НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

______________________________________________________________

ЛУГОВСЬКОЙ Едуард Віталійович

УДК 577.112: 612.115

Молекулярні механізми утворення фібрину та фібринолізу

03.00.04 – біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2004

Дисертацією є монографія.

Робота виконана у відділах молекулярної імунології і структури та
функції білка Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Науковий консультант –

Офіційні опоненти:

Провідна установа –

Захист відбудеться 24 січня 2005 р. о 14 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В.
Палладіна НАН України, за адресою: 01601 Київ, вул. Леонтовича 9.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії

ім. О.В. Палладіна НАН України, (Київ, вул. Леонтовича 9.)

Автореферат розісланий 22 грудня 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради
Кірсенко О.В.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми дисертації. У наш час головною причиною смертності
населення в індустріально розвинених країнах є захворювання, пов’язані з
порушеннями функціонування серцево-судинної системи. Зокрема, це такі
захворювання, як інфаркт міокарду, інсульт головного мозку, емболія
легеневих артерій, які супроводжуються чи є наслідком аномальної
активації системи зсідання крові. У крові людини функціонують дві
антагоністичні системи – зсідання крові та фібриноліз. Перша приводить
до утворення тривимірної сітки фібрину, яка є каркасом будь-якого
тромбу, а друга – до розщеплення фібрину та руйнування тромбу.
Центральним білком системи зсідання крові є фібриноген. У результаті
активації системи зсідання утворюється тромбін, який відщеплює від
фібриногену два фібринопептиди А та перетворює фібриноген у фібрин
дезАА, здатний до спонтанної полімеризації. Полімеризація фібрину
здійснюється за рахунок міжмолекулярної взаємодії комплементарних сайтів
молекули – центрів полімеризації, що утворені певними амінокислотними
залишками. На сьогоднішній день вважається доведеним, що перша стадія
полімеризації – побудова протофібрил із мономерних молекул фібрину дезАА
– відбувається завдяки взаємодії пари комплементарних центрів
полімеризації “А”–“а” [Laudano A.P., et al, 1978; Everse S.J., et al,
1998]. Після досягнення критичної довжини протофібрили асоціюють
латерально за участі специфічних центрів латеральної асоціації, які були
відкриті за допомогою рентгеноструктурного аналізу [Yang Z., et al,
2000]. На цій стадії значно прискорюється відщеплення тромбіном
фібринопептидів В, і молекули фібрину дезАА в складі протофібрили
перетворюються у фібрин дезААВВ із додатковою полімеризаційною
активністю, яка забезпечується взаємодією іншої відомої пари
комплементарних центрів полімеризації – “B”–“b” [Laudano A.P., et al,
1978; Everse S.J., et al, 1998]. Однак є експериментальні дані, які
свідчать про існування додаткових комплементарних центрів полімеризації
в центральному Е- та периферичному D- доменах фібрину [Siebenist K.R.,
et al, 1990; Moskowitz K.A., et al, 1994]. Паралельно з утворенням
протофібрил та фібрил відбуваються специфічні процеси їх галуження, які
й приводять до формування тривимірної фібринової сітки [Weisel J.W.,
1986]. Полімеризація фібрину є прикладом одного з найскладніших процесів
самозбирання надмолекулярних структур у живих організмах. Тому
дослідження даного процесу має фундаментальне значення. Враховуючи те,
що фібринова сітка є структурною основою будь-якого тромбу, дослідження
механізмів утворення фібрину та його руйнування є актуальною проблемою
клінічної медицини.

Руйнування полімерного фібрину забезпечується, головним чином, завдяки
ферментативній дії плазміну. Цей фермент каталізує гідроліз фібрину до
розчинних продуктів. Серед останніх особливе місце займає D-димер, який
утворюється при розщепленні плазміном фібрину, стабілізованого фактором
XIIIa. Відомо, що концентрація D-димеру в плазмі крові суттєво
збільшується при емболії легеневих артерій, тромбозі глибоких вен,
ДВС-синдромі та багатьох інших захворювань [Rogers S., et al, 1986;
Nieuwenhuizen W., et al, 1997]. Тому кількісне визначення D-димеру в
плазмі крові є дуже важливим при діагностиці вказаних захворювань.
Кількісне визначення D-димеру в плазмі крові проводять за допомогою
різних імунохімічних методів із використанням моноклональних антитіл
(монАТ), які специфічно взаємодіють із D-димером. При цьому дані монАТ
не повинні реагувати з фібрин(оген)ом. Це можливо тільки за умови, якщо
епітопи для цих монАТ у молекулах D-димеру є експонованими, а у
фібриногені та фібрині закритими чи, навіть, відсутніми. Такі епітопи в
молекулі D-димеру є неоантигенними детермінантами, оскільки вони стають
доступними для взаємодії з монАТ тільки після плазмінового розщеплення
фібрину, стабілізованого фактором XIIIа. Тому визначення локалізації
неоантигенних детермінант є важливим для дослідження антигенної
структури D-димеру, а монАТ, епітопи для яких розташовані в таких
неоантигенних детермінантах, мають велике значення для розробки методів
кількісного визначення D-димеру.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота
виконувалась за ДНТП “Біохімія тварин і людини” (шифр 2.28.4) за
бюджетними темами: 2.10.11 “Вивчення імунохімічної структури антигенів і
розвиток імунної відповіді на них” (1988-1993 рр.); 2.10.9 “Дослідження
імунохімічної структури антигенів і розвиток імунної відповіді на них.
Біохімічний та імунохімічний аналіз механізмів тромбоутворення”
(1993-1998 рр.); 2.2.1.9 (шифр 40101, номер держреєстрації 0199U000273):
«Дослідження імунохімічної структури біологічно активних білків та
пептидів» (з 1999-2003 рр.) у відділах структури та функції білка та
молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН
України.

