.

NADH-Залежна монооксигеназна система мікросом печінки тварин при дії іонізуючого випромінювання та аліментарних факторів (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 2628
Скачать документ

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ім. В.Н. КАРАЗІНА

Ткаченко Валентина Миколаївна

УДК 577.15.03.04

NADH-Залежна монооксигеназна система мікросом печінки тварин при дії
іонізуючого випромінювання та аліментарних факторів

03.00.04 – біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському національному університеті
ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: – доктор фізико-математичних наук, професор

Товстяк Володимир Васильович,

Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна,

завідувач кафедри біологічної і медичної фізики

Офіційні опоненти: – доктор біологічних наук, старший науковий

співробітник

Мітряєва Наталія Андріївна,

НДІ медичної радіології

АМН України,

зав. відділом радіаційної біології (м. Харків),

– доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник

Розанов Леонід Федорович

Інститут проблем кріобіології та кріомедицини НАН України (м. Харків),

провідний науковий співробітник

Провідна установа:

Львівський національний університет імені Івана Франка

(кафедра біохімії) Міністерства освіти і науки України,

м. Львів

Захист дисертації відбудеться 02.11. 2005 р. о 14_ годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного
університету ім. В.Н. Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи
4, ауд. 3-15.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці
Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна за адресою:
61077, м. Харків, пл. Свободи 4.

Автореферат розісланий 01 вересня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради ________________  Падалко В.І.

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. Реальні умови існування сучасної людини
характеризуються істотним впливом на організм таких факторів, як:
емоційний стрес, несприятливі хімічні (ксенобіотики, лікарські сполуки,
харчові добавки та ін.) і фізичні фактори середовища (іонізуюче
випромінювання різної природи, статична електрика та ін.), а також
різний ступінь оптимальності раціону харчування (забезпеченість
необхідними білками, вітамінами і т.д). Ці фактори можуть приводити до
значних змін процесів метаболізму, що може викликати появу цілого ряду
таких негативних явищ, як захворювання різної етіології, передчасне
старіння і т.д.

З огляду на важливість і різноманіття функцій, що виконують
мембрани в живому організмі, стає зрозумілим, чому ці порушення процесів
метаболізму виявляються в першу чергу на рівні
структурно-функціонального стану біомембран.

Одним з відомих експериментальних підходів до вивчення біомембран є
дослідження в конкретних умовах експерименту стану мембранозв’язаних
ферментів або ферментних систем. Однією з таких систем є
електронтранспортна система мікросом печінки, яка виконує такі
найважливіші функції, як метаболізм цілого ряду ендогенних сполук,
детоксикація ксенобіотиків, десатурація жирних кислот і ряд інших [А.И.
Арчаков, 1975, А.В. Карякин, А.И. Арчаков, 1981, А.И. Арчаков, 1983,
В.В. Шуянцева и др., 1999]. Незважаючи на значну кількість робіт, ця
ферментна система (і особливо її NADH-залежний ланцюг) при цілому ряді
несприятливих впливів на організм залишається ще недостатньо вивченою, а
наявні дані літератури досить суперечливі. Дані сучасної літератури
свідчать про те, що одним з могутніх факторів-модифікаторів
біомембран є іонізуюча радіація [С.Т. Рыскулова, 1986, Б.И. Поливода
и др., 1990, А.Ю. Сунгуров, 1989, В.В. Товстяк, 1999], причому
ступінь її впливу на організм істотно залежить від повноцінності
раціону харчування, який може приводити як до посилення
ушкоджуючої дії радіації, (при незбалансованості раціону харчування)
[В.Я. Береза, Г.С. Яцула, 1994], так і значному її зменшенню (при
повноцінному раціоні харчування, збагаченому вітамінами,
іншими біологічно-активними сполуками і т.д) [Тутельян В.А., 1996,
В.М. Корзун и др., 2002, В.В. Ванханен и др., 2003].

