НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

КОЗЛОВА ЮЛІЯ ОЛЕКСАНДРІВНА

УДК:
615.014.41:612.419:616.72-002.77:616.832-004.1

Вивчення впливу факторів кріоконсервування на клітини гемопоетичної
системи в умовах розвитку аутоімунних захворювань

03.00.19. – кріобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН
України

Науковий керівник: член-кореспондент НАН України,

доктор медичних наук, професор

Гольцев Анатолій Миколайович,

Інститут проблем кріобіології і
кріомедицини НАН

України, заст. директора з
наукової роботи ІПКіК НАН

України, м. Харків

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий

співробітник Розанов Леонід
Федорович,

Інститут проблем кріобіології та
кріомедицини НАН

України, провідний науковий
співробітник відділу

низькотемпературного
консервування,

м.Харків

доктор медичних наук, професор

Фролов Олександр Кирилович,

Запорізький національний
університет,

зав. кафедрою імунології і
біохімії,

м. Запоріжжя

Провідна установа: Національний медичний університет

ім. О.О. Богомольця МОЗ
України,

відділ експериментальної та
клінічної імунології,

м.Київ

Захист відбудеться „25” жовтня 2005 року о 13-30 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01. в Інституті проблем
кріобіології і кріомедицини НАН України, 61015, Харків – 15, вул.
Переяславська, 23

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ІПКіК НАН України за
адресою: 61015, Харків – 15, вул. Переяславська, 23

Автореферат розіслано „21” вересня 2005р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

член-кореспондент НАН України
Гольцев А.М. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Період емпіричних досліджень у області трансплантації
лімфогемопоетичних тканин завершився успішним їхнім застосуванням при
лікуванні гемо- та імунодепресивних станів різного генезу [Абдулкадыров
К.М., 1976; Thomas E.D. et al., 1976; Kanavaros P. et al., 1999;
Грищенко В.И и др., 2002; Гольцев А.Н. и др., 2004]. Встановлений
останнім часом факт причетності дефекту стовбурових кровотворних
попередників до розвитку жорстких аутоімунних захворювань (АІЗ), які не
піддаються традиційним методам лікування, став поштовхом для проведення
такої “реконструктивної” терапії, як трансплантація кісткового мозку
(КМ), клітин ембріональної печінки, ізольованих стовбурових
гемопоетичних клітин та ін. [Tyndall A., 1999; Гольцев А.Н. и др., 2003;
Nash R.A. et аl., 2003; Snowden J.A., 2004]. Точний механізм дії терапії
— пересадження гемопоетичної тканини — залишається неясним, тим більше,
що ефект спостерігається навіть при трансплантації аутологічного, тобто
отриманого від хворих з АІЗ матеріалу [Алексеев Л.П. и др., 2000;
Ikehara S. 2001; Porta C., 2004]. Перспективним для з’ясування механізму
лікувального ефекту аутотрансплантації КМ при АІЗ є використання
експериментальних тварин з АІЗ, зокрема, такими мультифакторними
модельними патологіями, як ад’ювантний артрит (АА) і експериментальний
алергічний енцефаломієліт (ЕАЕ), що є аналогом ревматоїдного артриту
(РА) і розсіяного склерозу (РС) людини.

Для реалізації програм лікування АІЗ за допомогою трансплантації
кровотворних клітин необхідно створити їхні запаси і надійні способи
довгострокового збереження з застосуванням оптимальних технологій
кріоконсервування. Відзначається, що головними факторами ушкодження
клітин у процесі їх кріоконсервування є сольові і температурні
градієнти, зміна рН середовища, механічний вплив кристалів льоду та ін.
[Белоус А.М. и др., 1994; Gao D. et al., 2000; Холодный В.С. и др.,
2002]. Відомо, що кріостійкість біооб’єкта до дії факторів
низькотемпературного консервування визначається його вихідним
структурно-функціональним станом [Цуцаева А.А. и др., 1982; Дубрава
Т.Г., 1986; Гольцев А.Н и др., 1987; Zaheer H.A. et al., 1994; Balint B.
et аl., 1999]. На прикладі гемопоетичних клітин показано, що різні за
ступенем диференціювання кровотворні попередники виявляють різну
чутливість до однакових умов кріоконсервування, а різні режими
кріоконсервування по-різному впливають на ті самі властивості клітин
[Гольцев А.Н., 1988; Goltsev A.N. et al., 2001]. Крім того,
отримано результати, що підтверджують можливість використання
кріоконсервування як способу модифікації морфофункціонального статусу
кровотворних клітин [Луценко Е.Д. и др., 1995; Goltsev A.N. et al.,
2005], а також зміни імунореактивності мієлотрансплантату [Гольцев А.Н.
и др., 1994; 1996]. Однак навіть при таких особливостях взаємодії
“біологічний об’єкт – фактори кріоконсервування” у даний час
низькотемпературне консервування клітин КМ проводиться переважно за
стандартними методиками, що не враховують особливості вихідної
структурної організації мієлокаріоцитів. Є підстави вважати, що
гемопоетична система при розвитку АІЗ має спотворений
структурно-функціональний профіль [Kawamura M. et al., 1997; Гольцев
А.Н. и др., 2003; 2004]. У зв’язку з цим виникає необхідність з’ясувати
характер і причини таких змін, а також провести дослідження, які
спрямовані на розробку альтернативних методів кріоконсервування
гемопоетичної тканини донорів з патологією у вигляді АІЗ.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконана відповідно до плану НДР ІПКіК НАН України у відділі
кріопатофізіології в рамках теми №2.2.6.6. „Вивчення механізмів
корегуючої дії продуктів фетоплацентарного комплексу на
лімфогемопоетичну систему в умовах розвитку аутоімунних захворювань при
старінні”, № держреєстрації 0102U002023; теми
№2.2.6.11. „Вивчення молекулярних основ регуляції продуктами
ембріофетоплацентарного комплексу кооперативних взаємодій
імунокомпетентних клітин при аутоімунній патології”, № держреєстрації
0102U002022 і теми №2.2.6.18. „Використання кріоконсервованих
стовбурових клітин різного походження для лікування аутоімунних
захворювань”, № держреєстрації 0104U006439.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи — вивчити вплив фізико-хімічних
факторів кріоконсервування на морфофункціональні показники клітин
кісткового мозку тварин з різними формами АІЗ (АА, ЕАЕ).

Відповідно до поставленої мети передбачалося:

Провести порівняльний аналіз гематологічних, імунологічних, біохімічних
показників тварин у динаміці розвитку АА і ЕАЕ.

Дослідити структурно-функціональний стан гемопоетичної системи тварин з
АІЗ.

З’ясувати характер впливу окремих фізико-хімічних факторів (рН,
осмолярність) на життєздатність і морфофункціональні характеристики
клітин кісткового мозку тварин із зазначеними АІЗ.

Оцінити життєздатність і морфофункціональний потенціал клітин кісткового
мозку тварин з АА і ЕАЕ після експозиції з різними кріопротекторами
(гліцерин, ДМСО).

