НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

На правах рукопису

НИПОРКО ОЛЕКСІЙ ЮРІЙОВИЧ

УДК: 577.322.4: 5: 7+576.311.348.7

Особливості просторової структури тубуліну як основа клітинної відповіді
рослин на дію гербіцидів динітроанілінового та фосфороамідного рядів

Спеціальність 03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата

біологічних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у відділі геноміки і біотехнології Інституту клітинної
біології і генетичної інженерії НАН України

Науковий керівник доктор біологічних наук,
професор,

член-кореспондент НАН України

Блюм Ярослав Борисович

Інститут клітинної біології і генетичної інженерії НАН України

завідувач відділу геноміки і біотехнології

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук

Кучук Микола Вікторович

Інститут клітинної біології і генетичної інженерії

заступник завідувача відділу генетичної інженерії

доктор біологічних наук

Швартау Віктор Валентинович

Інститут фізіології рослин та генетики НАН України

завідувач відділу мінерального живлення

Провідна установа

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України

Захист відбудеться “ 23 ” лютого 2006 р. о 14 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.202.01 при Інституті клітинної біології
і генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул.
Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту клітинної
біології і генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ,
вул. Заболотного, 148.

Автореферат розісланий “ 22 ” cічня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

Д 26.202.01

кандидат біологічних наук

О. А. Кравець

Актуальність проблеми. Явище специфічної взаємодії з
низькомолекулярними і не тільки органічними речовинами є характерним для
тубулінів будь-якого походження. Зокрема, тубуліни є мішенями для цілого
ряду речовин, що характеризуються гербіцидними, протипухлинними,
фунгіцидними, протигельмінтними, антипротозойними та іншими видами
біологічної активності [Correia, 2001]. Але, незважаючи на високу
консервативність структури тубулінів різного походження, рослинні
тубуліни в цьому відношенні характеризуються наявністю унікальних
властивостей. Насамперед це стосується їх здатності специфічним чином
зв’язувати низькомолекулярні сполуки динітроанілінового та
фосфороамідного рядів, що застосовуються як гербіциди [Morejohn, 1987,
Vaughn, 1987]. Зазначені класи речовин виступають ефекторами саме для
тубулінів рослинного походження і взагалі не взаємодіють з тваринними
тубулінами, незважаючи на надзвичайно високий рівень гомології їх
амінокислотних послідовностей [Anthony, 1998]. Беручи до уваги, що
тубулінам з різних органічних царств властива перехресна імунна
активність, можна зробити обґрунтований висновок, що структурні
відмінності, які обумовлюють ці властивості тубулінів рослин, мають
специфічний характер. Для повного розуміння процесів такого рівня
специфічності необхідне детальне дослідження особливостей просторової
структури цієї групи білків.

Але особливості тубулінів рослин та організації мікротрубочок, які вони
формують, не обмежуються явищем їх специфічної взаємодії з
динітроаніліновими та фосфороамідними сполуками. Відомо, що деякі
мікротрубочкові утворення рослин мають дещо відмінну структуру від їх
аналогів у тваринній клітині. Насамперед це стосується центрів
організації мікротрубочок (ЦОМТ). У тваринних клітинах ЦОМТи містять
морфологічно оформлені центріолі, а у клітинах рослин таких явно
виражених структур немає. Водночас відомо, що ЦОМТи як тваринних, так і
рослинних клітин мають майже ідентичний склад білків, головне місце
серед яких посідає (-тубулін [Vaughn, 1998, Tassin, 1999]. Для ЦОМТів
тваринних клітин є характерною також наявність ряду мінорних тубулінів,
яких ще не виявлено в клітинах рослин, за винятком ?-тубуліну,
знайденого у водоростей [Dutcher, 1998]. Можна зробити закономірне
припущення про відмінність властивостей контактних поверхонь у тубулінів
різних органічних царств, які врешті-решт призводять до відмінностей у
характері полімеризації цих білків у відповідні субклітинні утворення.
Таким чином, і в цьому випадку необхідно мати точну інформацію щодо
просторових характеристик рослинних тубулінів.

Поряд із специфічними властивостями тубулінам рослин властиві ознаки, що
характеризують всю надродину тубулінів, а саме здатність до
олігомеризації, здатність зв’язувати ГТФ, мікрогетерогенність та
здатність посттрансляційно модифікуватись [McKean, 2001]. Таке поєднання
в собі як специфічних, так і загальних для тубулінів властивостей вказує
на необхідність детального дослідження особливостей просторової
структури рослинних тубулінів. Однак до останнього часу жодного
дослідження в цій галузі не проводилося. Можливо, цей факт пояснюється
як труднощами технологічного характеру при отримані рослинних тубулінів
із ступенем чистоти, необхідним для їх кристалізації, так і обмеженням
самих кристалографічних методів, що у більшості випадків не дозволяють
виявити різниці в просторовій структурі високогомологічних білків. Однак
високий ступінь гомології тубулінів різного походження дає змогу
застосувати результати кристалографічних досліджень тубулінів тварин
[Nogales, 1998] для відтворення просторової структури тубулінів
рослинного походження. Тому з’ясування просторових особливостей молекул
тубулінів рослин із застосуванням методів in silico є не лише актуальним
питанням для розуміння клітинних та молекулярних механізмів
функціонування мікро трубочок рослин. Вирішення цього питання повинно
також стати ключем до розуміння молекулярних механізмів
чутливості/стійкості рослинної клітини до дії динітроанілінових та
фосфороамідних гербіцидів.

Зв’язок роботи з науковою тематикою організації. Дисертаційна робота
виконувалась в рамках бюджетних тем Інституту клітинної біології та
генетичної інженерії НАН України: відділу цитофізіології та клітинної
інженерії: № 2.28.2.9 «Вивчення молекулярно-біологічних і генетичних
процесів в реконструйованих трансгеномних і трансгенних клітинних лініях
і рослинах» (1995-1999), а потім відділу геноміки і біотехнології: №
2.28.2.10 «З`ясування ролі цитоскелетних структур клітини у відповіді
рослин на вплив абіотичних факторів та розробка біотехнологічних
підходів для регуляції функціонування цитоскелету» (2000-2004, номер
держреєстрації 0101U000395).

Мета та завдання дослідження. Метою дослідження була реконструкція
просторової структури тубулінів рослинного походження і аналіз її
специфічних особливостей, що обумовлюють чутливість або стійкість
рослинної клітини до гербіцидів динітроанілінового та фосфороамідного
рядів.

Згідно з поставленою метою до завдань експериментальної роботи входило:

а) здійснити розробку моделей просторової структури молекул (-, (- та
(-тубулінів рослинного походження;

б) провести порівняльний аналіз особливостей вторинної і просторової
структури рослинних (-, (- та (-тубулінів між собою та в порівнянні з
вторинною і просторовою структурою тубулінів іншого походження;

в) побудувати моделі (-тубулінів рослинного походження з амінокислотними
замінами (мутаціями), що визначають їх стійкість до динітроанілінових та
фосфороамідних гербіцидів, і охарактеризувати закономірності структури і
розташування на поверхні (-тубулінів сайтів зв’язування цих сполук;

г) проаналізувати закономірності взаємодії різних динітроанілінів та
фосфороамідів з ідентифікованим сайтом зв’язування;

д) перевірити можливість існування аналогічного сайту зв’язування на
поверхні (- та (-субодиниць тубулінів;

е) проаналізувати механізми стійкості рослин до динітроанілінів та
фосфороамідів, які базуються на відповідних змінах в структурі
(-тубуліну, і порівняти їх з такими, що обумовлені змінами в (-тубуліні;

є) проаналізувати закономірності розташування в первинній послідовності
та просторовій структурі тубулінів мутацій, що спричиняють підвищення
стійкості до сполук різної природи з антимікротубочковою активністю.

Об’єкт дослідження. Просторова організація тубулінів рослинної клітини.

Предмет дослідження. Особливості просторової структури (-, (- та
(-тубулінів рослинного походження, які визначають характер відповіді
рослини на дію динітроанілінових та фосфороамідних сполук на клітинному
рівні.

Методи дослідження. У роботі було застосовано широкий спектр методів
структурної біоінформатики. Аналіз послідовностей тубулінів проводився
за допомогою методів множинного вирівнювання. Розробка промоделей
просторової структури молекул рослинних тубулінів та тубулін-подібних
білків (FtsZ), оптимізація їх просторової структури, аналіз молекулярних
коливань і дослідження властивостей комплексів тубулінів з
динітроаніліновими та фосфороамідними сполуками здійснювалися за
допомогою методів молекулярної механіки. Розробка топології
динітроанілінових та фосфороамідних гербіцидів і розрахунки їх
електронних властивостей здійснювалися за допомогою методів квантової
механіки.

