Національна Академія Наук України

Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця

?????????????????????????????

Токар Сергій Леонідович

УДК 576.311.3/612.014.2/616.453

Морфо-функціональні особливості регуляції активності адренокортикоцитів
щура

03.00.13 – фізіологія людини та тварин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2005 Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі загальної фізіології нервової системи

Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України

Наукові керівники: академік НАН України, Костюк Платон Григорович

директор Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України

зав. відділом загальної фізіології нервової системи (ЗФНС)

кандидат біологічних наук Лук’янець Олена Олександрівна

провідний науковий співробітник відділу ЗФНС Інституту фізіології ім.
О.О. Богомольця

НАН України

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук Стеченко Людмила Александрівна,
професор кафедри гістології,

цитології та ембріології національного медичного університету ім.
О.О.Богомольця НАН України;

Кандидата біологічних наук Войтенко Лариса Павлівна, старший
науковий співробітник відділу нейрональних мереж інституту фізіології
ім. О.О. Богомольця НАН України.

Провідна установа: Інститут ендокрінології ім. В.П. Комісаренко АМН
України.

Захист відбудеться «15» березня 2005 р. о «14» годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при Інституті
фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ,
вул. Богомольця 4.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім.
О. О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця
4.

Автореферат розісланий «09» березня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З. О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Основною функцією секреторних клітин кори
надниркових залоз є синтез стероїдних гормонів, серед яких найбільш
відомими є кортизол, альдостерон та кортикостерон. Починаючи із 50-60
років минулого сторіччя було проведено багато досліджень, дозволивших
виявити основні ферменти, які беруть участь у стероїдогенезі. Було також
встановлено, що різні стадії стероїдогенезу відбуваються у різних
компартментах клітини. Так загальним попередником усіх типів стероїдних
гормонів є холестерол, він депонується, головним чином, у ліпідних
краплях. Для залучення у першу реакцію стероїдогенезу холестерол
транспортується до внутрішньої мембрани мітохондрії, де він
перетворюється на прегненолон, за участю особливого ферменту (цитохрому
Р450scc) та системи транспортування електронів, до якої входять
ферредоксин оксидоредуктаза та ферредоксин. Наступне перетворення
прегненолону на прогестерон або на 17–окси-прегненолон відбувається на
мембранах гладенького ендоплазматичного ретикулуму (гЕПР). Вважається,
що з мембранами гЕПР пов’язане проходження також і наступних реакцій
стероїдогенезу, але для остаточного синтезу альдостерону та кортизолу
проміжні продукти стероїдогенезу (11-дезоксикортикостерон або
17?-окси-11-дезоксикортикостерон) повинні знову потрапити на внутрішню
мембрану мітохондрій, де і відбуваються остання стадія стероїдогенезу.
Після проходження усіх перетворень готова молекула стероїдного гормону
потрапляє у позаклітинне середовище і далі до кров’яного русла.

Дослідження, що проводилися останнім часом в різних лабораторіях світу,
показали, що синтез та секреція стероїдних гормонів в клітинах кори
надниркових залоз контролюється біологічно активними речовинами, що
мають різну природу та походження. Вони потрапляють у кору надниркових
залоз з током крові або за рахунок дифузії крізь міжклітинну порожнину.
Механізм дії цих біологічно активних агентів залишається ще багато в
чому не вивченим. Так, до недавнього часу вважалось, що вплив
адренокортикотропного гормону (АКТГ) на структуру та функцію клітин кори
надниркових залоз опосередкований головним чином активацією цАМФ
залежного каскаду, тоді як результати більш пізніх досліджень показали
що месенджерні системи, які опосередковують дію АКТГ, по-перше,
багатоканальні, по-друге містять вздовж каскадів пункти “входу” та
“виходу” різноманітних модулюючих впливів. Таким чином, дуже важливим
постає питання дослідження участі різних систем внутрішньоклітинних
посередників, у регуляції життєдіяльності адренокортикоцитів.

Одним із напрямків вирішення цієї проблеми є вивчення впливу іонів
кальцію на ультраструктуру клітин кори надниркових залоз.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана
в рамках наукової програми Інституту фізіології ім О.О. Богомольця НАН
України: „Молекулярні механізми, відповідальні за специфіку функцій
різних мозкових структур” № гос. Реєстрації 0100U002062

Мета дослідження. Мета даної роботи полягала у вивченні особливостей
ультраструктури клітин пучково-сітчастої зони кори надниркових залоз, за
нормальних умов (контроль), після збільшення концентрації іонів кальцію
у цитоплазмі, після аплікації гуморального (АКТГ) та нейронального
(ацетилхоліну) факторів, здатних прискорювати стероїдогенез та після дії
агоніста мускаринових ацетелхолінових рецепторів пілокарпіну. Для
виключення можливого опосередкування впливу зазначених речовин на
ультраструктуру адренокортикоцитів через клітини інших типів,
дослідження проводилися в умовах диссоційованої культури. Вивчення
ультраструктури клітин пучково-сітчастої зони кори надниркових залоз
проводилося із застосовуванням методів електронної мікроскопії. Для
вивчення змін концентрації іонів кальцію у цитоплазмі клітини в умовах
експерименту застосовували оптичней метод вимірювання
внутрішньоклітинної концентрації кальцію.

Завдання дослідження.

1. Дослідити ультраструктуру культивованих клітин кори надниркових залоз
в контрольних умовах і виявити основні типи ультраструктури, характерні
для цих клітин.

2. Виявити зміни в ультраструктурі культивованих клітин
пучково-сітчастої зони після аплікації АКТГ, кальцієвого іонофору А23187
та гіперкалієвого розчину.

3. Провести порівняльний аналіз впливу АКТГ та речовин, що підвищують
вміст іонів кальцію у цитоплазмі, на ультраструктуру клітин
пучково-сітчастої зони кори надниркових залоз.

4. Виявити зміни в ультраструктурі культивованих клітин
пучково-сітчастої зони після аплікації ацетилхоліну та пілокарпіну.

5. Провести порівняльний аналіз впливу ацетилхоліну та пілокарпіну на
ультраструктуру клітин пучково-сітчастої зони кори надниркових залоз,
порівняти виявлені зміни в ультраструктурі із змінами, які виникають
після аплікації інших речовин, здатних підвищувати вміст іонів кальцію у
цитоплазмі.

6. Дослідити здатність АКТГ, ацетилхоліну та пілокарпіну впливати на
концентрацію іонів кальцію у цитоплазмі адренокортикоцитів.

Наукова новизна отриманих результатів. Виявлено три морфологічні типи
культивованих клітин, що походять із пучково-сітчастої зони кори
надниркових залоз, показано, що різниця в ультраструктурі цих клітин не
є строго детермінованою а може змінюватися під впливом зовнішніх
факторів. Було встановлено, що десятихвилинна інкубація із АКТГ стимулює
зменшення площі мітохондрій і одночасне збільшення щільності їх
розташування у цитоплазмі. Також показано, що зростання концентрації
іонів кальцію у цитоплазмі впливає на ультраструктуру мітохондрій і
зокрема стимулює утворення везикулярних крист; сприяє реорганізації
мембран гЕПР. Показана наявність одночасних структурних контактів
мембран гЕПР із мітохондріями та плазматичною мембраною, це може
свідчити про участь мембран гЕПР у секреції стероїдних гормонів. Вперше
показана наявність декількох типів осміофільності матриксу ліпідних
крапель клітин кори надниркових залоз; також встановлено, що специфіка
осміофільності матриксу ліпідних крапель корелює із наявністю в
ультраструктурі клітин ознак прискореного стероїдогенезу. Було
встановлено, що збільшення концентрації іонів кальцію у цитоплазмі
стимулює зменшення діаметру ліпідних крапель і одночасне збільшення
щільності їх розташування у цитоплазмі. Було також встановлено, що
збільшення концентрації іонів кальцію у цитоплазмі після аплікації
кальцієвого іонофору А23187 викликає зміни в ультраструктурі, дуже
подібні до тих, що спостерігаються після аплікації АКТГ. Це свідчить
про те, що іони кальцію можуть бути важливим внутрішньоклітинним
посередником, що опосередковує гострий вплив АКТГ на ультраструктуру
адренокортикоцитів. Отримані дані доповнюють сучасні уявлення про
ультраструктуру клітин пучково-сітчастої зони кори надниркових залоз та
участь у її регуляції механізмів чутливих до концентрації іонів кальцію
у цитоплазмі.

Теоретичне та практичне значення отриманих результатів. Отримані в даній
роботі результати мають як теоретичне, так і можливе практичне значення.
Так, були виявлені деякі раніше невідомі особливості ультраструктури
клітин кори надниркових залоз, які можуть відігравати важливу роль у
процесі стероїдогенезу. Разом із тим висловлені в цій роботі припущення
можуть створити основу для проведення подальших досліджень, що
допоможуть з’ясувати функціональне значення виявлених особливостей
ультраструктури клітин кори надниркових залоз. Важливе значення мають
отримані в цій роботі дані, щодо ролі іонів кальцію у регуляції
ультраструктури клітин кори надниркових залоз. Так, було показано, що
збільшення концентрації іонів кальцію у цитоплазмі може бути одним із
головних механізмів, що опосередковує швидкі зміни в ультраструктурі
клітин кори надниркових залоз у відповідь на аплікацію АКТГ.

Отже, виявлена чутливість ультраструктури клітин кори надниркових
залоз, особливо тих органел, що приймають участь у стероїдогенезі, до
концентрації іонів кальцію у цитоплазмі, може бути використана при
розробці лікарських препаратів, здатних впливати на секреторну функцію
адренокортикоцитів.

Особистий внесок здобувача. Аналіз отриманих електронограм, експерименти
із дослідженням вмісту іонів кальцію у цитоплазмі клітин, комп’ютерні
розрахунки із використанням непараметричного критерію Уілкоксона
проводилось особисто автором. В розробці концепції роботи, обговоренні
та редагуванні приймали активну участь співавтори публікацій. В роботі
по приготуванню культури, підготовці препаратів для
електронно-мікроскопічних досліджень та отриманні електронограм
допомагали співробітники відділу ЗФНС Коваль Л.М. та Яворська О.М.