З огляду на вищесказане, вивчення структурно-функціонального стану
біомембран, зокрема, мікросомальних (і особливо, вивчення стану
NADH-залежного електронтранспортного ланцюга) в умовах впливу іонізуючої
радіації і модифікуючої дії ступеня збалансованості раціону харчування
представляється досить актуальною проблемою.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота
виконана в рамках наукових досліджень кафедри біологічної і медичної
фізики Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна по
темах:

Дослідження фізико-хімічних механізмів впливу іонізуючого випромінювання
на структурні і функціональні властивості модельних і природних мембран
з метою розробки радіопротекторних речовин (номер держреєстрації
UA 01008653 Р);

Розробка фізико-хімічних методів екологічного контролю, радіаційного
захисту і медичної діагностики дії іонізуючих випромінювань малих
інтенсивностей (номер держреєстрації О 197 UO 16499).

Мета і задачі дослідження. Метою дисертаційної роботи явилося
встановлення закономірностей функціонування NADH-залежної
монооксигеназної системи мікросом печінки тварин при дії іонізуючої
радіації та аліментарних факторів в умовах in vitro та in vivo .

Виходячи з мети, були визначені наступні задачі:

1. Дослідження змінення вмісту та активності мембранозв’язаних ферментів
NADH-залежної електронтранспортної системи у мікросомах печінки щурів
під впливом гамма-опромінення та сумісній дії опромінення і
незбалансованої по тваринних білках і вітамінам антиоксидантного ряду
дієти, а також харчової добавки (борошна ароніі чорноплідної).

2. Вивчення структурного стану мембран мікросом печінки щурів при дії
гамма-опромінення та сумісній дії опромінення та різного складу дієти,
а також харчової добавки аронії чорноплідної.

3. Дослідження інтенсивності аскорбат-Fe2+-індукованого ПОЛ, вмісту
гідроперекисів ліпідів, швидкості генерації супероксидного радикала та
активності антиоксидантних ферментів (глутатіонпероксидази і
глутатіон-S-трансферази) в мікросомах печінки тварин під впливом
одноразового гамма-опромінення, незбалансованого раціону та харчової
добавки аронії чорноплідної. 4. Вивчення в умовах in vitro
закономірностей змінення NADH-редуктазної активності мікросомальних
мембран печінки під впливом гамма-опромінення, а також вивчення ролі
процесів перекісного окислення ліпідів (ПОЛ) у формуванні радіаційних
ефектів, що спостерігаються.

5. Вивчення в умовах in vitro впливу агентів, що модифікують структурний
стан мембран (тритона Х-100 та глутарового альдегіду), на характер
радіаційно-індукованих змін NADH-редуктазної активності мікросом
печінки.

Об’єкт дослідження. Функціонування NADH-залежної монооксигеназної
системи мікросом печінки тварин під впливом іонізуючого випромінювання
та аліментарних факторів.

Предмет дослідження. Активність та вміст мембранозв’язаних
ферментів NADH-залежної електронтранспортної системи, інтенсивність
перекісних процесів, активність антиоксидантних ферментів,
структурно-функціональний стан мікросомальних мембран.

Методи дослідження. Були використані методи диференціального
центрифугування, а також спектрофотометричні та флуориметричні методи.

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше показано, що найбільш
чуттєвою до опромінення складовою електронтранспортного ланцюга мікросом
є NADH-залежний флавопротеїд. Встановлено, що опромінення тварин, які
утримувалися на незбалансованому по білкам і вітамінам антиоксидантного
ряду раціоні харчування приводить до більш вираженого збільшення
інтенсивності процесів ПОЛ, що може бути пов’язано зі збільшенням
швидкості генерації супероксидного радикалу і зниженням
глутатіонпероксидазної та глутатіон-S-трансферазної активностей
мікросом. Показано, що одноразове гамма-опромінення тварин, які
одержували незбалансований раціон харчування, приводить до більш
виражених змін вмісту та активності компонентів NADH-залежного
електронтранспортного ланцюга мікросом печінки, ніж у тварин, які
утримувалися на оптимальному раціоні харчування. В експериментах в
умовах in vitro при дії опромінення і агентів, що модифікують
структурний стан мікросомальних мембран (тритона Х-100 та глутарового
альдегіду) встановлено, що найбільше радіочутливим є NADH-залежний
флавопротеїд, що узгоджується з даними, отриманими в умовах in vivo.