Наукова новизна. Вперше відтворено і досліджено просторову структуру
молекул (-, (- та (-тубулінів рослинного походження. Показано, що
загальний план просторової будови і тип упаковки всіх без винятку
тубулінів мають подібний характер, але при цьому кількість і довжина
елементів вторинної структури кожного конкретного тубуліну визначається
не лише його амінокислотною послідовністю, а також особливостями складу
амінокислотних залишків, що утворюють просторове оточення цих елементів.

Вперше показано, що тубулінам будь-якого походження властива
метастабільність вторинної структури в часі, що може бути одним з
ключових факторів, які забезпечують динамічні властивості мікротрубочок
у живій клітині. Також вперше показано відсутність істотної різниці у
структурі ділянок різного ступеня консервативності для (-, (- і
(-тубулінів будь-якого походження.

Вперше на поверхні молекул (- і (-тубулінів рослин ідентифіковано
розташування сайтів взаємодії з гербіцидами динітроанілінового та
фосфороамідного рядів і виявлено їх структурні особливості.
Продемонстровано унікальність розташування відповідних сайтів на (- та
(-субодиницях тубуліну, що пов’язано з індивідуальними відмінностями в
їх просторовій структурі. Виявлено, що відмінність в ефективності
мутацій по (- та (-субодиницях, які спричиняють стійкість до
динітроанілінових і фосфороамідних сполук, обумовлена різницею між
доступністю відповідних сайтів взаємодії.

Показано, що позиція мутації в рослинному (-тубуліні, яка може
спричиняти підвищення рівня холодостійкості, приводячи до перебудов
поверхні інтердимерного контакту, збігається з позицією заміни, що
викликає підвищення стійкості до динітроанілінових гербіцидів. Отримані
дані свідчать про те, що структура поверхні інтердимерного контакту є
критичним фактором у забезпеченні відповіді рослинної клітини на стреси
цілком різної природи (холод, гербіциди).

Встановлено загальні закономірності розташування в первинній
послідовності тубулінів мутацій, що підвищують стійкість до речовин, які
деполімеризують мікротрубочки – вони локалізуються не далі шостого
залишку від позицій амінокислот, залучених в утворення поверхонь
повздовжніх контактів (як інтердимерних, так і інтрадимерних) між
субодиницями тубуліну або у процеси взаємодії з молекулами ГТФ/ГДФ.

Практична цінність. У ході роботи розроблено оригінальну методику оцінки
стабільності комплексів молекул тубуліну з низькомолекулярними
антимікротрубочковими речовинами, застосування якої дає змогу підвищити
ефективність дизайну нових антимітотичних сполук (гербіцидів,
фунгіцидів, протипухлинних та антипротозойних препаратів). Виявлені
закономірності розташування мутацій, що спричиняють підвищення стійкості
до антимікротрубочкових речовин, у первинній послідовності та
молекулярному просторі тубулінів, можуть бути ефективно використані для
вирішення зворотних завдань – отримання змінених молекул тубулінів,
нечутливих до дії певних антитубулінових агентів за допомогою методів
білкової інженерії.

Результати дослідження використовуються у навчальному процесі:

а) під час підготовки спеціалістів з клітинної біології та генетичної
інженерії в Київському університеті імені Тараса Шевченка при викладанні
спецкурсу «Структурно-біологічне моделювання» і спецпрактикуму
«Комп’ютерне моделювання структури білків»;

б) під час підготовки магістрів-біологів у Міжнародному Соломоновому
університеті при викладанні курсу „Моделювання просторової структури
білків та білкова інженерія”.

Особистий внесок здобувача. Постановку наукових завдань досліджень,
наступну інтерпретацію отриманих результатів та розробку структури
дисертаційної роботи було здійснено спільно з науковим керівником. Усі
експериментальні дослідження були виконані особисто здобувачем. Оцінка
стабільності комплексів (- і (-тубуліну із сполуками динітроанілінового
та фосфороамідного рядів здійснювалася за оригінальною методикою,
розробленою дисертантом.

Апробація роботи. Результати дисертаційної роботи доповідались на XVI
Міжнародному ботанічному конгресі (Сент-Луїс, США, 1999) та XVII
Міжнародному ботанічному конгресі (Відень, Австрія, 2005), конференції
“Цитоскелет и клеточная регуляция” (Пущино, Росія, 2000), VII
конференції молодих учених „Проблеми фізіології рослин та генетики на
рубежі третього тисячоліття” (Київ, Україна, 2000), 40-их
(Сан-Франциско, США, 2000) та 42-их щорічних зборах Американського
товариства клітинної біології (Сан-Франциско, США, 2002), І
Всеукраїнській конференції молодих учених „Актуальні проблеми сучасної
природничої науки” (Сімферополь, Україна, 2001), 16-му Європейському
цитоскелетному форумі (Маастріхт, Нідерланди, 2001), І
болгарсько-українському семінарі з біотехнології рослин (Лесідрен,
Болгарія, 2001) та ІІ українсько-болгарському семінарі з біотехнології
рослин (Ялта, Україна, 2002), І конференції студентів, аспірантів та
молодих учених з молекулярної біології та генетики (Київ, Україна,
2001), Міжнародному симпозіумі „Biotechnology Approaches for
Exploitation and Preservation of Plant Resources ”, (Ялта, Україна,
2002), Міжнародному симпозіумі „ The Plant Cytoskeleton: functional
diversity and biotechnological implications” (Київ, Україна, 2002),
українсько-британському семінарі з біотехнології рослин „Biotech
Approaches to Engineering Plant Growth” (Ялта, Україна, 2004),
конференції молодих учених-ботаніків „Актуальні проблеми ботаніки та
екології” (Канів, Україна, 2004). Результати роботи є складовою частиною
циклу робіт „Молекулярні і клітинні механізми стійкості рослин до
гербіцидів з антимітотичною активністю”, відзначеною Премією НАН України
для молодих учених (Постанова Президії НАН від 24 лютого 2003 року).

Публікації. Основні результати дисертації викладені у 8 статтях і 13
тезах, опублікованих у профільних журналах та збірниках матеріалів
конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду
літератури, опису матеріалів і методів дослідження, результатів
дослідження та їх обговорення, заключення, висновків та списку цитованої
літератури (221 найменування). Робота викладена на 152 сторінках,
містить 38 рисунків та 9 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Об’єкти і методи досліджень. В роботі досліджено особливості просторової
структури таких тубулінів рослинного походження: (- і (-тубулін гусячої
трави (Eleusine indica (L.) Gaeth.), (-тубулін різушки (Arabidopsis
thaliana L.), (- і (-тубулін хламідомонади (Chlamydomonas reinhardtii
Dang.), (-тубулін тютюну техасько-мексиканського (Nicotiana
plumbaginifolia Viviani), (-тубулін хлоромонасу (Chloromonas). Для
порівняльного аналізу структурних особливостей рослинних тубулінів із
структурою інших тубулінів і тубулін-подібних білків було використано (-
і (-тубуліни свині (Sus scrofa L.), (-тубулін людини (Homo sapience L.),
бактеріальний FtsZ-білок метанококу (Methanococcus jannaschii) та білок
поділу хлоропластів A. thaliana. Вибір (-тубуліну E. indica обумовлено
наявністю у нього трьох ізоформ, які відповідають високорезистентному
(R), частково резистентному (І) та чутливому (S) до динітроанілінових та
фосфороамідних сполук біотипам цієї рослини. Висока стійкість R-біотипу
обумовлена точковою мутацією Thr239–>Ile, часткова стійкість I-біотипу
обумовлена точковою мутацією Met268–>Thr. Вибір (-тубуліну різушки
обумовлено тим, що на момент проведення дослідження це був єдиний
(-тубулін рослин з повністю відомою послідовністю. Аналіз (-тубулінів
хламідомонади та хлоромонасу здійснено з метою порівняння особливостей
просторової структури тубулінів холодочутливих та холодостійких рослин,
оскільки для цих білків достовірно показано відмінності в первинній
послідовності. (-Тубуліни хламідомонади і техасько-мексиканського тютюну
досліджено внаслідок того, що у цих організмів показано виникнення
підвищеної стійкості до динітроанілінових та фосфороамідних сполук за
рахунок змін, які відбуваються саме в (-субодиницях (заміна Lys350->Met
у хламідомонади та наявність зміненої (-ізоформи у тютюну).
Послідовності всіх тубулінів, за винятком (-тубуліну N. plumbaginifolia,
були отримані з банку даних SWISS-PROT. Послідовності (-тубуліну N.
plumbaginifolia були встановлені співробітниками відділу у співпраці з
проф. Байардом (Клемсонський університет, Клемсон, США).