Апробація результатів дисертації. Загальні положення роботи
висвітлювались на засіданнях наступних наукових зібрань: міжнародній
школі-семінарі ”Мембрани та сигнали” (Київ, 3-8 вересня 2000р.), на
конференції “Bogomoletz-Nencki Meeting” (Сулейов, Польща, 7-8 травня
2001р.), на міжнародній конференції „ Pharmacology of Synaptic
Transmission in the Nervous System” (Київ, 16-17 червня 2002р.), на
“Second Bogomoletz-Nencki Symposium. Intracellular signalling in
excitable cells” (Київ, 1-3 вересня 2002р.), на конференції для молодих
вчених Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАНУ „Перспективні
напрямки досліджень сучасної фізіології” (Київ, 17-18 листопада 2003) та
на IBRO Advanced school of neuroscience “Receptors, channels,
messengers” (Ялта 16-28 вересня 2005).

Публікації. За результатами роботи опубліковано 4 статті та тези 3
доповідей в наукових журналах.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду
літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів досліджень,
обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел із 183
найменувань. Робота викладена на 151 сторінках та ілюстрована 51
рисунками та 6 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтована актуальність дослідження ультраструктури кори
надниркових залоз щура та механізмів її регуляції.

В розділі 1 „Огляд літератури” наводиться історичний розвиток уявлень
про структуру та функції надниркової залози. Також відображено сучасні
погляди, що до будови надниркової залози ссавців та значення гормонів
кори надниркових залоз в регуляції гомеостазу організму. Описані основні
етапи синтезу мінерало- та глюкокортикоїдів. У цьому розділі також
наведено сучасні уявлення, що до участі деяких внутрішньоклітинних
механізмів у процесі транспорту холестеролу до внутрішньої мембрани
мітохондрій. Проаналізовані літературні дані, що до гуморальної та
нейрональної регуляції функції клітин кори надниркових залоз, та участі
іонів кальцію у опосередкуванні цих регулюючих впливів.

В розділі 2 „Матеріали і методи” описано методичні підходи використані
для досягнення поставленої мети:

• Виділення ізольованих клітин кори надниркових залоз щура.

• Приготування культури клітин кори надниркових залоз щура.

• Фіксації клітин, вміщення клітин в аралдит, контрастування та
приготування

ультратонких зрізів.

• Вивчення ультраструктури клітин за допомогою електронного мікроскопу.

• Оптичне вимірювання концентрації вільних іонів кальцію в цитоплазмі
клітини

Виділення клітин кори надниркових залоз. Експерименти проводили на
статевозрілих білих нелінійних щурах масою 180-230 грамів. Процедуру
декапітації щура проводили у відповідності з вимогами НАН України по
використанню експериментальних тварин. Виділені надниркові залози
поміщали у розчин №1 (NaCl-155мМ, Hepes-10мМ, Глюкоза-10мМ, KCl-6мМ рН
7.4) з додаванням фонового антибіотика гентоміцину (40мкл/10мл).
Ферментативну обробку тканини проводили у розчині №1, в який також
додавали 2.5 мг/мл колагенази типу А та 5 мг/мл альбуміну сироватки
крові бика (Sigma, США). В ферментативному розчині тканини витримували
протягом 25 хвилин при температурі +37оС. Після цього фермент видаляли
із тканини, повністю змінюючи розчин 5 разів у пробірці. Відмиту тканину
пропускали крізь стерильне нейлонове сито із діаметром пори 100мкм.
Отриманий після цього гомогенат центрифугували протягом 6-7 хвилин при
швидкості 1000 обертів на хвилину. Надосадову рідину зливали, а об’єм
суспензії доводили до 1 мл розчином №1. Окремі клітини отримували за
допомогою м’якого, повільного піпетування із використанням піпеток
різного диаметру. Після цього клітини поміщали на покриті поліарнітином
(Sigma, США) акларові пластинки (Nunc Inc. USA).

Умови культивування клітин. Через п’ятнадцять хвилин клітини
закріплювалися на акларових пластинках. Далі їх переносили в чашку
Петрі, що містила 2мл розчину №2 (Dolbecco’s Мodified Еagles medium
(DME), без соди-13.4г/л, NaHCO3-2.2г/л, HEPES-2.38г/л,
пеніцілін/стрептоміцин-5мл/л, гентаміцин-2мл/л, кінську сироваткау
крові-100мл/л ). Після цього чашки Петрі поміщали в СО2-інкубатор
(Ули-20, Россія). Кількість СО2 в камері інкубатора підтримувалася на
рівні 5%, а вологість 95%. Інкубація клітин проводили при +37оС, рН 7.4.

Інкубація із досліджуваними речовинами. Досліджувані речьовини
аплікувались у насичуючій концентрації, що за даними літератури
спричиняє найбільший ефект. Так у першому експерименті первинну культуру
клітин занурювали у розчин №3 (NaCl-150мМ, Hepes-10мМ, CaCl2-2мМ,
MgCl2-2мМ, KCl-5мМ рН 7.4), що також містив АКТГ (фрагмент 4-10) у
концентрації 10 мкМ. Через 10 хвилин пластинки із клітинами переносили у
фіксуючий розчин. В іншому досліді пластинки із клітинами на 30 хвилин
занурювали у розчин №1, що не містив іонів кальцію, але містив
кальцієвий іонофор A23187 у концентрації 10мкМ після цього клітини на 30
секунд переносили в розчин №2, що містив 2.5мМ CaCl2. Далі; акларові
пластинки поміщали у фіксуючий розчин. В наступному досліді збільшення
концентрації іонів кальцію у цитоплазмі досягалося за рахунок активації
потенціал керованих кальцієвих каналів. Потенціал чутливі кальцієві
канали активувались при зануренні клітин у розчин який зменшував
потенціал на клітинній мембрані. Так акларові пластинки із культурою
клітин ми поміщали на 2 хвилини у розчин №4 (NaCl-60мМ, Hepes-100мМ,
CaCl2-2мМ, MgCl2-2мМ, KCl-100мМ рН 7.4), потім їх переносили у фіксуючий
розчин. Для вивчення впливу ацетилхоліну, акларові пластинки із
одноденною культурою занурювали на 90 секунд у розчин №2, що також
містив ацетилхолін у концентрації 1 мМ. Після цього клітини поміщали у
фіксуючий розчин. Для вивчення впливу пілокарпіну на ультраструктуру
кори надниркових залоз акларові пластинки із одноденною культурою
занурювали у розчин №2, що містив пілокарпіну гідрохлорид у насичуючій
концентрації, що дорівнювала 300 мкМ. Через 10 хвилин акларові пластинки
переносили у фіксуючий розчин.

Приготування препаратів для електронно-мікроскопічних досліджень.
Акларові пластинки з контрольними клітинами, а також із тими що
інкубували у присутності досліджуваної речовини, поміщали у фіксуючий
розчин, який містив 2.5% глютаральдегіда, розчиненого у фосфатному
буфері (KH2PO4-28мМ, Na2HPO4-181мМ, та 4%-сахарози), і витримували
протягом 2-4 годин. Потім їх промивали фосфатним буфером 2 рази протягом
5 хвилин. Після цього проводили дофіксацію, шляхом занурення акларових
пластинок на 1-2 години у 1% розчин OsO4 (в тому ж фосфатному буфері).
Далі фіксуючий розчин знову відмивали, а отримані препарати зневоднювали
етанолом у зростаючій концентрації. Отримані акларові пластинки
занурювали у абсолютний ацетон, де відбувалася їх остаточна
дегідратація. Далі препарати заливали аралдитом (Fluka), при цьому
концентрацію аралдиту в розчині в три етапи збільшували до 100%, а
концентрацію ацетону відповідно зменшували до 0%.

Желатинові капсули, заповнені аралдитом, поміщали на вибраних, за
допомогою інвертованого мікроскопу (World Precision Instruments USA),
ділянках культури. Після цього акларові пластинки для полімеризації
поміщали до термостату із температурою 56-60 оС на дві доби. Отримані
желатинові блоки відділяли від акларових пластинок. За допомогою леза
ділянку, що містить експериментальний матеріал, вирізали у формі
невисокої пірамідки. Приготування зрізів проводилася за допомогою
ультрамікротому (LKB, Швеція). Отримані ультратонкі зрізи мали товщину
від 200 до 500 A. Їх поміщали на округлі мідні сіточки діаметром 3мм.
Далі отримані препарати контрастували за методом Рейнольда.

Електронно-мікроскопічні дослідження та морфометричний аналіз
ультраструктури адренокортикоцитів. Фотографування ультраструктури
клітин кори надниркових залоз проводилася за допомогою електронного
трансмісійного мікроскопа (JEM 100X Японія) при збільшенні від 2000х до
40000х. Під час проведення експериментів була отримано значна кількість
електронограм, що відображали особливості ультраструктури 110 клітин.
Площу цитоплазми та розташованих в ній ліпідних крапель і мітохондрій, а
також кількість органел підраховували із використанням ЕОМ та
спеціальної програми Kslite (Kontron Electronics Німеччина). Після цього
розраховувалися такі параметри: діаметр ліпідної краплі, щільність
розташування органел у цитоплазмі, відносна площа компартменту органели.
Діаметр ліпідної краплі розраховувався за формулою:

де D- діаметр ліпідної краплі, S-площа краплі, що розраховувалася за
допомогою пЕОМ. Щільність розташування органел у цитоплазмі
підраховували як кількість органел (мітохондрій або ліпідних крапель) на
зрізі, віднесена до загальної площі цитоплазми на зрізі, і нормована до
1мкм2 площі цитоплазми. Відносну площу компартменту різних органел
(мітохондрій або ліпідних крапель) розраховували як частину площі
цитоплазми клітини, що припадає на органели певного типу, виражали у
відсотках від загальної площі цитоплазми клітини на зрізі. Кінцеву
матиматичну обробку отриманих данних проводили за допомогою пакету
програм Origin 5.0 (Microcal Software Inc. U.S.A.). Статистичну
достовірність отриманих результатів аналізували із використанням
непараметричного критерію Манна-Уітні (в різних наукових джерелах цей
метод також називають критерієм Уілкоксона), який розраховувався за
допомогою програми SPSS 10.0.7 (SPSS Inc.).