Мета і завдання дослідження. Мета дослідження полягала в пошуку та
вивченні функціональної ролі раніше невідомих центрів полімеризації
фібрину і в створенні нової моделі формування тривимірної сітки фібрину
– каркаса тромбу. Метою було також одержання монАТ, специфічних до
головного продукту фібринолізу – D-димеру для дослідження його
антигенної структури та використання цих монАТ з метою кількісного
визначення D-димеру в плазмі крові людини.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

1. Розробити метод кількісного визначення NH2-кінцевих амінокислотних
залишків білків для ідентифікації фібриногену, фібрину дезАА та дезААВВ.

2. Розробити метод одержання фібрину дезАА за допомогою тромбіну.

3. Дослідити природу міжмолекулярних взаємодій, які забезпечують процес
полімеризації фібринів дезАА та дезААВВ.

4. Одержати в ізольованому вигляді фрагмент В(15-118 фібрину, D-фрагмент
і D-димер фібрину.

5. Дослідити вплив фрагмента В(15-118 на процес полімеризації фібрину
дезАА та фібрину дезААВВ.

6. Дослідити комплексоутворення фрагмента В(15-118 із D-фрагментом та з
D-димером фібрину.

7. Одержати NH2-кінцеві дисульфідні вузли (N-ДСВ) фібрин(оген)у та
поліпептидні ланцюги, що складають ці фрагменти (А(1-51, В(1-118, (1-78;
А(17-51, В(15-118).

8. З метою виявлення невідомих центрів полімеризації в центральному
домені Е молекули фібрину одержати монАТ – інгібітори полімеризації
фібрину проти фрагментів N-ДСВ фібрин(оген)у. Встановити локалізацію
епітопів для цих монАТ.

9. З метою виявлення невідомих центрів полімеризації в периферичному
домені D молекули фібрину одержати монАТ – інгібітори полімеризації
фібрину проти D-димеру. Встановити локалізацію епітопів для цих монАТ.

10. На основі одержаних експериментальних результатів створити нову
модель полімеризації фібрину, яка б включала нові центри полімеризації.

11. Одержати монАТ проти кінцевого продукту фібринолізу – D-димеру
фібрину, які б специфічно взаємодіяли з D-димером без перехресної
реакції з фібриногеном та фібрином. Визначити локалізацію епітопів
(відповідно й неоантигенні детермінанти) для таких монАТ у D-димері.

12. На основі одержаних монАТ, специфічних до D-димеру, розробити метод
кількісного визначення цього фрагменту в плазмі крові людини з метою
моніторингу системи зсідання крові та фібринолізу.

Об’єкти дослідження: фібриноген, фібрин дезАА, фібрин дезААВВ, D-димер
фібрину.

Предмет дослідження: дослідження молекулярних механізмів полімеризації
фібрину та антигенної структури D-димеру фібрину.

Методи дослідження. Фібриноген виділяли методом фракційного висолювання
за допомогою Na2SO4. Фібрин дезАА одержували за розробленим нами
методом, використовуючи низькі концентраціі тромбіну, та зберігали в
0,02 М оцтовій кислоті. Фібрин дезААВВ одержували за допомогою
підвищених концентрацій тромбіну за методом Т.В. Варецької та зберігали
також у 0,02 М оцтовій кислоті. Кількісний аналіз NH2-кінцевих
амінокислот фібриногену, фібрину дезАА та фібрину дезААВВ проводили за
допомогою розробленого нами методу, який заснований на реакції Едмана.
N-ДСВ фібриногену та фібрину одержували шляхом гідролізу вихідних білків
бромціаном. Поліпептидні ланцюги N-ДСВ фібриногену (А(1-51, В(1-118,
(1-78) та фібрину (А(17-51, В(15-118, (1-78) виділяли шляхом відновлення
та карбоксиметилювання з подальшим розділенням методом рідинної
хроматографії високого тиску (HPLC). Фібринопептиди А (А(1-16) та В
(В(1-14) одержували з реакційної суміші фібриноген + тромбін за
допомогою розробленого нами методу з подальшим їх розділенням із
використанням HPLC. Ідентифікацію всіх вказаних фрагментів N-ДСВ
фібриногену та фібрину проводили автоматичним сіквенуванням за Едманом
та мас-спектрометрією. D-димер виділяли з плазмінового гідролізату
фібрину методом афінної хроматографії на фібрин-сефарозі, а D-фрагмент –
із плазмінового гідролізату фібриногену методом іонообмінної
хроматографії на CM-Sephadex G-50. Поліпептидні ланцюги (( та (, що
входять до складу D-димеру, після відновлення та карбоксилювання
D-димеру виділяли за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі
(ПААГ) із додецилсульфатом натрію (ДС-Na) та подальшої елюції з гелю.
Чистоту всіх одержаних білкових препаратів визначали методом
електрофорезу в ПААГ із ДС-Na. Інгібіторну активність білкових продуктів
по відношенню до процесу полімеризації фібрину визначали за допомогою
турбідиметричного аналізу. Для одержання гібридом проводили злиття
клітин селезінки імунізованих мишей із клітинами мієломи в присутності
поліетиленгліколю. Моноклональні антитіла з культурального середовища
виділяли за допомогою афінної хроматографії на протеїн-G-сефарозі та на
фібриноген-сефарозі. Зв’язування монАТ з різними білковими продуктами
визначали за допомогою імуноферментного аналізу та імуноблотаналізу
(вестерн-блот аналізу).

