.

Особливості структурно-функціонального стану плазматичних мембран пухлинних клітин, резистентних до доксорубіцину (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 2767
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІнСтитут експериментальної патології,

oнкології І радіобіології ім. Р.Є. Кавецького

ТРИНДЯК Володимир Петрович

УДК: 616-006.6:615.277.3:576.31+0.53

Особливості структурно-функціонального стану плазматичних мембран
пухлинних клітин, резистентних до доксорубіцину

14.01.07 – онкологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і
радіобіології ім Р.Є.Кавецького НАН України, м. Київ.

Науковий керівник – член-кореспондент НАН України,

доктор медичних наук, професор

Чехун Василь Федорович,

Інститут експериментальної патології, онкології

і радіобіології ім.Р.Є.Кавецького НАН України, м.Київ,

директор інституту, завідувач відділу механізмів протипухлинної терапії.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

Бурлака Анатолій Павлович,

Інститут експериментальної патології, онкології

і радіобіології ім.Р.Є.Кавецького НАН України, м.Київ,

провідний науковий співробітник відділу біофізики канцерогенезу;

кандидат біологічних наук,

Гуніна Лариса Михайлівна,

Інститут онкології АМН України, м.Київ,

старший науковий співробітник науково-дослідного відділення
анестезіології та інтенсивної терапії.

Провідна установа ( Київська медична академія післядипломної освіти
ім. П.Л. Шупика МОЗ України, кафедра онкології, м. Київ.

Захист відбудеться “ 5 ” травня 2004 р. о 15 год. на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної
патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України за
адресою: 03022, м.Київ, вул. Васильківська, 45.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР

ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Автореферат розісланий “ 2 ” квітня 2004 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук

Н.В.Бородай

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Аналіз динаміки захворюваності населення України на
злоякісні новоутворення свідчить про зростання за останнє десятиріччя
рівня цього показника від 307,4 до 325,0 на 100 тис. населення, або на
5,7 % а смертність від цієї патології займає друге місце після
серцево-судинних хвороб [Федоренко З.П., 2001; Онкологічні захворювання
в Україні, Київ, 2004]. Тому проблема підвищення ефективності
комплексного, в тому числі, хіміотерапевтичного лікування онкологічних
хворих є однією з основних проблем теоретичної та клінічної онкології,
але, не дивлячись на певні успіхи, вона все ще далека від остаточного
вирішення.

За ступенем поширеності використання в різних схемах хіміотерапії одне з
провідних місць посідають антрациклінові антибіотики, зокрема
доксорубіцин (DOX), який, на жаль, як і деякі інші протипухлинні
препарати, має низьку вибірковість дії та високу кардіо- та
мієлотоксичність [Булкіна З.П., 1991; Schimmel K.J. et al., 2004]. Крім
того, пухлини можуть мати природну або набуту в результаті хіміотерапії
резистентність до DOX [Курпешев О.К. и др., 2002; Nielsen D. et al.,
1996]. Зокрема втрата чутливості пухлинних клітин до дії DOX може бути
обумовлена не тільки змінами на рівні геному, але й появою чисельних
епігеномних реакцій на рівні функціонального протеому, які розвиваються
з перших хвилин після взаємодії клітин з цитостатиком [Poulaki V. et
al., 2001; Pakunlu R.I. et al., 2003].