Провести порівняльну оцінку впливу різних швидкостей заморожування і
концентрацій кріопротектора на життєздатність і морфофункціональні
характеристики клітин кісткового мозку тварин з АА і ЕАЕ

Вивчити вплив різних режимів кріоконсервування на колонієутворюючу
активність кровотворних клітин-попередників різного ступеня
диференціювання тварин з АІЗ у системах in vitro та in vivo.

Об’єкт дослідження. Режими кріоконсервування з різними концентраціями
кріопротектора та швидкостями заморожування клітин кісткового мозку
здорових тварин і з АІЗ.

Предмет дослідження. Клітини кісткового мозку здорових тварин та з АІЗ
(АА та ЕАЕ).

Методи дослідження: гематологічні, імунологічні, біохімічні,
морфологічні, гістологічні, а також методи культивування клітин
кісткового мозку у системах in vitro та in vivo.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше проведено порівняльний
аналіз стану гемопоетичної системи тварин при розвитку різних АІЗ, таких
як АА і ЕАЕ. Відзначено, що зміни цього компартменту організму
обумовлені структурно-функціональною модифікацією клітинно-тканинних
субстратів імунокомпетентної сфери і вираженими змінами метаболічних
процесів. Новими є результати, що демонструють залежність
морфофункціональних перебудов у гемопоетичній системі від виду АІЗ,
різноспрямованої зміни ряду показників стану мієлокаріоцитів, а також
функціонального статусу кровотворних попередників КМ тварин при цих
формах АІЗ.

Уперше проведена комплексна оцінка впливу фізико-хімічних факторів, що
реалізуються у процесі кріоконсервування на морфологічні і функціональні
показники клітин КМ тварин з АІЗ у системах in vitro та in vivo.
Показано, що ідентичні умови кріоконсервування КМ здорових донорів і з
АІЗ забезпечували не тільки різну збереженість кровотворних
попередників, що реалізують функціональний потенціал in vitro та in
vivo, але й перерозподіл у цих компартментах попередників з різним
ступенем комітованості. У результаті оптимальними у відношенні
забезпечення функціональної повноцінності клітин тварин з АІЗ є різні
умови кріоконсервування. Крім того, встановлено унікальний ефект
„реставрації” функції кровотворних попередників різного рівня
диференціювання КМ тварин з АІЗ за певних умов кріоконсервування. На
підставі отриманих результатів зроблено важливий висновок, що клітини КМ
при розвитку в організмі АІЗ, тобто зі зміненим вихідним
структурно-функціональним статусом, мають принципові відмінності
відповіді на дію реалізованих у процесі кріоконсервування
фізико-хімічних факторів. Ця теза підтверджується отриманими новими
даними про істотні розходження відповіді клітин КМ здорових тварин і з
АІЗ на окремі фактори кріоконсервування в системі in vitro.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані підкреслюють
важливість і визначають необхідність обліку вихідного
морфофункціонального стану КМ, зокрема, при розвитку в організмі АІЗ,
оптимізації методів його кріоконсервування і підвищення ефективності
застосування при аутотрансплантації. Роль окремих факторів
кріоконсервування (осмолярність і рН) у зміні структурно-функціонального
стану клітин КМ тварин з АІЗ може бути врахована при аналізі механізмів
ушкодження мієлокаріоцитів і „адаптації” визначених режимів
кріоконсервування у відношенні КМ зі зміненим структурно-функціональним
станом. Установлений факт „керування” функціонального потенціалу
кровотворних клітин КМ різного ступеня диференціювання тварин з АІЗ
варіюванням умов кріоконсервування відкриває можливість у клінічній
практиці „регулювати” темп відновлення лімфогемопоезу реципієнтів у
посттрансплантаційний період.

Особистий внесок дисертанта. Винесені на захист положення і результати
отримані дисертантом особисто. Роботи, що відносяться до теми
дисертаційної роботи, опубліковані у співавторстві з науковим керівником
теми член-кор. НАН України Гольцевим А.М. та іншими співробітниками
відділу кріопатофізіології, відбивають результати загального планування
і проведення експериментів, узагальнення результатів і підготовки
матеріалів до друку. В опублікованих із співавторами працях особистий
внесок здобувача полягає:

— у роботах [1, 5, 7] в участі у теоретичній та практичній розробці
методів вивчення стану органів ЛГПС, зокрема, клітин КМ при розвитку
АІЗ;

— у роботах [2, 8, 9, 11] у вивченні змін життєздатності, адгезивної
здатності та фагоцитарної активності клітин КМ тварин з АІЗ після
експозиції їх у розчинах різної осмолярності та рН;

— у роботах [3, 4, 12, 13] у відпрацюванні методики культивування
нативних та кріоконсервованих клітин КМ щурів з АА та ЕАЕ;

— у роботах [3, 4, 10, 12, 13] у проведенні різних режимів заморожування
клітин КМ;

— у роботах [6, 14] у здійсненні визначення активності ферментів
антиоксидантної системи та рівня гідроперекисів ліпідів у гомогенатах
печінки щурів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи
доповідалися та обговорювалися на наукових форумах: конференції молодих
учених ІПКіК НАН України „Холод у біології і медицині” (Харків, 2003 і
2004 рр.); науково-практичній конференції „Наука і соціальні проблеми
суспільства: медицина, фармація, біотехнологія” (Харків, 2003 р.);
Міжнародному конгресі з кріобіології і кріомедицини „Cryobiomol-2003”
(Коімбра, 2003 р.); конференції молодих учених і студентів з
молекулярної біології та генетики „50 years of the double helix of the
DNA and 30 anniversary of the Institute of molecular biology and
genetics NAS of Ukraine” (Київ, 2003 р.); науково-практичній конференції
„Сучасні аспекти репродуктології, перинатальної медицини та
кріобіології” (Харків, 2003 р.), Міжнародному конгресі з кріобіології і
кріомедицини „The 41stAnnual Meeting of the Society for Cryobiology —
CRYO-2004” (Пекін, 2004 р.); I Українській науковій конференції
„Проблеми медичної і біологічної фізики” (Харків, 2004 р.); VIII
Міжнародній науковій екологічній конференції „Актуальные проблемы
сохранения устойчивости живых систем” (Белгород, 2004 р.).

Публікації. За матеріалами дисертаційного дослідження опубліковано 14
робіт, з яких 5 — у спеціалізованих фахових виданнях та 1 патент на
винахід.

Обсяг і структура дисертації. Дисертацію викладено на 179 сторінках
друкованого тексту, з яких 131 сторінка основного змісту. Дисертація
складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів
досліджень, результатів власних досліджень, заключної частини,
висновків, переліку використаних джерел літератури (23 сторінки), що
включає 209 першоджерел. Дисертацію ілюстровано 12 таблицями та 44
рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження

Дослідження були виконані на білих 5-6 — місячних щурах-самцях масою
160-180 г (116 тварин) і статевозрілих мишах-самцях лінії СВА масою
19-22 г (120 тварин), що утримувалися в стандартних умовах віварію
Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України. Усі
маніпуляції з тваринами здійснювали згідно з положенням “Європейської
конвенції захисту хребетних тварин, які використовуються з
експериментальною та іншою науковою метою” (м.Страсбург, 1985 р.).

