НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ КЛІТИНИ

ДРОБОТ Людмила Борисівна

УДК 577.112.7:576.32/36

Особливості організації і функціонування сигнальних мереж в нормальних
та пухлинних клітинах

03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Львів – 2005

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі сигнальних механізмів клітини Інституту
біології клітини НАН України (м. Львів).

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор,

член-кореспондент НАН України

Сибірний Андрій Андрійович,

Інститут біології клітини НАН України,

директор Інституту

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,

академік НАН України

Комісаренко Сергій Васильович,

Інститут біохімії НАН України,

директор Інституту

доктор біологічних наук, професор,

член-кореспондент НАН України

Риндич Алла Володимирівна,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

завідувач відділу молекулярної онкогенетики

доктор біологічних наук,

Луцик Максим Дмитрович

Інститут біології клітини НАН України,

Провідний науковий співробітник відділу

регуляції проліферації клітин

Провідна установа: Інститут експериментальної патології, онкології і
радіобіології ім. Р.Є Кавецького НАН України, м. Київ

Захист відбудеться “ 23 ” грудня 2005 р. о 14 годині на
засіданні cпеціалізованої вченої ради Д 35.246.01 в Інституті біології
клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова,14/16.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології клітини
НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.

Автореферат розіслано “ ” листопада 2005 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук, ст. н. сп.
Убийвовк В.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Однією із властивостей, спільних для всіх живих
організмів, є їх динамічна здатність до постійної координації власної
діяльності у відповідності зі змінами в оточуючому середовищі і свого
внутрішнього стану, що забезпечується функціонуванням шляхів
трансмембранного перетворення і внутрішньоклітинного проведення
регуляторних сигналів (сигнальних шляхів) (Schlessinger, 1994; Pawson,
1995). До недавнього часу вважалось, що передача окремих сигналів від
мембранних рецепторів вглиб клітини відбувається шляхом низки взаємодій
між сигнальними білками та іншими молекулами сигнального шляху. Однак
величезний об’єм інформації стосовно численних нових учасників
сигнальних систем, що поставляється структурною геномікою, призвів до
якісного перегляду звичних і дуже часто спрощених уявлень в галузі
клітинної біології (Monk, 2003). Виявилось, що регуляторні білки
сконструйовані, переважно, у вигляді касет доменів, що опосередковують
білково-білкові (-ліпідні, -нуклеїнові) взаємодії або володіють
ферментативною активністю (Pawson & Nash, 2000). Завдяки значним
успіхам, які були досягнуті протягом останніх років у з’ясуванні
модульної організації сигнальних білків та в розшифровці механізмів
міжмолекулярних взаємодій, відповідальних за збирання сигнальних молекул
в окремі біохімічні шляхи, стало зрозумілим, що здатність клітин
регулювати просторово розділені функції обумовлена організацією
сигнальних шляхів в мережі (Jordan et al., 2000). Встановлено, що
провідну роль у просторовому розмежуванні сигналювання відіграють
адаптерні та риштувальні (scaffold) білки, які забезпечують одночасно
збирання надмолекулярних комплексів сигнальних білків і взаємодії з
елементами клітинних структур, таких як цитоскелет і ін. (Pawson & Nash,
2003). Результати цих робіт однозначно показали, що порушення сигнальних
механізмів клітини є однією з головних молекулярних подій в етіології і
патогенезі багатьох захворювань людини і, зокрема, раку (McCormick,
1999; Hahn & Weinberg, 2002). По мірі поглиблення нашого розуміння
деталей такої функціональної організації і переходу на наступний рівень
аналізу взаємозв’язаних клітинних функцій, постає надзвичайно важлива
проблема виявлення та вивчення властивостей сигнальних мереж в цілому,
таких як здатність до інтеграції і консолідації величезної кількості
регуляторних сигналів, специфічність, ефективність і інтенсивність
сигналювання, кінетика і амплітуда проходження сигналу в мережі і ін.
Від відповіді на ці і інші взаємопов’язані питання в значній мірі буде
залежати, в якому напрямку буде розвиватись фундаментальна біологічна
наука і які стратегічні підходи буде використовувати медицина в
майбутньому. Важливим показником практичної значимості досліджень у
вказаній галузі молекулярної клітинної біології є інтенсивний розвиток
цілої галузі дизайну фармакологічних засобів, здатних ефективно
пригнічувати у змінених клітинах конститутивно активовані сигнальні
мережі шляхом блокування передачі сигналу в окремих її ланках, що
дозволяє регулювати фізіологію клітин в обхід генетичних змін, які
призвели до розвитку тих чи інших патологічних станів (Sawyer, 1998;
Dalgarno et al., 1998; Vidal et al., 2001; Madhusadan & Ganesan, 2004:
Noble et al., 2004).

Однак, незважаючи на суттєві зусилля, переважна більшість сигнальних
шляхів досліджені лише частково, дуже мало відомо про те, яким чином
окремі сигнали надходять до специфічних компартментів клітини,
просторово-часові принципи організації і функціонування сигнальних мереж
клітин залишаються в значній мірі нез’ясованими, робота над створенням
базових концепцій, які б дозволили безпосередньо перейти від аналізу
окремих сигнальних компонентів до системного аналізу, розпочалась лише
нещодавно. Деякі аспекти вказаної проблеми знайшли розвиток у даній
дисертаційній роботі.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконана у відповідності з планами наукових досліджень відділу
сигнальних механізмів клітини Інституту біології клітини НАН України
(раніше відділ біохімії клітинної диференціації Відділення регуляторних
систем клітини Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України). У
роботі використані результати досліджень, отримані в рамках наступних
бюджетних тем: „Исследование биохимических механизмов действия инсулина
на клетки животных в раннем эмбриогенезе”, № держреєстрації 01830064145,
1982-1985 рр.; „Изучение биохимических механизмов действия полипептидных
факторов роста на клетки животных и человека”, № держреєстрації
01860011724, 1986-1990 рр.; „Изучение молекулярних механизмов действия
трансформирующего фактора роста типа ? (ТФР- ?) на пролиферацию и
дифференцировку клеток животных и человека”, № держреєстрації
0294900001, 1991-1993 рр.; „Дослідження каскадних процесів
фосфорилювання білків при індукції диференціації клітин”, №
держреєстрації 0297V000549, 1994-1996 рр.; „Дослідження молекулярних
механізмів альтернативної диференціації клітин”, № держреєстрації
0197V004659, 1997-1999 рр.; „Дослідження ролі білок-білкових взаємодій,
опосередкованих Src-гомологічними доменами сигнальних білків в регуляції
проліферації, диференціації і апоптозу клітин людини і тварин”, №
держреєстрації 0100V000081, 2000-2003 рр.; „Роль SH3-вмісних адаптерних
білків Ruk/CIN85/SETA в регулюванні сигнальних мереж нормальних і
трансформованих клітин”, № держреєстрації 0104V000724, 2004-2006 рр.
Робота виконувалась також у рамках вітчизняних конкурсних програм: 5-ти
проектів Державного фонду фундаментальних досліджень, зокрема, „Вивчення
функціонального стану рецепторних тирозинових протеїнкіназ та білків,
асоційованих з ними, в регуляції процесів проліферації і диференціації
клітин в культурі”, № 5/17, 1992-1993 рр.; „Дослідження ролі
GTP-зв’язуючих білків (G-білків) в регуляції активності
фосфоінозитидкіназ при стимуляції клітинної проліферації і
диференціації”, № 5.2/73, 1993-1994 рр.; „Дослідження ролі
тирозинспецифічного фосфорилювання білків у регуляції процесів
проліферації і диференціації клітин в культурі”, № 5.3/436, 1994-1996
рр.; “Регуляція функціональної активності низькомолекулярних
GDP/GTP-зв`язуючих Ras-подібних білків в процесі індукції диференціації
лейкемічних клітин в культурі”, № 5.4/38, 1997-1998 рр.; „З’ясування
біологічної ролі адаптерного білка Ruk в регуляції процесів
проліферації, диференціації та апоптозу клітин людини і тварин”, №
05.07/00283, 2001-2005 рр.

Мета та завдання досліджень. Метою дослідження було з’ясувати
особливості функціонування сигнальних мереж в нормальних і пухлинних
клітинах на моделях зародків тварин, що розвиваються, та клітин у
культурі, експериментально обґрунтувати гіпотезу стосовно критичної ролі
стехіометрії адаптерних/риштувальних білків в надмолекулярних сигнальних
комплексах у забезпеченні специфічності та інтенсивності
внутрішньоклітинного сигналювання, дослідити сигнальні мережі,
опосередковані SH3-вмісним адаптерним/ риштувальним білком Ruk, та
проаналізувати експресію ізоформ Ruk у пухлинах людини.

Для досягнення поставленої мети було сформульовано такі основні
завдання:

з’ясувати роль інсуліну і епідермального фактора росту (EGF) у регуляції
процесів, що відбуваються в клітинах ранніх зародків костистої риби
в’юна та ідентифікувати і охарактеризувати основні сигнальні ланки, які
модулюються вказаними факторами росту;

дослідити динаміку сигнальних процесів в клітинах зародків в’юна на
стадії пізньої бластули-ранньої гаструли в контролі та при дії інсуліну
і EGF;

встановити здатність інгібітора тирозинових протеїнкіназ, анзаміцинового
антибіотика гербіміцину А, і форболового ефіру, форбол-міристат-ацетату
(РМА), інгібувати клітинний ріст, індукувати диференціацію і апоптоз
Ph+-позитивних клітин еритролейкемії людини лінії К562;

проаналізувати роль і динаміку р210Bcr-Abl-залежних внутрішньоклітинних
сигнальних шляхів в клітинах еритролейкемії людини лінії К562 та вплив
на ці процеси гербіміцину А і форбол-міристат-ацетату;

виявити зміни в складі надмолекулярних комлексів, опосередкованих
адаптерними білками Grb2 та р85?, регуляторною субодиницею РІ-3-кінази,
при дії гербіміцину А і РМА на клітини К562;

ідентифікувати білки-партнери, які взаємодіють із SH3-вмісним адаптерним
білком Ruk in vivo і in vitro, та домени адаптерного білка, залучені до
взаємодії, дослідити роль доменної організації білка Ruk в регуляції
його біологічної активності;

дослідити експресію адаптерного білка Ruk/CIN85 в пухлинах нирки людини;

показати роль стехіометрії адаптерних білків в надмолекулярних
сигнальних комплексах в регуляції біологічної активності їхніх
ефекторних мішеней.

Об’єкт дocліджeння: сигнальні мережі нормальних і пухлинних клітин.

Пpeдмeт дocліджeння: динаміка сигнальних процесів, білок-білкові
взаємодії, опосередковані адаптерними/риштувальними білками, в
організації та регулюванні сигнальних мереж клітин.

Методи дослідження: біохімічні, молекулярно-біологічні, молекулярної
клітинної біології, цитологічні, імунофлуоресцентна мікроскопія.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше виявлені рецептори
інсуліну і EGF в клітинах зародків в’юна на стадії ранньої гаструли,
вивчено кінетичні параметри ліганд-рецепторної взаємодії. Показано, що
ідентифіковані рецептори інсуліну і EGF є функціональними і зазнають
автофосфорилювання, що стимулюється лігандами. Визначено молекулярну
масу субодиниць рецептора інсуліну та рецептора EGF. Охарактеризовано
провідні рецептор-чутливі сигнальні ланки, залучені до реалізації
ефектів зазначених факторів росту. До них належать GTP-зв’язувальні
білки, система обміну поліфосфоінозитидів плазматичних мембран,
тирозинспецифічне фосфорилювання білків ембріональних клітин, S6-кіназна
активність.

Вперше показано, що основною закономірністю сигнальних процесів в
ранньому ембріогенезі є їх системний коливний характер, в той час як
скерованість регуляторного впливу екзогенних поліпептидних факторів
росту (ПФР) залежить від рівня активності сигнальних ланок в інтактних
зародках (від пригнічення їхньої активності при високому рівні в
контролі і, навпаки, до стимуляції – при низькому рівні в контролі).

Отримано оригінальні дані про те, що незалежно від експресії в клітинах
К562 химерної тирозинової кінази р210Bcr-Abl, рівень її активності,
фосфорилювання білків по тирозину та рівень активності ефекторних білків
р21Ras і фосфатидилінозит-3-кінази (РІ-3-кінази) не підтримуються на
постійному конститутивному рівні, а володіють коливним характером
залежно від фази росту клітинної культури. Показано, що зміни в
активності досліджуваних сигнальних ланок, індуковані інгібітором
тирозинових протеїнкіназ гербіміцином А і РМА, є різноспрямованими і
носять системний фазовий характер залежно від показників в інтактних
клітинах за відсутності згаданих чинників.

Встановлено, що осциляції сигнальних процесів в лейкемічних клітинах
К562 корелюють із змінами у складі р210Bcr-Abl-залежних надмолекулярних
комплексів, опосередкованих адаптерними білками Сbl, Grb2, Shc і р85?,
регуляторною субодиницею РІ-3-кінази. З’ясовано, що ці ж зміни
визначають і направленість дії позаклітинних регуляторних сполук на
рівень р21Ras-залежного і РІ-3-кіназного сигналювання.

Вперше показано, що регуляторна субодиниця РІ-3-кінази, білок р85?, та
ендонуклеаза(и) є зв’язувальними партнерами адаптерного білка Ruk,
ідентифіковано домени і мотиви, залучені до міжмолекулярної взаємодії,
проаналізовано роль внутрішньомолекулярних взаємодій в регулюванні
біологічної активності Ruk. Встановлено зниження експресії ортолога Ruk
у людини, білка CIN85, у зразках світлоклітинної карциноми нирки людини
(у 12 випадках з 20 досліджених) порівняно з умовно нормальними
зразками.

Обґрунтовано та експериментально доведено критичну роль стехіометрії
адаптерних білків в надмолекулярних сигнальних комплексах в регуляції
біологічної активності їхніх ефекторних мішеней, специфічності та
інтенсивності сигналювання. Розроблено концепцію про системний характер
осциляцій сигнальних процесів в нормальних і пухлинних клітинах вищих
евкаріот, які визначають просторово-часову скерованість регуляторного
впливу позаклітинних сигнальних сполук. Отримані результати є важливим
вкладом у розвиток теорії мережевої організації сигнальних процесів і
мають загальнобіологічне значення.

Практичне значення одержаних результатів. З’ясування природи та
механізмів міжмолекулярної взаємодії, критичної ролі стехіометрії
адаптерних/риштувальних білків в надмолекулярних сигнальних комплексах у
забезпеченні інтенсивності і специфічності сигналювання, виявлення
зниження експресії Ruk/CIN85 в світлоклітинних карциномах нирки людини
закладає теоретичні основи створення фармакологічних препаратів нового
покоління, мішенями для яких стануть ключові центри організації
сигнальних мереж клітин, адаптерні і риштувальні білки. Зокрема,
розробка препаратів, здатних інгібувати взаємодію Grb2-Shc в клітинах
хронічної мієлоїдної лейкемії може стати одним із перспективних методів
лікування даного захворювання.

Очищені препарати рекомбінантних форм адаптерного білка Ruk використано
для отримання поліклональних та моноклональних антитіл, які можуть стати
основою для розробки специфічних діагностикумів та подальшого
дослідження біологічної ролі Ruk у контролі сигнальних мереж клітин.
Результати дисертаційної роботи рекомендуються для використання в
загальному курсі „Молекулярна біологія клітини” та спецкурсі „Клітинне
сигналювання” для студентів університетів зі спеціальностей „біохімія”
та „молекулярна біологія”.

Особистий внесок здобувача. Вcі результати отримані здобувачем особисто
або за безпосередньої участі. Дисертаційна робота – завершене
дослідження, виконане автором відповідно до програм експериментальних
досліджень, спланованих, проведених і узагальнених протягом 1986-2005
рр. Дисертантом особисто обґрунтовано концепцію роботи, розроблено
методологію експериментальних досліджень, зроблено пошук та аналіз даних
літератури, запропоновано робочі гіпотези, підготовлено до друку
публікації. Основні положення і висновки дисертаційної роботи,
сформульовані автором, обговорено разом із науковим консультантом –
чл.-кор. НАН України Сибірним А.А. Робота проводилась в рамках
держбюджетних та конкурсних тематик, які виконувались у відділі
сигнальних механізмів клітини Інституту біології клітини НАН України.
Окремі фрагменти дocліджeнь були виконані на базі Людвігівського
інституту ракових досліджень (Лондон, Велика Британія), Единбурзького
університету (Велика Британія), Онкологічного центру М.
Склодовської-Кюрі (Глівіце, Польша) та Інституту експериментальної
біології ім. Ненцького (Варшава, Польша) під час наукових стажувань. У
виконанні експериментів, описаних в розділі 3.1, брали участь
співробітники відділу сигнальних механізмів клітини Ю.Р. Кошельник та
В.С. Юрженко; розділі 3.2 – О.М. Ільницька, З.М. Гусак та Н.І.
Ігуменцева; розділі 3.3 – к.б.н. Ю.Я. Кіт, к.б.н. Бобак Я.П., к.б.н.
Маєвська О.М., В.Р. Дрель та Г.Ю. Шуваєва. Ідентифікацію доменів і
мотивів, залучених до взаємодії між адаптерним білком Ruk і р85?
регуляторною субодиницею РІ-3-кінази, здійснено у співробітництві з І.Т.
Гутом та В.Л. Бухманом (Велика Британія). Співучасть співробітників
відділу сигнальних механізмів клітини Інституту біології клітини НАН
України у виконанні роботи відмічена у спільних публікаціях.

