаходу).

Матеріали наукових конференцій

Надкерничная Е.В., Ковтун В.А. Нитрогеназная активность Rhizobium
meliloti в условиях симбиоза при возделывании люцерны на семена
//Микробиологические процессы в почвах и урожайность
сельскохозяйственных культур (Материалы к секции республ. конф. «Пути
повышения эффективности факторов интенсификации сельскохозяйственного
производства»). — Вильнюс. — 1986. — С.261-263. (Планування дослідів,
проведення досліджень, текст).

Надкерничная Е.В., Колибаба В.В., Мамчур А.Е., Зарицкий Н.М.
Ультраструктура клубеньков люпина после воздействия фитотоксического
гликолипида //V всесоюз. биохимический съезд (Тезисы стендовых
сообщений). — Том 3. — М.: «Наука». — 1986. — С.217-218. (Планування
дослідів, проведення досліджень, текст).

Надкерничная Е.В., Ушакова М.А., Сальник В.П. Способность различных
видов и штаммов азоспирилл образовывать азотфиксирующие клубеньки на
корнях моркови //Мікробіол. журн. — 1994. — Т.56, №2. — С.85.
(Планування дослідів, проведення досліджень, текст).

Maltseva N.N., Nadkernichnaya E.V., Kanivets N.A. Associations of
nitrogen-fixing bacteria with winter rye //Nitrogen fixation:
fundamentals and applications (Proceedings of the 10-th international
congress on nitrogen fixation, St. Petersburg, Russia, May 28 — June 3,
1995). — Kluwer Academic Publishers, Dordrecht-Boston-London. — 1995. —
P.769. (Планування дослідів, проведення досліджень).

Мальцева Н.Н., Надкерничная Е.В., Канивец Н.А. Ассоциация
азотфиксирующих бактерий с озимой рожью //9-й Баховский коллоквиум по
азотфиксации. Тезисы докл. — ОНТИ ПНЦ РАН, Пущино. — 1995. — С.77.
(Планування дослідів, проведення досліджень).

Maltseva N.N., Nadkernichnaya E.V., Kanivets N.A., Ushakova M.A. Study
of biological nitrogen entering in winter rye by nitrogen-fixing
bacteria inoculation //International workshop on associative
interactions of nitrogen-fixing bacteria with plants. Saratov, Russia,
June 5-8, 1995 (Book of abstracts). — Saratov, Russia. — 1995. — P.48.
(Планування дослідів, проведення досліджень).

Патыка В.Ф., Надкерничная Е.В., Скорик В.В. Роль генетических факторов в
явлении ассоциативной азотфиксации //Використання сучасних
молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у
генетико-селекційних дослідженнях (Збірник матеріалів II Міжнар. конф.,
м. Одеса). — Київ: Аграрна наука. — 1998. — С.41-42. (Планування
дослідів, проведення досліджень, текст).

Надкернична О.В., Скорик В.В., Патика В.П. Вплив генетичних факторів на
асоціативну азотфіксацію озимого жита //Сталий розвиток агроекологічних
систем в умовах обмеженого ресурсного забезпечення (Матеріли
наук.-метод. конференції). — К. — 1998. — С.122-123. (Планування
дослідів, проведення досліджень, текст).

Надкерничная Е.В., Скорик В.В., Патыка В.Ф. Азотфиксирующий потенциал
небобовых растений и его использование в селекции //Материалы 7-й
международной научно-практической конференции «Нетрадиционное
растениеводство, экология и здоровье». — Симферополь. — 1998. —
С.579-580. (Планування дослідів, проведення досліджень, текст).

Patyka V.F., Nadkernichnaya E.V., Tolkachev N.Z. Nitrogen fixing
potential of winter rye and soybean and its using in selection //New
approaches and techniques in breeding sustainable fodder crops and
amenity grasses (Proceedings of 22-nd Eucarpia fodder crops and amenity
grasses section meeting, October 17-21 1999 St. Petersburg Russia). —
Санкт-Петербург: Вира. — 1999. — С.168-169. (Планування дослідів,
проведення досліджень, текст).

Ковалевская Т.М., Надкерничная Е.В., Козар С.Ф., Бардаков А.Г.
Эффективность симбиоза Bradyrhizobium sp. (Lupinus) с люпином жёлтым в
условиях жесткого инфекционного фона //Состояние и перспективы развития
люпиносеяния в XXI веке (Тез. докл. Междунар. науч.-практ. конф. (ВНИИ
люпина, 17-19 июля 2001г.). — Брянск. — 2001. — С.53-56. (Планування
дослідів, проведення досліджень, текст).

Патыка В.Ф., Надкерничная Е.В. Генетическая детерминация признака
ассоциативной азотфиксации //Сельскохозяйственная микробиология в
XIX-XXI веках (Тезисы всерос. конф. 14-19 июня 2001г.). —
Санкт-Петербург. — 2001. — С.67-68. (Планування дослідів, проведення
досліджень, текст).

