Національна Академія Наук України

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного

крисенко олександр Володимирович

УДК 579.222.6

Особливості катаболічних процесів у стійких до антибіотиків штамів
neisseria gonorrhoeae

03.00.07 – мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі мікробіології та вірусології
Дніпропетровського національного університету.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Вінніков Альберт Іванович,

Дніпропетровський національний університет,

завідувач кафедри мікробіології та вірусології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Варбанець Людмила Дмитрівна,

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України,

завідувач відділу біохімії мікроорганізмів

доктор медичних наук

Поліщук Олена Іванівна,

Інститут епідеміології та інфекційних хвороб

ім. Л.В. Громашевського АМН України,

завідувач лабораторії загальної мікробіології

Провідна організація: Київський національний університет імені Тараса
Шевченка, кафедра мікробіології і загальної імунології, Кабінет
Міністрів України, м. Київ

Захист відбудеться “20 ” вересня 2006 року о 1200 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 по захисту дисертацій при
Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України
за адресою: Д 03680 Київ ДСП, вул. Заболотного, 154.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту мікробіології

і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Д 03680 Київ
ДСП, вул. Заболотного, 154.

Автореферат дисертації розіслано “18“ серпня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук
Пуріш Л.М. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА ДИСЕРТАЦІЙНОЇ РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема розповсюдження стійких до антибіотиків
штамів патогенних бактерій належить до числа найгостріших в сучасній
медицині та біології, оскільки саме антибіотики є найбільш ефективним, а
часто єдиним інструментом в боротьбі із мікробними збудниками
захворювань. Гонокок в цьому плані не є виключенням – відомо про
стійкість гонококів до антибіотиків всіх основних класів (Ray at al.,
2005), включаючи нещодавно запроваджені в медичну практику, а також
множинну резистентність гонококів (Van Duynhoven, 1999). Слід
відзначити, що гонококова інфекція є одним із чинників, що впливає на
репродуктивне здоров’я, а відтак певною мірою і на демографічний стан в
країні. Все це зумовлює окрім суто науково-практичної значимості,
соціально-економічну актуальність проблеми.

Одним із шляхів вирішення проблеми є пошук та впровадження нових
антибіотиків, однак цей підхід не дозволяє остаточно вирішити проблему,
оскільки антибіотикорезистентність у мікроорганізмів формується досить
швидко. Ще одним підходом є застосування одночасно з антибіотиками
препаратів, що пригнічували б ферменти, які забезпечують резистентність
завдяки інактивації антибіотика, проте такий підхід не дає змогу
подолати стійкість, зумовлену іншими механізмами (модифікація мішені,
зниження проникності поверхневих структур клітини та інші). Таким чином,
незважаючи на значну кількість досліджень, проблема залишається далекою
від вирішення.

На сьогодні не викликає сумніву те, що для розв’язання проблеми
антибіотикорезистентності є необхідним детальне дослідження всіх
аспектів, пов’язаних з антибіотикорезистентністю, зокрема метаболізму
бактеріальної клітини. Очевидним є те, що реалізація механізмів
антибіотикостійкості пов’язана як із специфічними, так і загальними
структурно-функціональними змінами в бактеріальній клітині. Все це
зумовлює необхідність найбільш широкого порівняльного вивчення різних
ланок метаболізму чутливих та стійких до антибіотиків штамів, з метою
встановлення метаболічних особливостей, пов’язаних із стійкістю до
антибіотиків. Особливої уваги заслуговують процеси катаболічного обміну,
оскільки і реалізація механізмів стійкості, і розповсюдження генетичних
детермінант антибіотикорезистентності пов’язані з енергозалежними
процесами (Вінніков, 1988).

В цьому плані Neisseria gonorrhoeae залишається недостатньо вивченим
об’єктом. Дані про особливості метаболізму гонококів в зв’язку із
стійкістю до антибіотиків практично відсутні. Все це значно ускладнює
розробку раціональних підходів використання антибіотиків при терапії
гонококових інфекцій.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження,
представлені в роботі, виконані на кафедрі мікробіології та вірусології
Дніпропетровського національного університету, в межах програми
науково-дослідної держбюджетної теми № 4-031-03 “Фізіолого-біохімічні
процеси, які лежать в основі синтезу біологічно активних сполук,
патогенності та взаємовідносин у мікроорганізмів” (№ державної
реєстрації 0103U000560), яка координується планом науково-дослідних тем
Міністерства освіти та науки України.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи був порівняльний аналіз основних
процесів катаболічного обміну у чутливого та стійких до антибіотиків
штамів N. gonorrhoeae.

Реалізація поставленої мети здійснювалась виконанням таких задач:

встановити інтенсивність накопичення кінцевих продуктів шляхів
катаболізму глюкози та вплив на ці процеси специфічного інгібітора
гліколізу;

визначити активність основних ферментів гліколізу, пентозо-фосфатного
циклу, шляху Ентнера-Дудорова;

визначити загальну інтенсивність циклу трикарбонових кислот,
інтенсивність окислювальних, анаплеротичних реакцій та реакцій, що
пов’язують цикл з конструктивним обміном;

дослідити окислювальну активність клітин та мембранних препаратів,
особливості функціонування дихального ланцюга та вплив специфічних
інгібіторів;

встановити показник ліпід-білкового співвідношення в цитоплазматичній
мембрані у стійких та чутливих до антибіотиків штамів гонококів, що
досліджувались.

Об’єктом дослідження були штами N. gonorrhoeae, серед яких чутливий та
стійкі до антибіотиків, антибіотикорезистентність, ферменти та
структурні компоненти клітини.

Предмет дослідження — основні процеси катаболічного обміну та
структурно-функціональні показники цитоплазматичної мембрани чутливого
та стійких до антибіотиків штамів гонококів.

Методи дослідження — мікробіологічні, біохімічні, фізико-хімічні,
хімічні.

Наукова новизна роботи. Вперше проведено порівняльне дослідження
основних катаболічних процесів: гліколізу, пентозофосфатного циклу,
2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатного шляху, циклу трикарбонових кислот в
аеробних та анаеробних умовах у стійких та чутливого до антибіотиків
штамів гонококів.

Вперше показано загальну інтенсифікацію катаболізму глюкози, встановлено
зміну співвідношення шляхів катаболізму глюкози у множинностійких штамів
гонококів: посилення ролі шляху Ентнера-Дудорова та гліколізу, зниження
активності окислювальної ланки пентозофосфатного циклу.

Встановлено зниження загальної інтенсивності циклу трикарбонових кислот
та окислювальних реакцій циклу, водночас із посиленням протоку
інтермедіатів циклу на біосинтетичні процеси у полірезистентних штамів
N. gonorrhoeae, по відношенню до чутливого штаму.