Індукцію АА здійснювали субплантарним уведенням 0,2 мл повного
ад’юванту Фрейнда, що містить 3 мг/мл Micobacterium tuberculosis, на 100
г маси тварини за методом Пірсона [Pearson C.M., 1963]. ЕАЕ індукували
уведенням у подушечки чотирьох лап щурів 0,4 мл гомогенату алогенної
тканини спинного мозку в суміші з повним ад’ювантом Фрейнда [Давыдова
Г.С., 1969]. Контролем була група здорових тварин.

Стан лімфогемпоетичної системи (ЛГПС) тварин оцінювали на 7, 14, 21 і
28-у добу після індукції патології з використанням гематологічних,
імунологічних, біохімічних, морфологічних, гістологічних методів і
культивування клітин КМ у системах in vitro та in vivo. Зокрема, за
допомогою ФІТЦ-мічених моноклональних антитіл (Galtag, США) до CD-4 і
CD-8 структур мембран [Шторх В., 1987] було визначено субпопуляційний
склад Т-клітин та імунорегуляторний індекс (ІРІ), що виражає відношення
CD-4+/CD-8+. Активність природних кілерів (ПК) спленоцитів щурів
визначали обчисленням індексу цитотоксичності [Мельников О.Ф., 1999],
рівень циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) у сироватці крові —
загальноприйнятим методом [Стручков П.В. и др., 1985]. Рівень
метаболізму тварин у динаміці розвитку АІЗ оцінювали за вмістом
гідроперекисів ліпідів (ГПЛ) у тесті з 2-тіобарбітуровою кислотою
[Mihara M. еt al., 1980]; глутатіонпероксидазну (ГПО) і
глутатіонредуктазну (ГР) активності реєстрували флуориметричним методом
на основі зменшення НАДФН2 [Zakowski J.J., 1978; Лемешко В.В., 1987].

На підставі проведених досліджень було визначено початок хронічного
перебігу даних патологій: для АА — 14-у добу, а для ЕАЕ – 21-у добу.
Установлення імунологічних ознак, що змінюються найбільш маніфестно у
цей період (зниження ІРІ та константи ЦІК), було підставою для вибору
часу забору КМ, що одержували зі стегнових кісток шляхом вимивання
середовищем 199 з додаванням 10%-ї ембріональної телячої сироватки і
2%-го цитрату натрію.

Розчини з різними осмолярностями (100, 150, 200, 600, 1200, 2400
мОсм/кг) і рН (5,0; 6,0; 8,0; 9,0) були обрані як окремі фактори, що
модифікують морфофункціональний стан клітин КМ на етапах
кріоконсервування.

На етапі еквілібрації і вибору кріопротектора використовували гліцерин і
диметилсульфоксид (ДМСО) у 5, 7, 10 і 15%-й (кінцевій) концентрації.
Експозиція клітин КМ із кріопротекторами проводилася при температурі 4°С
протягом 10 хвилин — часу, необхідного для оптимального насичення клітин
кріопротектором ?Холодный В.С., 2002?. Проведені дослідження показали,
що гліцерин у всіх вищевказаних концентраціях і 15%-й ДМСО негативно
впливали на клітини КМ. У зв’язку з цим у подальших експериментах з
оцінки впливу різних швидкостей охолодження на морфофункціональну
збереженість мієлокаріоцитів були використані 5, 7 і 10%-ї концентрації
ДМСО. Кріоконсервування суспензії КМ здійснювали на програмному
заморожувачі “Cryoson” (Німеччина) у кріоконтейнерах фірми Nunc обсягом
1 мл (6,0х106 кл/мл).

У роботі апробувані програми кріоконсервування зі швидкостями
охолодження:

1 єС/хв до -40°С з наступним зануренням у рідкий азот – режим 1 [Rowley
S.D., 1994];

10 єС/хв, 10- хвилинна витримка при температурі -40 ?С з наступним
зануренням у рідкий азот — режим 2 [Останков М.В., 2001];

40 єС/хв, 10- хвилинна витримка при температурі -40?С з наступним
зануренням у рідкий азот — режим 3 [Козлова Ю.А. и др., 2004].

Відігрівання суспензії проводили на водяній бані при температурі 38-40°С
протягом 40-50 с. Після кріоконсервування клітини КМ відмивали від
кріопротектора шляхом повільного додавання рівного обсягу робочого
розчину і наступного центрифугування.

До і після кріоконсервування оцінювали: життєздатність клітин КМ методом
суправітального фарбування 0,2%-м розчином трипанового синього [Костенко
Е.А., 1968]; якісний склад ядровмісних клітин на мазках, пофарбованих
азур-II-еозином; адгезивну здатність клітин КМ [Пастер Е.У и др., 1989];
фагоцитарну активність (фагоцитарний індекс (ФІ) — відсоток клітин, які
фагоцитували; фагоцитарне число (ФЧ) — число захоплених однією клітиною
мікроорганізмів; абсолютний показник фагоцитарної активності
мієлокаріоцитів — АПФАМ, що визначався за формулою: АПФАМ=ФИхФЧх(абс.
кількість кл/мкл суспензії х106)) [Александров М.Г., 1988]. Вміст
кровотворних попередників грануломоноцитопоезу (КУО-ГМ) оцінювали за
методом С.І. Шерешкова, 1974, у нативному КМ на 7-му добу, у
кріоконсервованому – на 14-ту добу культивування з урахуванням факту
тимчасової інгібіції проліферативної активності КУО-ГМ після
кріоконсервування [Дубрава Т.Г., 1986]. Інтегральний показник КУО-ГМ —
це сумарна кількість попередників, що формують структури, до 20 клітин —
кластери і більш 20 клітин – колонії [Афанасьев Б.Н. и др., 1985]. Для
оцінки розподілу в КМ кровотворних клітин з різним ступенем потентності
(менш диференційовані попередники формують колонії, більш
диференційовані – кластери [Афанасьев Б.В. и др., 1985]) був введений
індекс проліферативної активності (ІПА КУО-ГМ), що представляє собою
відношення колонієутворюючих попередників до кластероутворюючих [Гольцев
А.Н. и др., 2005]. Кровотворні попередники, що формують колонії в
селезінках летально опромінених мишей (КУОс), визначали
загальноприйнятим методом [Till J.E., 1961] на 8-у добу – КУОс-8 (більш
диференційовані) і 14-у добу – КУОс-14 (менш диференційовані) [Harris
R.A. et al., 1984] після введення КМ. Вміст колоній різних типів у
селезінках оцінювали на гістологічних зрізах [Меркулов Г.А., 1961].

З метою об’єктивізації отриманих даних щодо стану КМ тварин з АІЗ до і
після кріоконсервування було використано індекс сумарного ступеня
відхилення (ССВ) [Пат. №2004031694 Україна, 2004], що є сумою значень
відхилень від контролю всіх показників, яка розділена на 100 та виражена
в умовних одиницях. Більш задовільними були результати з меншою ССВ.
Статистичну обробку експериментальних даних проводили за методом
Стьюдента-Фішера.