Наукова новизна одержаних результатів.

Відкрито невідомі раніше центри полімеризації фібрину та створена нова
модель формування тривимірної сітки фібрину, яка є каркасом будь-якого
тромбу. Виявлено нову антигенну детермінанту в D-димері фібрину, яка
експонується в процесі фібринолізу.

2. Розроблено метод кількісного аналізу NH2-кінцевих амінокислот, який
дозволив диференціювати фібриноген, фібрини дезАА та дезААВВ.

3. Показано, що взаємодія центрів полімеризації при самозбиранні
фібрину дезАА здійснюється, головним чином, за рахунок електростатичних
і водневих взаємодій, а при самозбиранні фібрину дезААВВ додатково
включаються й гідрофобні взаємодії.

4. Вперше експериментально показано існування нековалентних взаємодій
між D-фрагментами, що свідчить про існування нековалентних взаємодій між
D-доменами в процесі побудови протофібрил фібрину.

Показано існування центру латеральної асоціації протофібрил фібрину в
NH2-кінцевій частині В(-ланцюга?фібриногену, який для свого
функціонування не потребує відщеплення фібринопептиду В.

Вперше показано, що в D-домені фібрину людини окрім центру «а» існує
інший, раніше невідомий центр полімеризації, який необхідний для
побудови протофібрил. Зазначений центр знаходиться в NH2-кінцевій
частині (-ланцюга D-домену фібрину.

Вперше показано, що у фрагменті В(134-190 (ймовірно в В(155-160)
D-димеру фібрину людини знаходиться невідома раніше антигенна
детермінанта, яка не експонована у молекулі фібриногену та з’являється в
процесі фібринолізу.

Показано, що одержані нами монАТ III-3b, специфічні до D-димеру фібрину,
можуть бути використані для кількісного визначення D-димеру в плазмі
крові людини з діагностичною метою.

Теоретичне і практичне значення отриманих результатів. Одержано
експериментальні дані, які свідчать про існування в молекулі фібрину
людини невідомих раніше центрів полімеризації, необхідних для побудови
протофібрил і для латеральної асоціації протофібрил фібрину. Ця
інформація стала основою для створення нової моделі полімеризації
фібрину та формування трьохвимірної сітки фібрину, яка є каркасом
будь-якого тромбу.

Одержано монАТ (III-3b) проти D-димеру фібрину людини, яке специфічно
взаємодіє з D-димером без перехресної реакції з фібриногеном і фібрином.
Показана принципова можливість використання монАТ III-3b для кількісного
визначення D-димеру в плазмі крові людини. МонАТ III-3b може бути
використане для створення імунотест-системи на D-димер, який має важливе
значення в діагностиці різних захворювань, що пов’язані з активацією
системи зсідання крові.

Особистий внесок здобувача. Здобувач особисто розробив тактику
експериментальних досліджень, які були проведені для вирішення всіх
поставлених наукових задач. Брав безпосередню участь: при розробці
нового методу кількісного аналізу NH2-кінцевих амінокислот фібриногену,
фібрину дезАА та фібрину дезААВВ; в розробці нового методу одержання
фібрину дезАА за допомогою тромбіну; в пріоритетних фізико-хімічних
дослідженнях полімеризації фібриногену та двох форм фібрину; при
одержанні X-фрагмента фібриногену, який дав початок новому науковому
напрямку. Визначав інгібуючий вплив фібриногену на полімеризацію фібрину
дезАА та фібрину дезААВВ при різних значеннях іонної сили та рН. Брав
участь у проведенні всіх турбідиметричних досліджень інгібування
полімеризації фібрину за допомогою монАТ і їх Fab-фрагментів. Брав
безпосередню участь в одержанні всіх фрагментів фібриногену та фібрину,
які були використані як антигени при імунізації тварин і при локалізації
епітопів для одержаних монАТ в молекулі фібрину. Взяв активну участь при
формуванні нового напрямку в дослідженні механізмів полімеризації
фібрину за допомогою монАТ, який запропонував науковий консультант цієї
роботи, академік НАН України С.В. Комісаренко. Здобувач проводив наукове
керівництво при здійсненні запланованих експериментів, аналізував усі
одержані експериментальні дані та написав особисто майже всі вказані
публікації.