Оптичний метод вимірювання внутрішньоклітинної концентрації кальцію.
Для введення кальцій чутливого зонду в клітину, акларові пластинки з
культурою клітин кори надниркових залоз занурювалися в розчин №3, що
містив барвник фура-2 (ацетоксиметилестер)(Probes,США) у концентрації
(1 мМ/л), із доданням детергенту плуронік F-127 (0.002%) (Sigma, США).
Фарбування клітини проводилося у спеціальній камері протягом 45 хвилин
при 37оC. Після фарбування скельця переносилися в розчин №3, де вони
витримувалися протягом 40 хвилин для повної деестерифікації зонду
фура-2/АМ. Збудження флуоресцентного зонду здійснювалося при довжині
хвилі 360 та 380нм за допомогою монохроматора (T.I.L.L. Photonics GmbH,
Мюнхен, Німеччина). Процеси запису даних контролювалися за допомогою
комп’ютерної програми „Pulse” (HEKA, Ламбрехт, Німеччина), яка в реально
масштабі часу розраховувала відношення флуоресцентних сигналів на двох
довжинах хвиль R=F1/F2.

В розділі „Результати досліджень” описується ультраструктура клітин
пучково-сітчастої зони кори надниркових залоз щура в нормі та в умовах
експерименту, а також здатність досліджуваних біологічно активних
речовин впливати на концентрацію іонів кальцію у цитоплазмі
адренокортикоцитів.

На першому етапі роботи досліджували ультраструктуру культивованих
клітин кори надниркових залоз щура в контролі. Ми виявили чотири типи
клітин, які відрізнялися за рядом морфологічних ознак. Мітохондрії
клітин перших трьох типів мали головним чином везикулярні,
трубчасто-везикулярні, і рідко трубчасті кристи, тому ми зробили
висновок, про те, що ці клітини походять із пучково-сітчастої зони кори
надниркових залоз. Дані морфометричних розрахунків для клітин перших
трьох типів наведені в таб.1. Клітини четвертого типу зустрічалися

Таблиця 1. Порівняння досліджуваних морфометричних параметрів у різних
типах секреторних клітин, пучково-сітчастої кори надниркових залоз щура.

Типи клітин Дані морфометричних досліджень ультраструктури ліпідних
крапель та мітохондрій в умовах контролю.

Середній діаметр ліпідних крапель(нм.)

Середня щільність розташування ліпідних крапель

(кількість

/мкм2).

Середня площа компартменту ліпідних крапель

(% від площі цитоплазми)

Середня площа мітохондрій (мкм2).

Середня щільність розташування мітохондрій

(кількість

/мкм2).

Середня площа компартменту мітохондрій

(% від площі цитоплазми)

