МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ
Одеський державний медичний університет
Гладчук Ігор Зіновійович
УДК 618.1-089:616-072.1
ОПЕРАТИВНА ЕНДОСКОПІЯ В КОМПЛЕКСНОМУ ЛІКУВАННІ ЖІНОЧОЇ БЕЗПЛІДНОСТІ
14.01.01-АКУШЕРСТВО ТА ГІНЕКОЛОГІЯ
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора медичних наук
Одеса – 1999
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Одеському державному медичному університеті
Науковий консультант:
Доктор медичних наук, професор, чл.-кор. АМН України Запорожан Валерій Миколайович Одеський державний медичний університет завідувач кафедри акушерства та гінекології
Офіційні опоненти:
Доктор біологічних наук, професор, Іванюта Лідія Іванівна, Інститут педіатрії, акушерства та гінекології АМН України, завідувач відділенням реабілітації репродуктивної функції жінок, м. Київ
Доктор медичних наук, професор, Леуш Станіслав Сергійович, Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика , завідувач кафедри акушерства та гінекології №1
Доктор медичних наук, професор, Зелінський Олександр Олексійович, Одеський державний медичний університет, завідувач кафедри перинатальної медицини. Дитячої та підліткової гінекології
Провідна установа: Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця, кафедра акушерства та гінекології №1
Захист відбудеться “ 24 ” травня 1999 р. о 13-00 год.
на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.600.01 при Одеському державному медичному університеті (270026, м. Одеса, провулок Валіховський, 2).
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Одеського державного медичного університету (270026, м. Одеса, провулок Валіховський,3).
Автореферат розісланий “ 25 ” квітня 1999 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
професор В. М. Демідов
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. останнє десятиріччя характеризується значним погіршенням екологічної ситуації, що природньо відображується на здоров’ї населення України та тривалості життя людини. Одним із провідних факторів такої ситуації є те, що у середовищі проживання сучасної людини існує близько 6 млн. хімічних сполук, які надходять до її організму з повітрям, водою та їжею в підвищених концентраціях, а інактивація цих сполук відбувається в печінці. Більшість цих сполук мають виразні гепатотропні властивості, що приводить до виникнення гострих та хронічних гепатитів (Э. Н. Баркова, 1994; Г. Х. Божко, 1990).
Дослідженню впливу токсичних сполук на морфологічний стан печінки сьогодні присвячена значна кількість експериментальних та клінічних робіт. У виконаних роботах досліджені метаболізм вуглеводів, вітамінів (В. Е. Ланкин, 1987; М. И. Бушма, 1987; Ю. И. Губский. 1990), активність різних ферментів, процеси пероксидації (Ю. И. Губский, 1991; З. К. Зиямутдинова,1991; А. С. Логинов, 1991) енергетичний обмін (В. В. Белоусова, 1995). Більшість авторів вважають, що тим інтимним механізмом, який відіграє ключову роль в патогенезі токсичного ураження є активація вільнорадикального окислення (Ю. И. Губский, 1991; А. С. Логинов). У літературі також є окремі повідомлення, які стосуються функціонування, як ферментативної так і неферментативної антиоксидантної системи. Не дивлячись на таку кількість робіт, до цього часу немає цілісного уявлення про те, що лежить в основі деструктивних змін в печінковій клітині і яким чином ці зміни відображаються на показниках крові. Таке явище, вірогідно, зв’язане з різними підходами до постановки експерименту, відсутністю системності вивчення патологічного процесу. На жаль у всьому різноманітті літературних даних, що торкаються патогенезу токсичних гепатитів немає єдиної думки, щодо пускових механізмів ураження, тобто тих первинних змін які передують гістологічним проявам порушення структури органу, не досліджені також механізми первинної реакції і в самому гепатоциті на дію агента і яким чином вони можуть бути відображеними на біохімічних показниках крові.