Дослідження останніх років в області молекулярної біології та
теоретичної онкології привели до створення молекулярно-генетичної
концепції дії цитостатиків, згідно з якою фармакологічний ефект
розглядається як результат складної взаємодії між лікарським засобом і
біомакромолекулами. Зміна властивостей клітинної поверхні, зокрема її
плазматичної мембрани (ПМ), може значною мірою визначати трансмембранний
транспорт та біологічну активність протипухлинних препаратів, в тому
числі DOX [Чехун В.Ф., 1994; Cruz Silva M.M. et al., 2001; Konig S.A. et
al., 2003]. Показано, що виникнення резистентності пухлин до DOX
найчастіше обумовлене зменшенням накопичення препарату всередині
пухлинних клітин, що корелює з підвищенням експресії або активності
трансмембранного енергозалежного транспортного білка Р-глікопротеїну,
який здійснює активний транспорт цитостатиків з клітини назовні
[Ambudkar S.V. et al., 1999]. Необхідною умовою для нормального
функціонування Р-глікопротеїну за лікарської резистентності є
проникнення цитостатиків всередину ліпідного бішару плазматичної
мембрани клітини [Romsicki Y., Sharom F.J., 1999]. В свою чергу,
активність Р-глікопротеїну та дифузія DOX через мембрану значною мірою
залежить від її фізико-хімічного стану [Pallares-Trujillo J. et al.,
2000; Gattoni M., Boffi A., 2003]. Отже, чутливість пухлинних клітин до
DOX значною мірою визначається структурно-функціональним станом
плазматичної мембрани клітин.

Однак, існуючих даних щодо визначення мембранних ефектів DOX, механізмів
розвитку резистентності пухлинних клітин до нього та окреслення шляхів
її подолання на даний час все ще недостатньо. Тому широкий спектр
комплексних експериментальних досліджень по вивченню епігеномного
механізму дії DOX та розвитку резистентності до нього на рівні
плазматичної мембрани є актуальним і має принципове значення для
подолання лікарської резистентності пухлин при хіміотерапії онкологічних
захворювань.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами інституту. Робота
виконана у відповідності до плану науково-дослідних робіт Інституту
експериментальної патології, онкології і радіобіології
ім. Р.Є. Кавецького НАН України в рамках НДР за темами „Моделювання та
дослідження процесу виникнення резистентності пухлини з метою пошуку
позапухлинних маркерів їх резистентності” (РК0196U008369) та „Вивчення
біологічних особливостей пухлинного процесу при формуванні фенотипу
лікарської резистентності” (0101U000670).

Метою дослідження є встановлення ролі структурно-функціональних змін
плазматичної мембрани пухлинних клітин в механізмі резистентності до дії
доксорубіцину.

Задачі дослідження:

Вивчити кінетику росту карциноми Герена та популяційний склад клітин
карциноми Герена при формуванні резистентності до DOX.

Встановити фізико-хімічні особливості плазматичних мембран клітин
карциноми Герена з різним ступенем чутливості до DOX. Дослідити вплив
DOX на параметри зв’язування флуоресцентних зондів з ПМ клітин вихідного
та резистентного до DOX штамів карциноми Герена.

Вивчити особливості складу ліпідів та вміст поліамінів у ПМ вихідного та
резистентного до DOX штамів карциноми Герена.

Дослідити трансмембранний транспорт DOX у чутливому та резистентному до
DOX штамах карциноми Герена.

Дослідити вплив мембраноактивних агентів на чутливість до дії DOX
карциноми Герена.

Об’єкт дослідження: щури лінії Вістар з перещепленою карциномою Герена
вихідного та резистентного до DOX штамів; суспензія ПМ пухлинних клітин
та тканина карциноми Герена, клітини первинної культури карциноми Герена
вихідного та резистентного штамів.

Предмет дослідження. Індукована лікарська резистентність до
доксорубіцину, структурно-функціональний стан плазматичних мембран
клітин карциноми Герена.

Методи дослідження: експериментальної онкології in vivo, фізико-хімічні,
біофізичні, біохімічні, ЯМР- і ІЧ-спектроскопія,
електронно-мікроскопічні, статистичні.

