НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

Хоменко Людмила Анатоліївна

УДК 579.87:665.73-035.83.0028

Нокардіоподібні актинобактерії – деструктори моторних олив

03.00.07 – мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2007

Дисертація є рукопис.

Робота виконана у відділі фізіології промислових мікроорганізмів
Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного Національної
Академії Наук України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор, академік НАНУ

Підгорський Валентин Степанович, Інститут мікробіології і вірусології
ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу фізіології
промислових мікроорганізмів

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Пирог Тетяна
Павлівна, Національний університет харчових технологій, завідувач
кафедри біотехнології мікробного синтезу;

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Павленко Микола
Ілліч, Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, завідувач
лабораторії екологічних досліджень

Захист відбудеться 19 грудня 2007 року о 10 годині на засіданні
Спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 Інституту мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Д 03680, м.
Київ ДСП, вул. Заболотного, 154, зал засідань.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і
вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України за адресою: м. Київ,
вул. Заболотного, 154.

Автореферат дисертації розіслано „ 16„ листопада 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник
Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Однією з важливих екологічних проблем сьогодення є
очищення природного середовища від забруднення мінеральними (нафтовими)
оливами, із яких найбільш токсичними для живих організмів є моторні
оливи. Постійно зростаюча потреба у цих речовинах, загальне світове
виробництво яких на даний час перевищує 40 млн. тон на рік, збільшує
ризик їх потрапляння у ґрунт та воду і свідчить про необхідність
підвищення контролю за їх токсичністю та удосконалення методів очищення
забруднених ними середовищ.

Сучасні мінеральні моторні оливи є збалансованим колоїдним розчином
базової мінеральної оливи, що представляє собою багатокомпонентну суміш
високомолекулярних вуглеводнів та пакету присадок, який складається з
індивідуальних функціональних присадок, призначених для підвищення
якості олив, і може містити такі високотоксичні речовини як феноляти,
дітіофосфати та алкілдітіофосфати металів [Караулов, Худолий, 2000].
Потрапляння в біосферу моторних олив призводить до порушення природних
біоценозів водойм та ґрунту і значно погіршує санітарно-гігієнічний стан
забруднених об’єктів. При розкладі цих речовин можуть утворюватись
канцерогенні сполуки, які викликають зміни у функціонуванні системи
імунного захисту людини і, як наслідок, алергічні, онкологічні та інші
захворювання [Протасов, Молчанов, 1995; Абрацумян и др., 1999].

З метою попередження і зменшення негативного впливу моторних олив та
інших мастильних матеріалів на довкілля та людину в країнах Євросоюзу і
в Україні насьогодні запроваджені Державні стандарти [CEC L-33-F-93;
ДСТУ, 2004], які зобов’язують та регламентують проведення контролю за
основною екологічною характеристикою цих речовин, а саме — їх здатністю
до біодеструкції в природних умовах. У цих процесах значну роль можуть
відігравати нокардіоподібні актинобактерії родів Rhodococcus, Gordonia і
Dietzia, які переважають в забруднених нафтою та нафтопродуктами
природних екосистемах і широко використовуються в біотехнологіях
очищення довкілля від цих полютантів [Ившина, 1997; Christofi et al.,
1998; Ившина и др., 2003]. Незважаючи на широке практичне використання
та значний рівень дослідження біологічних властивостей зазначених
актинобактерій, їх здатність до біодеструкції мінеральних, в тому числі
моторних олив, майже не вивчена. У доступній нам літературі є тільки
поодинокі дані про засвоєння моторних олив окремими штамами
нокардіоподібних актинобактерій [Звягинцева и др., 2001; Koma et al.,
2003; Худокормов, 2006], відсутня інформація про чутливість цих бактерій
до токсичних компонентів олив та присадок до них, не вивчені особливості
їх росту на цих субстратах як єдиному джерелу вуглецю та енергії.
Дослідження вказаних властивостей та процесів дозволить отримати нові
дані про біологічні особливості нокардіоподібних актинобактерій та
створити умови для розробки на їх основі біотехнологій очищення довкілля
від моторних олив.

Зв’язок теми з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у
відповідності з напрямом науково-дослідних робіт Інституту мікробіології
і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України в межах бюджетної
тематики відділу фізіології промислових мікроорганізмів “Дослідження
систематичного положення та фізіолого-біохімічних особливостей
мікроорганізмів, які мають промислове значення” (державний реєстраційний
номер 0198V007755, 1999 — 2003 рр.); “Систематика і біосинтетичні
можливості бактерій і дріжджів. Розробка наукових основ створення за їх
допомогою нових біотехнологічних препаратів і процесів” (державний
реєстраційний номер 0104U003000, 2004-2008 рр.); “Збереження та
забезпечення належного функціонування об’єкта, що становить національне
надбання – Колекція мікроорганізмів Інституту мікробіології і
вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України” (державний реєстраційний
номер 0105U003954, 2003 — 2006 рр.) прикладної бюджетної тематики
відділу “Розробка наукових основ створення біотехнології очищення
довкілля від нафтових олив” (державний реєстраційний номер 0107U003512,
2007-2009 рр.).

Мета та завдання досліджень. Мета роботи – скринінг штамів
нокардіоподібних актинобактерій-деструкторів мінеральних моторних олив,
визначення їх біологічних особливостей та можливості використання в
біотехнологіях очищення довкілля від цих мастильних матеріалів

У відповідності із вказаною метою були поставлені наступні завдання:

виділити з природних джерел та визначити видову належність
нокардіоподібних актинобактерій, що засвоюють моторні оливи;

провести скринінг активних штамів-деструкторів моторних олив та
визначити їх здатність до утилізації різних марок мінеральних моторних
олив;

дослідити чутливість штамів актинобактерій до дії токсичних компонентів
мінеральних моторних олив, пакетів присадок, індивідуальних
функціональних присадок та деяких факторів зовнішнього середовища;

визначити здатність актинобактерій – деструкторів моторних олив до
синтезу поверхнево-активних речовин та очищення відходів пластмасової
тари від цих мастильних матеріалів.

Об’єкт дослідження – нокардіоподібні актинобактерії, мінеральні моторні
оливи, пакети присадок та індивідуальні функціональні присадки до
моторних олив.

Предмет дослідження – деструктивна активність нокардіоподібних
актинобактерій щодо моторних олив, їх чутливість до токсичних
компонентів цих речовин, деяких факторів зовнішнього середовища та
здатність до очищення відходів пластмасових каністр від залишків
моторних олив.

Матеріали та методи дослідження. При виконанні поставлених завдань
використовувались мікробіологічні, фізико-хімічні, хемотаксономічні,
біохімічні та статистичні методи досліджень.

Наукова новизна отриманих результатів. Досліджена здатність до засвоєння
найбільш розповсюджених марок мінеральних моторних олив у 21
свіжоізольованого і 161 колекційного штаму нокардіоподібних
актинобактерій, що підтримуються в Українській колекції мікроорганізмів
Інституту мікробіології і вірусології ім.Д.К.Заболотного НАН України.
Встановлено, що найбільш активні штами-деструктори моторних олив
належать до видів Dietzia maris, Gordonia rubripertincta та Rhodococcus
erythropolis. Вперше визначена чутливість вказаних видів до різних
концентрацій мінеральних моторних олив і присадок до них та її
залежність від наявності і кількості в цих речовинах основного
токсичного компоненту – дітіофосфату цинку. Отримані нові дані про
стійкість штамів-деструкторів олив до окремих складників цих речовин —
важких металів, фенолу і сірки. Виявлена здатність вказаних штамів до
росту в несприятливих умовах існування – широкому діапазоні кислотності
і мінералізації середовища та температури.