На сьогодення в медичній науці достатньо широко дискутуються питання про “критичні” метаболічні процеси, “критичні”органи та тканини, а також “критичні” клітини та клітинні структури які формують первинну реакцію – відповідь на дію будь-якого несприятливого фактору як зовнішнього так і внутрішнього середовища. З цієї точки зору до таких “критичних” систем необхідно віднести процеси, що забезпечують репродукцію клітини і перш за все роль хроматину, який являє собою специфічний комплекс ДНК з ядерними білками. На підставі того, що міжнуклеосомна деградація хроматину являє собою складний процес, то в цьому відношенні є важливим дослідження механізмів послідовних етапів експресії генома, транскрипції, процесингу та виходу РНК з ядер. Відомо (В. П. Кушнер, 1988), що в регуляції процесів транскрипції важливу роль відіграють білки хроматину, які виконують як неспецифічний (гістони), так і специфічний (негістонові білки) контроль. Порушення ДНК-білкових взаємодій в хроматині і зв’язані з цим зміни транскрипції у клітинах ураженого організму обумовлюються, як порушеннями первинної структури, так і змінами заряду білкової молекули (Н. Д. Кобец, 1991). В зв’язку з цим, дослідження модифікацій білків хроматину, яка є динамічним і мобільним процесом, може бути одним із ранніх критеріїв оцінки стану гепатоцитів. Сприймаючи до уваги універсальну роль циклічних нуклеотидів у регуляції метаболічних процесів на різних рівнях організації організму, ми вважаємо, що вивчення їх вмісту та взаємовідношень між собою при токсичних ураженнях печінки, дозволить з’ясувати особливості взаємозв’язку їх з модифікаційними змінами білків. Крім того, суттєвим моментом у цьому аспекті є дослідження стану і взаємовідносин у системі ПОЛ-АОС, а також характерних особливостей функціональної взаємодії цієї системи з врахуванням наведених вище процесів.
Враховуючи той факт, що багатьма експериментальними дослідженнями доведена спільність деяких механізмів ушкодження клітин печінки при вірусних гепатитах, та гепатитах, викликаних дією ССl4, то розробка названих питань дозволить розкрити раніше не відомі патофізіологічні механізми токсичного ураження печінки, з’ясувати, яким чином деструктивні зміни в клітинах печінки відображаються на клініко-лабораторних показниках периферійної крові та екстраполювати їх на аналогічні при хронічних вірусних гепатитах, які являються однією із найважливіших проблем охорони здоров’я населення планети.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана згідно з планом науково-дослідницьких робіт Одеського державного медичного університету і є фрагментом комплексного дослідження з теми: “Вдосконалення методів патогенетичної і дієтотерапії хворих гепатитом з врахуванням екологічного забруднення продуктів харчування”. № держреєстрації 0193U039629, ГКНТ 01.07.04./022.
Мета і задачі дослідження. Метою дослідження було вивчення патогенетичних механізмів токсичного та вірусного ураження печінки на основі дослідження порушень реакцій модифікації білків хроматину, змін початкових етапів експресії генома ядер клітин печінки, їх звяўзок зі станом редокс-системи і на цій підставі розробити шляхи експрес-діагностики та фармакологічної корекції.
Відповідно до мети дослідження були сформульовані слідуючі задачі:
1. Вивчити рівні модифікації гістонів та негістонових білків хроматину ядер клітин печінки у фізіологічних умовах та після токсичного ураження тетрахлорметаном.
2. Дослідити активність ферментів модифікуючих структуру гістонів хроматину ядер клітин печінки (ацетилтрансфераз, метилтрансфераз, цАМФ-залежних протеїнкіназ), у фізіологічних умовах і при токсичному ураженні CCl4.
3. Визначити фізико-хімічні властивості гістонів та процеси взаємодії гістонів і негістонових білків з ДНК в клітинах печінки інтактних тварин та після дії тетрахлорметану.
4. Встановити закономірності біосинтезу і виходу із ядер клітин печінки РНК, а також залежність цих процесів від вмісту циклічних нуклеотидів, перекисного окислення ліпідів та функціонального стану АОС за умов токсичного ураження CCl4.
5. Провести дослідження залежності названих процесів від стану та взаємовідносин у системах ПОЛ-АОС, цАМФ, цГМФ і з’ясувати як вони відображаються на останніх в периферійній крові інтактних тварин та після дії тетрахлорметану.
6. Провести дослідження особливостей функціонального стану системи ПОЛ-АОС в еритроцитах та сироватці в динаміці перебігу вірусних гепатитів і співставити результати з аналогічними показниками в гепатоцитах та в крові при токсичному ураженні і розробити методи експрес-діагностики.
