НАУКОВИЙ ЦЕНТР РАДІАЦІЙНОЇ МЕДИЦИНИ АМН УКРАЇНИ

Дмитренко Ірина Віталіївна

УДК 577.21:575:616.155.392-053.2

Молекулярно-генетичні порушення, асоційовані з гострими лейкеміями у
дітей

03.00.15 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті клінічної радіології

Наукового центру радіаційної медицини АМН України

Науковий керівник

доктор біологічних наук

Мінченко Жана Миколаївна,

Інститут клінічної радіології Наукового центру радіаційної медицини АМН
України, завідувач лабораторії імуногенетики відділу гематології та
трансплантології

Офіційні опоненти

доктор біологічних наук

Дьоміна Емілія Анатоліївна,

Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології АМН
України,

провідний науковий співробітник відділу радіобіології

доктор біологічних наук

Заставна Данута Володимирівна,

Інститут спадкової патології АМН України, м. Львів,

завідувач відділення діагностики спадкової патології

Провідна установа

Київський національний університет ім. Тараса Шевченка,

кафедра загальної та молекулярної генетики

Захист дисертації відбудеться “ 23 ” березня 2006 р. о 13.00
годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.562.02 Наукового
центру радіаційної медицини АМН України (04050, м. Київ, вул.
Мельникова, 53).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Наукового центру
радіаційної медицини АМН України (04050, м. Київ, вул. Мельникова, 53).

Автореферат розісланий “ 21 ” лютого 2006 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради ________________________ А.В.
Стефанович

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Сучасна молекулярно-генетична діагностика лейкемій
базується на визначенні специфічних генетичних порушень, пов’язаних із
злоякісною трансформацією клітин. Генодіагностика надає можливість не
тільки судити про ступінь злоякісності пухлини, але і проводити ранню
ідентифікацію маркерів несприятливого прогнозу щодо перебігу хвороби. що
у великій мірі вилучає фактор суб’єктивності в оцінці конкретного
клінічного синдрому і є вкрай важливим для вибору тактики лікування
(Киселев Ф.Л. с соавт., 1990; Greaves M., Wiemels J., 2003; Steelman
I.S. et al., 2004).

На сьогодні вже описана більшість специфічних транслокацій, пов’язаних
із гострими лейкеміями (ГЛ) (Сергеев А.Г. с соавт., 2000). Транслокації
приводять до утворення химерних генів та експресії химерних білків з
онкогенними властивостями. Однак, у випадках гострих лімфобластних
лейкемій (ГЛЛ) такі транслокації та відповідні химерні гени виявляються
у невеликому відсотку хворих. Це обумовило необхідність пошуку інших
пухлинних маркерів, які б представляли більш зручну мішень для детекції
лімфоїдної клональності. До таких маркерів належать гени важких та
легких ланцюгів імуноглобулінів (IgH та IgK), оскільки перебудови в них
виникають на ранніх етапах В-клітинної проліферації (Ruiz-Arguelles G.J.
et al., 2000). Оскільки пухлинна маса походить з однієї
злоякісно-трансформованої клітини, то перебудови генів імуноглобулінів
(Ig) всіх пухлинних клітин будуть ідентичні.

У випадках, коли специфічні транслокації відсутні і походження
злоякісного процесу залишається нез’ясованим, ключову роль можуть
відігравати інші генетичні пошкодження, що стосуються, наприклад,
мутацій в генах-супресорах пухлини або в генах репарації
дезоксірибонуклеїнової кислоти (ДНК). За даними більшості авторів
непрямим доказом порушень в генах репарації є поява мікросателітної
нестабільності, що характеризується змінами у мікросателітній ДНК. Вони
виникають внаслідок зниження ефективності клітинних репараційних систем.
Порушення репарації ДНК розглядають як частину молекулярного механізму
канцерогенезу (Chung D.C., Rustgi A.K., 1995; Indraccolo S. et al.,
1999).

Дані про наявність мікросателітної нестабільності при гемобластозах
досить суперечливі. В експериментальних роботах виявлено взаємозв’язок
між інактивацією генів репарації і наступною мікросателітною
нестабільністю з одного боку та із злоякісною лімфоїдною проліферацією з
іншого боку (Lowsky R. et al., 1997). Окремі дослідники розглядають
мікросателітну нестабільність як ознаку прогресії гострих та хронічних
лейкемій (Wada C. et al., 1994). Існують дані про те, що наявність
мікросателітної нестабільності у початковому періоді гострої лейкемії
або неходжкінської злоякісної лімфоми є несприятливим прогностичним
фактором. При цьому рецидиви, які розвиваються досить швидко,
резистентні до хіміотерапії (Indraccolo S. et al., 1999).

Не дивлячись на прогрес в галузі молекулярно-генетичної діагностики
лейкемій, на сьогоднішній день немає єдиної думки про діагностичне і
прогностичне значення відносно перебігу захворювання як транслокацій і
пов’язаних з ними химерних генів, так і маркерів клональності
(перебудови у генах імуноглобулінів та в мікросателітних локусах) при
гострих лейкеміях у дітей. Практично відсутні роботи по дослідженню
взаємозв’язку між нестабільністю мікросателітної ДНК, утворенням
химерних генів, цитогенетичними порушеннями і іншими маркерами
клональності.

Безумовно, сучасна діагностика гострих лейкемій у дітей для встановлення
діагнозу повинна включати дані про генетичні зміни, які обумовлюють
властивості пухлини та особливості перебігу захворювання, що вимагає
розробки відповідної схеми дослідження клональних генетичних порушень у
таких хворих. Застосування встановлених цитогенетичних та
молекулярно-генетичних ознак патологічного клону дасть змогу визначити
ступінь злоякісності процесу та визначити групу ризику щодо перебігу
хвороби, виділити групи лейкемій з однаковими генетичними механізмами
для подальшої модифікації програми лікування, збільшити термін
тривалості життя хворих, що буде мати соціально-економічний ефект.
Наведене визначає актуальність проблеми і обгрунтовує вибір теми
дисертаційної роботи.

Зв’язок роботи з науковим програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконувалась на базі Інституту клінічної радіології Наукового
центру радіаційної медицини АМН України в лабораторії імуногенетики
відділу гематології та трансплантології, а також в Лестерському
університеті (Великобританія) на кафедрі генетики (керівник наукової
групи проф. Ю.Є. Дуброва). Робота виконана в рамках науково-дослідних
робіт за тематикою АМН України: “Створити програму проведення
трансплантації стовбурових клітин кісткового мозку з урахуванням
особливостей реакції організму постраждалих у віддалений період після
радіологічної катастрофи” (№ держреєстрації 0100U00338, 2000–2003 рр.),
“Вивчити особливості перебігу лейкемій та лімфом у дітей і підлітків,
які проживають на забруднених радіонуклідами територіях України, та
удосконалити сучасні методи лікування їх у віддалений період після
аварії на ЧАЕС. Розробити та впровадити систему
лікувально-профілактичних заходів у дітей і підлітків груп радіаційного
ризику з онкогематологічної патології” (№ держреєстрації 0102U005694,
2002–2005 рр.), “Визначення ролі генетичних систем крові та деяких
молекулярно-генетичних маркерів пухлинних клонів в комплексній оцінці
ефективності трансплантації стовбурових гемопоетичних клітин у хворих на
лейкемії, лімфоми та солідні пухлини” (№ держреєстрації 0103U001408,
2003–2006 рр.).

Мета і задачі дослідження. Мета дослідження – визначення
молекулярно-генетичних маркерів пухлинних клонів з урахуванням
клональних перебудов в генах імуноглобулінів і мікросателітної
нестабільності як прогностичних факторів перебігу гострих лейкемій у
дітей, розробка оптимальної схеми дослідження клональних генетичних
порушень у дітей, хворих на гострі лейкемії.

Для досягнення зазначеної мети були поставлені такі задачі:

1. Вивчити цитогенетичні порушення у дітей, хворих на гострі лейкемії.

2. Вивчити експресію химерних генів у дітей, хворих на гострі лейкемії.

3. Вивчити клональні перебудови в генах легких та важких ланцюгів
імуноглобулінів у дітей, хворих на гострі лейкемії.

4. Вивчити порушення мікросателітної ДНК у дітей, хворих на гострі
лейкемії.

5. Визначити найбільш діагностично значущі генетичні порушення при
гострих лейкеміях, розробити схему дослідження клональних генетичних
порушень у дітей, хворих на гострі лейкемії.

6. Вивчити взаємозв’язок між молекулярно-генетичними порушеннями
(химерними генами, клональними перебудовами в генах Ig, мікросателітною
нестабільністю) та клініко-гематологічними факторами прогнозу і
перебігом гострих лейкемій у дітей.

