НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ІМ. Р.Є.
КАВЕЦЬКОГО

ЛУК’ЯНОВА НАТАЛІЯ ЮРІЇВНА

УДК: 618.11-006:577.2

Молекулярно-біологічні особливості злоякісних пухлин яєчника з фенотипом
лікарської резистентності

14.01.07 – онкологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ — 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і
радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Науковий керівник — академік НАН України, доктор медичних наук,
професор, Чехун Василь Федорович,

директор, завідувач відділу механізмів протипухлинної терапії,
Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.
Р.Є. Кавецького НАН України.

Офіційні опоненти: — доктор біологічних наук, професор

Воронцова Ада Леонідівна,

провідний науковий співробітник відділу експериментальних клітинних
систем Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології

ім. Р.Є. Кавецького НАН України;

— кандидат медичних наук

Ціп Наталія Павлівна,

старший науковий співробітник відділення онкогінекології Інституту
онкології АМН України.

Провідна установа – Національний медичний університет ім.
О.О.Богомольця, кафедра онкології, м. Київ.

Захист відбудеться “16” травня 2007 року об 11 00 на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної
патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України
(03022, Київ, вул.Васильківська, 45).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького
НАН України.

Автореферат розісланий “___” _квітня____ 2007 року.

Учений секретар спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук Н.В.Бородай

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Рак яєчника (РЯ) є найчастішою причиною
смертності пацієнток із онкогінекологічними захворюваннями (Бохман Я.В.,
2002; Abdollahi N., 2004; Christie M. et al, 2006). Висока летальність
обумовлена безсимптомністю перебігу захворювання, внаслідок чого у 75%
випадків РЯ виявляють на III-IV стадії пухлинного процесу, що погіршує
прогноз та результати лікування (Воробйова Л.І., 2005). Захворюваність
на РЯ в Україні за даними Національного Канцер-Реєстру України складала
у 2005 році 15,5 на 100 тис. населення. Високими є показники смертності
від РЯ у тому числі протягом першого року після встановлення діагнозу
(станом на 2005 рік 34,8%) (Бюл. Нац. Канцер-Реєстру України.,2006).
П’ятирічна виживаність хворих на РЯ становить 15-25% і протягом останніх
30 років майже не змінилася (Кулаков В.І., 1999). Щороку від РЯ помирає
більше жінок ніж від раку шийки матки та ендометрію разом узятих
(Гилятудзинова З.Ш., 2000). Не дивлячись на удосконалення методів
діагностики та лікування хворих на злоякісні епітеліальні пухлини
яєчника, віддалені результати лікування все ще залишаються
незадовільними. З одного боку, це може бути пов`язане з високою
агресивністю РЯ, а з іншого – з резистентністю пухлин до протипухлинних
препаратів (ППП), в зв`язку з чим у переважної більшості хворих
спостерігається прогресування пухлинного процесу (Karseladze A.I. et al,
2002). Вважається, що розвиток резистентності відбувається за рахунок
індивідуальної генетично обумовленої резистентності, а також за рахунок
появи популяції резистентних клітин при проведенні повторних курсів
протипухлинної терапії. З`ясування механізмів формування лікарської
резистентності (ЛР) і розробка шляхів її подолання неможливі без
розуміння процесів, які відбуваються в клітинах під дією ППП і
призводять до їх подальшої нечутливості (Чехун В.Ф. та співав, 2000;
Курпешев О.К. та співав, 2002; Murata T. et al, 2006).

Досягнення сучасної генетики та молекулярної біології поглибили
розуміння природи виникнення та прогресії злоякісних новоутворень. В
останні роки стан проблеми прогностичних факторів в онкології докорінно
змінився, головним чином, завдяки широкому впровадженню в практику
сучасних молекулярно-біологічних методів дослідження (Kamazawa S.T. et
al, 1999; Имянитов Е.Н., 2000; Коршунов А.Г. та співав, 2002; Lyall M.S
et al, 2006). Поряд з діагностикою цілого ряду захворювань, ці методи
дозволяють визначати геномні порушення, що детермінують розвиток
пухлини, ступінь злоякісності, метастатичний потенціал та рівень її
чутливості до протипухлинної терапії. Зокрема, експресія ряду білків ЛР,
таких як Р-глікопротеїн (P-gp) та глутатіон-S-трансфераза (GST) в
злоякісних пухлинах, характеризує їх низьку чутливість до хіміотерапії
(Arts H.J.G et al, 1999; Yokoyama Y et al, 1999; Горбачева Л.Б. та
співав., 2001; Полушкина И.Н. та співав., 2003; Cheng G et al, 2004). І
хоча у деяких дослідженнях підтверджується значення GST, P-gp, а також
білків-регуляторів апоптозу, як маркерів ефективності протипухлинної
терапії та агресивності перебігу захворювання при злоякісних пухлинах
яєчника, зв’язок цих молекул з клінічними прогностичними факторами, а
також із виживаністю хворих ще недостатньо доведений.

За цих обставин, на сьогодні практично єдиним підходом підвищення
виживаності хворих на рак вважається індивідуалізація лікування на
основі клініко-морфологічних особливостей, а визначення
молекулярно-генетичних показників, які корелюють з ефективністю
лікування та виживаністю хворих, залишається одним з актуальніших
напрямків наукових досліджень. Не викликає сумніву, що в клінічній
онкології для вибору оптимальної тактики лікування, для прогнозування
ефективності терапії і подальшого перебігу злоякісного процесу
необхідним є виявлення додаткових високоінформативних маркерів. Такий
підхід дозволить більш обґрунтовано розробляти шляхи та підходи до
індивідуалізації протипухлинної терапії.

Саме цій проблемі присвячена наша робота. Вивчення експресії білків ЛР
та білків-регуляторів апоптозу в злоякісних клітинах яєчника може
сприяти більш глибокому розумінню механізмів захисту клітин від
цитотоксичної дії ППП та розробити шляхи подолання резистентності до
ППП, що є надзвичайно важливим для підвищення ефективності лікування
онкологічних хворих.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана
згідно науково-дослідних робіт Інституту експериментальної патології,
онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України за темами:
“Вивчення біологічних особливостей пухлинного процесу при формуванні
фенотипу лікарської резистентності” (номер державної реєстрації
0101U000670, 2000-2004 рр.) та „Особливості функціонування онкогеному”
(номер державної реєстрації 0102U003228, 2002-2006 рр.).

Мета дослідження: Дослідити молекулярно-біологічні особливості
злоякісних клітин яєчника лінії А2780 при формуванні резистентності до
цисплатину і доксорубіцину та з’ясувати їх можливе прогностичне
значення у хворих на РЯ.