7. На основі ЛКС плазми крові розробити новий скринінговий метод діагностики, критеріїв важкості перебігу захворювання та ефективності використаної терапії
Наукова новизна отриманих результатів. Вперше отримано дані, які свідчать, що основною ланкою патогенетичних зрушень при різних формах гепатитів являються порушення в метаболізмі білків. Вони носять універсальний характер і майже не залежать від детермінуючого фактору.
Вперше показано порушення рівнів модифікацій гістонів та негістонових білків хроматину ядер, особливості змін активності ферментів, які модифікують структуру гістонів хроматину ядер гепатоцитів. Встановлено фізико-хімічні властивості гістонів, рівні взаємодії гістонів і негістонових білків з ДНК гепатоцитів, закономірності біосинтезу та виходу з ядер гепатоцитів РНК, а також регуляторний вплив на ці процеси циклічних нуклеотидів, і залежність стану перекисного окислення ліпідів та антиоксидантної системи за умов токсичного ураження печінки.
Вперше вивчена цільна картина та показано значення і взаємозвўязок функціонального стану систем ПОЛ-АОС, цАМФ, цГМФ на різних стадіях токсичного та вірусного гепатитів. Встановлено питомий вклад окремих компонентів досліджених систем у патофізіологічні механізми ураження клітин печінки і їх взаємозвўязок з функціональними порушеннями в еритроцитах та сироватці крові.
Вперше виявлено тотожності та розбіжності змін функціонального стану досліджених систем у сироватці та еритроцитах за умов токсичного і вірусного гепатитів.
Вперше всебічно досліджені механізми дії гептралу. Одержані нові дані про позитивний вплив гептралу на процеси фосфорилювання, метилювання, АДФ-рибозилювання гістонів та негістонових білків хроматину ядер за умов токсичного ураження тертрахлорметаном. Визначено позитивний вплив гептралу на активність ферментів, модифікуючих структуру гістонів хроматину ядер клітин печінки при токсичному ураженні тертрахлорметаном. В експериментальних та клінічних умовах доказана висока ефективність гептралу при лікуванні токсичних та вірусних гепатитів, які підтверджують основні патофізіологічні зрушення при ураженні печінки.
На підставі експериментальних та клінічних досліджень встановлені механізми порушення білоксинтезуючої функції печінки за умов токсичного та вірусного гепатиту, сформульована робоча гіпотеза, з’ясовані раніше невідомі ланки патогенезу цієї патології.
Вперше отримані дані про доцільність використання ЛКС, як експрес-методу у діагностиці, оцінці важкості перебігу захворювання та ефективності фармакотерапії.
Практичне значення роботи. Отримані експериментальні дані в значній мірі розширили існуючі уявлення про порушення метаболічних процесів, які лежать в основі токсичного та вірусного уражень гепатоцитів, ці результати відкривають нові перспективи для розробки методів цілеспрямованої корекції уражень печінки. Комплексна оцінка білок-синтезуючого апарату ядер клітин печінки і механізмів функціонування окислювальних процесів, функціональної спроможності антиоксидантної системи, системи циклічних нуклеотидів, тіолдисульфідного обміну, вмісту піридинових нуклеотидів з наступним аналізом отриманих результатів перспективна в плані підвищення ефективності і надійності діагностики ступеню, глибини деструктивних процесів у клітинах печінки та контролю за ефективністю лікувальних засобів. Встановлені закономірності взаємовідносин між інтенсивністю перекисного окислення ліпідів, функціональним станом антиоксидантних механізмів та тіолдисульфідним обміном в еритроцитах та плазмі крові, мають важливе значення для практичної гепатології. Вперше у експериментальних та кліничних умовах доведена і обгрунтована доцільність використання ЛКС у якості експрес-методу для діагностики ступеню важкості і прогнозу перебігу та ефективності терапевтичних заходів при токсичних та вірусних гепатитах. На підставі проведених обстежень вперше запропоновано використання ЛКС для виявлення груп ризику по печінкових патологіях у регіонах з різним станом екосистем.
В результаті проведених досліджень виявлені нові властивості відомого препарату гептралу. З’ясовано, що він позитивно впливає на процеси транскрипції білків хроматину, покращує взаємодію ДНК з цими білками, впливає на стан біохімічних реакцій, що модифікують білки хроматину та викликає нормалізацію тіолдисульфідного обміну.