Практичне значення одержаних результатів. Відібрані штами
нокардіоподібних актинобактерій, які проявляють високу метаболічну
активність щодо мінеральних моторних олив, стійкі до токсичних
компонентів цих речовин і факторів зовнішнього середовища. Завдяки
здатності до ефективного відмивання пластмасової поверхні від моторних
олив та їх деструкції, вказані штами перспективні для очищення від цих
речовин відходів пластмасової тари, яка є цінною вторинною сировиною.
Активні штами-деструктори олив та отримані експериментальні дані можуть
бути використані для розробки на їх основі нових біотехнологічних
методів ліквідації забруднень довкілля моторними оливами та іншими
мастильними матеріалами.

Особистий внесок здобувача. Основні експериментальні дані були одержані
здобувачем особисто: відібрані проби забрудненого нафтопродуктами
ґрунту, виділені та ідентифіковані свіжоізольовані штами, досліджена
чутливість нокардіоподібних актинобактерій до різних марок мінеральних
моторних олив, пакетів присадок, індивідуальних функціональних присадок
та окремих їх компонентів, визначений вплив факторів зовнішнього
середовища на ріст вивчених штамів. У активних штамів-деструкторів олив
досліджені гідрофобно-гідрофільні властивості клітинної поверхні та
емульгуюча активність. Проведена статистична обробка даних.

Планування головних напрямків роботи, формулювання основних положень
дисертації та підготовка до друку наукових статей проведено під
керівництвом наукового керівника дисертаційної роботи акад. НАНУ
В.С.Підгорського. Таксономічні дослідження та скринінг активних
деструкторів моторних олив проведено за участі с.н.с., к.б.н.
Т.М.Ногіної, визначення деструктивної активності нокардіоподібних
актинобактерій щодо олив здійснено спільно з к.б.н. С.Л.Куберською,
дослідження здатності штамів актинобактерій до синтезу
поверхнево-активних речовин проведені на базі Відділення фізико-хімії
горючих копалин Інституту фізико-органічної хімії та вуглехімії НАНУ під
керівництвом с.н.с., к.х.н. О.В.Карпенко, які є співавторами відповідних
публікацій.

Автор роботи висловлює глибоку вдячність с.н.с. Українського
науково-дослідного інституту нафтопереробної промисловості „МАСМА”
С.С. Шамкіній за консультації щодо характеристик моторних олив та
присадок.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень та
положення дисертації доповідались та обговорювались на 69-й науковій
конференція молодих вчених, аспірантів і студентів Національного
університету харчових технологій (Київ, 2003), конкурсах
експериментальних робіт молодих дослідників ІМВ НАНУ (Київ, 2003, 2004,
2005, 2006); ІІ науково-технічній конференції “Нові технології та
обладнання по переробці промислових та побутових відходів і їх
медико-екологічне забезпечення” (Східниця, 2003), Х з’їзді Товариства
мікробіологів України (Одеса, 2004); практичній конференції “Природничі
науки на межі століть” (Ніжин, 2004), Щорічній науковій конференції “Дні
науки НаУКМА” (Київ 2005), 11-й Міжнародній конференції “Проблемы
биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды” (Саратов,
2005), ІІ-й Міжнародній науковій конференції молодих вчених “Молодь і
досягнення науки у вирішенні проблем сучасності” (Чернівці, 2005),
Першій, другій та третій міжнародній науковій конференції студентів та
аспірантів “Молодь і поступ біології” (Львів, 2005, 2006, 2007), 10-й
Міжнародній Пущинській школі-конференції молодих вчених “Биология –
наука ХХІ века” (Пущино, 2006), Міжнародній науковій конференції
“Мікробні біотехнології” (Одеса, 2006) та The young scientists and
students international scientific conference “Modern problems of
microbiology and biotechnology” (Odesa, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 16 наукових робіт, із
них 5 статей у фахових виданнях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із
вступу, огляду літератури (2 розділи), 4 розділів експериментальних
досліджень, підсумку, висновків, списку використаних джерел, який
включає 225 найменувань (з яких 103 – іноземні) та додатку. Робота
викладена на 154 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 45
рисунками і 18 таблицями.

Огляд літератури

Огляд літератури представлений двома розділами, кожний з яких
поділяється на два підрозділи. В першому розділі узагальнено літературні
дані щодо таксономічної структури нокардіоподібних актинобактерій, які
належать до родів Gordonia, Dietzia і Rhodococcus класу Actinobacteria,
їх розповсюдження та роль у природі. В другому розділі наведена
інформація про здатність цих мікроорганізмів до деструкції вуглеводнів
нафти та нафтопродуктів, включаючи мінеральні оливи. В окремих
підпунктах узагальнені літературні дані про характеристику і властивості
мінеральних моторних олив, а також перспективи використання
нокардіоподібних актинобактерій в біотехнологіях очищення навколишнього
середовища від цих мастильних матеріалів.

Матеріали та методи досліджень

Об’єктами досліджень були 21 свіжоізольовані штами актинобактерій,
виділені з ґрунту на території м.Чернігова та смт. Пуща-Водиця в місцях
локальних забруднень мастильними матеріалами і з активного мулу міських
очисних споруд м. Києва (смт. Бортничі). В роботі досліджувались, також,
161 колекційні штами нокардіоподібних актинобактерій, що належать до
видів D.maris, G.rubrіpertincta, R.erythropolis, R.fascians, R.longus,
R.opacus та R.ruber, які підтримуються в Українській колекції
мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім.Д.К.Заболотного
НАН України.

Як субстрат для культивування актинобактерій використовували базову
мінеральну оливу (БМО) марки НС 22/130 та універсальні мінеральні
моторні оливи (ММО) класу 15W-40 торгових марок “Азмол-Супер”, “Havoline
Рremium”, “Esso Uniflo”, “Luxoil Super” і “Titan Truck SHPD”. В роботі
досліджувались наступні марки пакетів присадок (ПП) до моторних олив:
Hitec 9227, Hitec 2854, Infenium 1272, Infenium 2281, Infenium 3354 і
Infenium 5265 та основні типи індивідуальних функціональних присадок
(ІФП) марок Hitec 611, С-150 Нафтан, Детерсол-140, Komad-302
(мийно-деспергувальні), Hitec 623, Плексол, Полібутен
(в’язкісно-депресорні), Liqui Moly (антифрикційна) та Multadit OB
(протизношувальна).

Виділення штамів-деструкторів моторних олив проводили методом
накопичувальних культур або прямим висівом на агаризоване мінеральне
середовище Мюнца (г/л): KNO3 – 1,0; MgSO4 – 0,1; KH2PO4 – 0,14; NaCl –
1,0 [Звягинцев, 1991] в яке додавали 1,0 % (об. частка) гексадекану.

Первинний скринінг штамів, що засвоюють моторні оливи, проводили за
результатами вимірювання оптичної густини (ОГ) культуральної рідини
після росту культур при температурі 28°С при перемішуванні (n=240 об/хв)
впродовж 5 діб на середовищі Мюнца, в яке додавали 0,1 % (об. частка)
суміші (1:1:1) мінеральної (“Азмол-Супер”), частково синтетичної (“Liqui
Moly”) та синтетичної (“Лукой Синтетик”) моторних олив. Інокулятом
слугувала водна суспензія дводобових бактеріальних культур (титр клітин
108 кл/мл), вирощуваних на агаризованому поживному середовищі №53
[Catalogue of strains DSMZ, 1989]. Для подальших досліджень відбирали
штами, ОГ яких перевищувала 0,6 одиниць при початковому її значенні
0,05.