Апробація результатів дисертації. Експериментальні дані дисертації були
представлені на наступних конференціях:

Радянсько-американський симпозіум з хімії та фізики білка. – Рига,
1976, (усна доповідь).

ІVий Український біохімічний з’їзд, Дніпропетровськ. – 1982, (усна
доповідь).

VIIIth Symposium on chemistry of peptides and proteins. FRG-USSR,
Aachen. 29.09-03.10, 1991, (oral presentation session).

XIIIth International Fibrinogen Workshop, Manchester, UK., September
4-10, 1994, (oral presentation session).

XIIIth International Congress on Fibrinolysis and Thrombolysis,
Barcelona, Spain. 1996, Barcelona, Spain, (poster session).

The XVth International Fibrinogen Workshop, Cleveland, USA, August
13-15, 1998, (oral presentation session).

16th International Fibrinogen Workshop 2000, Leiden, The Netherlands,
August 23-26, 2000, (poster session).

XVIIIth Congress of The International Society on Thrombosis and
Haemostasis 2001, Paris, France, Juli 6-12, 2001, (poster session).

16th International Congress on Fibrinolysis and Proteolysis in
conjunction with the 17th International Fibrinogen Workshop, Munich,
Germany, September 08-13, 2002, (oral presentation session).

VIIIий Український біохімічний з’їзд, м.Чернівці, 1-3 жовтня 2002 р.,
(усна доповідь).

XIXth Congress The International Society on Thrombosis and Haemostasis,
Birmingham, UK. – July 12-18, 2003, (poster session).

18th International Congress on Thrombosis, Ljubljana, Slovenia, June
20-24, 2004, (poster session).

Публікації. За результатами, що представлені в дисертаційній роботі,
опубліковано 31 статтю у фахових виданнях та 12 тез у збірках
українських і міжнародних конференцій.

Структура дисертації. Дисертація у вигляді монографії складається з
передмови, семи глав, висновку, списку літературних джерел (670
найменувань). Монографія викладена на 13,41 обліково-видавничих аркушах
(224 сторінки). Монографія містить 1 таблицю та 41 рисунок.

Основний зміст роботи

Огляд літератури. В монографії висвітлено сучасні погляди на будову
молекули фібриногену, його перетворення в мономерний фібрин під дією
тромбіну, молекулярні механізми полімеризації фібрину та ферментативний
гідроліз полімерного фібрину плазміном.

Матеріали та методи досліджень. Фібриноген одержували з плазми крові
людини методом фракційного висолювання сульфатом натрію [Варецька Т.В.,
1960]. Фібрин дезАА одержували за розробленим нами оригінальним методом,
використовуючи низькі концентрації тромбіну. При цьому домішки фібрину
дезААВВ видаляли з препарату фібрину дезАА у вигляді твердої фази за
фізико-хімічних умов середовища, при яких фібрин дезАА залишався в
розчині [Lougovskoi E.V., Gogolinskaya G.K., 1999]. Фібрин дезААВВ
одержували за допомогою підвищених концентрацій тромбіну за методом
В.О. Бєліцера та Т.В. Варецької [Belitser V.A., Varetskaja T.V., 1968].
Препарати фібринів дезАА та дезААВВ зберігали в 0,02 М оцтовій кислоті.
Кількісний аналіз NH2-кінцевих амінокислот фібриногену, фібрину дезАА та
фібрину дезААВВ проводили за допомогою розробленого нами методу, який
був заснований на реакції Едмана, та включав тонкошарову хроматографію
фенілтіогідантоїнових похідних амінокислот [Луговськой Е.В., та спів.,
1975]. Активний плазмін (КФ.3.4.21.7.) одержували шляхом активації
плазміногену стрептокіназою (Varidase RN, «Lederle», Німеччина). D-димер
виділяли з плазмінового гідролізату, прошитого фактором XIIIа (КФ
2.3.2.13) фібрину, методом афінної хроматографії на фібрин-сефарозі
[Marder V.J., 1976]. Для одержання гібридом проводили злиття клітин
селезінки імунізованих мишей із клітинами мієломи (X63-Ag8.6.5.3, «Flow
Laboratories», Англія) в присутності поліетиленгліколю [Koehler G.,
Milstein C., 1975]. Моноклональні антитіла з культурального середовища
виділяли за допомогою афінної хроматографії на фібриноген-сефарозі та
Protein G сефарозі («Pharmacia», Швеція). Зв’язування монАТ із різними
білковими продуктами визначали за допомогою непрямого імуноферментного
аналізу та імуноблотаналізу [Tsang V.C.W., 1983]. Для одержання
Fаb-фрагментів монАТ II-4d та II-3b проводили гідроліз монАТ папаїном
(КФ.3.4.22.2.) («Sigma»). З одержаних гідролізатів Fаb-фрагменти
виділяли за допомогою двох послідовних афінних хроматографій: спочатку –
на Protein G Sepharose («Pharmacia», Швеція), з якою зв’язувались тільки
Fc-фрагменти монАТ, а потім – на фібриноген-сефарозі. D-фрагмент
виділяли з плазмінового гідролізату фібриногену методом іонообмінної
хроматографії на CM-Sephadex G-50 («Pharmacia», Швеція). Ланцюги ( та
((, що входять до складу D-димеру, виділяли з препарату суміші
відновлених і карбоксиметильованих поліпептидних ланцюгів D-димеру за
допомогою електрофорезу в 10,5%-му ПААГ з 0,1% ДС-Na та подальшої елюції
їх із ПААГ за розробленою нами методикою. Для видалення ДС-Na з
одержаних таким чином препаратів (- та ((-ланцюгів проводили їх
переосадження з ацетону [Lugovskoy E.V., et al, 2002]. Субфрагмент D46
виділяли з плазмінового гідролізату D-фрагмента, а TSD-субфрагмент – із
хімотрипсинового (КФ.3.4.21.1.) гідролізату D-фрагмента за допомогою
електрофорезу в 10,5%-му ПААГ з 0,1% ДС-Na та подальшої елюції з ПААГ за
розробленою нами методикою [Lugovskoy E.V., et al, 2004]. Чистоту всіх
одержаних білків та їх фрагментів перевіряли за допомогою електрофорезу
в ПААГ з ДС-Na [Schaegger H., Von Jagow G., 1987].