Отримані в роботі результати дозволяють обгрунтувати доцільність застосування гептралу за умов токсичного і вірусного гепатиту.
Результати роботи впроваджені в клінічні заклади міста Одеси та області, а також у практику наукових досліджень і навчальний процес ряду кафедр медичного університету.
Особистий внесок здобувача. Автором самостійно розроблена дослідницька програма, самостійно проведені біохімічні, біофізичні дослідження як в умовах експерименту, так і в умовах клініки. Проведено аналіз результатів дослідження, обгрунтування основних положень дисертаційної роботи, зроблені висновки, статистична обробка матеріалу та оформлення дисертаційної роботи. Опубліковані основні результати досліджень в фахових виданнях.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що включені до дисертації, оприлюднено на засіданнях Одеського відділення Українського наукового товариства інфекціоністів (Одеса 1997, 1998); на засіданнях Одеського відділення Українського наукового товариства фізіологів та патофізіологів (Одеса 1996,1997); The Fourth International Symposium on Maritime Heal (Oslo, June 21 to 25 1997), European Conference on Travel Medicine. (Venice, 1998); На IV международном конгрессе “Реабилитация в медицине и иммунореабилитация”. (Сочи, 1998); На V зўїзді інфекціоністів України (Тернопіль, 1998).
Публікації. Результати дисертації опубліковані в 25 наукових роботах з них 15 у журнальних статтях центральних видань за фахом, 1 стаття у науковому посібнику, 2 журнальні статті у іноземних журналах за фахом, двох монографіях , 2 методичних рекомендаціях, та 3 роботи у матеріалах і тезах конференцій та симпозіумів.
Обсяг і структура дисертації. Основний зміст дисертації викладено на 351 сторінці машинописного тексту, містить 40 таблиць, 51 рисунок і дві схеми. Робота складається із вступу, огляду літератури, розділу матеріалу та методи досліджень, 5-х розділів власних досліджень, обговорення результатів, узагальнення, висновків, списку використаної літератури, який складається із 271 вітчизняних та 271 зарубіжних джерел
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи досліджень. Експериментальні дослідження проведені на 980 статевозрілих щурах самцях масою 180 – 200 г, які утримувались в стандартних умовах та на стандартній дієті віварію. При проведенні досліджень всі експериментальні тварини були розділені на слідуючі групи: 1) інтактні тварини – контрольна група; 2) тварини після внут-рішньошлункового введення олійного розчину CCl4; 3) отруєні CCl4 тварини, яким вво-дили внутрішньоочеревинно розчин гептралу; 4) отруєні CCl4 тварини, яким внут-ріш-ньоочеревинно вводили МІГУ-2, 5) тварини, яким перед веденням ССl4 вводили гептрал.
Токсичний гепатит викликали шляхом одноразового внутрішньо-шлункового введення за до-помогою зонду 50 % олійного розчину CCl4 із розрахунку 5 мг/кг маси. Після введення олійного розчину CCl4 піддослідних тварин брали до екс-пе—-ри-менту через 24, 48, 72, 120 годин та на 14 та 21 день. Об’єктом для експе-римен-тальних досліджень була печінка, еритроцити та сироватка периферійної крові.
Гептрал препарат виробництва фірми Knoll Farmaceutici Spa Італія міс-тить активну речовину адеметионін 1,4-бутандисульфат. Адеметионін (S-аденозил-4-метионін) – біологічна сполука, яка міститься у всіх тканинах організму. Його молекула приймає участь у більшості біохімічних реакцій, як донор метилової групи, і як попередник фізіологічних тіолових сполук.
З метою дослідження дії гептралу на механізми неспецифічної рези-стентно-сті організму його вводили піддослідним тваринам внутрішньо-очеревинно 2 мг гепт-ралу в 0,5 мл розчинника, що відповідає 5 мг на 1 кг маси.