Вперше визначено значення показника співвідношення ліпід/білок
мембранних препаратів гонококів та показано підвищення цього показника у
множинностійких штамів порівняно з чутливим.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані в роботі результати
вказують на відмінності процесів катаболічного обміну та центрального
метаболізму у стійких до антибіотиків штамів гонококів, а тому можуть
стати основою для розробки нових підходів у вирішенні проблеми подолання
антибіотикорезистентності, зокрема застосуванню препаратів, які б
специфічно впливали на окремі метаболічні ланки мікробної клітини, в
першу чергу на процеси енергетичного обміну. Це є підставою для розробки
та вдосконалення схем раціональної антибіотикотерапії, які завдяки
комбінованій дії антибіотиків та препаратів, що впливають на метаболізм
бактеріальної клітини, були б високоефективними по відношенню до стійких
штамів.

Матеріали дисертації увійшли в навчальні програми ряду курсів кафедри
мікробіології та вірусології Дніпропетровського національного
університету: “мікробіологія”, “медична мікробіологія”, “вчення про
антибіотики”, “фізико-хімічні методи в мікробіології”, “сучасні методи
діагностики інфекційних захворювань”.

Особистий внесок здобувача. Робота виконана автором особисто на кафедрі
мікробіології та вірусології ДНУ під керівництвом доктора біологічних
наук, професора Віннікова А.І. Автором особисто проведено аналіз
літературних даних щодо проблем, висвітлених у роботі, здійснено
експериментальні, лабораторні дослідження, аналіз, узагальнення та
обговорення отриманих результатів. Автором самостійно визначена
інтенсивність процесів катаболічного обміну, зокрема, початкових шляхів
катаболізму глюкози (гліколізу, пентозофосфатного циклу, схеми
Ентнера-Дудорова), циклу трикарбонових кислот та анаболічних реакцій,
пов’язаних з циклом у N. gonorrhoeae. Досліджено особливості
функціонування дихального ланцюга, вплив інгібіторів дихання, визначено
співвідношення ліпід/білок в мембранних препаратах. Визначення
чутливості до антибіотиків та культурально-фізіологічних властивостей
досліджених штамів N. gonorrhoeae проведено спільно з ас. Скляр Т.В.,
визначення окислювальної активності проведено спільно з к.б.н., доц.
Голодок Л.П., які є співавторами відповідних публікацій.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи були
представлені на V Міжнародній Конференції “Альянс Франсез”
(Дніпропетровськ, 1998), І Міжнародному конгресі “Актуальні питання
інфектології в акушерстві та гінекології” (Донецьк, 1998), ІІ
Міжнародному конгресі “Актуальні питання інфектології в акушерстві та
гінекології” (Донецьк, 1999), ІІ з’їзді Українського мікробіологічного
товариства (Чернігів, 2000), ІІІ з’їзді Українського біофізичного
товариства (Львів, 2002); VІ Міжнародній Конференції “Наука і освіта” –
2003 (Дніпропетровськ-2003); Х з’їзді Товариства мікробіологів України
(Одеса, 2004), VІІ Міжнародній Конференції “Наука і освіта” – 2005
(Дніпропетровськ, 2005).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 14 наукових праць, із них –
6 статей у фахових виданнях та 8 тез конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу,
огляду літератури (3 розділи), експериментальної частини (4 розділи),
обговорення результатів, висновків, списку цитованої літератури, який
включає 218 найменувань (з яких – 176 іноземні). Робота викладена на
131 стор. машинописного тексту, ілюстрована 18 рисунками і 13 таблицями.

Огляд літератури

Розділ 1. Загальні біологічні властивості N. gonorrhoeae.

Представлено дані щодо морфології, ультраструктури, культуральних та
фізіологічних особливостей гонокока.

Розділ 2. Метаболічні особливості гонококів.

У розділі розглянуто особливості метаболізму гонококів, зокрема шляхи
катаболізму глюкози (гліколіз, пенозофосфатний шлях, шлях
Ентнера-Дудорова), центральний метаболізм (цикл трикарбонових кислот),
структуру дихального ланцюга.

Розділ 3. Резистентність гонококів до антимікробних препаратів.

Представлено біохімічні механізми стійкості N. gonorrhoeae до основних
класів антимікробних препаратів. Розглянуто генетичні аспекти
антибіотикорезистентності (хромосомна, плазмідна резистентність,
поширення детермінант стійкості).

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА

Розділ 4. Матеріали та методи досліджень

Характеристика штамів, що досліджувались. Об’єктом досліджень були штами
N. gonorrhoeae: А, B, C, D, E, що відрізняються за рівнями та спектром
чутливості до антибіотиків, із колекції культур кафедри мікробіології та
вірусології Дніпропетровського національного університету (табл. 1). Всі
штами містять криптичну плазміду (4,2 kb), штам D додатково містить
кон’югативну плазміду (38,9 kb), штам E – Африканську (5,1 kb).

Штами характеризувались типовими для N. gonorrhoeae морфологічними,
фізіологічними та біохімічними ознаками (позитивна оксидазна реакція,
відсутність жовтуватого пігменту, ферментація глюкози з утворенням
кислоти та нездатність до ферментації, мальтози, фруктози, сахарози,
маннози, лактози, відсутність гемолізу, нездатність відновлювати NO3-
здатність синтезувати полісахариди із сахарози).

Визначення мінімальної пригнічуючої концентрації (МПК) антибіотиків
методом серійних розведень та інтерпретацію результатів проводили за
методикою, описаною Lind, 1984.

Таблиця 1

МПК ряду антибіотиків по відношенню до штамів N. gonorrhoeae,

що досліджувались

Штами

Примітка: — — стійкіcть до антибіотика; — помірна
стійкість.

Тс — тетрациклін, Cm — хлорамфенікол, Pn — пеніцилін,

Str — стрептоміцин, Sp — спектиноміцин,

Cfk — цефокситін, Cfr — цефуроксим.

* — штам продукує в-лактамазу

Накопичення біомаси гонококів, одержання суспензії клітин, безклiтинних
гомогенатiв та мембранних препаратів. Культивування та накопичення
біомаси гонококів проводили у рідкому живильному середовищі (бульйон на
основі екстракту бичачого серця, pH 7,2, 1% пептону, 20% сироватки
великої рогатої худоби, 2% гідролізату казеїну, 2% екстракту дріжджів,
глюкози – 2 г/л) при струшуванні та на твердому агаризованому середовищі
аналогічного складу. Культивування проводили при температурі 37 0С в
атмосфері з 10% вмістом СО2 (Овчинніков, 1987). Анаеробне культивування
проводили в анаеростаті в атмосфері 5% СO2, 10% H2, 85% N2, до складу
живильного середовища додатково вносили NaNO2 (5 mМ) в якості кінцевого
акцептора електронів.