1 831,0+/-18,0 0,304+/-0,071 16,9+/2,8 0,273+/-0,007
1,111+/-0,047 30+/-1,8

2

616,1+/- 43,7

0,333+/-0,169

11,0+/-6,0 ***

0,159+/-0,010

1,736+/-0,458

27,7+/-4,1

3 ***

1057,6+/-38,6

0,252+/-0,027

26,4+/-4,1

0,276+/-0,013 ***

0,619+/-0,105 ***

18,4+/-1,7

***–р<0,001 уже рідко і складали лише 5% від загальної маси клітин. Вони мали мітохондрії із електронно-щільним матриксом і пластинчастими кристами. Взявши до уваги будову мітохондрій, ми зробили висновок про те що, ці клітини походять з клубочкової зони. Клітини першого типу складали майже 42% від загальної кількості досліджених нами клітин. Цитоплазма клітин першого типу, містила велику кількість мембран гладенького ендоплазматичного ретикулуму (гЕПР). Мембрани гЕПР мали структурні контакти із мітохондріями та ліпідними краплями. Середня площа мітохондрій дорівнювала 0,273+/-0,007 мкм2 (n=814). Матрикс мітохондрій завжди був помітно темнішим у порівнянні із оточуючою цитоплазмою. Мітохондрії містили велику кількість світлих везикулярних крист. Середня щільність розташування мітохондрій у цитоплазмі дорівнювала 1,111+/-0,047 на мкм2 (n=10). Разом з тим середня площа компартменту мітохондрій складала 30,0+/-1,8% від загальної площі цитоплазми на зрізі (n=10). Середній діаметр ліпідних крапель в клітинах першого типу складав 831,0+/-18,0 нм (n=180). Дослідження електронограм показало, що існує два типи крапель, які відрізняються за щільністю матриксу. Так, матрикс крапель першого типу має значно більшу щільність, ніж матрикс розташованих поруч мітохондрій, біля поверхні таких крапель завжди спостерігалася щільна окантовка. Навпаки ліпідні краплі другого типу мали таку ж саму або навіть меншу щільність, ніж матрикс розташованих поруч мітохондрій, у таких краплях електронно-щільна окантовка була відсутня. Ліпідні краплі обох типів можна було спостерігати на одній електронограмі. Середня щільність розташування ліпідних крапель у цитоплазмі дорівнювала 0,304+/-0,071 крапель на мкм2 (n=10). Середня площа компартменту ліпідних крапель складала 16,9+/-2,8% від загальної площі цитоплазми на зрізі (n=10). В клітинах першого типу часто зустрічалися щільні тільця, що могли являти собою, як пероксисоми, так і лізосоми. Вони мали сірий вміст із одним або декількома острівцями електронно-щільної речовини. Вони утворювали структурні контакти із мембранами гЕПР, мітохондріями і рідше із ліпідними краплями. Іноді щільні тільця містили одне або декілька ліпідних включень, що свідчить про участь цих структур у метаболізмі холестеролу, а також про можливість їх участі у процесі стероїдогенезу. Клітини другого типу складали 16% від загальної маси досліджених клітин кори надниркових залоз. Мембрани гЕПР в цих клітинах зустрічалися у меншій кількості, ніж у цитоплазмі клітин першого типу. Середня площа мітохондрій складала 0,159+/-0,010% мкм2 (n=149). Середня щільність розташування мітохондрій у цитоплазмі складала 1,736+/-0,458 на мкм2 (n=3). Разом із тим середня площа компартменту мітохондрій дорівнювала 27,7+/-4,1% від загальної площі цитоплазми на зрізі (n=3). Середній діаметр ліпідних крапель дорівнював 616,1+/-43,7 нм (n=30). Цей показник був меншим у порівнянні із клітинами першого типу (таб.1). Різниця між вибірками була достовірною (р<0,001). За своєю структурою матрикс ліпідних крапель був однорідним. Вміст ліпідних крапель по своїй щільності був подібним до матриксу мітохондрій. Отже, у клітинах другого типу спостерігалися головним чином краплі другого типу. Ліпідні краплі часто мали структурні контакти із ядром. Середня щільність розташування ліпідних крапель у цитоплазмі дорівнювала 0,3334+/-0,1688 крапель на мкм2 (n=3). На долю компартменту ліпідних крапель приходилося в середньому 11,0+/-6,0% (n=3) від загальної площі цитоплазми на зрізі. Ультраструктура щільних тілець була такою ж, як і в клітинах першого типу. Клітини третього типу складали 37% від загальної кількості клітин. Мембрани гЕПР в клітинах третього типу частіше мали вигляд пухирців, мішечків або невеликих трубочок. Середня площа мітохондрій складала 0,276+/-0,013 мкм2 (n=380), і була більшою ніж у клітинах другого типу. Різниця між вибірками була достовірною (р<0,001). Щільність матриксу мітохондрій була подібною до щільності навколишньої цитоплазми. У матриксі мітохондрій виявлялися трубчасті і у меншій кількості везикулярні кристи. Середня щільність розташування мітохондрій у цитоплазмі клітин третього типу дорівнювала 0,619+/-0,105 мітохондрій на мкм2 (n=8) і була меншою ніж у клітинах першого типу. Різниця між вибірками була достовірною (p<0,001). Середня площа компартменту мітохондрій складала 18,4+/-1,7% від загальної площі цитоплазми на зрізі (n=8) і була меншою, ніж в клітинах першого та другого типів. Різниця між вибірками була достовірною (p<0,001). Ліпідні краплі могли істотно відрізнятися за своїми розмірами. Середній діаметр ліпідних крапель складав 1057,6+/-38,6 нм (n=155), і був більшим ніж в клітинах першого та другого типів. Різниця між вибірками була достовірною (p<0,001). Матрикс ліпідних крапель клітин третього типу був завжди структурованим: спостерігалась щільна окантовка на внутрішній стороні мембрани ліпідної краплі та більш просвітлена центральна частина. Не зважаючи на це, ліпідні краплі можна було також поділити на два типи, які істотно розрізнялися за щільністю матриксу. Так, краплі першого типу мали темний матрикс, щільність якого була значно більшою ніж щільність матриксу мітохондрій, тоді як краплі другого були світлішими. Обидва типи крапель ми могли спостерігати на одному зрізі в різних клітинах або навіть у одній і тій самій клітині. Ліпідні краплі часто мали структурні контакти із ядром і рідко із мембранами гЕПР та плазматичною мембраною. Середня щільність розташування ліпідних крапель у цитоплазмі клітин третього типа дорівнювала 0,252+/-0,027 крапель на мкм2 (n=8). Середня площа компартменту ліпідних крапель складала 26,4+/-4,1% від загальної площі цитоплазми на зрізі (n=8) і була більшою, ніж у клітинах першого та другого типів, але різниця між вибірками була недостовірною. Щільні тільця у клітинах третього типу зустрічалися досить рідко; вони мали невеликі розміри і рідко мали структурні контакти із іншими органелами. Після інкубації з АКТГ та кальцієвим іонофором ультраструктура адренокортикоцитів була більш однотипною, ніж у контролі. Таким чином, можна зробити висновок про те, що аплікація АКТГ та збільшення концентрації іонів кальцію у цитоплазмі спричиняють активацію певних внутрішньоклітинних процесів, здатних зменшувати або нівелювати різницю в ультраструктурі клітин 1-3 типів. Зважаючи на це, при проведенні морфометричних досліджень ми вивчали вплив АКТГ та кальцієвого іонофору на всі клітини пучково-сітчастої зони без поділу їх на типи (таб 2.). Після інкубації клітин із АКТГ, мембрани гЕПР, частіше мали вигляд каналів, об’єднаних у сітку. Вони мали структурні контакти із мітохондріями, ліпідними краплями та щільними тільцями. Середня площа мітохондрій дорівнювала 0,223+/-0,006 мкм2 (n=1727) і була меншою ніж у контролі (таб 2). Різниця між контрольною та експериментальною вибірками була Таблиця 2. Порівняння досліджуваних морфометричних параметрів клітин, пучково-сітчастої кори надниркових залоз щура в контролі та після інкубації с АКТГ або з кальцієвим іонофором А23187 Речовина, що досліджу-валась. Типи клітин Дані морфометричних досліджень ультраструктури ліпідних крапель та мітохондрій. Середній діаметр ліпідних крапель (нм.). Середня щільність розташування ліпідних крапель (кількість /мкм2). Середня площа компартменту ліпідних крапель (% від площі цитоплазми) Середня площа мітохондрій (мкм2). Середня щільність розташування мітохондрій (кількість /мкм2). Середня площа компартменту мітохондрій (% від площі цитоплазми) Конт. Всі типи 909,6+/-20,3 0,291+/-0,038 21,3+/-2,5 0,261+/-0,006 0,923+/-0,089 24,4+/-1,8 АКТГ Всі типи *** 692,9+/-9,6 *** 0,644+/-0,086 26,7+/-2,5 *** 0,223+/-0,06 ** 1,301+/-0,064 29,4+/-2,2 А23187 Всі типи *** 751,7+/-12,9 *** 0,793+/-0,136 ** 40,2+/-4,2 *** 0,177+/-0,006 1,096+/-0,101 19,1+/-1,4 Конт.