Задачі дослідження:

1) створити резистентні до цитотоксичної дії цисплатину та
доксорубіцину клітинні сублінії карциноми яєчника людини лінії А2780;

проаналізувати зміни морфологічних та електронномікроскопічних
характеристик клітин лінії А2780, що виникають при формуванні
резистентності до цисплатину та доксорубіцину;

дослідити фенотипові особливості вихідних (А2780) та резистентних клітин
(A2780/DDP та A2780/Dox) та встановити молекулярні маркери, що
корелюють з розвитком резистентності до цисплатину та доксорубіцину;

визначити особливості експресії протеїнів-регуляторів апоптозу та білків
ЛР в пухлинних клітинах хворих на РЯ різного ступеня диференціювання;

дослідити кореляцію між експресією в пухлинних клітинах молекулярних
маркерів, асоційованих з ЛР, та індивідуальною чутливістю хворих на РЯ
до ППП;

проаналізувати кореляційний зв`язок між молекулярними маркерами,
асоційованими з ЛР, та виживаністю хворих на РЯ.

Об’єкт дослідження: чутливі та резистентні до цитотоксичної дії ППП
клітинні сублінії карциноми яєчника людини лінії А2780; тканина РЯ
людини.

Предмет дослідження: експресія молекулярних маркерів, асоційованих з ЛР,
в процесі формування стійкості до цисплатину та доксорубіцину клітин
РЯ людини лінії А2780 та в пухлинних клітинах хворих на РЯ.

Методи дослідження. Морфологічні, електронномікроскопічні, імуноцито- та
імуногістохімічні, проточної цитофлуориметрії, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше створені резистентні до
цитотоксичної дії цисплатину та доксорубіцину клітинні сублінії РЯ
людини А2780/DDP та А2780/Dox. На моделі цих ліній показано, що за умов
застосування різних цитостатиків, феномен ЛР формується із залученням
різних механізмів: резистентність до цисплатину виникає на базі
антиапоптичної програми (підвищення експресії Bcl-2 та зниження
експресіїї CD95/Fas-антигену), а до доксорубіцину- на базі mdr1-залежних
процесів (підвищення експресії Р-глікопротеїну). Вперше доведено, що
набування резистентності клітин РЯ людини до цисплатину та
доксорубіцину супроводжується ускладненням ультраструктурної організації
та підсиленням адгезивних властивостей за рахунок збільшення рівня
експресії Е-кадгерина. Встановлено, що у хворих на рак яєчника
найінформативнішими маркерами резистентності до доксорубіцину є
підвищена експресія Р-gp, а до цисплатину та карбоплатину — Bcl-2 та
GST, відповідно. Доведено кореляцію молекулярних маркерів апоптозу та ЛР
пухлинних клітин хворих на РЯ (Р53, Bcl-2, P-gp, GST) з традиційними
клініко-морфологічними прогностичними показниками.

Практичне значення одержаних результатів: Визначення експресії білків
Р-gp, GST, Р53 та Bcl-2 в пухлинних клітинах хворих на РЯ дозволяє
передбачати можливий розвиток ЛР, а отже і індивідуальну ефективність
протипухлинної терапії. Отримані дані можуть бути використані при
розробці нових підходів до індивідуалізації медикаментозного лікування
хворих на РЯ.

Особистий внесок здобувача. Здобувач самостійно планувала та
виконувала наукові досліди. Автором особисто отримані резистентні
варіанти клітин лінії А2780 — А2780/DDP та А2780/Dox. Здобувач
проаналізував результати електронномікроскопічних досліджень чутливих
та резистентних клітин лінії А2780. Автор самостійно досліджувала
експресію поверхневих та внутрішньоклітинних антигенів
імуноцитохімічним методом та за допомогою проточної цитофлуориметрії.
Автором проведено морфологічне та імуногістохімічне дослідження
експресії антигенів, пов`язаних з резистентністю до ППП, у хворих на РЯ
та проаналізований їх зв’язок з клінічним статусом пацієнтів. Здобувачем
самостійно проведено аналіз отриманих результатів дослідження та
сформульовані основні положення та висновки роботи.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були
представлені та обговорені на: II з’їзді онкологів країн СНД (Київ,
2000); конференціях молодих вчених в Інституті експериментальної
патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАНУ (Київ
2000, 2006); III з’їзді онкологів країн СНД (Мінськ, 2004); XI з’їзді
онкологів України (Судак, 2006); Всеукраїнській науково-практичній
конференції „Молекулярні основи і клінічні проблеми резистентності до
лікарських засобів” (Київ, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 наукових робіт, в
тому числі 6 статей у виданнях, рекомендованих ВАК України, 6 – тез
матеріалів наукових конференцій та з’їздів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду
літератури, розділу матеріали і методи дослідження, 3-х розділів власних
досліджень, заключення, висновків, списку використаних джерел.
Дисертацію викладено на 126 сторінках. Вона містить 28 рисунків, 6
таблиць. Список використаної літератури охоплює 187 посилань, в тому
числі 147 зарубіжних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Об’єктами дослідження були клітинна
лінія РЯ людини А2780 та її сублінії, резистентні до цитотоксичної дії
цисплатину – А2780/DDP та доксорубіцину – А2780/Dох. Резистентні
варіанти А2780/DDP та А2780/Dox були отримані шляхом вирощування
вихідних клітин А2780 у культуральному середовищі з додаванням
наростаючих концентрацій цисплатину в діапазоні доз від 0,1 до 25 мкг/мл
та доксорубіцину в діапазоні доз від 0,01 до 1 мкг/мл. Цисплатин та
доксорубіцин додавали двічі на тиждень після пересіву клітин. Кожні два
місяці проводили тестування досліджуваних клітин для встановлення рівня
їх резистентності за допомогою МТТ- методу. Величини IC50 (inhibitable
concentration 50) цисплатину для клітин А2780 та A2780/DDP становили
1,25 та 10 мкг/мл, відповідно; IC50 доксорубіцину для клітин А2780 та
А2780/Dox — 0,25 та 1 мкг/мл, відповідно. Таким чином, рівень
резистентності до цитотоксичної дії цисплатину клітин лінії A2780/DDP,
на час проведення досліджень становив 8, а до цитотоксичної дії
доксорубіцину клітин лінії А2780/Dox — 4.

За допомогою імуноцитохімічного методу на клітинах А2780, A2780/DDP та
А2780/Dox досліджено експресію білків- регуляторів апоптозу — Р53,
Bcl-2, CD95/Fas; білків, пов`язаних з ЛР — Pgp, GST, МТ, антигену
проліферації, а також експресію білку системи адгезії — Е-кадгерину.
Дослідження експресії вищезгаданих маркерів проводили також за допомогою
методу проточної цитофлуориметрії на цитофлуориметрі FACScan (Вecton
Dickinson, США) з використанням показника піку інтенсивності
флуоресценції (ПІФ), який дорівнює відношенню лінійної інтенсивності
флуоресценції препарату, що вивчається, до лінійної інтенсивності
флуоресценції контролю. В якості контролю до антитіл, які
досліджувались, використовували антитіла подібного ізотипу, які не
експресуються клітинами даного походження.