Введення гептралу піддослідним тваринам проводили в першу добу двічі з перервою в 12 годин, а потім кожен день на про-тязі 14 діб. Після введення гептралу, експериментальних тварин брали для проведення досліджень через 24, 48, 72, 120 годин на 14 та 21 день. Така постановка експе-рименту дозволяла виявити особливості патофізіологічних механізмів розвитку деструктивних порушень метаболізму білків, та стан неспецифічних адаптивних механізмів, при токсичному гепатиті і виявити механізми впливу на зазначені процеси гептралу в динаміці перебігу цієї патології. Вибрана доза гептралу відпо-відає рекомендованій добовій дозі гептралу при лікуванні різних порушень фун-кціонального стану печінки у людей. З метою оцінки ефективності лікування за допомого ЛКС-метрії окремій групі піддослідних тварин вводили МІГУ-2 препарат, синтезований у Одеському державному медичному університеті, який являє собою координаційну сполуку германію з нікотинамідом. МІГУ-2 вводили внутрішньочеревно на протязі 2-х тижнів із розрахунку 11 мг/кг маси тіла.
Для дослідження патофізіологічних механізмів розвитку гепатитів у людей були обстежені 90 хворих на хронічний гепатит В в віці від 40 до 60 років, чоловіків 80, жінок 10. Контрольну групу складали донори того ж віку. Діа-гноз хронічного вірусного гепатиту В ставили на підставі маркерного аналізу отриманих імуноферментним та радіоімунним методами. При цьому та-кож враховували анамнестичні, епідеміологічні та клінічні дані.
Другу групу складали 30 хворих на хронічний гепатит В середньої важ-кості перебігу, які отримували загальновизначену базисну терапію. Третю групу (30 осіб) складали хворі на хронічний гепатит В середньої важкості перебігу, які отримували окрім базисної терапії гептрал.
Об’єктом для досліджень у хворих були еритроцити та плазма пери-ферійної крові. Крім цього було проведено обстеження груп ризику у Чорнобильський зоні 60 чоловік, у Ленінградській області 41 чоловік, у Ризській зоні 41 чоловік, у Київській області 51 чоловік і у Одеській області 77 чоловік
Після декапітації експериментальних тварин, швидко проводили розтин че-ревної порожнини і забирали печінку, яку промивали тричі охолодженим фізіо-логічним розчином. Потім тканину печінки зважували на торзіонних вагах і вико-ристовували для проведення досліджень. Гомогенизування тканин печінки прово-дили в середовищі виділення, яке складалося із 0,145 М розчину KCl який містив у собі 3.3 мМ. КНСО3 з рН – 7,4.
Ядра вилучали за методом Pogo (A. O. Pogo, 1967). Хроматин отримували по методу Тена та співавторів в модифікації Уманського та співавторів (1978). Лабільно пов’язані з ДНК негістонові білки отримували внаслідок обробки очищеного хроматину 0,35 М NaCl рН – 7,5 (F. Strause, 1982). Гістони екстрагували 0,25N Н2SO4 присаджували ацетоном, промивали етанолом і ліофілізували. Індивідуальні гістони отриму-вали фракціонуванням сумарних гістонів методом гельфільтрації на біогелі Р-60, та се-фадексі G-100 (E. L. Bocm., 1973). Фракцію міцно пов’язаних негістонових білків отримували (після екстракції гістонів) шляхом обробки хроматину 0,5N HClО4 при температурі 100°С на протязі 20 хвилин. Сумарні негістонові білки отримували із очищеного хроматину за методом Босток К. (К. Босток, 1976). Для досліджень модифікації білків in vivo тваринам внутрішньоочеревинно (із розрахунку на 100 г маси) вводили: при до-сліджені фосфорилювання – 6,0 МБк NaH232PO4 за дві години до декапітації, при дослідженні ацетилювання – 6,0 МБк 14СН3СООNa за півтори години до декапі-тації, при дослідженні АДФ-рибозилювання – 8,0 МБк 3Н-рибози за 2 години до декапі-тації; при дослідженні метилювання – 8,0 МБк 3Н-метилметіонину за 1,5 години до дека-пітації.
Електрофорез гістонів проводили за методом Panhyim та Chalkley (1969). За-фарбовані гелі сканували на спектрофотометрі Specord – UV – Vis. Концент-рацію білку визначали по Desoye (1980). Підрахунок радіоактивності в зонах гелю прово-дили по методу Aloye (1979).