Порівняльне вирівнювання і аналіз послідовностей тубулінів здійснювалися
за допомогою програми ClustalX [Thompson, 1997]. Було проведено
тотальний аналіз послідовностей всіх тубулінів, для яких повністю
розшифровано первинну структуру – 144 послідовності (-тубулінів, 166
послідовностей (-тубулінів, 28 послідовностей (-тубулінів, 2
послідовності (-тубулінів і 1 послідовність (-тубуліну. Крім того,
окремо вирівнювались і аналізувались послідовності всередині кожної
тубулінової родини, тобто окремо (-, (- і (-родин, а також проводилося
попарне вирівнювання тубулінів об’єктів дослідження та їх множинне
вирівнювання з іншими послідовностями залежно від мети конкретного
дослідження. Зокрема, проводилось вирівнювання послідовностей всіх
(-тубулінів рослинного проходження, вирівнювання послідовності
(-тубуліну різушки з послідовностями (- і (-тубулінів свині та (- і
(-тубулінів гусячої трави.

Як матрицю для наближення третинної структури всіх досліджуваних (- та
(-тубулінів було використано просторову структуру (- та (-тубулінів S.
scrofa (ProteinDataBank, http://www.rcsb.org/pdb, код 1TUB). Як матриця
для моделювання просторової структури рослинного (-тубуліну
використовувалася просторова структура молекули (-тубуліну свині,
оскільки послідовності ( і (-тубулінів мають більший ступінь подібності
між собою, ніж послідовності (- і (-тубулінів. Первинні моделі були
побудовані з використанням програмного пакету HyperChem 4.5. Промоделі
(-тубуліну гусячої трави було розроблено у трьох варіантах, що
відповідають природним біотипам цього організму, які характеризуються
різним ступенем чутливості/стійкості до динітроанілінових і
фосфороамідних сполук, а також було розроблено модель гіпотетичного
(-тубуліну цього організму, що містить заміну в положенні 268, яка
спричиняє підвищення рівня холодостійкості у зелених водоростей. Для
імітації внутрішньоклітинних умов молекули поміщалися у водне середовище
за допомогою модулів editconf і genbox програмного пакета GROMACS
[Lindahl, 2001]. Розмір водного оточення визначався розмірами
досліджуваних молекул і варіював від 68,043 A3 до 82,73 А3. Оптимізація
геометрії молекул здійснювалася шляхом мінімізації потенційної енергії
за допомогою модулів grompp й mdrun пакета GROMACS. Для оптимізації
використовувався алгоритм крутого спуска при максимальній кількості
кроків 1000 і градієнті 0,1. Мінімізація енергії проводилася з
використанням силового поля ffgmx – стандартного силового поля GROMACS.
Процедура молекулярного рестрейнінгу проводилася з використанням
зазначених вище модулів при температурі 3000К протягом 0,2 пс.
Повідомлення про помилки в структурі молекул протягом виконання програми
були відсутні. Вивчення молекулярної динаміки здійснювалося протягом 1.5
пс після стабілізації рівня коливань конформаційної енергії
(короткочасна динаміка) для поодиноких білків та 1,8 нс (довгострокова
динаміка) для комплексів при температурі 3000К.

Аналіз вторинної структури проводився з використанням стандартної
програми детектування вторинної структури dssp [Kabsch, 1983]. Матриці
залежності вторинної структури від часу коливання генерувалися за
допомогою модуля do_dssp пакета GROMACS. Схеми розподілу елементів
вторинної структури було побудовано на основі вищезазначених матриць за
допомогою програмного пакета OpenCalc. Аналіз тривимірної структури та
характеру упакування здійснювався за допомогою програм Swiss PDBViewer
[Guex, 1997] і WebLabViewerPro 3.5 Trial. Значення середньоквадратичного
відхилення в координатах відповідних амінокислотних залишків для різних
порівнюваних тубулінів розраховувались за допомогою функції calculate
RMSD програмного пакета MolMol [Koradi, 1996]. Розрахунки та
візуалізація Ван-дер-Ваальсової молекулярної поверхні проводилися за
допомогою програм MSMS [Sanner, 1996] та WebLabViewerPro Trial 3.5 та
3.7. Значення енергії білків та комплексів „білок-ліганд”, а також
коливання енергії у часі розраховувалися за допомогою модуля g_energy
програмного пакету GROMACS. Для дослідження було використано такі
речовини: орізалін, трифлюралін, пендіметалін, еталфлюралін, бенефін –
представники динітроанілінового ряду, аміпрофосметил та кремарт
(бутаміфос) – представники фосфороамідного ряду. Конструювання
„скелетів” досліджуваних речовин здійснювалося за допомогою програми
HyperChem. Значення зарядів на атомах розраховувались за допомогою
методів CNDO, AM1 та PM3. Для виконання розрахунків молекулярної
динаміки та коливань енергії гербіцидів у водному середовищі та в складі
комплексів з молекулами тубулінів програмним пакетом GROMACS було
розроблено топологію молекул динітроанілінів і фосфороамідів за
допомогою веб-сервера PRODRG [van Aalten, 1996]. Розрахунки просторової
структури промоделей зазначених речовин проводились
молекулярно-механічними методами ММ+ та GROMACS. Оптимізація геометрії
досліджуваних гербіцидів проводилась у водному середовищі за допомогою
зазначених методів у програмах HyperChem 5.02 та GROMACS (модуль mdrun).
Розмір водяного боксу становив 2,23 А3. Молекулярні коливання
розраховувалися за допомогою модуля mdrun програмного пакета GROMACS в
інтервалі 1,8 нс.

Первинну ідентифікацію сайтів, що відповідають за взаємодію із сполуками
динітроанлінового і фосфороамідного ряду було проведено шляхом
візуального аналізу структури ван-дер-ваальсової поверхні тубулінів та
розподілу електростатичного потенціалу на ній. Промоделі комплексів
тубулінів з гербіцидами було отримано шляхом ручного докінгу
динітроанілінів та фосфороамідів у відповідні відшукані сайти на
поверхні рослинних (- та (-тубулінів. Оптимізація структури та
дослідження динаміки комплексів „тубулін-гербіцид” здійснювалася за
описаною вище методикою, застосованою для тубулінів. Молекулярні
коливання комплексів „тубулін-гербіцид” досліджувалось в інтервалі 1.8
нс. Коливання конформаційної енергії оцінювались окремо для молекул
лігандів у складі відповідних комплексів і сумарно для лігандів разом з
їх амінокислотним мікрооточенням (3 амінокислоти, найближчі до
групи-детермінанта у складі молекул гербіцидів). Перші набори значень
використовувалися для порівняння стабільності комплексів одного й того ж
ліганді з різними (- та (-тубулінами. Другі набори значень
використовувались для порівняння стабільності комплексів різних
гербіцидів з молекулою (-тубуліну.

Реконструкція просторової структури (-, (- та (-тубулінів рослинного
походження. У результаті реконструкції було показано, що структура
тубулінів рослинного походження характеризується рядом важливих
особливостей (рис.1). Деякі з них мають загальнотубуліновий характер, в
той час як інші є приналежністю виключно тубулінів рослин. Всі без
винятку тубуліни характеризуються подібними планом будови і типом
упаковки білкової глобули, що включає два (-складчастих шари –
антипаралельний і паралельний, розташовані всередині молекули під кутом
один до одного і ряд (-спіральних елементів, які розташовуються на
периферії білкової глобули і таким чином оточують корові (-шари. Перший
складчастий шар утворений паралельними (-смугами, утворюючи разом з
оточуючими їх спіралями типову згортку Росмана, характерну для
нуклеотид-зв’язуючих білків. Таким чином, за типом упаковки всі
досліджувані білки належать до типу (/(. Спільність загального плану
просторової структури всіх тубулінів закономірно визначається високим
рівнем гомології їх первинних структур.