Результати досліджень та їхнє обговорення

Неодноразово зазначалося, що АІЗ є патологією всього організму
[Головизин М.В, 1993; Гольцев А.Н. и др., 2000; 2002], тим самим
підкреслюючи „зацікавленість” різних компартментів імунної системи в їх
розвитку. У зв’язку з цим на першому етапі виконання роботи було
проведено дослідження стану ЛГПС для виявлення в ній порушень при
розвитку даних патологій. Порівняльна оцінка розвитку імунозапального
процесу показала як спільність змін імунологічних, гематологічних і
біохімічних показників при АА і ЕАЕ, так і відмінності. Крім того, зміни
в імунній системі відмічалися вже на етапі доклінічної маніфестації
патологій і знову ж виявлялися в залежності від виду АІЗ. Так, при
дослідженні клітинної ланки імунітету було встановлено пригнічення
кілерної активності клітин селезінки (природні кілери — ПК) у всі
терміни розвитку АА, що узгоджується з даними літератури про дефект
цитолітичної активності ПК при наростанні активності і тяжкості РА
[Семененя И.Н., 1991]. У той же час при розвитку ЕАЕ зміна вмісту ПК
мала хвилеподібний характер: зниження на 7-у добу; зростання до 14-ї
доби і тенденція до зниження в період 21-28-ї діб у порівнянні з
контролем. Важливо, що при обох патологіях відбувалася розбалансування
співвідношення регуляторних субпопуляцій Т-хелперів і Т-супресорів в
селезінці. Причому вміст останніх знижувався значно інтенсивніше, що
характерно для розвитку АІЗ [Гольцев А.Н., 2002; Козлова Ю.А., 2004;
Рассоха И.В., 2005]. У гуморальній ланці відмічено накопичення найбільш
патогенних дрібнодисперсних ЦІК (дЦІК) у всі терміни розвитку обох
патологій, що досліджуються. Однак при розвитку АА їх накопичення було
більше, ніж при ЕАЕ. Це явище є закономірним, оскільки відомо, що дЦІК є
потенційним чинником імунного пошкодження тканин синовіальної оболонки
суглоба при РА [Яременко О.Б., 2002; Рассоха І.В., 2005]. У
гематологічному статусі вже на 7-у добу розвитку АІЗ на фоні
лейкоцитозу, зумовленого підвищенням кількості сегментоядерних
нейтрофілів, спостерігалося збільшення швидкості осідання еритроцитів в
порівнянні з контролем і зменшення вмісту гемоглобіну в крові. Ці ознаки
характерні для запального процесу [Шиффман Ф.Дж., 2000].

Аутоімунні захворювання, які протікають хронічно, характеризуються
порушенням балансу про- і антиоксидантної системи [Кочетова Е.В., 1996;
Гольцев А.Н., 2004]. При визначенні інтенсивності ПОЛ було зазначено, що
порівняльні патології мають різноспрямовану динаміку зміни вмісту ГПЛ в
печінці. Так, при АА вміст ГПЛ був знижений в порівнянні з контролем
протягом всіх термінів розвитку патології. Спостерігалася активація ГПО
на фоні зниження активності ГР в порівнянні з контролем, що може
свідчити про нездатність останньої відновлювати глутатіон. У той же час
при ЕАЕ посилення процесів ПОЛ відбувалося вже на стадії доклінічних
проявів захворювання (7 доба) з достовірним зниженням кількості ГПЛ до
14-ї доби. Зміна активності ГПО мала хвилеподібний характер протягом
всіх термінів цієї патології. Достовірне зниження активності ГР на
21-28-у добу розвитку ЕАЕ, можливо, визначається зменшенням активності
системи продукування НАДФН2 (головним чином дегідрогеназ циклу
трикарбонових кислот і пентозофосфатного шунта), а також конкуренцією з
нею за НАДФН ГПО [Кулинский В.И. и др., 1993].

Таким чином, при АА і ЕАЕ спостерігається виражена зміна стану ЛГПС
експериментальних тварин, що, очевидно, є слідством розвитку
імунно-запального процесу, порушенням цитокінового профілю і т.д.
[Демина Т.Л. и др., 1997; Столяров И.Д., 2002; Kuroda T. et al., 2002].
Важливо зазначити, що при розвитку досліджуваних патологій можна
виділити гостру фазу захворювання на 3-7-у добу після індукції АА і
7-14-у добу ЕАЕ, з подальшою фазою хронізації патологічного процесу, що
підтверджується дослідженнями клінічних ознак даних патологій, які було
отримано раніше [Гольцев А.Н. и др., 2003; Бабенко Н.Н., 2003]. Іншими
словами, весь комплекс відмічених змін є важливим чинником зміни стану
гемопоетичної системи організму.

Попередні дослідження клітинного складу КМ тварин з різними видами АІЗ
показали, передусім, зниження кількісного вмісту клітин еритроїдного
ряду та збільшення мієлоїдного і лімфоїдного в порівнянні з мієлограмами
здорових тварин.

При дослідженні функціональних показників відмічена чітка залежність
характеру та міри зміни адгезивних і фагоцитарних властивостей клітин КМ
від виду патології (рис. 1) Так, при артриті ФЧ було достовірно нижче за
контроль, а ФІ і кількість адгезуючих клітин (АК) істотно перевищували
його рівень. У результаті АПФАМ тварин з АА не відрізнявся від контролю.
У той же час при ЕАЕ дані показники були значно нижчими за контроль.
Підвищення рівня фагоцитарної активності і адгезивної здатності клітин
КМ при АА може бути наслідком збільшення при даній патології синтезу
ІЛ-8, а зниження при ЕАЕ — підвищення експресії іншого цитокину —
трансформуючого чинника ? [Демина Т.Л., 1997], інгібітора багатьох
функцій клітин [Возианов А.Ф. и др., 1998].

Оцінка вмісту в КМ кровотворних попередників, що формують in vitro
гранулоцитарно-макрофагальні колонії (КУО-ГМ), показала, що у тварин з
АА і ЕАЕ їх кількість знижувалася в рівній мірі і складала відповідно
57,43±3,56 і 51,23±2,78% від контролю. Таке зниження може бути пов’язано
зі зменшенням продукції колонієстимулюючих чинників при даних
патологіях [Гембицкий Е.В., 1991].

Рис.1. Функціональні показники кісткового мозку тварин з АІЗ:

а — фагоцитарна активність

б – вміст адгезуючих клітин

У компартменті КУОс КМ тварин із АА на фоні збільшення в 1,3 разу вмісту
клітин з більш високим проліферативним потенціалом (КУОс-14) знижувалася
в 2,5 рази кількість КУОс-8, що може бути слідством реалізації
компенсаторних механізмів у гемопоетичній системі [Гольцев А.Н. и др.,
2003].

J l ?