Об’єкт дослідження: цитогенетичні та молекулярно-генетичні порушення при
гострих лейкеміях у дітей.

Предмет дослідження: характеристика молекулярно-генетичних порушень як
критериїв щодо перебігу гострих лейкемій у дітей.

Методи дослідження. Для вирішення поставлених завдань використовували
цитогенетичні, молекулярно-генетичні методи дослідження. Статистична
обробка даних проводилася за допомогою програми Microsoft Excell та
програмних пакетів STATISTIKA (версія 7.0) і SYSTAT (версія 10.0).

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше проаналізовані та описані
характер, частота та складність порушень каріотипу, експресія химерних
генів, клональні перебудови генів імуноглобулінів та порушення в
мікросателітній ДНК (локуси D9S171 та D12S98) в співставлені з
показниками перебігу гострих лейкемій у дітей.

Показано, що наявність клітин із спорідненими клонами є прогностично
несприятливою ознакою перебігу ГЛ.

Вперше встановлено, що складні клональні порушення каріотипу у дітей,
хворих на ГЛ, є незалежним прогностично несприятливим чинником
індивідуальної відповіді на терапію, а делеція 16-ї хромосоми в сегменті
16q13 специфічна для хворих на гостру мієлобластну лейкемію (ГМЛ) і не
погіршує прогноз перебігу захворювання.

Встановлено, що транскрипт AML/ETO не є специфічним виключно для
М2-варіанту ГМЛ, що обумовлює необхідність його дослідження у всіх
хворих на гостру мієлобластну лейкемію. Показано, що ПЛР-позитивні хворі
щодо генів AML1/ETO та TEL/AML1 мають кращу відповідь на терапію.

Показано, що клональні перебудови генів імуноглобулінів, а також
порушення в мікросателітних локусах D9S171 та D12S98 можуть бути
використані як молекулярні маркери пухлинного клону у дітей, хворих на
ГЛЛ. А залучення декількох пар праймерів для кожного гена та аналіз двох
генів імуноглобулінів (IgH та IgK) збільшує виявлення клональності.

Встановлено, що контроль за мінімальною резидуальною хворобою, який
грунтується на скринінгу химерних транскриптів та клональних порушень
генів імуноглобулінів, дозволяє виділити пацієнтів з найвищим ризиком
розвитку раннього рецидиву ГЛ.

Практичне значення одержаних результатів. На основі вивчення
цитогенетичних та молекулярно-генетичних порушень у дітей, хворих на
гострі лейкемії, визначені критерії прогнозу перебігу цього
захворювання, надана оцінка інформативності різних методів дослідження
окремих маркерів пухлинних клонів у пацієнтів з ГМЛ та ГЛЛ. Обгрунтована
доцільність використання клональних перебудов генів імуноглобулінів та
мікросателітної нестабільності як маркерів клональності лейкемічного
процесу у дітей.

Розроблена схема дослідження клональних молекулярно-генетичних порушень
у дітей, хворих на гострі лейкемії.

За результатами роботи розроблено “Методичні рекомендації щодо принципів
формування груп ризику з онкогематологічних захворювань та прогноз
перебігу лейкемій у дітей, які мешкають на забруднених радіонуклідами
територіях України”, співавтори В.Г. Бебешко, О.В. Кучер, К.М. Бруслова,
О.Є. Кузнєцова.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведено
патентно-інформаційний пошук, проаналізовано літературу за обраною
темою, визначено мету і задачі дослідження. Особисто виконані постановка
культури клітин кісткового мозку, приготування та диференційне
G-фарбування препаратів хромосом обстежених пацієнтів, цитогенетичний
аналіз, дослідження експресії химерних генів методом
зворотнотранскриптазної полімеразної ланцюгової реакції (ЗТ-ПЛР),
клональних перебудов генів імуноглобулінів методом полімеразної
ланцюгової реакції (ПЛР), вивчення мікросателітної нестабільності
методом ПЛР з подальшим сіквенуванням, статистичний аналіз матеріалу.
Самостійно проведено аналіз та узагальнення даних, сформульовано
висновки, написано і оформлено всі розділи дисертації.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались і
обговорювались на III науково-практичній конференції “Onсogenetic
problems: scientific and applied aspects” (Київ, 2002), 8-му щорічному
конгресі Європейської асоціації гематологів (Ліон, Франція, 2003), 9-му
щорічному конгресі Європейської асоціації гематологів (Женева,
Швейцарія, 2004), 5-й парнасівській міжнародній конференції “Molecular
mechanisms of cellular signaling” (Київ, 2005), міжнародній
науково-практичній конференції “Гематологія і трансфузіологія”,
присвяченій 5-річчю “Українського журнала гематології та
трансфузіології” (Київ, 2005).

Публікації. Основні положення роботи викладено в 12 друкованих працях, в
тому числі в 5 cтаттях у фахових наукових журналах та 7 тезах
доповідей на конференціях.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 180 сторінках
машинопису і складається із вступу, огляду літератури, описання
матеріалів і методів дослідження, 5 розділів власних досліджень, аналізу
та узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних
літературних джерел (9 російською та українською мовами та 153
іноземних). Дисертаційна робота проілюстрована 39 таблицями та 16
малюнками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Групу обстеження склали 110 пацієнтів у
віці від одного до 18 років, у яких був встановлений діагноз ГМЛ (35
дітей) та ГЛЛ (75 дітей). Додатково було обстежено 19 дорослих віком від
19 до 32 років, хворих на ГМЛ. Контрольну групу складали 20 здорових
дітей віком від 4 до 18 років.

Діагноз лейкемії встановлювався співробітниками відділення радіаційної
гематології дитячого віку (зав. відділення – д.мед.н. К.М. Бруслова),
відділу гематології та трансплантології (зав. відділу – чл.-кор. АМН
України, д.мед.н., проф. В.Г. Бебешко) Інституту клінічної радіології
Наукового центру радіаційної медицини АМН України, а також відділу
гематології дитячого віку Науково-дослідного інституту гематології та
переливання крові АМН України (зав. відділу – к.мед.н. В.Д. Дроздова).

Оцінка первинного клінічного статусу включала огляд шкірних покривів,
враховувала розміри печінки та селезінки, а також наявність збільшених
лімфовузлів, лейкемічних проявів з боку центральної нервової системи
(ЦНС) та осалгій. У гемограмі до уваги брали абсолютну кількість
лейкоцитів, тромбоцитів, рівень гемоглобіну та відсоток бластних клітин.
У кістковому мозку оцінювали відсоток бластних клітин. Діагноз ГЛ
формувався у відповідності до FAB-класифікації і імунофенотипу бластних
клітин.

Для оцінки особливостей клінічного перебігу захворювання аналізували
відповідь на терапію на 33-й день від початку лікування (наявність або
відсутність ремісії), тривалість ремісії (безрецидивне виживання),
наявність рецидиву, а також п’ятирічне загальне виживання. Лікування
хворих проводилося за стандартними протоколами інтенсивної
поліхіміотерапії відповідно до імуноцитоморфологічного варіанта
захворювання. Шістьом пацієнтам була проведена трансплантація
гемопоетичних стовбурових клітин периферичної крові. Медіана тривалості
спостереження за пацієнтами складала 32 місяці (від 1 до 182 місяців).
Обсяг проведених досліджень наведено в табл. 1.

Цитогенетичні дослідження проводили на прямих та 24-годинних
нестимульованих культурах клітин кісткового мозку. Препарати метафазних
хромосом фарбували за G-методом. Ідентифікацію кожної пари хромосом та
їх змін проводили згідно з критеріями ISCN (1995). У кожного пацієнта
аналізували від 7 до 30 метафазних пластинок. В облік брали тільки
клонові порушення (Mitelman F., 1995). Клоном вважали порушення, яке
повторювалося не менше ніж двічи на 10 проаналізованих пластинок. Клон з
втратою чи придбанням хромосоми враховувався тільки при наявності
мінімум трьох клітин з однаковою чисельною аномалією на 10
проаналізованих клітин.

Таблиця 1

Методи дослідження та групи пацієнтів, які були обстежені

Найменування дослідження Кількість обстеже-них пацієнтів з ГМЛ Кількість
обстеже-них пацієнтів

з ГЛЛ Всього

Цитогенетичне дослідження каріотипу 19 26 45

ПЛР-дослідження експресії химерних генів 32 61 93

ПЛР-дослідження клональних перебудов генів IgK і IgH

12

40

52

Дослідження порушень в мікросателітних локусах D6S268, D9S171, D12S98

7

21

28

Вилучення геномної ДНК з клітин кісткового мозку, периферичної крові та
букального епітелію проводили за стандартною методикою “висолювання”
(Miller S. et al., 1988). Вилучення РНК з клітин кісткового мозку та
периферичної крові проводили за Chomchinski P., 1987.