Ідентифікацію культур проводили за визначниками Bergey’s [Bergey’s
Manual of Systematic Bacteriology, 1986, 1989] та монографією
О.А.Нестеренко та ін. [1985]. Культурально-морфологічні та
фізіолого-біохімічні ознаки нокардіоподібних бактерій, визначення
ізомерів діамінопімелінової кислоти, моноцукридного складу гідролізатів
клітин, наявності та типу міколових кислот вивчали загальноприйнятими
методами [Герхардт, 1983; Лабинская, 1972; Звягинцев, 1991]. Отримання
та визначення амінокислотного складу пептидоглікану клітинних стінок
проводили за описаним раніше [Ногина и др., 1989] модифікованим методом
K.N.Schleifer і O.Kandler [1972].

Чутливість штамів до різних концентрацій ММО та їх компонентів визначали
методом дифузії в агар з використанням лунок [Егоров, 1986; Аржаков и
др., 2004]. В лунки діаметром 8 мм вносили розчинені в базовій
мінеральній оливі ММО, ПП та ІФП у концентраціях (г/мл): 1,0; 0,8, 0,6;
0,4; 0,2, 0,1; 0,08; 0,05; 0,04; 0,02; 0,01; 0,008; 0,004; 0,0008 та
0,0004. Водний розчин фенолу використовували в концентраціях (мг/мл) –
10, 25, 50, а розчинену в гексадекані молекулярну сірку в концентраціях
(мг/мл) – 0,2; 0,5; 1,0; 2,0 та 4,0 [Комарова и др., 2003]. Показником
чутливості бактерій до зазначених речовин слугувала наявність чи
відсутність зони затримки росту культур навколо лунок в агарі. Для
порівняння ступеня антимікробної дії досліджуваних речовин
використовували такий показник як мінімальна пригнічуюча концентрація
(МПК), що відповідала останній концентрації речовини, після якої не
утворювались зони затримки росту культур. Чутливість штамів до іонів
важких металів вивчали на агаризованому середовищі Мюнца, в яке додавали
розчини солей: ZnSO4, Pb(NO3)2, CuSO4, FeSO4 та Al(NO3)3 у
концентраціях (мг/л): 2, 5, 10, 100, 200, 500 та 1000 [Richards et al.,
2002].

В усіх подальших дослідах штами вирощували в умовах як описано для
первинного скринінгу.

Для вивчення поверхнево-активних властивостей клітин та визначення
ліпідів штами вирощували на середовищі Гудвіна (г/л): K2HPO4 – 2,0;
KH2PO4 – 2,0; MgSO4 х 7H2O – 0,5; NaNO3 – 3,0 ; цитрат Na – 1,0;
дріжджовий екстракт – 1,0 [Донец и др., 1970], в яке вносили 1 % (об.
частка) гексадекану. Інокулят готували так само як описано для
скринінгу штамів. Дослідження змін гідрофобності клітинної поверхні
проводили за методом Rosenberg et al. [1980]. Емульгуючу активність
визначали за індексом емульгування (Е24) методом Купера у модифікації
Турковської та ін. [2002]. Поверхневий натяг (ПН) досліджували за
методом Вільгельмі з використанням платинової пластинки [Абрамзон и др.,
1988].

Вміст загальних ліпідів визначали ваговим методом після їх екстрагування
сумішшю Фолча з культуральної рідини, попередньо видаливши з неї
гексаном залишки гексадекану. Якісний склад ліпідів вивчали методом
тонкошарової хроматографії у системі розчинників: хлороформ-метанол-вода
(85:15:1). Ліпіди ідентифікували після проявлення пластинок 5 %-ним
спиртовим розчином фосфорномолібденової кислоти і анісовим альдегідом із
застосовуванням маркерного аналізу.

Визначення деструктивної активності штамів щодо олив проводили після їх
росту на середовищі Мюнца з 1,0 % (об. частка) базової або 0,1 % (об.
частка) мінеральної моторної оливи. Як інокулят використовували культури
з експоненційної фази росту (28 — 36 год), вирощені на середовищі
Гудвіна. Кількість залишкових вуглеводнів у культуральній рідині
визначали гравіметричним методом [Лурье, 1971] після їх екстракції
хлороформом. Фракційний склад вуглеводневих компонентів БМО вивчали
методом рідинної хроматографії з використанням гранульованого силікагелю
марки КСГК (завод “РИАП”, м. Київ). Фракціонування вуглеводнів проводили
розчинниками у такій послідовності: гексан, гексан – бензол (1:1),
бензол, хлороформ. Зміни у складі базової оливи після росту штамів
актинобактерій визначали на хромато-масспектрометричній системі Agilent
6890N/5973 inert (Germany).

Процес очищення забруднених моторними оливами відходів пластмасових
каністр досліджували на середовищі Мюнца за розробленою нами методикою.
Інокулят готували так само як описано при визначенні деструктивної
активності штамів. Єдиним джерелом вуглецю та енергії слугували
вуглеводні моторних олив, що знаходились на поверхні внесених у
середовище попередньо зважених 5,0 г пластинок з середнім розміром
1-2 х 3-4 см, які отримували шляхом подрібнення пластмасових каністр
з-під моторних олив. Кількість вуглеводнів на цих пластинках до початку
та в кінці дослідів визначали гравіметричним методом після їх екстракції
хлороформом [Лурье, 1971]. Для підрахунку загальної початкової кількості
вуглеводнів на дослідних пластинках (С0) за основу брали попередньо
визначену нами середню розрахункову кількість вуглеводнів на 1,0 г
пластинок (СП), яка дорівнювала 0,0554±0,003 г. Аналіз результатів
процесу очищення пластинок від олив проводили за такими показниками:
ефективність відмивання поверхні пластмаси (ЕВ), яку оцінювали шляхом
порівняння вмісту вуглеводнів на забруднених і відмитих пластинках та
ступенем деструкції олив (ЕД), змитих з пластинок у середовище в процесі
культивування бактерій. Вказані показники визначали за формулами:

Показник процесу Формула для розрахунку

Початкова кількість вуглеводнів на 5 г дослідних пластинок (С0), г С0 =
m х СП, г

Ефективність відмивання поверхні пластмасових пластинок (ЕВ), % ЕВ= С0 –
С1 х 100

С0

Ступінь деструкції оливи (ЕД), змитої з пластинок у середовище
культивування, % ЕД= С0 – (С1+ С2) х 100

С0

Примітки: m – вага дослідних пластинок; С1 – залишкова кількість
вуглеводнів на пластинках, г; С2 – залишкова кількість вуглеводнів в
культуральній рідині, г

Статистична обробка одержаних результатів проводили з використанням
комп’ютерної програми Microsoft Office Excel 2003.

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Засвоєння різних марок мінеральних моторних олив нокардіоподібними
актинобактеріями та їх деструктивна активність. Із забрудненого
мастильними матеріалами ґрунту і активного мулу міських очисних споруд
виділено 21 штам бактерій, які за морфолого-культуральними та
фізіолого-біохімічними ознаками відповідали характеристикам
нокардіоподібних актинобактерій. Дослідження хемотаксономічних ознак
показало, що діагностичною кислотою їх клітинних стінок є
мезо-діамінопімелінова кислота (мезо-ДАПК). У моноцукридному складі
гідролізатів клітин переважають арабіноза і галактоза, амінокислоти
пептидоглікану містять мезо-ДАПК, аланін і глютамінову кислоту у
співвідношенні 1:2:1, що відповідає прямопоперековозв’язаному типу
пептидоглікана (варіація А1г), який притаманний нокардіоподібним
актинобактеріям з IV типом клітинної стінки. Показано, що всі досліджені
штами містять міколові кислоти, які відрізняються між собою за величиною
Rf на хроматограмі.

За комплексом досліджених ознак ізольовані з ґрунту штами УКМ Ас-212,
УКМ Ас-220, УКМ Ас-222, УКМ Ас-223, УКМ Ас-205 та УКМ Ас-586 віднесені
до виду Dietzia maris, УКМ Ас-242 – до Rhodococcus fascians, а виділений
з активного мулу штам АИ-1 – до Rhodococcus erythropolis (табл.1).