Oe

R

T

V

X

Z

\

^

`

b

d

°

?¤?¤???°

H J ¶ F

Oe

O

hoA}

?¤?¤???ріоцитів тварин з АІЗ, що визначає необхідність як в
теоретичному, так і прикладному аспекті вивчення особливостей відповіді
цих клітин на дію фізико-хімічних чинників, що реалізуються в процесі
кріоконсервування. Вже на попередньому етапі оцінки в системі in vitro
було показано чіткі відмінності відповіді клітин КМ здорових тварин і з
АІЗ на дію окремих чинників кріоконсервування (рН, осмолярність),
причому в залежності від виду патології (АА і ЕАЕ). Так, оцінка
кількості АК після експозиції КМ в розчинах з різними рН і осмолярністю
свідчить про збільшення адгезивного потенціалу мієлокаріоцитів здорових
тварин і з ЕАЕ в порівнянні з такою при рН 7,2 і осмолярністю 300
мОсм/кг, тоді як при АА цей показник знижувався (рис. 2). Дані зміни
можуть бути слідством модифікації конформаційної організації мембрани
мієлокаріоцитів з експансією „прихованих” рецепторів у випадку ЕАЕ і зі
„сходженням” (shedding) структур глікокаліксу при АА. Виходячи із даного
тесту, для клітин КМ здорових тварин і з АІЗ у більшій мірі стресорними
є гіперосмолярні середовища.

У середовищах з різним рН клітини КМ контрольної групи і з ЕАЕ найбільш
чутливі до кислих значень рН, а з АА — до лужних. Отже, розвиток
патології сприяє створенню умов специфічного сприйняття мієлокаріоцитами
фізико-хімічних чинників кріоконсервування, які можуть виявляти свою
активність як ізольовано, так і діяти комплексно.

Рис.2. Вміст адгезуючих клітин у суспензії клітин КМ здорових тварин
(контроль) і з АІЗ після експозиції в середовищах з різним рН (а) та
осмолярністю (б)

Дослідження впливу типу і концентрації кріопротекторів на
життєздатність, адгезивні і фагоцитарні властивості мієлокаріоцитів
здорових тварин і з АІЗ за допомогою інтегрального показника сумарного
ступеня відхилення (ССВ) продемонстрували перевагу 5, 7 і 10%-го ДМСО в
порівнянні з гліцерином в аналогічних концентраціях (табл. 1). Причому в
цьому випадку в меншій мірі модифікуються морфофункціональні
характеристики КМ тварин з АА, ніж з ЕАЕ.

Ефективність аутотрансплантації кріоконсервованого КМ визначається мірою
збереження різних його клітинних популяцій, але перш за все стовбурових
кровотворних клітин. Порівняльна оцінка їх життєздатності показала, що
після кріоконсервування КМ здорових тварин зі швидкістю охолодження
1?С/хв (режим 1) колонієутворююча активність КУО-ГМ підвищувалася та
досягала максимального рівня (92,02±3,68 від контролю) при 10%-й
концентрації ДМСО (табл. 2).

На відміну від КМ здорових тварин збереження КУО-ГМ і ІПА КМ тварин з АА
і ЕАЕ у режимі 1 залишалися на рівні показників до кріоконсервування
тільки при використанні 7%-го ДМСО. Дві інші концентрації ДМСО були менш
ефективні. Однак враховуючи ІПА, кріоконсервування КМ тварин з АІЗ
забезпечувало збереження КУО-ГМ з більшим проліферативним потенціалом
(формуючі колонії).

Збільшення швидкості заморожування до 10°С/хв (режим 2) супроводжувалось
зниженням збереження КУО-ГМ КМ здорових тварин при використанні всіх
концентрацій ДМСО в порівнянні з режимом 1 (табл. 2.). Проте і в цьому
випадку 10%-й ДМСО забезпечував максимальне збереження КУО-ГМ
(64±3,21%), а ІПА був в 1,3 рази вище, ніж в контролі, що свідчило про
перевагу кровотворних попередників з колонієутворюючою функцією.

Таблиця 1

ССВ показників КМ здорових тварин (контроль) і з АІЗ після експозиції в
розчинах з різною концентрацією кріопротекторів

Група ССВ показників Концентрація ДМСО, %

Концентрація гліцерину, %

5

7

10

15

5

7

10

15

Контроль Цілість, умов.од.

0,06

0,07

0,02

0,18

0,26

0,20

0,21

0,17

АК, умов.од.

0,82

0,74

0,95

1,80

2,08

1,59

1,24

0,82

АПФАМ, умов.од.

0,44

0,25

0,02

0,67

0,61

0,64

0,66

0,52

?ССВ, умов.од.

1,32

1,06

0,99

2,65

2,95

2,43

2,11

1,51

АА Цілість, умов.од.

0,12

0,03

0,01

0,09

0,18

0,13

0,12

0,17

АК, умов.од.

0,33

0,07

0,11

0,56

0,77

0,44

0,38

0,25

АПФАМ, умов.од.

0,82

0,29

0,21

0,33

0,43

0,41

0,77

0,81

?ССВ, умов.од.

1,27

0,39

0,33

0,98

1,38

0,98

1,27

1,23

ЕАЕ Цілість, умов.од.

0,04

0,01

0,04

0,13

0,19

0,17

0,12

0,13

АК, умов.од.

2,23

0,96

0,74

3,55

3,81

2,96

2,76

1,83

АПФАМ, умов.од.

4,22

2,52

2,2,97

3,13

4,11

4,98

4,93

6,38

?ССВ, умов.од.

6,49

3,49

3,75

6,81

8,11

8,11

7,81

8,34

Залежність вмісту КУО-ГМ КМ тварин з АА від концентрації кріопротектора
після заморожування в режимі 2 практично повторювала таку ж залежність
при режимі 1. Судячи по ІПА, на відміну від КМ здорових тварин
підвищення швидкості заморожування явно інгібіювало функціональний
потенціал клітин-попередників, що формують колонії, причому при
збільшенні концентрації протектора в більшій мірі.

Після кріоконсервування КМ тварин з ЕАЕ (режим 2) зниження вмісту КУО-ГМ
складало 38-46%, а в КМ тварин з АА — 29-32,8% в порівнянні з початковим
рівнем життєздатності кровотворних попередників нативних
мієлокаріоцитів. Слід зазначити, що при використанні 7%-ї концентрації
ДМСО серед кровотворних попередників, які підлягали зберіганню,
переважали колонієутворюючі попередники, в той час як в КМ тварин з АА —
кластероутворюючі.