Визначення експресії химерних генів BCR/ABL, E2A/PBX1, MLL/AF4, MLL/AF9,
AML/ETO, TEL/AML1 та CBF-в/MYH11 проводили за допомогою двораундової
“гніздової” ЗТ-ПЛР. Праймери для ампліфікації генів BCR/ABL, MLL/AF4 та
AML/ETO синтезували згідно до протоколів, рекомендованих Європейською
програмою BIOMED-1 (van Dongen J., 1999). Праймери для ампліфікації
генів E2A/PBX1, MLL/AF9, TEL/AML1 та CBF-в/MYH11 входили до складу
комерційних наборів (Гематологічний науковий центр РАМН, Москва).
Продукт ампліфікації візуалізували методом электрофорезу в 2 %
агарозному гелі.

Для визначення клональних перебудов в генах імуноглобулінів (IgK та IgH)
праймери, склад ПЛР-суміші та температурні режими ампліфікації
відповідали протоколам, рекомендованим Європейською програмою BIOMED-1
(Pongers-Willemse M.J. et al., 1999), а також згідно Garsia-Sаnz R. et
al. (1999). Для визначення перебудов у гені IgK використовували 5 пар
праймерів, а IgH – 2 пари праймерів. Після ампліфікації проводився
гетеродуплексний аналіз для виділення клональних ПЛР-продуктів
(Garsia-Sаnz R. et al., 1999). Отриманий продукт візуалізували методом
электрофорезу в 6 % поліакріламідному гелі.

Для дослідження перебудов у мікросателітній ДНК у кожного пацієнта
порівнювали мікросателітну пухлинну та конституційну ДНК. Джерелом
пухлинної ДНК були клітини кісткового мозку або периферичної крові в
гострому періоді захворювання. Конституційну ДНК отримували з букального
епітелію або в деяких випадках з клітин кісткового мозку в фазі
клініко-гематологічної ремісії. Проводили мультиплексну ПЛР
мікросателітних маркерів D6S268, D9S171, D12S98. Праймери та умови
ампліфікації відповідали наведеним в базі даних Genome DataBase (
HYPERLINK «http://www.ncbi.nlm.gov/Entrez» www.ncbi.nlm.gov/Entrez ).
Результати аналізували за допомогою автоматичного аналізатора ABI PRISM
3100 (“Applied Biosystems”, США) з використанням програмного
забезпечення GeneMapper, версія 3.0. Появу в пухлинній ДНК нового алеля
в даному локусі враховували як мікросателітну нестабільність (МСН),
втрату алелей порівняно з конституційною ДНК – як втрату
гетерозиготності (ВГ).