Водночас кількість і довжина окремих елементів вторинної структури є
індивідуальною характеристикою кожного конкретного типу тубуліну. Так, у
структурі (-тубуліну чутливого біотипу E. indica наявні 18 спіральних та
11 складчастих елементів, в структурі (-тубуліну E. indica – 17
спіральних та 12 складчастих елементів, в структурі (-тубуліну A.
thaliana – 19 спіральних та 9 складчастих елементів. Ступінь
упорядкованості структури (- та (-тубулінів становить 56%. Для
(-тубуліну ця величина є дещо меншою (53%), що пояснюється більшою
довжиною невпорядкованої С-кінцевої ділянки рослинних (-тубулінів
порівняно з відповідними ділянками (- та (-тубулінів. Кількість і
довжина елементів вторинної структури визначається не лише
амінокислотними залишками, які безпосередньо входять до складу цих
елементів, але також їх просторовим мікрооточенням, що виникає внаслідок
упаковки пептидного ланцюга в нативну глобулярну структуру. На користь
цього твердження свідчить той факт, що для відповідних тотожних залишків
не є характерною гомологія вторинної структури. Загальною
характеристикою всіх тубулінів є також наявність гнучкого хвоста,
збагаченого кислими залишками (в основному, залишками глютамату), що
розташовується в С-кінцевій області молекули і фактично є окремим
структурним доменом.

Встановлено, що фундаментальною особливістю всіх досліджуваних тубулінів
є явно виражена метастабільність елементів вторинної структури у часі –
явище, яке характеризується наявністю переходів цілого ряду
амінокислотних залишків, що входять до (-складок і (-спіралей, у
невпорядковані структури і назад. Так, варіабельність вторинної
структури становить 46% для (-субодиниць та 50% для (-субодиниць
тубуліну. Наявність метастабільності відрізняє тубуліни від їх
прокаріотичних гомологів – FtsZ-білків, які, навпаки, характеризуються
високою стабільністю вторинної структури у часі. Метастабільність
вторинної структури, притаманна молекулам тубулінів, очевидно пов’язана
з досить малою щільністю упаковки цих білків порівняно з іншими
(зокрема, з тими ж FtsZ-білками) – середнє співвідношення кількості
амінокислотних залишків до обсягу молекули становить у FtsZ-білків 15,2
о/оо проти 12,7 о/оо у тубулінів) і може виступати одним з ключових
факторів, що забезпечують відоме явище динамічної нестабільності
цитоплазматичних мікротрубочок у живій клітині. Разом з тим слід
зазначити, що молекулам (-тубуліну рослинного походження властивий
нижчий рівень варіабельності вторинної структури порівняно з молекулами
(- і (-тубулінів – 46%. Цей феномен найімовірніше за все пов’язаний із
специфікою клітинної ролі (-тубулінів, які виступають основним складовим
елементом центрів організації мікротрубочок. Зважаючи на те, що ЦОМТи
проявляють більшу стабільність у часі порівняно з самими
мікротрубочками, можна говорити про те, що складові компоненти ЦОМТів
повинні також проявляти стабільність, підвищену порівняно із
стабільністю компонентів мікротрубочки. Якщо взяти до уваги відсутність
у складі рослинних ЦОМТів такого структурного компоненту як центріолі,
закономірно припустити, що роль фактора, який стабілізує ЦОМТи рослин у
часі, виконують безпосередньо молекули (-тубуліну. Слід також відмітити,
що (-тубулін стійкого біотипу гусячої трави характеризується ще вищим
рівнем стабільності вторинної структури у часі – його варіабельність
становить 40%, тому вірогідно припустити, що мікротрубочки, які
формуються за участю цього зміненого ізотипу, також будуть, крім
зниженої чутливості до гербіцидів динітроанілінового та фосфороамідного
рядів, відзначатися підвищеною стабільністю.

Порівняльний аналіз особливостей структури ділянок різного ступеня
консервативності (-, (- та (-тубулінів рослин з відповідними
особливостями тваринних тубулінів зокрема показав, що розподіл
консервативних, гомологічних і відмінних залишків на поверхні тубулінів
має рівномірно-мозаїчний характер без чітких ознак кластеризації (рис.
3), а ступінь їх представленості на поверхні корелює із загальним
вмістом залишків відповідного рівня в досліджуваних молекулах. Дані щодо
розподілу величин середньоквадратичного відхилення в координатах
відповідних амінокислотних залишків між тубулінами рослин і тварин
свідчать про відсутність істотної різниці в третинній структурі ділянок
різного ступеня консервативності як у (-, так і у (- та (-субодиниць
тубулінів (табл. 1).

Зазначене явище може бути пояснене лише у випадку, коли молекула білка є
єдиним структурним доменом, який, в свою чергу, реагує як єдине ціле на
зміни у власній структурі та клітинному середовищі. Це забезпечує
достатній рівень толерантності просторової структури тубулінів до
випадкових амінокислотних замін і водночас дає змогу мікротрубочкам
гнучко реагувати на зміну стану клітинного середовища і стреси
різноманітної природи. З іншого боку, виявлений феномен свідчить про
неістотність ознаки консервативності тих або інших залишків в обумові
специфічних властивостей тубулінів рослинного походження.

Таблиця 1

Значення середньоквадратичного відхилення координат амінокислотних
залишків різного ступеня консервативності

Тип залишків ( ( (

а б а б а б

консервативні 0.55 1.28 0.84 1.28 0.16 1.38

гомологічні 0.55 1.29 0.84 1.26 0.17 1.22

відмінні 0.51 1.67 0.83 1.39 0.55 1.62

Примітка: а – для молекул після оптимізації геометрії (в статиці), б –
протягом молекулярної динаміки в інтервалі 2 пс.

Структурні особливості (-тубуліну, що обумовлюють чутливість або
стійкість рослинної клітини до динітроанілінових та фосфороамідних
сполук. Аналіз структури молекулярних поверхонь тубулінів та розподілу
електростатичного потенціалу на цих поверхнях дав змогу встановити, що
сайт зв’язування динітроанілінів і фосфороамідів у випадку (-тубуліну
розташовується на поверхні інтердимерного контакту. Основним компонентом
цього сайту є позитивно заряджена порожнина (рис. 4а), утворена
амінокислотними залишками Arg2, Arg243, Val250, Asp251, Val252, Asn253,
Glu254 (і частково Cys4, His8, Leu136 та Phe138), яка є місцем
зв’язування негативно зарядженої нітрогрупи, спільної для
динітроанілінових та фосфороамідних сполук (рис. 5). Висновок про
фундаментальну роль спільного компоненту обох класів гербіцидів у
процесах їх взаємодії з молекулами тубулінів можна зробити з того факту,
що чутливість та/або стійкість до динітроанілінів та фосфороамідів
завжди має позитивно-перехресний характер. Бензольне кільце, до якого
приєднані 2 (у випадку динітроанілінів) або 1 (у випадку фосфороамідів)
нітрогрупи, також є спільним компонентом обох класів гербіцидів, але
його роль у взаємодії дещо інша – воно надає молекулі гербіциду певної
ригідності, що забезпечує відповідну стабільність цієї структури у часі,
і відповідно, можливість утворення достатньо стабільних комплексів з
молекулою тубуліну. Найближчими до нітрогрупи виявляються залишки Arg2,
Asp251 та Asn253. Додаткова аміногрупа аргініна в положенні 2
експонована на поверхні молекули і орієнтована в бік потенційної області
взаємодії, роблячи, таким чином, безпосередній внесок у формування
позитивного потенціалу виявленої порожнини. Кислотна група аспартата в
положенні 251, навпаки, занурена в товщу молекули і орієнтована в бік,
протилежний потенційній області взаємодії, не впливаючи таким чином на
властивості останньої.

3/4

A

Ae

o

l O U Ue th 0

2

?

a

|

?

 

c

???

?????

????c

¤

¦

?

?

A

?

o

U Ue 2

x

?

a

???

?????????

?????

4

???d???

???????

.-тубуліну наступного димера. Крім того, ряд залишків, що утворюють сайт
взаємодії, зокрема Gln133, Asn249, Asp251 та Gly256, беруть участь у
взаємодії з молекулою гуанозинтрифосфату – обов’язкового фактора
полімеризації тубулінів. Таким чином, в нашому випадку ми маємо справу
також і з прямою конкуренцією низькомолекулярних речовин цілком різної
природи за сайт зв’язування на поверхні білку. Дослідження молекулярної
динаміки утворених комплексів в інтервалі 1.8 нс показали, що їх
дисоціація не відбувалася в жодному випадку.