Клінічну групу склали 196 хворих на РЯ, які лікувалися в відділенні
онкогінекології Інституту онкології АМНУ протягом 1996 — 2006 рр. (зав.
відділенням проф. Воробйова Л.І.) . Пацієнти були проінформовані та дали
згоду на використання хірургічного матеріалу в дослідницьких цілях.
Класифікацію пухлин проводили згідно класифікації ВООЗ (2003 р.).
Розподіл хворих за віком, стадією захворювання, гістологічною структурою
та ступенем диференціювання пухлин наведені в табл. 1.

Таблиця1

Клініко-морфологічна характеристика хворих

Характеристика Кількість хворих (%)

Вік (роки):

< 60 130(66%) > 60 66(34%)

Середній 52

Діапазон 23-74

Гістологічна структура пухлини:

Серозний рак

Муцинозний рак

134 (68%)

62 (32%)

FIGO стадія:

III-a 39 (20%)

III-b 48 (25%)

III-c 26 (13%)

IV 83 (42%)

Ступінь диференціювання пухлини:

G1 84 (43%)

G2 42 (21%)

G3 70 (36%)

Всього 196 хворих

Всім хворим на першому етапі лікування були виконані циторедуктивні
хірургічні операції. Тканину пухлини для морфологічного дослідження
фіксували в 4%-му розчині нейтрального формаліну і заливали в парафін за
загальновживаним методом. З парафінових блоків готували препарати,
фарбували їх гематоксилін-еозином і вивчали морфологічні особливості
пухлин в світлооптичному мікроскопі. Імуногiстохiмiчне дослiдження з
використанням МКАТ проведено на парафінових зрізах пухлинної тканини
вищезгаданих хворих. Було проведено дослідження експресії Р53, Bcl-2,
Pgp, GST, антигену проліферації та Е-кадгерину. Цитотоксичну активність
протипухлинних препаратів досліджували на злоякісних клітинах хворих на
РЯ за допомогою МТТ-тесту. Для цього тканину пухлини після механічної
дезагрегації інкубували у культуральному середовищі RPMI-1640 (Sigma) з
протеолітичними ферментами на протязі 6-8 годин при 37оС. Після
інкубації отриману суспензію клітин двічі відмивали у холодному
забуференому фізіологічному розчині та підраховували відсоток мертвих
клітин, який складав 1-2,9%. Суспензію клітин в об`ємі 100 мкл
розсаджували в 96-лункові пластикові планшети в концентрації 1х106
клітин/мл та інкубували в стандартних умовах при 37оС за вологих умов,
5% СО2. Після 24-годинної адаптації клітин до умов культивування
додавали по 100 мкл розчину препаратів (цисплатин, доксорубіцин,
карбоплатин, метотрексат, 5-фторурацил, вінкристин, цисклофосфамід,
вепезид) в трьох дозах: десятикратно вищій за терапевтичну,
терапевтичній та десятикратно нижчій за терапевтичну. Після чого
проводили МТТ-тест за загальноприйнятою методикою.

Всім хворим в післяопераційному періоді на 7-8 добу була розпочата
протипухлинна терапія за схемою СP (цисплатин 75 мг/м2 ендоабдомінально
перші 2 цикли з довенним введенням у подальші цикли циклофосфану- 750
мг/м2) або СС (карбоплатин 300 мг/м2 ендоабдомінально перші 2 цикли з
довенним введенням у подальші цикли циклофосфану- 750 мг/м2).Всього
проводили 6 курсів ПХТ з інтервалом в 21 день (при задовільних
клінічно-лабораторних показниках).