Максимальна кількість кровотворних попередників у кріоконсервованому зі
швидкістю 40°С/хв (режим 3) КМ здорових тварин зберігалася при
використанні не 10%, а 7%-го ДМСО (табл. 2). Цей показник практично був
ідентичним отриманому при використанні цієї ж концентрації ДМСО в режимі
1. Однак, незважаючи на те, що він був кращим при режимі 2 (64,00±3,21%,
р<0,05), все ж поступався максимальному при режимі 1 (92,34±6,44%, р<0,05) і становив 75,61±3,55%. При будь-якій концентрації кріопротектора ІПА змінювався в порівнянні з контролем, який при використанні 5%-го ДМСО був більш ніж в 1,5 рази вище, а при 10%-й концентрації - в 2 рази нижче за контроль. Істотно, що такі виражені зміни ІПА при 5 і 10% концентрації кріопротектора відбувалися на тлі приблизно однакового зниження загальної кількості КУО-ГМ в цих групах (в середньому в 2 рази). Таблиця 2 Вміст КУО-ГМ в КМ здорових тварин (контроль) і з АІЗ після кріоконсервування за різними режимами Режим Показник Контроль АА ЕАЕ Концентрація ДМСО, % 5 7 10 5 7 10 5 7 10 1 КУО-ГМ, % 59,38± 3,65 77,43± 4,50 92,00± 3,68 42,76± 1,75 51,24± 4,84* 40,79± 3,54* 37,50± 1,87* 44,74± 2,03* 30,26± 1,34* ІПА, умов.од. 1,31± 0,04 1,09± 0,02 1,00± 0,02 2,00± 0,10* 1,60± 0,05* 0,87± 0,06 2,60± 0,07* 2,40± 0,04* 1,20± 0,05 2 КУО-ГМ, % 42,30± 1,23 60,52± 2,00 64,00± 3,21 38,31± 1,87 55,37± 3,97 43,80± 2,04* 28,11± 1,08* 32,70± 0,97* 29,30± 0,62* ІПА, умов.од. 0,80± 0,02 0,70± 0,02 1,30± 0,04 0,60± 0,02 0,30± 0,01* 0,15± 0,01* 0,60± 0,02 1,70± 0,07* 1,00± 0,02 3 КУО-ГМ, % 47,56± 2,45 75,61 3,55± 48,78± 1,58 39,00± 1,05* 40,65± 2,23 50,41± 4,65* 10,70± 0,54* 15,23± 1,30* 20,32± 1,41* ІПА, умов.од. 1,60± 0,07 0,75± 0,04 0,56± 0,02 1,00± 0,03 0,59± 0,03 0,53± 0,03 0,30± 0,02* 0,70± 0,04 0,90± 0,02* Натив КУО-ГМ, % 100,00±2,25 57,43±3,56* 51,23±2,78* ІПА, умов.од. 1,00±0,01 1,73±0,03* 2,93 ±0,04* Примітка: * - відмінності статистично достовірні (р<0,05) в порівнянні з контролем У режимі 3 максимальне збереження КУО-ГМ КМ тварин з АА і ЕАЕ на відміну від режиму 1 (51,24±4,84 і 44,74±2,03%) та 2 (55,37±3,97 і 32,70±0,97%) забезпечувала не 7, а 10%-а концентрація ДМСО (50,4±4,56 і 20,32±1,41% від контролю; 88±3,45 і 39,65±3,57% від показника до заморожування). Однак для режиму 3 по мірі підвищення концентрації ДМСО простежувалося зниження в КМ тварин з АА і підвищення в КМ тварин з ЕАЕ вмісту більш потентних попередників (колонієутворюючих). Таким чином, при різних швидкостях заморожування КМ тварин з АА КУО-ГМ були менш чутливі до зміни умов кріоконсервування, ніж КМ тварин з ЕАЕ і здорових. Серед КУО-ГМ кожна популяція (колоніє- або кластероутворююча) по-різному відповідала на зміну швидкостей заморожування і концентрацій кріопротектора. При цьому встановлено, що 5%-а концентрація ДМСО виявилася найменш ефективною. Виходячи з цього, в подальших дослідженнях колонієутворюючої активності КМ в системі in vivo ми визнали доцільним використовувати тільки 7 і 10%-у концентрацію ДМСО. Представлені на рис. 3 дані свідчать про те, що кращі з трьох режимів кріоконсервування результати колонієутворюючої активності КМ здорових тварин були отримані після трансплантації мієлокаріоцитів, кріоконсервованих в режимі 1 з 10%-м ДМСО (див. рис. 3, а). Рис.3. Вміст КУОс в КМ, який було кріоконсервовано зі швидкістю,?С/хв.: 1 ( а - режим 1), 10 ( б - режим 2) і 40 ( в - режим 3) Примітка: за 100% прийнята кількість колоній, які були утворені нативним КМ здорових тварин При такій же концентрації протектора зберігалася найбільша кількість КУОс в КМ, кріоконсервованому в режимі 2 (див. рис. 3, б), хоч цей результат поступався попередньому. Звертає увагу той факт, що при повільних швидкостях заморожування КМ (режими 1 і 2) з будь-якою з вибраних концентрацій кріопротектора зберігалися переважно менш диференційовані попередники (КУОс-14). Про такі перерозподіли субпопуляцій КУОс свідчить і різної міри виражена зміна ІПА в порівнянні з контролем. Більш лабільними до дії високих швидкостей заморожування (режим 3) при обох концентраціях кріопротектора виявилися КУОс-14. Крім того, на відміну від режимів 1 і 2, в режимі 3 більш високе збереження КУОс було отримано при використанні 7%-го ДМСО. Особливо реагували КУОс КМ тварин з АА на чинники кріоконсервування. Режим 1 та 10%-а концентрація кріопротектора забезпечували початкове (до заморожування) збереження КУОс-8 і зниження КУОс-14 приблизно на 30% (див. рис. 3, а), що фактично свідчить про збереження „дисгармонії” у співвідношенні попередників (ІПА КУОс більше за 2,5 умов. од.). Найбільш збалансоване співвідношення субпопуляцій КУОс відмічалося після кріоконсервування КМ у режимі 1 з 7%-м ДМСО. Після трансплантації такого КМ приблизно 65-70% КУОс-8 і КУОс-14 зберігали здатність до формування колоній. Слід підкреслити, що ці умови кріоконсервування (швидкість охолодження 1°С/хв і 7%-а концентрація ДМСО) „гармонізували” колонієутворюючий потенціал КМ тварин з АА (ІПА КУОс), наближаючи його до кращих показників кріоконсервованого під захистом 10%-го ДМСО КМ здорових тварин (1,12±0,02 та 1,3±0,01 умов. од. відповідно). Менш успішним був режим 2, хоч також при 7%-й концентрації кріопротектора одержано абсолютно ідентичні результати, що були отримані при кріоконсервуванні контрольного КМ з 10%-м ДМСО (див. рис. 3, б). На відміну від режиму 1, у цьому випадку при 10%-му ДМСО колонієутворюючий потенціал КМ тварин з АА мінявся у бік істотної переваги функції менш потентних КУОс-8. На тлі майже п'ятикратного зниження в порівнянні з вмістом до кріоконсервування КУОс-14, кількість останніх збільшувалася в 1,8 рази, що супроводжувалось зниженням ІПА до 0,44 умов. од. Режим 3 з обома концентраціями кріопротектора, як і при кріоконсервуванні КМ здорових тварин, в більшій мірі інгібував функцію КУОс-14 (див. рис. 3, в). Однак у протилежність КМ здорових тварин 10%-а концентрація ДМСО забезпечувала майже в два рази кращі результати, ніж 7%-а, а також „гармонізуючий” ефект співвідношення субпопуляцій КУОс (ІПА КУОс - 0,78±0,03). Таким чином, трансплантація КМ, кріоконсервованого при повільних швидкостях охолодження (10 і 1°С/хв) з 7%-м ДМСО, а також швидкості 40°С/хв з 10%-м ДМСО маніфестується як би ефектом „реставрації” його колонієутворюючого потенціалу, модифікованого патологією. ВИСНОВКИ Аутотрансплантація КМ як важливий складовий компонент лікування АІЗ визначає необхідність оптимізації методів його кріоконсервування. Проведені в дисертаційній роботі дослідження акцентують увагу на істотній важливості початкового стану цього біооб’єкту у визначенні його кріолабільності і кріостабільності. Отримані дані чітко демонструють як різноспрямовані зміни морфофункціонального потенціалу КМ здорових тварин і з АІЗ в однакових умовах кріоконсервування, так і збіг характеру такого роду змін при використанні різних режимів. 