Апробація результатів досліджень. Основні положення роботи доповідались
і були представлені на вітчизняних та міжнародних конференціях і
симпозіумах, зокрема: VП Всесоюзній нараді по ембріології (Ленінград,
1986), V Українському біохімічному з’їзді (Івано-Франківськ, 1987), ІV
Всесоюзному з’їзді ендокринологів (Львів, 1987), Всесоюзній конференції
„Механизмы действия медиаторов и гормонов на эффекторные клетки”
(Суздаль, 1988), Міжнародному симпозіумі по молекулярній і клітинній
онкобіології (Таллін, 1988), Всесоюзній нараді „Актуальные вопросы
клеточной биологии: факторы роста, дифференцировки, злокачественной
трансформации” (Ленінград, 1989), Міжнародному симпозіумі по
молекулярній і клітинній онкобіології (Львів, 1990), Радянсько-Фінському
симпозіумі “Signal molecules and cell differentiation” (Суздаль, 1991),
VІ Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1992), 12-му Міжнародному
конгресі „International Society of Developmental Biologists” (Відень,
1993), 6-ій Весняній конфренції IMP “Interfaces between Cancer and
Development” (Відень, Австрія, 1995), Конгресі Європейської організації
з біології розвитку (Тулуза, Франція, 1995), VП Українському
біохімічному з’їзді (Київ, 1997), ХХХV з’їзді Польського біохімічного
товариства (Олштин, Польша, 1999), 3-ій, 4-ій і 5-ій Парнасівських
конференціях (Львів, 2000; Вроцлав, Польша, 2002; Київ, 2005), VШ
Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002), Міжнародній
конференції “Interactions in macromolecular assemblies” (Друскіненкай,
Литва 1993), Всеукраїнській науково-практичній конференції „Біохімія”
(Дніпропетровськ, 2003), Наукових конференціях в Глівіце “Gliwickie
Spotkania Naukowe” (Глівіце, Польша, 2002, 2003), 29-ому Конгресі FEBS
(Варшава, Польша, 2004), Установчому з’їзді Українського товариства
клітинної біології (Львів, 2005), 30-ому Конгресі FEBS (Будапешт,
Угорщина, 2005).

Публікації. Зa тeмoю диcepтaції oпyблікoвaнo 57 poбіт, з яких 27 cтaтей
y провідних фахових виданнях, 30 — тeзи дoпoвідeй у матеріалах
міжнapoдниx та вітчизняних нayкoвиx конференцій, з’їздів, конгресів.

Cтруктура та обсяг дисертації. Дисертація містить тaкі poзділи: вcтyп,
аналітичний oгляд літepaтypи, мaтepіaли тa мeтoди дocліджeнь, peзyльтaти
власних дocліджeнь, аналіз та узагальнення peзyльтaтів дocліджeнь,
виcнoвки тa cпиcoк викopиcтaниx джepeл. Диcepтaцію виклaдeнo нa 357
cтopінках мaшинoпиcнoгo тeкcтy і пpoілюcтpoвaнo 110 pиcyнками тa 4
тaблицями. Спиcoк використаних джерел oxoплює 465 нaймeнyвaнь.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури детально висвітлено сучасний стан
проблеми організації і функціонування сигнальних мереж клітини.
Приведено дані стосовно доменної організації сигнальних білків та
проаналізовано роль міжмолекулярних взаємодій у перетворенні та
внутрішньоклітинному проведенні регуляторних сигналів. Особливу увагу
приділено аналізу сигнальних мереж, опосередкованих онкобілком Bcr-Abl
та SH3-вмісним адаптерним білком Ruk.

Матеріали та методи досліджень. У дисертаційній роботі викopиcтано такі
ізотопи: H332PO4 (4625 Kі/мoль), мeтил-[3H]-тимідин (4250 Kі/мoль),
Na125І без носія (15,7 Kі/мг), [?-32P]ATP (1000 Kі/мoль), [?-32P]GTP (15
Ki/ммоль), («Iзoтoп», Pocія); [?-32P]GTP (20 Кi/ммоль), [32P]NAD+ (10
Кі/ммоль), (“Amersham”, Англія), [?-32P]ATP (4500 Кi/моль), (“NEN”,
Бельгія).

Використано такі плазмідні вектори, сконструйовані для експресії в
клітинах бактерій і ссавців: pGEX-2T/Grb2(full), pGEX-2T/Grb2-N-SH3,
pGEX-2T/Grb2-C-SH3, pGEX-2T/p85?(full), pGEX-2T/p85?-SH3,
pGEX-2T/Ruk-SH3A, pGEX-2T/Ruk-SH3B, pGEX-2T/Ruk-SH3C, pGEX-2T/Ruk-3SH3
(вказані вектори були надані проф. І. Гутом (UCL, Велика Британія);
pGEX-4T/Ruks, pRc/CMV2, pRc/CMV2/Rukl, pRc/CMV2/Rukm, pRc/CMV2/Rukh,
pCMV5/Rukl-Flag-tag, pCMV5/Rukm-Flag-tag, pCMV5/Rukh-Flag-tag,
pCMV5/?Pro-Ruk-Flag-tag, pCMV5/?SH3-Ruk-Flag-tag (вказані вектори були
надані проф. В. Бухманом (Кардіфський університет, Велика Британія);
pBlueBac4 (”Invitrogen”, США). Рекомбінантні бакуловіруси, що
експресували р85? та р110? субодиниці РІ-3-кінази були надані для роботи
проф. М. Вотерфілдом (Людвігівський інститут ракових досліджень,
Лондонське відділення, Велика Британія).

Інсулін горбуші був наданий к.б.н. Ю.І. Русаковим (Інститут еволюційної
фізіології і біохімії ім. І.М. Сєченова РАН), EGF із слинних залоз мишей
– к.б.н. Ю.Д. Іващенко (Інститут експериментальної патології, онкології
і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України), аглютинін з пpopocтків
пшeниці (WGA), N-aцeтил-глюкoзaмін і гемоціанін мечехвоста – д.б.н.
Лyцикoм M.Д. (Інститут біології клітини НАН України), холерний,
кашлючний і ботулінічний токсини – к.б.н. М. Панченко (Російський
кардіологічний науковий центр, Москва). Праймери для субклонування
Glu-tag ізоформ кДНК Ruk були надані І. Гутом. [32Р]-мічені 32-mer та
24-mer олігодезоксинуклеотиди (ОДН) та 150-mer ОДН гену 5S рРНК
Litechinus variagatus були надані д-ром Й. Ржешовська-Вольни
(Онкологічний центр ім. М. Склодовської-Кюрі, Глівіце, Польща).
Поліклональні анти-p21Ras антитіла були надані к.б.н. Н. Мазуренко
(Російський онкологічний науковий центр, Москва), анти-Glu-tag антитіла
– д-ром Л. Стефенсом (AFRC Інститут Бабрагама, Кембрідж, Велика
Британія), а моноклональні анти-Ras антитіла клону Y13-259,
моноклональні анти-р85? та поліклональні анти-Ruk антитіла проти
17-членного С-кінцевого пептиду Ruk – проф. І. Гутом .

У роботі також використано моноклональні анти-Erk антитіла (“Zymed
Laboratories, Inc.”), поліклональні анти-с-Cbl, -Shc, -Abl антитіла
(“Santa Cruz Biotechnology”, США); моноклональні анти-pTyr антитіла
клону 4G10, кон’юговані з пероксидазою хрону (“Upstate Biotechnology
Inc.”, США), клону RC20 (Transduction Laboratories”, США) та клону pY20
(“Santa Cruz Biotechnology”); анти-Flag антитіла (“Sigma”, США), кролячі
антитіла проти IgG щура, анти-мишачі та анти-кролячі IgG, кон’юговані з
пероксидазою хрону (“Promega”, США), анти-кролячі IgG, кон’юговані з
FITC (“Pierce”, США); розчини для ЕCL детекції (“Amersham”, Велика
Британія) та набори реактивів для виділення плазмідної ДНК “NucleoSpin
System” (“NT”, Велика Британія) і “Qiagen plasmid Kit” (“Qiagen”,
Німеччина); набір реактивів для ПЛР (“Fermentas”, Литва); набір
реактивів для елюції фрагментів ДНК з агарозного гелю “QIAquick gel
extraction kit” (“Qiagen”); набір реактивів для лігазної реакції “Takara
ligase kit” (“Takara”, Японія); набори реактивів для рестриктазних
реакцій (“Fermentas”); набір для отримання рекомбінантних бакуловірусів
“Bac-N-BlueTM” (“Invitrogen”, США); реагент для трансфекції клітин комах
“InsectinPlusTM” (“Invitrogen”); ДНК із сім’яників сперми лосося та ДНК
Е. coli (“Sigma”).

Поліклональні анти-фосфотирозинові антитіла та антитіла до найменшої
ізоформи Ruk, білка Ruks, що включає спільну для всіх ізоформ С-кінцеву
суперспіралізовану ділянку, отримували шляхом імунізації кролів
антигенами KLH-фосфотирозин і GST-Ruks, відповідно, з наступним афінним
очищенням. Гібридому, що продукує моноклональні антитіла до SH3A домену
Ruk, отримано в результаті соматичної гібридизації спленоцитів мишей,
імунізованих GST-3SH3 фрагментом Ruk, з клітинами мієломи миші SP1.

В експериментах було використано зародки в’юна, які отримували з
заплідненої ікри за методикою Коcтомарової (1964), та постійні лінії
клітин К562 (хронічного мієлолейкозу людини), НЕК293 (ембріональної
нирки людини), U937 (гістоцитарної лімфоми людини), NIH3T3 (фібробласти
миші), Cos1 (фібробласти нирки зеленої африканської мавпи), L1210
(лейкемії миші), Ramоs (В-лімфоми людини), HELA S3 (аденокарциноми матки
людини), MDCK (епітеліальні клітини Мадін-Дарбі нирки собаки), C6
(гліоми щура), A549 (аденокарциноми легень людини), С2С12 (міобласти
миші) і SF9 (комах Spodoptera frugiperda). Клітини постійних ліній
вирощували в середовищах DMEM або RPMI 1640 (“Sigma”, США) за
присутності 10% ембріональної сироватки теляти (FBS) (“GibcoBRL”, Велика
Британія), 2 мМ L-глутаміну, 50 МО/мл пеніциліну, 50 мкг/мл
стрептоміцину (“GibcoBRL”) в зволоженій атмосфері з 5% СО2 при 370, а
клітини SF9 – в середовищі IPL-41 (“GibcoBRL”) з додаванням 10% FBS,
їстолату, концентрату ліпідів та гентаміцину (“GibcoBRL”) при 270С.
Трансформовані бактерії E. coli штаму XL-1 Blue (“Stratagene”, США)
вирощували в середовищі Luria – Bertani (LB) з ампіциліном (0,05 мг/мл),
а бактерії штаму BL-21 (“Stratagene”, США) з екстраплазмідою
резистентності до хлорамфеніколу – в середовищі LB з додаванням
хлорамфеніколу та ампіциліну (0,02 і 0,05 мг/мл, відповідно) на шейкері
при 370С. В дослідженнях використано клінічний матеріал після
хірургічного видалення нирки з пухлинним ростом, який отримували в
рамках співпраці з кафедрою урології Львівського національного медичного
університету ім. Данила Галицького. Проаналізовано післяопераційний
матеріал 20 хворих на рак нирки. За клінічними та гістологчними ознаками
пухлини були верифіковані як світлоклітинний рак ІІ-ої та ІІІ-ої стадій.
Визначення стадій проводили за класифікацією TNM (1997).

Блаcтодерми, ізольовані клітини та фракції плазматичних мембран виділяли
згідно методик Луцика та cпівр. (1983, 1986). Концентрацію білка
визначали за методом Петерсона (Peterson, 1977). Аналіз включення
міченого [3Н]-тимідину в ДНК клітин бластодерм проводили, як описано в
роботі (Юрженко і ін., 1993). Зв’язування [125І]-інcуліну та [125І]-EGF
клітинами бластодерм в’юна аналізували згідно рекомендацій (Jackobs,
1979). Ковалентне зв’язування [125I]-інcуліну та [125І]-EGF білками
плазматичних мембран зародкових клітин при допомозі
диcукцинімідилcуберату здійснювали за модифікованою методикою Пілча та
cпівр. (Pilch et al., 1979). Чаcткову очиcтку рецепторів інcуліну та EGF
проводили афінною хроматографією на WGA-cефарозі за умов, які були
запропоновані Вертбладом та cпівр. (Vertblad et al., 1977). Вивчення
автофоcфорилювання рецепторів інcуліну і EGF проводили з використанням
препарату глікопротеїнів, отриманого афінною хроматографією на
WGA-cефарозі (Drobot et al., 1994). Включення 32P в поліфосфоінозитиди
плазматичних мембран та їх аналіз здійснювали, як описано в роботі
(Дробот і ін., 1991). GTP-зв’язувальні білки на нітроцелюлозних блотах
ідентифікували за допомогою [?-32P]GTP, ADP-рибозилтранcферазну реакцію
проводили за присутності кашлючного, холерного та ботулінового токсинів
(Drobot et al., 1995). Часткову очистку S6 кінази з бластодерм в’юна
здійснювали ступінчатою хроматографією на DEAE-целюлозі та
гель-проникаючою хроматографією на сефадексі G-150. S6-кіназну реакцію
проводили, використовуючи як субстрат 40S субодиниці рибосом із печінки
щура. Рибосомні білки розділяли двовимірним електрофорезом в ПААГ згідно
з протоколом (Kalshmidt & Wittman, 1970). Клітинні білки розділяли
електрофорезом у градієнтному (5-17%) ПААГ за присутності SDS в буферній
системі Леммлі (Laemmli, 1970). Імуноблотинг білків здійснювали після їх
електропереносу з ПААГ на нітроцелюлозну або полівінілдифторидну
мембрани згідно з рекомендаціями (Towbin, 1979). Імунорективні смуги
білків на блотах виявляли за допомогою набору для підсиленої
хемілюмінесценції (ECL).

Інтенсивність росту культури клітин К562 оцінювали, підраховуючи
кількість клітин в камері Горяєва. Кількість мертвих клітин визначали
після їх зафарбовування трипановим синім. Ступінь еритроїдної
диференціації клітин К562, індукованих гербіміцином А (4·10-8 M)
(“Sigma”) визначали за накопиченням гемоглобіну, підраховуючи %
бензидин-позитивних клітин (Rowley et al., 1981). Мегакаріоцитну
диференціацію індукували РМА (1,6·10-8 М). Апоптоз клітин лінії U937
індукували TNF-? (“Sigma”) в концентрації 10 нг/мл. Ступінь еритроїдної
та мегакаріоцитної диференціації, наявність цитоархітектурних
характеристик апоптозу оцінювали також за цитоморфологією клітин К562 і
U937 після зафарбовування за методом Романовського-Гімзи (Лилли, 1969).
Виділення та електрофоретичний аналіз клітинної ДНК проводили за методом
(Herrmann, 1994). Співвідношення GTP/GDP в анти-Ras імунопреципітатах
аналізували згідно з методиками, описаними в роботах (Karnitz et al.,
1995; Satoh et al., 1990), з нашими модифікаціями (Drobot et al., 2005).
Лізис клітин проводили як описано в роботі (Domin et al., 1996). Для
імунопреципітації лізати клітин, стандартизовані за вмістом білка
(1.3-1.5 мг), інкубували при постійному перемішуванні протягом 2 год при
40С з відповідними антитілами. Імунні комплекси осаджували за допомогою
білок G-сефарози (“Pharmacia”, Швеція)/білок А-сефарози (“Pharmacia”)
протягом 1 год при 40С з наступним імуноблотингом. Детекцію сигнальних
білків на блотах здійснювали, використовуючи специфічні антитіла.
Реакцію фосфорилювання Bcr-Abl in vitro проводили в анти-с-Abl
імунопреципітатах лізатів клітин за присутності [?-32P]ATP. Мічені білки
розділяли в SDS-ПААГ з наступною авторадіографією електрофореграм.
Ступінь фосфорилювання Bcr-Abl in vivo оцінювали як описано в роботі
(Ільницька і ін., 2003). Ліпідкіназну активність РІ-3-кінази аналізували
в анти-р85? імунопреципітатах лізатів клітин К562 (Kilgour et al.,
1996).

Білково-білкові взаємодії аналізували in vitro з використанням афінно
очищених рекомбінантних GST-кон’югованих форм адаптерних білків: Grb2
(повнорозмірної форми та фрагментів, що відповідають N- та С-кінцевим
SH3 доменам), регуляторної р85? субодиниці РІ-3-кінази (повнорозмірної
форми та фрагменту, що відповідає SH3 домену), Ruk (А-, В-, С-SH3
доменів та фрагменту, що відповідає 3SH3 доменам). Білки клітинних
лізатів, преципітовані за допомогою глутатіон-сефарози, розділяли в
SDS-ПААГ з наступним імуноблотингом. Денситометричний аналіз результатів
імуноблотингу здійснювали з використанням пакетів програм “Image Tool”
та “GelPro”.