Статистична обробка одержаних результатів проводилася за допомогою
математичної програми медико-біологічної статистики STATISTIСA 6.0.
Обчислення і порівняння достовірності відмінностей середніх величин
проводили з використанням t-критерію Ст’юдента для множинних порівнянь.
При цьому достовірним вважалися відмінності з вірогідністю не менше 95%
(Р<0,05). Кореляційний аналіз проводився з використанням коефіцієнту кореляції (r) Пірсона. Для розширення уявлень про кінетику виживаності використовували медіану тривалості життя. Показник загальної виживаності визначали за допомогою однопоказникового метода Каплана-Мейєра. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ Морфологічні та електронномікроскопічні особливості злоякісних клітин яєчника при формуванні резистентності до цисплатину та доксорубіцину. У процесі виконання першого фрагменту роботи нами було проведено комплексне дослідження біологічних властивостей клітин карциноми яєчника людини лінії А2780, а також двох отриманих на її основі субліній A2780/DDP та A2780/Dox, резистентних до цисплатину та доксорубіцину відповідно. Набування ЛР клітинами даних ліній відбувалося протягом довготривалого їх культивування в умовах зростаючих концентрацій цисплатину та доксорубіцину. Дослідження морфологічних особливостей клітин ліній А2780 показало, що набування резистентності до цисплатину та доксорубіцину в клітинах РЯ людини супроводжувалось значними змінами їх морфологічної будови. Так, було встановлено, що при формуванні резистентності до цисплатину та доксорубіцину відбувалось збільшення розмірів вихідних клітин, значно зростали їх адгезивні властивості, знижувалась швидкість проліферації та збільшувався час подвоєння. При електронномікроскопічному дослідженні також встановлено деякі відмінності в морфологічній будові резистентних клітин одержаних субліній, які насамперед стосуються змін елементів цитоскелету. Так, в резистентних клітинах ліній А2780/DDP та A2780/Dox виявлялась значна кількість мікротрубочок, мікрофіламенти здебільшого формували пучки різної товщини, які найчастіше були розташовані поблизу ядра. Для клітин резистентних ліній характерною була присутність добре розвинутого гранулярного ендоплазматичного ретикулуму, представленого довгими цистернами активного комплексу Гольджі, який складався з 2-3 локусів. Поблизу комплексу Гольджі завжди була присутня значна кількість мультивезикулярних тілець. Останні з`являлися також в багатьох клітинах під плазматичною мембраною, що може свідчити про збільшення транспорту в оточуюче середовище та зменшення кількості ППП в цитоплазмі клітин, а отже і зниження їх цитотоксичної активності. Таким чином, на підставі морфологічних та електронномікроскопічних досліджень встановлено, що набування резистентності до цисплатину та доксорубіцину в клітинах РЯ супроводжувалось значними змінами їх морфологічної та тонкої будови. Експресія білків, асоційованих з ЛР в клітинах ліній A2780, A2780/DDP та A2780/Dox. Активація шляхів, що забезпечують стійкість пухлинних клітин до токсичного впливу терапевтичних препаратів, асоціюється із змінами в експресії ряду регуляторних білків, які приймають безпосередню участь в реалізації програми формування феномену ЛР. Одним з механізмів виникнення лікарської резистентності є ампліфікація гену mdr1 і, відповідно, експресія специфічних білків, які відповідають за швидке виведення препаратів з пухлинної клітини. Згідно даних літератури (Kamazawa S. et al, 1999; Ставровская А.А., 2000), клітини яєчника в нормі не експресують Р-gp. Не виявляється цей протеїн і при злоякісній трансформації клітин яєчника. У зв’язку з цим, особливий інтерес представляло вивчення можливої ролі Р-gp у формуванні ЛР в клітинах РЯ. В наших дослідженнях експресія P-gp була відсутня як в чутливій, так і в резистентній до цисплатину популяціях клітин, що свідчить про mdr1-незалежний шлях формування ЛР. Натомість, у цитоплазмі практично всіх клітин, резистентних до доксорубіцину (лінія А2780/Dox) спостерігалась підвищена експресія Р-gp. Відомо, що альтернативним механізмом виникнення стійкості до протипухлинної терапії є експресія білків родини ізоензимів GST та металотионеїнів (МТ). Нами встановлена істотна відмінність експресії GST в клітинах досліджуваних субліній. Показано, що підвищення експресії GST та зниження експресії МТ є важливою складовою формування ЛР клітин карциноми яєчника людини до цисплатину. Істотні зміни відбувались і на рівні ключових білків-регуляторів апоптозу та проліферації. У нашому дослідженні довготривале культивування клітин РЯ з цисплатином сприяло значному зменшенню кількості CD95- та Bcl-2-позитивних клітин та не впливало на рівень експресії білку Р53. З розвитком ЛР проліферативний потенціал клітин A2780/DDP знижувався вдвічі та зменшувався в 1,5 рази в клітинах А2780/Dox. Ці дані ще раз підтверджують, що при набуванні клітинами ЛР до ППП завжди знижується їх проліферативний потенціал і вони стають більш диференційованими, незалежно від конкретного механізму дії кожного із цитостатиків. В процесі клітинного диференціювання, яке відбувається при розвитку ЛР, може змінюватись експресія генів, які кодують молекули адгезії, або генів, які регулюють білки цитоскелету. При проведенні порівняльного дослідження експресії білків, які визначають міжклітинні взаємодії, нами встановлено, що в процесі формування ЛР до цисплатину та доксорубіцину, в клітинах А2780/DDP і A2780/Dox спостерігалось значне збільшення експресії Е-кадгерину. Таким чином, розвиток резистентності до цисплатину в клітинах лінії А2780/DDP супроводжувався появою експресії антиапоптичного білку Bcl-2, що сприяло підсиленню репаративних можливостей ДНК та зменшенню поглинання ППП, та спостерігалось в пухлинах хворих з низькою чутливістю до протипухлинної терапії. За даними Zhu X.H. et al. (2002), підвищення експресії Bcl-2 корелює з підвищенням вмісту GST та активністю антиоксидантних ферментів, що є підтвердженням регуляції Bcl-2 клітинним антиоксидантним фактором. На нашу думку, гіперекспресія Bcl-2 та одночасне підвищення рівня GST в резистентних до цитотоксичного впливу цисплатину клітинах А2780/DDP, призводить до зміни редокс-балансу, зниженню активності каспаз та сприяє пригніченню розвитку апоптозу. Поряд з цим, згідно з нашими даними, резистентність до цисплатину супроводжуалась відсутністю чутливості до CD95/Fas-опосередкованого апоптозу, оскільки експресія поверхневих рецепторів CD95/Fas-антигену значно знижувалась на клітинах А2780/DDP (Табл. 2). Таким чином, провідним фактором у механізмі розвитку резистентності клітин лінії А2780/DDP до цисплатину є антиапоптична програма, яка реалізується за рахунок підвищенння рівня білку Bcl-2 та зниження CD95/Fas-антигену. Система глутатіонової детоксикації при