Первинний скринінг деструкторів моторних олив проведений серед
свіжоізольованих (21 штам) та колекційних (161 штам) культур
нокардіоподібних актинобактерій показав (рис.1), що найбільша кількість
штамів, які засвоюють оливи як єдине джерело вуглецю та енергії,
належала до видів D.maris (76,0 % від досліджених), R.erythropolis
(52,0 %) та G.rubripertinctа (45,0 %).

Таблиця 1

Видова належність та основні диференцюючі ознаки ізольованих штамів

Ознаки D. maris R. fascians R.erythro-

polis

УКМ Ас-212 УКМ Ас-220 УКМ Ас-222 УКМ Ас-223 УКМ Ас-205 УКМ Ас-586 УКМ

Ас-242 АИ- 1

Колір колоній на МПА рожево-червоний жовто-

гарячий кремовий

Розмір клітин, мкм 0,5-2,0 3,0-6,0 3,0-6,0

Утворення кислоти з:

галактози

арабінози — — — — — — + —

— — — — — — + —

Засвоєння Na солей кислот: цис-аконітової

(-кетоглутарової

г-аміномасляної — — — — — — + —

— — — — — — + —

— — — — — — — —

Наявність нітратредуктази + + + + + + — +

Ріст у середовищі з 10 % NaCl — — — — — — + —

Міколові кислоти (Rf) 3,8 4,1 3,9

Значно менша кількість деструкторів олив виявлена серед штамів R.opacus
(17,0 %) та R.fascians (13,0 %). Жоден із представників видів R.longus і
R.ruber не ріс на середовищі з моторними оливами.

Рис.1 Здатність досліджених штамів нокардіоподібних актинобактерій до
засвоєння суміші (1:1:1) мінеральної, частково синтетичної та
синтетичної олив

1 — R.erythropolis; 2 — R.fascians; 3 — D.maris; 4 — R.opacus;

5 — G.rubrіpertincta; 6 — R. longus; 7 — R.ruber.

На основі проведених досліджень відібрано 8 свіжоізольованих та
15 колекційних штамів актинобактерій, що належали до видів
R.erythropolis, G.rubropertincta та D.maris і краще за інших росли
(ОГ = 1,2 — 4,2 одиниць) на суміші (1:1:1) мінеральної,
частково-синтетичної та синтетичної олив. Вивчення здатності цих штамів
до утилізації базової оливи та кожної з 5-ти досліджених марок
мінеральних моторних олив показало, що незалежно від таксономічної
належності, всі штами краще засвоювали БМО (Рис. 2). Це можна пояснити
тим, що БМО не містить присадок і, відповідно, токсичних для
мікроорганізмів речовин, які можуть негативно впливати на їх
життєздатність.

Засвоєння актинобактеріями досліджених олив як єдиного джерела вуглецю
та енергії підтверджується значним приростом у них біомаси при
культивуванні на мінеральному середовищі з цими оливами. Встановлено, що
при рості штамів R.erythropolis УКМ Ас-50, G. rubripertincta УКМ Ас-179
та D.maris УКМ Ас-205 на базовій оливі титр клітин у них з початкового
значення 1,1 х 106 — 1,3 х 106 КУО/мл збільшувався на початку
стаціонарній фазі росту (48 — 60 год) до 1,2 х 108 — 2,6 х 108 КУО/мл.

Представлені на рис.2 дані свідчать про те, що штами діетзій, гордоній
та родококів відрізняються між собою за здатністю до засвоєння різних
марок моторних олив, яка залежить від складу цих речовин та
індивідуальних особливостей штамів. Кращий ріст більшості з них
спостерігався при засвоєнні олив марок “Luxoil Super”, “Азмол Супер” та
“Havoline Premium” ніж „Esso Uniflo” та “Titan Truck SHPD”. Найвищі
показники ОГ (1,5- 4,9 одиниць) при рості на цих оливах виявлено у
штамів D. maris УКМ Ас-205, G.rubrіpertincta УКМ Ас-179 і УКМ Ас-190,
R.erythropolis УКМ Ас-50 і УКМ Ас-77.

Визначення активності деструкції актинобактеріями базової оливи
показало, що найвищим (81,0-84,0 %) цей показник був у штамів
R.erythropolis УКМ Ас-50, G. rubripertincta УКМ Ас-179 та D. maris УКМ
Ас-205 (табл. 2). Ці результати перевищують більше ніж в 2 рази наведені
Koma et al. [2003] дані для штамів Rhodococcus sp. та Gordonia sp. при
вивченні їх здатності до деструкції базової оливи класу SAE 10. Відносно
інших досліджених нами штамів встановлено, що деструкція оливи у
R.erythropolis АИ-1 та більшості штамів D. maris складала
(72,0 % — 80,0 %). Менші значення цього показника (52,0%-63,0%) виявлені
у G. rubripertincta УКМ Ас-178, УКМ Ас-190 та R.erythropolis УКМ Ас-48,
УКМ Ас-58 і УКМ Ас-73; ще нижчою (25,0-49,0 %) деструкція була у решти
досліджених штамів.

Таблиця 2

Деструкція базової мінеральної оливи марки НС 22/130 штамами

Gordonia rubripertincta, Rhodococcus erythropolis та Dietzia maris

№ п/п Штами Деструкція, %

1. R.  erythropolis УКМ Ас-50

G. rubripertincta УКМ Ас-179

D. maris УКМ Ас-205 81,0

82,0

84,0

2. D. maris УКМ Ас -220, УКМ Ас-221, УКМ Ас-222, УКМ Ас-223, УКМ Ас-586

R. erythropolis АИ-1

72,0-80,0

3. R. erythropolis УКМ Ас-48, УКМ Ас-73, УКМ Ас-58

G. rubripertincta УКМ Ас-178, УКМ Ас-190 52,0-63,0

4. G. rubripertincta УКМ Ас-171, УКМ Ас-175, УКМ Ас-189

R. erythropolis УКМ Ас-23, УКМ Ас-43, УКМ Ас-44, УКМ Ас-77 R. fascians
УКМ Ас-242 25,0-49,0

Результати деструкції враховували через 14 діб культивування штамів

1/4

\

”y@

¬

”y@

¬

a$

”y@

¬

OeE ”y@

¬

&`/„?Ifa$

”y@

¬

штамів, показало, що вони містять від 100 % до 72,3 % вуглеводнів,
основними компонентами яких є парафіно-нафтенова фракція, що складає
90,7 — 96,9 % від загального вмісту вуглеводнів, в незначній кількості
представлені ароматична (1,9 — 4,3 %) та смолисто-асфальтенова
(1,2 — 2,5 %) фракції. Встановлено, що деструктивна активність штамів
G.rubripertincta УКМ Ас-179, R. erythropolis УКМ Ас-50 та D.maris УКМ
Ас-205 визначена через 5 діб культивування, була найвищою (56,9-64,6 %)
щодо парафіно-нафтенової фракції базової оливи (табл. 3). Найбільшу
ступінь деструкції ароматичної (40,5 %) та смолисто-асфальтенової
(61,7 %) фракції вуглеводнів проявляв D.maris УКМ Ас-205. Активність
деструкції цих фракцій у штаму R.erythropolis УКМ Ас-50 була нижчою на
5,5 % та 20,1%, а у G.rubripertincta УКМ Ас-179 – на 15,0 % та 21,6 %,
відповідно. Результати наших досліджень дещо перевищують дані, які
отримані K.Jiraspripongpun et al. [2002] при дослідженні здатності до
біодеградації різних груп вуглеводнів моторних олив марки Hokkaido
представниками інших видів родів Gordonia та Rhodococcus.