кДНК Rukl, що містила на С-кінці епітоп Glu-tag, отримували полімеразною
ланцюговою реакцією (ПЛР). Отриману кДНК субклонували в pBlueBac4
“transfer” вектор за центрами пізнавання ендонуклеазами рестрикції BamH1
і EcoR1. Ізолювання рекомбінантних бакуловірусів і інфікування клітин
комах Spodoptera frugiperda лінії SF9 здійснювали згідно з
рекомендаціями фірми-виробника (“Invitrogen”, США). Для субклонування
Glu-tagged l, m, і h ізоформ адаптерного білка Ruk у вектори для
експресії в клітинах ссавців як матриці були використані вектори
pRc/Rukl, pRc/Rukm та pRc/Rukh. Нуклеотидну послідовність, яка кодувала
С-кінцевий фрагмент білків, модифікували за допомогою ПЛР. Сенсовий
праймер для l і m ізоформ включав послідовність навколо ApaI центру, а
для H форми – центр пізнавання для ендонуклеази рестрикції BamH1 і
5’-кінцеву послідовність. Антисенсовий праймер для всіх трьох ізоформ
включав послідовності для ендонуклеаз рестрикції EcoRI і ApaI,
стоп-кодону, Glu-tag епітопу та 3’-кінцевого фрагменту відповідних кДНК.
Продукт ПЛР для h ізоформи білка Ruk субклонували у вектор pcDNA3.1 за
центрами пізнавання ендонуклеазами рестрикції BamH1 і EcoR1. Плазмідну
ДНК ізолювали з трансформованих клітин E. coli штаму XL1 Blue. Тимчасову
трансфекцію клітин НЕК293 здійснювали за допомогою фосфату кальцію
(Webster, 1999).

Glu-tagged форми білка Ruk, експресовані в бакуловірусній системі та в
клітинах ссавців, очищали афінною хроматографією на білок G-сефарозі,
ковалентно кон’югованій з моноклональними анти-Glu-tag антитілами за
допомогою диметилпімелімідату (“Sigma”).

Механізми взаємодії між білком Ruk та регуляторною р85? субодиницею
РІ-3-кінази вивчали in vivo в бакуловірусній системі експресії. Вплив
адаптерного білка Ruk на РІ-3-кіназну активність вивчали in vitro з
використанням очищених препаратів рекомбінантних білків. Для аналізу
субклітинної локалізації білка Ruk клітини імунофлуоресцентно
забарвлювали згідно рекомендацій (Pyrzynska et al., 2002) з
використанням перших поліклональних анти-Ruks антитіл та других
FITC-кон’югованих анти-кролячих антитіл. Актиновий цитоскелет специфічно
забарвлювали TRITC фаллоїдином або Alexa Fluor 546 фаллоїдином (Sabala
et al., 2002). Контрастування ядерного хроматину клітин здійснювали
шляхом забарвлення DAPI (Li and Benezra, 1996). Конфокальну мікроскопію
отриманих препаратів проводили за допомогою конфокального мікроскопа TCS
SP2 під управлінням програмного забезпечення Leica Confocal Software
2.0. Сканування здійснювали при довжинах хвилі збудження 494 нм для FITC
(аргон-іонний лазер), 543 нм для TRITC фаллоїдину (гелій-неон-іонний
лазер) та 368 нм для DAPI (аргон-іонний лазер).

ДНК-зв’язувальні білки в афінно очищених препаратах Glu-tagged ізоформ
білка Ruk детектували методом затримки в гелі [Protic et al., 1993]. Для
дослідження ДНК-гідролізуючої активності препаратів рекомбінантних
білків як субстрати використовували 32Р-мічені
олігодезоксирибонуклеотиди та плазмідну ДНК. Для передбачення можливих
партнерів, залучених до білково-білкової взаємодії з Ruk, специфічних
послідовностей та характеристик досліджуваного білка, його субклітинної
локалізації були використані програми: GenRaner 3.00; PredictProtein (
HYPERLINK
«http://cubic.bioc.columbia.edu/predictprotein/submit_def.html»
http://cubic.bioc.columbia.edu/predictprotein/submit_def.html ); PSORT
II ( HYPERLINK «http://bioweb.pasteur.fr/» http://bioweb.pasteur.fr/
seqanal/interfaces/psort2.html).

Тотальну РНК із зразків умовно нормальних і пухлинних тканин нирки
людини виділяли гуанідинтіоціанатним методом (Маниатис и др., 1984). Для
Нозерн-гібридизації використовували 32Р-мічений зонд клону 3Е7 кДНК гену
ruk (Gout et al., 2000). Рівень експресії ізоформ Ruk/CIN85 на рівні
білка вивчали в Тритон Х-100-розчинних екстрактах відповідних зразків
методом імуноблотингу. Імуногістохімічні дослідження зразків нирки
проводили на парафінових зрізах за схемою непрямого методу виявлення
антигенів із застосуванням авідин-біотинової системи та пероксидази як
ферментної мітки згідно зі стандартними протоколами. Отримані препарати
аналізували під мікроскопом Axioplan (Zeiss, Німеччина) із застосуванням
імерсійного об’єктиву (х100).