Практичне значення отриманих результатів. Результати проведених
досліджень по вивченню зміни ферментативної активності мікросомальних
мембран під впливом різних модифікуючих факторів, поглиблюють та
розширюють сучасне розуміння молекулярних механізмів впливу іонізуючих
випромінювань на структурно-функціональні властивості ферментів і можуть
стати основою для розробки науково-обгрунтованих схем захисту біомембран
від радіаційного ушкодження.

Отримані результати також вказують на можливість підвищення
радіорезистентності мембранних систем шляхом модифікації їхнього
структурного стану і фізико-хімічних властивостей, у тому числі за
допомогою застосування оптимального раціону харчування, особливо з
використанням харчових добавок.

Особистий внесок здобувача. У процесі виконання дисертаційної
роботи автор особисто проаналізував сучасну наукову літературу за темою
дослідження, підібрав методи вирішення поставлених завдань та провів
експериментальні роботи щодо вимірювання вмісту гемопротеїдів та
активності NADH-залежної монооксигеназної системи мікросом з
використанням різних субстратів окислення.

Планування напрямків досліджень та інтерпретація отриманих
результатів здійснена спільно з науковим керівником, д.ф-м.н., проф.
Товстяком В.В. Дослідження в умовах in vivo стану антиоксидантних
ферментів було проведено сумісно зі ст. наук. співр., канд. біол. наук
Нікітченко Ю.В, в умовах in vitro визначення структурного стану
мікросомальних мембран були проведені сумісно зі ст. наук. співр.,
д.ф.-м.н. Горбенко Г.П., що знайшло відображення у спільних публікаціях.
Опромінення експериментальних тварин було здійснено сумісно зі ст.н.
співр. Крупіним В.Д. та Ніколовим О.Т.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень, що
увійшли в дисертаційну роботу, були представлені та обговорені на:
Радіобіологічному з’їзді (Київ, 1993); II з’їзді біофізиків Росії
(Москва, 1999); науковій конференції, присвяченій 100-річчю з дня
народження акад. І.М. Буланкіна (Харків, 2001), VII Міжн.наук.-практ.
конф. “Наука і освіта” (Дніпропетровськ, 2004), Між.наук.-практ. конф.
“Біологічні основи продуктивності та здоров’я тварин (м. Львів, 2004),
III Львівсько-Люблінській конференції з експериментальної та клінічної
біохімії (Львів, 2004).

Публікації. Основні положення роботи викладені в 11 друкованих
працях, з яких 6 статей та 5 тез доповідей.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу,
огляду літератури по проблемі, 6 розділів, що відображають результати
власних досліджень, закінчення, висновків, списку використаних джерел,
що включає 269 найменувань. Повний обсяг дисертації складає 152
сторінки, 20 ілюстрацій, 12 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження

Для виконання роботи було використано 100 щурів-самців лінії Wistar
та 20 кролів. Усі тварини утримувалися у стандартних умовах віварія
Інституту біології ХНУ ім. В.Н. Каразіна і ІПКІКМ НАН України.
Маніпуляції з тваринами проводили згідно до Європейської конвенції про
захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних
наукових цілей (Страсбург, 1986).

Експериментальні щури були розбиті на 6 груп. Тварини 1-ї та 2-ї
груп одержували протягом 50 днів стандартний раціон віварію [Западнюк
И.П. и др., 1983], доповнений полівітамінною сумішшю “Ревіт”.

В 3-й-6-й групах експериментальних тварин недостатність раціону по
тваринних білках і вітамінам антиоксидантного ряду моделювали протягом
50 днів шляхом виключення з дієти полівітамінної добавки “Ревіт”,
проварюванням рослинної олії (+ 1800 С, 3 години) [З. З. Хакимов, 1988
], а також зернової суміші та овочів (+ 1000 С, 1 година). М’ясну
добавку раціону піддослідних тварин заміняли такою ж по кількості
добавкою провареної зернової суміші. Тварини 5-ї та 6-ї груп на фоні
незбалансованої дієти після 30 днів експерименту протягом 20 днів
одержували додатково харчову добавку борошна плодів Aronia melanocarpa у
концентрації 0.6 мг на одну тварину.