Дослідження полімеризації мономерного фібрину desAABB та фібрину,
одержаного в системі фібриноген + тромбін (у присутності чи у
відсутності монАТ II-4d, монАТ II-3b, їх Fаb-фрагментів), проводили за
допомогою турбідиметричного методу [Hantgan R., 1980]. При цьому
визначали значення таких параметрів: лаг-періоду, який відповідає часу
утворення протофібрил; тангенсу кута нахилу дотичної до початкової
найбільш крутої ділянки кривої світлорозсіювання, який відповідає
швидкості латеральної асоціації протофібрил; зміни світлорозсіювання
розчину за певний час. Дослідження полімеризації мономерного фібрину
desAABB у присутності чи у відсутності монАТ та їх Fаb-фрагментів
проводили також за допомогою трансмісійної електронної мікроскопії
(електронний мікроскоп H-600, «Hitachi», Japan). Дослідження зв’язування
D-фрагмента та його імунних комплексів [D-фрагмент – монАТ] з
іммобілізованим Gly-Pro-Arg-Pro-пептидом проводили, використовуючи
Gly-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Glu-сефарозу, яка була люб’язно надана
професором Р. Дулитл (The Center for Molecular Genetics, University of
California, San Diego, USA).

Фізико-хімічна характеристика центрів полімеризації фібрину, що
послідовно утворюються при активації фібриногену тромбіном. Раніше було
відомо, що в міжмолекулярній побудові фібрину беруть участь
електростатичні та водневі зв’язки. У попередній роботі ми припустили,
що в цьому процесі мають брати участь і гідрофобні взаємодії. Тоді нам
вперше вдалося довести це при дослідженні мутності згустків, що
сформувалися в результаті полімеризації фібрину дезААВВ у присутності
різних концентрацій NaCl (від 0,15 М до 2,0 М) та інших солей. У даній
роботі нами були продовжені ці дослідження. Була виміряна швидкість
полімеризації фібрину дезААВВ у широкому діапазоні концентрацій NaCl та
інших солей. Виявилось, що різні солі, які володіють ефектом
висолювання, при збільшенні їх концентрації спочатку гальмують
полімеризацію, а при досягненні певної концентрації починають
прискорювати полімеризаційний процес (рис. 1). При цьому сила
прискорюючої дії солі повністю відповідала силі її висолюючої дії, яка
завжди спрямована на неполярні речовини, в даному випадку – на
гідрофобні бокові групи амінокислотних залишків фібрину. Таким чином,
було підтверджено наш попередній висновок, що прискорюючий ефект різних
солей при полімеризації фібрину дезААВВ обумовлений міжмолекулярними
взаємодіями гідрофобних бічних груп амінокислотних залишків.

Далі нами була досліджена фізико-хімічна природа та механізм
функціонування центрів полімеризації фібрину, що формуються після
відщеплення фібринопептидів А та В. Для цього необхідно було мати два
препарати фібрину: desAA та desAABB. Першою нашою задачею було навчитися
ідентифікувати фібриноген і ці форми фібрину. Для цього ми розробили
метод кількісного визначення NH2-кінцевих амінокислотних залишків
фібриногену та фібрину, який свого часу був пріоритетним у Радянському
Союзі. Метод був заснований на реакції Едмана та включав тонкошарову
хроматографію фенілтіогідантоїнових похідних NH2-кінцевих амінокислотних
залишків із подальшою їх елюцією та детекцією при 269 нм. При
послідовному перетворенні фібриногену у фібрин дезАА та далі – у фібрин
дезААВВ – набори NH2-кінцевих амінокислотних залишків змінюються таким
чином: 2Ala/2Tyr ( 2Gly/2Tyr ( 4Gly/2Tyr.