Таблиця 3

Деструкція окремих фракцій вуглеводнів базової мінеральної оливи

марки НС 22/130 штамами G. rubripertincta, R.erythropolis та D.maris

Вуглеводні Початкова кількість вуглеводнів, % Деструкція, %

G.rubripertincta

УКМ Ас-179 R. erythropolis

УКМ Ас-50 D.maris УКМ Ас-205

Парафіно-нафтенові 96,9 61,3 56,9 64,6

Ароматичні 1,9 20,0 35,0 40,5

Смолисто-асфальтенові 1,2 20,0 41,6 61,7

Примітка: початковий вміст оливи у середовищі дорівнював 1,0 % (об.
частка)

Якісні та кількісні зміни у складі базової оливи, які відбуваються після
5 діб культивування з активними штамами-деструкторами олив, підтверджено
методом хромато-масспектрометрії, за допомогою якого встановлено
(рис. 3), що найбільший рівень деструкції (61,3 %) цієї оливи мав штам
R.erythropolis УКМ Ас-50 і менші — G.rubrірertinctа УКМ Ас-179 (50,8%)
та D.maris УКМ Ас-205 (30,8%).

Вплив високих концентрацій мінеральних моторних олив та присадок на
життєздатність штамів нокардіоподібних актинобактерій. Враховуючи
наявність у складі моторних олив токсичних сполук, які можуть негативно
впливати на життєздатність мікроорганізмів, ми провели визначення
чутливості штамів до різних концентрацій базової оливи та використаних у
роботі марок мінеральних моторних олив, пакетів присадок і
індивідуальних функціональних присадок. Нами встановлено, що у 100 %
концентрації БМО не впливала на ріст штамів актинобактерій (Рис.4, а), а
всі досліджені моторні оливи проявляли різну ступінь антимікробної дії
щодо цих мікроорганізмів (рис.4, б-г). Найменше пригнічувала ріст штамів
олива “Азмол-супер” (рис.4, г), середнє значення МПК якої дорівнювало
0,8 г/мл (рис. 5). Більшу антимікробну активність (МПК=0,5 — 0,7 г/мл)
щодо досліджених штамів проявляли оливи марок “Luxoil Super” і “Havoline
Рremium” (ри.4, в; рис. 5). Найбільш чутливими актинобактерії були до
олив “Titan Truck” і “Esso Uniflo” (рис.4, б), які мали середні значення
МПК 0,18-0,22 г/мл.

Рис.4. Чутливість штаму R.erythropolis УКМ Ас-77 до 100 % концентрації
базової мінеральної оливи марки НС 22/130 (а) та мінеральних моторних
олив “Esso Uniflo” (б), “Havoline Premium” (в) та “Азмол-супер” (г).

Рис. 5. Середні значення мінімальних пригнічуючих концентрацій різних
марок мінеральних моторних олив для штамів D.maris, G.rubripertincta, та
R.erythropolis.

Визначення антимікробної дії пакетів присадок показало, що всі вони
пригнічували ріст досліджених штамів, за винятком HITEC 320N ? єдиного
із досліджених 7 пакетів, який не містить дітіофосфату цинку (ДТЦ).
Встановлено, що значення МПК пакетів присадок знаходилось в прямій
залежності від кількості в них ДТЦ. Найменшу антимікробну дію
(МПК=0,04-0,08 г/мл) проявляли пакети Infеnium D2281 та D3354, які
містили 0,7 — 0,8 % ДТЦ (Рис. 6). Значно більше пригнічували ріст
досліджених штамів решта пакетів присадок (МПК= 0,015 — 0,022 г/мл),
концентрація ДТЦ в яких була в 2-3 рази більшою.

Рис. 6. Середні значення мінімальних пригнічуючих концентрацій різних
марок пакетів присадок для штамів D. maris, G. rubripertincta,
R. erythropolis та R. fascians.

Дослідження антимікробної дії 9 марок індивідуальних функціональних
присадок на штами-деструктори олив показало, що всі вони були стійкими
до мийно-диспергувальних, в’язкістних, депресорних і антифрикційних
присадок (Рис. 7, а-е), які не містять дітіофосфат цинку. На відміну від
цього всі, без винятку, штами були чутливі до протизношувальної присадки
Multadit OB (рис.7, и; рис. 8), кількість ДТЦ в якій складає 8 %.

Рис. 8. Чутливість штаму R.erythropolis УКМ Ас-50  до  присадок
Детерсол-140 (а), Hitec 611 (б), С-150 ВО Нафтан (в), Komad-302 (г),
Hitec 623 (д), Liqui Moly (е), Плексол (ж), Полібутен (з) та Multadit OB
(и)

Мінімальна пригнічуюча концентрація цієї присадки для більшості штамів
G.rubripertincta дорівнювала 10 мг/мл, для D.maris – 8 мг/мл, а
R.erythropolis – 4 мг/мл (рис.8). Найбільшу стійкість до цієї присадки
(МПК = 20 мг/мл) проявляли штами D.maris УКМ Ас-222 та R.fascians УКМ
Ас-242.

Рис.8. Мінімальна пригнічуючи концентрація присадки Multadit OB для
штамів R.erythropolis (23, 43, 44, 48, 50, 58, 73, 77, АИ-1),
G.rubripertincta (171, 175, 178, 179, 189, 190), D.maris (221, 220, 222,
223, 205, 586, 734) та R.fascians УКМ Ас-242

Стійкість штамів актинобактерій до окремих компонентів олив та деяких
факторів середовища. Відомо, що моторні оливи у складі компонентів
присадок містять сполуки цинку, сірки та фенолу. В результаті
експлуатації олив в них можуть накопичуватися такі метали як мідь,
залізо, алюміній та свинець, підвищуватись мінералізація та знижуватись
рН [Караулов, Худолий, 2000]. Враховуючи це, нами досліджена стійкість
штамів-деструкторів олив до вказаних металів, сірки та фенолу, а також,
до деяких несприятливих факторів середовища (високих та низьких значень
рН, концентрацій NaCl і температури).

Встановлено, що штами актинобактерій проявляли різну чутливість до іонів
досліджених металів, з яких найбільш токсичний ефект проявляли Cu2+,
Al3+ та Zn2+. За ступенем токсичності щодо штамів-деструкторів моторних
олив іони металів можна розташувати у наступній послідовності: Cu2+
(МПК = 2-5 мг/л) > Al3+ (МПК = 50 мг/л) > Zn2+ (МПК = 50 — 100 мг/л) >
Pb2+ (МПК = 200 – 500 мг/л) > Fe 2+ (МПК = 500 мг/л). Це узгоджується з
даними інших авторів [Мельников, 2005; Худокормов, 2006], які визначали
вплив іонів важких металів на деяких представників родів Rhodococcus,
Gordonia і Dietzia.

Вивчення впливу елементарної сірки на ріст штамів актинобактерій
показало, що більшість з них були стійкими до її концентрації
0,2-0,4 мг/мл. Найбільшу чутливість до сірки проявляли D.maris УКМ
Ас-205 та УКМ Ас-586, затримка росту яких спостерігалась при її
найменшій концентрації (0,2 мг/мл). Встановлено, також, що всі
актинобактерії були стійкими до концентрації фенолу 5 мг/мл, більшість з
них проявляли стійкість до 10 мг/мл і значно менша кількість – до
25 мг/мл. Концентрація цього дезинфектанта 50 — 60 мг/мл пригнічувала
ріст всіх штамів незалежно від їх видової належності.