-контроль. **–р<0,01; ***–р<0,001 достовірною (p<0,001) (рис. 1). У порівнянні із оточуючою цитоплазмою матрикс мітохондрій завжди був більш щільним. Трубчасті кристи після аплікації АКТГ розбухали, а на їх поверхні можна було спостерігати утворення нових везикул. Середня площа компартменту мітохондрій після аплікації АКТГ збільшувалася до 29,4+/-2,2% від загальної площі цитоплазми на зрізі (n=20) (таб.2), але різниця між вибірками була не достовірною. При цьому середня щільність розташування мітохондрій у цитоплазмі після аплікації АКТГ збільшувалася до 1,301+/-0,064 мітохондрій на мкм2 (n=20) різниця між вибірками була достовірною (p<0,01). Можливо, що такі зміни пов’язані із прискоренням процесу фрагментації мітохондрій. В умовах експерименту також зменшувався середнійдіаметр ліпідних крапель до 692,9 +/-9,6 нм. Різниця між вибірками була достовірною (p<0,001) (рис. 2). Після інкубації із АКТГ клітини, майже завжди, містили, електронно-світлі краплі без окантовки. Ці краплі часто мали структурні контакти із мітохондріями, щільними тільцями, ядром клітини, рідше із мембранами гЕПР та плазматичною мембраною. Середня щільність розташування ліпідних крапель у цитоплазмі клітини після аплікації АКТГ збільшувалася до 0,644+/-0,086 крапель на 1мкм2 (n=20). Відмінність між вибірками була достовірною (p<0,001). Після аплікації АКТГ середня площа компартменту ліпідних крапель збільшувалася до 26,7+/-2,5% від загальної площі цитоплазми на зрізі (n=20) в умовах експерименту. Але різниця між вибірками булла недостовірною. У цитоплазмі також можна було спостерігати значну кількість крапель, що мали тісні структурні контакти між собою. Можливо, що присутність таких структур пов’язана із активацією процесу дроблення ліпідних крапель. Після інкубації із АКТГ у цитоплазмі адренокортикоцитів виявлялась велика кількість щільних тілець, що мали значні розміри. Вони містили світлий матрикс із грудками електронно-щільної речовини, часто вони також містили ліпідні включення. Щільні тільця мали структурні контакти із ліпідними краплями, мітохондріями, мембранами гЕПР і рідше із ядром. В клітинах, що інкубувалися з кальцієвим іонофором сітка каналів гЕПР займала значну частину цитоплазми. Мембрани гЕПР часто мали структурні контакти із мітохондріями, щільними тільцями, ліпідними краплями рідше із плазматичною мембраною. Ультраструктура мітохондрій, їх форма, характер розташування у цитоплазмі і особливості структурних контактів із іншими органелами були такими ж, як і після інкубації із АКТГ. Але, проведення морфометричних розрахунківдозволило виявити певні особливості. Так, після аплікації кальцієвого іонофору середня площа мітохондрій зменшувалася до 0,177+/-0,006 мкм2 (n=857) (таб.2). Різниця між вибірками була достовірною (p<0,001) (рис. 3). Одночасно ми спостерігали зменшення середньої площі компартменту мітохондрій до 19,1+/-1,4% (n=11) від загальної площі цитоплазми на зрізі (n=11) і одночасне збільшення середньої щільності розташування мітохондрій у цитоплазмі до 1,096+/-0,1011 мітохондрій на мкм2 (n=11) (таб.2). Але для обох останніх параметрів різниця між вибірками була не достовірною. Після застосування кальцієвого іонофору електронно-щільні краплі в цитоплазмі клітини більше не виявлялися. Разом із тим зникала або була досить слабо помітною електронно-щільна окантовка на внутрішній мембрані ліпідної краплі. Середній діаметр ліпідних крапель у порівнянні із контролем зменшувався до 751,7+/-12,9нм (n=531) (таб.2). Різниця між вибірками була достовірною (p<0,001) (рис. 4). Також як і після аплікації АКТГ, після застосування кальцієвого іонофору ліпідні краплі часто мали структурні контакти із мітохондріями, щільними тільцями, ядром клітини, мембранами грЕПР та гЕПР. Іноді ліпідні краплі могли також мати структурні контакти із плазматичною мембраною. Середня площа компартменту ліпідних крапель після інкубації з кальцієвим іонофором зростала до 40,2+/-4,2% від загальної площі цитоплазми на зрізі (n=11) (таб.2), різниця між вибірками, у цьому випадку, також була достовірною (p<0,01). Одночасно ми спостерігали зростання середньої щільності розташування ліпідних крапель до 0,793+/-0,136 крапель на мкм2 (n=11) (таб.2), різниця між вибірками була також достовірною (p<0,001). Таким чином, можна зробити припущення про те, що застосування кальцієвого іонофору активізує процес дроблення ліпідних крапель. Після аплікації кальцієвого іонофору в компартменті щільних тілець спостерігалися ті ж самі зміни, що і після аплікації АКТГ. В наступній частині нашої роботи ми досліджували вплив на ультраструктуру адренокортикоцитів гіперкалієвого розчину, ацетилхоліну та пілокарпіну. Застосування всіх зазначених речовин не призводило до нівелювання різниці в ультраструктурі клітин різних типів, але навпаки всі типи ультраструктури клітин що були виявлені у контролі також легко ідентифікувалися в умовах експерименту. Разом із тим клітини другого типу зустрічалися дуже рідко, тому зміни їх ультраструктури не аналізувалися. Результати розрахунків морфометричних параметрів ультраструктури адренокортикоцитів пучково-сітчастої зони кори надниркових залоз щура після аплікації зазначених речовин наведені в таб.3. В клітинах першого типу, що інкубувалися у гіперкалієвому розчині, сітка, утворена каналами гЕПР займала значну частину цитоплазми. Мембрани гЕПР мали структурні контакти із мітохондріями, щільними тільцями, ліпідними краплями та плазматичною мембраною. За своєю формою та щільністю матриксу, мітохондрії в експериментальних та контрольних клітинах істотно не відрізнялись. Середня площа мітохондрій у порівнянні із контролем зменшувалася до 0,214+/-0,005 мкм2 (таб.3), розбіжність між вибірками була достовірною (p<0,001) (рис 5). Разом із тим, середня щільність розташування мітохондрій у цитоплазмі майже не змінювалась, а середня площа компартменту мітохондрій зменшувалася до 24,6+/-2,1% від загальної площі цитоплазми на зрізі (n=18) (таб.3), але різниця між вибірками була недостовірною. Проведення морфометричних розрахунків також показало, що в клітинах першого типу після інкубації у гіперкалієвому розчині відбувається збільшення середнього діаметру ліпідних крапель до 930,4+/-14,0 нм (n=444) (таб. 3). При цьому різниця між контрольною та експериментальною вибірками була достовірною (p<0,001). Середня щільність розташування ліпідних крапель у цитоплазмі, змінювалася мало. Разом із тим, було виявлене зростання середньої площі компартменту ліпідних крапель до 24,8+/-3,4% (n=18) від загальної площі цитоплазми але різниця між вибірками була недостовірною. Таким чином, аплікація деполяризуючого розчину викликає збільшення середніх розмірів ліпідних крапель. За даними літератури збільшення концентрації іонів кальцію у клітині є одним із чинників який може призводити до активації процесів Таблиця 3. Зміни досліджуваних морфометричних параметрів у клітинах першого та третього типів після аплікації гіперкалієвого розчину, ацетилхоліну та пілокарпіну. Типи клітин Дані морфометричних досліджень ультраструктури ліпідних крапель та мітохондрій. Середній діаметр ліпідних крапель (нм.). Середня щільність розташування ліпідних крапель (кількість /мкм2). Середня площа компа-ртменту ліпідних крапель (% від площі цитоплазми) Середня площа мітохондрій (мкм2). Середня щільність розташу-вання мітохондрій (кількість /мкм2). Середня площа компа-ртменту мітохондрій (% від площі цитоплазми) Конт. 1 831,0+/-18,0 0,304+/-0,071 16,9+/2,8 0,273+/-0,007 1,111+/-0,047 30+/-1,8 3 1057,6+/-38,6 0,252+/-0,027 26,4+/-4,1 0,276+/-0,013 0,619+/-0,105 18,4+/-1,7 KCl 1 *** 930,4+/-14,0 0,334+/-0,041 24,8+/-3,4 *** 0,214+/-0,005 1,167+/-0,113 24,6+/-2,1 3 *** 732,2+/-31,7 0,291+/-0,052 *** 14,7+/-2,9 * 0,278+/-0,011 0,623+/-0,079 17,8+/-2,3 Ацетил-холін 1 ** 764,3+/-9,6 0,360+/-0,065 18,3+/-2,6 0,252+/-0,005 1,026+/-0,064 25,3+/-1,3 3 ** 906,1+/-18,5 ** 0,4041+/-,034 27,3+/-3,2 ** 0,217+/-0,005 0,893+/-0,073 19,7 +/-2,0 Піло- карпін 1 *** 707,9+/-16,9 0,359+/-0,068 15,6+/-3,6 *** 0,228+/-0,007 ** 1,486+/-0,107 33,6+/-2,8 3 994,0+/-40,0 0,274+/-0,071 26,3+/-7,3 0,239 +/-0,012 0.802 +/-0,06 28,3+/-8,8 Конт.-контроль. *–р<0,05;**–р<0,01; ***–р<0,001 стероїдогенезу, що в свою чергу супроводжується виходом холестеролу із ліпідних крапель, тому зростання середнього діаметру та середньої площі компартменту ліпідних крапель на зрізі в умовах нашого експерименту важко пояснити. Ми припускаємо, що такі зміни в ультраструктурі ліпідних крапель є характерними для клітин першого типу лише на початковому етапі активації стероїдогенезу. T 1/4 3/4 i ~ ® O _AE_`*bVbZc‚c?hUhtlAEl?quieueaeYaeeueueNeNeIeIeIeIeIeA????ae?ae?ae?ae?ae ?ae?ae?ae?ae?ue??ae?ae?ae?F? yyy < >

???????>

3/4

* , ° .