Препарат мономерного фібрину дезААВВ дотепер одержували за методом
Т.В.Варецької. Препарат фібрину дезАА в лабораторній практиці зазвичай
отримували з застосуванням ферментів із отрути змій, які відщеплюють
специфічно тільки фібринопептиди А. Проте як цей процес, так і сам
кінцевий препарат не є фізіологічними. Нам вдалось одержати фібрин дезАА
оригінальним способом за допомогою тромбіну. Для цього за методом
Дж.Шейнова ми одержали спочатку при знижених концентраціях тромбіну
фібрин дезАА з 5% — 10% домішкою фібрину дезААВВ. Далі ми провели
порівняльний аналіз полімеризації цього препарату фібрину дезАА з
домішкою фібрину дезААВВ і чистого препарату фібрину дезААВВ при різних
значеннях іонної сили та рН (рис. 2). Було знайдено, що, якщо перевести
фібрин дезАА з домішкою дезААВВ із кислого середовища в буфер із рН 6,2
та іонною силою 0,4, то в тверду фазу переходять лише домішки фібрину
дезААВВ, тоді як фібрин дезАА повністю залишається в розчині. Після
центрифугування було одержано практично 100%-ий препарат фібрину дезАА,
який за результатами аналізу NH2-кінцевих амінокислотних залишків
(2Gly/2Tyr) та за даними електрофорезу з (-меркаптоетанолом ?був
позбавлений фібринопептидів А, але зберігав фібринопептиди В.

З’явилася можливість прямого порівняння полімеризації двох тромбінових
препаратів фібрину з метою з’ясування природи та ролі центрів
полімеризації, які експонуються після відщеплення фібринопептидів А та
В. Порівняльне дослідження полімеризації фібрину desAA та desAABB при
різних концентраціях сечовини, різних значеннях іонної сили та різних рН
показало, що полімеризація фібрину desAA набагато сильніше залежить від
цих параметрів, тобто в міжмолекулярній побудові фібрину desAA більшу
роль виконують іонні та водневі взаємодії в порівнянні з фібрином
desAABB. Таким чином, після відщеплення від фібриногену тромбіном
фібринопептидів А експонуються центри полімеризації, які забезпечують, в
основному, електростатичні та водневі взаємодії між молекулами фібрину.
Далі було знайдено, що чутливість фібрину desAA до активуючого ефекту
солей виражена значно слабше, ніж для desAABB. Концентрації NaСl, що
підвищують мутність гелів та прискорюють полімеризацію, у випадку
фібрину desAA набагато вищі порівняно з фібрином desAABB (рис. 3). Було
зроблено висновок, що міжмолекулярні гідрофобні взаємодії при
полімеризації фібрину значно посилюються після відщеплення
фібринопептидів В.

Нові центри полімеризації у D- та Е-доменах фібрину. До недавнього часу
вважалося, що полімеризація фібрину здійснюється двома парами
комплементарних центрів “А”-“а” та “B”-“b”, які забезпечують
міжмолекулярні контакти центрального Е- та периферичного D-доменів
фібрину. Проте є дані, які свідчать на користь існування й інших пар
комлементарних центрів, що забезпечують процес полімеризації. Наприклад,
пептиди GPRР та GНRP, які імітують центри “А” та “В” в Е-домені фібрину,
зв’язуються з комплементарними їм центрами “a” та “b” в D-домені фібрину
з афінністю 1·104 М-1, тоді як міжмолекулярні взаємодії навіть фібрину
дезАА здійснюються з набагато більшою афінністю – 1·107 М-1. Цей факт
вказує на наявність взаємодій і інших пар центрів, що приводять до
такого збільшення спорідненості між молекулами фібрину. Один із таких
центрів, за багатьма даними, може знаходитись у фрагменті фібрину
В(15-53, а комплементарний йому центр – у D-домені фібрину.

Нашою основною концепцією, яка сформувалася після аналізу багатьох
літературних даних, було те, що кожна стадія полімеризації фібрину
здійснюється не однією парою комплементарних центрів, а, як мінімум,
двома парами. Під центром полімеризації ми розуміємо групу
амінокислотних залишків, розташованих послідовно в поліпептидному
ланцюзі молекули фібрину або зближених у просторі за рахунок третинної
структури, які беруть участь у міжмолекулярному зв’язуванні фібрину.

Для пошуку нових центрів полімеризації в D-домені фібрину, при
використанні одержаного нами D-димеру як антигену Колесніковою І.М. із
співр. були одержані 16 гібридом, що продукували монАТ різної
специфічності до D-димеру. З них були обрані дві, які синтезували
антитіла, здатні специфічно гальмувати процес полімеризації фібрину.
Турбідиметричний аналіз показав, що монАТ з умовною назвою II-4d та його
Fab-фрагмент інгібують полімеризацію на 100% при еквімолярному
співвідношенні їх до фібрину. Друге антитіло II-3b інгібує полімеризацію
фібрину на 60%, а його Fab-фрагмент – на 100% при тому ж молярному
співвідношенні до фібрину. Таке інгібування полімеризації означає, що
епітопи для даних антитіл в молекулі фібрину, з якими зв’язуються монАТ
та їх Fab-фрагменти, розташовані поряд або безпосередньо в центрах
полімеризації фібрину. Для того, щоб з’ясувати, яку саме стадію
полімеризації інгібують дані антитіла, були проведені
електронно-мікроскопічні дослідження В.І.Чернишовим зі співр. Ці
дослідження показали, що, коли фібрин полімеризувався у відсутності
антитіл, спостерігалося утворення спочатку типових протофібрил і далі –
поперечно-посмугованих фібрил. Коли ж у полімеризаційному середовищі
були присутні антитіла II-4d або їх Fab-фрагменти, фібрин залишався в
мономерному стані. У присутності Fab-фрагментів антитіл II-3b фібрин
також залишався лише в мономерному стані. Таким чином, було зроблено
висновок, що антитіла II-4d та II-3b інгібують стадію утворення
протофібрил із молекул мономерного фібрину.