Аналіз молекулярної поверхні (-тубуліну R-біотипу гусячої трави показав,
що внаслідок заміни Thr239–>Ile виявлена порожнина потенційної взаємодії
закривається (рис. 4б). Інтеграція діючої групи динітроанілінових та
фосфороамідних сполук в цю область на поверхні білка стає неможливою.
Молекула як динітроанілінового, так і фосфороамідного ліганда, у разі її
примусового розташування поблизу закритого сайту, досить швидко,
протягом 1 нс, мігрує в розчин. Таким чином, отримані результати добре
узгоджуються з експериментальними даними щодо впливу точкової заміни в
положенні 239 молекули (-тубуліну на рівень стійкості/чутливості до
зазначених речовин. У випадку заміни Met268–>Thr ((-тубулін І-біотипу)
спостережувана в потенційному сайті взаємодії картина дещо
ускладнюється. Означена заміна викликає не повне, а лише часткове
закриття позитивно зарядженої порожнини (рис. 4в). Така перебудова
молекулярної поверхні в області сайту зв’язування має своїм наслідком
те, що здатність до утворення комплексів між гербіцидом і білком
зберігається. Але в цій ситуації в залежності від розбіжностей у
стартовій конформації ці комплекси, на відміну від комплексів (–тубуліну
чутливого біотипу, характеризуються збільшеними амплітудами коливань
конформаційної енергії і різними рівнями стабільності (короткоживучі
розпадаються протягом перших 500 пс динаміки, довгожителі, подібно до
комплексів білка з S-біотипу, перевалюють за інтервал 1,8 нс).

Порівняльний аналіз динаміки значень конформаційної енергії зв’язаних
лігандів та їх білкового мікрооточення (амінокислотних залишків у
позиціях 2, 251 та 253) дав змогу виявити різницю у стабільності
комплексів, утворених динітроаніліновими (трифлюралін, орізалін,
пендіметалін, еталфлюралін, бенефін) та фосфороамідними (аміпрофосметил,
кремарт) сполуками з молекулою (-тубуліну S-біотипу гусячої трави, що на
клітинному рівні означає диференційовану антимікротрубочкову (і,
відповідно, антимітотичну) активність досліджуваних речовин. Як видно з
представлених результатів (рис. 6), найнижче значення конформаційної
енергії має комплекс, утворений внаслідок взаємодії (-тубуліну з
трифлюраліном, а рівні конформаційної енергії інших комплексів
досліджуваних речовин утворюють два кластери. Комплекси з бенефіном,
кремартом та орізаліном утворюють досить тісний кластер з меншим рівнем
конформаційної енергії, комплекси з еталфлюраліном, аміпрофосметилом і
пендіметаліном – менш щільний кластер з більшим рівнем енергії. Таким
чином, ряд афінності досліджуваних гербіцидів має такий вигляд:
трифлюралін > бенефін > кремарт > орізалін > еталфлюралін >
аміпрофосметил > пендіметалін. При цьому слід зауважити, що зменшення
афінності серед динітроанілінових сполук корелює з наявністю
розгалужених вуглеводневих ланцюгів на атомі азоту (еталфлюралін,
пендіметалін) та відсутністю зарядженої групи, що обумовлює додаткову
стабілізацію комплексів (пендіметалін). У випадку фосфороамідів
афінність корелює з довжиною вуглеводневих ланцюгів. Висока афінність
трифлюраліну обумовлена поєднанням ряду факторів – при відсутності
розгалуження вуглеводних ланцюгів та наявності додаткової зарядженої
групи ця сполука характеризується малим розміром молекули та високим
рівнем симетрії структури (на відміну від бенефіну – другого за рівнем
афінності представника динітроанілінів). Таким чином, індивідуальні
відмінності в активності різних речовин – представників цих рядів –
обумовлені індивідуальними особливостями просторової структури кожної
конкретної сполуки. Отримані результати корелюють з нашими даними щодо
чутливості/стійкості калусних культур гусячої трави, а також з
результатами інших досліджень по вивченню впливу динітроанілінів та
фосфороамідів на рослинні клітини.

Специфічною особливістю амінокислотного залишка 268 рослинного
(-тубуліну є те, що мутації в цій позиції призводять не лише до
виникнення підвищенної стійкості стосовно антимітотичних сполук. Так,
виявлено, що заміна метіоніна на валін у позиції 268 молекули (-тубуліну
корелює з підвищеною стійкістю психрофільних водоростей до умов низьких
позитивних температур і приводить до структурних перебудов поверхні
інтердимерного контакту. Ці перебудови призводять до підвищення
стабільності інтердимерних контактів, чим заважають обвальному
руйнуванню мікротрубочок при зниженні температури до рівня 5оС.
Моделювання впливу вищезазначеної заміни на структуру (-тубуліну
теплолюбної рослини Eleusine indica показало, що її наслідком є
уподібнення рельєфу молекулярної поверхні (-тубуліну в області
інтердимерного контакту до структури тієї ж області (-тубуліну
психрофільної водорості хлоромонас, що свідчить про значну функціональну
впливовість цієї мутації. На відміну від тубулінів рослин, підвищена
стійкість до низьких температур у тубулінів тварин обумовлена мутаціями
і відповідно перебудовами, які відбуваються у латеральних контактних
поверхнях, що свідчить про еволюційно різні шляхи виникнення
молекулярних механізмів адаптації до низьких температур у різних
органічних царствах.

Цілком вірогідно, що адаптація рослинної клітини до абіотичних факторів,
які мають цілком різну природу (у даному випадку – холод та гербіциди),
може відбуватися за рахунок загальних молекулярних механізмів,
пов’язаних з певними перебудовами поверхні інтердимерного контакту в
протофіламентах мікротрубочок внаслідок точкових мутацій в молекулах
тубулінів.

Механізми стійкості рослин до динітроанілінів та фосфороамідів, які
базуються на змінах в структурі (-тубуліну. Як зазначалося вище,
наслідком мутацій, що обумовлюють резистентність до досліджуваних
сполук, є повне або часткове закриття порожнини зв’язування нітрогрупи.
Але при цьому виявилося, що заміни, ефективні у випадку (-тубуліну, не
впливають на (-тубулін. Зокрема, висунуте раніше припущення про
функціональну значимість замін треоніна на ізолейцин в позиціях 237
(-тубуліну та 240 (-тубуліну, які є гомологічними позиції 239 молекули
(-тубуліну [Cronin, 1993], не підтверджується нашими дослідженнями.
По-перше, області на поверхні (- та ( тубуліну рослин, що відповідають
сайтові зв’язування динітроанілінів та фосфороамідів на поверхні
(-тубуліну, не містять позитивно заряджених порожнин, які могли б
зв’язувати нітрогрупу гербіцидів. Інакше кажучи, сайти на поверхні цих
субодиниць, у разі їх існування, повинні мати інше розташовування.
По-друге, аналіз поверхні молекул рослинних тубулінів, що несуть реальну
мутацію в положенні 239 ((-тубулін) і гіпотетичні мутації в положеннях
237 ((-тубулін) і 240 ((-тубулін), свідчить про відсутність будь-яких
структурних перебудов молекул (- та (-тубуліну. Можливо, це пояснюється
різницею в просторовому оточенні мутантних залишків. Так, найближче
оточення залишку треоніна в положенні 239 (-тубуліну складається з 11
амінокислотних залишків – Cys4, Gln31, Val235, Ser236, Leu238, Ala240,
Ser241, Leu242, Arg243, Phe255, у той час як оточення залишків
треонін-237 (-тубуліна і треоніна-240 (-тубуліну – з 9 залишків для
кожного. У випадку молекули (-тубуліну це Іle30, Gln134, Met233, Ser234,
Val236, Cys238, Cys239, Arg241, Leu250, у випадку молекули (-тубуліну –
відповідно Іle5, Val136, Tyr169, Met236, Ser237, Ser239, Thr241, Thr242,
Arg244. Варто звернути увагу, що простір навколо залишку треоніна-239
молекули (-тубуліну заповнений істотно щільніше, ніж оточення
відповідних залишків (- і (-тубуліну – 11 проти 9, що, у свою чергу, і
може обумовлювати більшу функціональну ефективність мутацій у цьому
локусі тубуліну.