Для отримання суспензії “спочиваючих” клітин по досягненні середини
логарифмічної фази росту, клітини осаджували та два рази промивали (0,04
М трис-НСl буфером рН 7,4) центрифугуванням (4000g протягом 15 хвилин),
потiм ресуспендували в тому ж буферi з 5 мМ МgCl2. Отримані суспензії
використовувались в дослідах з визначення інтенсивності дихання та
окислювальної активності. Безклiтинний гомогенат отримували руйнуванням
клiтин на ультразвуковому дезінтеграторi УЗДН-1 з експоненцiальним
випромiнювачем. Застосовували такий режим обробки: акустична потужність
— 20 Вт/см; сила струму 0,28 А; частота коливань 22 кГц, температура
озвучуваної суспензiї не перевищувала 5 оС. Озвучування проводили
протягом 3 хвилин з інтервалами в 30 секунд. Ефективність дезінтеграції
контролювали мікроскопічно. Незруйновані клiтини та фрагменти клiтинної
стiнки осаджували центрифугуванням (22000g протягом 30 хвилин), як
безклітинний гомогенат використовували супернатант. Мембранні препарати
отримували центрифугуванням при 144000 g протягом 70 хвилин, 4 оС. Осад
ресуспендували 0,04 М трис-НСl буфером рН 7,4 з 5 мМ МgCl2.

Визначення інтенсивності накопичення кінцевих продуктів катаболізму
глюкози. Визначення основних метаболітів катаболізму глюкози – ацетату
та лактату — проводили за методами, наведеними у Асатіані (1961).
Визначення інтенсивності накопичення кінцевих продуктів катаболiзму
глюкози в анаеробних умовах проводили при iнкубуваннi в пробiрках
Тунберга (вакуум – 4 мм рт. стовпчика). В експериментах по впливу NаF на
iнтенсивнiсть накопичення кінцевих продуктів катаболізму глюкози
iнгiбiтор вносили в iнкубацiйне середовище в концентрацiї 10-3 М.

Визначення активності ферментів. Визначення активності ферментів
проводили у безклітинних гомогенатах. Активнiсть гексокiнази (КФ
2.7.1.1.) визначали по закисленню середовища iнкубацiї за допомогою
iндикатора крезолового червоного, вимiрюючи оптичну густину при 547 нм.
Активнiсть фруктозодифосфатальдолази (КФ 4.1.2.13.) визначали за
швидкістю відновлення НАД+ з використанням додаткової ферментативної
системи, що містила глiцеральдегід-3-фосфатдегiдрогеназу.
Фосфофруктокiназну (КФ 2.7.1.11.) активність визначали за швидкістю
окислення НАДН з використанням суміжних ферментів –
фруктозо-1,6-дифосфатальдолази, гліцерол-3-фосфатдегiдрогенази та
тріозофосфатізомерази. Активність глюкозо-6-фосфатдегiдрогенази (КФ
1.1.1.49) визначали за методом Kornberg, Horecker (1955), по реакцiї
вiдновлення HAДФ+ при окисленнi глюкозо-6-фосфату. Активнiсть
6-фосфоглюконатдегiдрогенази (КФ 1.1.1.44) визначали за тією ж
методикою, що і глюкозо-6-фосфатдегiдрогенази, як субстрат
використовували натрiєву сiль 6-фосфоглюконату. Активність
фосфоглюкоізомерази (КФ 5.3.1.9) визначали спектрофотометрично за
швидкістю накопичення НАДФН з використанням додаткової ферментної
системи, що містила дегідрогеназу глюкозо-6-фосфату.
2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолазу (КФ 4.1.2.14) визначали за
швидкістю окислення НАДН з використанням додаткової ферментативної
системи, що містила лактатдегідрогеназу. Активнiсть
iзоцитратдегiдрогенази (КФ 1.1.1.42), малік-ензиму (КФ 1.1.1.40),
глутаматдегідрогенази (КФ 1.4.1.2) визначали за швидкiстю вiдновлення
НАДФ+. Активність цитратсинтази (КФ 4.1.3.7.) визначали за утворенням
вiльних SH-груп при використаннi дитiонiтробензоату (ДТНБ) при 412 нм.
Активнiсть фумаратгiдратази (КФ 4.2.1.2) визначали по накопиченню
фумарової кислоти при 250 нм. Активність сукцинатдегідрогенази (КФ
1.3.99.1) визначали за відновленням ферриціаніду калію, вимірюючи
оптичну густину при 420 нм. (-кетоглутаратдегідрогеназу (КФ 1.2.4.2.)
визначали за швидкістю відновлення НАД+. Малатдегідрогеназу (КФ
1.1.1.37) визначали за швидкiстю вiдновлення НАД+ чи окислення НАДН
залежно від напряму реакції. Активність фосфоенолпіруваткарбоксилази (КФ
4.1.1.31) визначали за швидкістю окислення НАДН з використанням
суміжного ферменту – малатдегідрогенази. Активнiсть
аспартатамiнотрансферази (КФ 2.6.1.1) та аланiнамiнотрансферази (КФ
2.6.1.2) визначали колориметричним динiтрофенiлгiдразиновим методом
(Прохорова, 1982).

Спектрофотометричні вимiрювання проводили на “Specord uv vis”
(Німеччина) при 30 оС. Активнiсть ферментiв виражали в нмоль
перетвореного субстрату за 1 хвилину на 1 мг бiлка.

Визначення швидкості дихання та окислення субстратів. Швидкість
ендогенного дихання та окислення субстратів визначали за швидкістю
поглинання кисню полярографічним методом з використанням закритого
електроду типу Кларка (Красильников, 1973).

Інфрачервона спектроскопія мембранних препаратів. Метод інфрачервоної
спектроскопії мембран використовували для визначення співвідношення
ліпід/білок. Вимірювання проводили на ІЧ спектрофотометрі Impact 400
(США), в діапазоні 1400 — 1800 см-1 і 2100 — 3100 см-1. Віднесення смуг
проводили за Беламі (1963).

Білок визначали за методом Lowry (1951).

Статистична обробка результатів. Статистичну обробку результатів 3 — 6
експериментів проводили із застосуванням t-критерію Стьюдента для малих
вибірок на 5% рівні значимості (Лакін, 1990).