Визначення чутливості штамів-деструкторів моторних олив до різних
значень мінералізації середовища показало, що всі вони росли в
присутності 1,0 — 5,0 % NaCl, а більшість з них – при 7 % NaCl.
Галотолерантними виявилися штами R.fascians УКМ Ас-242, G.rubripertincta
УКМ Ас-189 та R.erythropolis УКМ Ас-44, які були стійкими до 10 % NaCl,
а також, R.erythropolis УКМ Ас-50, який ріс при 15 % NaCl в середовищі.
Всі досліджені штами проявляли життєздатність в діапазоні рН від 6 до 10
одиниць, росли за температури 15-42°С та проявляли стійкість до
нагрівання при 60°С впродовж 15 хвилин, що свідчить про їх переваги
перед іншими мікроорганізмами – деструкторами вуглеводнів при рості в
несприятливих умовах існування.

Характеристика гідрофобності клітинної поверхні штамів-деструкторів
моторних олив та їх здатність до синтезу поверхнево-активних речовин.
Враховуючи те, що при засвоєнні нерозчинних у воді речовин, до яких
відносяться і мінеральні моторні оливи, значну роль відіграють
поверхневі властивості клітин, нами були вивченні зміни гідрофобності
клітинної поверхні активних штамів-деструкторів олив в процесі засвоєння
ними вуглеводнів. Встановлено, що впродовж фази активного росту до
початку стаціонарної фази відбувається значне підвищення показника
гідрофобності клітинної поверхні досліджених штамів, який змінювався у
G. rubripertincta УКМ Ас-179 – з 18 % до 82 %, а у R. erythropolis УКМ
Ас-50 –  з  5 % до 80 % (рис. 9). Виявлені нами закономірності
підтверджуються і роботами інших авторів [Bredholt et  al., 2002], які
досліджували гідрофобно-гідрофільні властивості клітинної поверхні
штамів родококів при їх рості на вуглеводневих субстратах.

Нами встановлено, що засвоєння вуглеводнів штамами-деструкторами
моторних олив супроводжується синтезом поверхнево-активних речовин, про
що свідчить зниження поверхневого натягу в середовищі культивування з
72,0 мН/м до 43,0 мН/м у штаму G.rubripertincta УКМ Ас-179, до 45,3 мН/м
– у D.maris УКМ Ас-205 та 35,0 мН/м – у R.erythropolis УКМ Ас-50.
Значний рівень зниження поверхневого натягу штамом R.erythropolis УКМ
Ас-50 свідчить про його перспективність як продуцента біоПАР. За нашими
даними основними компонентами біоПАР, що синтезують досліджені штами, є
трегалозомономіколати і трегалозодиміколати, які, як відомо з літератури
[Коронелли и др., 1990], є основними гліколіпідними біополімерами їх
клітинних стінок.

Рис. 9. Зміна гідрофобності клітинної поверхні штамів G.rubripertincta
УКМ Ас-179 та R.erythropolis УКМ Ас-50 при рості на гексадекані; ? – КУО
– колонієутворюючі одиниці; Д – показник гідрофобності

Дослідження емульгуючої активності штамів-деструкторів моторних олив
показало, що вони здатні утворювати емульсії типу “олія у воді”, які
стабільні понад 30 діб спостережень. Найбільші значення індексу
емульгування (Е24) – 40,3 — 57,3 % виявлені у суспензіях клітин відмитих
від культуральної рідини, дещо меншим (Е24 = 36,2 — 57,8 %) цей показник
був у культуральної рідини вказаних штамів (рис.10). Самі низькі
значення Е24 (1,7- 13,0 %), виявлені у супернатантів культуральної
рідини G.rubripertincta УКМ Ас-179, D.maris УКМ Ас-205 та R.erythropolis
УКМ Ас-50, свідчать про те, що синтезовані ними емульгатори асоційовані
з клітинами. Отримані результати узгоджуються з літературними даними про
здатність нокардіоподібних актинобактерій при рості на вуглеводневих
субстратах синтезувати клітиннозв’язані біоПАР, які проявляють
емульгуючі властивості [Philp et al., 2002; Куюкина, 2006].

Рис. 10. Емульгуюча активність (Е24) суспензії клітин, культуральної
рідини і супернатанту культуральної рідини штамів R.erythropolis УКМ
Ас-50 (1), G.rubripertincta УКМ Ас-179 (2) та D. maris УКМ Ас-205 (3) в
кінці експоненціальної фази росту на середовищі з гексадеканом

Враховуючи те, що активні штами-деструктори моторних олив синтезують
поверхнево-активні речовини, ми дослідили здатність цих бактерій очищати
поверхню використаних пластмасових каністр від олив з метою подальшого
її використання як вторинної сировини у виробництві пластмаси.
Актуальність цієї проблеми пояснюється тим, що в останні роки значно
збільшується забруднення довкілля тарою з-під олив, яка не розкладається
в природних умовах. Проведені нами дослідження показали, що самим
високим рівнем ефективності відмивання поверхні пластмаси та деструкції
олив у середовищі характеризувався штам R. erythropolis, для якого
вказані показники досягали значень 58,2 % та 55,1 %, відповідно, дещо
меншими вони були у штамів G. rubripertincta та D.maris (табл. 6).
Спільне культивування вказаних штамів призводило до підвищення в
1,1 — 1,9 рази ефективності цих процесів.

Таблиця 6

Результати очищення актинобактеріями пластмасових каністр від олив

Штами Загальна деструкція вуглеводнів (ЕД), % Ефективність від-мивання
поверхні пластмаси (ЕВ), %

R.erythropolis УКМ Ас-50 55,1±3,2 58,2±2,9

G.rubrіpertinctаУКМ Ас-179 47,2±5,4 49,6±5,3

D.maris УКМ Ас-205 31,5±9,5 36,4±9,4

Спільне культивування штамів УКМ Ас-50, УКМ Ас-179 та УКМ Ас-205
59,2±1,7 66,4±4,7

Контроль (без мікроорганізмів) 2,1±1,3 6,0±1,9

Отримані нами дані свідчать про те, що здатність досліджених штамів
актинобактерій до очищення пластмасової тари від залишків моторних олив
обумовлена високою метаболічною активністю цих мікроорганізмів щодо олив
та їх поверхнево-активними властивостями.

ВИСНОВКИ

1. Встановлена належність до видів Dietzia maris, Rhodococcus fascians
та Rhodococcus erythropolis штамів нокардіоподібних актинобактерій,
ізольованих із забруднених мастильними матеріалами ґрунтів та активного
мулу міських очисних споруд. Скринінг деструкторів моторних олив серед
21 свіжоізольованого та 161 колекційного штаму актинобактерій показав,
що більшість з них належить до видів D.maris (76,0 % із досліджених),
R.erythropolis (52,0 %) та G.rubripertincta (45 %). 

2. Вперше виявлена здатність видів родів Dietzia, Gordonia і Rhodococcus
до утилізації базової мінеральної оливи та 5 марок мінеральних моторних
олив класу 15W-40. Найвищу деструктивну активність щодо базової оливи
(81,0 -84,0 %) та моторних олив (40,3 — 66,9 %) проявляють штами
G. rubripertincta УКМ Ас-179, R. erythropolis УКМ Ас-50 та D. maris УКМ
Ас-205.

3. Вперше визначена чутливість актинобактерій до високих концентрацій
мінеральних моторних олив та присадок до них і показано, що вона є
штамовоспецифічною характеристикою, яка залежить від складу цих речовин
та їх вмісту у середовищі. Найбільшу антимікробну дію щодо
актинобактерій проявляли оливи марок “Esso Uniflo” і “Titan Truck SHPD”
(МПК = 0,05 -0,4 г/мл), пакети присадок Infenium D1272, Infenium Р5265,
Hitec D2854 і Hitec 9227 (МПК = 0,006 — 0,02 г/мл) та протизношувальна
присадка Multadit OB (МПК = 0,0004 — 0,002 г/мл), що обумовлено найвищим
вмістом в них основного токсичного компоненту олив – дітіофосфату цинку.