Всі експерименти проводили 3-5 разів. В роботі наведено середні значення
величин і стандартні похибки (М±m). Статистичний аналіз проводили,
користуючись критерієм Ст’юдента (t); вірогідними вважали дані у разі
р<0,05. Побудову графіків та статистичну обробку даних здійснювали за допомогою програм Origin 4.0 та Excel 97. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ Закономірності функціонування сигнальних мереж, залучених до регуляції проліферації і диференціації клітин зародків в’юна (Misgurnus fossilis L.). Однією з експериментальних моделей для вивчення сигнальних мереж, залучених до регуляції проліферації клітин і координованих змін активності генів протягом диференціації, є ембріони тварин, що розвиваються. Зародкові клітини, особливо на ранніх стадіях розвитку володіють мультипотентними властивостями і здатні як диференціюватися в певному напрямку залежно від індуктивного оточення, так і давати початок ембріональним карциномам (Piersma et al., 1989; Smith, 1987; Mummery et al., 1991). Наявні дані дозволяють вважати, що поліпептидні фактори росту (ПФР), які синтезуються ембріональними клітинами, та зміна чутливості до сигнальних сполук у процесі розвитку відіграють провідну роль у підтриманні тонкого балансу між інтенсивністю проліферації, скерованістю клітинної диференціації та програмованою клітинною смертю. Ключовим моментом на шляхах реалізації регуляторних ефектів ПФР в клітинах-мішенях є їхня взаємодія зі специфічними рецепторами клітинної поверхні. Хоча до початку наших робіт в зародках різних видів тварин на ранніх етапах розвитку були виявлені інсулін і IGF типів І і ІІ, речовини з активністю TGF?- і ?-типів, FGF (Heath & Smith, 1989; Кусень і ін., 1983), дані про кінетичні параметри ліганд-рецепторної взаємодії та молекулярну природу рецепторів ПФР, які експресуються в клітинах зародків на стадії пізньої бластули-ранньої гаструли, в літературі були відсутні. Не були також вивчені і охарактеризовані сигнальні процеси, які опосередковують ефекти ПФР на проліферацію і диференціацію та їхня динаміка. Роботу здійснювали на ізольованих клітинах зародків костистої риби в’юна, отриманих на стадії ранньої гаструли (10-12 год розвитку) (Костомарова, 1975). Нами виявлено, що ембріональні клітини специфічно та оборотно зв’язують [125I]інсулін та [125I]ЕGF. При 19?С рівновага між вільними та зв’язаними з клітинами радіолігандами досягалась до 2-ої год інкубації. При цьому рівень зв’язування прямо пропорційно залежав від кількості клітин в інкубаційному середовищі в діапазоні від 2 до 20 х 106 клітин/мл. Як видно з рис. 1, а, б, насичення центрів зв’язування інсуліну та ЕGF на поверхні клітин зародків в’юна спостерігається при концентрації лігандів в інкубаційному середовищі вище 40 та 12 нМ, відповідно. Під час оцінки параметрів інсулін-рецепторної взаємодії ми виходили з моделі, яка передбачає наявність двох класів рецепторів (Гребенщиков и Мошковский, 1986): І – з високою спорідненістю і низькою зв’язувальною ємністю; ІІ – з низькою спорідненістю і високою зв’язувальною ємністю. При цьому константи дисоціації (Kd) для двох класів існулінзв’язувальних центрів становлять 7,3 х 10-11 та 9,9 х 10-9 М з кількістю рецепторів на клітину 115 ? 12 та 4640 ? 370 (рис. 1, а). За даними аналізу Скетчарда рецептори ЕGF представлені одним класом з Kd 0,72 х 10-9 М та кількістю 5460 ? 105 рецепторів на клітину (рис. 1, б). Афінне мічення білків плазматичних мембран клітин зародків в’юна [125I]міченими лігандами показало, що інсулін зв’язується з білками з молекулярною масою 125 та 115 кДа, які відповідають ?-субодиниці рецептора інсуліну, а ЕGF – з білком з молекулярною масою 180 кДа. Ця взаємодія є специфічною, оскільки усувається за присутності надлишку немічених лігандів (рис. 1, в, г). Цікаво, що в плазматичних мембранах печінки в’юна інсулін зв’язується переважно з білком з молекулярною масою 130 кДа. ?-субодиниця рецептора інсуліну та рецептор ЕGF є тирозинспецифічними протеїнкіназами, здатними до ліганд-стимульованого автофосфорилювання. У свою чергу, фосфорилювання внутрішньоклітинного каталітичного домену рецепторів по специфічних залишках тирозину супроводжується зростанням ферментативної активності по відношенню до екзогенних субстратів (Yarden & Ullrich, 1988). Цю властивість ми використали для виявлення функціональної активності досліджуваних алостеричних ферментів, тобто їх здатності до трансмембранного перетворення регуляторного сигналу. З рис. 1, д, е видно, що в препараті мембранних глікопротеїнів, очищених хроматографією на WGA-сефарозі, інсулін у залежний від дози спосіб стимулює фосфорилювання білка з молекулярною масою 97 кДа, що відповідає ?-субодиниці інсулінового рецептору, а ЕGF – білка з молекулярною масою 180 кДа. Слід відзначити також інсулінозалежне посилення фосфорилювання білків з молекулярною масою 60, 64 та 110 кДа, які очевидно є потенційними субстратами кінази рецептора інсуліну. Специфічні рецептори багатьох сигнальних сполук, зокрема ПФР, спряжені в мембрані з надзвичайно гетерогенною групою GTP-зв’язувальних білків (G-білків), що належать до надродини високоафінних GTPаз (Birnbaumer et al., 1990; Satoh et al., 1992) і виконують роль молекулярних „перемикачів” в процесі Рис. 1. Клітини ранніх зародків в’юна експресують функ-ціональні рецептори інсуліну і EGF: кінетика специфічного зв’язування [125I]-інсуліну (а) та [125I]-EGF (б) в коорди-натах Скетчарда; (в) кова-лентне мічення білків плазма-тичних мембран клітин зародків і печінки дорослих особин в’юна [125I]-інсуліном (1-4) та [125I]-EGF (5-6) за допомогою дисукцинімідилсуберату:1,2,5,6-плазматичні мембрани клітин зародків в’юна; 3,4-плазматичні мембрани печінки в’юна; 2,4,6- афінне мічення за присутності надлишку відповідних немічених лігандів; (г) вплив інсуліну і EGF на фосфорилювання білків плазматичних мембран клітин зародків в’юна, очищеному афінною хрома-тографією на WGA-сефарозі. К - контроль трансмембранного перетворення регуляторних сигналів (Bourne et al., 1991). Згідно з отриманими даними (Drobot et al., 1995), уявне значення Km для GTP плазматичних мембран зародкових клітин складає 6,7.10-7 М, що відповідає Km відомих спрягаючих білків. Ідентифіковано субстрат ADP-рибозилтрансферазної активності кашлючного токсина, білок з молекулярною масою 39 кДа, який відповідає G?0-субодиниці (Birnbaumer et al., 1990), та субстрати ботулінового екзоферменту С3, білки з молекулярною місою 26 і 28 кДа, які відносяться до підродини Rho/Rac SMG білків (Hall, 1990; Braun et al., 1989). Експресію вказаних SMG білків в ранньому ембріогенезі в’юна підтверджено методом GTP-блотингу, в той час як гомолог білка Ras був ідентифікований методом імуноблотингу (Drobot et al., 1995). Дані про високий рівень експресії ряду специфічних G- і SMG-білків в ранньому ембріогенезі в’юна узгоджуються з їхньою функціональною значимістю. Для з’ясування особливостей функціонування сигнальних мереж, з точки зору ефективності внутрішньоклітинного перетворення регуляторного сигналу, можна використати тестування ряду внутрішньоклітинних параметрів після взаємодії ПФР з клітиною-мішенню. За умов in vivo до цих параметрів відноситься в першу чергу індекс мічення клітин [3H]-тимідином. Включення [3H]-тимідину в ДНК зародкових клітин вивчали протягом 9-15 год розвитку. З графіка, представленого на рис. 2, а, видно, що рівень включення [3H]-тимідину в ДНК значно в ідрізняється на досліджуваних етапах ембріогенезу, а Рис. 2. Включення 3H-тимідину в ДНК зародків в’юна протягом 9-15 год розвитку: контрольні бластодерми (а); при дії інсуліну та EGF (б); залежність включення [3H]–тимідину в ДНК зародків в’юна від концентрації інсуліну на 10 год (в) та на 12 год (г) розвитку. динаміка цього процесу володіє коливальним характером. Найбільш високий рівень включення [3H]-тимідину спостерігається на 12 год розвитку, в той час як значне зниження індексу мічення – на 10 год розвитку. Виявлені зміни свідчать про стадієспецифічну регуляцію синтезу ДНК, а, отже, і мітотичну активність клітин в ранньому ембріогенезі. Зниження синтезу ДНК співпадає з двома основними морфогенетичними подіями, які відбуваються протягом гаструляції і на початку нейруляції – індукцією мезодерми (10 год розвитку) і нейроектодерми (13 год розвитку). Встановлено (рис. 2, б), що інсулін (10-6М) і EGF (10-9М) пригнічують включення міченого тимідину в ДНК на стадіях, що характеризуються відносно високою мітотичною активністю клітин зародків в’юна (85 і 70% від контролю, відповідно, на 12 год розвитку). В періоди з відносно низьким мітотичним індексом інсулін і EGF, навпаки, посилюють цей процес: 136%, 185% (при дії інсуліну) та 110%, 118% (при дії EGF) порівняно з контролем на 11 і 13 год розвитку, відповідно). Необхідно зазначити, що вплив інсуліну і EGF як на стимуляцію, так і пригнічення включення [3H]–тимідину в ДНК бластодерм виявився дозозалежним (рис. 2, в, г). Отримані експериментальні дані дозволили висунути гіпотезу про здатність ПФР як стимулювати проліферацію різних типів клітин, так і пригнічувати сигнальні процеси, залежні від цих регуляторних сполук, в стимульованих клітинах. Виявлені ріст-регулюючі ефекти досліджуваних ПФР свідчать, що вже на ранніх стадіях ембріогенезу експресуються всі сигнальні ланки, необхідні для спряження і переносу регуляторного сигналу в ядро, а інсуліно- і EGF-подібні речовини володіють функціональною значимістю в регуляторних процесах, які відбуваються на ранніх етапах розвитку костистої риби в’юна. Одним із основних способів перетворення та внутрішньоклітинного проведення регуляторних сигналів є каскадні процеси фосфорилювання-дефосфорилювання клітинних білків, які визначають ключові параметри функціонування сигнальних мереж. Для з’ясування конкретних механізмів, які забезпечують залучення фосфорильованих по тирозину білків у процеси росту і трансформації клітин, було отримано поліклональні афінно очищені pTyr-специфічні антитіла. Спектри pTyr-вмісних білків у бластодермах, а також їх зміни під впливом інсуліну вивчали в динаміці протягом 9-15 год розвитку. Результати імуноблотингу білків бластодерм (рис. 3, а, б) свідчать про високий рівень фосфорилювання по залишках Tyr клітинних білків з мол. масами 105, 90, 66, 34, 30, 24 і 18 кДа. Ступінь модифікації вказаних білків є стадієспецифічним. Так, найбільш високий рівень pTyr-специфічного фосфорилювання білків з мол. масами 105, 90, 66, 30 і 24 кДа спостерігається на 9, 11 і 12 год розвитку, а білка з мол. масою 18 кДа – на 10, 13, 14 і 15 год, зі значним зниженням в останні досліджувані періоди. Смуги з мол. масами 42 і 53 кДа є більш вираженими на 10 і 14 год ембріогенезу. Цікаво, що зниження рівня фосфорилювання по Tyr білків з мол. масами 105, 90, 66, 30 і 24 кДа корелює з індукцією мезодерми і нейроектодерми на 10 і 13 год розвитку, відповідно, в той час як ступінь модифікації білка р18 в ці періоди є більш високим. Рис. 3. Імуноблотинг pTyr-вмісних білків лізатів бластодерм в’юна, ізольованих на 9–15 год розвитку, з використанням поліклональних анти-pTyr антитіл. Як другі антитіла були використані 125І-мічені антитіла проти IgG кроля: контроль (а,б); за присутності 10-6 М інсуліну (в,г); динаміка фосфорилювання білків (б,г): по осі ординат – кількість білку, ум. од.; по осі абсцис – стадія розвитку, год. Показано (рис. 3, в, г), що обробка бластодерм інсуліном (10-6М) призводить до значного пригнічення Tyr-специфічного фосфорилювання і/або посилення дефосфорилювання р105, р90, р66, р30, і р24 протягом всього досліджуваного періоду розвитку. Як видно з рис. 3, в, г, регуляторний вплив фактора росту на модифікацію р18 залежить від ступеня його базального фосфорилювання: зниження фосфорилювання спостерігається на стадіях з більш високим рівнем експресії (11, 14 і 15 год розвитку) і, навпаки, посилення фосфорилювання – на стадіях з відносно низьким рівнем експресії. Виключенням є 15 год розвитку, протягом якої ступінь модифікації р18 під впливом інсуліну залишається без видимих змін. При обговоренні змін в спектрах pTyr-вмісних білків в бластодермах в’юна, оброблених інсуліном, особливу увагу привертає також факт посилення фосфорилювання білків з мол. масами 34 і 42 кДа. При цьому, найбільш виражений ефект спостерігається на 9, 11, 12 і 15 год розвитку. Однією з найбільш гнучких та універсальних систем генерації вторинних посередників, яка може прямо чи опосередковано бути задіяною до контролю організації і функціонування сигнальних мереж клітин, є інозитліпідна сигнальна система (Ullrich & Schlessinger, 1991). Дослідження метаболізму поліфосфоінозитидів (ПФІ) у плазматичних мембранах зародкових клітин продемонструвало, що вже на ранніх етапах розвитку в’юна експресуються основні сигнальні ензими, які каталізують їх синтез та розпад (Дробот і ін., 1991). Встановлено, що метаболічні ланки обміну ПФІ є чутливими до дії інсуліну і гуанілових нуклеотидів (Дробот і ін., 1991). Тому метою наступного етапу роботи було з’ясувати, чи реалізується регуляторний вплив інсуліну на активність РІ-кіназ за умов in vivo та дослідити їх динаміку в ранньому ембріогенезі. З рис. 4, а, б видно, що як динаміка активностей РІ-3- та РІ-4-кіназ протягом 9-13 год розвитку, так і скерованість регуляторного впливу інсуліну на рівень активностей досліджуваних ензимів близько корелюють з даними по включенню міченого тимідину в ДНК. Так, максимальна активність РІ-3- та РІ-4-кіназ виявляляється на 11 і 12 год розвитку, в той час як мінімальна активність – на 10 та 13 год розвитку. Максимальний стимулюючий ефект інсуліну вдалось зафіксувати на 10 год розвитку (на 31 та 19% порівняно з контролем для РІ-3- та РІ-4-кіназ, відповідно), а максимальне пригнічення – на 12 год розвитку (на 35 і 40% порівняно з контролем для РІ-3- та РІ-4-кіназ, відповідно). Як стимулюючий (10 год розвитку), так і інгібуючий (12 год розвитку) ефекти інсуліну на рівень активностей РІ-3- та РІ-4-кіназ виявились дозозалежними (рис. 4, в, г). Встановлено також, що в очищених препаратах плазматичних мембран інсулін, як і за умов in vivo, на 10 год розвитку стимулює активність РІ-3-кінази на 40% порівняно з контролем (рис. 4, д). За присутності GTP?S спостерігається зниження рівня активності ензиму до 82% від контрольних значень. Інкубація мембран одночасно з інсуліном та GTP?S супроводжується наступним зниженням рівня активності РІ-3-кінази до 68%. Це дозволяє припустити, що GTP?S може потенціювати вплив інсуліну на пригнічення активності ферменту. В той же час, перемикання сигнальних шляхів регуляції активності ліпідкінази зі стимуляції на пригнічення може пояснюватись утворенням за присутності GTP?S стабільної активної форми G-білка з високою афінністю до ефекторної ланки. Одночасно, на 10 год за присутності GTP?S спостерігається не тільки підвищення рівня активності РІ-4-кінази (125% порівняно з контролем), але і потенціювання стимулюючого ефекту інсуліну (115% та 185%, відповідно) (рис. 4, е). Потенціювання GTP?S регуляторного впливу інсуліну на активність РІ-3-кінази виявлено також на 12 год розвитку (рис. 4, є). При обробці плазматичних мембран інсуліном спостерігається зниження активності ензиму на 50%, в той час як за присутності інсуліну і GTP?S цей рівень падає до 36% порівняно з контролем (рис. 4, е). Змін в активності РІ-4-кінази під впливом інсуліну і GTP?S на 12 год розвитку виявити не вдалось. Рис. 4. Вплив інсуліну і GTP?S на активність РІ-3- і РІ-4-кіназ в ранньому ембріогенезі в’юна: динаміка активності РІ-3- і РІ-4-кіназ (а, б); залежність активностей РІ-3- і РІ-4-кіназ від концентрації інсуліну на 10 год (в) і 12 год (г) розвитку; вплив інсуліну (10-6М) і GTP?S (10 мкМ) на активность РІ-3-кінази на 10 год (д) і 12 год (е) розвитку та РІ-4-кінази – на 10 год (є) розвитку; 1. контроль; 2. інсулін; 3. GTP?S; 4. інсулін + GTP?S. Проведені дослідження дозволяють припустити існування складної сітки регуляторних взаємозв’язків рецептора інсуліну з інозитліпідною сигнальною системою в клітинах ранніх зародків в’юна і зробити наступні важливі висновки: 1) ферменти синтезу інозитвмісних ліпідів, РІ-3- та РІ-4-кінази, є важливими ланками сигнальних мереж, залучених до регуляції процесів проліферації і диференціації в ранньому ембріогенезі в’юна; 2) G-білки є залучені до стимулювання активності РІ-4-кінази і негативного регулювання РІ-3-кінази в бластодермах ранніх ембріонів в’юна; 3) особливості функціонального спряження рецепторних тирозинових протеїнкіназ з ефекторними білками-субстратами забезпечують скерованість дії регуляторних факторів і можуть виступати в ролі пускового механізму, який визначає кінцеву фізіологічну відповідь клітин. Активація трансляції є необхідною метаболічною подією відповіді клітин на мітогенні стимули, індуктори диференціації і апоптозу. Ще у 80-х роках було показано, що процес ініціації трансляції, як одна з основних регуляторних ланок білкового синтезу, регулюється фосфорилюванням-дефосфорилюванням ключових компонентів апарату трансляції (Duncan & McConkey, 1982; Traugh et al., 1983). Одним з цих компонентів є білок S6 40S субчастинки рибосом, фосфорилювання якого зростає у відповідь на дію позаклітинних сигналів (Trevillyan et al., 1984; Blenis & Erikson, 1984; Maller et al., 1985). Як субстрат для виявлення і наступної характеристики S6-кіназної активності в цитозолі зародків в’юна використано 40S субчастинки рибосом, в яких білок S6 знаходиться в нативному оточенні. Виявлено, що в цитозолі бластодерм в’юна S6-кіназна активність є достатньо високою і складає 0,33 пмоль Рн · хв-1 · мг-1 (рис. 5, а). Обробка зародків протягом 