¤

–I™ue™6?8?a?8›ooeoaoaoaoooeoeoaoaoaoaoaoeOeEOeE1/4E1/4E1/4E1/4E1/4E®EOeE
®E®E!E‘o?

EHuy

41/2

41/2CJ

O

O

O

O

O

;

41/2CJ

;

;

O

??`??

???

O??

EH

41/2CJ

????l?????их крист, тоді як везикулярні виявлялися у незначній кількості
Мембрани гЕПР у порівнянні із контролем не зазнавали суттєвих змін.
Мітохондрії рівномірно розташовувалися у цитоплазмі, при цьому вони
часто мали структурні контакти із ліпідними краплями і помітно менше з
елементами гЕПР та ядром. Після інкубації із гіперкалієвим розчином
середній діаметр ліпідних крапель клітин третього типу зменшувався до
732,2+/-31,7 нм. (n=110) (таб.3), різниця між вибірками була
достовірною (p<0,001) (рис 6). Ліпідні краплі часто мали структурні контакти із розширеними цистернами апарату Гольджі, рідше із ядром. Середня щільність розташування ліпідних крапель у порівнянні з контролем майже не змінювалася (таб 3). Але при цьому спостерігалося зменшення середньої площі компартменту ліпідних крапель до 14,7+/-2,9% від площі компартменту ліпідних крапель (n=6) (таб.3). Відмінність між вибірками була достовірною (p<0,001). Таким чином, в клітинах третього типу, інкубація із деполяризуючим розчином призводила до зменшення розмірів компартменту ліпідних крапель, що можна пояснити прискоренням мобілізації депонованого у них холестеролу. Ультраструктура щільних тілець після аплікації гіперкалієвого розчину залишалася без змін. Після інкубації із ацетилхоліном мембрани гЕПР в клітинах першого типу були представлені довгими каналами об’єднаними у сітку. Вони часто мали структурні контакти із мітохондріями, рідше із щільними тільцями та ліпідними краплями. Разом із тим суттєвих змін в ультраструктурі мітохондрій клітин першого типу не спостерігалося. Після інкубації із ацетилхоліном середній діаметр ліпідних крапель у порівнянні із контролем зменшувався до 764,3+/-9,6нм (n=429) (таб. 3), розбіжність між вибірками була достовірною (p<0,01). Разом із тим, після інкубації із ацетилхоліном в клітинах першого типу спостерігалося недостовірне збільшення середньої щільності розташування ліпідних крапель у цитоплазмі при відсутності, істотних змін у середній площі компартменту ліпідних крапель. Такі зміни можуть вказувати на прискорення процесу дроблення ліпідних крапель. Щільні тільця мали округлу, овальну або неправильну форму. Розташовані у щільних тільцях ліпідні включення по центру просвітлювались, тоді як по краях містили скупчення електронно-щільної речовини. Іноді також можна було побачити щільні тільця, що мали суцільно чорний матрикс. Таким чином, ацетилхолін стимулював помітні зміни в ультраструктурі щільних тілець і можливо, що він також впливає на метаболізм холестеролу у цих органелах. Після інкубації із ацетилхоліном ультраструктура мембран гЕПР в клітинах третього типу майже не змінювалась. Також не зазнала змін форма мітохондрій та характер їх розташування у цитоплазмі. Разом із тим в окремих клітинах ми спостерігали перебудову ультраструктури крист; так, від трубчастих крист починали активно відділятися везикули. Щільність матриксу мітохондрій при цьому не змінювалась. Можливо, що такі клітини являють собою перехідну форму між третім та другим типами. Після інкубації із ацетилхоліном мітохондрії часто мали структурні контакти із ліпідними краплями та мембранами гЕПР, рідше із щільними тільцями та ядерною мембраною. Середня площа мітохондрій, після інкубації клітин із ацетилхоліном зменшувалася до 0,217+/-0,006 мкм2 (n=499) (таб.3). Розбіжність між вибірками була достовірною (p<0,001) (рис. 7). Середня щільність розташування мітохондрій у цитоплазмі при порівнянні із контролем зростала до 0,893+/-0,075 мітохондрій на мкм2 (n=9) (таб.3), але різниця між вибірками була недостовірною. Разом із тим, середнє значення площі компартменту мітохондрій у порівнянні із контролем не змінювалось. Таким чином, інкубація із ацетилхоліном в клітинах третього типу впливала на ультраструктуру крист та стимулювала зменшення розміру мітохондрій. Форма, структура матриксу, розташування у цитоплазмі, а також структурні контакти із іншими органелами, ліпідних крапель в клітинах третього типу після інкубації із ацетилхоліном не змінювались. В цитоплазмі, частіше зустрічалися клітини, що містили ліпідні краплі із щільним матриксом та електронно-щільною окантовкою. Середній діаметр ліпідних крапель клітин третього типу в умовах експерименту зменшувався до 811.5+/-9.2нм (n=643) (таб.3). Різниця між контрольною та експериментальною вибірками була достовірною (p<0,01) (рис. 8.). Після інкубації із ацетилхоліном ми також спостерігали зростання середньої щільності розташування ліпідних крапель у цитоплазмі до 0,404+/-0,0341 (n=9) крапель на мкм2, різниця між вибірками була достовірною (p<0,01). При цьому середня площа компартменту ліпідних крапель майже не змінювалася (таб.3). В клітинах третього типу в умовах експерименту, так само як і в контролі, щільні тільця зустрічалися дуже рідко. Іноді в їх матриксі можна було побачити дуже дрібні ліпідні включення, які ніколи не спостерігалися у контролі. Центральна частина ліпідного включення просвітлювалась, при цьому на периферії накопичувалася електронно-щільна речовина; разом із тим, матрикс у таких органелах мав високу електронну щільність. Найчастіше такі щільні тільця можна було побачити в клітинах у яких відбувалась везикуляризація крист. Після інкубації із пілокарпіном у цитоплазмі клітин першого типу, спостерігалося збільшення кількості організованих у тривимірну сітку мембран гЕПР. При цьому мембрани гЕПР найчастіше мали структурні контакти із мітохондріями, рідше із щільними тільцями, ліпідними краплями та плазматичною мембраною. Мітохондрії містили переважно везикулярні кристи, і порівняно невелику кількість великих трубчастих крист на яких формувалися нові везикули. Форма мітохондрій та щільність їх матриксу у порівнянні із контролем не зазнавали істотних змін. Середня площа мітохондрій зменшувалася до 0,228+/-0,007 мкм2 (n=706) (таб.3). Відмінність між вибірками була достовірною (p<0,001) (рис. 9). Одночасно, після інкубації із пілокарпіном в клітинах першого типу спостерігалося зростання середньої щільності розташування мітохондрій у цитоплазмі до 1,486+/-1,074 мітохондрій на мкм2 (n=8); різниця між в ибірками була достовірною (p<0,01). Середня площа компартменту мітохондрій у порівнянні із контролем суттєво не змінювалася. Таким чином, пілокарпін стимулював зменшення середнього розміру мітохондрій і одночасне збільшення щільності їх розташування у цитоплазмі. Миприпускаємо, що ці зміни можуть бути пов’язаними із фрагментацією мітохондрій. Після інкубації із пілокарпіном мітохондрії в клітинах першого типу часто мали структурні контакти із ліпідними краплями та щільними тільцями. Вони також могли контактувати із ядерною мембраною та елементами апарату Гольджі. Мітохондрії часто розташовувались білч плазматичної мембрани, але між ними та мембраною клітини завжди можна було виявити декілька цистерн гЕПР. Отже можливо, що мембрани гЕПР відіграють роль посередника між мітохондрією та мембраною клітини, що може бути важливим для перенесення готових стероїдних гормонів у позаклітинне середовище. Після інкубації із пілокарпіном середній діаметр ліпідних крапель клітин першого типу зменшувався до707,9+/-16,9нм (n=169). Відмінність між вибірками була достовірною (p<0,001) (рис. 10). Одночасно, ми спостерігали зростання середньої щільності розташування ліпідних крапель у цитоплазмі з 0,304+/-0,071 (n=8) до 0,359+/-0,068 крапель на мкм2 (n=15), а середня площа компартменту ліпідних крапель при цьому не зазнавала істотних змін (таб.3). Це дозволяє зробити припущення про те, що пілокарпін стимулює зменшення розміру ліпідних крапель. Щільні тільця розташовувалися невеликими групками. Більшість з них містила в своєму матриксі одне або декілька ліпідних включень. При цьому деякі ліпідні включення мали просвітлену серцевину, тоді як на периферії накопичувалася електронно-щільна речовина. Вірогідної різниці в ультраструктурі гЕПР, мітохондрій, ліпідних крапель та щільних тілець клітин третього типу у порівнянні із контролем не виявлено (таб 3). В якості матеріалу для проведення досліджень із кальціометрії ми використали культуру адренокортикальних клітин. Під час експериментів ми досліджували вплив двох секундної, аплікації різних хімічних агентів (АКТГ, ацетилхоліну, пілокарпіну та деполяризуючого розчину) на концентрацію іонів кальцію у цитоплазмі клітини. Було встановлено, що всі зазначені речовини здатні збільшувати концентрацію іонів кальцію у цитоплазмі адренокортикоцитів (рис. 11). Таким чином, збільшення внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію може бути одним із чинників, що опосередковує зміни ультраструктури секреторних клітин кори надниркових залоз щура, зафіксовані нами після інкубації клітин у розчині, що містив одну з зазначених біологічно активних сполук. Обговорення результатів. При аналізі ультраструктури культивованих адренокортикоцитів в контролі ми виявили чотири типи клітин. Аналізуючи будову мітохондрій цих клітин ми встановили, що клітини першого-третього типів належали до пучково-сітчастої зони, тоді як клітини четвертого - до клубочкової. Разом із тим нами було показано, що відмінності в ультраструктурі клітин першого-третього типів спостерігаються, головним чином, в ультраструктурі органел, що приймають участь у стероїдогенезі, зокрема мітохондрій, ліпідних крапель та мембран гЕПР. Тому ми зробили припущення, про те, що розбіжності в ультраструктурі клітин першого-третього типів можуть бути пов?язаними із функціональним станом клітини і не є строго детермінованими. Для перевірки цього припущення отримана нами культура клітин інкубувалася у розчині, що містив АКТГ (потужний стимулятор стероїдогенезу). Аналіз ультраструктури досліджуваних нами клітин показав, що інкубація з АКТГ приводить до нівелювання відмінностей в ультраструктурі клітин віднесених до першого-третього але не до четвертого типів. При цьому всі клітини першого–третього типів набували ультраструктурних ознак прискоренного стероїдогенеза. Найбільших змін зазнавала ультраструктура клітин третього типу, тоді як зміни у будові клітин першого типу були менш виражено. Це можна пояснити тим, що клітини першого типу вже знаходилися в активованому стані і додаткова стимуляція не призводила до значних змін. Отже отримані нами дані підтверджують припущення про те, що різниця у будові клітин пучково-сітчастої зони може бути пов’язаною із різними функціональними станами цих клітин і не є строго детермінованою. Можливо, що у живому організмі частина клітин цієї зони кори надниркових залоз знаходиться в активному стані і інтенсивно синтезує стероїдні гормони, тоді як в інших клітинах процеси стероїдогенезу загальмовані. Таким чином клітини із ознаками зменшення стероїдогенезу можуть виконувати резервні функції активуючися під впливом зовнішніх стимулюючих факторів, наприклад при збільшенні концентрації АКТГ у крові. Раніше вже була описана здатність АКТГ викликати збільшення кількості мітохондрій та ліпідних крапель у цитоплазмі, перехід мітохондріальних крист від трубчастої форми до везикулярної, збільшення плоші, що займають мітохондріальні кристи на зрізі, збільшення розміру компартменту мітохондрій та об'єму цитоплазми, що займають канали гЕПР та ін. Разом з тим несподіваним, для нас, був той факт, що у досліджуваних клітинах прискорення фрагментації мітохондрій можна було виявити вже після десятихвилинної аплікації АКТГ. В літературі була зафіксована здатність АКТГ стимулювати фрагментацію мітохондрій, лише через декілька годин або навіть діб після аплікації гормону. Можливо, що таке підсилення фрагментації мітохондрій може бути одним із засобів збільшення загальної поверхні мембран мітохондрій, на якій відбувається перенесення холістеролу в середину органел для участі у стероїдогенезі. Механізм, який забезпечує фрагментацію мітохондрій, залишається ще не до кінця зрозумілим. Відомо, що важливу роль у фрагментації мітохондрій відіграють білки, розташовані на мітохондріальних мембранах. У процесі стиснення та відокремлення зовнішньої мембрани мітохондрій дріжджів під час їх фрагментації важливу роль відіграє динамін подібний протеїн (Dnm1p), аналогом якого у ссавців є Drp1 (різні автори також використовують інші назви цього білку Dlp1, DVLP, Dymple). Звичайно більша частина Drp1 знаходиться у цитозолі, і тільки 3% зв’язано із мітохондріями. Було показано, що залучення Drp1 до зовнішньої мембрани мітохондрій і пов’язане із цим підсилення фрагментації мітохондрій активується за допомогою кальцій залежних механізмів. Можливо, що подібний механізм опосередковує активацію фрагментації мітохондрій після аплікації АКТГ, що, як було показано, супроводжується збільшенням концентрації іонів кальцію у цитоплазмі клітини. Іншою характерною ознакою короткотривалого