Розділ 5. Катаболізм глюкози у чутливого та стійких до антибіотиків
штамів гонокока

Відомо, що кінцевим продуктом аеробного катаболізму глюкози у гонококів
є ацетат, а в анаеробних умовах — ацетат і лактат. Для досліджуваних
штамів швидкість накопичення ацетату в аеробних умовах складала 0,32 —
0,43 мкмоль за 1 год на 1 мг білка, в анаеробних — 0,38 — 0,54 мкмоль за
1 год на 1 мг білка. Швидкість накопичення лактату складала 0,10 — 0,14
мкмоль за 1 год на 1 мг білка (табл. 2). Множинностійкі штами E та D
характеризувались підвищенням швидкості накопичення ацетату на 28,1 –
34,3 % в аеробних та на 39,5 – 42,1 % в анаеробних умовах і лактату на
30,0 – 40,0 % – в анаеробних в порівнянні з чутливим штамом B.

Для з’ясування ролі гліколізу в загальній схемі катаболізму глюкози нами
було досліджено вплив фториду натрію (NaF) в концентрації 10-3 М на
накопичення ацетату і лактату. Присутність NaF пригнічувала накопичення
ацетату в аеробних умовах на 8,3 – 20,9 %, а в анаеробних – на 10,6 –
24,1 % (табл. 2). Накопичення лактату в анаеробних умовах пригнічувалась
на 9,0 – 19,3%. Однак достовірним можна вважати пригнічення накопичення
ацетату та лактату NaF лише для штамів D і Е.

Таблиця 2

Вплив NaF на накопичення кінцевих продуктів катаболізму глюкози цілими
клітинами гонококів за аеробних та анаеробних умов інкубації (M±m)