Наукова новизна. Вперше in vivo показані зміни ліпідного складу та
просторових співвідношень між ліпідами та білками у плазматичних
мембранах пухлинних клітин з фенотипом резистентності до DOX.
Встановлено, що збільшення мікров’язкості ПМ пухлинних клітин,
резистентних до DOX, обумовлено підвищеним вмістом холестеролу та
поліамінів, меншим рівнем ненасиченості ліпідів порівняно з ПМ чутливих
до дії DOX клітин. Показано, що зміна ліпідного складу ПМ клітин
резистентних пухлин призводить до зменшення інтенсивності перебігу
процесів перекисного окислення ліпідів під впливом DOX. Вперше доведено,
що одним з механізмів виникнення резистентності до дії DOX є збільшення
мікров’язкості ПМ пухлинних клітин із одночасним зменшенням пасивної
дифузії DOX через мембрану без суттєвих змін активного транспорту даного
цитостатика назовні. Вперше in vivo показано, що застосування
мембраноактивних речовин, які збільшують проникність плазматичних
мембран пухлинних клітин, підвищує чутливість резистентних пухлин до дії
доксорубіцину.

Практичне значення. Застосування комплексного підходу до вивчення
біохімічного складу та структурних властивостей плазматичної мембрани
клітин при формуванні лікарської резистентності пухлин до дії DOX
дозволило встановити причини втрати чутливості до дії цитостатиків
антрациклінового ряду. Встановлені зміни структурно-функціонального
стану плазматичних мембран клітин пухлин з індукованою резистентністю
визначають можливість застосування мембраноактивних агентів, як
специфічних модуляторів резистентності пухлин до DOX з метою покращання
результатів лікування онкологічних хворих.

Особистий внесок здобувача. При виконанні дисертаційної роботи
здобувачем була зібрана та проаналізована література за темою
дисертації, самостійно проведені експерименти in vivo та in vitro,
спектрофлуориметричні дослідження ПМ пухлинних клітин, визначення
кількісного та якісного ліпідного складу ПМ, виділення ДНК, дослідження
чутливості пухлин до дії DOX з визначенням ступеня гальмування росту
пухлини, визначення активності окисного фосфорилювання у мітохондріях
пухлинних клітин, запис та обробка 31Р-NMR спектрів ліпідів ПМ і
визначення їх індексу ненасиченості. Самостійно проведена статистична
обробка, теоретичне узагальнення результатів досліджень, формулювання
основних положень та висновків роботи.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були
представлені на: ІV науково-практичній конференції молодих онкологів
України (Київ, 2001); XV Міжнародній школі-семінарі „Спектроскопія
молекул та кристалів” (Чернігів, 2001); Міжнародному симпозіумі
„Внутрішньоклітинні системи сигнальної трансдукції у рослин та тварин”
(Київ, 2001); X з’їзді онкологів України (Ялта, 2001); 6 Міжнародному
медичному конгресі студентів і молодих учених (Тернопіль, 2002); VIII
Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002); V конференції молодих
онкологів України (Київ, 2002); 52ND Riga Stradins university’s students
conference in medicine (Riga, 2003).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 17 наукових робіт, в тому
числі, 8 статей у провідних фахових журналах, 9 тез у матеріалах
вітчизняних та міжнародних конференцій та з’їздів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 162 сторінках
друкованого тексту та складається з вступу, огляду літератури, трьох
розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення досліджень,
висновків, списку літератури. Робота ілюстрована 11 таблицями, 29
рисунками. Список літератури містить 258 першоджерел, з них третина за
останні 5 років.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проведені на 756
щурах-самцях лінії Вістар масою 150-200 г розведення експериментальної
бази Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології
ім. Р.Є.Кавецького НАН України. При проведенні експериментальних
досліджень керувались міжнародно прийнятими правилами проведення робіт з
експериментальними тваринами. В роботі був застосований препарат
доксорубіцин („Doxorubicin-Ebewe”, Австрія), дозволений для клінічного
застосування.

Дослідження були проведені на вихідному (чутливому) і резистентному до
DOX варіантах штаму карциноми Герена. Вивчення впливу DOX були проведені
на плазматичних мембранах пухлинних клітин карциноми Герена та клітинах
первинної культури цього штаму.