Опромінення щурів проводили одноразово дозою 8 Гр на
установці “Дослідник”. Джерело ? -опромінення Со60, потужність
експозиційної дози 1.95 Гр/хв. Ізольовані мікросоми опромінювали
одноразово дозами 10, 100, 1000 і 10000 Гр на лінійному прискорювачі
електронів “ЛУЕ-6” [А.И. Панасенко, В.Г. Рудычев, 1991; V.G. Rudichev,
I.I. Zalubovsky, 1993]. Енергія електронів при опроміненні зразків
складала 5 Мев, середній струм пучка 30 мка, потужність пучка
прискорених електронів 5.6 Квт, частота посилок від одноразової до 50
Гц, щільність потоку електронів на об’єктах з лінійними розмірами до 15
см до 1012 ел/см2 при неоднорідності меншої 10% (частота проходження 100
імпульсів за 1сек.).

Експериментальні тварини були розбиті на 6 груп, яким надалі було
присвоєно такі позначення :1 – стандартний раціон харчування віварію,
2 – стандартний раціон харчування + ?-опромінення, 3 – незбалансована
(по тваринним білкам та вітамінам антиоксидантного ряду) дієта, 4 –
незбалансована дієта + ?-опромінення, 5 – незбалансована дієта + добавка
аронії чорноплідної, 6 – незбалансована дієта + добавка борошна аронії
чорноплідної + ?-опромінення.

Мікросоми печінки тварин виділяли методом диференціального
центрифугування як описано у роботах [В.В. Лемешко, 1980; В.Н. Орехович,
1987].

Визначення NADH-редуктазних активностей проводили як описано в
роботі [И.И. Карузина, А.И. Арчаков, 1987] з субстратами: К3[Fe(CN)6]
при довжині хвилі 420 нм, з неотетразолєвим синім при 550 нм та з
2,6-ДХФІФ – при 600 нм на двопроміневому спектрофотометрі “Specord UV
VIS” (Німеччина) при постійному перемішенні і термостатуванні при 370С.
Активність виражали в нмоль продукта, що утворюється, використовуючи
коефіцієнти молярної екстинкції 1.02?103 М-1?см-1 для К3[Fe(CN)6],
28.8?103 М-1?см-1 для неотетразолєвого синього та 21?103 М-1?см-1 для
2,6-ДХФІФ, відповідно [А.И. Арчаков, 1987].

Вміст цитохромів Р-450 і в5 визначали по Omura T. and Sato R. як
описано в роботі [И.И. Карузина, А.И. Арчаков, 1987]. Спектри поглинання
гемопротеїдів записували на двопроміневому спектрофотометрі “Specord UV
VIS”. Вміст цитохромів виражали в пмоль на 1 мг білка, використуючи
коефіцієнти молярної екстинкції 91?103 М-1?см-1 та 164?103 М-1?см-1 для
цитохромів Р-450 та в5, відповідно.

Структурний стан мембран мікросом досліджували за допомогою
флуоресцентних зондів: 1-аніліно-8-сульфоната (1,8-АНС) при довжині
хвилі збудження 365 нм і флуоресценції – 470 нм, а також пірена –
довжина хвилі збудження 337 нм. Коефіцієнт ексимеризації пірена
розраховували по відношенню інтенсивності флуоресценції ексимерів (480
нм) і мономерів (390 нм) [Ю.А. Владимиров, Г.Е. Добрецов, 1980]. Спектри
флуоресценції реєстрували на спектрофлуориметрі СМ-2203 (Беларусь) та на
установці з монохроматорами МДР-23 та МСД-2 [В.А. Кобяков и др, 2004].

Дослідження інтенсивності аскорбат-Fe2+-індукованого ПОЛ мікросом
проводили як описано в роботі [Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков, 1972] при
постійному перемішуванні та термостатуванні при 370С. Спектри поглинання
пофарбованого продукту записували на спектрофотометрі “Specord UV VIS”,
виміряли різницю екстинкції при довжинах хвиль 532 і 580 нм та
розраховували кількість МДА, використовуючи коефіцієнт молярної
екстинкції, рівний 1.56?105 М-1?см-1.