Штами Neisseria gonorrhoeae

B A C D E

Кількість ацетату, мкмоль за 1 год

на 1 мг білка Аеробні умови NaF 0,29(0,01

0,31(0,02

р( 0,05 0,33(0,01

р( 0,05 0,34(0,02

р< 0,05 0,33(0,04 р< 0,05 контроль 0,32(0,02 0,34(0,04 р( 0,05 0,36(0,02 р( 0,05 0,43(0,05 р< 0,05 0,41(0,01 р< 0,05 % пригнічення 9,4 % 8,8 % 8,3 % 20,9% 19,5% Анаеробні умови NaF 0,33(0,03 0,39(0,02 р( 0,05 0,42(0,05 р( 0,05 0,41(0,07 р< 0,05 0,42(0,04 р< 0,05 контроль 0,38(0,03 0,44(0,05 р( 0,05 0,47(0,02 р( 0,05 0,54(0,04 р< 0,05 0,53(0,03 р< 0,05 % пригнічення 13,1 % 11,4 % 10,6 % 24,1 % 20,8 % ількість лактату, мкмоль за 1 год на 1 мг білка Анаеробні умови NaF 0,089(0,02 0,091(0,01 р( 0,05 0,097(0,01 р( 0,05 0,113(0,02 р< 0,05 0,107(0,02 р< 0,05 контроль 0,10(0,01 0,10(0,02 р( 0,05 0,11(0,02 р( 0,05 0,14(0,01 р< 0,05 0,13(0,01 р< 0,05 % пригнічення 11,0 % 9,0 % 11,8 % 19,3% 17,7% В розвиток отриманих даних було визначено активність ферментів гліколізу, пентозофосфатного циклу та шляху Ентнера-Дудорова (рис.1, 2 ). Для штамів із множинною стійкістю до антибіотиків Е і D встановлено вищу активність першого ферменту в схемі катаболізму глюкози - гексокінази (на 15,8 – 24,8 %), глюкозо-6-фосфатдегідрогенази, що є загальним ферментом для пентозофосфатного циклу та шляху Ентнера-Дудорова (на 11,9 – 28,0 %), альдолази 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконату (на 25,8 – 34,5 %), гліколітичних ферментів: фосфоглюкоізомерази (на 14,6 – 23,6 %), фосфофруктокінази (на 25,3 – 28,9 %) та альдолази фруктозо-1,6-дифосфату (на 26,9 – 34,5 %). Водночас у множинностійких штамів була нижчою на 19,0 – 27,8 % активність 6-фосфоглюконатдегідрогенази – ключового ферменту окислювальної ланки пентозофосфатного циклу. Рис. 2. Порівняння рівнів активності фосфофруктокінази та альдолази фруктозо-1,6-дифосфату в безклітинних гомогенатах досліджуваних штамів гонококів за аеробних та анаеробних умов культивування (за 100% прийнято активність ферменту у штаму В в аеробних умовах) Таким чином, множинностійкі штами характеризуються загальною інтенсифікацією катаболізму глюкози та зміною співвідношення катаболічних шляхів – підвищення інтенсивності шляху Ентнера-Дудорова та зниження інтенсивності окислювальної ланки пентозофосфатного циклу. Розділ 6. Особливості центрального метаболізму у штамів гонококів з різною стійкістю до антибіотиків Катаболізм глюкози у гонококів завершується накопиченням ацетату, який далі остаточно окислюється до СО2 та води в результаті реакцій циклу трикарбонових кислот (ЦТК). Окрім того, що ЦТК є ключовою ланкою катаболізму, цикл також є центральним амфіболічним процесом, так як проміжні продукти циклу можуть бути використані на біосинтетичні потреби. Нами було визначено активність цитратсинтази та дегідрогеназ ізоцитрату, (-кетоглутарату, сукцинату та фумаратгідратази (табл. 3). Таблиця 3 Активність ряду ферментів ЦТК у безклітинних гомогенатах штамів гонококів за різних умов культивування Фермент Умови Активність ферменту, нмоль за 1 хв. на 1 мг білка ( М ( m ) Штам В Штам А Штам С Штам D Штам E Цитратсинтаза Аеробні умови 35,4(2,3 33,9(2,1 р( 0,05 29,4(1,9 р( 0,05 23,0(1,7 р< 0,05 25,1(1,6 i ? J i i ? H L N t ? o Ff ?????? ????l???? ,1(1,9 26,5(1,7 р( 0,05 24,7(2,1 р( 0,05 19,3(1,8 р< 0,05 20,7(1,7 р< 0,05 Ізоцитрат-дегідрогеназа Аеробні умови 42,8(2,6 39,9(1,8 р( 0,05 38,1(2,3 р( 0,05 30,8(1,6 р< 0,05 33,4(1,5 р< 0,05 Анаеробні умови 36,4(2,1 35,3(1,6 р( 0,05 29,4(1,9р( 0,05 22,1(1,7 р< 0,05 26,9(1,8 р< 0,05 (-кетоглутарат-дегідрогеназа Аеробні умови 18,6(0,4 17,6(0,8 р( 0,05 16,9(0,7 р( 0,05 14,3(0,5 р< 0,05 15,1(0,4 р< 0,05 Анаеробні умови 14,9(0,3 14,5(0,5 р( 0,05 13,2(0,9 р( 0,05 12,1(0,7 р< 0,05 11,7(0,9 р< 0,05 Сукцинат-дегідрогеназа Аеробні умови 67,1(2,8 63,5(3,1 р( 0,05 56,6(3,6 р< 0,05 51,4(4,7 р< 0,05 53,4(2,5 р< 0,05 Анаеробні умови 64,3(2,6 55,7(3,7 р( 0,05 47,5(3,2 р< 0,05 45,7(3,4 р< 0,05 47,1(3,8 р< 0,05 Фумараза Аеробні умови 14,8(0,7 15,5(0,4 р( 0,05 16,1(0,7 р( 0,05 19,7(0,8 р< 0,05 18,6(0,5 р< 0,05 Анаеробні умови 9,6(0,3 10,1(0,6 р( 0,05 9,9(0,5 р( 0,05 13,5(0,6 р< 0,05 13,0(0,5 р< 0,05 Аналіз активності ферментів ЦТК досліджуваних штамів показав зниження активності цитратсинтази на 28,9 – 35,0 % та ізоцитратдегідрогенази (на 21,9 – 39,3 %), (-кетоглутаратдегідрогенази (на 18,8 – 23,1 %) та сукцинатдегідрогенази (на 20,4 – 28,9 %) у полірезистентних штамів D та E в порівнянні з чутливим до антибіотиків штамом В, що можна розглядати як свідчення зниження інтенсивності окислювальних процесів циклу у цих штамів. У всіх штамів відмічено зниження активності вказаних ферментів ЦТК в анаеробних умовах порівняно з аеробними. Слід відзначити, що в безклітинних гомогенатах всіх досліджуваних штамів не було виявлено активність малатдегідрогенази. Водночас, штами із множинною стійкістю характеризувались вищою активністю фумаратгідратази (на 25,7 – 40,6 %), яка, окрім забезпечення нормального функціонування ЦТК, є проміжною ланкою процесу включення продуктів перетворення ряду амінокислот та жирів в цикл (табл. 3). Активність ферментів, що каталізують анаплеротичні реакції, також була вищою у множиннорезистентних штамів: малік-ензиму - на 36,3 – 48,4 %, фосфоенолпіруваткарбоксилази - на 41,8 – 48,7 % (табл. 4). Таблиця 4 Активність анаплеротичних ферментів у безклітинних гомогенатах штамів гонококів за різних умов культивування Фермент Умови Активність ферменту, нмоль за 1 хв. на 1 мг білка ( М ( m ) Штам В Штам А Штам С Штам D Штам E Малік-ензим Аеробні умови 35,3(2,0 37,9(2,4 р( 0,05 38,2(2,6 р( 0,05 52,4(3,5 р< 0,05 48,1(2,9 р< 0,05 Анаеробні умови 39,7(2,5 40,9(2,1 р( 0,05 42,4(2,3 р( 0,05 58,0(2,9 р< 0,05 56,3(2,7 р< 0,05 Фосфоенол-піруват-карбоксилаза Аеробні умови 11,7(0,5 12,3(0,8 р( 0,05 12,6(0,7 р( 0,05 17,4(0,6 р< 0,05 16,8(0,9 р< 0,05 Анаеробні умови 9,8(0,4 10,1(0,6 р( 0,05 10,9(0,7 р( 0,05 14,2(0,9 р< 0,05 13,9(0,5 р< 0,05 Реакцією, що безпосередньо пов’язує ЦТК (та вуглеводний обмін) з амінокислотним обміном, є взаємоперетворення (-кетоглутарату та глутамату, який є центральною сполукою обміну амінокислот. Глутамат може утворюватись також з аланіну та аспарагінової кислоти під дією аланін- та аспартатамiнотрансфераз. Множинностійкі штами D та E характеризувались вищим на 87,3 % і 84,4 % в аеробних та на 75,6 % і 70,1 % відповідно в анаеробних умовах рівнем активності глутаматдегідрогенази в порівнянні з чутливим штамом В (табл. 5). Таблиця 5 Активність глутаматдегідрогенази та