Препарати АМФ-залежної протеїнкінази І і ІІ отримували із печінки згідно Dastugue і співавторів (1973). Активність протеїнкіназ визначали по методу Uno і співавторів (J. Uno, 1976). Препарати гістонацетилаз А та В отримували із хроматину печінки. Їх активність визначали по Gallwitz (1970; 1972). Виділення, очищення препара-тів гістонметилаз І та ІІ із хроматину печінки по методу Gallwitz (1971); актив-ність полі-(АДФ-рибозо)-полімерази по Заалішвілі та ін. (1980).
Для отримання високо очищених ацетилтрансфераз із ядер печінки щурів за основу був використаний метод Syres і Gallwitz. Очищення гістон-ацетилтрансфераз контролю-вали шляхом вимірювання активності ферментів. Використовуючи в якості субст-рату сумарні гістони печінки і (І-14С) ацетил-коензим А (фірма “Amersham”, Ве-ликобританія), а також електрофоретично (R. K. Laemmly, 1973). Інкубаційне середовище для ви-значення активності ацетилтрансфераз ядер клітини печінки в кінцевому об’ємі ) 0,5 мл містило: 30 мМ трис-НCl буфер, рН 7,9; 0,7 мМ КCl, 0,2 мМ
ЕДТА; 7 мМ NH4Cl 4 мМ b-меркаптоетанол, 7,5 % гліцерин, 20 мкг препа-рату сумарних гістонів, 4Ч10-4 МБк (І – 14С) – ацетил-коензима А (питома активність – 198 МБк/ммоль) і ацетилтрансферази від 5 до 25 мкг.
Протеїнкінази із печінки щурів виділяли по методу Tichonisky (Z. Tichonisky, 1974). Для дослідження фосфорилювання ацетилтрансфераз in vitro з допомогою цАМФ-залежних про-теїнкіназ інкубаційне середовище в кінцевому об’ємі 0,5 мл містило: препарат ацетилтрансферази 10 мкг, протеїнкінази 5 мкг, 30 м М трис- НCl буфер рН 7,5; 0,7 мМ NH4Cl; 0,2 мМ ЕДТА; 7 мМ 4 мМ b-меркапто-етанол, 20 нМ АТФ; 4 нМ цАМФ; 4Ч10-2 МБк (g-32Р) АТФ (фірма “Amerscham”, питома активність 14Ч 104 МБк/ммоль).
Залежність активності ацетилтрансфераз від їх фосфорилювання за допомо-гою цАМФ-залежних протеїнкіназ досліджували, використовуючи інкубаційне се-редовище, що містить в кінцевому об’ємі 0,5 мл; 30 мл трис- НCl буфер рН 7,5; 0,7 мМ КCl; 0,2 мМ ЕДТА; 7 мМ NH4Cl; 4 мМ b-меркаптоетанол; 20 нМ АТФ; 4 нМ цАМФ; 10 мкг ацетилтрансферази і від 2 до 10 мкг протеїнкінази. Через 20 хв. ін-кубації при 37° С проби охолоджували на льоду, вносили 4 Ч 10 -4 МБк (І-С14) ацети-лкоензима А і 20 мг препарату сумарного гістона. Інкубацію проводили 20 хв. при 37° С. Реакцію зупиняли додаванням 0,5 мл 10% ТХО. За одиницю активності ацетилтрансфераз приймали кількість нмоль ацетату, включеного в 1мг гістонів за 1 хв.
Про фосфорилювання ацетилтрансфераз in vivo судили по включенню 32Р із NaH232PO4, питома активність – 88 МБк/ммоль, який вводили внутрішньоочеревинно із розрахунку 6,0 МБк на 100 г ваги тварини за 2 год. до декапітації.
ДНК із печінки виділяли по методу Кеу і співавторів (1975). Для отри-мання ДНК з питомою радіоактивністю використовували модель подавлення і від-новлення ре-плікації ДНК циклогексимідом (П. Я. Бойков, 1979). ДНК виділяли через 60 год. після внутрішньо-очеревинного введення циклогексиміда (0,2 мг на 100 г ваги) і через 2 год. після внутрішньоочеревинного введення 3Н-тимідина (8,0 МБк на 100 г ваги). Реконст-рукцію комплексів гістон-ДНК і НГБ-ДНК проводили по методу Bryan (1978) з де-якими модифікаціями. Співвідношення гістон/ДНК в комплексах визна-чали по методу Johnson та ін. (1972).