Формування резистентності карциноми Герена до DOX проводили шляхом
послідовних перещеплень пухлинних клітин, які отримували від щурів після
курсового введення DOX. При першому пасажі 20 тваринам перевивали під
шкіру стегна по 2х106 клітин карциноми Герена. Ці тварини були
розподілені на дві групи: контрольну і дослідну. Щурам дослідної групи
на 7-9 добу після перещеплення пухлини 5 разів вводили DOX в дозі
1,5 мг/кг внутрішньоочеревинно (в/о) через день. Тварин з рецидивами
пухлин після закінчення курсу хіміотерапії на 22-25 добу забивали шляхом
декапітації під легким ефірним наркозом. З пухлин готували суспензію
клітин, яку перещеплювали під шкіру щурам другого пасажу. Тварин ділили
на контрольну і дослідну групи. Введення препарату в дослідній групі
проводили за описаною вище схемою. Третій пасаж пухлин був аналогічний
попередньому. На кожному етапі досліду у тварин визначали об’єм пухлини
за трьома лінійними розмірами.

Для аналізу фізико-хімічних властивостей ПМ пухлинних клітин карциноми
Герена тварини були розділені на групи: І група – щури з вихідною
карциномою Герена, яким вводили фізіологічний розчин; IІ група – щури з
вихідною карциномою Герена, яким вводили DOX в/о у максимально
переносимій дозі 9,5 мг/кг; ІІІ група – щури з резистентним варіантом
карциноми Герена, яким вводили фізіологічний розчин; ІV група – щури з
резистентним варіантом карциноми Герена, яким в/о вводили DOX в дозі
9,5 мг/кг.

Оцінку змін стану мембран проводили в динаміці після однократного в/о
введення DOX в дозі 9,5 мг/кг маси через 15 хвилин, 1, 4, 24, і 96
годин. Вибір такого періоду досліджень був визначений, з одного боку,
тривалістю життя мембранних структур (рециклізація мембранного
самовідновлення становить 10-100 годин), а з другого – особливостями
фармакокінетики DOX [Губский Ю.И. и соавт., 1998]. Після отримання
тканин, що досліджувались, всі наступні операції, для яких потрібна
низька температура, проводились на холоді. Забір матеріалу у тварин
проводився одночасно для всіх методів досліджень, що дозволило отримати
порівнянні результати в межах кожної групи.

Для дослідження модифікуючого впливу тритону Х-100 („Sigma”, США) та
2,4-динітрофенолу („Sigma”, США) на чутливість карциноми Герена до дії
DOX тваринам було перещеплено резистентний до DOX штам карциноми Герена.
Щури з перещепленою пухлиною були розподілені на 6 дослідних груп. І
групу склали контрольні тварини з інтратуморальним введенням
фізіологічного розчину в кількості 0,3 мл, що починали з 9-10 доби після
перещеплення. До ІІ групи увійшли щури, котрим вводили лише DOX.
Тварини, яким вводили інтратуморально тритон Х-100, склали ІІІ групу.
Щурам ІV групи вводили DOX на фоні інтратуморального введення тритону
Х-100. До V та VІ груп відповідно увійшли щури з вихідним штамом
карциноми Герена та щури з вихідним штамом карциноми Герена, яким
вводили DOX. Схема введення препаратів в усіх групах була однаковою: DOX
вводили в/о п’ятикратно в дозі 1,5 мг/кг маси тіла, тритон Х-100 –
інтратуморально п’ятикратно по 0,3 мл 0,01 % розчину.

Аналіз кінетики пухлинного росту на всіх етапах дослідження проводили за
допомогою математичної моделі росту гетерогенних пухлин Вейбула [Weibull
W., Sweden S., 1951]:

V=V0 x ехр((а(t-tlag))?), (1)

де: V0 – початковий об’єм пухлини, що прищеплюється.