аспартатамiнотрансферази в безклітинних гомогенатах штамів гонококів за різних умов культивування Фермент Умови Активність ферменту, нмоль за 1 хв. на 1 мг білка (М ( m) Штам В Штам А Штам С Штам D Штам E Глутамат- дегідрогеназа Аеробні умови 21,2(1,5 20,9(1,3 р( 0,05 22,4(1,8 р( 0,05 39,7(2,2 р< 0,05 39,1(2,5 р< 0,05 Анаеробні умови 25,4(1,3 26,8(1,6 р( 0,05 27,9(1,5 р( 0,05 44,6(2,4 р< 0,05 43,2(2,0 р< 0,05 Аспартатамiно- трансфераза Аеробні умови 29,3(1,7 30,8(1,5 р( 0,05 32,1(1,6 р( 0,05 41,4(2,1 р< 0,05 38,7(1,7 р< 0,05 Анаеробні умови 34,1(1,9 35,7(1,6 р( 0,05 36,3(1,7 р( 0,05 49,8(2,3 р< 0,05 47,2(2,4 р< 0,05 Активність аспартатамінотрансферази у штамів D та Е була вищою в порівнянні з чутливим штамом В на 41,3 % та 32,1 % відповідно в аеробних умовах та на 46,0 % і 38,4 % відповідно в анаеробних (табл. 5). Активність аланінамінотрансферази у досліджуваних штамів не виявлено. Приведені в розділі дані свідчать про зниження інтенсивності окислювальних реакцій циклу трикарбонових кислот та посилення спрямованості потоку інтермедіатів на біосинтетичні потреби у штамів N. gonorrhoeae, з множинною стійкістю до антибіотиків. Розділ 7. Особливості окислювальних процесів у штамів, що досліджувались Як відомо, найбільш ефективним способом отримання енергії є аеробне окислення до води та вуглекислоти. У зв’язку з цим, як інтегральний показник інтенсивності катаболічних процесів можна розглядати швидкість ендогенного дихання та дихання в присутності ряду екзогенних субстратів. Динаміка ендогенного дихання суспензій спочиваючих клітин досліджуваних штамів свідчить про те, що найбільш інтенсивно окислювальні процеси перебігають в експоненціальній та початку стаціонарної фази, що пов’язано з високою метаболічною активністю клітини і, як наслідок, значними витратами енергії. В стаціонарній фазі процеси первинного метаболізму уповільнюються та відмічається різке зниження потреб в енергії (рис. 3). Суттєвих відмінностей в швидкості ендогенного дихання для чутливих та стійких штамів не відмічено, однак стійкі штами (C, D, E) характеризувались дещо вищою швидкістю ендогенного дихання в порівнянні із чутливим штамом В (рис.3). Найбільш інтенсивно суспензією спочиваючих клітин окислялася глюкоза. Слід відзначити менш інтенсивне окислення пірувату, ацетату, фумарату, малату, сукцинату, оксалоацетату, б-кетоглутарату клітинами множинностійких штамів D і Е. Мембранні препарати штамів з множинною стійкістю до антибіотиків характеризувались вищим рівнем окислювальної активності по відношенню до лактату та НAДH і нижчим рівнем - по відношенню до сукцинату в порівнянні з чутливим штамом B. За інтенсивністю окислення малату достовірних відмінностей серед штамів, що досліджувались, не було. Швидкість дихання в присутності вказаних субстратів пригнічувалась KCN (максимально на 72,4±2,1 – 72,9±3,3 %), ротенон пригнічував лише окислення НАДН (максимально на 63,3±2,4 %). Відмінностей в чутливості до даних інгібіторів у досліджуваних штамів не виявлено. З метою порівняння кількісного складу білкового та ліпідного компоненту в мембранних препаратах штамів гонококів з різними спектрами та рівнями стійкості до антибіотиків, нами було визначено співвідношення ліпід/білок для штамів, що досліджувались. Наші дослідження показали, що для штаму D з множинною стійкістю (пеніцилін, тетрациклін, стрептоміцин), показник ліпід/білок був у 1,56 рази, а для іншого полірезистентного штаму E та стійкого до стрептоміцину штаму С - у 1,16 рази вищим від цього показника для чутливого штаму (табл. 6). Таблиця 6 Співвідношення ліпід/білок в мембранних препаратах досліджуваних штамів гонококів Штами N. gonorrhoeae Стійкістьсть до антибіотиків Співвідношення ліпід/білок (М ( m) A Sp 0,26±0,01, р( 0,05 B - 0,25±0,01 C Str, (Pn,Tc)* 0,29±0,01, р< 0,05 D Pn, Tc,Str, (Cm, Cfr,Cfk)* 0,39±0,02, р< 0,05 E Pn, Str, (Tc)* 0,29±0,01, р< 0,05 Примітка:( )* - помірна стійкість Тс - тетрациклін, Cm - хлорамфенікол, Pn - пеніцилін, Str - стрептоміцин, Sp - спектиноміцин, Cfk - цефокситін, Cfr - цефуроксим Ймовірно, встановлене підвищення вмісту ліпідного компоненту в структурі мембрани, може створювати додатковий бар’єр для проникнення антибіотиків в клітину та впливати на метаболічну функцію мембрани. Таким чином, узагальнюючи результати роботи, можна відмітити суттєві зміни катаболічного обміну, інтенсифікацію ряду реакцій, що пов'язують катаболізм з біосинтетичними процесами, зміни в складі мембранних структур у множинностійких штамів гонококів. Представлені дані вказують на комплексні структурно-функціональні перебудови бактеріальної клітини, що пов’язані з множинною стійкістю, та становлять в зв’язку з цим певний інтерес для з’ясування загальних закономірностей розвитку і реалізації антибіотикорезистентності та пошуку нових підходів у вирішенні проблеми. ВИСНОВКИ Штами N. gonorrhoeae з множинною стійкістю до антибіотиків характеризуються загальною інтенсифікацією катаболізму глюкози, зниженням активності окислювальних реакцій ЦТК з одночасним посиленням потоку інтермедіатів на біосинтетичні потреби, змінами в структурно-функціональних характеристиках цитоплазматичної мембрани, що є теоретичними основами для розробки нових підходів у антимікробній терапії гонококової інфекції. Для множинностійких штамів гонококів встановлено підвищення інтенсивності накопичення кінцевих продуктів катаболізму глюкози (ацетату на 28,1 – 34,3 % в аеробних та на 39,5 – 42,1 % в анаеробних умовах і лактату на 30,0 – 40,0 % - в анаеробних), що вказує на інтенсифікацію катаболізму глюкози у цих штамів. Множинностійкі штами гонококів характеризуються на 19,0 - 27,8 % нижчою активністю 6-фосфоглюконатдегідрогенази, що вказує на меншу інтенсивність у них окислювальної ланки пентозофосфатного циклу. Полірезистентні штами гонококів характеризуються більш високою активністю 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолази (на 25,8 - 34,5 %), фосфофруктокінази (на 25,3 - 28,9 %) та альдолази фруктозо-1,6-дифосфату (на 26,9 - 34,5 %), що дозволяє зробити припущення про інтенсифікацію шляху Ентнера-Дудорова та гліколізу у цих штамів. Встановлено зниження активності цитратсинтази на 28,9 – 35,0 % та дегідрогеназ ізоцитрату, (-кетоглутарату та сукцинату на 18,8 – 39,3 %, а також зниження інтенсивності окислення ацетату та ряду субстратів ЦТК у полірезистентних штамів в порівнянні з чутливим до антибіотиків штамом, що можна розглядати як свідчення зниження інтенсивності окислювальних процесів