підвищенні рівня резистентності клітин А2780/DDP компенсує зниження кількості МТ, які метаболізують препарати даного класу. Таблиця 2. Фенотипові особливості клітин РЯ лінії A2780 та субліній з індукованою резистентністю до цисплатину та доксорубіцину Лінія Клітини з позитивною експресією досліджуваних білків, (%) P-gp GST MT ІПО- 38 p53 Bcl-2 CD-95 Е-кадгерин A2780/S - 10 90 80-90 60-70 10 90% 10-15 A2780/DDP - 80-90 30-40 40-45 60-70 70-80 10% 60-70 A2780/Dox 80-90 20-30 50-60 50-60 60-70 10% 70-80 60-70 Як показали наші дослідження, формування резистентності до доксорубіцину в клітинах лінії А2780/Dox відбувалось за mdr-залежним шляхом. Основною складовою резистентності до доксорубіцину є значне підвищення рівня експресії Р-gp в більшості злоякісних клітин, оскільки рівень експресії всіх інших досліджуваних маркерів при формуванні фенотипу клітин з ЛР істотно не змінювався (Табл.2). Слід зазначити, що набування резистентності як до цисплатину, так і до доксорубіцину супроводжувалось змінами в морфологічній будові досліджуваних клітин; згадані зміни відбувалися у напрямку підвищення диференціювання і адгезивних властивостей клітин та зниження їх проліферативного потенціалу. При цьому, зниження останнього чітко корелювало зі зниженням експресії МТ (r=0,8, P<0,05). Таким чином, в результаті проведених досліджень з`ясовано, що розвиток резистентності до цисплатину та доксорубіцину в клітинах РЯ людини пов`язаний зі змінами функціонального складу білків, які відповідають за апоптичну загибель клітин під впливом цитотоксичної дії ППП, порушенням активності внутрішньоклітинних систем детоксикації, зниженням проліферативної активності та підсиленням адгезивних властивостей злоякісних клітин, що знайшло відображення в морфологічній перебудові злоякісних клітин в резистентних сублініях. - 6 d h ? ? - 6 8 f h „o yyyy^„o „o yyyy]„e^„o „o yyyy]„e^„o „o yyyy]„e^„o „o y^„o „o „ o^„o fAhA W 0 ?Другий фрагмент роботи був присвячений дослідженню молекулярних маркерів апоптозу та ЛР на клінічному матеріалі —пухлинних клітинах, отриманих від хворих на РЯ. Серед чисельних факторів прогнозу захворювання при РЯ (Кедрова А.Г.,2006) виділяють 5 основних груп: пухлинний фактор (стадія та гістологічний тип); хірургічний фактор (ступінь циторедукції пухлини); фактори, що визначаються у сироватці крові (маркер СА-125), молекулярні фактори (VEGF, EGFR, р53, Muc16, Muc 1 та інш.); імунологічні (лімфоїдна інфільтрація TIL-лімфоцитами (tumour-infiltrating lymphocytes). Оскільки в сучасній літературі не існує єдиної точки зору, стосовно прогностичного значення експресії молекулярних маркерів в пухлинах різного ступеня диференціювання, ми порівняли експресію білків-регуляторів апоптозу та ЛР при різних гістологічних формах та різному ступені диференціювання пухлинних клітин у хворих на РЯ. Встановлено, що гіперекспресія мутантного білку Р53 і антигену проліферації, що виявлялась за допомогою МКАТ ІПО-38, характерна для низькодиференційованих як серозних, так і муцинозних злоякісних пухлин яєчника. Ці пухлини відрізнялися найвищим ступенем злоякісності, агресивним перебігом захворювання і розповсюдженням процесу (за класифікацією FIGO (IIIc-IV) (Р<0,05; рис.1). Рис 1. Варіабельність експресії Р53 та антигену проліферації (IPO-38) в залежності від ступеня диференціювання РЯ. За даними більшості дослідників (Полушкина И.Н. та співав., 2003; Gadducci A. et al, 2006), мутація р53 відбувається на пізніх стадіях розвитку РЯ і може вважатися важливою прогностичною ознакою агресивності пухлинного процесу. Відомо також, що висока проліферативна активність клітин є маркером несприятливого прогнозу (Mazurek A. et al, 1998; Nnene I.O. et al, 2004). Дані спостереження були підтверджені і нашими дослідженнями, в яких виявлена значна експресія білку р53 і високий проліферативний потенціал клітин у хворих на низькодиференційований серозний та муцинозний РЯ. Це може свідчити про можливість використання цих показників, як маркерів прогнозу несприятливого перебігу пухлинного процесу. Високодиференційовані пухлини хворих на РЯ, за нашими даними, відрізнялися відсутністю експресії мутантного білку Р53, низьким індексом проліферації пухлинних клітин та наявністю значної кількості клітин, які експресують білок Bcl-2, що є характерним і для пухлин інших локалізацій (Borner M.M.,1999). Щодо експресії маркерів ЛР, то вона спостерігалась у пухлинах яєчника різного ступеня диференціювання та не залежала від нього (r=0,03; Р>0,05, рис.2). У той же час, отримані нами дані свідчать про чіткий
взаємозв`язок між ступенем диференціювання пухлинних клітин та рівнем
експресії білків-регуляторів апоптозу (r=0,78 для Bcl-2, r= — 0,8 для
Р53 та ІПО-38; Р<0,05; рис.2). Рис. 2. Залежність експресії маркерів ЛР від ступеня диференціювання пухлин хворих на РЯ. Отже, визначення експресії білків Р53, Вcl-2 та антигену, який свідчить про проліферативний потенціал злоякісних клітин і прогресію пухлини в цілому, може бути випробувано у клінічній практиці з метою встановлення їх значення стосовно прогнозу перебігу захворювання у хворих на РЯ. Чутливість до ППП та експресія молекулярних маркерів, асоційованих з ЛР, у хворих на РЯ. Ще однією складовою, яка суттєво впливає на результати лікування та виживаність хворих на РЯ, є ЛР клітин пухлини до дії ППП. Загальновизнані методи визначення чутливості пухлин до ППП базуються на дослідженні тканини пухлини та оцінці дії ППП in vitro за допомогою МТТ-, АТР- та інших методів, які не завжди є доступні для використання в загальній клінічній практиці. Поряд з цим, за даними сучасної літератури (Huang J. et al, 2003; Cheng G et al, 2004), рівень експресії деяких білків-регуляторів апоптозу та ЛР може характеризувати індивідуальні особливості перебігу пухлинного процесу кожного конкретного хворого. На цій підставі, за допомогою МТТ-тесту, нами було проведено вивчення взаємозв’язку між експресією білків, асоційованих з ЛР, та індивідуальною чутливістю до ППП 86 хворих на РЯ. Встановлено, що експресія деяких білків ЛР та апоптичної загибелі чітко корелювала з індивідуальною чутливістю хворих на РЯ до ППП. Показано, що експресія Р-gp є характерною ознакою нечутливості пухлин яєчника до цитотоксичної дії доксорубіцину (r= 0,76, Р<0,05). У 29 хворих, пухлини яких були резистентними до цитотоксичного впливу доксорубіцину, підвищена експресія білку Р-gp спостерігалась майже в усіх пухлинних клітинах. У 28 хворих на РЯ з нечутливими до карбоплатину пухлинами спостерігалась підвищена експресія GST. Експресія білку Вcl-2 виявлялась в переважній більшості злоякісних клітин 39 хворих з пухлинами, які були резистентні до цитотоксичного впливу цисплатину. Слід звернути увагу на те, що при дослідженні клітин резистентних ліній раку яєчника в системі in