30 хв EGF в концентрації 10 нг/мл супроводжується підвищенням S6-кіназної активності цитозолю на 25%. Рис. 5. В клітинах ранніх зародків в’юна експресується S6-кіназа, чутлива до дії EGF: (а) електрофоретичне розділення в SDS-ПААГ продуктів реакції фосфорилювання 40S субчастинок рибосом із печінки щура цитозолем зародків в’юна: 1 – цитозоль контрольних бластодерм; 2 – цитозоль бластодерм, оброблених EGF; 3 – цитозоль контрольних бластодерм + 40S рибосоми; 4 – цитозоль бластодерм, оброблених EGF + 40S рибосоми; (б) двовимірний електрофорез рибосомних білків: 1. протеїнограма; 2. аналіз S6-кіназної активності цитозолю контрольних бластодерм; 3. аналіз S6-кіназної активності цитозолю бластодерм, стимульованих EGF в концентрації 20 нг/мл протягом 30 хв. 0, 1, 2, 3, 4-5 – форми білка S6 різного ступеня модифікації. Відомо, що S6-кінази з різних джерел, які стимулюються мітогенами, фосфорилюють білок S6 по 5 центрах як за умов in vivo (Thomas et al., 1982; Oliver et al., 1988), так і in vitro (Matsuda et al., 1989). Для з’ясування залежності між рівнем стимуляції S6-кіназної активності EGF в бластодермах за умов in vivo і характером модифікації білка S6 ми провели розділення білків 40S субчастинок рибосом після кіназної реакції методом двовимірного електрофорезу, який дозволяє виявляти форми білка S6 різного ступеня модифікації. З рис. 5, б видно, що S6-кіназа/кінази з контрольних і оброблених EGF (20 нг/мл, 30 хв) бластодерм каталізує включення 4-5 залишків фосфату в екзогенний білок S6. При цьому, ефект стимулюючого агента знаходить відображення не в зміні специфічності модифікації субстрату по різних центрах, а лише в кількісному вираженні ферментативної активності. З метою з’ясування ролі S6-кінази, що стимулюється EGF, в регуляції сигнальних мереж клітин ранніх зародків в’юна нами було отримано частково очищений препарат досліджуваного ферменту. На першому етапі очистку S6-кінази проводили іонообмінною хроматографією на DEAE-целюлозі в градієнті концентрації NaCI (рис. 6, а, в). Згідно з отриманими даними в цитозолі зародків в’юна після хроматографічного розділення виявляються 3 фракції, що мають здатність фосфорилювати білок S6. Ці фракції елююються послідовно 10 мкМ сАМР в стартовому буфері (фракція 1), 0,12-0,18 M NaCI (фракція 2) і 0,25-0,30 M NaCI (фракція 3). Після обробки бластодерм зародків в’юна EGF в концентрації 20 нг/мл протягом 30 хв S6-кіназна активність фракції 1 зменшується в 2 рази, фракції 2 зростає в 4 рази і практично не змінюється у фракції 3. На наступному етапі очистки з метою визначення молекулярної маси S6-кінази, що стимулюється EGF, нами було здійснено гель-проникаючу хроматографію на сефадексі G-150 фракції 2 (рис. 6, б, в). Згідно з профілем елюції уявна молекулярна маса досліджуваного ензиму складає біля 70 кДа, що узгоджується з даними літератури. Рис. 6. Часткова очистка та харак-теристика властивостей кінази рибосомного білка S6: а) хрома-тографія на DEAE-целюлозі білків цитозолю зародків в’юна (колонка 1х2 см; на колонку наносили 5-7 мг білка цитозолю; стартовий буфер містив 20 мМ трис- НСІ, рН 7,0, 5 мМ MgCI2, 2 мМ EGTA, 2 мМ DTT, 25 мМ NaCI). 1 - концентрація білка за поглинанням при 280 нм; 2 - S6-кіназна активність; (б) гель-проникаюча хроматографія на сефадексі G-150 фракції 2 після іонообмінної хроматографії на DEAE-целюлозі (колонка 0,5 х 100 см; стартовий буфер містив 20 мМ ?-гліцерофосфату). 1 - концентрація білка; 2 - S6-кіназна активність. Як стандарти були використані алкогольдегідрогеназа (150 кДа), BSA (67 кДа), овальбумін (45 кДа), а також мономер Con A (25 кДа); (в) аналіз S6-кіназної активності в цитозолі зародків в’юна, а також у фракціях, зібраних після іонообмінної та гель-проникаючої хроматографії. 1, 2 – S6-кіназна активність цитозолю зародків в’юна; 3, 4 – S6-кіназна активність фракції 2 після DEAE-хроматографії; 5, 6 – S6-кіназна активність у фракції, зібраній після хроматографії на сефадексі G-150; 1, 3, 5 – за відсутності 40S субчастинок рибосом; 2, 4, 6 – за присутності 40S субчастинок рибосом; (г, д) динаміка S6-кіназної активності фракції 2 після DEAE-хроматографії протягом 9-13 год розвитку. Встановлено, що як і у випадку вивчення інших сигнальних процесів в клітинах зародків в’юна (Tyr-специфічне фосфорилювання, активність РІ-3- і РІ-4-кіназ), S6-кіназна активність осцилює протягом досліджуваного періоду розвитку, в той час як фазові зміни активності під впливом EGF володіють антибатним характером. Так, максимальна активність виявляється на 10 год розвитку з наступним підйомом на 13 год, а мінімальна – на 9 і 12 год розвитку. Максимальний рівень S6-кіназної активності та здатність EGF інгібувати відповідний сигнальний шлях співпадають з індукцією мезодерми (10 год розвитку) і нейроектодерми (12 год розвитку) і корелюють із зниженням включення тимідину в ДНК. Результати проведених досліджень свідчать, що основною закономірністю сигнальних процесів в ранньому ембріогенезі є їх системний коливний (осциляторний) характер, в той час як скерованість регуляторного впливу екзогенних ПФР залежить від рівня активності сигнальних ланок в інтактних бластодермах (від пригнічення їхньої активності при високому рівні в контролі і, навпаки, до стимуляції – при низькому рівні в контролі). Закономірності регулювання сигнальних механізмів у клітинах еритролейкемії людини лінії К562 при індукції процесів диференціації і апоптозу. На наступному етапі для з’ясування молекулярних механізмів, які лежать в основі осциляцій сигнальних процесів в клітинах та впливу на них позаклітинних регуляторних сполук, було обрано таку модель, як клітини еритролейкемії людини лінії К562 з високим рівнем експресії химерного онкобілка р210Bcr-Abl (Anderson, 1979). Вважається, що конститутивна тирозинкіназна активність р210Bcr-Abl є фактором, що визначає високий проліферативний потенціал клітин К562 і підтримує їх на стадії бласту. В той же час, клітини К562 зберегли здатність до диференціації під впливом індукторів різної хімічної природи та скерованості дії в обхід генетичних змін, що викликали їхню трансформацію (Tabillo et al., 1983). Встановлено, що нагромадження бензидин-позитивних клітин та клітин з морфологією промегакаріоцитів і мегакаріоцитів залежить від дози індукторів диференціації, гербіміцину А та РМА, та часу інкубації з ними. Враховуючи отримані дані, в усіх наступних експериментах були використані концентрації індукторів, які забезпечували на 4-у добу півмаксимальне нагромадження диференційованих клітин: 4·10-8 М – для гербіміцину А і 1,6·10-8М – для РМА. Згідно з отриманими даними, вже через 3 доби після обробки антибіотиком кількість бензидин-позитивних клітин досягає максимуму (52+8,3%), що складає приблизно половину клітинної популяції, в той час як рівень РМА-індукованої мегакаріоцитної диференціації досягає на цей же момент близько 66% (за даними цитоморфологічних досліджень). Культивування клітин К562 протягом 4-х діб за присутності індукторів диференціації супроводжується вже на 24-у год 33% і 42% пригніченням клітинного росту порівняно з контролем, яке досягає на 96 год 57% і 74% для гербіміцину А і РМА, відповідно (рис. 7, а). Виявилось також, що культивування клітин з гербіміцином А призводить до загибелі на 72-у год 22-25% клітинної популяції, в той час як в контролі спостерігається загибель лише 5-6% клітин (рис. 7, б). Слід відмітити, що відносна кількість живих клітин в культурі, індукованій РМА, практично не відрізняється від цього показника в контрольних клітинах і залишається на такому ж рівні протягом всього часу культивування (рис. 7, б). Загибель частини клітин за механізмом апоптозу в культурі гербіміцин А-індукованих клітин було підтверджено аналізом фрагментації ДНК при електрофорезі в агарозному гелі (рис. 7, в). Нагромадження моно- і олігонуклеосомних фрагментів ДНК в індукованих клітинах вдалось зафіксувати лише на 48 год культивування з наступним збільшенням їх кількості на 72 год Ці факти, дозволяють зробити висновок, що гербіміцин А володіє здатністю спрямовувати клітини К562 щонайменше по двох напрямках – диференціації по еритроїдному ряду або по шляху апоптозу. Останній процес є своєрідною функціональною атрофією частини клітинної популяції, нездатної переходити в диференційований стан. Як видно з рис. 7, в, обробка клітин К562 РМА не супроводжується індукцією апоптозу, що корелює з даними цитоморфологічних досліджень. Рис. 7. Вплив гербіміцину А і РМА на ріст та виживання клітин К562. Клітини культивували за присутності індукторів протягом 96 год: (а) кількість живих клітин в кожній точці представлено в процентах від кількості живих клітин в точці 0 (час індукції); (б) % виживання визначали за кількістю живих клітин в популяції; (в) електрофореграми ДНК інтактних (контроль) та стимульованих гербіміцином А та РМА клітин К562. M – ДНК-стандарти. i ? ? H J n a ???????a EHuy u?ecaUaOacIcEcEAEc»c»c±c»cI?c»c»c±c±cI?c»c±c»c±c±cEc»cEc»cEcEcEc»c» vxzOe!O!U!L+uoeuoe?oeeoeeoeuoeuoeuoeaoeaoeaoeuoeuoe?oeuoeUoeuoeuoeuoeeoe eoeOeoeIoeCACACACAoe?oe±oeeoea?oea?oe ??????????ивості їх регуляції при індукції диференціації лейкемічних клітин в культурі є нез’ясованими. Імуноблотингом з використанням анти-с-Abl антитіл встановлено, що при обробці клітин гербіміцином А рівень експресії р210Bcr-Abl незначно знижується вже на 3-ю год інкубації і в подальшому не зазнає значних змін (рис. 8, а). Аналіз автокіназної активності p210Bcr-Abl в процесі гербіміцин А-індукованої еритроїдної диференціації клітин К562 показав, що зміни в рівні фосфорилювання p210Bcr-Abl носять коливний характер як в контрольних, так і стимульованих клітинах (рис. 8, б, в). Рівень фосфорилювання p210Bcr-Abl в клітинах, які культивувались за присутності антибіотика, зростає на 3-ю год і протягом наступних досліджених періодів часу є нижчим порівняно з контролем. В той же час, характер динаміки фосфорилювання p210Bcr-Abl є подібним в інтактних і індукованих клітинах, починаючи з 12 год культивування. Фосфорилювання p210Bcr-Abl і ефекторних білків по тирозину є необхідною молекулярною передумовою для активації Bcr-Abl-залежних сигнальних мереж, залучених до регуляції росту, диференціації та апоптозу Ph1-позитивних клітин (Lugo et al., 1990). Встановлено, що, попри експресію в клітинах дерегульованої тирозинової протеїнкінази р210Bcr-Abl, фосфорилювання низки специфічних білків по залишках тирозину не підтримується на постійному конститутивному рівні, а залежить від фази росту клітинної культури (рис. 9, а). Згідно даних літератури і значень Mr, а також результатів попередніх імуноблот-аналізів з використанням специфічних антитіл, pY-вмісні білки, ідентифіковані в лізатах клітин К562, відповідають Bcr-Abl (pp210), c-Bcr (pp160), с-Abl (pp140), c-Cbl (pp120), ізоформам адаптерного білка Shc (pp52 і рр46) та CrkL (pp39). Модифікація білків з Mr 210, 160, 140, 116 і 42 кДа протягом перших 24 год культивування характеризується хвилеподібною динамікою і практично пригнічується на 2-3 добу. Обробка клітин інгібітором тирозинових протеїнкіназ призводить на 3 год культивування до значного посилення фосфорилювання вказаних білків (рис. 9, а), що корелює з підвищенням автокіназної активності. Існує також залежність рівня їхнього фосфорилювання в клітинах, що диференціюються, від відповідних показників в інтактних клітинах (посилення фосфорилювання у випадку більш низького рівня модифікації в контролі і, навпаки). Таким чином, результати дослідження динаміки автокіназної активності і анти-pTyr імуноблотингу не дозволяють однозначно інтерпретувати ефекти гербіміцину А в клітинах К562 як результат прямого впливу антибіотика на тирозинкіназну активність химерного онкобілка. Цей вплив, найбільш імовірно, може бути пов’язаний з порушенням білок-білкових взаємодій в Bcr-Abl-залежних сигнальних комплексах за рахунок здатності гербіміцину А реагувати з сульфгідрильними групами білків (Makishima et al., 1995). Використання прямого методу вимірювання співвідношення GTP/GDP в анти-Ras імунопреципітатах клітин, попередньо інкубованих за присутності Н332РО4, дозволило показати, що посилення фосфорилювання p210Bcr-Abl і ряду специфічних білків в клітинах К562 на 3 год культивування з гербіміцином А узгоджується зі змінами функціональної активності низькомолекулярної високоафінної GTPази, р21Ras. З діаграми видно (рис. 9, в), що кількість GTP, асоційованого з р21Ras, в контрольних клітинах протягом 3-х діб культивування коливається в межах від 27% до 37%. Отримані цифри відображають відносно високий вміст активної форми р21Ras в Bcr-Abl-трансформованих клітинах, ріст яких підтримується присутністю сироватки (Mandanas et al., 1993; Cortez et al., 1996). Встановлено, що гербіміцин А вже на 3-ю год викликає зростання співвідношення GTP/GDP на 15% порівняно з контролем (28,4% в контролі і 43,6% за присутності антибіотика, рис. 9, в). В наступні часові періоди цей показник падає, однак навіть на 3-ю добу не досягає контрольних значень (27% в контролі і 31,5% за присутності антибіотика). Анти-Erk імуноблотингом (рис. 9, б) показано, що тимчасова активація p21Ras на 3-ю год культивування клітин К562 за присутності гербіміцину А корелює з активацією ключової ланки Ras-залежного сигнального каскаду, Erk-кінази. Про активацію Erk судили по зростанню кількості фосфорильованої форми фермента, яка мігрує більш повільно при електрофорезі в SDS-ПААГ. Рис. 9. Ras-залежне сигналювання в клітинах К562 в процесі еритроїдної диференціації, індукованої гербіміцином А: (а) анти-pTyr імуноблотинг лізатів контрольних і індукованих клітин К562; (б) анти-Erk імуноблотинг лізатів контрольних і індукованих клітин К562; (в) динаміка рівня Ras•GTP (в %) в контрольних і індукованих клітинах К562 ( – контроль; - за присутності гербіміцину А; (г) анти-pTyr імуноблотинг білків лізатів контрольних і індукованих клітин К562, що зв’язуються in vitro з GST-кон’югованою формою Grb2; (д) зв’язування білка Shc з рекомбінантною GST-кон’югованою формою Grb2 в лізатах контрольних і гербіміцин А-індукованих клітин лінії К562. Зміни у взаємодіях одного з активаторів Ras-залежного сигнального каскаду, адаптерного білка Grb2, з pY-вмісними білками лізатів контрольних і гербіміцин А-індукованих клітин аналізували in vitro, використовуючи рекомбінантну GST-кон’юговану форму Grb2. Показано, що основними pY-вмісними білками, які зв’язуються з GST-Grb2 в лізатах контрольних і індукованих клітин К562 в процесі їхнього культивування є білки з мол. масами 52, 66, 74, 116, 140, 160 і 210 кДа (рис. 9, г). Рівень зв’язування вказаних фосфобілків протягом перших 24 год культивування досить близько корелює з динамікою фосфотирозин-специфічного фосфорилювання клітинних білків: зниження зв’язування спостерігається на 12-у год в лізатах контрольних клітин та на 6-у і 24-у год в лізатах гербіміцин А-індукованих клітин. При цьому максимум зв’язування в контрольних клітинах відповідає мінімальному рівню білок-білкової взаємодії в клітинах, що диференціюються, і, навпаки. Одночасно, результати по зв’язуванню з GST-Grb2 in vitro на 48-у і 72 год культивування різко контрастують із даними анти-pY-імуноблотингу загальних клітинних лізатів: зниження рівня фосфорилювання ряду специфічних білків клітин К562 співпадає з драматичним зростанням їхньої афінності до рекомбінантного білка. Не виключено, що виявлене посилення взаємодії може бути результатом прямого і опосередкованого кооперативного зв’язування за участю як SH2, так і SH3 доменів Grb2 і визначатися фізіологічними потребами клітин. Беручи до уваги дані літератури, що множинні Grb2-комплекси опосередковують активацію Ras-залежного сигналювання в гемопоетичних клітинах (Puil et al., 1994), проаналізувано динаміку зв’язування стиковочного білка Shc з GST-Grb2 в процесі гербіміцин А-індукованої еритроїдної диференціації клітин К562. За результатами анти-Shc імуноблотингу (рис. 9, д) зв’язування білка Shc з GST-Grb2 в лізатах контрольних клітин володіє фазним характером. Максимальне зв’язування спостерігається на 12-у і 48-у год культивування клітин. Обробка клітин гербіміцином А супроводжується значним пригніченням білок-білкової взаємодії у всі досліджувані періоди часу з максимумом на 24 год. Період максимального зв’язування Shc в індукованих клітинах відповідає мінімуму зв’язування в контролі. Звертає на себе увагу також факт посилення зв’язування Shc в лізатах контрольних клітин на 48 і 72 год культивування, в той час як в індукованих клітинах взаємодія Shc-Grb2 в цей період взагалі не виявляється. Обробка клітин К562 РМА призводить на 3-ю год до посилення асоціації досліджуваних адаптерних білків з наступним поступовим зниженням рівня зв’язування до 72-ої год культивування, що значно відрізняється за динамікою від клітин, індукованих гербіміцином А. Результати проведених досліджень дозволяють зробити важливий висновок, що зниження здатності Shc утворювати комплекс з GST-Grb2 корелює з нагромадженням диференційованих клітин при індукції як еритроїдної, так і мегакаріоцитної диференціації клітин К562. Таким чином, розробка препаратів, здатних інгібувати взаємодію Grb2-Shc в клітинах хронічної мієлоїдної лейкемії може стати одним із перспективних методів лікування даного захворювання. Встановлено, що рівень експресії регуляторної р85? субодиниці РІ-3-кінази залишається незмінним протягом досліджуваного періоду часу як в інтактних, так і в гербіміцин А- та РМА-індукованих клітинах (рис. 10, а). За результатами проведених досліджень РІ-3-кіназна активність, як і інші досліджені сигнальні процеси в клітинах К562, осцилює залежно від фази росту клітинної культури (рис. 10, б). Піки активності в контрольних клітинах спостерігались на 3-ю і 48-у год, в той час як мінімальна активність виявлялась на 12-у і 72-у год культивування. Обробка клітин гербіміцином А призводить на 3-ю год індукції еритроїдної диференціації практично до повного інгібування активності РІ-3кінази (на 96% порівняно з контролем) з одночасною, як було показано раніше, активацією Ras-залежного сигналювання. Протягом 6-ої - 24-ої год культивування РІ-3-кіназна активність в індукованих клітинах перевищувала контрольні значення з наступним значним зниженням, як і в контролі, на 72 год. Загальний характер динаміки активності РІ-3-кінази при індукції мегакаріоцитної диференціації є подібним до динаміки активності цього фермента в клітинах, оброблених гербіміцином А до 48 год культивування (рис. 10, в). При цьому слід відмітити, що кінцева відповідь при сигналюванні через РІ-3-кіназу на пізних етапах (72-а год) індукції еритроїдної і мегакаріоцитної диференціації суттєво відрізняється: інгібування ліпідкіназної активності спостерігається під впливом гербіміцину А і, навпаки, стимуляція – при дії РМА. Отримані дані дозволяють зробити висновок про різну регуляторну значимість фосфоінозитидів, фосфорильованих в 3’-положенні кільця інозиту, в реалізації біологічних ефектів гербіміцину А та РМА в клітинах К562. Рис. 10. Динаміка РІ-3-кіназної активності протягом еритроїдної і мегакаріоцитної диференціації клітин К562: (а) анти-р85? імуноблотинг лізатів інтактних (контроль) та стимульованих гербіміцином А та РМА клітин К562; (б, в) РІ-3-кіназна активність в інтактних та стимульованих гербіміцином А та РМА клітинах К562. Авторадіограми продуктів РІ-3-кіназної реакції, розділених тонкошаровою хроматографією на силікагелі; (г, д) РІ-3-кіназна активність, виражена в імп·хв-1 [32Р], включеного в РtdІns(3)Р, при дії гербіміцину А і РМА. К0 – точка 0 (час індукції). З метою з’ясування особливостей регуляції активності РІ-3-кінази в інтактних клітинах К562 і під впливом індукторів диференціації та апоптозу порівнювали динаміку білок-білкових взаємодій, опосередкованих повнорозмірною формою регуляторної р85? субодиниці фермента та її SH3 доменом, з динамікою активності РІ-3-кінази. Встановлено, що основними pY-вмісними білками лізатів клітин К562, які взаємодіють in vitro з GST-р85?