Склад і локалізація сайтів зв’язування динітроанілінів та фосфороамідів
на молекулярній поверхні (-тубулінів характеризується певними
відмінностями стосовно відповідних сайтів на поверхні (-тубулінів (табл.
2, рис. 8а, в). Сайти розташовуються на інтрадимерній поверхні, містять
по 2 диамінові залишки, причому залишок лізину-350, внаслідок мутації по
якому відбувається підвищення стійкості до динітроанілінів у
хламідомонади, безпосередньо входить до складу відповідного
інтерактивного сайту та мікрооточення зв’язаної нітрогрупи (в складі
відповідних комплексів).

Застосування виявлених на попередніх етапах дослідження закономірностей
розташування мутацій, що підвищують стійкість до антимікротрубочкових
речовин, дало змогу ідентифікувати позицію заміни, яка найімовірніше
викликає стійкість до динітроанілінових і фосфороамідних сполук у N.
plumbaginifolia. Серед позицій унікальних замін, які містяться у
молекулах (-тубулінів стійкої лінії порівняно з (-тубулінами чутливої,
лише позиція 248 відповідає всім умовам позицій, що несуть мутації
стійкості до антимікротрубочкових. Заміна серину-248 на пролін має
наслідком перебудови в сайті зв’язування на поверхні білка (рис. 8г),
подібні до змін, викликаних заміною лізину-350 на метіонін в молекулі
(-тубуліну хламідомонади (рис. 8б).

Таблиця 2

Амінокислотні залишки різних типів тубулінів, що входять до складу
сайтів взаємодії з динітроаніліновими/фосфороамідними сполуками

Тип тубуліну (-тубулін E. indica (-тубулін C. reinhardtii (-тубулін N.
plumbaginifolia

Амінокислоти сайту зв’язування Arg2, Gln133, Arg243, Asn249, Val250,
Asp251, Val252, Asn253, Glu254 Leu246, Asn247, Ala248, Asp249, Lys252,
Leu253, Val255, Asn256, Lys350 Leu246, Asn247, Ser248, Asp249, Lys252,
Leu253, Asn256, Lys350, Ser351, Thr 352

Амінокислоти, що утворюють оточення нітрогрупи Arg2, Asp251, Asn253
Ala248, Lys252, Lys350 Ser248, Lys252, Lys350

Привертає увагу те, що рівень афінності динітроанілінів стосовно молекул
рослинних (- і (-тубулінів відрізняються неістотно (рис. 9), хоча
фізіологічна ефективність замін по (- та (-субодиницях відрізняється
майже на 2 порядки. Явище, яке ми спостерігаємо, можна пояснити тим, що
основний пул клітинного тубуліну, неполімеризованого в мікротрубочки,
знаходиться в димеризованому стані. Отже, поверхня інтрадимерного
контакту на молекулі (-тубуліну виявляється блокованою сусідньою
(-субодиницею і недоступною для впливу гербіциду. Зв’язування
динітроанілінів/фосфороамідів з (-тубуліном можливе лише у проміжок часу
між трансляцією останнього та його димеризацією. Навпаки, інтердимерна
поверхня (-тубуліну, весь час лишається доступною для контакту з
молекулою гербіциду.

Таким чином, сайти зв’язування динітроанілінових та фосфороамідних
речовин на молекулах (- і (-тубулінів рослин характеризуються подібними
особливостями структури – для них є обов’язковою наявність позитивно
зарядженої порожнини, яка служить місцем зв’язування негативно
зарядженої нітрогрупи гербіцидів, і диамінного амінокислотного залишку
(лізину чи аргініну), який виступає основним джерелом позитивного
потенціалу на поверхні сайту. Але при цьому розташування сайтів є
унікальним як у випадку (-, так і випадку (-субодиниць, що визначається
індивідуальними особливостями складу, і як наслідок, поверхневого
рельєфу обох типів досліджуваних тубулінів. Неуніверсальний характер
розташування інтерактивних сайтів на поверхні різних типів тубулінів
разом з неуніверсальністю мутацій є вагомим підтвердженням надзвичайно
специфічних властивостей молекулярної поверхні тубулінів рослин стосовно
сполук динітроаніліного і фосфороамідного ряду.

Аналіз закономірностей розташування мутацій, що спричиняють стійкість до
антимікротрубочкових сполук. Дані аналізу розташування в просторі
молекули тубуліну точкових мутацій, які спричиняють підвищення
резистентності до антимікротрубочкових речовин, свідчать, що всі відомі
на сьогодні заміни локалізуються в безпосередній близькості від
контактних поверхонь (рис. 10). Заміни, наслідком яких є стійкість до
речовин, що деполімеризують мікротрубочки, як правило розташовуються під
поверхнями повздовжніх контактів, тоді як мутації, що спричиняють
стійкість до стабілізуючих мікротрубочки речовин, експоновані на
поверхнях латеральних контактів між протофіламентами.

Показано також, що всі мутації, які спричиняють стійкість до сполук, які
деполімеризують мікротрубочки, належать до позицій, консенсусних в межах
( чи (-родини, та розташовані в первинній послідовності тубулінів не
далі шостого залишку від позицій амінокислот, які залучені до утворення
поверхонь повздовжніх контактів між субодиницями тубуліну або у процеси
взаємодії з молекулами ГТФ/ГДФ, але ніколи не збігається з останніми.
Виявлені нами закономірності дають змогу передбачати позиції нових
мутацій, що спричинятимуть стійкість рослинної клітини до впливу цих
сполук, а також істотно полегшити ідентифікацію сайтів зв’язування
антимітотичних речовин з деполімеризуючим механізмом дії, оскільки
резонно припустити, що зазначені мутації відбуваються в безпосередній
близькості до відповідних інтерактивних сайтів. Таким чином, з великою
вірогідністю сайти зв’язування деполімеризуючих речовин будуть
приурочені до поверхонь повздовжніх контактів, сайти зв’язування
стабілізуючих сполук відповідно – до латеральних.

Рис. 10. Просторове розташування в димері тубуліну відомих мутацій, що
спричиняють стійкість до антимікротрубочкових речовин. а – вид ззовні
мікротрубочки, б – вид зсередині мікротрубочки, в – латеральний вид.

ВИСНОВКИ

У ході роботи вперше було відтворено просторову структуру (-, (- і
(-тубулінів рослинного походження і досліджено особливості їх третинної
структури, які обумовлюють характер відповіді рослинної клітини на вплив
динітроанілінових та фосфороамідних гербіцидів на молекулярному рівні.

1. Показано, що при єдності загального плану просторової будови і типу
упаковки кожний тип тубуліну характеризується індивідуальною кількістю і
довжиною елементів вторинної структури, які визначаються не лише
амінокислотними послідовностями, а також залежать від складу залишків,
що утворюють просторове оточення цих елементів.

2. Вперше показано, що тубулінам як рослинного, так і тваринного
походження властива метастабільність вторинної структури в часі, яка
може виступати одним з ключових факторів, що забезпечують динамічні
властивості мікротрубочок у живій клітині. Нижчий рівень
метастабільності (-тубулінів рослин порівняно з (- і (-тубулінами (53%
проти 56%) може бути обумовлений клітинною роллю цих білків як основних
структурних компонентів ЦОМТів.

3. Встановлено, що структура ділянок різного ступеня консервативності

(-, (- і (-тубулінів будь-якого походження не має ознак істотної
різниці, що свідчить про некритичність ознаки
консервативності/відмінності тих чи інших залишків в обумовленні
специфічних властивостей тубулінів рослин.

4. Вперше на поверхні молекул (-тубуліну рослинного походження
ідентифіковано розташування сайту взаємодії з надспецифічними ефекторами
рослинних тубулінів – динітроаніліновими і фосфороамідними гербіцидами.
Показано, що цей сайт розташовується на поверхні інтердимерного контакту
і складається з амінокислотних залишків Arg2, Gln133, Arg243, Asn249,
Val250, Asp251, Val252, Asn253, Glu254.

5. Показано, що основним структурним компонентом сайту зв’язування
динітроанілінових та фосфороамідних сполук є позитивно заряджена
порожнина на поверхні (-тубуліну, до складу якої входить залишок
диамінної амінокислоти і яка служить для зв’язування діючого компоненту
гербіцидів – нітрогрупи, приєднаної до бензольного кільця. Мутації, що
викликають підвищення стійкості до означених сполук, спричиняють повне
або часткове закриття цієї порожнини. Різниця в антимітотичній
ефективності окремих представників динітроанілінів і фосфороамідів
обумовлена індивідуальними особливостями їх просторової структури.