vitro, нами були отримані аналогічні результати. Експресія Е-кадгерину у нашому дослідженні спостерігалась тільки у 5 з 86 (5,8%) досліджуваних хворих та не корелювала з індивідуальною чутливістю хворих на РЯ до досліджуваних ППП. Нами також не знайдено залежності між експресією білку Р53 та чутливістю хворих до досліджуваних ППП. Це вірогідно можна пояснити тим, що формування фенотипу ЛР у хворих з пухлинами даної локалізації не пов`язано з порушеннями функції білку Р53, тобто при розвитку ЛР мутації в гені р53 не виникають. Поряд з цим, нами не було виявлено взаємозв’язку резистентності до таких ППП як метотрексат, 5-фторурацил, вінкристин, цисклофосфамід та вепезид з експресією маркерів апоптозу та ЛР. Вірогідно, резистентність до цих препаратів лише частково пов`язана з порушенням механізмів апоптичної загибелі, множинної ЛР та системи глутатіону. Таким чином, експресія Р-gp є характерною ознакою нечутливості пухлин яєчника до цитотоксичної дії доксорубіцину. Підвищена експресія Bcl-2 та GST в пухлинних клітинах хворих на рак яєчника свідчить про їх резистентність до цисплатину та карбоплатину. Отримані результати дозволять запропонувати імуногістохімічне визначення експресії Bcl-2, Р-gp та GST у тканині РЯ, поряд з загальновизнаними методами, для використання у клінічній практиці з метою визначення індивідуальної чутливості злоякісних пухлин яєчника до ППП. Визначення експресії молекулярних маркерів як показників виживаності та ефективності лікування хворих на РЯ. Для визначення ролі маркерів ЛР резистентності та апоптозу як показників виживаності було проведено ретроспективне вивчення біологічних особливостей зразків пухлин яєчника у 61 хворої на розповсюджений РЯ, яким було проведене комбіноване лікування. В залежності від показників загальної тривалості життя, з метою встановлення чинників прогнозу перебігу хвороби та ефективності протипухлинної терапії, хворі на розповсюджений РЯ були ретроспективно розподілені на 4 групи: група - 23 хворі з III-ю стадією захворювання, у яких спостерігався сприятливий перебіг захворювання, показники виживаності значно перевищували загальнопопуляційні; група -14 хворих з IV-ю стадією захворювання, які також мали відносно сприятливий перебіг захворювання, і показники виживаності дещо перевищували загальнопопуляційні; група - 14 хворих, з III-IV стадіями захворювання, у яких крім розповсюдженого раку яєчника виявлені інші синхронні пухлини геніталій; 4 група — 10 хворих на РЯ III-IV стадії, які мали вкрай несприятливий перебіг захворювання, а показники виживаності були значно гіршими в порівнянні з загальнопопуляційними Встановлено, що у більшості хворих з високою медіаною тривалості життя (95,1 міс., р<0,05) пухлинні клітини характеризувалися відсутністю експресії маркерів ЛР та білків-регуляторів апоптозу (Табл. 3). Експресія Р-gp та GST спостерігалась менш ніж в 10% злоякісних клітин тільки у 2 з 23 досліджуваних хворих даної групи. Експресія білку Р53 визначалася в пухлинних клітинах 26% хворих цієї групи, що може бути пов’язано, згідно даним літератури (Gadducci A. et al, 2006), зі стадією розповсюдженості пухлинного процесу (III стадія за класифікацією FIGO). В протилежність цьому, експресія антиапоптичного білку Bcl-2 спостерігалась в цитоплазмі пухлинних клітин тільки у 2-х із 23-х досліджуваних хворих і складала 8,6%. Таблиця 3. Кореляція експресії молекулярних маркерів в пухлинних клітинах і виживаністю хворих на РЯ (r= -0,76,P<0,05) Групи хворих Медіана тривалості життя (міс) Хворі з позитивною експресією досліджуваних маркерів, % P-gp GST P53 Bcl-2 1 група (п=23) 95,1 8,6 8,6 26 8,6 2 група (п=14) 76,4 21,4 21,4 28,5 21,4 3 група (n= 14) 25,0 85,7 85,7 78,5 90 4 група (n= 10) 45,0 90 90 80 95 Всього (n=61) 65,3 Не дивлячись на те, що хворі 2-ої групи мали розповсюдженість пухлинного прогресу, яка відповідала IV стадії захворювання, медіана тривалості життя цих хворих була високою і складала 76,4 місяців (р<0,05) та чітко корелювала зі слабкою експресією досліджуваних маркерів лише у 3 хворих (Табл. 3). Експресія Р-gp та GST спостерігалась в 5% злоякісних клітин тільки 3-х з 14-ти досліджуваних пухлин 21,4% хворих. Експресія білку Р53 спостерігалась в ядрах злоякісних клітин у 28,5% хворих даної групи, але кількість позитивно забарвлених клітин не перевищувала 10%. Поряд з цим, експресія антиапоптичного білку Bcl-2 виявлена в поодиноких клітинах у 21,4% хворих. В протилежність цьому, пухлини хворих 3-ої та 4-ої досліджуваних груп відрізнялися гіперекспресією Р-gp та GST (Табл. 3). Експресія цих білків спостерігалася в більшості пухлинних клітин у 85,7% хворих 3-ої та у 90% досліджуваних хворих 4-ої групи. Ці дані співпадають з даними клінічних спостережень (Shain K.H. et al, 2001; Huang J et al, 2003), які свідчать, що віддалені результати лікування таких хворих істотно гірші, ніж у хворих з відсутньою експресією P-gp та GST в злоякісних клітинах. Пухлини хворих 3-ої та 4-ої груп також відрізнялися гіперекспресією білків-регуляторів апоптозу. Гіперекспресія Р53 виявлена у 78,5% хворих 3-ої та у 90% хворих 4-ої групи. Клінічні спостереження останніх років переконливо доводять, що підвищена експресія Bcl-2 є маркером несприятливого прогнозу при пухлинах багатьох локалізацій, у тому числі і при злоякісних пухлинах яєчника (Sagarra R.A. et al, 2002; Nezhat F. et al, 2002), і це співпадає з отриманими нами даними, оскільки медіана тривалості життя хворих 3-ої та 4-ої досліджуваних груп була низькою та складала 25,0 та 45,0 місяців, відповідно. Таким чином, нами встановлена кореляція між експресією молекулярних маркерів, які пов’язані з резистентністю до цитотоксичної терапії і запрограмованою загибеллю клітин, та виживаністю хворих на розповсюджений РЯ. Виявлено, що підвищена експресія білків ЛР та білків-регуляторів апоптозу супроводжується несприятливим перебігом захворювання у хворих на РЯ: підвищений рівень експресії Р-gp, GST та Bcl-2 є характерним для хворих на рак яєчника з низькою медіаною тривалості життя. ВИСНОВКИ В роботі охарактеризовано молекулярно-біологічні особливості злоякісних клітин яєчника з фенотипом ЛР в системі in vitro та у хворих на РЯ. В результаті довготривалого культивування клітин епітеліальної карциноми яєчника людини лінії А2780 в умовах зростаючих концентрацій цисплатину та доксорубіцину отримано клітинні сублінії (А2780/DDP та А2780/Dox), резистентні до дії відповідних цитостатиків . 2. Показано, що за умов застосування різних цитостатиків феномен ЛР формується із залученням як спільних, так і різних молекулярних механізмів; формування феномену лікарської резистентності як до цисплатину, так і до доксорубіцину в клітинах РЯ людини, супроводжується підвищенням адгезивних властивостей клітин та зниженням їх проліферативної активності. 