впливу АКТГ на ультраструктуру клітин пучково-сітчастої зони кори надниркових залоз була перебудова крист. У різних роботах раніше було показано, що перехід від трубчатого характеру будови мітохондріальних крист до везикулярного співпадає із прискоренням стероїдогенезу. Механізм, який забезпечує та функціональна доцільність переходу структури крист із трубчастої до везикулярної форми, до сих пір не з’ясовані. Відомо, що кристи у мітохондріях виникають як інвагінації внутрішньої мембрани і дозволяють істотно збільшити її розміри. Ферменти, які каталізують синтез стероїдних гормонів, розташовані на внутрішній мембрані мітохондрій; таким чином можна припустити, що перебудови в ультраструктурі крист під час активації стероїдогенезу можуть впливати на роботу цих ферментів або покращувати транспорт проміжних продуктів. Так, отвір, який з’єднує порожнину кристи та міжмембранну порожнину, за даними літератури, має сталий розмір і майже не змінюється при різних функціональних станах клітини. Його розмір складає приблизно 28нм. Таким чином, перетворення однієї кристи, що має трубчасту будову, на декілька везикулярних крист може сприяти прискоренню дифузії проміжних продуктів стероїдогенезу між порожниною кристи та між мембранною порожниною, як це показано на рис 12. В наших дослідах після аплікації АКТГ та кальцієвого іонофору окрім процесу везикуляризації трубчастих крист також спостерігалося їх розбухання без суттєвих змін у об’ємі мітохондрій. Ці результати співпадають із даними літератури про те, що кристи мітохондрій розширюються при потраплянні до клітини різних іонів. Можна припустити, що розбухання крист пов’язане із входом до їх порожнини певного компоненту, що робить їх вміст гіперосмотичним по відношенню до матриксу клітини. Таким компонентом можуть бути іони кальцію, які потрапляють до цитоплазми після аплікації АКТГ та кальцієвого іонофору. Разом із тим, нам майже нічого невідомо про внутрішньоклітинні механізми, що забезпечують перехід структури мітохондріальних крист від трубчастої до везикулярної. Але виходячи із отриманих нами результатів, можна зробити висновок про те, що ці процеси є чутливими до змін концентрації іонів кальцію у цитоплазмі. Прискоренне формування тривимірної сітки мембран гЕПР у наших дослідах спостерігалося після аплікації АКТГ та при збільшенні концентрації іонів кальцію у цитоплазмі, після аплікації кальцієвого іонофору або гіперкалієвого розчину. В різних літературних джерелах також обговорювалося важливе значення іонів кальцію для утворення елементів гЕПР. Так, відомо, що утворення структур ЕПР інгібується після застосування хелатора іонів кальцію 5,5'-дібромо BAPTA. Збільшення кількості мембран гЕПР у клітинах кори надниркових залоз звичайно супроводжує прискорення стероїдогенезу. Таким чином збільшення концентрації іонів кальцію у цитоплазмі клітини після аплікації АКТГ може бути одним із факторів, що опосередковує зростання кількості зв’язаних між собою мембран гЕПР. Відомо, що на мембранах гЕПР розташовуються ферменти, які приймають участь у стероїдогенезі, а саме цитохроми Р450с17 та Р450с21. Отже можна припустити, що зростання кількості мембран гЕПР під час активації стероїдогенезу дозволить залучити до процесу стероїдогенезу більшу кількість цих ферментів, а також білків необхідних для їх функціонування. З іншого боку, утворення сітки пов’язаних між собою каналів може полегшити транспорт проміжних продуктів стероїдогенезу між органелами, що приймають участь у ланцюжку біохімічних перетворень. У ліпідних краплях депонується холестерол, тоді як у мітохондріях відбувається перший етап стероїдогенезу. Отже наявність структурних контактів гЕПР з мітохондріями з одного боку, із ліпідними краплями з іншого може використовуватися для перенесення холестеролу від ліпідних крапель до міста першої реакції стероїдогенезу в мітохондріях. Мобілізація холестеролу з ліпідних крапель за рахунок стимуляції роботи гормон чутливої ліпази (ферменту, що сприяє мобілізації холестеролу для потреб стероїдогенезу) відіграє важливу роль у прискоренні стероїдогенезу. Разом із тим, найбільша кількість гормон чутливої ліпази знаходиться в ЕПР. Гормон чутлива ліпаза може переноситися до мембрани ліпідних крапель при активації цАМФ залежних механізмів. Ми припускаємо, що наявність морфологічних контактів між мембранами гЕПР та ліпідними краплями може мати важливе значення для перенесу гормон чутливої ліпази на мембрани ліпідних крапель і таким чином позитивно впливати на інтенсивність стероїдогенезу. На отриманих нами електронограмах було видно, що канали гЕПР могли мати одночасні структурні контакти із клітинною мембраною та з мітохондріями, в яких відбуваються завершальні етапи синтезу стероїдних гормонів. Отже можна сказати, що отримані результати свідчать про можливу участь мембран гЕПР у перенесенні стероїдних гормонів у позаклітинне середовище. Раніше це припущення вже обговорювалось у літературі, але до цих пір воно не було перевірене. Отже, перебудови ультраструктури гЕПР у клітинах кори надниркових залоз щура, що були зафіксовані після аплікації різних біологічно активних речовин і зокрема стимуляторів стероїдогенезу АКТГ та ацетилхоліну можуть бути важливими для швидкого прискорення стероїдогенезу. Разом із тим, взаємозв’язок структури та функції мембран гЕПР в клітинах кори надниркових залоз потребує подальшого вивчення. Отримані нами дані вказують на те, що зміни концентрації іонів кальцію у цитоплазмі клітини також можуть суттєво впливати на морфометричні параметри ліпідних крапель. Аплікація АКТГ та кальцієвого іонофору викликала достовірне зменшення діаметру ліпідних крапель та зростання щільності їх розташування у цитоплазмі, що можна пояснити активацією процесу дроблення крапель (табл. 2). Підтвердженням проходження процесу дроблення ліпідних крапель можуть бути подвійні краплі, майже повністю з’єднані між собою або зв’язані неширокими місточками, що на нашу думку співпадають із різними стадіями дроблення краплі. Дроблення ліпідних крапель, так само як і фрагментація мітохондрій, може мати значення для збільшення загальної площі поверхні, на якій відбувається контакт між компартментом ліпідних крапель та навколишньою цитоплазмою. Відомо, що саме на цій поверхні відбувається взаємодія між гормон-чутливою ліпазою та естерифікованим холестеролом, накопиченим у матриксі ліпідної краплі. Разом із тим, залишається незрозумілим, яким чином у цьому випадку відбувається збільшення площі мембрани ліпідних крапель, яка являє собою моношар фосфоліпідів. Можна припустити, що до цього процесу долучаються структури гЕПР, які часто мають структурні контакти із мембранами ліпідних крапель. На отриманих електронограмах нами було зафіксовано наявність ліпідних крапель, що відрізнялися за осміофільністю матриксу та наявністю або відсутністю електронно-щільної окантовки. Так осміофільність матриксу ліпідних крапель коррелювала із наявністю у клітині морфологічних ознак прискореного стероїдогенезу. У контролі матрикс ліпідних крапель в клітинах першого типу виявився більш світлим у порівнянні із матриксом ліпідних крапель клітин, віднесених нами до третього типу. Разом із тим, електронно-щільна окантовка на периферії ліпідних крапель, розташованих у цитоплазмі клітин третього типу, виявлялася частіше, ніж у матриксі ліпідних крапель, розташованих у цитоплазмі клітин першого тину. При цьому після аплікації АКТГ та кальцієвого іонофору електронно-щільна окантовка зовсім не виявлялась, а матрикс ліпідних крапель ставав більш світлим. Ми припускаємо, що особливості осміофільності матриксу ліпідних крапель можуть бути пов’язаними із функціональним станом клітини і знаходиться під контролем внутрішньоклітинних механізмів, чутливих до концентрації іонів кальцію. Можливо також, що нерівномірна осміофільність матриксу ліпідних крапель пов’язана із функціонуванням білків на їх мембрані, зокрема гормон чутливої ліпази. Подальші дослідження повинні виявити механізми, що впливають на осміофільність матриксу ліпідних крапель, та з’ясувати їх зв’язок із стероїдогенезом. Структурні контакти між ліпідними краплями та ядром клітини спостерігалися на деяких електронограмах кори надниркових залоз щурів та биків. Роль таких контактів у життєдіяльності клітини, зокрема у синтезі стероїдних гормонів, в опрацьованій нами літературі не обговорювалася. Але зараз відомо, що холестерол та продукти метаболізму жирних кислот можуть регулювати експресію деяких генів, що приймають участь у регуляції транспорту ліпідів у клітині. Так, холестерол приймає участь у регуляції активності гену кавеоліну—білку, що виявляється в мембрані ліпідних крапель та приймає участь у захопленні холестеролу із позаклітинного середовища, а також у його транспорті в цитоплазмі клітини. Таким чином, при подальших дослідженнях структурних контактів ліпідних крапель із ядром цікаво було б вивчити їх можливе значення для регуляції активності геному клітини і відповідної модуляції різних внутрішньоклітинних процесів і зокрема стероїдогенезу. Нас також зацікавили структурні контакти ліпідних крапель із плазматичною мембраною, що виявлялися у клітинах кори надниркових залоз щурів після аплікації кальцієвого іонофору та у клітинах кори надниркових залоз бика після аплікації гіперкалієвого розчину. Відомо, що певна кількість кортикостерону може знаходитися у ліпідних краплях, а саме, 65-79% від його загальної кількості у клітині. Отже можливо, що наявність таких контактів може сприяти перенесенню гідрофобної молекули кортикостерону із матриксу ліпідної краплі у позаклітинний простір і таким чином прискорювати секрецію стероїдних гормонів. Щільні тільця часто зустрічалися у цитоплазмі клітин пучково-сітчастої зони кори надниркових залоз у контролі, причому кількість цих структур та їх розміри відрізнялися у клітинах різних типів. Певні зміни у морфології цих структур можна було спостерігати після аплікації АКТГ або кальцієвого іонофору. До компартменту щільних тілець, можуть бути віднесеними як пероксисоми, так і лізосоми. Обидва типи органел можуть відігравати важливу роль у стероїдогенезі і зокрема у внутрішньоклітинному транспорті холестеролу. Так відомо, що у лізосомах відбувається гідроліз захоплених клітиною ліпопротеїнів із низькою щільністю і вивільнення зв’язаних з ними ефірів холестеролу та вільного холестеролу. З іншого боку раніше відзначалася участь лізосом у гідролізі ефірів холестеролу, депонованих в ліпідних краплях макрофагів. Можливо, що подібну функцію виконують лізосоми пучково-сітчастої зони кори надниркових залоз, але це питання до сих пір залишається невивченим. З іншого боку пероксисоми можуть відігравати важливу роль у стероїдогенезі як джерело холестеролу. Раніше було показано, що холестерол може синтезуватися у матриксі пероксисом. У пероксисомах також накопичується значна кількість протеіну, що переносить стерол другого типу (sterole carrier proteine 2). Цей білок бере активну участь у транспорті холестеролу крізь цитоплазму клітини, але до сих пір невідомо, чи відіграють певну роль у цьому процесі пероксисоми. У нашій роботі показано, що аплікація АКТГ або збільшення концентрації іонів кальцію у цитоплазмі клітини після аплікації кальцієвого іонофору виявляють стимулюючий вплив на компартмент щільних тілець, що проявляється у збільшенні кількості та розміру цих структур. Аплікація агоністу рецепторів ацетилхоліну М-типу пілокарпіну стимулювала зміни в ультраструктурі, багато в чому подібні до тих, що спостерігалися після аплікації ацетилхоліну. Одночасно кальційметричні дослідження показали здатність пілокарпіну збільшувати концентрацію іонів кальцію у цитоплазмі адренокортикоцитів. Це дозволяє нам зробити припущення про те, що вплив ацетилхоліну на ультраструктуру досліджуваних нами клітин опосередкувуеться активацією рецепторів ацетилхоліну М типу. Таке припущення підтверджується також даними літeратури про те, що секреція кортизолу та альдостерону в клітинах кори надниркових залоз бика та щура посилюється за рахунок активації рецепторів ацетилхоліну М, але не Н типу. Отже не зважаючи на те, що попередні дослідження показали відсутність холінергічних нервових закінчень в пучково-сітчастій зоні кори надниркових залоз щура наведені в цій роботі дані, вказують на здатність ацетилхоліну модулювати ультраструктуру клітин цієї зони. При чьому, зміни в ультраструктурі клітин, що викликаються ацетилхоліном є подібними за напрямком до тих, що виникають після аплікації АКТГ та кальцієвого іонофору, але вони набагато менші за своєю інтенсивністю. Тому можна припустити, що і в умовах живого організму ацетилхолін може спричиняти певний модулюючий вплив на ультраструктуру клітин пучково-сітчастої зони кори надниркових залоз щура. Так, він може потрапити до цієї зони із нервових закінчень, розташованих поряд у клубочковій зоні або в медулі. З іншого боку можна припустити, що при певних фізіологічних умовах холінергічні нервові закінчення можуть проростати аж до пучково-сітчастої зони, наприклад при гіпернервії. Висновки 1. Було описано три типи клітин пучково-сітчастої зони кори надниркових залоз щура, що відрізнялися особливостями будови мітохондрій, ліпідних крапель, гЕПР та щільних тілець. 