/full та GST-р85?/SH3, є білки з Mr 210, 160, 140, 120, 85, 66, 52, 46 і 39 кДа (рис. 11, 12). Зв’язування ідентифікованих білків в лізатах інтактних клітин характеризується вираженою хвилеподібною динамікою, в той час як зміни в рівні білок-білкової взаємодії в лізатах індукованих клітин носять координований характер порівняно з контрольними показниками (рис. 11, 12). Суттєве зниження активності РІ-3-кінази на 3-ю год інкубації за присутності гербіміцину А пов’язане з низьким рівнем зв’язування практично всіх ідентифікованих фосфотирозинвмісних білків (рис. 10, 11). Важливо також зауважити, що в гербіміцин А-індукованих клітинах зв’язування р120 як з SH3 доменом регуляторної субодиниці РІ-3-кінази, так і з її повнорозмірною формою негативно корелює з динамікою активності фермента. В інтактних клітинах негативної кореляції між цими показниками не спостерігається. Одночасно, максимуми активності РІ-3-кінази в контрольних (на 3-ю і 48-у год культивування) та індукованих клітинах (на 6-у та 24-у год культивування) співпадають із підвищенням рівня зв’язування білків р66 і р52. Результати проведених досліджень дозволяють припустити, що білок p120 (c-Cbl за даними імуноблотингу) при асоціації з р85? може функціонувати як негативний регулятор каталітичної активності ензиму в процесі гербіміцин А-індукованої еритроїдної диференціації клітин К562. Вартим уваги є факт, що в гербіміцин А-стимульованих клітинах відсутня кореляція між змінами активності РІ-3-кінази і рівнем зв’язуванням білка р46Shc з р85?, в той час як в інтактних клітинах встановлена відповідність добре прослідковується. Рівень зв’язування вказаних білків in vivo обернено корелює з рівнем тирозин-специфічного фосфорилювання Shc, який виявляється в GST-р85?/SH3 преципітатах (рис. 11, а) та рівнем зв’язування Shc, який детектується в GST-Grb2 преципітатах (рис. 9, д). Результати наших експериментів корелюють з даними інших дослідників, згідно яких SH3 домен р85? взаємодіє з N-кінцевою Pro-багатою ділянкою Shc, який фосфорилюється по залишках тирозину та опосередковує конститутивну взаємодію з продуктом протонкогену c-Cbl (Harrison-Findik et al., 1995). Вказана взаємодія є однією з ланок сигнальних мереж, на рівні яких контролюється активність РІ-3-кінази в Bcr-Abl-трансформованих клітинах. Не виключено, що рівень модифікації Shc є одним із регуляторних чинників, які впливають на стехіометрію білок-білкової взаємодії з іншими адаптерними білками (Grb2, p85?) та на специфічність і скерованість сигналювання через вказані надмолекулярні комплекси. Результати експериментів по зв’язуванню in vitro білків клітинних лізатів з GST-кон’югованими формами р85? в процесі мегакаріоцитної диференціації клітин К562 стали ще одним яскравим свідченням на користь існування осциляцій в рівні зв’язування специфічних мішеней із адаптерними білками та скерованості впливу позаклітинних регуляторних сполук на формування таких надмолекулярних комплексів залежно від показників в контролі. Встановлено, що максимальному зв’язуванню в контролі на 12-у год відповідає мінімальне зв’язування більшості білків в РМА-стимульованих клітинах, і, навпаки, на 48-у год при мінімальному зв’язуванні в контролі спостерігається максимальне зв’язування під впливом РМА. На 3-ю добу відмічається практично повне інгібування взаємодії pY-вмісних білків з повнорозмірною формою р85? як в контролі, так і в досліді. В клітинах К562, що диференціюються по мегакаріоцитному шляху, виявляється обернена залежність між ліпідкіназною активністю РІ-3-кінази та зв’язуванням білків р210Bcr-Abl, р140c-Abl і р120c-Cbl з повнорозмірною формою р85?, чого не спостерігається в інтактних клітинах. Очевидно, відновлення негативного контролю вищевказаних білків на активність РІ-3-кінази є важливим регуляторним моментом в контролі сигнальних шляхів клітин, що стали на шлях диференціації. Рис. 11. Анти-pY імуноблот-аналіз білків лізатів інтактних (контроль) та стимульованих гербіміцином А клітин лінії К562, що специфічно зв’язуються in vitro з рекомбінантними GST-кон’югованими формами регуляторної р85? субодиниці РІ-3-кінази: SH3 доменом (а); повнорозмірною формою р85?, (б); динаміка зв’язування різних форм GST-p85? з окремими фосфотирозинвмісними білками лізатів контрольних та гербіміцин А-індукованих клітин К562, (в, г). Ступінь зв’язування виражали в умовних одиницях. Отримані дані дозволяють запропонувати гіпотезу, згідно якої диференційна координована регуляція Ras-залежного і РІ-3-кіназного сигнальних шляхів можезабезпечувати як стимуляцію мітогенезу і інгібування апоптозу, так і індукцію диференціації в одному і тому ж типі Bcr-Abl-трансформованих клітин. Можна припустити, що клітини вибирають між проліферацією і диференціацією завдяки різниці в тривалості та періодичності активації Ras/Erk і РІ-3-кінази, в основі чого лежать різноскеровані системні зміни на рівні взаємодії специфічних адаптерів із своїми ефекторними мішенями. Таким чином, існує ймовірність, що індуктори диференціації можуть не просто десенситизувати функції Ras і РІ-3кінази на ранніх стадіях відповіді лейкемічних клітин, а швидше всього здатні переключати Ras-залежне РІ-3-кіназне сигналювання на альтернативний шлях. Закономірності регулювання сигнальних механізмів клітин за участю адаптерного білка Ruk. Як зазначалось в попередніх розділах, провідну роль в організації та регулюванні сигнальних мереж клітин відіграють адаптерні/”риштувальні” білки, характерною особливістю будови яких є наявність множинних доменів та мотивів, залучених до міжмолекулярної взаємодії, зокрема SH2, SH3, РТВ, РН доменів та інших (Pawson & Nash, 2003). З клонуванням у 2000 році SH3-вмісного адаптерного білка Ruk було започатковано новий напрямок досліджень в галузі клітинного сигналювання (Gout et al., 2000). Нагромаджені на сьогодні експериментальні дані дозволяють вважати Ruk представником окремої родини SH3-вмісних адаптерних білків (Dikic, 2002), які виконують інтегруючу роль в регуляції архітектури актинового цитоскелету і адгезії клітин (Hutchings et al., 2003; Schmidt et al., 2003; Tibaldi & Reinherz, 2003), апоптозу (Gout et al., 2000; Chen et al., 2000; Schiffer et al., 2004), мітогенному сигналюванні (Petrelli et al., 2002; Soubeyran et al., 2002), ліганд-опосередкованому ендоцитозі рецепторних тирозинових протеїнкіназ (Petrelli et al., 2002; Soubeyran et al., 2002; Szymkiewicz et al., 2002 Особливості структурно-функціональної організації Rukl (наявність трьох SH3 доменів, пролін- та серин-багатих повторів, суперспіралізованої С-кінцевої ділянки) (Gout et al., 2000) свідчать, що вказаний білок може взаємодіяти з молекулами різної хімічної природи, залученими до сигнальної трансдукції Вшлшсб 2002). Для подальшого розгортання досліджень у вказаному напрямку були отримані поліклональні та моноклональні антитіла проти С-кінцевого суперспіралізованого району та N-кінцевого SH3A домену, відповідно, Rukl. Використання вказаних антитіл дозволило показати, що профілі експресії ізоформ Ruk та його ортолога у людини, білка CIN85, їхня субклітинна локалізація та здатність до олігомеризації є специфічними для кожної з досліджених ліній клітин (NIH3T3, Cos1, L1210, HEK293, Ramos, HeLa S3, MDCK, C6, A549, U937) (Дробот І ін., 2005). Очевидно, виявлені зокономірності відображають різну біологічну роль ізоформ Ruk/CIN85 в клітинах різного видового та тканевого походження. З метою пошуку білків, які взаємодіють із Pro-багатими мотивами Ruk, була використана панель GST-SH3 доменів для преципітації рекомбінантного білка Rukl, який експресували в бакуловірусній системі. Як видно з рис. 12, а, Rukl взаємодіє in vitro з низкою SH3 доменів, але найбільш ефективно з SH3 доменом р85? регуляторної субодиниці РІ-3-кінази та N-кінцевим SH3 доменом адаптерного білка Grb2. Значно слабше, але досить чітке зв’язування спостерігалось з SH3 доменами адаптерного білка Crk і цитоплазматичних тирозинових протеїнкіназ Src і Fyn. Встановлено також, що Rukl утворює стабільний комплекс з р85? при співекспресії в клітинах комах, в той час як експресія делеційного ?SH3 мутанту повністю усуває виявлену взаємодію (рис. 12, б). Натомість, делеція ВН домену р85? (включно з Pro-багатими ділянками) не впливає на формування надбілкового комплексу. Отримані результати свідчать про те, що саме SH3 домен р85? і Pro-багата ділянка Rukl відповідають за взаємодію досліджуваних сигнальних білків in vivo. З іншого боку, експерименти по зв’язуванню in vitro GST-кон’югованих фрагментів Ruk з р85?, яку експресували в клітинах НЕК293, виявили здатність SH3А і SH3В доменів адаптерного білка взаємодіяти з Pro-багатими ділянками регуляторної субодиниці РІ-3-кінази. Як видно з рис. 12, в, ця взаємодія потенціюється при використанні, як байту, GST-3SH3. Таким чином, міжмолекулярна взаємодія Ruk і р85? носить складний комплексний характер і відбувається за участю різних доменів і мотивів Ruk, які опосередковують гетеромеризацію двох білків. На наступному етапі було проаналізовано вплив вказаної міжбілкової взаємодії на ліпідкіназну активність холоферменту з використанням афінно очищених препаратів Rukl Glu-tagged та р85?-р110? з лізатів клітин SF9, інфікованих відповідними рекомбінантними бакуловірусами. З рис. 12, г видно, що присутність Rukl призводить до істотного інгібування активності РІ-3-кінази, Рис. 12. Регуляторна р85? субодиниця РІ-3-кінази - зв’язувальний партнер Rukl: (а) зв’язування Rukl Glu-tagged, експресованого в бакуловірусній системі, з GST-SH3 доменами різних сигнальних білків. р47 і р67 – субодиниці NADPH-оксидази. Крайня права доріжка містить рекомбінатний Rukl Glu-tagged, очищений з клітин SF9; (б) Взаємодія Rukl і регуляторної р85? субодиниці РІ-3-кінази в клітинах SF9. Клітини SF9 інфікували рекомбінантними бакуловірусами, що експресували Rukl Glu-tagged і/або повнорозмірну форму р85? або її делеційні мутанти. Анти-Glu-tag імунопреципітати лізатів інфікованих клітин розділяли електрофорезом в SDS-ПААГ з наступним анти-р85? імуноблотаналізом: 1-3 – анти-Glu-tag імунопреципітати; 4, 5 – загальні клітинні лізати; (в) взаємодія in vitro GST-кон’юго ваних фрагментів Ruk з повнорозмірною формою р85?, експресованою в клітинах НЕК293; (г) вплив Rukl на РІ-3-кіназну активність in vitro. Rukl Glu-tagged і р85?-р110? очищали з клітин SF9, інфікованих відповідними рекомбінантними бакуловірусами. Очищені рекомбінантні білки змішували у зазначених співвідношеннях і визначали РІ-3-кіназну активність за присутності [?-32P]ATP, використовуючи як субстрат РІ. причому максимальне інгібування спостерігається при еквімолярному співвідношенні досліджуваних білків в реакційній суміші. Цікаво, що наступне підвищення кількості Rukl (від 50 до 100 нг) супроводжується зростанням ферментативної активності до значень, які детектуються за відсутності Rukl. Таким чином, Rukl виявився першим серед низки адаптерних білків, зв’язувальних партнерів РІ-3-кінази, який виявляє інгібуючий ефект на ліпідкіназну активність холоферменту. Результати попередніх досліджень (див. Розділ 2) дозволяють вважати дозозалежність у скерованості ефектів Rukl типовою для риштувальних білків, які можуть функціонувати як центри організації ансамблів білків лише за умови їхньої оптимальної стехіометрії у надмолекулярних комплексах. У випадках, коли концентрація риштувального білка є вищою від оптимальних значень повинно спостерігатись значне пригнічення сигналювання на виході, пов’язане з порушенням і/або реорганізацією системи міжмолекулярних взаємодій. Такі властивості адаптерних/риштувальних білків можуть ефективно використовуватись для регулювання специфічності, ефективності та амплітуди проходження сигналу в мережі, контролювати просторово-часову організацію сигнальних систем клітин. Встановлена нами можливість ядерної локалізації Rukl (Дрель і ін., 2002; Havrylov et al., 2005), а також наявність в його амінокислотній послідовності позитивно заряджених ділянок дозволяє припустити, що досліджуваний білок може прямо або опосередковано взаємодіяти не лише з білками, а й з нуклеїновими кислотами. Для дослідження білково-нуклеїнової взаємодії за умов in vitro було очищено рекомбінантний білок Rukl Glu-tagged з лізатів трансфікованих клітин HEK293 афінною хроматографією на білок G-сефарозі з ковалентно кон’югованими моноклональними анти-Glu-tag антитілами. Результати проведених експериментів свідчать, що в досліджуваному препараті присутні щонайменше два білки, які володіють спорідненістю до ДНК (рис. 13, а, б, в, доріжки 1-3, 6, 10) і які не виявляються в контрольному елюаті (рис. 13, а, в, доріжки 4, 13). Виявлена взаємодія є дозозалежною (рис. 13, а, доріжки 1-3) і пригнічується як за присутності надлишку неміченого ОДН (рис. 13, б, доріжка 7), так і ДНК із сперми лосося (рис. 13, в, доріжки 9-12), що може свідчити про специфічність утворення білок-нуклеїнових комплексів. Електрофорез в денатуруючих умовах показав, що інкубація Rukl Glu-tagged з 150-mer [32Р]-міченим ОДН гену 5S рРНК L. variagatus при 370С супроводжується утворенням низькомолекулярних мічених фрагментів використаної проби (рис. 14). На наступному етапі ДНКазну активність препарату Rukl Glu-tagged аналізували за його здатністю гідролізувати плазмідну ДНК in vitro. Показано, що ДНКазна активність виявляється лише в елюаті з афінного сорбенту, інкубованого з лізатами клітин НЕК293, трансфікованих вектором pRc/CMV2/Rukl-Glu-tag, але не контрольних клітин, трансфікованих вектором pRc/CMV2 без вставки (рис. 15, доріжки 2, 4). При цьому за присутності Zn2+, неспецифічного інгібітора нуклеаз (Duke et al., 1983), реакція гідролізу плазмідної ДНК препаратом Rukl Glu-tagged повністю інгібується (рис. 15, доріжка 5). При додаванні в інкубаційне середовище анти-Ruk та анти-Glu-tag антитіл (рис. 15, доріжки 8, 10) спостерігається часткове пригнічення ДНКазної активності, причому вказаний ефект є дозозалежним від доданих антитіл (рис. 15, доріжки 7, 8). Рис. 13. Затримка білок-нуклеїнових комплексів при електрофорезі в гелі. Rukl Glu-tagged інкубували з 26-mer [32P]-міченим ОДН (а, б) або з 150-mer [32P]-міченим ОДН гену 5S рРНК L. variagatus (в), протягом 1 год при 40С. Затримку комплексів аналізували електрофорезом в 6% ПААГ в ТБЕ буфері: 1) 0,5 мкг Rukl Glu-tagged + [32P]-ОДН; 2) 1 мкг Rukl Glu-tagged + [32P]-ОДН; 3) 2 мкг Rukl Glu-tagged +[32P]-ОДН; 4) контрольний елюат + [32P]-ОДН; 5) [32P]-ОДН; 6) 1 мкг Rukl Glu-tagged + [32P]-ОДН; 7) 1 мкг Rukl Glu-tagged + [32P]-ОДН + 1 мкг ОДН; 8) [32P]-ОДН; 9) [32P]-ОДН; 10) 1 мкг Rukl Glu-tagged + [32P]-ОДН; 11) 1 мкг Rukl Glu-tagged + [32P]-ОДН + 0,5 мкг ДНК; 12) 1 мкг Rukl Glu-tagged + [32P]-ОДН + 1 мкг ДНК; 13) контрольний елюат + [32P]-ОДН. Рис. 14. Аналіз здатності афінно очищеного препарату Rukl Glu-tagged гідролізувати ДНК. Препарат білка інкубували з 150-mer [32P]-міченим ОДН гену 5S рРНК L. variagatus протягом 30 хв при 370С і розділяли в 15% ПААГ за присутності 7 M сечовини в TБE буфері:1) 1 мкг Rukl Glu-tagged + [32P]-ОДН; 2) елюат з афінного носія, інкубованого з лізатами контрольних клітин HEK293, трансфікованих вектором pRc/CMV2 + [32P]-ОДН; 3) [32P]-ОДН. Рис. 15. Гідроліз плазмідної ДНК афінно очищеним препаратом білка Rukl Glu-tagged: 1) вектор pRc/CMV2; 