циклу трикарбонових кислот у стійких до антибіотиків штамів N. gonorrhoeae. Для множинностійких штамів гонококів встановлено підвищення активності фумаратгідратази - на 25,7 – 40,6 %, ферментів анаплеротичних реакцій (малік-ензиму - на 36,3 – 48,4 %, фосфоенолпіруваткарбоксилази - на 41,8 – 48,7 %) та ферментів конструктивного обміну, пов’язаних з ЦТК (глутаматдегідрогенази – на 70,1 % – 87,3 %, аспартатамінотрансферази – на 32,1 – 46,0 %), що свідчить про інтенсифікацію спрямованості ЦТК на біосинтетичні потреби. Швидкість дихання в присутності НАДН, малату, сукцинату та лактату пригнічувалась KCN (максимально на 72,4±2,1 – 72,9±3,3 %), ротенон пригнічував лише окислення НАДН (максимально на 63,3±2,4 %), що вказує на асоціацію дегідрогеназ сукцинату та лактату з дихальним ланцюгом на рівні коензиму Q. Відмінностей в чутливості до даних інгібіторів у досліджуваних штамів не виявлено. Вперше встановлено співвідношення ліпід/білок мембранних препаратів гонококів, що складає 0,25±0,01 – 0,39±0,02. У множинностійких штамів цей показник в 1,16 – 1,56 рази вищий ніж у чутливого штаму, що вказує на підвищений вміст ліпідного компоненту мембрани, та, як наслідок, – зниження проникності мембрани для антибіотиків у резистентних штамів. Список робіт, опублікованих за темою дисертації Крисенко О.В., Вінніков А.І. Активність ферментів циклу трикарбонових кислот у стійких та чутливих до антибіотиків штамів Neisseria gonorrhoeae // Микробиол. журнал, 2004. - Т. 66, № 6. - С. 3 - 9. (Здобувачем особисто визначено активність ферментів циклу трикарбонових кислот стійких та чутливих до антибіотиків штамів Neisseria gonorrhoeae). Крысенко А.В., Скляр Т.В., Козицкая С.Н., Голодок Л.П., Винников А.И. Окислительная активность и накопление конечных продуктов обмена у плазмидсодержащих штаммов гонококка и стафилококка // Микробиол. журнал, 2001, - Т.63, №6. - С. 19-25. (Здобувач особисто визначив швидкість накопичення кінцевих продуктів катаболізму глюкози та окислювальну активність у чутливого та стійких до антибіотиків штамів гонококів). Крысенко А.В., Скляр Т.В., Винников А.И. Вопросы антибиотикоустойчивости бактерий Neisseria gonorrhoeae // Вісник ДДУ. Біологія. Екологія, 2000. - № 7. - С. 122-126. (Здобувач особисто провів інформаційний пошук стосовно проблеми антибіотикостійкості Neisseria gonorrhoeae ). Скляр Т.В., Крысенко А.В., Винников А.И. Сравнение питательных сред для культивирования Neisseria gonorrhoeae // Микробиол. журнал, 1997. - Т.59, №1. - С.82-86. (Здобувач провів оптимізацію поживного середовища для культивування Neisseria gonorrhoeae, провів аналіз отриманих даних). Скляр Т.В., Крысенко А.В., Гаврилюк В.Г., Винников А.И. Сравнение параметров развития культур Neisseria gonorrhoeae и Staphylococcus аureus на питательных средах различного состава // Микробиол. журнал, 1998. - Т.60, №1. - С.25-31. (Здобувач провів порівняльний аналіз параметрів росту періодичних культур гонококів та стафілококів). Черватюк Н.В, Крысенко А.В., Винников А.И. Обмен веществ у микроорганизмов и синтез вторичных метаболитов // Вісник ДДУ. Біологія. Екологія, 2002. – Т.1, № 10. - С. 123-128. (Здобувач особисто провів аналіз літературних даних стосовно процесів обміну речовин у мікроорганізмів). Krissenko O., Skliar Т., Vinnikov A. Particularites de la croisance de Neisseria gonorrhoeae dans un boullon colture // Actes de la V-e Conference Inter. France et Ukraine, 1998, Dniepropetrovsk. - V.3. - P. 68-69. Крысенко А.В., Скляр Т.В., Винников А.И. Антибиотикоустойчивость клинических штаммов Neisseria gonorrhoeae // Мат. Междунар. конгресса “Актуальные вопросы инфектологии в акушерстве и гинекологии”. Донецк, 1998. - Т.2. - С. 30. Крысенко А.В., Скляр Т.В., Винников А.И. Физиолого-биохимические различия представителей рода Neisseria, значимые для идентификации // Мат. II Междунар. конгресса “Актуальные вопросы инфектологии в акушерстве и гинекологии”. Донецк, 1999. - С. 2. Крысенко А.В., Скляр Т.В., Голодок Л.П., Винников А.И. Активность катаболических процессов у стафилококков и гонококков, содержащих плазмиды устойчивости к антибиотикам // Матеріали з’їзду Українського мікробіологічного товариства, Чернігів, 2000. Бюлетень інституту сільськогосподарської мікробіології, 2000. - №8. - С. 39-41. Крисенко О.В., Вінніков А.І. Інфрачервоні спектри мембранних препаратів стійких та чутливих до антибіотиків штамів Neisseria gonorrhoeae // Тези доповідей ІІІ з?їзду Українського біофізичного товариства. – Львів, 2002. – С. 95. Крисенко О.В., Вінніков А.І. Інтенсивність накопичення кінцевих продуктів катаболізму глюкози у стійких та чутливих до антибіотиків штамів гонококів // Мат. VI Міжнар. науково-практичної конференції “Наука і освіта 2003”. Дніпропетровськ-Донецьк-Харків, 2003. – Т.2. – С. 55-57. Крисенко О.В., Вінніков А.І. Особливості функціонування циклу трикарбонових кислот у чутливих та стійких до антибіотиків штамів Neisseria gonorrhoeae // Х з?їзд Товариства мікробіологів України. Одеса, 2004. – С. 134. Крисенко О.В., Вінніков А.І. Активність ряду реакцій конструктивного обміну, пов?язаних з циклом трикарбонових кислот у стійких та чутливих до антибіотиків штамів Neisseria gonorrhoeae // Мат. VІІ Міжнар. науково-практичної конференції “Наука і освіта 2005”. Д., 2005. - Біологія. – Т. 10. – С. 19-21. Анотація Крисенко О.В. Особливості катаболічних процесів у стійких до антибіотиків штамів Neisseria gonorrhoeae. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2006. Дисертація присвячена дослідженню шляхів катаболізму глюкози, центрального метаболізму та структурно-функціональних особливостей мембран у чутливого та стійких до антибіотиків штамів гонокока. Показано, що множинностійкі штами гонококів характеризуються інтенсифікацією реакцій шляху Ентнера-Дудорова та гліколізу водночас із зниженням інтенсивності окислювальної ланки пентозо-фосфатного циклу. У вказаних штамів активність 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолази вища на 25,8 - 34,5 %, фосфофруктокінази на 25,3 - 28,9 % та альдолази фруктозо-1,6-дифосфату на 26,9 - 34,5 %, активність 6-фосфоглюконатдегідрогенази нижча на 19,0 - 27,8 %. Встановлено зниження активності цитратсинтази на 28,9 – 35,0 % та дегідрогеназ ізоцитрату, (-кетоглутарату та сукцинату на 18,8 – 39,3 %, а також зниження швидкості окислення ацетату та ряду субстратів ЦТК у полірезистентних штамів, водночас із підвищенням активності фумаратгідратази (на 25,7 – 40,6 %), ферментів