Параметр „а” відображає швидкість росту цілісної пухлини в
експоненціальній фазі росту і обернено-пропорційний тривалості
мітотичного циклу окремих пухлинних клітин. Параметр „?” є просторовим
чинником, який характеризує у зворотно-пропорційній залежності швидкість
гальмування росту пухлини за рахунок просторової упаковки клітин. ?=1
відповідає експоненціальному збільшенню кількості пухлинних клітин, що
асинхронно діляться, у вигляді клітинної суспензії. tlag – латентний
період росту перещепленої пухлини, обумовлений часом адаптації пухлинних
клітин з подальшим формуванням агрегату цих клітин, здатного до росту в
організмі; який визначається часом від моменту перещеплення пухлини до
виявлення пальпованого вузла.

Кінетичні параметри росту пухлини а, ?, tlag визначали для кожної
тварини контрольної групи по кінетичних кривих росту, які розраховували
експериментально методом нелінійної регресії за допомогою спеціально
розроблених програм.

Протипухлинний ефект DOX визначали за показником гальмування росту
пухлини. Для характеристики чутливості пухлини до впливу цитостатика
використовували коефіцієнт гальмування росту пухлини (K), який
розраховували за формулою:

, (2)

де: Vk – середній об’єм пухлини в контрольній групі; V? – середній об’єм
пухлини в дослідній групі.

Для цього з моменту появи пухлини визначали її об’єм за трьома лінійними
розмірами на протязі всього досліду. Об’єм пухлини (V) визначали за
формулою:

, (3)

де: I1, I2, I3 – ортогональні розміри пухлини.

Електрокінетичний потенціал (ЕКП) клітин карциноми Герена, як один з
опосередкованих показників стану плазматичної мембрани, визначали згідно
з методикою [Яніш Ю.В. та ін., 2001]. Лінійну швидкість руху клітин в
електричному полі вимірювали за допомогою приладу оригінальної
конструкції проф. В.О. Шляховенка, що дає змогу використовувати дуже
малі об’єми досліджуваних клітинних суспензій та зводить до мінімуму
сторонні впливи на електрофоретичну рухомість клітин.

Виділення плазматичних мембран клітин з пухлинних клітин щурів проводили
за методом диференційного ультрацентрифугування у градієнті щільності
сахарози. Концентрацію білка в суспензії плазматичних мембран визначали
за методом Лоурі.

Чистоту мембранного препарату контролювали за активністю маркерних
ферментів Na+, К+-АТФази і 5′-нуклеотидази та аналізували
електронно-мікроскопічним методом негативного контрастування [Маtlieb
M.A., 1974]. Активність Na+, К+-АТФази у препараті ПМ була в 11 разів
більшою порівняно з гомогенатом, а 5′-нуклеотидази – в 15 разів.
Показники окисного фосфорилювання мітохондрій досліджували
полярографічним методом з використанням закритого платинового електрода
типу електрода Кларка [Todor I.N., Chekhun V.F., 1995].

Ліпідний склад ПМ пухлинних клітин оцінювали за вмістом фосфоліпідів і
холестеролу. Фосфоліпіди з ПМ екстрагували методом двофазної екстракції
[Tyagi R.K. et al., 1996]. Якісний і кількісний склад фосфоліпідів ПМ
визначали за допомогою 31Р-ЯМР-спектроскопії [Merchant T.E. et al.,
1993]. 31Р-спектри записували на ЯМР-спектрометрі „Mercury-300BB”
(Varian, США) на частоті 121,46 МГц. Аналіз вмісту загального
холестеролу у ПМ проводили методом газо-рідинної хроматографії на
хроматографі „Carlo Erba” (Італія), на скляних колонках (0,5 м) з носієм
1,5 % OV-1 на фазі Chimalite W (80(100 меш) („Shimadzu seikashu”,
Японія) при 250 ОC.

Дослідження інфрачервоних (ІЧ) спектрів фосфоліпідів проводили на
серійному спектрометрі IFS-48 („Bruker”, Німеччина) з використанням
приставки на відбивання. В якості підкладки були використані скляні
пластинки з напиленим шаром золота товщиною 200(500 A [Кейтс М., 1973;
Chekhun V.F. et al., 2002].