2. Показано, що риси ультраструктури секреторних клітин пучково-сітчастої зони, не є строго заданими, але змінюються під впливом зовнішніх факторів, або при збільшенні концентрації іонів кальцію у цитоплазмі. 3. Показано, що інкубація клітин пучково-сітчастої зони кори надниркових залоз із АКТГ стимулює зменшення діаметру мітохондрій і одночасно збільшення щільності їх розташування у цитоплазмі, що може бути проявом прискорення процесу їх фрагментації. Така інкубація також стимулює збільшення кількості везикулярних крист, у матриксі мітохондрій за рахунок їх відбруньковування від трубчастих крист. 4. Показано, що інкубація адренокортикоцитів у розчині, що містить АКТГ або кальцієвий іонофор А23187 стимулює зменшення розмірів ліпідних крапель і одночасне зростання щільності їх розташування у цитоплазмі. 5. При аналізі електронограм було виявлено два різні типи осміофільності матриксу ліпідних крапель. Встановлено, що краплі із просвітленим однорідним матриксом частіше виявляються у клітинах, що мають морфологічні ознаки прискореного стероїдогенезу, тоді як краплі із темним матриксом і щільною окантовкою частіше зустрічаються у клітинах, що не мають таких ознак. 6. Показано, що ацетилхолін та агоніст ацетилхолінових рецепторів М типу пілокарпін спричиняють, подібний за характером модулюючий вплив на ультраструктуру секреторних клітин пучково-сітчастої зони кори надниркових залоз щура. 7. Встановлено, що вплив насичуючої концентрації АКТГ на ультраструктуру клітин пучково-сітчастої зони кори надниркових залоз щура є дуже потужним, тоді як аплікація навіть насичуючої концентрації ацетилхоліну призводить до більш тонких змін в ультраструктурі. 8. За допомогою кальційчутливого зонду fura-2 показано, що аплікація АКТГ, ацетилхоліну та пілокарпіну збільшує концентрацію іонів кальцію у цитоплазмі клітин кори надниркових залоз щурів. 9. Проведені експериментальні дослідження показали, що механізми чутливі до концентрації іонів кальцію у цитоплазмі клітини можуть відігравати важливу роль у процесі перебудови ультраструктури адренокортикоцитів, і можуть опосередковувати вплив різних сигнальних молекул, що надходять до плазмолемми із позаклітинного середовища. Перелік опублікованих праць здобувача за темою дисертації. Коваль Л.М.,Яворская Е.Н.,Токарь С.Л., Лукьянец Е.А. Ультраструктурные характеристики стероидных везикул и митохондрий из адренокортикальных клеток быка. Нейрофизиология/Neurophysiology 2000, т.32, №3, ст.272-274. Koval L.M., Tokar S.L., Yavorskaya E.N., Lukynetz E.A. Calcium-induced ultrastructural interactions in adrenocorticocytes. Нейрофизиология/Neurophysiology 2002, v.34, №2-3, p. 177-178. Tokar S.L., Koval L.M., Yavorskaya E.N., Lukynetz E.A. Changes in ultrastructure of adrenocortical cells induced by cholinergic agonists. Нейрофизиология/Neurophysiology 2002, v.34, №2-3, p.557-259. Токар С.Л., Коваль Л.М., Яворская О.М., Лукьянец О.О. Особливості ультраструктури культуральних клітин кори надниркових залоз щура у нормі та після аплікації кальцієвого іонофору А23187 та адренокортикотропного гормону. Фізіологічний журнал 2004, т.50, №2, ст.105-110. Токар С.Л., Коваль Л.М., Яворская О.М., Лукьянец О.О. Особливості ультраструктури ліпідних крапель в клітинах пучково-сітчастої зони кори надниркових залоз щура in vitro. Фізіологічний журнал 2004, т.50, № 6, ст. 107-113. Тези доповідей Tokar S.L., Koval L.M., Yavorskaya E.N., Lukynetz E.A. Influence of epileptogenic drug pilocarpine on morphological properties of steroid vesicles of adrenocortical cells. Bogomoletz-Nencki Meeting Sulej?w, Poland.-May 7-9, 2001,O7. Токар С.Л. Лук’янець І.О., Яворська О.М., Лук’янець О.О. Зміни веутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу під впливом стероїдогенезстимульованих факторів. Фізіологічний журнал, 2002, т.48, № 2, ст. 17. Tokar S.L., Koval L.M., Yavorskaya E.N., Lukynetz E.A. Role of calcium ions in ultrastructural changes evoked by adrenocorticotropic hormone in rat adrenocortical cells. Second Bogomoletz-Nencki Symposium “Intracellular signaling in excitable cells” Kiev, Ukrane, September 1-3, 2002, p.16-17. Tokar S.L., Koval L.M., Yavorskaya E.N., Lukynetz E.A. Features of lipid drops ultrastructure in rat adrenocortical cells and mechanisms of its regulation. IBRO advanced school of neuroscience Yalta, Ukrane, September 16-28, 2005, p.50 Анотації Токар С.Л. Морфо-функціональні особливості регуляції активності адренокортикоцитів щура.-Рукопис. Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 – фізіологія людини та тварин. Інститут фізіології ім О.О.Богомольця НАН України. Київ – 2005. Дисертація присвячена вивченню особливості регуляції ультраструктури адренокортикоцитів щура in vitro. Найчастіше в культурі зустрічались клітини, що походили з пучково-сітчастої зони кори надниркових залоз. Електронно-мікроскопічні дослідження дозволили виділити три типи ультраструктури цих клітин. Аплікація адренокортикотропного гормону або кальцієвого іонофору А23187 призводила до нівелювання різниці між клітинами із різними типами ультраструктури. За допомогою кальційчутливого зонду fura-2 показано, що аплікація АКТГ, ацетилхоліну та пілокарпіну збільшує концентрацію іонів кальцію в цитоплазмі адренокортикоцитів. Було встановлено, що збільшення коцентрації іонів кальцію в цитоплазмі клітин пучково-сітчастої зони спричиняє модулюючий вплив на ультраструктуру цих клітин, при цьому вони набувають ознак прискоренного стероїдогенезу. Таким чином збільшення концентрації іонів кальцію у цитоплазмі клітин пучково-сітчастої зони кори надниркових залоз щура може бути одним із механізмів, що опосередковує швидкі зміни в ультраструктурі цих клітин у відповідь на аплікацію АКТГ. Виявлені в цій роботі особливості регуляції ультраструктури клітин кори надниркових залоз щура можуть мати важливе значення для поглиблення розуміння процесів стероїдогенезу і створюють підгрунтя для проведення подальших досліджень. Ключові слова: адренокортикоциты, ультраструктура, кальцій, адренокортикотропний гормон, ацетилхолін. Токарь С.Л. Морфо-функциональные особенности регуляции активности адренокортикоцитов крысы. - Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13 – физиология человека и животных. Институт физиологии человека и животных им. А.А. Богомольца НАН Украины. Киев – 2005. Диссертация посвящена изучению особенности регуляции ультраструктуры адренокортикоцитов крысы in vitro. Изучались клетки коры надпочечников крысы, находившиеся в условиях первичной культуры. Для изучения ультраструктуры этих клеток использовались методы электронной микроскопии и морфометрического анализа. Внутриклеточная концентрация ионов кальция измерялась при помощи оптического метода. В контрольных условиях, было выделено четыре типа клеток, которые отличались особенностями ультраструктуры митохондрий, липидных капель, мембран гЕПР и плотных телец. Клетки первого – третьего типов имели черты ультраструктуры свидетельствующие про их происхождение из пучково-сетчатой зоны коры надпочечников. На их долю приходилось 95% от общего количества клеток в культуре. Клетки четвертого типа имели особенности ультраструктуры свидетельствующие про их происхождение из клубочковой зоны коры надпочечников. Они составляли только 5% от общего количества клеток в культуре. Из за малого количества клеток четвертого типа их ультраструктура в этой работе не исследовалась. Клетки первого типа имели черты ультраструктуры характерные для клеток, которые интесивно синтезируют стероидные гормоны, клетки третьего типа наоборот имели морфологические черты, свидельствующие про невысокую скорость стероидогенеза, при этом клетки второго типа занимали промежуточное положение. В контроле было показано существование двух типов осмиофильности матрикса липидных капель. Так капли с малой и равномерной осмиофильностью матрикса, чаще встречались в клетках первого и второго типов. Липидные капли, c высокой осмиофильностью матрикса, которая значительно усиливалась на периферии, чаще можно было увидеть в клетках, третьего типа. Аппликация адренокортикотропного гормона (АКТГ) или кальциевого ионофора А23187 приводила к исчезновению разницы в ультраструктуре клеток пучково-сетчатой зоны, при этом все клетки приобретали черты ультраструктуры, свидетельствующие про высокую скорость стероидогенеза. Это позволило сделать вывод про то, что особенности ультраструктуры клеток первого – третьего типов связанны с их функциональным состоянием и не являются строго определенными. При помощи клеточного зонда fura-2 было показано, что аппликация АКТГ, ацетилхолина и пилокарпина увеличивает концентрацию ионов кальция в цитоплазме адренокортикоцитов. Было показано, что увеличение концентрации ионов кальция в цитоплазме клеток пучково-сетчатой зоны или аппликация АКТГ оказывало очень похожее регулирующее воздействие на их ультраструктуру, при этом она приобретала черты, свидетельствующие про ускорение стероидогенеза. Так наблюдалось уменьшение размеров липидных капель и одновременное увеличение плотности их расположения в цитоплазме, что можна пояснить фрагментацией этих органелл. При этом также наблюдалось изменение структуры матрикса липидных капель, так все капли приобретали низкую, по сравнению с другими органеллами, осмиофильность матрикса, а электронно-плотная „окантовка” возле мембраны липидной капли исчезала. Такие изменения могут быть связаны с ускорением мобилизации холистерола из липидных капель для участия в стероидогенезе. Вместе с тем наблюдался переход митохондриальных крист от трубчатой к везикулярной форме. Инкубация клеток коры надпочечников с ионофором А23187 или с АКТГ также вызывала увеличение количества связанных между собой каналов гладкого эндоплазматического ретикулума. Таким образом, увеличение концентрации ионов кальция в цитоплазме клеток пучково-сетчатой зоны коры надпочечников крыс может быть одним из главных механизмов, который опосредует быструю перестройку ультраструктуры этих клеток в ответ на аппликацию АКТГ. В работе также сравниваелось действие АКТГ и ацетилхолина на ультраструктуру клеток пучково-сетчатой зоны коры надпочечников крысы, показано, что аппликация насыщающей концентрации АКТГ вызывает значительные изменения в ультраструктуре клеток, тогда как аппликация даже насыщающей концентрации ацетилхолина стимулирует только небольшие сдвиги. Проделанная работа выявила ранее неизвестные особенности ультраструктуры адренокортикоцитов, дальнейшее исследование, которых может представлять интерес для углубления понимания механизмов обеспечивающих прохождение стероидогенеза. Ключевые слова: адренокортикоциты, ультраструктура, кальцый, адренокортикотропний гормон, ацетилхолин. Tokar S.L. Functional features of regulation of activity of rat adrenocortical cells. The thesis for the defense of PhD degree on speciality 03.00.13 – human and animal physiology. - O.O.Bogomolets Institute of Physiology National Academy of Sciences of Ukraine. Kyiv - 2005. The dissertation is devoted to the study of regulation of rat adrenocortical cells ultrastructure in vitro. More friquently in culture there were the cells allocated from fasciculate-reticularis zone. Electron-microscopic and imaging analysis methods were used for investigation of ultrastructure of these cells. Control experiments allowed us to allocate three types of cells which differed in ultrastructure of mitochondria, lipid droplets, smooth endoplasmic reticulum and dense bodies. Application of adrenocorticotropic hormone or calcium ionophphore А23187 resulted in the disappearance of a difference between cells with various types of ultrastructure. It has been shown that application of ACTH, acetylcholine and pilocarpine increase concentration of calcium ions in the cytoplasm. It has been established that the increase in concentration of calcium ions in cytoplasm of adrenocortical cells influence on ultrastructure of these cells, so they get attributes of accelerated steroidogenesis. Thus, the increase in concentration of calcium ions in cytoplasm of fasciculate-reticularis zone cells could be one of mechanisms which mediated fast changes in ultrastructure of these cells after ACTH application. The features of adrenocortical cells ultrastructure, which was revealed in this dissertation can have a great importance for deeper understanding of steroidogenesis and prepare basis for further experiments. Keywords: adrenocortical cells, ultrastructure, calcium, adrenocorticotropic hormone, acetylcholine. PAGE \* Arabic 27

Похожие записи