Цифровий матеріал оброблявся методом варіаційної статистики (критерій
Likelihood ratio ч2). Розподіл тривалості ремісії (безрецидивного
виживання) та загального виживання оцінювалися методом Каплан і Мейер,
дані про виживання порівнювали за результатами log-rank-тесту. Для всіх
досліджуваних показників статистично вірогідною вважалася величина
р<0,05. Комп’ютерна обробка даних проводилася за допомогою програми Microsoft Excel та програмних пакетів STATISTIKA (версія 7.0) і SYSTAT (версія 10.0). Результати роботи та їх обговорення. Гостра лейкемія – гетерогенне захворювання з різним результатом лікування. Наявність певних закономірностей і відмінностей в перебізі патологічного процесу дозволяють припустити, що ГЛ можуть бути розділені на декілька біологічних підгруп за особливостями генетичних порушень. Тому основу дослідження склало вивчення порушень каріотипу, експресії химерних генів, що виникають при специфічних для ГЛ транслокаціях, дослідження клональних перебудов генів IgK та IgH, а також порушень мікросателітної ДНК у дітей з різними морфологічними формами ГЛ. Клініко-гематологічна характеристика обстежених пацієнтів. Групи дітей з ГМЛ та ГЛЛ вірогідно (р<0,001) відрізнялися віковими піками. Серед хворих на ГМЛ переважали діти, старші за 10 років (середній вік 12,34±0,85 років, медіана 14 років), тоді як в групі дітей з ГЛЛ вік більшості пацієнтів був до 10 років (середній вік 8,63±0,55 років, медіана 8 років). До групи обстеження входили 64 особи чоловічої статі і 46 дівчаток. Розподіл за статтю був однаковим обох групах нагляду. Аналіз ініціальних клініко-лабораторних показників показав, що в групі хворих на ГЛЛ вірогідно частіше (р<0,05) відмічалася органомегалія, збільшення лімфовузлів та скарги на осалгії. У цих дітей вірогідно частіше (р<0,05) виявлялися бластні клітини в периферичній крові, та відносна кількість бластних клітин у аспіраті кісткового мозку. Серед хворих на ГМЛ двоє дітей були резистентні до терапії, що було вірогідно частіше (р<0,05), ніж в групі дітей з ГЛЛ. Хворі на ГМЛ характеризувалися вірогідно меншим (p<0,05) загальним п’ятирічним виживанням. Відмінності в ініціальних клінічних проявах та тривалості життя хворих на ГМЛ та ГЛЛ дали підставу окремо розглядати генетичні порушення в кожній групі обстежених. Були окреслені основні клініко-лабораторні параметри і сформовані групи пацієнтів з ГЛ за віком, спільними ініціальними клініко-лабораторними показниками та особливостями перебігу захворювання для співставлення з молекулярно-генетичними порушеннями, які можуть їх обумовлювати. Характеристика цитогенетичних порушень у дітей, хворих на гострі лейкемії, та їх прогностичне значення. Клональні хромосомні порушення мали місце у 7 з 19 хворих на ГМЛ та 5 з 26 хворих на ГЛЛ. Ці показники дещо нижчі в порівнянні з літературними даними (Rooney D.E., Czepulkowski B.H., 1992; Xue Y. еt al., 2001; Jarosova M., 2003). Однією з можливих причин такого розмаїття у виявленні хромосомних аномалій при аналізі диференційно забарвлених хромосом може бути різне співвідношення підваріантів гострих лейкемій в обстежених групах. Не було виявлено вірогідних відмінностей у розповсюдженості порушень каріотипу в группах хворих на ГМЛ та ГЛЛ та специфічних асоціацій з морфоцитохімічними підваріантами ГМЛ. У групі пацієнтів з ГЛЛ цитогенетичні порушення виявлялися тільки у хворих на В-клітинну лейкемію. Найчастіше до клональних перебудов залучалася 16-та хромосома (у 6 випадках з 25 подій). При цьому в більшості випадків (5 з 7) такі порушення були специфічні для хворих на ГМЛ (р=0,07). Треба відзначити, що тільки у одного з цих пацієнтів була зареєстрована інверсія 16-ої хромосоми, яка вважається специфічною для ГМЛ М4Ео (Lo-Coco F. et al., 2003). У решти хворих спостерігалися делеції довгого плеча 16-ої хромосоми на різних рівнях і транслокація t(16;21)(p11.2;q22). Делеція довгого плеча 16-ї хромосоми в сегменті q13 мала місце виключно у хворих на ГМЛ (р<0,05). В окремих повідомленнях про хворих на ГМЛ з del(16q) автори вказують наявність інших криптичних перебудов із залученням 16-ї хромосоми, які, можливо, й визначали особливості перебігу захворювання ( HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&term =%22Usuki+K%22%5BAuthor%5D" \o "Click to search for citations by this author." Usuki K. еt al., 1996; HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&term =%22Sharma+P%22%5BAuthor%5D" \o "Click to search for citations by this author." Sharma P. еt al., 1999). У наших дослідженнях використання молекулярно-генетичних методів підтвердило, що вказана делеція не була результатом криптичної транслокації t(16;16) або інверсії inv(16). Всі хворі на ГМЛ з del(16)(13q) досягли повної ремісії до 33-го дня індукційної терапії і не мали дуже ранніх рецидивів. Була виділена група хворих із складними порушеннями каріотипу, коли мали місце декілька структурних і/або чисельних хромосомних порушень у одного і того ж пацієнта (2 з 7 хворих на ГМЛ і 2 з 5 хворих на ГЛЛ). З них у жодного хворого на ГМЛ не було зареєстровано повної ремісії на 33-й день лікування. Навпаки, обидва хворі на ГЛЛ досягли ремісії в стандартні терміни, але мали дуже ранні рецидиви. Хворі на ГМЛ із складними порушеннями каріотипу відрізнялися вірогідно меншою тривалістю життя (р<0,05). Серед них у одного хворого спостерігалися клітини зі спорідненими клонами, що свідчить про прогресію захворювання. В одному випадку М4Ео ГМЛ мала місце інверсія inv(16), специфічна для даного варіанту ГМЛ, яка супроводжувалася появою додаткової 22-ої хромосоми, що на нашу думку сприяло розвитку раннього рецидиву у цієї пацієнтки. Наявність inv(16) дозволяє віднести хворого до групи низького ризику, тоді як поява додаткової хромосомної аберації погіршує прогноз перебігу захворювання. Цей висновок повністю узгоджується з думкою Douet-Guilbert N. з співавт. (2003). На наш погляд, не дивлячись на присутність специфічних прогностично сприятливих цитогенетичних порушень, складні зміни каріотипу у вигляді додаткових клонових хромосомних аномалій є несприятливою прогностичною ознакою і погіршують перебіг захворювання. Дуже злоякісний перебіг захворювання спостерігався у дитини з М5а ГМЛ, яка мала в каріотипі 3 споріднених клона. У всіх клітинах була присутня рідкісна транслокація t(16;21)(p11.2;q22). Подібно до даних Kong X.T. з співавт. (1997), обстежена нами дитина без виходу в ремісію померла через 8 місяців від встановлення діагнозу. Проте, первинна резистентність до хіміотерапії і такий бурхливий розвиток захворювання, можливо, були обумовлені не тільки транслокацією t(16;21), яка є несприятливою прогностичною ознакою (Kong X.T. et al., 1997), але і персистенцією додаткових клонів у вигляді делеції del(6q) (16 % клітин), а також рідкої транслокації дуплікованого фрагмента довгого плеча 1-ої хромосоми на довге плече 13-ої хромосоми. І хоча був зареєстрований тільки один випадок резистентності до терапії, вірогідність асоціації такого перебігу захворювання із наявністю складного каріотипу та ознак прогресії пухлини мала статистично значущий рівень (р<0,05). Поява додаткових хромосомних аномалій характерна для прогресії захворювання ( HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&term =%22Domracheva+EV%22%5BAuthor%5D" \o "Click to search for citations by this author." Domracheva E.V. еt al., 2002). Складні порушення каріотипу з однаковою частотою описані у всіх групах ризику, що обумовлює корисність цього маркера в ідентифікації пацієнтів з несприятливим прогнозом перебігу захворювання ( HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&term =%22Van+Limbergen+H%22%5BAuthor%5D" \o "Click to search for citations by this author." van Limbergen H. et al., 2002; Jarosova M. et al., 2003; HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&term =%22Mugneret+F%22%5BAuthor%5D" \o "Click to search for citations by this author." Mugneret F . et al., 2003). Як один із запропонованих механізмів розвитку складних генетичних порушень висловлена гіпотеза про вирішальне значення для еволюції пухлини не появи нових специфічних порушень, а зміни дози генів, що виявляється у вигляді моносомій, трисомій, делецій і призводить до генетичного дисбалансу ( HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&term =%22Johansson+B%22%5BAuthor%5D" \o "Click to search for citations by this author." Johansson B . et al., 1994). Наші спостереження також показали, що це припущення може бути цілком справедливим. Різний початок і перебіг захворювання мали хворі на ГЛЛ із складними каріотипами, до складу яких входили порушення в довгому плечі 11-ої хромосоми (11q23), де розташований MLL-ген. У хворого з каріотипом 46,XY,del(11)(q23)[6]/ 46,XY,del(11)(q23),i(10)[1]/46,XY,i(10)[1]/46,XY[12] під час встановлення діагнозу клінічно виявлялася тільки спленомегалія та осалгії, в показниках крові – тромбоцитопенія і низький рівень гемоглобіну. Незалежно від наявності порушень в 11q23 та додаткових хромосомних аберацій, клініко-гематологічна ремісія тривається у нього 33 місяці. Цей випадок збігається з даними інших дослідників про те, що хворі з делецією 11q23 відповідають на терапію краще, ніж пацієнти з будь-якою іншою перебудовою в сегменті 11q23 (Raimondi S.C. et al., 1995; Pui C. et al., 2002). Цей факт може бути пов’язаний із тим, що при незбалансованих транслокаціях і делеції 11q23 ген MLL рідко залучається до перебудови, що і обумовлює відносно сприятливий пребіг захворювання у хворих цієї групи (Raimondi S.C. et al., 1995). Маніфестація і перебіг хвороби різко відрізнялися в іншої хворої з транслокацією t(4;11), яка була частиною складного каріотипу 49,XX,t(4;11)(q21;q23),+X,+2mar. Клініко-лабораторні показники (високий ініціальний лейкоцитоз, гепатоспленомегалія, залучення центральної нервової системи) повністю відповідали описаним в літературі у хворих з t(4;11) (Сергеев А.