3. У механізмі розвитку резистентності клітин лінії А2780/DDP до цисплатину провідною є антиапоптична програма, яка реалізується за рахунок підвищенння рівня білку Bcl-2 та зниження CD95/Fas-антигену. Глутатіонова система при підвищенні рівня резистентності клітин А2780/DDP компенсує зниження кількості МТ, які метаболізують препарати даного класу. 4. Формування резистентності до доксорубіцину в клітинах лінії А2780/Dox відбувається за mdr-залежним шляхом. Основною складовою резистентності до доксорубіцину є значне підвищення рівня експресії Р-gp в більшості злоякісних клітин; рівень експресії всіх інших досліджуваних маркерів при формуванні фенотипу ЛР у цих клітин істотно не змінюється. 5. Доведено кореляцію експресії молекулярних маркерів, асоційованих з ЛР, з традиційними маркерами прогнозу ефективності терапії та перебігу захворювання хворих на РЯ. 6. Встановлено, що найбільш інформативними імуногістохімічними маркерами резистентності пухлин хворих на рак яєчника до цитотоксичної дії доксорубіцину є підвищена експресія Р-глікопротеїну, в той час як гіперекспресія Bcl-2 та глутатіон-S-трансферази в цих пухлинах свідчить про наявність резистентності злоякісних клітин до цисплатину та карбоплатину, відповідно. 7. Показано, що підвищений рівень експресії в пухлинних клітинах деяких маркерів апоптозу та ЛР (Р53, Bcl-2, P-gp та GST) корелює з тривалістю життя хворих на РЯ, що може свідчити про доцільність їх використання у розробці індивідуальних схем протипухлинної терапії та прогнозі перебігу захворювання. Перелік робіт, опублікованих за темою дисертації 1. N. Yu. Lukyanova, G.I.Kulik, O.V.Yurchenko, K.M. Shatrova, L.I. Vorobyova, V.S.Svintitsky, G.V.Evtushenko, V.F.Chekhun. Expression of p53 and Bcl-2 proteins in epithelial ovarian carcinoma with different grade of differentiation //Experimental Oncology. - 2000. - T. 22, № 1.- C.91-93. (Проводила морфологічні та імуногістохімічні дослідження, приймала участь у написанні і оформленні статті). 2. Лукьянова Н.Ю., Кулик Г.И., Чехун В.Ф. Роль генов р53 и bcl-2 в лекарственной резистентности опухолей // Вопросы онкологии. – 2000.-Т.46, № 46.-C.121-129. (Приймала участь у обробці наукових даних, написанні та оформленні статті) S.Mikhalap, L.Shlapatska, A.Berdova, O.Yurchenko, F.Lopez, N.Yu. Lukyanova, S.P.Sidorenko. Monoclonal antibody IPO-38 in evaluation of proliferative activity of tumor cells // Experimental Oncology. - 2000. - Т.22.- №2, С.36-38. (Проводила морфологічні та імуногістохімічні дослідження). Лук’янова Н.Ю., Юрченко О.В., Шпильова С.І., Свінцицький В.С., Кулік Г.І., Чехун В.Ф. Чутливість до протипухлинних препаратів та експресія молекулярних маркерів апоптозу і лікарської резистентності у хворих на рак яєчників // Здоровье женщины.- 2005. – Т.2. - №22 , часть 2. – С.52-54. (Проводила морфологічні та імуногістохімічні дослідження, визначала індивідуальну чутливість хворих до протипухлинних препаратів, приймала участь у написанні і оформленні статті). V.F.Chekhun, N.Yu.Lukyanova, O.V.Yurchenko, G.I.Kulik. The role of expression of the components of proteome in the formation of molecular profile of human ovarian carcinoma A2780 cells sensitive and resistant to cisplatin // Experimental Oncology.- 2005. - T.27.- №3.- С.191-195. (Власноруч отримала резистентну до цисплатину лінію клітин А2780, проводила імуноцитохімічні дослідження, приймала участь у обробці експериментальних даних та написанні і оформленні статті). Лук’янова Н.Ю., Юрченко О.В., Свінцицький В.С., Чехун В.Ф. Прогностичні молекулярні маркери у хворих на рак яєчника // Онкология. - 2006.- Т.8. - №3. – С.241-244. (Проводила імуногістохімічні дослідження, приймала участь у обробці наукових даних та написанні і оформленні статті). Лукьянова Н.Ю., Михалап С.В., Кулик Г.И., Воробьева Л.И., Свинцицкий В.С., Чехун В.Ф. Экспрессия некоторых регуляторных белков апоптоза в злокачественных эпителиальных опухолях яичников, обладающих различной чувствительностью к противоопухолевым препаратам // Материалы II съезда онкологов стран СНГ . – Киев, 2000. – С. 303. Лукьянова Н.Ю., Кулик Г.И., Юрченко О.В., Свинцицкий В.С., Чехун В.Ф. Роль некоторых компонентов протеома злокачественных опухолей яичника в формировании лекарственной резистентности // Материалы III съездa онкологов и радиологов СНГ. – Минск, 2004. – С.311. Лукьянова Н.Ю., Чехун В.Ф. Изменение компонентов протеома опухолевых клеток А2780 и MCF-7 при формировании фенотипа лекарственной резистентности //Материалы VII международной конференции молодых онкологов “Современные проблемы экспериментальной онкологии”. – Киев, 2006. – С.54. Лукьянова Н.Ю., Шпилевая С.И., Кулик Г. И., Чехун В.Ф. Экспрессия молекулярных маркеров апоптоза и лекарственной резистентности у больных раком яичников // Матеріали 11-го з'їзду онкологів України.- Крим, Судак, 2006 .- С.30. Лукьянова Н.Ю., Шпилевая С.И., Свинцицкий В.С., Чехун В.Ф. Прогностические маркеры эффективности противоопухолевой терапии у больных раком яичников. // Материалы IV съезда онкологов и радиологов СНГ .- Баку, 2006. - С.227-228. Лук’янова Н.Ю., Юрченко О.В., Свінцицький В.С., Шпильова С.І., Кулик Г.І., Чехун В.Ф. Прогностичні молекулярні маркери у хворих на рак яєчника. // Матеріали Всеукраїнської науково-практичної конференції з міжнародною участю: Молекулярні основи і клінічні проблеми резистентності до лікарських засобів.—Київ, 2006 – С.36. Анотація Лук’янова Н.Ю. Молекулярно-біологічні особливості злоякісних пухлин яєчника з фенотипом лікарської резистентності. - Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.01.07 – Онкологія.- Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, Київ –2007. Дисертація присвячена дослідженню молекулярно-біологічних особливостей злоякісних клітин лінії А2780 при формуванні резистентності до цисплатину і доксорубіцину та з’ясуванню їх можливого прогностичного значення в пухлинах хворих на рак яєчника. В експериментах in vitro показано, що формування фенотипу лікарської резистентності до цисплатину та доксорубіцину супроводжується змінами морфологічної будови та ускладненням ультраструктурної організації вихідних клітин лінії А2780. Доведено, що в умовах застосування різних цитостатиків, феномен лікарської резистентності формується із залученням різних механізмів: резистентність до доксорубіцину в клітинах раку яєчника людини відбувається за mdr1-залежним механізмом, а резистентність до цисплатину – шляхом зміни експресії ферментів глутатіонової системи та антиапоптичного білку Bcl-2. Встановлена кореляція експресії молекулярних маркерів, асоційованих з лікарською резистентністю, з клініко-морфологічними характеристиками хворих на рак яєчника. Найбільш інформативними імуногістохімічними маркерами резистентності пухлин хворих на рак яєчника до цитотоксичної дії доксорубіцину є підвищена експресія Р-глікопротеїну, в той час як гіперекспресія Bcl-2 та глутатіон-S-трансферази в цих пухлинах свідчить про наявність резистентності злоякісних клітин до цисплатину та карбоплатину, відповідно. Підвищений рівень експресії Р-gp, GST та Bcl-2 є характерним для хворих на рак яєчника з низькою медіаною тривалості життя. Ключові слова: лікарська резистентність, злоякісні пухлини яєчника, Р-gp, GST, P53, Bcl-2. Аннотация Лукьянова Н.