2) pRc/CMV2 + елюат з афінного носія, інкубованого з лізатами контрольних клітин HEK293, трансфікованих вектором pRc/CMV2; 3) pRc/CMV2 + елюат з афінного носія, інкубованого з лізатами контрольних клітин HEK293, трансфікованих вектором pRc/CMV2, + 1 мM ZnCl2; 4) pRc/CMV2 + Rukl Glu-tagged; 5) pRc/CMV2 + Rukl Glu-tagged + 1 мM ZnCl2; 6) pRc/CMV2 + анти-Ruk АТ (0,2 мкг); 7) pRc/CMV2 + анти-Ruk АТ (0,2 мкг) + Rukl Glu-tagged; 8) pRc/CMV2 + анти-Ruk АТ (0,8 мкг) + Rukl Glu-tagged; 9) pRc/CMV2 + анти-Glu-tag АТ (1 мкг); 10) pRc/CMV2 + анти-Glu-tag АТ (1 мкг) + Rukl Glu-tagged. Залежність гідролізу плазмідної ДНК від наявності білка Rukl Glu-tagged в інкубаційному середовищі була підтверджена при його виснажуванні в результаті преінкубації отриманого препарату за присутності анти-Glu-tag антитіл з наступною преципітацією імунних комплексів за допомогою білок G-сефарози (Кіт і ін., 2004). З рис. 16, доріжка 1, видно, що плазміда pcGT знаходиться в основному в суперскрученій і значно менше в лінійній та нікованій кільцевих формах (для порівняння див. утворення лінійної форми при розщепленні плазміди ендонуклеазою рестрикції EcoRI (рис. 16, доріжки 5, 6). Після 30 хв інкубації pcGT з препаратом Rukl Glu-tagged спостерігається перехід суперскрученої форми плазміди в ніковану кільцеву та лінійну з подальшим гідролізом останьої (див. рис. 16, доріжка 2). При збільшенні часу інкубації до 60 хв спостерігається зменшення кількості нікованої кільцевої форми плазміди та збільшення лінійної разом із продуктами гідролізу. На 90 хв можна спостерігати майже повний гідроліз плазміди (див. рис. 16, доріжка 4). Для подальшої характеристики нуклеазної активності, асоційованої з білком Rukl Glu-tagged, ми проаналізували залежність гідролізу плазмідної ДНК від іонів Mg2+, Ca2+ та Mn2+ (Khodarev et al., 1998, Widlak et al., 2001). З рис. 16, доріжка 8, видно, що нуклеаза/(нуклеази), асоційовані з Rukl Glu-tagged, можуть використовувати як кофактор лише іони Mg2+. Встановлено також, що нуклеазна активність не залежить від іонів Ca2+ та Mn2+ (див. рис. 16, доріжки 9, 10). В той же час виявлено, що при комплексній дії іонів Mg2+ і Ca2+ спостерігається значне посилення гідролізу ДНК (див. рис. 16 доріжка 11), в той час як за присутності іонів Mn2+ і Ca2+ гідроліз не відбувається (див. рис. 16, доріжка 12). Цікаво, що комплексна дія іонів Mg2+ та Mn2+ не призводить до посилення гідролізу плазмідної ДНК порівняно з дією самого Mg2+ (див. рис. 16, доріжки 13 та 8, відповідно). Рис. 16. Гідроліз плазмідної ДНК афінно очищеним препаратом білка Rukl Glu-tagged: 1) pcGT; 2) pcGT + Rukl Glu-tagged (інкубація 30 хв); 3) pcGT + Rukl Glu-tagged (інкубація 60 хв); 4) pcGT + Rukl Glu-tagged (інкубація 90 хв); 5) pcGT + EcoRI (інкубація 30 хв); 6) pcGT + EcoRI (інкубація 60 хв); 7) pRc/CMV2; 8) pRc/CMV2 + Rukl Glu-tagged + 5 мM MgCl2; 9) pRc/CMV2 + Rukl Glu-tagged + 1 мM CaCl2; 10) pRc/CMV2 + Rukl Glu-tagged + 5 мM MnCl2; 11) pRc/CMV2 + Rukl Glu-tagged + 5 мM MgCl2 + 1 мM CaCl2; 12) pRc/CMV2 + Rukl Glu-tagged + 5 мM MnCl2 + 1 мM CaCl2; 13) pRc/CMV2 + Rukl Glu-tagged + 5 мM MgCl2 + 5 мM MnCl2. Отримані дані дозволяють зробити висновок, що афінно очищений препарат рекомбінантного білка Rukl Glu-tagged володіє здатністю не тільки зв’язуватись із ДНК, але і гідролізувати її. Асоційована нуклеаза(и) є Mg2+ - залежною і проявляє як екзо-, так і ендонуклеазну активності. Крім того встановлено, що іони Ca2+ значно потенціюють гідроліз плазмідної ДНК при використанні іонів Mg2+ як кофактора ферментативної реакції. Для з’ясування, які саме послідовності білка Rukl задіяні у взаємодію із нуклеазою/(нуклеазами), були використані препарати рекомбінантних Glu-tagged m та h ізоформ білка Ruk, які представляють собою його сплайсові вкорочені варіанти з одним SH3-доменом, або С-кінцевий суперспіралізований район, відповідно (Gout et al., 2000). З рис. 17 видно, що в усіх досліджуваних препаратах (Rukl Glu-tagged, Rukm Glu-tagged та Rukh Glu-tagged) є присутніми щонайменше два білки, які володіють спорідненістю до ДНК. Слід зауважити, що виявлені білково-нуклеїнові комплекси володіють однаковою електрофоретичною рухливістю та інтенсивністю. ДНКазну активність препаратів Rukl Glu-tagged, Rukm Glu-tagged та Rukh Glu-tagged аналізували за їх здатністю гідролізувати плазмідну ДНК in vitro. Як видно з рис. 18, ДНКазна активність виявляється в усіх досліджуваних препаратах l, m та h ізоформ рекомбінантного білка Ruk і повністю інгібується за наявності іонів Zn2+. Рис. 17. Затримка білок-нуклеїнових комплексів при електрофорезі в гелі. Препарати рекомбінантних Glu-tagged l, m та h ізоформ білка Ruk інкубували з 32-mer [32P]-міченим ОДН. Затримку комплексів аналізували електрофорезом в 6% ПААГ в ТБЕ буфері: 1) Rukl Glu-tagged + [32P]-ОДН; 2) Rukm Glu-tagged + [32P]-ОДН; 3) Rukh Glu-tagged + [32P]-ОДН; 4) [32P]-ОДН. Рис. 18. Гідроліз плазмідної ДНК афінно очищеними препаратами білків Rukl Glu-tagged, Rukm Glu-tagged та Rukh Glu-tagged. 1) pRc/CMV2; 2) pRc/CMV2 + Rukl Glu-tagged; 3) pRc/CMV2 + Rukl Glu-tagged + 1 мM ZnCl2; 4) pRc/CMV2 + Rukm Glu-tagged; 5) pRc/CMV2 + Rukm Glu-tagged + 1 мM ZnCl2; 6) pRc/CMV2 + Rukh Glu-tagged; 7) pRc/CMV2 + Rukh Glu-tagged + 1 мM ZnCl2. Таким чином, афінно очищені препарати Glu-tagged ізоформ (l, m та h) білка Ruk, спільною структурною особливістю яких є наявність “coiled-coil” послідовності, містять принаймні два білки, які володіють спорідненістю до ДНК, а також проявляють ДНКазну активність. При цьому слід відмітити, що в процесі гідролізу відбувається перехід суперскрученої форми плазміди в ніковану, яка зазнає наступного гідролізу. Картування C-кінцевої суперспіралізованої ділянки амінокислотної послідовності адаптерного білка Rukl, залученої до взаємодії із нуклеазою/(нуклеазами), та виявлення ряду їх каталітичних властивостей дозволяє продовжити роботу по ідентифікації даної ендонуклеази/(ендонуклеаз) та з’ясуванню їхньої біологічної ролі. Дослідження механізмів між- та внутрішньомолекулярних взаємодій, опосередкованих доменами і мотивами ізоформ Ruk, методом зв’язування in vitro GST-кон’югованих форм рекомбінантних білків показало, що з формами Ruk, які містять Pro-багаті мотиви (Rukl, Rukm) найефективніше взаємодіє GST-SH3A-домен і в значно меншому ступені GST-SH3В-домен, в той час як зв’язування Rukl і Rukm до GST-SH3С-домену не виявляється зовсім (Ilnytska et al., 2005). Посилення зв’язування спостерігається при використанні як „байту” GST-3SH3, що може свідчити про кооперативність внутрішньомолекулярних взаємодій. Цікаво, що при усуненні стеричних обмежень у випадку експресії Ruk?SH3, останній однаково ефективно преципітується всіма трьома (А, В і С) SH3-доменами Ruk. Крім цього всі експресовані ізоформи Ruk (Rukl, Rukm і Rukh), а також мутантна форма білка без Pro-багатих мотивів, ?Pro-Ruk, ефективно преципітуються GST-Ruks, що свідчить про роль С-кінцевого суперспіралізованого району в ди-/олігомеризації ізоформ Ruk (Ilnytska et al., 2005). Встановлено також, що система внутрішньомолекулярних взаємодій, опосередкованих адаптерним білком Ruk, зазнає змін під час TNF?-індукованого апоптозу клітин лінії U937 (Ilnytska et al., 2005). Значне посилення взаємодії Rukl з GST-SH3A-доменом спостерігається на 4-6 год культивування порівняно з інтактними клітинами, що співпадає в часі з нагромадженням нуклеосомних фрагментів ДНК. Зміна здатності Pro-багатих мотивів Ruk взаємодіяти з екзогенними партнерами може свідчити про існування в клітинах динамічної рівноваги між активними (відкритими) і неактивними (закритими внаслідок внутрішньомолекулярних взаємодій) формами адаптерного білка, що, без сумніву, має регуляторне значення для узгодженого функціонування Ruk-залежних сигнальних мереж в просторі і часі. Наявні функціональні дані свідчать про те, що адаптерний білок Ruk виконує важливу роль не тільки у підтриманні гомеостазу нормальних клітин, але може бути також залученим до регулювання шляхів злоякісної трансформації клітин людини і тварин і, як наслідок, слугувати молекулярним маркером канцерогенезу та, в перспективі, представляти привабливу мішень для антипухлинної терапії. Для з’ясування можливої біологічної ролі ортолога Ruk у людини, білка CIN85, в канцерогенезі нами було проаналізовано рівень його експресії в світлоклітинних карциномах нирки людини різного ступеня злоякісності згідно класифікації TNM. Експресію ізоформ адаптерного білка CIN85/Ruk досліджували в 20 зразках пухлин нирки людини та відповідних контрольних зразках (морфологічно незмінена тканина, ізольована із того самого органу при радикальній нефректомії) методами імуноблотингу, нозерн-блотингу та імуногістохімії. За даними імуноблот-аналізу основні імунореактивні смуги в Тритон Х-100-розчинних екстрактах досліджуваних зразків відповідають білкам з молекулярними масами 130, 85, 56 і 34 кДа. Як видно з рис. 19, а, співвідношення в експресії ізоформ CIN85/Ruk є специфічним як для контрольних, так і пухлинних зразків. В той же час, встановлено достовірне зниження рівня експресії повнорозмірної форми білка CIN85/Ruk з Mr 85 кДа у переважній частині досліджених зразків пухлин (в 12-ти зразках з 20-ти) порівняно з контрольними зразками (рис. 20, в-д). Зміни в експресії CIN85/Ruk на рівні білка корелюють із змінами експресії на рівні мРНК (рис. 19, а, б) та даними імуногістохімії (рис. 19, е). Імуногістохімічні дослідження зразків пухлин та умовно нормальних тканин виявили ще одну цікаву закономірність. Поряд із загальним зниженням інтенсивності зафарбовування в клітинах пухлин детектуються зміни субклітинної локалізації CIN85/Ruk – транслокація до ядра та переважне накопичення в примембранній зоні. Результати проведених досліджень узгоджуються з даними літератури про посилення сигналювання, залежного від рецепторів епідермального фактора росту (EGF) та фактора росту гепатоцитів (c-Met) в карциномах нирки (Nakamura et al., 2001; Weber et al., 2003). Таке посилення може бути наслідком не тільки генетично обумовленого підвищення рівня експресії зазначених рецепторів, а й порушення механізмів їх ліганд-індукованого ендоцитозу, критичною регуляторною ланкою яких є CIN85. З іншого боку, беручи до уваги здатність Rukl інгібувати ліпідкіназну активність РІ-3-кінази, яка в ряді клітинних систем володіє вираженим антиапоптичним потенціалом (Gout et al., 2000), виявлене зниження рівня експресії CIN85/Ruk може одночасно вносити вклад в посилення виживання карциномних клітин. Такі властивості, зокрема, здатність інгібувати PI-3-кіназне сигналювання та зниження експресії в пухлинах, роблять CIN85 функціонально подібним до відомого білка-супресора пухлин PTEN (Sansal & Sellers, 2004). Таким чином, виявлене зниження експресії адаптерного білка CIN85/Ruk в пухлинах нирки людини може призводити до втрати узгодженого контролю процесів апоптозу і проліферації в трансформованих епітеліальних клітинах та вносити вклад в канцерогенез і прогресію нирково-клітинних карцином. ВИСНОВКИ Проведено комплекс експериментальних робіт, за результатами яких запропоновано гіпотезу про системний характер осциляцій сигнальних процесів в нормальних і пухлинних клітинах евкаріот та їхню роль в координації спряжених сигнальних шляхів. Запропоновано і експериментально доведено концепцію стосовно критичної ролі стехіометрії адаптерних/риштувальних білків в надмолекулярних сигнальних комплексах в забезпеченні специфічності і інтенсивності сигналювання. Отримані дані обгрунтовують можливості впливу на специфічні ланки сигнальних мереж за тих чи інших патологічних станів. 1. На моделі зародків костистої риби в’юна (Misgurnus fossilis L.) ідентифіковано і охарактеризовано ряд сигнальних ланок, що активуються на початкових етапах ембріонального розвитку тварин: - вперше виявлені і охарактеризовані функціональні рецептори інсуліну і EGF в клітинах зародків в’юна на стадії ранньої гаструли; - охарактеризовано кінетичні параметри високоафінної GTPазної активності G-білків плазматичних мембран зародкових клітин, ізольованих на стадії ранньої гаструли, ідентифіковано субстрати кашлючного (G?0 з Mr 29 кДа) та ботулінічного (з Mr 26 і 28 кДа) токсинів, SMG-білки підродин Rho/Rac та Ras; - ідентифіковано фосфотирозинвмісні білки, рівень модифікації яких залежить від стадії розвитку зародків і регулюється інсуліном; - проаналізовано особливості функціонування інозитліпідної сигнальної системи в клітинах ранніх зародків в’юна та вплив на ці процеси інсуліну та гуанілових нуклеотидів. Вперше встановлено, що G-білки залучені до інсулін-опосередкованого стимулювання активності РІ-4-кінази і негативного регулювання РІ-3-кінази залежно від стадії ембріонального розвитку; - вперше отримано частково очищені препарати S6-кінази ембріональних клітин, ізольованих на стадії ранньої гаструли, досліджено її деякі фізико-хімічні властивості, субстратну специфічність, динаміку активності та особливості регулювання під впливом EGF. 2. Вперше показано, що основною закономірністю сигнальних процесів в ранньому ембріогенезі (Tyr-специфічного фосфорилювання білків, активностей РІ-3- і РІ-4-кіназ та S6-кінази) є їх системний коливний характер, в той час як скерованість регуляторного впливу екзогенних ПФР (інсуліну і EGF) залежить від рівня активності сигнальних ланок в інтактних зародках. Висунуто гіпотезу про здатність ПФР не тільки стимулювати проліферацію різних типів клітин, а й пригнічувати сигнальні процеси в стимульованих клітинах у просторово-часовий спосіб. 3. Встановлено, що індукція основних морфогенетичних подій в ранньому ембріогенезі (мезодерми, 10 год розвитку, і нейроектодерми, 13 год розвитку) співпадає з пригніченням біосинтезу ДНК, тирозин-специфічного фосфорилювання білків з Mr 105, 90, 66, 30 і 24 кДа, активностей РІ-3- і РІ-4-кіназ та зростанням активності S6-кінази і посиленням Tyr-специфічного фосфорилювання білка з Mr 18 кДа. Виявлені особливості динаміки сигнальних процесів вказують на системний характер регулювання сигнальних мереж у ранньому ембріогенезі в’юна. 4. На моделі Ph1-позитивних клітин еритролейкемії людини лінії К562 з високим рівнем експресії дерегульованої тирозинової кінази р210Bcr-Abl отримано оригінальні дані про те, що рівень її активності, фосфорилювання білків по тирозину, активність ефекторних білків p21Ras і РІ-3-кінази не підтримуються на постійному конститутивному рівні, а володіють коливним характером залежно від фази росту клітинної культури. 5. Показано, що інгібітор тирозинових протеїнкіназ гербіміцин А, індукує еритроїдну диференціацію і викликає пригнічення росту клітин К562, пов’язане, в значній мірі, зі зниженням життєздатності клітин (на 22 %) внаслідок включення апоптичної програми. Індуктор мегакаріоцитної диференціації, пухлинний промотор РМА, також викликає значне зниження клітинного росту (на 67 %), яке не супроводжується індукцією апоптозу. 6. Встановлено, що гербіміцин А індукує тимчасові координовані зміни активності ключових ефекторних ланок р210Bcr-Abl, активацію p21Ras та інгібування активності РІ-3-кінази на 3 год еритроїдної диференціації клітин К562. Подібні зміни активності РІ-3-кінази спостерігаються і в процесі мегакаріоцитної диференціації, індукованої РМА. 7. Показано, що осциляції перебігу сигнальних процесів у лейкемічних клітинах К562 корелюють зі змінами р210Bcr-Abl-залежних надмолекулярних комплексів, до складу яких входять адаптерні білки Cbl, Grb2, Shc і р85? регуляторна субодиниця РІ-3-кінази. 8. Динамічні системні зміни стехіометрії адаптерних білків Grb2, Shc, с-Cbl і р85? регуляторної субодиниці РІ-3-кінази у Bcr-Abl-опосередкованих надмолекулярних комплексах визначають рівень Ras-залежного і РІ-3-кіназного сигналювання в процесі еритроїдної і мегакаріоцитної диференціації клітин К562. 9. Встановлено, що профілі експресії ізоформ Ruk та його ортолога у людини, білка CIN85, їхня субклітинна локалізація та здатність до олігомеризації є специфічними для кожної з досліджених ліній клітин (NIH3T3, Cos1, L1210, HEK293, Ramos, HeLa S3, MDCK, C6, A549, U937). Виявлені зокономірності відображають різну біологічну роль ізоформ Ruk/CIN85 в клітинах різного видового та тканевого походження. 10. Ідентифіковано р85? регуляторну субодиницю РІ-3-кінази, як зв’язувальний партнер адаптерного білка Ruk. Показано, що взаємодія між двома білками носить комплексний характер і опосередковується SH3-доменами і Pro-багатими ділянками як Ruk, так і р85?. 12. У системі in vitro, з використанням очищених бакуловірусних препаратів РІ-3-кінази і Ruk показано, що здатність адаптерного білка інгібувати активність ліпідкінази залежить від стехіометрії Ruk у надмолекулярному комплексі. Максимальний інгібуючий ефект Ruk виявляється при еквімолярному співвідношенні сигнальних білків у комплексі. 13. Продемонстровано, що адаптерний білок Ruk може утворювати комплекси з ендонуклеазою(ами) в клітинах лінії НЕК293 ембріональної нирки людини. Виявлена нуклеазна активність є Мg2+, Ca2+-залежною і інгібується іонами Zn2+ та гепарином. Встановлено, що взаємодія з ендонуклеазою опосередковується С-кінцевим суперспіралізованим районом Ruk. 14. З’ясовано механізми внутрішньо- та міжмолекулярних взаємодій, опосередкованих доменами і мотивами Ruk. Виявлення осциляцій у здатності пролін-багатих мотивів Ruk взаємодіяти з екзогеннними партнерами в процесі TNF?-ідукованого апоптозу клітин U937 свідчить про існування в клітинах динамічної рівноваги між активними (відкритими) і неактивними (закритими внаслідок внутрішньомолекулярних взаємодій) формами адаптерного білка. 