Надкерничная Е.В., Ушакова М.А., Алексейченко Н.А. Азотфиксирующие
бактерии рода Azospirillum, выделенные из клубеньков на корнях шелковицы
//Микробиология и биотехнология XXI столетия (Материалы международ.
конф.). — Минск. — 2002. — С.57-59. (Планування дослідів, проведення
досліджень, текст).

Надкернична О.В. Інтродукція діазотрофів в грунт — перспективний шлях
підвищення продуктивності агробіоценозів //Матеріали міжнарод. наукової
конф. «Сталий розвиток агроекосистем». — Вінниця. — 2002. — С.110-112.

Методичні рекомендації, в розробці і підготовці яких автор брав
безпосередню участь

Патика В.П., Толкачов М.З., Шерстобоєва О.В., Колмаз Ю.Т., Шерстобоєв
М.К., Бутвіна О.Ю., Князєв О.В., Чайковська Л.О., Волкогон В.В.,
Канівець В.І., Токмакова Л.М., Надкернична О.В. та ін. Рекомендації по
ефективному застосуванню біопрепаратів азотфіксуючих та
фосформобілізуючих бактерій в сучасному ресурсозберігаючому землеробстві
/Міністерство агропромислового комплексу України. Українська академія
аграрних наук. — К. — 1997. — 19с. (Планування дослідів, проведення
досліджень).

Патика В.П., Шерстобоєва О.В., Шерстобоєв М.К., Волкогон В.В.,
Надкерничний С.П., Мельничук Т.М., Канівець В.І., Токмакова Л.М.,
Близнюк Н.М., Надкернична О.В. та ін. Рекомендації по ефективному
застосуванню мікробіологічних препаратів у сучасному ресурсозберігаючому
землеробстві /Міністерство агропромислового комплексу України.
Українська академія аграрних наук. Інститут сільськогосподарської
мікробіології УААН. — Чернігів. — 1999. — 22с. (Планування дослідів,
проведення досліджень).

Патика В.П., Панченко Г.М., Зарицький М.М., Надкернична О.В., Волкогон
В.В. та ін. Сільськогосподарська мікробіологія — на допомогу аграрному
виробництву. Збірник наукових розробок /Інститут сільськогосподарської
мікробіології УААН. Чернігів. — 2001. — 59с. (Планування дослідів,
проведення досліджень, текст).

АНОТАЦІЯ

Надкернична О.В. Особливлсті взаємодії мікро- і макросимбіонтів в
системі діазотрофи — небобова рослина. — Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за
спеціальністю 03.00.16 — екологія. — Інститут агроекології та
біотехнології УААН, Київ, 2004.

Дисертація присвячена висвітленню особливостей взаємодії мікро- і
макроорганізмів в асоціативній системі діазотрофи — небобова рослина.
Визначено структуру асоціативного азотфіксуючого комплексу
мікроорганізмів кореневої зони небобових сільськогосподарських культур
та їх здатність до фіксації молекулярного азоту в залежності від
природних умов, особливостей росту і розвитку рослин.

Показана роль генотипу рослин у формуванні і активному функціонуванні
азотфіксуючого комплексу: ризосферні діазотрофи — рослина.

Встановлено принципову можливість утворення специфічних симбіозів
діазотрофів з небобовими рослинами.

Отримано новий високоефективний і технологічний штам азотфіксуючих
бактерій і на його основі створено препарат. Визначено умови ефективного
застосування біопрепарату для активізації процесу фіксації атмосферного
азоту в кореневій зоні небобових рослин, підвищення продуктивності
рослин, поліпшення якості одержаної продукції за одночасного збереження
довкілля від надмірного забруднення.

Ключові слова: азотфіксація, діазотрофи, індуковані симбіози, мікробний
препарат (біопрепарат), Azospirillum brasilense, озиме жито, шовковиця,
морква, урожай.

АННОТАЦИЯ

Надкерничная Е.В. Особенности взаимодействия микро- и макросимбионтов в
системе диазотрофы — небобовое растение. — Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени доктора биологических наук по
специальности 03.00.16 — экология. — Институт агроэкологии и
биотехнологии УААН, Киев, 2004.

В диссертации отражены сведения об особенностях взаимодействия микро- и
макроорганизмов в ассоциативной системе диазотрофы — небобовое растение.
Определена структура ассоциативного азотфиксирующего комплекса
микроорганизмов корневой зоны небобовых сельскохозяйственных культур и
их способность к фиксации молекулярного азота в зависимости от природных
условий, особенностей роста и развития растений.

Показана роль генотипа растений в формировании и активном
функционировании азотфиксирующего комплекса: ризосферные диазотрофы —
растение.

Установлена принципиальная возможность образования специфических
симбиозов диазотрофов с небобовыми растениями.

Получен новый высокоэффективный и технологический штамм азотфиксирующих
бактерий и на его основе создан препарат. Определены условия
эффективного использования биопрепарата для активизации процесса
фиксации атмосферного азота в корневой зоне небобовых растений,
повышения продуктивности растений, улучшения качества полученной
продукции при одновременном сохранении окружающей среды от чрезмерного
загрязнения.