Г. и др., 2000; Cazzaniga G. et al., 2002). Через 2 місяці лікування за протоколом високого ризику у неї розвинувся рецидив, резистентний до терапії. Очевидно, що наявність складного каріотипу у поєднанні з транслокацією t(4;11), яка сама по собі є несприятливою ознакою, повинна розглядатися як чинник вибору протоколу лікування для групи високого ризику, можливо, з подальшою трансплантацією стовбурових кровотворних клітин периферичної крові (ТСККПК) в першій ремісії. Таким чином, ряд виявлених хромосомних порушень має прогностичне значення і є чинником віднесення хворого до тієї або іншої групи ризику. Відсутність асоціативних зв’язків між порушеннями каріотипу та ініціальними клініко-лабораторними показниками у хворих на ГЛ свідчить про те, що виділені клональні порушення є незалежними прогностичними чинниками щодо перебігу захворювання. Отримані результати підкреслюють необхідність комбінування цитогенетичних і молекулярно-генетичних досліджень для більш повного виявлення гене-тичних порушень, особливо при бідній морфології хромосом, низькому виході, або повній відсутності метафаз. Збереження ранньої смертності, а також дуже ранніх рецидивів в групі хворих без порушень каріотипу спонукає до пошуку додаткових генетичних порушень, які, з одного боку, є маркерами клональності, а з іншого – визначають біологічні механізми канцерогенезу. Експресія химерних генів у дітей, хворих на гострі лейкемії, та їх прогностичне значення. Експресія химерних генів мала місце у 27 з 93 обстежених дітей. Вірогідно частіше (р<0,01) вона виявлялася у дітей з ГМЛ (у 15 з 32), ніж дітей з ГЛЛ (12 з 61). Найбільш поширеним серед хворих на ГМЛ (у 8 з 32 обстежених дітей та у 6 з 19 дорослих) виявився транскрипт AML1/EТО, що утворюється внаслідок транслокації t(8;21). Він не був специфічним для М2-варіанту, який реєструвався тільки у половини ПЛР-позитивних хворих на ГМЛ. Враховуючи, що хворі на ГМЛ, у яких мала місце така перебудова, відрізнялись кращою відповіддю на терапію (5 повних ремісій серед 8 обстежених дітей) та меншим відсотком дуже ранніх рецидивів (2 рецидива з 8 обстежених дітей), ми вважаємо доцільним розглядати транслокацію t(8;21) з химерним геном AML1/EТО як ознаку сприятливого прогнозу щодо перебігу захворювання. Транскрипт CBFB/MYH11 був специфічним (р<0,05) для М4Ео-варіанту ГМЛ. Ми не виявили вірогідних відмінностей у перебізі захворювання у дітей з цією перебудовою порівняно із хворими, у яких не реєструвалися химерні транскрипти. Специфічною виключно для хворих на ГЛЛ в нашому дослідженні була експресія химерних генів E2A/PBX і TEL/AML1. Експресія химерного гена E2A/PBX1 була виявлена у 2 з 61 дитини з ГЛЛ. За результатами клініко-гематологічного обстеження при встановленні діагнозу у таких хворих були відсутні скарги на осалгії та мав місце ініціальний лейкоцитоз більше за 20 Г/л, який є чинником несприятливого перебігу захворювання. Особливостей відпо-віді на терапію у дітей з експресією химерного гена E2A/PBX1 виявлено не було. ? ¬ ® d?th]„Aa$ " † ? ¬ ® a N ® a N P R t v ? a N P R v x ? a l AeCuuuuuuuuuuoooooeeeeaaOE T4VaeXEZ°^?_aeauegael2nvqxqooooooeeeeoeeeeeeeoooaeO d?th`„A d?th`„A oeeeooUNNoNoNeNNeeeoAo d?th`„A O O O U U U %, що утворюється в результаті криптичної транслокації t(12;21), виявлялася у двох дітей. Наші результати щодо сприятливого перебігу захворювання у цих хворих (обидва пацієнта досягли повної ремісії і не мали ранніх рецидивів) не досягли рівня статистичної значущості. Але дослідження, проведені на великих групах обстежених (Jamil A. et al., 2000), виявляють кореляцію між експресією химерного гена TEL/AML1 і тривалим загальним і безподійним виживанням, що свідчить про позитивний результат лікування хворих з t(12;21) і дає можливість розглядати це порушення як прогностично сприятливу ознаку. Експресія химерного гена BCR/ABL мала місце у 3-х хворих на ГЛЛ і у одного хворого на ГМЛ. При цьому хворі відрізнялися різними варіантами химерного продукту. Для хворих на ГЛЛ характерним вважається переважання транскрипту BCR/ABL р190 (Cazzaniga G. et al., 2002). В нашому дослідженні в групі дітей з ГЛЛ виявлена як експресія химерного гена BCR/ABL р190, так і BCR/ABL р210. При ГМЛ мав місце лише транскрипт BCR/ABL р210. У всіх обстежених нами BCR/ABL-позитивних хворих цитогенетично не виявлялася t(9;22) і інші клональні порушення каріотипу. Схожі результати наведені в роботі (Wells S.J. et al., 1996). Причиною може бути наявність інших, не завжди помітних перебудов, що приводять до формування химерного гена BCR/ABL без Ph хромосоми. Аналіз показників перебігу захворювання не виявив яких-небудь відмінностей у групі хворих з експресією гена BCR/ABL. Перебудови, що задійснюють ген MLL, зокрема MLL/AF4, також були присутні як у пацієнтів з ГМЛ (у одного з 32 дітей), так і з ГЛЛ (у 2 з 61 дитини). Проведення цитогенетичного дослідження у цих хворих виявило транслокацію t(4;11) тільки в однієї дитини з дуже злоякісним перебігом захворювання. В наших дослідженнях не вдалося показати особливості перебігу захворювання, обумовлені цією перебудовою. Можливо, це пов’язано з тим, що за віком всі хворі (за винятком вищезазначеного випадку) не виходили за межі вікової групи від одного до 10 років, яка відрізняється кращими показниками виживання серед хворих з t(4;11) (Forestier E. et al., 2000). У всіх випадках транскрипти MLL/AF4 розрізнялись місцями розриву задіяних генів. Можливо, кожний з них має своє прогностичне значення і є специфічним для того чи іншого варіанту гострої лейкемії. Дослідження не показало розбіжностей у розповсюдженості експресії химерного гена MLL/AF4 серед дітей (від 1 до 18 років) та дорослих віком від 19 до 32 років, хворих на ГМЛ. В той же час транскрипт MLL/AF9 виявлявся тільки в обстеженій групі дорослих, хворих на ГМЛ. Дослідження мінімальної резидуальної хвороби (МРХ) показало, що чинником прогнозу перебігу захворювання є також динаміка пухлинного клону після проведення терапії. Серед 16 обстежених дітей в клініко-гематологічній ремісії МРХ визначалася у 10 осіб (зберігалася ПЛР-позитивність). Серед хворих на ГЛЛ кількість ПЛР-негативних дітей в клініко-гематологічній ремісії була вірогідно більша (р<0,05) порівняно з групою хворих на ГМЛ. Аналіз асоційованості МРХ з типом химерного гена показав, що елімінація пухлинного клону вірогідно частіше (р<0,05) мала місце у пацієнтів, у яких в гострому періоді захворювання було виявлено експресію TEL/AML1 та BCR/ABL химерних генів. Не встановлено жодного випадку реверсії до ПЛР-негативності у пацієнтів з AML1/ETO, CBFB/MYH11 та MLL/ AF4 химерними генами. Порівнюючи відповідь на терапію у ПЛР-позитивних та ПЛР-негативних хворих на стадії клініко-гематологічної ремісії, було виявлено, що кількість повних ремісій на 33-й день у хворих без ознак персистенції пухлинного клону (ПЛР-негативні хворі) вірогідно більше (р<0,05). Згідно отриманим даним відсутність МРХ асоціюється з хорошою відповіддю на терапію (серед 6-ти ПЛР-негативних хворих тільки у одного було зареєстровано ранній рецидив і ще у одного – пізній). В той час, коли зберіганя експресії химерних генів як маркерів пухлинних клонів може супроводжуватися як тривалою ремісією, так і раннім рецидивом (з 10-ти ПЛР-позитивних дітей у 6-ти розвинувся ранній рецидив). Тобто, ПЛР-позитивність у клініко-гематологічній ремісії не є прогностичним тестом. Факт існування МРХ після відміни цитостатичного лікування свідчить, з одного боку, про недостатній протипухлинний ефект хіміотерапії і селекції стійких до певної цитостатичної дії субклонів пухлинних клітин, проліферація яких у будь-який момент може привести до рецидиву захворювання (Ford A.M. et al., 2001). З іншого боку, можливо, в період ремісії відновлюється імунологічний контроль за резидуальними пухлинними клітинами (Foa R. et al., 1996). Тривала персистенція таких маркерів пухлинних клонів, як AML1/ETO, CBFB/MYH11, підтверджує припущення Greaves M. (1997), що окремі