Зміну оптичної щільності комплексів гістон-ДНК і НГБ-ДНК при їх плавленні реє-стрували на спектрофотометрі Perkin-Semer при 260 нм і записували її як функцію темпера-тури. Похідну гіперхромності визначали за формулою Li i Bohner (1971). Для визначення ступеня і характеру взаємодії білок-ДНК використовували метод фіксації білків з ДНК на нітроцелюлозних фільтрах (А. С. Логинов, 1994). Вміст білка в пробах визначали по Lowry.
При вивчені синтезу і виходу РНК із ядер використовували безклітинну си-стему ізольованих ядер, запропоновану Meisler і Tropp (1969), забезпе-чу-ючу синтез різних типів клітинних РНК в співвідношенні, близькому до фізіоло-гіч-ного. В якості міченого попередника синтезу РНК використовували 3Н-УТР (питома радіоактивність 25,6 104 МБк /ммоль). Виділення хроматину із ядер клітин і ви-зна-чення його матричної активності в системі з РНК-полімеразою E. Coli прово-дили згідно метода Zhelabovskaja i Berdishev (1972).
Цитозоль отримували шляхом послідовного цент-рифугування клітинного гомогенату при 20000 і 105000g. Фракціонування нуклеї-но-вих кислот проводили по методу Schmindt i Thannhauser ( 1945). Кількість ДНК в препаратах ядер і хроматину визначали спектрофотометрично по методу А. С. Спіріна (1958).
Для отримання нативних препаратів РНК із ядер використовували метод Scherrer (1945), а із інкубаційного середовища – метод Swan та ін. (1967 – 1978). Фрак-ціонування препаратів РНК здійснювали в лінійному градієнті 5 – 20% сахарози в роторі SW-40 препаративної центрифуги Beckman L2-65 В при 30000 g впродовж 4 год., а препаратів РНП, які являють собою сумарний рибонукле-опротеїдний матеріал, що ви-віль-няється із ядер в інкубаційне середовище за час інкубації (20 хв) – в градієнті концентрації 15 – 30 % сахарози при 3000g впродовж 3 год. при 3°С в роторі SW-50,1 ультрацентрифуги Beckman (США). Коефіцієнти седиментації РНК і РНП розраховували по формулі Martin і Ames (1961). Розпо-діл полі А+ і полі А- – РНК здійснювали на оліго (aТ)-целюлоз-них колонках, ви-користовуючи прописи Aviv i Leder (1972).
Для визначення радіоактивності препаратів РНК і РНП біополімери оса-джували трихлороцтовою кислотою і осадки переносили на міліпорові фільтри (склофільтри або целюлозні фільтри). Радіоактивність проб на міліпорових фільтрах ви-значали в толуольному сцинтиляторі на автоматичному лічильнику SL-400 фірми “Intertechnigue”. Активність супероксиддисмутази визначали по здатності ферменту ін-гібувати реакцію відновлення нітросинього тетрозолія супероксид-аніон-ради-ка-лом (R. Fried, 1975). Швидкість утворення супероксиданіонрадикала оцінювали по швидкості віднов-лення нітросинього тетрозолія в середовищі, що містить НАДН. Віднов-лення ніт-росинього тетрозолія визначали по зміні оптичної щільності при довжині хвилі 540 нм. Вимір оптичної щільності проводили через 1, 3, 5, хв. на СФ-46 проти контрольної проби, що не містить НАДН. Активність виражали в умов-них оди-ницях оптичної щільності на 1 г тканини або 1 мл еритроцитарної маси.
Про каталазну активність судили по швидкості руйнування перекису водню в нмоль за 1 хв. при довжині хвилі 240 нм (M. Ensinger, 1976). Активність ферменту виражали в міжнародних одиницях (МО) по кількості зруйнованого субстрату в хвилину і відносили до 1 мл еритроцитарної маси або 1 г тканини.
Активність глутатіонредуктази визначали методом описаним А. М. Герасимовим і спі-вавт. (1976) і виражали в нмоль/хв. НАДФН на 1мл еритро-цитарної маси або 1 г тканини.