4. Штами-деструктори моторних олив проявляють різну чутливість до важких
металів, які присутні в оливах. За збільшенням ступеня токсичного впливу
на актинобактерії іони важких металів можна розташувати у такій
послідовності: Cu2+ > Al3+ > Zn2+ > Pb2+ > Fe2+. Більшість досліджених
штамів проявляють життєздатність в широкому діапазоні рН (6-10),
температури (5-42°С) та мінералізації середовища (1-7 % NaCl), стійкі до
концентрації сірки 0,2 — 4,0 мг/мл та фенолу 5 — 10 мг/мл.

5. Процес засвоєння нокардіоподібними актинобактеріями вуглеводневих
компонентів моторних олив супроводжується значним підвищенням (з
1,8 -12,5 % до 53,0 — 83,0 %) рівня гідрофобності клітинної поверхні та
синтезом поверхнево-активних речовин, які знижують поверхневий натяг у
середовищі до 45,3 — 35,0 мН/м, проявляють емульгуючі властивості
(Е24=40,3 — 57,3 %) та здатні до утворення стійких емульсій типу “олія у
воді”. Штами R.erythropolis УКМ Ас-50, D.maris УКМ Ас-205 та
G.rubripertincta УКМ Ас-179 – найбільш активні деструктори моторних
олив, здатні очищати пластмасову тару від залишків олив.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

Ногіна Т.М., Хоменко Л.А., Підгорський В.С. Характеристика штамів
алканотрофних нокардіоподібних актинобактерій, що засвоюють нафтові
мастила // Наукові записки НаУКМА. Серія Біологія та екологія. ? 2004. ?
Т.29. ? С. 49-55 (Здобувачем самостійно вивчена здатність колекційних
штамів актинобактерій до росту на моторних оливах та досліджена динаміка
їх росту на мінеральному середовищі з оливами).

Хоменко Л.А., Ногіна Т.М., Куберська С.Л. Деградація моторних мастил
нокардіоподібними актинобактеріями // Вісник Одеського Національного
Університету. – 2005. ? T.10. ? Випуск 7. ? С. 90-95 (Здобувачем
самостійно вивчена здатність актинобактерій до засвоєння суміші різних
типів олив та отримані зразки для їх хроматографічного аналізу).

Хоменко Л.А., Ногіна Т.М., Підгорський В.С. Здатність штамів
R.erythropolis до утилізації мінеральних моторних олив та їх стійкість
до деяких стресових факторів // Наукові записки НаУКМА. Серія Біологія
та екологія. ? 2005. – T.43. – С.38-42 (Здобувачем самостійно
досліджений ріст на різних марках мінеральних моторних олив штамів
R.erythropolis та їх чутливість до різних концентрацій цих речовин).

Хоменко Л.А., Ногіна Т.М., Підгорський В.С. Вплив мінеральних моторних
олив та пакетів присадок до них на ріст штамів Gordonia rubripertincta
// Науковий вісник Чернівецького Університету. Серія Біологія. ? 2006.
? Випуск 297. ? С. 117-121 (Здобувачем самостійно досліджена здатність
до росту на моторних оливах штамів G.rubripertincta та їх стійкість до
різних концентрацій цих речовин).

Ногіна Т.М., Хоменко Л.А., Підгорський В.С., Шамкіна С.С. Природні штами
нокардіоподібних актинобактерій-деструктори моторних олив // Наукові
записки НаУКМА. Серія Біологія та екологія. ? 2006. ? T.54. – С. 31-35
(Здобувачем самостійно досліджені морфолого-культуральні та фізіологічні
властивості 8 свіжоізольованих штамів актинобактерій, вивчена їх
чутливість до моторних олив та пакетів присадок).

Підгорський В.С., Ногіна Т.М., Думанська Т.У., Куберська С.Л.,
Хоменко Л.А. Перспективи використання алканотрофних бактерій для
очищення відходів пластмаси від залишків моторних мастил // Труди ІІ
науково-технічної конференції „Нові технології та обладнання по
переробці промислових та побутових відходів і їх медико-екологічне
забезпечення (17-20 лютого 2003р). ? смт. Східниця. – 2003. ? С.118-121.

Чернишенко А.С., Хоменко Л.А. Нокардіоподібні бактерії-деструктори
нафтопродуктів // 69-та Наукова конференція молодих вчених, аспірантів
та студентів НУХТ (22-24 квітня 2003 р), Київ, НУХТ, 2003. ? C. 69.

Хоменко Л.А., Ногіна Т.М. Здатність нокардіоподібних актинобактерій до
біодеградації нафтових мастил // Матеріали науково-практичної
конференції “Природничі науки на межі століть” (23-25 березня 2004). ?
Ніжин. ? 2004. ? С.103-104.

Хоменко Л.А., Ногіна Т.М., Куберська С.Л. Деградація моторних мастил
нокардіоподібними актинобактеріями // Тези доповідей Х з’їзду Товариства
мікробіологів України (15-17 вересня 2004р). ? Одеса: Астропринт. ?
2004. ? С.89.

Хоменко Л.А., Ногіна Т.М. Вплив деяких компонентів моторних олив на ріст
вуглеводеньокислюючих штамів нокардіоподібних актинобактерій // Тези
доповідей пер-шої міжнародної наукової конференції студентів та
аспірантів “Молодь і поступ біології” (11-14 квітня 2005 р). ? Львів –
2005. ? С.96.

Ногина Т.М., Хоменко Л.А., Подгорский В.С. Влияние различных типов
присадок на рост штаммов R.erythropolis – деструкторов моторных масел //
Тезисы докладов Международной конференции “Проблемы биодеструкции
техногенных загрязнителей окружающей среды” (14-16 сентября 2005 г). ?
Саратов. ? 2005. ? С.38-39.

Хоменко Л.А., Ногіна Т.М., Куберська С.Л. Біорозщеплюваність моторних
олив під дією вуглеводеньокислюючих бактерій // Тези доповідей другої
міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів “Молодь і
поступ біології” (21-24 березня 2006р). ? Львів. ?2006. ? С. 328-329.

Хоменко Л.А., Ногина Т.М. Чувствительность природных изолятов
нокардиоформ к антимикробному действию моторных масел // Тезисы 10-й
Пущинской Школы-конференции молодых ученых (посвященная 50-летию
Пущинского научного центра РАН), (17-21 апреля 2006 г). ? Пущино. ?2006.
? С.218.

Ногина Т.М., Подгорский В.С., Хоменко Л.А. Особенности бактериальной
деструкции минеральных моторных масел // Тези доповідей Міжнародної
наукової конференції „Мікробні біотехнології” (11-15 вересня 2006 р) –
Одеса: Астропринт. – 2006. – С.198

Пристай М.И., Хоменко Л.А. Здатність штамів Rhodococcus erythropolis,
Gordonia rubripertincta і Dietzia maris до синтезу поверхнево-активних
речовин // Тези доповідей третьої наукової конференції студентів і
аспірантів “Молодь і поступ біології” (23 — 27 квітня 2007 р). ? Львів.
? 2007. ? С. 359

Homenko L., Nogina T. Ability actinobacteria of genus Rhodococcus and
Gordonia to clear waste products of plastic container of motor oils
rests // Modern problems of Microbiology and Biotechnology: Book of
abstracts: Матеріали Міжнародної конференції молодих учених і студентів
/ Голов. ред. В.О. Іваниця. – Одеса: Астропринт, 2007. – С.80.

АНОТАЦІЯ

Хоменко Л.А. Нокардіоподібні актинобактерії – деструктори моторних олив.
– Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Інститут мікробіології і
вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України, Київ, 2007.