транслокації є тільки першими з кроків, необхідних для розвитку лейкемії, тому для реактивації захворювання необхідні додаткові генетичні порушення. Це положення продовжує багатокрокову гіпотезу канцерогенезу і дозволяє розглядати наявність пухлинних маркерів під час стійкої ремісії як повернення в пре-лейкемічний стан. Таким чином, аналіз отриманих результатів свідчить про те, що для ГМЛ специфічними є химерні гени MLL/AF9, AML1/ETO, CBFB/MYH11, а для ГЛЛ – BCR/ABL p190, TEL/AML1 і E2A/PBX1. Транскрипти BCR/ABL p210 і MLL/AF4 зустрічаються як при мієлоїдній, так і при лімфоїдній лейкеміях. Прогностичним чинником є не наявність чи відсутність аберантних метафаз або експресії химерних генів, а саме характер генетичних аномалій, таких як складний каріотип, наявність споріднених клонів, експресія AML1/ETO, TEL/AML1 та MLL/AF4. Оцінка мінімальної резидуальної хвороби на основі скринінгу химерних транскриптів дозволяє виділити пацієнтів з вищим ризиком розвитку раннього рецидиву. При дослідженні МРХ прогностично сприятливим фактором є відсутність маркерів пухлинних клонів на стадії ремісії. Клональні перебудови генів IgH та IgK у дітей, хворих на гостру лімфобластну лейкемію, та їх прогностичне значення. В гострому періоді ГЛЛ клональні перебудови в генах імуноглобулінів виявлялися в 22 з 40 хворих дітей. У 11 з них (50 % від усіх хворих, у яких виявлені клональні перебудови в генах імуноглобулінів) були присутні два маркери – клональні порушення як в гені IgH, так і в гені IgK. Отримані дані показали доцільність використання мінімум двох праймерів (до ділянок FR2 і FR3) при дослідженні клональних реаранжировок гена IgH. Такий підхід дозволив нам, використовуючи пари праймерів FR2/JHс і FR3/JHс, збільшити виявлення клональності до 48 % (19/40) в порівнянні з максимальним відсотком клональності, рівним 40 %, при використанні тільки пари праймерів FR3/JHс. Схожа ситуація спостерігалася також при дослідженні генів легких ланцюгів імуноглобулінів, коли при послідовному використанні п'яти пар праймерів (VkI/Kde, VkII/Kde, VkIII/Kde, VkIV/Kde і іntron/Kde), моноклональний ПЛР-продукт був виявлений у 3-х, 6-ти, 2-х, 3-х і 3-х дітей відповідно, а суммарний ефект від одночасного використання всієї панелі праймерів склав 35 % (14/40) дітей з ГЛЛ. У групі хворих з В-клітинною ГЛЛ клональні перебудови генів Ig частіше зустрічалися при pro-B-імунофенотиповому варіанті ГЛЛ (у 6 з 8 обстежених дітей). Виявлено, що перебудови генів Ig вірогідно частіше (р<0,05) мали місце в групі пацієнтів, у яких кількість лейкоцитів в периферичній крові на момент встановлення діагнозу не перевищувала 20 Г/л, а кількість тромбоцитів була менше за 180 Г/л. Клональні перебудови генів Ig на різних стадіях терапії досліджували у 13 дітей. У хворих, у яких зберігалися обидва маркери клональності була зареєстрована гірша відповідь на терапію – у всіх розвинувся ранній рецидив (р<0,05). Краща відповідь на терапію була у хворих, у яких зареєстрована елімінація пухлинного клону на підставі зникнення обох маркерів клональності (перебудов як в генах IgK, так і в генах IgH). Проте, відсутність МРХ на момент завершення лікування ГЛЛ у дітей повністю не виключала вірогідність розвитку рецидиву. У всіх обстежених ПЛР-позитивних хворих розвинувся ранній рецидив, хоча за даними Hoeltzer D. (2000) при наявності ознак МРХ ризик розвитку рецидиву складає 61 %. У групі ПЛР-негативних дітей з 8-ми пацієнтів у 4-х також було зареєстровано зрив ремісії. У трьох з них в гострому періоді захворювання як пухлинний маркер були присутні клональні порушення тільки генів IgH. При моніторингу МРХ елімінація перебудов гена IgH може бути обумовлена його природньою гіперваріабельністю та наявністю вторинних рекомбінацій, що може бути, на думку деяких авторів, наслідком протипухлинної терапії (Sсzepanski T. et al., 2000). При цьому пухлинний клон зберігається, і такі хворі рецидивують. Тому більш інформативним ми вважаємо аналіз двох генів імуноглобулінів (IgH та IgK). Таким чином, клональні перебудови генів імуноглобулінів є специфічними для лімфоїдної злоякісної проліферації і можуть бути використані як молекулярний маркер пухлинного клону у хворих на ГЛЛ при дослідженні МРХ. Це дозволить виділити пацієнтів з вищим ризиком розвитку раннього рецидиву. Порушення мікросателітної ДНК у дітей, хворих на гострі лейкемії. Мікросателітні перебудови були виявлені у 6 з 21 дитини з ГЛЛ. У пацієнтів з ГМЛ, а також у здорових дітей подібні генетичні зміни не виявлялися. Мікросателітна нестабільність (МСН) не була типова для лейкемій і виявлялася тільки в одного хворого в локусі D9S171. Втрата гетерозиготності (ВГ) з однаковою частотою (по 3 з 6 випадків в кожному локусі) зустрічалася як в локусі D9S171, так і в локусі D12S98, в той час, як в локусі D6S268 молекулярні порушення не ідентифікувалися. Maeck L. et al., (2000), досліджуючи групи хворих на ГМЛ та мієлодиспластичний синдром МДС, також описували більш часту ВГ ніж МСН. ВГ в досліджуваних мікросателітних локусах була специфічна для лімфобластної лейкемії, що узгоджеється з даними інших авторів (Indraccolo S. et al., 1999). Втрата гетерозиготності досліджуваних мікросателітних ділянок відображає можливе місце локалізації генів-супресорів пухлини. У зв'язку з цим треба віддати належне припущенню, що інактивація або делеція генів-супресорів пухлини – основний патологічний шлях лейкемогенеза при дитячих ГЛЛ (Takeuchi S. et al., 1995; HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&term =%22Heerema+NA%22%5BAuthor%5D" \o "Click to search for citations by this author." Heerema N.A. et al., 2000). Не було виявлено асоціативних зв’язків ВГ в локусах D9S171 та D12S98 з певними імунофенотиповими варіантами ГЛЛ, проте вона вірогідно переважала у дітей старших за 10 років (р<0,05). Серед пацієнтів з порушеннями мікросателітної ДНК у вигляді ВГ, яким проводилося цитогенетичне дослідження, не було виявлено клональних порушень каріотипу. Певно, в цих випадках алельні втрати відбувалися на субмікроскопічному рівні, що підтверджує доцільність дослідження порушень в мікросателітній ДНК особливо в тих випадках, коли немає інших маркерів клональності. У хворого з мікросателітною нестабільністю в локусі D9S171 розвинувся ранній, резистентний до терапії рецидив. Інші автори теж розглядають МСН у хворих на лейкемію як несприятливу прогностичну ознаку (Indraccolo S. et al., 1999; Hayami Y. et al., 1999). При порівнянні тривалості ремісії у дітей ВГ в різних локусах звертає на себе увагу факт, що у хворого з ВГ в локусі D9S171 через 2 місяці розвинувся рецидив, в той же час у дітей з ГЛЛ, у яких мала місце ВГ в локусі D12S98, тривалість ремісії була понад 26 місяців. Таким чином, порушення в мікросателітній ДНК може використовуватися як молекулярний маркер клонального злоякісного процесу для моніторингу МРХ у дітей, хворих на ГЛЛ. Отримані результати та дані, висвітлені в літературі, щодо специфічності та прогностичної значущості різних генетичних перебудов у хворих на ГЛ стали підгрунтям для розробки оптимальної схеми дослідження клональних генетичних порушень у дітей, хворих на гострі лейкемії (рис. 1). Його основним завданням є виявлення прогностично несприятливих генетичних порушень, які обумовлюють віднесення хворого до групи високого ризику і вибір більш інтенсивної терапії. Крім того, таке дослідження дає можливість відокремити хворих на гострі лейкемії, які потребують використання специфічної терапії першої лінії (з включенням ретиноїдів при t(15;17) та інгібіторів ABL-кінази ST1571 при t(9;22)). І, нарешті, визначаються клональні генетичні порушення, які будуть використані як маркери пухлини при моніторингу відповіді на терапію та МРХ. На початковому етапі обстеження пропонується усім пацієнтам із вперше виявленою лейкемією проведення цитогенетичного дослідження клітин кісткового мозку. Це дозволить виділити групу хворих із складними порушеннями каріотипу, які потребують інтенсифікації терапії. Молекулярно-генетичне дослідження у дітей, хворих на ГЛ, доцільно починати з виявлення перебудов, що задіюють ген MLL на хромосомі 11q23, і химерного гена BCR/ABL, що виникає внаслідок транслокації t(9;22). Обидва порушення описані нами як при мієлоїдній, так і при лімфоїдній лейкеміях. Найбільша увага повинна приділятися транслокації t(4;11) з химерним геном MLL/AF4 та t(9;11) з химерним геном MLL/AF9, які обумовлюють досить несприятливий перебіг захворювання, особливо у відповідних вікових групах. В наших дослідженнях експресія химерного гена BCR/ABL не була пов’язана з певними особливостями перебігу захворювання, але наявність цієї перебудови дозволяє виділити групу хворих на ГЛ, яким можливо призначення специфічного лікування з використанням інгібіторів ABL-кінази. REF SHAPE \* MERGEFORMAT Рис. 1. Схема дослідження клональних генетичних порушень у дітей, хворих на гострі лейкемії Спрямованість подальшого дослідження