Загальний вміст та склад поліамінів (ПА) в ПМ пухлинних клітин визначали
методом тонкошарової хроматографії з використанням флуориметрії
[Abdel-Monem M.M., Ohno K., 1973]. Активність орнітиндекарбоксилази
(ОДК) в гомогенаті тканини пухлин визначали радіометричним методом
[Russell D.H., Snyder S., 1968], диаміноксидази (ДАО) – за [Larsen P.M.,
Kemp A., 1964].

Індекс ненасиченості ліпідів ПМ пухлинних клітин визначали в екстракті
ліпідів ПМ на аналізаторі подвійних зв’язків („AMMO”, Росія) із
розрахунком кількості озону, яка витрачається при окисленні подвійних
зв’язків поліненасичених жирних кислот за методом УФ-спектроскопії при
довжині хвилі 250-310 нм [Тітов В.Н. та ін., 2002].

Хемілюмінесцентні показники перебігу процесів перекисного окислення
ліпідів (ПОЛ) в пухлині вихідного та резистентного штамів карциноми
Герена визначали у динаміці через 0,25; 1; 4; 24 та 48 год після
введення тваринам препарату [Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972].
Активність каталази у гомогенаті тканини пухлин визначали
спектрофотометричним методом [Королюк М.А. та ін., 1988].

Флуоресцентне визначення інтегральних показників
структурно-функціонального стану плазматичних мембран пухлинних клітин
(зміна в’язкості, структурних перебудов, поверхневого заряду,
трансмембранного потенціалу, концентрації води і т.п.) проводили за
допомогою зондів – магнієвої солі 1-аніліно-8-нафталін сульфонату (АНС)
та пірену („Sigma”, США). [Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е., 1980].
Визначали константу зв’язування АНС, концентрацію місць зв’язування АНС
на мембрані, індекс полярності та ступінь ексимеризації пірену в
мембрані. Зміни цих величин обумовлені змінами величини заряду і ступеня
упорядкованості ділянок мембрани, в які вбудовуються молекули зонду. При
аналізі структурних змін в ПМ використовували також параметри власної
білкової флуоресценції, індукованої при довжині хвилі 280 нм та 296 нм
[Бурштейн Э.А., 1977], і ефективності індуктивно-резонансного переносу
енергії (ІРПЕ) між донорно-акцепторними парами (ДАП).

Ультраструктуру пухлинних клітин та їх плазматичних мембран досліджували
за допомогою загальноприйнятих методів електронної мікроскопії.

Дифузію DOX та його накопичення всередині пухлинних клітин вивчали на
первинній культурі карциноми Герена вихідного та резистентного до DOX
штамів, яку отримували за [Stampfer, M.R., 1985]. Активність дифузії DOX
та його накопичення всередині пухлинних клітин визначали за зміною
величини флуоресценції DOX в інкубаційному середовищі, яку визначали на
спектрофлуриметрі „LS-3B” („Perkin Elmer”, Англія).

Математичну обробку результатів проводили з використанням t-критерію
Стьюдента за допомогою пакету прикладних програм. Результати аналізу
вважали достовірними при Р

@

B

D

F

^

?oe6

h

E

???”

?6

b

”y

Oe0”y



&

F

d

&

F

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

`„

d

d

d

d

d

d

d

3

3

3

d

d

d

`„A

d

3

3

3

i

`

d

d

d

d

i

?

?