1. Встановлено виражені відмінності в порівнянні з контролем морфофункціональних характеристик клітин КМ тварин з АІЗ, в тому числі статусу стовбурових кровотворних попередників різного рівня диференціювання, який виявляється в зміні їхної здатності формувати гемопоетичні структури в умовах in vitro та in vivo. 2. Оцінка морфофункційного стану клітин КМ тварин з АІЗ продемонструвала відмінності відповіді на окремі фізико-хімічні чинники кріоконсервування в порівнянні з контрольним КМ. Зазначено, що клітини КМ, особливо тварин з ЕАЕ (при оцінці життєздатності і адгезивних властивостей), більш чутливі до дії гіперосмолярних розчинів у порівнянні з контролем. Поряд з цим клітини КМ тварин з ЕАЕ більш стійкі до лужних рН, тоді як з АА - до кислих. 3. Порівняльний аналіз ступеня відхилення характеристик морфофункціонального стану клітин КМ на етапі їх експозиції з ДМСО і гліцерином довів перевагу ДМСО як потенційного кріопротектора для низькотемпературного консервування КМ тварин із АІЗ. 4. Відзначена різноспрямована відповідь клітин КМ тварин із різними АІЗ на реалізацію однотипних режимів кріоконсервування. Так, заморожування зі швидкістю 1 і 40°С/хв індукує підвищену експресію молекул адгезії на клітинах КМ при ЕАЕ і інгібує - при АА. 5. Доведено, що ідентичні умови кріоконсервування КМ здорових тварин і з АІЗ забезпечували не тільки різну збереженність кровотворних попередників, що реалізують функціональний потенціал in vitro та in vivo, але й перерозподіл у цих компартментах попередників з різним ступенем комітованості. У той же час „оптимальними” відносно забезпечення функціонального потенціалу цих клітин КМ виявилися різні умови кріоконсервування: для КМ тварин з АА - режим 3 (10%-й ДМСО), з ЕАЕ - режим 1 (7%-й ДМСО), для здорових - режим 1 (10%-й ДМСО). 6. Певні режими кріоконсервування реалізують у КМ тварин з АА ефект „реставрації” функції КУОс не тільки підвищуючи їхній функціональний потенціал, але і гармонізуючи співвідношення різних субпопуляцій. Крім того, для КМ тварин з АА всі режими кріоконсервування виявляли ефект стимуляції функції кровотворних попередників КУОс-8 (більш диференційованих) на тлі інгібіції КУОс-14 (менш диференційованих). 7. Варіювання швидкостями охолодження і концентрацією кріопротектора дозволяє спрямовано забезпечувати в КМ більший або менший ступінь збереження кожної із субпопуляцій кровотворних попередників. Загалом швидкісне заморожування КМ здорових тварин і з АІЗ (з будь-якими концентраціями кріопротектору) призводило до реалізації „супресивної” дії кріоконсервування у відношенні більш потентних попередників як серед КУО-ГМ, так і КУОс, що може бути використано в тій або іншій клінічній ситуації. ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ Гольцев А.Н., Козлова Ю.А. Аутоиммунная патология как предрасполагающий фактор изменения криочувствительности клеток лимфогемопоэтической системы // Пробл. криобиологии. – 2003. - №3. – С.62-70. Козлова Ю.А., Гольцев А.Н., Останков М.В. Влияние изолированных физико-химических факторов криоконсервирования на клетки костного мозга с различным исходным структурно-функциональным статусом // Пробл. криобиологии. – 2003. - №4. – С.3-11. Гольцев А.М., Козлова Ю.О., Дубрава Т.Г., Гуріна Т.М., Ямпольська К.Є. Вміст КУО-ГМ в кріоконсервованому кістковому мозку тварин з аутоімунними захворюваннями // Клінічна та експериментальна патологія. – 2004. - Т.3, №2. – С.392-393. Козлова Ю.А., Гольцев А.Н., Дубрава Т.Г., Гурина Т.М. Предпосылки оптимизации метода криоконсервирования костного мозга животных с аутоиммунной патологией // Пробл. криобиологии. – 2004. - №2. – С.76-83. Козлова Ю.А., Дубрава Т.Г., Гольцев А.Н. Некоторые характеристики структурной организации и функционального потенциала клеток костного мозга при аутоиммунных патологиях // Пробл. мед. науки та освіти. - 2004. - №3. - С.48-50. Гольцев А.Н., Козлова Ю.А., Бабенко Н.Н., Овсянников С.Е., Никитченко Ю.В. Интенсивность метаболических процессов организма крыс в динамике развития экспериментального аллергического энцефаломиелита // Медична хімія. - 2004. - Т.6, №3. - С.117-119. Пат. №3761 Україна, МПК7 А61В5/00 Заявл. 09.03.04; №2004031694 Публ. 15.12.2004. - Бюл.№12. - С. 3.12. Спосіб порівняльної оцінки ефективності лікування / Гольцев А.М., Останкова Л.В., Луценко О.Д., Дубрава Т.Г., Бабенко Н.М., Рассоха І.В., Горська А.Ю., Козлова Ю.О. Гольцев А.Н., Козлова Ю.А., Останков М.В., Дубрава Т.Г., Луценко Е.Д. Через понимание особенностей влияния физико-химических факторов криоконсервирования на клетки костного мозга с различным исходным структурно-функциональным статусом к повышению эффективности их использования // Збірник тез III Міжнародної науково-практичної конференції „Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія”. – Харків, 2003. - С. 253. Гольцев А.Н., Козлова Ю.А., Останков М.В., Бабенко Н.Н. Изменение функциональных характеристик клеток костного мозга животных с аутоиммунными заболеваниями под действием изолированных факторов криоконсервирования // Збірник наукових праць „Сучасні аспекти репродуктології, перинатальної медицини та кріобіології”. – Харків, 2003. - С.19-23. Kozlova Yu.A. Change in structural and functional organization of bone marrow cells under development of autoimmune diseases as a probable factor of their cryosensitivity modificatation // Abstract book of conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics „50 years of the double helix of the DNA and 30 anniversary of the Institute of molecular biology and genetics NAS of Ukraine”. – Kyiv, 2003. - P.169. Kozlova Yu.A., Dubrava T.G., Babenko N.N., Ostankov M.V., Lutsenko E.D., Goltsev A.N. Effect of pH on the structural and functional properties of normal rat myelokaryocytes and during autoimmune pathology // Cryobiology. – 2003.- Vol.47, №3, – P.282. Goltsev A.N., Dubrava T.G., Kozlova Yu.A., Ostankov M.V., Goltsev K.A., Kurov A.M. Cryostability of various bone marrow cell populations during adjuvant arthritis // Abstracts book „World congress of cryobiology and cryomedicine (CRYO-2004)”.- Beijing, 2004. - P.154. Козлова Ю.А., Гольцев А.Н., Луценко Е.Д., Дубрава Т.Г. Влияние различных режимов криоконсервирования на сохранность кроветворных клеток костного мозга животных с адъювантным артритом // Сборник материалов VIII Международной научной экологической конференции „Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем.”– Белгород, 2004. - С.89-90. Козлова Ю.А., Бабенко Н.Н., Овсянников С.Е., Гольцев А.Н. Свободнорадикальное окисление липидов при экспериментальном аллергическом энцефаломиелите до и после введения продуктов эмбриофетоплацентарного комплекса // Збірник тез I Української наукової конференції „Проблеми медичної і біологічної фізики”. - Харків, 2004.- С. 120. АНОТАЦІЇ Козлова Ю.О. Вивчення впливу факторів кріоконсервування на клітини гемопоетичної системи в умовах розвитку аутоімунних захворювань.- Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 – кріобіологія.- Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2005. Дисертація присвячена вивченню особливостей впливу фізико-хімічних чинників, що реалізуються в процесі кріоконсервування (рН і осмолярність середовища, вид і концентрація кріопротектора, швидкість охолодження) на морфофункціональні властивості клітин кісткового мозку здорових тварин, з ад'ювантним артритом і експериментальним алергійним енцефаломієлітом в системах in vitro та in vivo. Показано принципові відмінності похідного функціонального статусу клітин кісткового мозку здорових донорів і з аутоімунними захворюваннями, а також його зміни при аналогічних умовах кріоконсервування. Зазначено, що ”оптимум” колонієутворюючої активності кровотворних клітин-попередників здорових тварин і з аутоімунними захворюваннями реалізується при кріоконсервуванні кісткового мозку у різних режимах. Встановлено ефект „реставрації” зміненої патологією функції кровотворних попередників різного рівня диференціювання кісткового мозку тварин з аутоімунними захворюваннями за певних умов кріоконсервування (концентрація кріопротектора, швидкість заморожування). Ключові слова: кріоконсервування, клітини кісткового мозку, гемопоетичні попередники (КУО-ГМ, КУОс), ДМСО, осмолярність, рН, ад'ювантний артрит, експериментальний алергійний енцефаломієліт Козлова Ю.А. Изучение влияния факторов криоконсервирования на клетки гемопоэтической системы в условиях развития аутоиммунных заболеваний. - Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19. - криобиология. - Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2005. Диссертационная работа посвящена изучению влияния физико-химических факторов (рН и осмолярность среды, вид и концентрация криопротектора, скорость охлаждения), которые определяют сохранность морфофункциональных свойств клеток костного мозга животных с аутоиммунными заболеваниями в виде адъювантного артрита и экспериментального аллергического энцефаломиелита при криоконсервировании. В результате экспериментальных исследований установлено, что характер влияния факторов криоконсервирования определяется исходным структурно-функциональным статусом клеток костного мозга, который к тому же определяется видом аутоиммунного заболевания. Показано, что в период острого (7-е сутки) и хронического (14-е сутки для адъювантного артрита и 21-е для экспериментального аллергического энцефаломиелита) течения патологий у животных отмечались в разной степени выраженные изменения гематологических, иммунологических и биохимических показателей организма. В сравнительном аспекте определены функциональные характеристики (адгезивный и фагоцитарный потенциал, содержание кроветворных предшественников разной степени дифференцировки) клеток костного мозга здоровых животных и с аутоиммунными заболеваниями (на этапе хронического течения патологии) до и после использования различных режимов криоконсервирования (концентрация криопротектора, скорость охлаждения). Установлено, что варьирование концентрацией криопротектора при одной и той же скорости замораживания позволяет выделить ”оптимум” условий, при котором факторы криоконсервирования подобно влияют не только на функциональный статус кроветворных клеток, но и полученного от разных доноров (физиология и патология) костного мозга. В то же время, разные скорости замораживания селективно влияют на кроветворные клетки определенного уровня дифференцировки в здоровом и „патологическом” костном мозге. Установлено, что оптимальными в обеспечении функционального потенциала этих клеток оказались различные условия криоконсервирования. Так, максимальное количество и наиболее сбалансированный субпопуляционный состав кроветворных предшественников в виде колониеобразующих единиц грануломоноцитопоэза (КОЕ-ГМ) и формирующих колонии в селезенке летально облученных реципиентов (КОЕс) костного мозга здоровых животных был сохранен после замораживания со скоростью 1?С/мин с 10%-м ДМСО, для костного мозга животных с адъювантным артритом - 40єС/мин с 10%-м ДМСО, для костного мозга животных с экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом - 1єС/мин с 7%-м ДМСО. Кроме того, установлен уникальный эффект ”реставрации” искаженной патологией функции кроветворных предшественников разного уровня дифференцировки костного мозга животных с адъювантным артритом и экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом при определенных условиях криоконсервирования. На основании полученных результатов сделано заключение, что клетки костного мозга при развитии в организме патологии аутоиммунного генеза, т.е. с измененным исходным структурно-функциональным статусом имеют принципиальные отличия ответа на действие физико-химических факторов, реализуемых в процессе криоконсервирования. Подтверждается правомочность идеи о возможности использования криоконсервирования как фактора направленной регуляции состояния биообъекта, что открывает перспективу реализовывать в клинической практике ”управляемый” темп восстановления в целом лимфогемопоэтической системы реципиента. Ключевые слова: криоконсервирование, клетки костного мозга, гемопоэтические предшественники (КОЕ-ГМ, КОЕс), ДМСО, осмолярность, рН, адъювантный артрит, экспериментальный аллергический энцефаломиелит Kozlova Yu.A. Studying the effect of cryopreservation factors on cells of hemopoietic system under development of autoimmune diseases. – Manuscript. Thesis for a candidate’s degree obtaining (PhD equivalent) on a specialty 03.00.19 – cryobiology. – Institute for Problems of Cryobiology & Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, 2005 The thesis is devoted to studying the effect of peculiarities of the realized during cryopreservation physical and chemical factors, such as pH and medium osmolarity, cryoprotectant type and concentration, cooling rate on morphofunctional properties of bone marrow cells of healthy animals and those with adjuvant arthritis as well as experimental allergic arthritis in vitro and in vivo. There are demonstrated basic differences of initial functional status of bone marrow cells for healthy donors and those with autoimmune diseases, as well as its changes under similar cryopreservation conditions. The “optimum” of colony forming activity of hematopoietic precursors of healthy animals and those with autoimmune diseases is found to be realized when cryopreserving bone marrow cells under various regimens. There is established the “restoration” effect of the impaired by pathology function of bone marrow hematopoietic precursors of various differentiation level for animals with autoimmune diseases as a result of certain cryopreservation conditions (different concentrations of cryoprotectant and freezing rates). Key words: cryopreservation, hematopoietic precursors (CFU-GM, CFUs), DMSO, osmolarity, pH, adjuvant arthritis, experimental allergic encephalomyelitis Відповідальний за випуск Г.О. Бабійчук Підписано до друку 15.09.2005 р. Формат 60х84 1/16 Наклад 100 прим. Умов. друк. арк. 0,9. Друк. на ризографі. ПП Степанов В.В. м. Харків, вул. Ак. Павлова, 311 PAGE \* Arabic 22

Похожие записи