обумовлюється варіантом лейкемії. З огляду на розповсюдження аберацій t(8;21) і inv(16) при різних підваріантах гострої мієлобластної лейкемії ми вважаємо, що усі хворі на ГМЛ повинні проходити обстеження на наявність цих перебудов. Вказані транслокації та відповідні химерні гени є чинником сприятливого прогнозу перебігу ГЛ. Дослідження химерного гена PML/RARa доцільне лише у хворих з підозрою на М3-варіант ГМЛ. У випадку ПЛР-позитивності до терапевтичного протоколу включають ретиноїди. Пацієнтам з ГЛЛ проводять додаткове обстеження на наявність транслокацій t(12;21), t(1;19) та відповідних химерних генів TEL/AML1 і E2A/PBX1. У зв’язку з невеликою розповсюдженістю специфічних транслокацій та відповідних химерних генів при ГЛЛ ми вважаємо, що для цієї групи хворих у якості пухлинного маркеру є обов’язковим дослідження клональних перебудов в генах IgK та IgH, а також пропонуємо використання порушень мікросателітної ДНК як додаткового маркеру клональності. Особливо це виправдано у випадках, коли інші методи не виявили злоякісну природу процесу. Динаміка пухлинного клону на різних етапах терапії є важливим прогностичним тестом щодо перебігу ГЛ, тому в фазі ремісії доцільно проводити повторне цитогенетичне та молекулярно-генетичне дослідження. Для цього ми вважаємо обов’язковим використання тільки клітин кісткового мозку через те, що у периферичній крові кількість пухлинних клітин може різко знизитися, що приводить до хибнонегативного результату. Під час рецидиву комплексне цитогенетичне і молекулярно-генетичне дослідження проводять за тією ж схемою, що й у гострий період. Це дозволить визначити, чи є рецидив результатом репопуляції початкового лейкемічного клону, чи представляє прогресію захворювання, або вторинну пухлину. Таким чином, проведені дослідження окреслюють спектр молекулярно-генетичних маркерів, які дозволять розділити пацієнтів з ГЛ на групи з однаковими генетичними порушеннями, що визначають перебіг захворювання і є чинниками віднесення хворого до певної групи ризику. На нашу думку оптимізація генетичного обстеження хворих в залежності від нозологічної форми ГЛ буде сприяти підвищенню ефективності лікування з урахуванням біологічних особливостей пухлинного процесу. ВИСНОВКИ У дисертаційній роботі наведене наукове узагальнення та нове вирішення актуальної задачі – розширення спектру генетичних критеріїв прогнозування перебігу захворювання та розробки оптимальної схеми досліджень генетичних порушень у дітей з гострими лейкеміями на основі дослідження генетичних маркерів клональної природи лейкемічного процесу: хромосомних порушень, химерних генів, перебудов генів імуноглобулінів та порушень мікросателітної ДНК. 1. Клональні порушення на генному, хромосомному та геномному рівнях визначаються як генетичні маркери пухлинних клонів. Їх аналіз надає можливість не тільки судити про ступінь злоякісності пухлини, але і проводити ранню ідентифікацію маркерів несприятливого прогнозу щодо перебігу хвороби, а також моніторинг МРХ та ерадикації пухлинного клону. Найбільш важливим прогностичним чинником є не наявність чи відсутність, а саме характер генетичних аномалій, а також їх динаміка в процесі лікування. 2. Складні клональні зміни каріотипу під час первинного встановлення діагнозу є незалежним прогностично несприятливим чинником індивідуальної відповіді на терапію, не зважаючи на присутність специфічних прогностично сприятливих цитогенетичних порушень. Наявність клітин із спорідненими клонами свідчить про прогресію захворювання. Їх теж можна розглядати як прогностично несприятливу ознаку. 3. Характер і частота порушень каріотипу у дітей залежить від варіанта лейкемії. Делеція 16-ї хромосоми в сегменті 16q13 специфічна для хворих на ГМЛ і не погіршує прогноз перебігу захворювання. 4. Експресія химерних генів вірогідно частіше зустрічається у дітей з ГМЛ, ніж дітей з ГЛЛ. Для ГМЛ специфічними визначені транскрипти MLL/AF9, AML1/ETO, CBFB/MYH11, а для ГЛЛ – BCR/ABL p190, TEL/AML1 і E2A/PBX1. У групі хворих на ГМЛ транскрипт CBFB/MYH11 специфічний для М4Ео-варіанту, а AML1/EТО виявляється не тільки при М2-варіанті. Це обумовлює необхідність його дослідження у всіх хворих на ГМЛ. Чинником сприятливого перебігу захворюваня є не наявність, а тип химерного гена. ПЛР-позитивні хворі щодо генів AML1/ETO та TEL/AML1 мають кращу відповідь на терапію. 5. Клональні перебудови генів імуноглобулінів є специфічними для лімфоїдної злоякісної проліферації і можуть бути використані як молекулярний маркер пухлинного клону у хворих на ГЛЛ. Залучення декількох пар праймерів для кожного гена, а також аналіз двох генів імуноглобулінів (IgH та IgK) підвищує ефективність виявлення клональності. 6. Оцінка мінімальної резидуальної хвороби, яка заснована на скринінгу химерних транскриптів та клональних порушень генів імуноглобулінів, дозволяє виділити пацієнтів з вищим ризиком розвитку раннього рецидиву після звичайних хіміотерапевтичних курсів та ТСККПК. При дослідженні МРХ сприятливим прогностичним чинником є відсутність маркерів пухлинних клонів на стадії ремісії. Щодо клональних перебудов генів імуноглобулінів, краща відповідь на терапію спостерігається у хворих, у яких зареєстровано зникнення обох маркерів клональності. 7. У хворих на ГЛЛ в мікросателітних локусах D9S171 та D12S98 частіше має місце втрата гетерозиготності, ніж поява нового алеля. Порушення в мікросателітній ДНК можуть бути використані як молекулярний маркер пухлинного клону в цій групі хворих. 8. Вибір оптимального спектру пухлинних маркерів і удосконалення схеми молекулярно-генетичного обстеження дітей, хворих на гострі лейкемії, обгрунтовується специфічністю порушень каріотипу, химерних генів і клональних перебудов генів імуноглобулінів, а також специфічністю мікросателітних змін для конкретних варіантів гострих лейкемій. СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ 1. Клінічне значення молекулярних маркерів пухлинних клонів у пацієнтів з гострими лейкеміями при проведенні трансплантації кісткового мозку / В.Г. Бебешко, Ж.М. Мінченко, І.В. Дмитренко, О.В. Кучер, Н.М. Цвєткова, І.А. Крячок. Ж.А. Мішаріна, С.В. Клименко, В.І. Хоменко // Трансплантологія. – 2004. – Т. 6, № 2. – С. 61–65. Особистий внесок – дослідження експресії химерних генів та мутацій гену FLT-3 у хворих на гострі лейкемії. Участь в аналізі матеріалу та написанні. 2. AML1 gene rearrangements and mutations in radiation-associated acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome / S.V. Klymenko, K. Trott, M.J. Atkinson, K. Bink, V.G. Bebeshko, D.A. Bazyka, I.V. Dmytrenko, I.V. Abramenko, N. Bilous, H. Zitzelsberger, M. Rosemann // Journal of Rad. Research. –2005. – Vol. 46. – P. 249–255. Особистий внесок – дослідження експресії гену AML1/ETO методом ЗТ-ПЛР у хворих на ГЛ та МДС. Участь в аналізі матеріалу та написанні. 3. MLL gene alterations in radiation-associated acute myeloid leukemia / S.V. Klymenko, K. Bink, K.R. Trott, V.G. Bebeshko, D.A. Bazyka., I.V. Dmytrenko, I.V. Abramenko, N.I. Bilous, H. Zitzelsberger, A.V. Misurin, M.J. Atkinson, M. Roserman // Experimental oncology. – 2005. – Vol. 27, N 1. – P. 71–75. Особистий внесок – дослідження експресії химерних генів, що задіюють MLL, у хворих на ГМЛ. Участь в аналізі матеріалу та написанні. 4. Досвід використання молекулярно-генетичних методів дослідження в діагностиці лейкемій у дітей / В.Г. Бебешко, Ж.М. Мінченко, К.М. Бруслова, І.В. Дмитренко, О.В. Кучер, О.Є. Кузнєцова, В.Д. Дроздова, Н.О. Кубаля // Український журнал гематології та трансфузіології. – 2005. – № 6. – С. 15–20. Особистий внесок – дослідження експресії химерних генів у дітей, хворих на гострі лейкемії. Аналіз матеріалу та написання. 5. Мінченко Ж.М., Дмитренко І.В., Кучер О.В. Реаранжировки генів імуноглобулінів і перебудови мікросателітної ДНК як маркери пухлинної клональності при гострій лімфобластній лейкемії у дітей // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології. – 2005. – № 5. – С. 16–27. Особистий внесок – дослідження клональних перебудов генів імуноглобулінів методом ПЛР, вивчення мікросателітної нестабільності методом ПЛР з подальшим сіквенуванням, статистичний аналіз матеріалу. Написання та оформлення роботи. 6. Genetic markers of the acute leukemia in children / V.G. Bebeshko, J.N. Minchenko, O.V. Kucher, K.M. Bruslova, J.A. Misharina, O.O. Dmytrenko, I.V. Dmytrenko // Materials of III scientific-practice conference “Ontogenetic problems: scientific and applied aspects”, Kiev, Ukraine, 2002. Оncology. – 2002. – Vol. 4, Suppl. – P. 6–7. Особистий внесок – цитогенетичні та молекулярно-генетичні дослідження. Аналіз матеріалу та написання роботи. 7. Molecular research of fusion genes in children acute leukemias / I.V. Dmytrenko, J.N. Minchenko, O.V. Kucher, V.G. Fedorenko, K.M. Bruslova, V.G. Bebeshko, V.D. Drozdova, V.I. Khomenko // 8-th Annual Congress of the European Hematologic Association, Lyon, 2003. The Hematology Journal. – 2003. – Vol. 4, Suppl. 