Можна було припустити, що монАТ II-4d, II-3b та їх Fab-фрагменти при
приєднанні до молекули фібрину порушують функціональну активність
відомого центру “a” в D-домені фібрину, який, як відомо, разом із
комплементарним йому центром “А” в Е-домені бере участь у побудові
протофібрил. Для перевірки цього припущення ми дослідили здатність
центру “a” D-фрагмента, що знаходився в складі імунного комплексу з
монАТ-інгібіторами, зв’язуватися з імобілізованим пептидом
Глі-Про-Арг-Про, який імітує комплементарний центр “А”. Виявилося, що як
сам D-фрагмент, так і його імунні комплекси з монАТ-інгібіторами
зберігали здатність приєднуватися до імобілізованого пептиду (рис. 4).
Таким чином, центр полімеризації, який блокується
антитілами-інгібіторами та їх Fab-фрагментами, не співпадає з відомим
центром “a”.

Конкурентний імуноферментний аналіз показав, що епітопи для обох
антитіл-інгібіторів не співпадають один з одним. Результати, одержані за
допомогою імуноблотаналізу, показали, що епітопи для монАТ II-4d та
II-3b знаходяться в ((?ланцюгу?D-димера. Обидва антитіла реагували лише
з одним продуктом хімотрипсинового гідролізату D-фрагмента з
молекулярною масою приблизно 28 кДа. Даний продукт відповідає
TSD-субфрагменту, який, як відомо, включає N-кінцеві частини (-, ?-?та
?-ланцюгів D-фрагмента [Medved L.V., et al, 1982]. Після відновлення
(-меркаптоетанолом?TSD-субфрагмента обидва антитіла реагували лише з
поліпептидним ланцюгом, який мав молекулярну масу 16 кДа (рис. 5). З
урахуванням попередніх імуноблотів і будови TSD-субфрагмента цей ланцюг
є NН2-кінцевим фрагментом (-ланцюга?D-фрагмента.

Таким чином, можна стверджувати, що епітопи для монАТ II-4d та II-3b, а
отже, і невідомий центр полімеризації знаходяться в NH2-кінцевій частині
(-ланцюга?D-домену фібрину. Цей центр (назвемо його умовно “с”) не
співпадає з відомим центром полімеризації «a», що знаходиться в
СООН-кінцевій частині (-ланцюга D-домену. Це означає, що побудова
протофібрил фібрину здійснюється не тільки за рахунок міжмолекулярної
взаємодії відомої пари центрів “A”-“a”, але й за рахунок, як мінімум, ще
однієї пари комплементарних центрів. Центр, комплементарний центру “с” у
D-домені фібрину, слід було шукати в Е-домені фібрину. Висока міжвидова
гомологія та експериментальні результати, які були одержані іншими
авторами, дозволяють нам припустити, що такий центр (назвемо його “С”)
знаходиться в амінокислотній послідовності В(15-53?фібрину, а саме у
фрагментах В(27-31 та/або В(41-45 (рис. 6).

Ми одержали три монАТ до N-ДСВ фібрину, епітопи для яких розташовані у
фрагменті В(15-53. Ці антитіла разом із їх Fab-фрагментами на 90-100%
інгібують полімеризацію фібрину. Попередній аналіз експериментальних
даних дозволяє сподіватися, що після локалізації епітопів для цих монАТ
за допомогою синтетичних пептидів ми зможемо локалізувати центр “С”.

Раніше нами було досліджена інгібіторна активність фрагмента В(15-118,
який був виділений нами з N-ДСВ фібрину і містив фрагмент В(15-53. Було
показано, що при 12оС навіть десятикратний молярний надлишок В(15-118
відносно фібрину інгібує його полімеризацію. Логічно було б припустити,
що цей фрагмент, який представляє частину Е-фрагмента та містить центр
полімеризації “В” (В(15-17), буде з’єднуватися з D-фрагментом, і що в
цьому з’єднані буде брати участь, як мінімум, пара комплементарних
центрів “В” та “b”. Утворення такого комплексу було показано нами за
допомогою нативного електрофорезу. Гель-фільтрація (HPLC) комплексу
В(15-118 із D-фрагментом при температурі 12оС показала, що профіль
елюції містив два піки (рис. 7).