Встановлена здатність нокардіоподібних актинобактерій родів Dietzia,
Gordonia і Rhodococcus до деструкції 5 марок мінеральних моторних олив
класу 15W-40. Найвища деструктивна активність (40,3 — 66,9 %) щодо цих
олив виявлена у штамів G.rubripertincta УКМ Ас-179, R.erythropolis УКМ
Ас-50 та D.maris УКМ Ас-205. Показано, що чутливість актинобактерій до
високих концентрацій олив та присадок корелює з присутністю і кількістю
в них дітіофосфату цинку. Серед важких металів, які містяться в оливах,
найбільшу токсичну дію на досліджені штами виявляли іони міді, алюмінію
та цинку. Більшість штамів-деструкторів олив життєздатні в широкому
діапазоні рН (6 — 10), температури (5 — 42°С) і мінералізації
(1-7 % NaCl) середовища, витримують нагрівання при 60°С впродовж
15 хвилин, проявляють стійкість до концентрації сірки 0,2 — 4,0 мг/мл та
фенолу 5 — 10 мг/мл.

Показано, що процес засвоєння актинобактеріями вуглеводнів моторних олив
супроводжується значним підвищенням гідрофобності клітинної поверхні та
синтезом клітиннозв’язаних поверхнево-активних речовин, які проявляють
емульгуючі властивості (Е24 = 40,3-57,3 %) та утворюють стійкі емульсії
типу „олія у воді”. Встановлено, що у складі цих речовин переважають
гліколіпіди (моно- та диміколати трегалози), які знижують поверхневий
натяг води до 45,3 — 35,0 мН/м. Виявлена здатність досліджених штамів до
очищення пластмасових каністр від залишків моторних олив.

В результаті проведених досліджень відібрані активні штами-деструктори
моторних олив перспективні для використання в біотехнологіях очищення
забрудненого цими мастильними матеріалами навколишнього середовища.

Ключові слова: нокардіоподібні актинобактерії, моторні оливи, присадки,
біодеструкція, антимікробна дія, важкі метали, гідрофобність,
поверхнево-активні речовини.

АНОТАЦИЯ

Хоменко Л.А. Нокардиоподобные актинобактерии – деструкторы моторных
масел. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.07 – микробиология. – Институт микробиологии и
вирусологии им. Д. К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2007.

Исследована способность к деструкции минеральных моторных масел штаммами
нокардиоподобных актинобактерий и изучены их биологические особенности
при росте на этих субстратах. Наибольшее количество штаммов, которые
усваивают различные марки минеральных моторных масел класса 15W-40,
принадлежат к видам G. rubripertincta, R. erythropolis и D. maris.
Установлено наличие у этих микроорганизмов субстратной специфичности по
отношению к моторным маслам разного химического состава. Наивысшая
степень деструкции базового масла (81,0 — 84,0 %) и минеральных моторных
масел (40,3 — 66,9 %) выявлена у штаммов G.rubripertincta УКМ Ас-179,
R.erythropolis УКМ Ас-50 и D.maris УКМ Ас-205.

Показано, что чувствительность актинобактерий к высоким концентрациям
исследованных марок масел, пакетов присадок и индивидуальных
функциональных присадок является штаммовоспецифичной характеристикой,
которая зависит от присутствия и количества в них основного токсического
компонента масел – дитиофосфата цинка. Средние значения минимальных
ингибирующих концентраций моторных масел, пакетов присадок и
противоизносной присадки Multadit OB, которые содержат дитиофосфат
цинка, составляли для исследованных штаммов 0,18 — 0,80 г/мл,
0,015 — 0,080 г/мл и 0,0004 — 0,002 г/мл, соответственно. По возрастанию
степени токсического влияния на штаммы актинобактерий ионы тяжелых
металлов, которые присутствуют в маслах, можно расположить в такой
последовательности: Cu2+ > Al3+ > Zn2+ > Pb2+ > Fe2+. Большинство
штаммов-деструкторов моторных масел проявляют устойчивость к
неблагоприятным условиям существования – они жизнеспособны в широком
диапазоне рН (6-10) и минерализации среды (1-7 % NaCl), растут при
температуре 15 — 42°С, выдерживают нагревание при 60°С на протяжении 15
минут, устойчивы к содержанию серы 0,2-4,0 мг/мл и фенола 5-10 мг/мл.

Процесс усвоения углеводородов штаммами-деструкторами моторных масел
сопровождается значительным (в 5 — 6 раз) повышением уровня
гидрофобности клеточной поверхности и синтезом поверхностно-активных
веществ, которые снижают поверхностное натяжение в среде до 45,3 мН/м —
35,0 мН/м, проявляют эмульгирующие свойства (Е24 = 40,3 — 57,3 %) и
образуют устойчивые эмульсии типа “масло в воде”. Установлена
способность исследованных штаммов к очистке пластмассовых канистр от
остатков масел.

В результате проведенных исследований отобраны активные
штаммы-деструкторы моторных масел, перспективные для использования в
биотехнологиях очистки окружающей среды, загрязненной этими смазочными
материалами.

Ключевые слова: нокардиоподобные актинобактерии, моторные масла,
присадки, биодеструкция, антимикробное действие, тяжелые металлы,
гидрофобность, поверхностно-активные вещества.

SUMMARY

Homenko L.A. Noсardioform aсtinobaсteria are destructors of motor oils.–
Manuscript.

The candidate degree thesis by speciality 03.00.07 – microbiology.
Zabolotny Institute of Microbiology and Virology of National Academy of
Sciences of Ukraine, Kyiv, 2007.

The ability of nocardioform actinobacteria belongongin to genera
Dietzia, Gordonia and Rhodococcus to degrade mineral motor oils of the
class 15W-40 of 5 different brands has been determined. The strains of
G.rubripertincta UCM Ac-179, R.erythropolis UCM Ac-50 and D.maris UCM
Ac-205 possessed the highest degrading activity of the given oils. It
has been shown that concentration of zinc dithiophosphate in oils and
additives determined sensitivity of actinobacteria to high levels of
these compounds. Among heavy metal ions present in motor oils copper,
aluminum and zinc were most toxic to the studied strains. Most strains
degrading motor oils maintain viability under a broad range of pH (6 —
10), temperature (5 — 42°С) and NaCl concentration (1-7 %), heating at
60°С for 15 minutes and were resistant to sulfur at concentration
0.2-4.0 mg/ml and phenol at 5-10 mg/ml.

It has been shown that during assimilation of motor oil hydrocarbons the
cell surface hydrophobicity and synthesis of cell-bound surface-active
substances considerably increased. These substances are emulsifying
agents (Е24 = 40,3 — 57,3 %) and form stable oil-water emulsions.
Glycolipids (trehalose mono- and dimycolates) made up the major part of
these substances and decrease water surface tension to 45,3-35,0 mН/m.
The studied strains have been found to remove motor oil traces from the
surface of plastic jerricans. The selected active strain-destructors of
motor oils have a potential use in bioremediation of motor
oil-contaminated natural environments.

Key words: nocardiform actinobacteria, motor oils, additives,
biodegradation, antimicrobial action, heavy metals, hydrophobicity,
surface-active substances

Рис.2. Ріст штамів D. maris  і R. fascians УКМ Ас- 242 (А),
G. rubrіpertincta   (Б)  та R. erythropolis   (В)     на мінеральних
моторних оливах різних марок

Рис. 3. Газо-рідинний аналіз деструкції базової мінеральної оливи
актинобактеріями:

контрольний зразок оливи (1);

зразки олив після росту штамів D.maris УКМ Ас-205 (2),
G. rubripertincta УКМ Ас- 179 (3) і R. erythropolis УКМ Ас- 50 (4)

б

г

в

а

г

д

в

б

а

д

ж

е

и

з

Похожие записи