6. Показано, що мутація Met–>Thr в позиції 268 рослинного (-тубуліну,
яка викликає виникнення проміжної стійкості до динітроанілінових
гербіцидів, співпадає з позицією заміни Met–>Val, яка спричиняє
підвищення рівня холодостійкості і, в свою чергу, приводить до перебудов
поверхні інтердимерного контакту. Таким чином, показано критичну роль
інтердимерної поверхні в забезпеченні стійкості до стрес-факторів цілком
різної природи.

7. Виявлено, що розташування відповідних сайтів взаємодії на поверхні
(-тубуліну не співпадає з таким на поверхні (-тубуліну, що обумовлено
індивідуальними відмінностями у складі відповідних субодиниць. Сайт на
поверхні (-тубуліну локалізується на поверхні інтрадимерного контакту і
містить у випадку хламідомонади залишки Leu246, Asn247, Ala248, Asp249,
Lys252, Leu253, Val255, Asn256, Lys350, (Ser351, Thr352), а у випадку
тютюну – Leu246, Asn247, Ser248, Asp249, Lys252, Leu253, Val255, Asn256,
Lys350, Ser351, Thr352.

8. Виявлено, що різниця в спорідненості динітроанілінів і фосфороамідів
до (- і (-субодиниць тубулінів є неістотною, а істотна відмінність в
ефективності мутацій по (- та (-субодиницях, які підвищують стійкість до
цих сполук, обумовлена різницею між доступністю поверхонь інтердимерного
та інтрадимерного контакту для атаки молекулою гербіциду.

9. Виявлено загальну закономірність розташування мутацій, що спричиняють
підвищення стійкості до речовин, які деполімеризують мікротрубочки –
позиції цих замін локалізуються не далі шостого залишку від
амінокислоти, залученої до утворення поверхонь повздовжніх контактів, що
може бути базовим критерієм для пошуку нових мутацій з аналогічною
активністю.

Список публікацій

1. Ныпорко А. Ю., Блюм Я. Б. Сравнительный анализ вторичной структуры
тубулинов и FtsZ-белков // Биополимеры и клетка. – 2001. – Т. 17. – С.
61-69.

2. Ныпорко А. Ю., Блюм Я. Б. Особенности вторичной структуры (-тубулина
растений // Учёные записки ТНУ, серия “Биология”. – 2001. – Т. 14. – С.
145-150.

3. Ныпорко А. Ю., Блюм Я. Б. Моделирование и анализ пространственной
структуры молекул (-тубулина высших растений // Доповіді НАН України. –
2002. – № 1, – С. 175-179.

4. Ныпорко А. Ю., Емец А.И., Климкина Л.А., Блюм Я. Б. Взаимосвязь
чувствительности каллуса Eleusine indica к трифлюралину и
амипрофосметилу с особенностями взаимодействия этих соединений с
тубулином // Физиология растений. – 2002. – Т. 49. – С. 459-466.

5. Ныпорко А. Ю., Живолуп А. Н., Блюм Я. Б. Сравнительный анализ
первичной структуры мутантных тубулинов, устойчивых к
антимикротрубочковым соединениям, для предсказания позиций новых мутаций
с аналогичными свойствами // Цитология и генетика. – 2003. – Т. 37. – С.
69-78.

6. Blume Ya.B., Nyporko A.Yu., Yemets A.I., Baird W.V. Structural
modeling of plant б-tubulin interaction with dinitroanilines and
phosphoroamidates // Cell Biol. Int. – 2003. – V. 27. – P. 171-174.

7. Nyporko A.Yu., Demchuk O.N., Blume Ya.B. Cold adaptation of plant
microtubules: structural interpretation of primary sequence changes in a
highly conserved region of (-tubulin // Cell Biol. Int. – 2003. – V. 27.
– P. 241-243.

8. Ныпорко А. Ю., Демчук О. Н., Блюм Я. Б. Анализ структурных
особенностей (-тубулина растений, обеспечивающих повышенную устойчивость
к холоду // Цитология и генетика. – 2003. – Т. 37– № 6. – С. 3-11.

9. Nyporko A. Yu. Three-dimensional structure of plant tubulins //
Abstr. of XVI International Botanical Congress (August 1-7, 1999, st.
Louis, USA), – St. Louis, 1999. – P. 665.

10. Ныпорко А. Ю., Блюм Я. Б. Идентификация и анализ сайтов
взаимодействия молекул тубулина растений с высокоспецифичными лигандами
// Тезисы конференции “Цитоскелет и клеточная регуляция” (Пущино,
Россия, 11-12 мая 2000). – Пущино, 2000. – С. 27.

11. Емец А.И., Ныпорко А. Ю., Блюм Я. Б. Механизмы
динитроанилин-устойчивости у высших растений // Материалы II
международной научной конференции “Биотехнология в растениеводстве,
животноводстве и ветеринарии” (18-19 октября 2000, Москва, Россия) –
Москва, 2000. – С. 121-122.

12. Ныпорко А. Ю., Блюм Я. Б. Особенности пространственной структуры
молекул тубулина растений // Тези доповідей VII Конференції молодих
вчених “Проблеми фізіології рослин і генетики на рубежі третього
тисячоліття” (18-20 жовтня, 2000, Київ, Україна) – Київ, 2000. – С. 86.

13. Nyporko A.Yu., Yemets A.I., Klimkina L.A., Blume Ya.B.
Identification and analysis of interactive sites of plant tubulin for
dinitroanilines and phosphoroamidates // Mol. Biol. Cell – 2000. – V.
11. – P. 190a.

14. Nyporko A.Yu., Yemets A.I., Blume Ya. B. Three-dimensional
reconstruction of interactive sites of plant б-tubulin for
dinitroanilines and phosphoroamidates // Abstr. of 16th European
Cytoskeleton Forum Meeting (August 22-26, 2001, Maastricht, the
Netherlands) – Мaastricht, 2001. – P. 30.

15. Nyporko A.Yu. Investigation of spatial-specific properties of plant
tubulins // Abstr. of of Conference for students, PhD and young
scientists on Molecular Biology and Genetics, dedicated to the
establishment of Ukraine Society for molecular biology (September 20-22,
2001, Kyiv, Ukraine) – Kyiv, 2001. – P. 61.

16. Blume Ya.B., Nyporko A.Yu., Yemets A.I. Development of gene transfer
approaches for creating of dinitroaniline resistant crops // Abstr. of
Bulgarian-Ukrainian Seminar on Plant Biotechnology, (September 24-28,
2001, Lessidren, Bulgaria) – Lessidren, 2001.

17. Blume Ya.B., Nyporko A.Yu., Yemets A.I. Modified plant tubulin genes
– a novel system for transgenic plant selection: mode of action and
ecologically safety // Abstr. of Int. Symposium “Biotechnology
Approaches for Exploitation and Preservation of Plant Resources” (May
26-31, 2002, Yalta, Ukraine) – Yalta, 2002. – P. 90.

18. Blume Ya.B., Nyporko A.Yu., Yemets A.I., Baird W.V. Are earlier
predicted sites of different plant tubulins involved in interaction with
dinitroanilines? // Mol. Biol. Cell – 2002. – V. 13. – P. 463a.

19. Yemets A. I, Radchuk V V., Nyporko A. Y., Bayer G.Ya., Pakhomov
A.V., Blume Ya.B. Novel selection system for transgenic plants based on
altered tubulin genes conferring resistance to dinitroanilines // Abstr.
of Ukrainian-UK Workshop on Plant Biotechnology “Biotech Approaches to
Engineering Plant Growth” (March, 14-16, 2004, Yalta Ukraine) – Yalta,
2004 – P.41.

20. Ныпорко А. Ю., Блюм Я. Б. Анализ особенностей структуры участков
различной степени консервативности молекул тубулинов растительного
происхождения // Актуальні проблеми ботаніки та екології. – Вип. 9. –
Матеріали конференції молодих вчених-ботаніків – Канів, 7-10 вересня
2004. – С. 170-172.

21. Yemets A. I., Nyporko A. Y., Swire-Clark G., Baird W. V., Blume Y.
B. Mechanisms of plant resistance to dinitroanilines and
phosphoroamidates based on в-tubulin mutations // Abstracts of XVII
International Botanical Congress (July 17-23, 2005, Vienna, Austria) –
Vienna, 2005 – P.292.

АНОТАЦІЇ

Нипорко О. Ю. Особливості просторової структури тубуліну як основа
клітинної відповіді рослин на дію гербіцидів динітроанілінового та
фосфороамідного рядів. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія. –
Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ,
2005.