анаплеротичних реакцій (малік-ензиму та фосфоенолпіруват карбоксилази на 36,3 – 48,7 %) та ферментів конструктивного обміну, пов’язаних з ЦТК (глутаматдегідрогенази на 70,1 – 87,3 %, аспартатамінотрансферази на 32,1 – 46,0 %), що свідчить про інтенсифікацію спрямованості ЦТК на біосинтетичні потреби. Показано, що швидкість дихання в присутності ряду екзогенних субстратів пригнічувалась KCN (максимально на 72,4±2,1 – 72,9±3,3 %), ротенон пригнічував лише окислення НАДН (максимально на 63,3±2,4 %). Відмінностей в чутливості до даних інгібіторів у досліджуваних штамів не виявлено. Визначено показник співвідношення ліпід/білок (0,25±0,01 – 0,39±0,02) мембранних препаратів досліджуваних штамів. У більшості антибіотикорезистентних штамів цей показник в 1,16 – 1,56 рази вищий порівняно з чутливим штамом, що вказує на підвищений вміст ліпідного компоненту мембрани. Ключові слова: Neisseria gonorrhoeae, антибіотикорезистентність, катаболізм глюкози, цикл трикарбонових кислот, дихання. АННОТАЦИЯ Крысенко А.В. Особенности катаболических процессов у устойчивых к антибиотикам штаммов Neisseria gonorrhoeae. – Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 – микробиология. – Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2006. Диссертация посвящена исследованию путей катаболизма глюкозы, центрального метаболизма и структурно-функциональных особенностей мембран у чувствительного и устойчивых к антибиотикам штаммов гонококка. Показано, что множественноустойчивые штаммы гонококков характеризуются повышением скорости накопления ацетата на 28,1 – 34,3 % в аэробных и на 39,5 - 42,1 % в анаэробных условиях и лактата на 30,0 - 40,0 % – в анаэробных. Присутствие NaF ингибировало накопление ацетата в аэробных условиях на 8,3 – 20,9 %, а в анаэробных – на 10,6 - 24,1 %. Накопление лактата в анаэробных условиях ингибировалось на 9,0 – 19,3 %. Установлена интенсификация реакций пути Ентнера-Дудорова и гликолиза, вместе со снижением интенсивности окислительного звена пентозо-фосфатного цикла у множественноустойчивых штаммов. У указанных штаммов активность 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолазы выше на 25,8 - 34,5 %, фосфофруктокиназы на 25,3 - 28,9 % и альдолазы фруктозо-1,6-дифосфата на 26,9 - 34,5 %, активность 6-фосфоглюконатдегидрогеназы ниже на 19,0 - 27,8 %. Установлено снижение активности цитратсинтазы на 28,9 – 35,0 % и дегидрогеназ изоцитрата, б-кетоглутарата и сукцината на 18,8 – 39,3 %, а также снижение скорости окисления ацетата и ряда субстратов ЦТК у полирезистентных штаммов, на фоне повышения активности фумаратгидратазы (на 25,7 – 40,6 %), ферментов анаплеротических реакций (малик-ензима и фосфоенолпируват-карбоксилазы на 36,3 – 48,7 %) и ферментов конструктивного обмена, связанных с ЦТК (глутаматдегидрогеназы на 70,1 – 87,3 %, аспартатаминотрансферазы на 32,1 – 46,0 %), что свидетельствует об интенсификации направленности ЦТК на биосинтетические потребности. Наиболее интенсивно суспензией покоящихся клеток окислялась глюкоза. Следует отметить менее интенсивное окисление пирувата, ацетата, фумарата, малата, сукцината, оксалоацетата, б-кетоглутарата клетками множественноустойчивых штаммов. Показано, что скорость дыхания в присутствии НАДН, малата, сукцината и лактата ингибировалась KCN (максимально на 72,4±2,1 % – 72,9±3,3 %), ротенон ингибировал только окисление НАДН (максимально на 63,3±2,4 %). Отличия в чувствительности к данным ингибиторам у исследуемых штаммов не выявлены. Определен показатель соотношения липид/белок (0,25±0,01 – 0,39±0,02) мембранных препаратов исследуемых штаммов. У большинства антибиотикорезистентных штаммов этот показатель в 1,16 – 1,56 раза выше по сравнению с чувствительным штаммом, что указывает на повышенное содержание липидного компонента мембраны. Ключевые слова: Neisseria gonorrhoeae, антибиотикорезистентность, катаболизм глюкозы, цикл трикарбоновых кислот, дыхание. THE SUMMARY Krysenko A.V. Peculiarities of catabolic processes in antibiotics resistant Neisseria gonorrhoeae strains. - Manuscript. Dissertation for scientific degree of candidate of biological science by speciality 03.00.07 – Microbiology – Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2006. The dissertation is devoted to a research of glucose catabolism pathways, central metabolism and structural and functional peculiarities of membranes in sensitive and resistant to antibiotics Neisseria gonorrhoeae strains. It is shown that multiresistant gonococcus strains are characterized by intensification of reactions of Entner-Doudoroff pathway and glycolysis, with intensity of the oxidative link of pentose phosphate cycle decreasing at the same time. In the strains specified the 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase activity is 25,8 - 34,5 % higher, phosphofructokinase activity is 25,3 - 28,9 % higher and fructose 1,6-diphosphate aldolase activity is 26,9 - 34,5 % higher, the 6-phosphogluconate dehydrogenase activity is 19,0 - 27,8 % lower. There has been observed a decrease in citrate synthase activity by 28,9 – 35,0 % and dehydrogenases of isocitrate, 2-ketoglutarate and succinate by 18,8 – 39,3 %, and also a decrease of acetate and some tricarboxylic acid cycle (TCA cycle) substrates oxidation rate in multiresistant strains, on a background of rising activity of fumarase (by 25,7 – 40,6 %), enzymes catalyzing anapleurotic reactions (malic enzyme and PEP-carboxylase by 36,3 – 48,7 %) and enzymes of a constructive metabolism connected with TCA cycle (glutamate dehydrogenase by 70,1 – 87,3 %, aspartate aminotransferase by 32,1 – 46,0 %), which testifies to intensified orientation of TCA cycle to biosynthetic needs. It is shown that breathing rate at the presence of some exogenous substrates was inhibited by KCN (by 72,4±2,1 – 72,9±3,3 % at the maximum), rotenone only inhibited NADH oxidation (by 63,3±2,4 % at the maximum). There have been noticed no differences in sensitivity to the given inhibitors in the strains investigated. The lipid/protein index (0,25±0,01 - 0,39±0,02) of membranous preparations of the given strains has been determined. The majority of antibiotic resistant strains have a 1,16 - 1,56 times higher index compared to the sensitive strain, which testifies to an extra content of a membrane lipid component. Key words: Neisseria gonorrhoeae, antibiotic resistance, glucose catabolism, tricarboxylic acid cycle, respiration. PAGE 1 PAGE 16

Похожие записи