2. – P. 311. Особистий внесок – дослідження експресії химерних генів методом ЗТ-ПЛР у дітей, хворих на ГЛ. Участь в аналізі і синтезі матеріалу та написанні. 8. The prediction of acute leukemias current at children / E.V. Kucher, V.G. Bebeshko, J.N. Minchenko, K.M.Bruslova, I.V.Dmytrenko, E.A. Dmytrenko // 8-th Annual Congress of the European Hematologic Association, Lyon, 2003. The Hematology Journal. – 2003. – Vol. 4, Suppl. 2. – P. 287. Особистий внесок – дослідження каріотипу та експресії химерних генів. Участь в аналізі та написанні. 9. AML1 gene rearrangements in radiation-associated acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome / S.V. Klymenko, M.J. Atkinson, V.G. Bebeshko, D.A. Bazyka, K. Bink, I.V. Dmytrenko, I.V. Abramenko, N. Bilous, H. Zitzelsberger, M. Rosemann // 9-th Annual Congress of the European Hematologic Assosiation, Zeneva, 2004. The Hematology Journal. – 2004. – Vol. 5. – Suppl. 2. – P. S76–S77. Особистий внесок – дослідження експресії химерного гену AML1/ETO у хворих на ГЛ та МДС. Участь в аналізі матеріалу та написанні. 10. Genetic risk factors of acute leukaemias in children suffered from Chernobyl Accident / I.V. Dmytrenko, J.M. Minchenko, O.A. Dmytrenko, T.Y. Shlyachtychenko, O.V. Kucher, N.M. Tsvyetkova, K.M. Bruslova, V.G. Bebeshko // 9-th Annual Congress of the European Hematologic Assosiation, Zeneva, 2004. The Hematology Journal. – 2004. – Vol. 5. – Suppl. 2. – P. 278. Особистий внесок – дослідження каріотипу та молекулярно-генетичні дослідження у дітей, хворих на лейкемії, які постраждали від Чорнобильської аварії. Участь в аналізі матеріалу та написанні. 11. Прогностическое значение клональных перестроек генов легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов у детей с острыми лимфобластными лейкемиями / И.В. Дмитренко, Ж.Н. Минченко, Е.М. Бруслова, В.Г. Бебешко // Матеріали науково-практичної конференції “Гематологія і трансфузіологія: фундаментальні та прикладні питання”, Київ, 2005. Український журнал гематології та трансфузіології. – 2005. – № 4. – С. 42. Особистий внесок – дослідження химерних генів та клональних перебудов генів Ig, статистичний аналіз матеріалу. Написання та оформлення. 12. Association of the molecular-genetic disturbances and markers of various genetic blood systems in patients with oncohematologic pathology with features of diseases flowing on different steps of the hemopoetic cells transplantation/ I.V. Dmytrenko, V.G. Bebeshko, J.M. Minchenko, O.O. Dmytrenko, N.M. Tsvetkova, O.V. Kucher, I.A. Kryachok, S.V. Klymenko, T.Y. Shlyahtichenko // 5-th Parnas Conference “Molecular mechanisms of cellular signaling”, Kyiv, 2005. The Ukrainian biochemical journal. – 2005. – Vol. 77, N 2. – P. 168. Особистий внесок – дослідження експресії химерних генів та мутацій гену FLT-3. Участь в аналізі матеріалу та написанні. АНОТАЦІЯ Дмитренко І.В. Молекулярно-генетичні порушення, асоційовані з гострими лейкеміями у дітей Дисертація (рукопис) на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 – генетика. Науковий центр радіаційної медицини АМН України, Київ, 2006. В дисертації наведено результати дослідження порушень каріотипу, експресії химерних генів, клональних перебудов генів Ig, порушень в мікросателітній ДНК в співставлені з показниками перебігу гострих лейкемій у дітей. Показано, що наявність клітин із спорідненими клонами є прогностично несприятливою ознакою перебігу гострих лейкемій, а ПЛР-позитивні хворі щодо генів AML1/ETO та TEL/AML1 мають кращу відповідь на терапію. Виявлено, що клональні перебудови генів імуноглобулінів, а також порушення в мікросателітних локусах D9S171 та D12S98 можуть бути використані як молекулярний маркер пухлинного клону у дітей, хворих на гострі лімфобластні лейкемії. Встановлено, що оцінка мінімальної резидуальної хвороби, яка заснована на скринінгу химерних транскриптів та клональних порушень генів імуноглобулінів, дозволяє виділити пацієнтів з вищим ризиком розвитку раннього рецидиву гострих лейкемій. На підставі отриманих даних було розширено спектр генетичних критеріїв прогнозування перебігу захворювання. Розроблено оптимальну схему досліджень генетичних порушень у дітей з гострими лейкеміями. Ключові слова: гостра лейкемія у дітей, каріотип, химерні гени, гени Ig, мікросателітна ДНК, прогноз. АННОТАЦИЯ Дмитренко И.В. Молекулярно-генетические нарушения, ассоциированные с острыми лейкемиями у детей Диссертация (рукопись) на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 – генетика. Научный центр радиационной медицины АМН Украины, Киев, 2006. В диссертации представлены результаты исследования нарушений кариотипа, экспрессии химерных генов, клональных перестроек генов иммуноглобулинов, нарушений в микросателлитной ДНК в сопоставлении с показателями течения острых лейкемий у детей. Установлено, что из прогностических факторов течения заболевания наиболее значимыми являются характер генетических аномалий и их динамика в процессе лечения. Показано, что сложные клональные изменения кариотипа при первичном установлении диагноза, а также присутствие клеток с родственными клонами, свидетельствующими о прогрессии заболевания, являются независимым прогностически неблагоприятным фактором индивидуального ответа на терапию. Делеция 16-ой хромосомы в сегменте 16q13 специфична для больных острой миелобластной лейкемией и не ухудшает прогноз течения заболевания. Выявлено, что экспрессия химерных генов достоверно чаще встречается у детей с острыми миелобластными лейкемиями, чем у детей с острыми лимфобластными лейкемиями. Для миелобластных лейкемий специфическими являются транскрипты MLL/AF9, AML1/ETO, CBFB/MYH11, а для лимфобластных лейкемий – BCR/ABL p190, TEL/AML1 и E2A/PBX1. ПЦР-положительные больные относительно генов AML1/ETO и TEL/AML1 имеют лучший ответ на терапию. Показано, что клональные перестройки генов иммуноглобулинов, а также нарушения в микросателлитных локусах D9S171 и D12S98 могут использоваться как молекулярный маркер опухолевого клона у детей с острыми лимфобластными лейкемиями. Оценка минимальной резидуальной болезни, которая основана на скрининге химерных транскриптов и клональных нарушений генов иммуноглобулинов, позволяет выделить пациентов с более высоким риском развития раннего рецидива. При исследовании минимальной резидуальной болезни благоприятным прогностическим фактором являлось отсутствие маркеров опухолевых клонов на стадии ремиссии. Относительно клональных перестроек генов иммуноглобулинов, лучший ответ на терапию наблюдался у больных, у которых зарегистрировано исчезновение обоих маркеров клональности. У больных острой лимфобластной лейкемией в микросателлитных локусах D9S171 и D12S98 чаще имела место потеря гетерозиготности, чем появление нового аллеля. На основании полученных данных был расширен спектр генетических критериев прогнозирования течения острых лейкемий и разработана оптимальная схема исследований генетических нарушений у детей с острыми лейкемиями. Ключевые слова: острая лейкемия у детей, кариотип, химерные гены, гены Ig, микросателлитная ДНК, прогноз. ABSTRACT Dmytrenko I. Molecular-genetic abnormalities associated with acute leukemias in children The dissertation (manuscript) for the degree of candidate of biological science on specialty 03.00.15 – genetics. Research Centre for Radiation Medicine of Academy of Medical Science of Ukraine, Kyiv, 2006. In dissertation the results of research of karyotype abnormalities, fusion genes, clonal rearrangements of Ig genes, disturbances in microsatellite DNA are presented comparing with the indexes of acute leukemia flowing in children. It was demonstrated that the presence of cells with relative clones is predictive unfavorable sign of acute leukemia flowing, and PCR-positive patients according to the genes AML1/ETO and TEL/AML1 have the best therapy response. It was revealed that clonal rearrangements of Ig genes and disturbances in microsatellite loci D9S171 and D12S98 can be used as molecular marker of the tumor clone in children with acute lymphoblastic leukemia. It was found that the estimation of minimal residual disease, based on the investigation of fusion transcripts and clonal rearrangements of Ig genes, allows to select patients with the higher risk of development of acute leukemia early relapse. On the basis of these data the spectrum of genetic criteria of disease flowing prediction was extended. The optimum chart of genetic abnormalities researches in children with acute leukemia was worked out. Keywords: acute leukemia in children, karyotype, fusion genes, Ig genes, microsatellite DNA, prediction. Підписано до друку 16.02.2006. Формат 60(90/16. Папір офсет. № 1. Друк офсет. Ум. друк. арк. 0,9. Тираж 100 прим. Зам. 365. Друк “ІВЦ АЛКОН” 04074, м. Київ-74, вул. Автозаводська, 2. Тел./факс: (044) 430-82-47.

Похожие записи