У роботі відтворено просторову структуру тубулінів рослинного походження
та досліджено її особливості, які обумовлюють характер клітинної
відповіді рослин на дію динітроанілінових та фосфороамідних гербіцидів.
Показано, що тубулінам взагалі і тубулінам рослин зокрема властива
метастабільність вторинної структури, яка може бути одним з ключових
факторів, що забезпечують динамічні властивості мікротрубочок у живій
клітині. На поверхні ( і (-тубулінів росли ідентифіковано сайти
специфічної взаємодії з динітроаніліновими та фосфороамідними
гербіцидами, що розташовуються відповідно на поверхнях інтер- та
інтрадимерного контактів і мають спільну складову компоненту – позитивно
заряджену порожнину, яка зв’язує нітрогрупу гербіцидів. Але при цьому їх
амінокислотний склад і локалізація на ( та (-субодиницях не співпадають,
що обумовлено індивідуальними відмінностями в складі останніх. Виявлено,
що просторова структура поверхонь інтердимерних контактів є критичним
фактором при відповіді рослинної клітини на стреси цілком різної природи
(холод та гербіциди). Показано, що мутації по (- та (-тубуліну, які
обумовлюють стійкість до динітроанілінових та фосфороамідних гербіцидів,
мають різну ефективність завдяки різниці в доступності сайтів на
поверхні ( і (-тубулну. Виявлено основні закономірності розташування
мутацій, що обумовлюють стійкість до речовин, які деполімеризують
мікротрубочки.

Ключові слова: тубулін рослин, особливості просторової структури,
специфічна взаємодія, стійкість до речовин, що деполімеризують
мікротрубочки, динітроанілінові та фосфороамідні гербіциди, клітинна
відповідь на стрес.

Ныпорко А. Ю. Особенности пространственной структуры тубулина как основа
клеточного ответа растений на действие гербицидов динитроанилинового и
фосфороамидного рядов. – Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.11 – цитология, клеточная биология, гистология. –
Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев,
2005.

В работе впервые была реконструирована пространственная структура (, ( и
( тубулинов растительного происхождения и проанализированы её
особенности, обеспечивающие клеточный ответ растений на воздействие
динитроанилиновых и фосфороамидных гербицидов. Эти вещества с высокой
эффективностью связываются с тубулином растений, что приводит к
деполимеризации микротрубочек в растительной клетке, и в то же время не
способны взаимодействовать с тубулином животного происхождения, несмотря
на высокую консервативность надсемейства тубулинов и чрезвычайно высокий
уровень гомологии их аминокислотных последовательностей.

В ходе работы установлено, что при единстве общего плана
пространственного строения и типа упаковки каждый конкретный тубулин
характеризуется индивидуальным количеством и длиной элементов вторичной
структуры, что определяется не только аминокислотными
последовательностями исследуемых белков, но и в немалой степени зависит
от пространственного микроокружения остатков, образующих эти элементы.
Также впервые показано, что тубулинам как растительного, так и животного
происхождения свойственна метастабильность вторичной структуры во
времени (переход остатков, образующих спиральные и складчатые элементы,
в неупорядоченные структуры и обратно), которая может выступать одним из
ключевых факторов, обеспечивающих динамические свойства микротрубочек в
живой клетке. Более низкий уровень метастабильности (-тубулинов растений
по сравнению с (- и (-тубулинами (53% против 56%) может быть обусловлен
клеточной ролью этих белков как основных структурных компонентов центров
организации микротрубочек. Интересным выявился тот факт, что для
глобулярных частей (- (- и (-тубулинов любого происхождения характерно
структурное единство – структура участков тубулинов, состоящих из
консервативных, гомологичных и отличных остатков не несёт признаков
существенной разницы, что обеспечивает ответ тубулинов как единого
целого на воздействие любого характера.

На поверхности молекул (- и (-тубулинов растительного происхождения
идентифицировано расположение сайтов взаимодействия с динитроанилиновыми
и фосфороамидными гербицидами. Показано, что соответствующие сайты
взаимодействия располагаются на поверхности интердимерного контакта в
случае (-субъединицы тубулина и на поверхности интрадимерного контакта в
случае (-субъединицы тубулина. Выявлено, что основным структурным
компонентом этих сайтов связывания является положительно заряженная
полость на поверхности молекулы, в состав которой входит остаток
диаминовой аминокислоты и которая служит для связывания действующего
компонента гербицидов – нитрогруппы, присоединенной к бензольному
кольцу. Мутации, вызывающие повышение устойчивости к исследуемым
соединениям, вызывают полное или частичное закрытие этой полости.
Разница в антимитотической эффективности отдельных представителей
динитроанилинов и фосфороамидов обусловлена индивидуальными
особенностями их пространственной структуры.

Важным выявился тот факт, что мутация в позиции 268 растительного
(-тубулина, вызывающая повышение уровня устойчивости к динитроанилиновым
и фосфороамидным гербицидам, совпадает с позицией замены, которая
обеспечивает повышенную холодоустойчивость. Таким образом, мы можем с
высокой долей вероятности можем утверждать, что структура поверхности
интердимерного контакта (-тубулина растений играет критическую роль в
обеспечении стойкости к стресс-факторам вполне разной природы.

Сайты на поверхности (- и (-субъединиц не совпадают между собой, что
обусловлено индивидуальными отличиями в составе соответствующих
тубулинов. Сайт на поверхности (-тубулина образовано остатками Arg2,
Gln133, Arg243, Asn249, Val250, Asp251, Val252, Asn253, Glu254, сайт на
поверхности (-тубулина – остатками Leu246, Asn247, Ala(Ser)248, Asp249,
Lys252, Leu253, Val255, Asn256, Lys350 (Ser351, Thr352). Разница в
сродстве динитроанилинов и фосфороамидов к (- и (- субъединицам является
незначительной, а существенное отличие в эффективности мутаций по (- и
(-субъединицам, повышающих устойчивость к этим соединениям, обусловлена
разницей в доступности поверхностей интердимерного и интрадимерного
контакта для атаки молекулой гербицида.

Выявлены общие закономерности расположения мутаций, вызывающих повышение
устойчивости к веществам, деполимеризующим микротрубочки –
приуроченность к контактным поверхностям, принадлежность к консенсусным
позициям внутри конкретного семейства тубулинов и локализация не далее
шестого остатка от аминокислоты, вовлеченной в образование поверхностей
продольных контактов. Эти закономерности могут быть базовым критерием
для поиска новых мутаций с аналогичной активностью и для получения
устойчивых к антимикротрубочковым веществам линий растений путём
сайт-направленного мутагенеза.

Ключевые слова: тубулин растений, особенности пространственной
структуры, специфическое взаимодействие, устойчивость к веществам,
деполимеризующим микротрубочки, динитроаналиновые и фосфороамидные
гербициды, клеточный ответ на стресс.

Nyporko A. Yu. The features of spatial structure of tubulin as
background of plant cell response on the influence of dinitroaniline and
phosphoramidate herbicides. – Manuscript.

The Thesis for Philosophy Doctor Degree in Biology, specialty 03.00.11 –
cytology, cell biology, histology. – Institute of Cell Biology and
Genetic Engineering of NAS of Ukraine, Kyiv, 2005.

The spatial structure of plant tubulins was reconstructed and its
features, that are conditioned the character of cell response of plants
on the influence of dinitroaniline and phosphoramidate herbicides, were
investigated in the thesis. It was shown the metastability of secondary
structure is proper for tubulin at all and for plant tubulin in
particular, that can be one of key factors providing dynamic properties
of microtubules in living cell. On the surface of ( and (-tubulins it
was identified the sites of specific interaction with dinitroaniline and
phosphoramidate herbicides, that are arranged on the surfaces of inter-
and intradimer contacts and have common component – positively charged
cavern binding the herbicide nitrogroup. But at that their amino acid
composition and localization on ( and (-subunits don’t coincide, that is
conditioned by individual differences in tubulin composition. It was
shown the structure of interdimer contact surface is critical factor in
plant cell response to stresses of different identity (cold and
herbicides). It was revealed that mutations in ( and (-tubulin
conditioning the resistance to dinitroaniline and phosphoramidate
herbicides have different effectiveness due to the distinction in site
accessibility on the surface of ( and (-tubulin. It was revealed the
main regularities, witch condition the resistance to substances that
depolymerize microtubules.

Key words: plant tubulin, features of spatial structure, specific
interaction, resistance to substances depolymerizing microtubules,
dinitroaniline and phosphoramidate herbicides, cell response to stress.

PAGE 20

Похожие записи