Ae

!нтного до DOX штамів карциноми Герена. Зокрема, у ПМ клітин
резистентного до дії DOX штаму карциноми Герена відмічається достовірне
зниження ступеня ексимеризації пірену на 29 % та ефективності ІРПЕ між
люмінофорами білків та піреном на 19-14 % порівняно з ПМ клітин
вихідного штаму (табл. 1.). Ймовірність ексимеризації знижувалась
внаслідок зменшення рухомості жирно-кислотних ланцюгів ліпідів, тобто
збільшення мікров’язкості гідрофобних зон ліпідного матриксу. Отже
гідрофобні ділянки ліпідного матриксу мембран резистентних клітин мають
більшу мікров’язкість, що може призводити до зменшення дифузії
цитостатиків, через мембрану. Нижча ефективність ІРПЕ між люмінофорами
білків та піреном у ПМ клітин резистентного штаму свідчить про менший,
порівняно з ПМ вихідного штаму, рівень занурення білків у ліпідний
матрикс. Було показано зменшення ІРПЕ між люмінофорами білків та АНС у
ПМ резистентних клітин на 24 % і збільшення кількості місць зв’язування
АНС у 1,9 рази порівняно з ПМ клітин вихідного штаму. Ці дані вказують
на те, що АНС на поверхні мембран резистентного штаму зв’язується з
іншими, не білковими групами молекул.

Таблиця 1.

Зміни структурної організації плазматичних мембран клітин карциноми
Герена

з фенотипом резистенності до доксорубіцину

Об’єкт вимірювання Довжина хвилі збудження (нм) Спектральний показник
Відношення значення спектрального показника у ПМ клітин резистентного
штаму до значення у ПМ клітин вихідного штаму

АНС 380 Кількість місць зв’язування 1,92 ( 0,08*

ДАП:

білок-АНС 280 Ефективність ІРПЕ 0,76 ( 0,07*

Пірен 340 Ступінь ексимеризації (Iе/Iм) 0,71 ( 0,035*

ДАП:

білок-пірен 280 Ефективність ІРПЕ 0,86 ( 0,05*

Примітка. * – pАНОТАЦІЯ Триндяк В.П. Особливості структурно-функціонального стану плазматичних мембран пухлинних клітин, резистентних до доксорубіцину. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.01.07-онкологія. – Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України, Київ, 2004. В експериментальних дослідженнях встановлено, що при розвитку резистентності до DOX у клітинах карциноми Герена відбуваються значні структурні зміни ПМ, достовірно збільшується мікров’язкість ПМ пухлинних клітин. Встановлено, що збільшення мікров’язкості ПМ резистентних пухлинних клітин обумовлено підвищеним вмістом холестеролу та поліамінів, меншим рівнем ненасиченості ліпідів порівняно з ПМ чутливих до дії DOX клітин, що призводить до зменшення інтенсивності перебігу процесів перекисного окислення ліпідів, індукованого DOX. Доведено, що збільшення мікров’язкості ПМ пухлинних клітин резистентного штаму карциноми Герена супроводжується зменшенням пасивної дифузії DOX через ПМ при відсутності суттєвих змін активного транспорту даного цитостатика. Застосування мембраноактивних речовин, які змінюють фізико-хімічні властивості ПМ пухлинних клітин, призводить до збільшення мембранної проникності, що, в свою чергу, підвищує чутливість резистентних пухлин до дії DOX. Ключові слова: індукована резистентність пухлин, доксорубіцин, карцинома Герена, плазматична мембрана. АННОТАЦИЯ Трындяк В.П. Особенности структурно-функционального состояния плазматических мембран опухолевых клеток, резистентных к доксорубицину. – Рукопись. Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 14.01.07-онкология. – Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е.Кавецкого НАН Украины, Киев, 2004. Диссертация посвящена актуальному вопросу онкологии – повышению эффективности применения доксорубицина при лечении опухолей с индуцированной резистентностью путем модификации проницаемости плазматических мембран опухолевых клеток. Целью исследования является установление роли структурно-функциональных изменений плазматической мембраны опухолевых клеток в механизме резистентности к действию доксорубицина. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: изучить кинетику роста карциномы Герена и популяционного состава клеток карциномы Герена при формировании резистентности к DOX; установить физико-химические особенности плазматических мембран клеток карциномы Герена с разной степенью чувствительности к DOX; исследовать влияние DOX на параметры связывания флуоресцентных зондов с ПМ клеток исходного и резистентного к DOX штаммов карциномы Герена; изучить особенности состава липидов и содержание полиаминов в ПМ исходного и резистентного к DOX штаммов карциномы Герена; исследовать трансмембранный транспорт DOX в исходном и резистентном к DOX штаммах карциномы Герена; исследовать влияние мембраноактивных агентов на чувствительность к действию DOX карциномы Герена. В работе применены методы экспериментальной онкологии, физико-химические, биофизические, биохимические, ЯМР- и ИК-спектроскопия, электронно-микроскопические, статистические. Для изучения механизмов формирования лекарственной резистентности опухолей в эксперименте был получен резистентный к действию DOX штамм карциномы Герена. Торможение роста исходного штамма опухоли составляет 57-65 %, тогда как резистентного – лишь 7-9 %. Резистентный штамм характеризуется большей гомогенностью популяционного состава клеток и более быстрой динамикой роста опухоли. При возникновении резистентности карциномы Герена к DOX наблюдается повышение структурной организации опухолевых клеток. В экспериментах на животных установлено, что при развитии резистентности к DOX в клетках опухолей происходят значительные структурно-функциональные изменения ПМ. При возникновении резистентности опухолей к DOX достоверно увеличивается микровязкость ПМ опухолевых клеток, что обусловлено повышенным содержанием холестерола и полиаминов, меньшим уровнем ненасыщенности липидов по сравнению с ПМ чувствительных к действию DOX клеток. Показано, что изменение липидного состава в ПМ резистентных клеток приводит к уменьшению интенсивности протекания процессов перекисного окисления липидов, индуцируемого DOX. Доказано, что увеличение микровязкости ПМ опухолевых клеток приводит к уменьшению пассивной диффузии DOX через мембрану, при этом существенных изменений активного транспорта данного цитостатика через ПМ опухолевых клеток не наблюдается. Іn vivo показано, что применение мембраноактивних веществ, которые изменяют физико-химические свойства ПМ, приводит к увеличению проницаемости мембран опухолевых клеток, что, в свою очередь, повышает чувствительность резистентных опухолей к действию DOX. Применение комплексного подхода к изучению свойств плазматических мембран клеток при формировании резистентности опухолей к DOX позволило установить причины потери чувствительности к действию цитостатиков антрациклинового ряда. Экспериментально доказано, что повышение транспорта DOX в клетку за счет изменений физико-химических свойств плазматической мембраны опухолевых клеток при применении мембраноактивных веществ приводит к повышению эффективности действия препарата и открывает возможности поиска новых путей снижения лекарственной резистентности опухолей. Ключевые слова: индуцированная резистентность опухолей, доксорубицин, карцинома Герена, плазматическая мембрана. Summary Tryndyak V.P. Peculiarities of structural-functional status of plasma membranes of tumor cells, resistant to doxorubicin. – Manuscript. Thesis for the degree of candidate of biologic sciences on speciality 14.01.07-oncology. – R.E.Kavetsky Institute of Experimental Pathology, Oncology and Radiobiology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2004. Experimental studies revealed that in the development of resistance to doxorubicin essential structural changes of plasma membrane occur in tumor cells, microviscosity of plasma membrane of tumor cells reliably increases. It is found that increase of microviscosity of plasma membrane of tumor cells is caused by increased content of cholesterol and polyamines, lower level of lipid unsaturation as compared with plasma membrane of sensitive to doxorubicin cells that results in decrease of intensity of lipid peroxidation induced by doxorubicin. It is proved that increase of microviscosity of plasma membrane of tumor cells in resistant strain of Guerin carcinoma is accompanied by decrease of passive doxorubicin diffusion via plasma membrane under absence of essential changes of active transport of this cytostatics. Use of membranoactive substances that change physico-chemical properties of plasma membrane of tumor cells results in increase of membrane penetration that enhance the sensitivity of resistant tumors to doxorubicin. Key words: induced drug resistance of tumors, doxorubicin, Guerin’s carcinoma, plasma membrane. PAGE 16 * * *

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020