Визначення вмісту гідроперекисів ліпідів у мікросомах печінки
тварин проводили за методом [Ohkawa et.al.,1979 ] з незначними змінами
[В.В. Лемешко, Ю.В Никитченко, 1986]. Спектр поглинання пофарбованого
продукту записували на двопроміневому спектрофотометрі “Specord UV VIS”,
вимірюючи потім різницю екстинкції при 532 і 520 нм. Вміст
гідроперекисів ліпідів виражали в еквівалентній кількості МДА.

Визначення вмісту вторинних продуктів ПОЛ – МДА в мікросомах
печінки тварин проводили в безбілкових пробах мікросом (після осадження
10% ТХУ), як описано в роботі [В.Н. Орехович,1987].

Ефективність перехоплення ОН? радикалів аронією чорноплідною
визначали з дезоксірібозою як описано в [B. Halliwell, et.al, 1987].
Спектр поглинання пофарбованого продукту записували на двопроміневому
спектрофотометрі “Specord UV VIS”.

Антиокислювальну активність аронії чорноплідної визначали на моделі
жовточних ліпопротеїдів, як описано в [Г.И. Клебанов и др.,1983]. Спектр
поглинання пофарбованих продуктів записували на двопроміневому
спектрофотометрі “Specord UV VIS”, при вимірюванні різниці екстинкції
при 535 та 588 нм. Результати виражали в % по відношенню до контролю.

[Р.А. Гуськова 1980].

Визначення глутатіонпероксидазної активності проводили в мікросомах
печінки щурів спектрофотометрично при довжині хвилі 340 нм як описано
в [В.З. Ланкин, С.М. Гуревич, 1976]. Активність виражали в нмоль
NADPH/хв. мг білка, використовуючи коефіцієнт молярної екстинкції
6.22?103 М-1?см-1

Визначення глутатіон-S-трансферазної активності проводили в
мікросомах печінки щурів спектрофотометрично при довжині хвилі 340 нм як
описано в роботі [M. Jones еt.al,1980]. Активність розраховували з
використанням коефіцієнта молярної екстинкції 9.6·103 М-1·см-1.

Вміст білка в досліджуваних зразках визначали по методу Лоурі і
співавторів в модифікації Міллера [S.I. Miller 1959].

Статистичну обробку результатів було проведено за допомогою
комп’ютерного пакета програм “Exel та Statistika 6,0” з використанням
t критерія Ст’юдента та кореляційного аналізу по Спірману. Відміни
вважали значущими при P ¦?u| ~ a ae O ?????~ O O O O O O $ O O ?центрація продуктів ПОЛ зростала на 65% у порівнянні з неопроміненими тваринами 1-ї групи (Рис. 6). Більш виражене збільшення гідроперекисів ліпідів в мікросомах печінки опромінених тварин, які отримували незбалансований раціон, очевидно пов'язане з тим, що сама по собі незбалансована дієта вірогідно збільшувала концентрацію продуктів ПОЛ в мікросомах (Рис. 6, 3-я група). Виявлене збільшення вмісту продуктів ПОЛ у відповідь на незбалансовану дієту узгоджується з даними роботи [Е.П. Сидорик, А.П. Бурлака, 2000] і може свідчити про активацію вільнорадикального окислювання ліпідів. Однак, більш конкретніше на це питання можна відповісти при дослідженні інтенсивності безпосередньо ПОЛ. Представлені на Рис. 7 дані свідчать, що змінення швидкості накопичення МДА при аскорбат-індукованому ПОЛ мікросом у відповідь на гамма-опромінення були подібними зі зміненнями вмісту гідроперекисей ліпідів. При цьому, більш виражене збільшення інтенсивності аскорбат-індукованого ПОЛ мікросом було у опромінених тварин, які отримували незбалансований раціон харчування. Рис. 6. Вміст гідроперекисів ліпідів в мікросомах печінки щурів при дії гамма-опромінення та аліментарних факторів. Примітки: * - P Р > 0.05) активності, а опромінення цих
тварин до достовірного зниження (на 30.3%, Р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020