Ключевые слова: азотфиксация, диазотрофы, индуцированные симбиозы,
микробный препарат, Azospirillum brasilense, озимая рожь, шелковица,
морковь, урожай.

ABSTRACT

Nadkernichnaya O.V. The features of interaction between micro- and
macrosymbionts in system of nitrogen-fixing bacteria — non-legume plant.
— A manuscript.

The dissertation on competition for scientific degree of doctor of the
biological sciences on professions 03.00.16 — ecology — the Institute
for agroecology and biotechnologies UAAS, Kiev, 2004.

The dissertation is devoted to studying the features of interaction
between micro- and macroorganisms in associative system nitrogen-fixing
bacteria — none-legume plant. The structure of associative
nitrogen-fixing complex of microorganisms in root zone of none-legume
agricultural crops and their ability to fix molecular nitrogen is
determined depending on natural conditions, peculiarities of growth and
development of plants. It is marked for the first time, that winter rye
is characterized by high activity of nitrogen fixation. Favorable
conditions for development of various regular and ecologic-trophic
groups of nitrogen-fixing microorganisms are created in a root zone of
the given culture. The most widespread and numerous are heterotrophic
aerobic bacteria of Azotobacter, Agrobacterium, Bacillus, Enterobacter,
Pseudomonas species. Anaerobic heterotrophs are represented by
Clostridium species. During the introduction of nitrogen-fixing bacteria
of Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Pseudomonas species in ground
with seeds of winter rye in a root zone of plants the active associative
system nitrogen-fixing bacteria — winter rye is formed.

The role of the genotype of plants in formation and active functioning
of nitrogen-fixing complex: rhyzosphere nitrogen-fixing bacteria — plant
is shown. Screening of sorts of winter rye on according to the ability
to associative nitrogen fixation allowed to reveal a spectrum of
variability between sorts, and also intrahigh-quality variability which
is caused by the genetic heterogeneity of sorts as well as the influence
of the environment on display of the nis-attribute.

The factor of inheriting the ability to associative nitrogen fixation
(h2 = 0,2986) is determined which proves that only about 30 % of plants
of winter rye inherit in posterity the increased ability to associative
nitrogen fixation.

A new highly effective and technological strain of nitrogen-fixing
bacteria Azospirillum brasilense 18-2 is received which well got
accustomed in rhizosphere ground during inoculation in a root zone of
winter rye, root surface, and also actively colonized the histosphere of
plants. Thus provided the formation of active associative system
Azospirillum — a plant, strengthening the activity of fixing molecular
nitrogen in 1,2-13,0 times depending on a sort of winter rye and also
depending on ecological factors.

On the basis of A. brasilense 18-2 the preparation is created,
conditions of its effective using for activization of the process of
fixing atmospheric nitrogen in a root zone of none-legume plants,
improvements of quality of received production are determined at
simultaneous preservation of the environment from excessive pollution
with pollutants. Using of the created preparation during cultivation of
winter rye has provided the increasing of nitrogen fixation activity in
a root zone of plants in 3,4-5,0 time, a grain yield — 2,3-7,1
centner/hectare (9,6-24,6 %), contents of amino acids in grain — on
40,0, including irreplaceable — on 47,8 % in comparison with a variant
without the preparation.

For the first time high nitrogen-fixing activity of nodules which are
spontaneously formed on mulberry roots is determined. On ability to
connect molecular nitrogen of an atmosphere they did not concede nodules
of some kinds of legume cultures (lucerne, clover, lupin), their
nitrogen-fixing activity made 13,06mkh of nitrogen/1h of nodules in one
hour. Responsible for high nitrogen-fixing activity of nodules that were
found out are the nitrogen-fixing bacteria of Azospirillum and
Agrobacterium species. As a result of the carried out screening the
consortium of Agrobacterium microorganisms for manufacturing bacterial
fertilizer under a mulberry is received. Using of the given consortium
during mulberry cultivation promoted increase of its leaf weight on
14,6-67,9 % depending on a sort.

For the first time on plants of carrots under influence of bacteria of
Azospirillum species it was artificial formation of nodules which served
as a place of localization of bacteria and it was characterized by
significant nitrogen-fixing activity. Electronic-microscopic researches
of the formed nodules ultrastructure have confirmed the presence of
symbiotic relations between specified nitrogen-fixing bacteria and
plants of carrots. Thus, the basic opportunity of formation the
associative mutual relations in the system of nitrogen-fixing bacteria —
non-legume plant into symbiotic is shown. Amplification of nitrogen
fixation process in non-legume plants can be achieved with the help of
biological nodulation factors, including bacteria from Azospirillum
species.

Key words: nitrogen fixation, nitrogen-fixing bacteria, induced
symbioses, a biological product, Azospirillum brasilense, winter rye, a
mulberry, carrots, a crop.

PAGE 35

Похожие записи