15. Встановлено зниження експресії повнорозмірної форми ортолога Ruk у людини, білка CIN85, у переважній більшості досліджених зразків (у 12 випадках з 20) світлоклітинної карциноми нирки людини. ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ Дробот Л.Б., Юрженко В.С., Кусень С.И. Фосфорилирование плазматических мембран клеток зародышей вьюна. 1. Базальное фосфорилирование //Биологические мембраны.-1989.-Т.6, №3.-С.275-282. Дробот Л.Б., Юрженко В.С., Кусень С.И. Эпидермальный фактор роста стимулирует протеинкиназную активность, специфическую к рибосомному белку S6, в бластодерме зародышей в’юна //Молекулярная биология.-1989.-Т.23, №3.-С.872-878. Дробот Л.Б., Кошельник Ю.Р., Шевчук М.Я., Кусень С.И. Влияние инсулина и гуаниловых нуклеотидов на метаболизм полифосфоинозитидов в плазматических мембранах клеток зародышей вьюна (Misgurnus fossilis L.) //Биологические мембраны.-1991.-Т.8, №10.-С.1066-1074. Стойка Р.С., Дробот Л.Б., Сушельницкий С.И., Юрженко В.С., Кошельник Ю.Р., Кусень С.И. Ранние эмбриональные клетки вьюна специфически связывают трансформирующий фактор роста типа бетта //Онтогенез.-1993.-Т.24, №1.-С.38-42. Юрженко В.С., Дробот Л.Б., Барсук Л.С., Кусень С.И. Функциональная активность рецепторов эпидермального роста в клетках ранних зародышей вьюна //Онтогенез.-1993.-Т.24, №3.-С.70-80. Drobot L.B., Yurzhenko V.S., Koshelnik Yu.R., Kusen S.I. Identification and characterization of insulin and epidermal growth factor receptors in loach embryonic cells //Biol. Mem.-1994.-Vol.7, №3.-P.291-299. Drobot L.B., Koshelnick Yu.R., Kusen S.I. GTP-binding proteins in plasma membranes of loach embryonic cells //Membr. And Cell Biol.-1995.-Vol.9, №1.-P.49-56. Вальовка Т.Й., Філоненко В.В., Пальчевський С.С., Великий М.М., Дробот Л.Б., Вотерфілд М., Мацука Г.Х., Гут І.Т. Функціональні та регуляторні особливості кінази рибосомного білка S6 типу бетта //Биополимеры и клетка.-1999.-Т.15, №5.-С.415-421. 10. Вальовка Т.Й., Філоненко В.В., Великий М.М., Дробот Л.Б., Вотерфілд М., Мацука Г.Х., Гут І.Т. Особливості фібронектинзалежної активації кіназ рибосомного білка S6 (S6K1 і S6K2) //Укр. біохім. журн.-2000.-Т.72, №3.-С.31-37. Ільницька О.М., Паливода О.Ю., Гусак Д.М., Вальовка Т.Й., Ігуменцева Н.І., Кусень С.Й., Дробот Л.Б. Аналіз білок-білкових взаємодій, опосередкованих адаптерним білком Grb2, в процесі мегакаріоцитної диференціації клітин еритролейкемії людини лінії К562 //Біополімери і клітина.-1999.-Т.15, №6.-С.501-507. Gout I., Middleton G., Adu J., Ninkina N.N., Drobot L.B., Filonenko V., Matsuka G., Davies A.M., Waterfield M., Buchman V.L. Negative regulation of PI 3-kinase by Ruk, a novel adaptor protein//EMBO J.-2000.-Vol.19, №15.-P.4015-4025. Rzeszowska-Wolny J., Drobot L. Sygnalizacja i zmiany funkcjonowania komorki po uszkodzeniu DNA /In: Na pograniczu chemii I biologii.-Poznan: Wydawnictwo Naukowe UAM.-2003.-T. IV.-S.231-252. Ільницька О.М., Мазур І.Я., Ігуменцева Н.І., Дробот Л.Б. Вивчення регуляції фосфатидилінозит-3-кіназного шляху в процесі гербіміцин А-індукованої еритроїдної диференціації клітин еритролейкемії лінії К562 //Укр. біохім. журн.-2001.-Т.73, №2.-С.31-33. Ільницька О.М., Олексин Г.О., Кусень С.Й., Дробот Л.Б. Регуляція активності фосфатидилінозит-3-кінази в процесі мегакаріоцитної диференціації клітин еритролейкемії людини, індукованої форбол-12-міристат-13-ацетатом //Біополімери і клітина.-2002.-Т.18.-№2.-С.110-114. Дрель В.Р., Паливода О.Ю., Шуваєва Г.Ю., Ігуменцева Н.І., Кіт Ю.Я., Гут І.Т., Бухман В.Л., Дробот Л.Б. Субклітинна локалізація адаптерного білка Rukl у клітинах НЕК293 //Біополімери і клітина.-2002.-Т.18, №4.-С.312-318. Ільницька О.М., Олексин О.Г., Кусень С.Й., Дробот Л.Б. Динаміка процесів диференціації і апоптозу в клітинах еритролейкемії людини лінії К562, індукованих інгібіторами тирозинових протеїнкіназ гербіміцином А і кверцетином //Медична хімія-2002.-Т.4, №4.-С.13-17. Кіт Ю.Я., Шуваєва Г.Ю., Дрель В.Р., Ігуменцева Н.І., Дробот Л.Б. Дослідження експресії дезоксирибонуклеаз у клітинах ссавців методом ренатурації білків у поліакриламідному гелі //Укр. біохім. журн.-2002.-Т.74, №3.-С.100-103. Кіт Ю., Шуваєва Г., Дрель В., Ігуменцева Н., Дробот Л. Дослідження нуклеазної активності клітинних лізатів методом ренатурації білків у поліакриламідному гелі // Вісник Львів. Ун-ту.-2002.-Т.28.-С.28-33. Verdier F., Valovka T., Zhyvoloup A., Drobot L.B., Buchman V., Waterfield M., Gout I. Ruk is ubiquitinated but not degraded by proteasome //Eur. J. Biochem.-2002.-Vol.269, №14.-P.3402-3408. Kit Yu.Ya., Drel V.R., Petriv O.I., Kovalyova V.A., Shuvayeva G.Yu., Palivoda O.Yu., Vovk E.I., Bobak Ya.P., Rzeszowska-Wolny J., Gout I.T., Buchman V.L., Drobot L.B. Adaptor protein Rukl forms protein-protein complexes with endonuclease activity in HEK293 cells //Biochemistry (Moscow).-2003.-Vol.68, №7.-P.810-815. Czajkowski R., Banachewicz W., Ilnytska O., Drobot L.B., Baranska J. Differential effects of P2Y1 and P2Y12 nucleotide receptors on ERK1/ERK2 and phosphatidylinositol 3-kinase signalling and cell proliferation in serum-deprived and nonstarved glioma C6 cells //Br. J. Pharm.-2004.-Vol.141, №3.-P.497-507. Borthwick E.B., Korobko I.V., Courtney L., Drel V.R., Fedyshyn Ya.Ya., Ninkina N., Drobot L.B., Buchman V.L. Multiple domains of Ruk/CIN85/SETA/CD2BP3 are involved in interaction with p85? regulatory subunit of PI 3-kinase //J. Mol. Biol.-2004.-Vol.343, №4.-P.1135-1146. Дробот Л.Б., Петрів О.І., Кіт Ю.Я., Дрель В.Р., Гут І.Т. Вплив адаптерного білка RukL на активність фосфатидилінозит-3-кінази за умов in vitro //Експ. та клін. фізіол. і біохім.-2004.-Т.7, №4.-С.50-59. Шуваєва Г.Ю., Бобак Я.П., Маєвська О.М., Ігуменцева Н.І., Ржепецький Ю.А., Машталір Н.Б., Поспішіль Ю.О., Шуляк О.В., Возіанов С.О., Дробот Л.Б. Експресія адаптерного білка CIN85/Ruk в пухлинах нирки людини //Експ. та клін. фізіол. і біохім.-2004.-Т.7, №4.-С.93-99. Ilnytska O.M., Drel’ V.R., Shuvayeva H.Yu., Havrylov S.V., Fedyshyn Ya.Ya., Mayevska O.M., Ihumentseva N.I., Gout I.T., Buchman V.L., Drobot L.B. Intra- and intermolecular interactions mediated by adaptor protein Ruk/CIN85/SETA //Biopolymers and Cell.-2005.-Vol. 21, №1.-P.48-54. Drobot L., Husak Z., Ilnytska O., Igumentseva N., Oleksyn H., Kusen’ S. Transient activation of Ras-dependent signalling at the early stages of Herbimycin A-induced erythroid differentiation of human erythroleukemia K562 cells //Experimental Oncology.-2005.-Vol. 27, №1.-P.31-37. Дробот Л.Б., Маєвська О.М., Шуваєва Г.Ю., Бобак Я.П., Барська М.Л., Ігуменцева Н.І., Басараба О.І., Федорко О.І. Поліклональні та моноклональні антитіла проти адаптерного Ruk/CIN85 білка: отримання, характеристика, можливості застосування //В зб.: Фундаментальні орієнтири науки (Біологія та науки про Землю і навколишнє середовище).-К.: Академперіодика.-2005.-С.105-118. Drobot L.B., Koshelnik Yu.R., Kusen S.I. GTP?S potentiate inhibition of phosphatidylinositol -3’ kinase by insulin in loach embryo cells //Abstracts of 14th Joint Meeting of British Endocrine Societies/1st Joint Meeting with European Federation of Endocrine Societies.-Warwick (Great Britain).-1995.-P.143. Drobot L.B., Koshelnik Yu.R., Kusen S.I. Enhancement or inhibition of insulin signalling in loach embryonic cells is dependent on stage of development //Abstracts of the Congress of the European Developmental Biology Organization (EDBC-1995).-Toulouse (France).-1995.-P.77. Drobot L. Ruk/CIN85 scaffolding adaptor protein: structural features and role in the signal transduction //Abstracts of 1st (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology.-Lviv (Ukraine).-2004.-P.14. Drobot L.B. Expression profiles of Ruk/CIN85 adaptor/scaffold protein isoforms in human tumors //Ukr.Biokhim.Zh.-Abstracts of 5th Parnas Conference.-Kiev (Ukraine).-2005.-P. 19. Havrylov S., Czajkowski R., Drobot L., Baranska J. Complex pattern of RUK/CIN85 adaptor localization //FEBS Lett.-Abstracts of 30th FBS congress and 9th IUBMB Conference.-Budapest (Hungary).-2005.-P.320. АНОТАЦІЇ Дробот Л.Б. Особливості організації і функціонування сигнальних мереж в нормальних та пухлинних клітинах. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія. – Інститут біології клітини НАН України, Львів, 2005. Дисертація присвячена дослідженню особливостей динаміки сигнальних процесів в нормальних і пухлинних клітинах на моделях зародків тварин, що розвиваються, та трансформованих клітин у культурі, експериментальному обґрунтуванню гіпотези стосовно критичної ролі адаптерних/риштувальних білків в організації і координації сигнальних мереж, їхньої стехіометрії в надмолекулярних сигнальних комплексах у забезпеченні специфічності та інтенсивності внутрішньоклітинного сигналювання. Показано, що основною закономірністю сигнальних процесів в ранньому ембріогенезі костистої риби в’юна (Misgurnus fossilis L.) є їх системний коливний характер, в той час як скерованість регуляторного впливу екзогенних поліпептидних факторів росту (інсуліну і EGF) залежить від рівня активності сигнальних ланок в інтактних зародках (від пригнічення їхньої активності при високому рівні в контролі і, навпаки, до стимуляції – при низькому рівні в контролі). Існування взаємоузгоджених осциляцій сигнальних процесів підтверджено на моделі клітин еритролейкемії людини лінії К562 з високим рівнем експресії онкогенної тирозинової кінази р210Bcr-Abl. Встановлена кореляція між динамічними системними змінами стехіометрії адаптерних білків Grb2, Shc, с-Cbl і р85?, регуляторної субодиниці РІ-3-кінази, в Bcr-Abl-опосередкованих надмолекулярних комплексах і рівнем Ras-залежного і РІ-3-кіназного сигналювання в процесі еритроїдної і мегакаріоцитної диференціації клітин К562, індукованої гербіміцином А і форбол-міристат-ацетатом, відповідно. Показано, що регуляторна р85? субодиниця РІ-3-кінази та ендонуклеаза(и) є зв’язувальними партнерами нового адаптерного білка Ruk, ідентифіковані домени і мотиви сигнальних білків, залучені до міжмолекулярної взаємодії, виявлені осциляції у здатності пролін-багатих мотивів Ruk взаємодіяти з екзогенними лігандами. Встановлено, що здатність адаптерного білка інгібувати активність ліпідкінази залежить від його стехіометрії в надмолекулярному комплексі. Виявлено зниження рівня експресії повнорозмірної форми Ruk у світлоклітинних карциномах нирки людини. Ключові слова: сигнальні мережі, динаміка сигналювання, білково-білкові взаємодії, адаптерні/риштувальні білки. Дробот Л.Б. Особенности организации и функционирования сигнальных сетей в нормальных и опухолевых клетках. – Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.11 – цитология, клеточная биология, гистология. – Институт биологии клетки НАН Украины, Львов, 2005. Диссертация посвящена исследованию особенностей динамики сигнальных процессов в нормальных и опухолевых клетках на моделях развивающихся зародышей животных и трансформированных клеток в культуре, экспериментальному обоснованию гипотезы относительно критической роли адаптерных/стеллажных белков в организации и координации сигнальных сетей, их стехиометрии в надмолекулярных сигнальных комплексах в обеспечении специфичности и интенсивности внутриклеточной сигнализации. Показано, что основной закономерностью сигнальных процессов в раннем эмбриогенезе костистой рыбы вьюна является их системный колебательный характер, в то время как направленность регуляторного влияния экзогенных полипептидных факторов роста зависит от уровня активности сигнальных звеньев в интактных зародышах (от угнетения их активности при высоком уровне в контроле и, наоборот, до стимуляции – при низком уровне в контроле). Существование взаимосогласованных осцилляций сигнальных процессов подтверждено на модели клеток эритролейкемии человека линии К562 с высоким уровнем экспрессии онкогенной тирозиновой киназы р210Bcr-Abl. Установлена корреляция между динамическими системными изменениями стехиометрии адаптерных белков Grb2, Shc, с-Cbl и р85?, регуляторной субъединицы РІ-3-киназы, в Bcr-Abl-опосредованных надмолекулярних комплексах и уровнем Ras-зависимой и РІ-3-киназной сигнализации в процессе эритроидной и мегакариоцитной дифференцировки клеток К562, индуцированной гербимицином А и форбол-миристат-ацетатом, соответственно. Показано, что регуляторная р85? субъединица РI-3-киназы и эндонуклеаза(ы) являются связывающими партнерами адаптерного белка Ruk, идентифицированы домены и мотивы сигнальных белков, вовлеченных в межмолекулярные взаимодействия, выявлены осцилляции в способности пролин-богатых мотивов Ruk взаимодействовать с экзогенными лигандами. Установлено, что способность адаптерного белка ингибировать активность липидкиназы зависит от его стехиометрии в надмолекулярном комплексе. Выявлено снижение уровня экспрессии полноразмерной формы Ruk в светлоклеточных карциномах почки человека. Ключевые слова: сигнальные сети, динамика сигнализации, белково-белковые взаимодействия, адаптерные/стеллажные белки. Drobot L.B. Features of signalling network organization and functioning in normal and tumour cells. – Manuscript. Thesis on the approaching the scientific degree of doctor of biological sciences, field 03.00.11 – cytology, cell biology, histology. – Institute of Cell Biology of National Academy of Sciences of Ukraine, Lviv, 2005. The thesis is devoted to investigation of signalling dynamics in normal and tumour cells using developing embryos and cells in culture as models, and to experimental substantiation of hypothesis concerning critical role of adaptor/scaffold proteins in organization and coordination of signalling networks, their stechiometry in multimolecular complexes providing for specificity and intensity of intracellular signalling. It was established that system-defined wave character is a basic rule of signalling processes during early embryogenesis. Especially, an induction of main morphogenetic events (mesoderm, 10 h of development, and ectoderm, 13 h of development) coincides with decrease of DNA synthesis, tyrosine-specific phosphorylation of proteins with Mr of 105, 90, 66, 30 and 24 kDa, as well as decrease of PI 3- and PI 4-kinases activities and simultaneous increase of S6 kinase activity and tyrosine phosphorylation of protein with Mr of 18 kDa. At the same time, direction of the regulatory action of exogenous polypeptide growth factors (insulin and EGF) depends on the levels of specific signalling components in intact embryos (from decrease of their activity at high level, and, vice versa, increase at low level). The existence of coordinated oscillations of signalling processes was confirmed using the model of human erythroleukemia K562 cells with high expression of oncogenic tyrosine kinase p210Bcr-Abl. It was shown that the level of its activity, phosphorylation of a set of specific proteins on tyrosine, the activity of effector proteins, p21Ras and PI 3-kinase, are not held constant, but reveal oscillatory nature depending on cell culture growth phase. Dynamic system-defined changes of adaptor proteins Grb2, Shc, c-Cbl and p85? regulatory subunit of PI 3-kinase stechiometry in Bcr-Abl-mediated multimolecular complexes define intensities of Ras-dependent and PI 3-kinase signalling in the course of erythroid and megakaryocytic differentiation of K562 cells induced by Herbimycin A or phorbol 12-myristate 13-acetate, respectively. Further studies were devoted to Ruk/CIN85, a member of separate and evolutionary conserved family of SH3-containing adaptor/scaffold proteins It was shown that Ruk/CIN85 isoforms expression, their subcellular distribution as well as the ability to form oligomeric complexes between different isoforms are cell line-specific. Possibly, these features may reflect specific biological role of Ruk/CIN85 isoforms in cell lines of various species and tissue origins. The obtained data suggest also that Ruk may be self-regulated by a physical interaction between its SH3A and, to a less extent, SH3B domains while coiled-coil region mediates oligomerization between different isoforms. p85? regulatory subunit of PI 3-kinase and endonuclease(es) were identified as binding partners of a novel adaptor/scaffold protein Ruk. It was shown that interaction between Ruk and p85? is a complex process involving SH3 domains and proline-rich motifs of both proteins, while binding of endonuclease(es) is mediated by C-terminal coiled-coil region of Ruk. In vitro experiments using purified baculoviral preparations of PI 3-kinase and Ruk, demonstrate that the ability of adaptor protein to inhibit the activity of lipid-kinase is dependent on the stechiometry of Ruk protein in the biologically relevant complex. Oscillations in the ability of Ruk proline-rich motifs to interact with exogenous ligands were revealed, suggesting the existence of the dynamic equilibrium between active (opened) and inactive (closed, resulted from intramolecular interactions) forms of adaptor protein. The decrease of expression of full-length form of Ruk protein was established in the major part of human renal light cell carcinoma samples studied compared to control samples. Key words: signalling networks, dynamics of signalling, protein-protein interactions, adaptor/scaffold proteins. Рис. 8. Фосфорилювання р210Bcr-Abl в анти-c-Abl імунопреципітатах інтактних клітин К562 (контроль) та під впливом гербіміцину А: (а) анти-с-Abl імуно-блотинг загальних лізатів клітин К562; (б) авторадіо-грама продуктів фосфорилювання в анти-с-Abl імуно-преципітатах; (в) динаміка рівня фосфорилювання Bcr-Abl in vivo в інтактних та стимульованих клітинах К562.

Похожие записи