Ю. Молекулярно-биологические особенности злокачественных опухолей яичника с фенотипом лекарственной резистентности. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.01.07-Онкология- Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины, Киев — 2007. Диссертация посвящена изучению молекулярно-биологических особенностей злокачественных клеток линии А2780 при формировании резистентности к цисплатину и доксорубицину и выяснению их вероятного прогностического значения у больных раком яичника. На основании комплексного исследования биологических особенностей клеток линии А2780, а также полученных на ее основе сублиний A2780/DDP и A2780/Dox, резистентных к цисплатину и доксорубицину, соответственно, было показано, что формирование феномена лекарственной резистентности (ЛР) сопровождается значительными изменениями их морфологического строения и усложнением ультраструктурной организации. При электронномикроскопическом исследовании установлено, что клетки резистентных сублиний A2780/DDP и A2780/Dox, по сравнению с исходными клетками А2780, характеризовались наличием значительного количества микротрубочек и пучков микрофиламентов различной толщины, локализованных преимущественно возле ядра; хорошо развитым гранулярным эндоплазматическим ретикулумом, представленным длинными цистернами активного комплекса Гольджи. Вблизи него, а также под плазматической мембраной всегда присутствовало значительное количество мультивезикулярных телец, что может свидетельствовать об усилении транспорта в окружающую среду и снижении количества противоопухолевых препаратов в цитоплазме клеток, а, соответственно, и снижении их цитотоксической активности. Показано, что в условиях применения разных цитостатиков феномен ЛР в клетках формируется с привлечением как общих, так и различных механизмов: формирование фенотипа ЛР к доксорубицину в клетках рака яичника человека происходит по mdr1-зависимому механизму, а резистентность к цисплатину - путем изменения экспрессии ферментов глутатионовой системы и антиапоптического онкопротеина Bcl-2. Глутатионовая система при повышении уровня резистентности клеток A2780/DDP компенсирует снижение количества металлотионеинов, метаболизирующих препараты данного класса. Общим механизмом формирования ЛР к обоим препаратам является повышение адгезивных свойств клеток и снижение их пролиферативной активности. В результате иммуногистохимических исследований установлена корреляция экспрессии молекулярных маркеров, ассоциированных с лекарственной резистентностью, с клинико-морфологическими характеристиками больных раком яичника. Показано, что экспрессия некоторых молекулярных маркеров апоптоза и пролиферации четко коррелирует со степенью дифференцировки опухолевых клеток. Гиперэкспрессия мутантного белка Р53 и антигена, ассоциированного с пролиферацией клеток, и выявляемого с помощью МКАТ ИПО-38, характерна для низкодифференцированных злокачественных опухолей яичника, отличающихся высокой степенью злокачественности и агрессивным течением. Экспрессия некоторых белков лекарственной резистентности и апоптической гибели опухолевых также коррелирует с индивидуальной чувствительностью больных раком яичника к противоопухолевым препаратам. В частности показано, что экспрессия Р-гликопротеина является характерным признаком нечувствительности опухолей яичника к цитотоксическому действию доксорубицина. Гиперэкспрессия Bcl-2 и GST в опухолевых клетках больных раком яичника свидетельствует об их резистентности к цисплатину и карбоплатину, соответственно. Наряду с этим, нами установлена корреляция экспрессии молекулярных маркеров, ассоциированных с резистентностью к цитостатической терапии, с выживаемостью больных распространенненным РЯ. Показано, что повышенная экспрессия белков лекарственной устойчивости и белков-регуляторов апоптоза сопровождается неблагоприятным течением заболевания у больных РЯ: повышенный уровень экспрессии Р-gp, GST и Bcl-2 в опухолях характерен для больных раком яичника с низкой медианой продолжительности жизни. Таким образом, на основе комплексного клинического, гистологического и иммуногистохимического исследования определено значение молекулярных маркеров, ассоциированных с лекарственной резистентностью, в прогнозировании протекания заболевания и чувствительности больных раком яичника к противоопухолевой терапии. Ключевые слова: лекарственная резистентность, злокачественные опухоли яичника, Р-gp, GST, P53, Bcl-2. ANNOTATION Lukyanova N.Yu. Molecular-biological features of malignant ovarian tumors with drug resistance phenotype. – А Manuscript. Dissertation for the candidate of biological science degree in speciality 14.01.07 – Oncology. R.E.Kavetsky Institute of Experimental Pathology, Oncology and Radibiology, NAS of Ukraine, Kyiv- 2007. Dissertation covers to study the molecular-biological features of malignant cell line А2780 whith formation of resistance to cisplatin and doxorubicin and determination of their possible prognostic role in patients with ovarian cancer. In Vivo-experiments have shown, that formation of resistance to ciplatin and doxorubicin is accompanied by changes of a morphological structure and complication of the ultrastructural organization of wild cell line А2780. It is proved, that the phenomenon of resistance to various antineoplastic drugs is formed with attraction of various mechanisms: resistance to doxorubicin in human ovarian cancer cells is occured by the mdr1-dependent mechanism, and resistance to cisplatin - by changing of expression of enzymes of glutathione system and antiapoptotic protein Bcl-2. The correlation of expression of drug resistance molecular markers with clinical-morphological characteristics of patient with ovarian cancer was established. The increased expression of P-glycoprotein is a most informative imunohistochemical marker of resistance of ovarian cancer to cytotoxic action of doxorubicin, hyperexpression of bcl-2 and glutation-S-transferase is characteristic for resistance to cisplatin and carboplatin, respectively. The increased level of expression of P-gp, GST and bcl-2 is characteristic for patient with ovarian cancer with a worse survival. Key words: drug resistance, malignant ovarian tumors, P-gp, GST, P53, Bcl-2. PAGE 14 Рівень експресії

Похожие записи