Визначення активності глутатіонпероксидази до перекису водню (ГП1) проводили по методу D. E. Palgia, W.N. Valentine (1967). Активність ферменту ви-ражали в нмоль / хв НАДФН на 1 мл еритроцитарної маси або 1 г тканини.
Активність глутатіонпероксидази до гідроперекису третбутилу (ГП2) визна-чали модифікованим методом D. E. Palgia, W.N. Valentine (1967). Активність фер-менту розраховували аналогічно ГП1.
Визначення активності глутатіонтрансферази (ГТ) до І-Сl-2,4- динітробен-золу проводили методом W. H. Habig і співавторів (W. H. Habig, 1974). Активність фермента ви-ражали в нмоль кон’югованого субстрату за хвилину на 1 г тканини або 1 мл ери-троцитарної маси.
Визначення вмісту відновленого глутатіону в тканинах проводили по ме-тоду, описаному М. І. Прохоровою (1982). Метод заснований на тому, що глутатіон, реа-гуючи з надлишком алоксану, утворює сполуку, що має максимум поглинання при 305 нм. Зміст відновленого глутатіону в еритроцитах визначали за допо-могою реактиву Еллмана по методу Bentler (1969) і кількість його виражали в нмоль на 1 мл еритро-цитарної маси.
Визначення вмісту і ступені відновленості піридинових нуклеотидів прово-дили по методу Слайтера і співавторів в модифікації В. М. Телепньової (1982). Принцип метода полягає в роздільній екстракції окислених і відновлених форм піридинових нуклеотидів і використанні глюкозо-6-фосфатдегідрогеназної реакції для визначення кількості НАДФ. Кількість виражали в нмоль на 1 г тка-нини.
Вміст сульфгідрильних груп визначали методом, основаним на викорис-танні реагенту Еллмана (1975) -5,5І-дитіобіс-2-нітробензойної кислоти, яка кіль-кіс-ним чином взаємодіє з сульфгідрильними групами, утворюючи змішаний дисульфід і звіль-нюючи аніон 2-нітро-5І-меркаптобензойної кислоти, яка погли-нається при довжині хвилі 412 нм. Кількість сульфгідрильних груп розра-ховували з урахуванням кое-фіцієнта молярної екстинції рівного при 412 нм- 13100 мІ смІ і виражали в нмоль на 1 г тканини. Визначення активності амінотрансфераз у сироватці крові проводили за методом Л.М. Осадчої (1979), біохемілюмінісценцію плазми крові проводоли за методом Ю.А. Владимирова (1978).
Визначення рівня циклічних нуклеотидів цАМФ і цГМФ проводили за до-помогою наборів фірми Amerchаm (Великобританія). Розмірність концентрації – пмоль на 1 г тканини.
Вміст дієнових конўюгатів визначали за допомогою метода І. Д, Стальної (1971). Кількість їх розраховували, виходячи з величини молярного коефіцієнта ек-с-тинції при 233 нм для спряжених дієнів поліненасичених вищих жирних кислот, що дорівнює 2,2 Ч 105 см-1 Ч м -1. Розмірність концентрації – нмоль на 1 г тканини або 1 мл еритроцитарної маси.
Малоновий діальдегід визначали за допомогою методу І. Д. Стальної і Т. Г. Гарішвілі (1971). Принцип метода заключається в тому, що при високій темпе-ратурі в кислому середовищі малоновий діальдегід реагує з 2-тіобарбітуровою кислотою, утворюючи забарвлений триметиловий комплекс з максимумом погли-нання при 532 нм. Кількість малонового диальдегіда розраховували з урахуван-ням молярного коефіцієнта екстинції рівного при 532 нм 1,56Ч105 см-1Ч м -1 і вира-жали в нмоль на 1 г тканини або 1 мл еритроцитарної маси. Лазерну кореляційну спектроскопію сироватки та плазми крові здійснювали на ЛК-спектрометрі з математичною обробкою данних за допомогою програми “Многомерный классификатор”.
Результати експериментальних досліджень піддавали статистичному аналізу з використанням ЕОМ та пакету програм Microsoft Word, Microsoft Excel, Microsoft Graph 5.0. Вірогідність отриманих результатів визначали використовуючи критерій Стўюдента Фішера (1975). Відхилення вважались вірогідним при Р
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