< oeeeOOOIEE3/4OO°EEOO 6 & F ????????????????OqOqUq:[email protected]{I{†|?|?|$},}0} AI{†|$} & & gdHPN & . Таким чином, нами був вперше одержаний прямий експериментальний доказ існування нековалентної взаємодії D-фрагментів, а отже, і D-доменів фібрину в процесі полімеризації. Причому в даному випадку таку взаємодію слід було віднести не до DD-lat, а до DD-long типу взаємодій D-доменів фібрину, що знаходяться в одній нитці протофібрили, оскільки, у разі DD-lat контактів, комплекси фрагмента В?15-118 з D-димером повинні б були димеризуватися. Пізніше рентгеноструктурний аналіз, проведений групою Р.Дулитла, підтвердив наші дані та ідентифікував амінокислотні залишки, які беруть участь у нековалентних взаємодіях D-доменів [Spraggon G., et al, 1997]. За фізіологічних умов та помірних концентрацій тромбіну протофібрили досягають критичної довжини (в середньому 8 молекул фібрину в одній нитці протофібрили), при якій починається їх латеральна асоціація. На теперішній час завдяки рентгеноструктурному аналізу однозначно визначена локалізація центрів полімеризації фібрину, які експонуються в його (С-доменах (у фрагментах (350-360 та (370-380) після міжмолекулярної взаємодії центрів “А”-“а” та забезпечують первинну латеральну асоціацію протофібрил. Таким чином, було встановлено, що основний механізм латеральної асоціації протофібрил - це міжпротофібрилярні взаємодії з’єднаних пар D-доменів, в яких знаходяться вказані фрагменти молекули фібрину. Р. Дулитл та співр. припустили також існування вторинних центрів латеральної асоціації протофібрил, що експонуються в (-ланцюгах,?після взаємодії центрів “В”-“b” [Doolittle R. et al, 2000]. Цікавим є питання про роль комплементарних центрів “В”-“b” в полімеризації фібрину. Існують переконливі дані про те, що відщеплення більшої частини фібринопептідів В і, відповідно, формування центру “В” відбуваються лише після побудови протофібрил. Отже, центри “В” не можуть відігравати вирішальну роль в побудові протофібрил. З іншого боку, існує багато даних про роль центрів “В”-“b” у посиленні латеральної асоціації протофібрил. Згідно з припущенням Р. Дулитла після взаємодії центрів “В” та “b” у процесі полімеризації, (С-домени?молекул фібрину відходять від суперспірального регіону, і у фрагменті В(330-375?експонуються вторинні центри латеральної асоціації [Doolittle R. et al, 2000]. Проте в одній із останніх робіт Л. Медведя та співр. було показано, що для розходження вказаних регіонів у D-домені, окрім взаємодії центрів “А”-“а” та “В”-“b”, необхідна взаємодія принаймні ще однієї пари комплементарних центрів [Medved L. et al, 2002]. Результати наших досліджень свідчать про те, що один із таких центрів може знаходитись у фрагменті В(14-25. Ми одержали монАТ 2d-2а проти N-ДСВ фібриногену й виділили окремі поліпептидні ланцюги, що входять до складу цього фрагмента – А(1-5???В??????, (1-78. Потім ми одержали N-ДСВ фібрину та його складові поліпептидні ланцюги – А(17-51??В???????, (1-78, а також ізольовані фібринопептиди А (А(1-16) і В (В(1-14). При використанні всіх вказаних фрагментів ми показали, що епітоп для монАТ 2d-2а включає амінокислотні залишки, розташовані ліворуч та праворуч від зв’язку В(14-15, який розщеплюється тромбіном (рис. 8). Ці монАТ на 60% інгібували латеральну асоціацію протофібрил фібрину дезАА, який зберігав фібринопептид В (і, отже, епітоп для цих монАТ) при еквімолярному співвідношенні до фібрину. Fab-фрагменти цих антитіл інгібували полімеризацію фібрину дезАА на 100% при молярному співвідношенні їх до фібрину, як 2 : 1 (рис. 9). Це свідчило про те, що інгібіторний ефект монАТ 2d-2а був зумовлений не стеричною перешкодою, а блокуванням центру латеральної асоціації протофібрил у результаті приєднання монАТ до свого епітопу в молекулі фібрину. Враховуючи локалізацію епітопу для монАТ 2d-2а, цей центр повинен включати амінокислотні залишки, що розташовані ліворуч та праворуч від зв’язку В(14Арг-15Глі. Таким чином, знайдений нами центр латеральної асоціації протофібрил для свого функціонування не вимагає відщеплення фібринопептидів В. Дані, одержані пізніше іншими дослідниками, підтвердили наші результати. Так, С. Лорд та співр., використовуючи рекомбінантний фібриноген, де залишок В?14?Арг (який входить в епітоп для нашого монАТ 2d-2а) був замінений на гістидин, показали істотне ослаблення латеральної асоціації протофібрил фібрину desAA, одержаного з такого фібриногену [S. Lord et al, 2003]. Крім того, іншими авторами [Hsieh Kun-hwa, 1997] було показано, що пептид В?20-25, який знаходиться поблизу від пептидного зв’язку В(14-15, є сильним інгібітором полімеризації фібрину. Таким чином, наші дані й результати, одержані іншими авторами, свідчать про те, що в ділянці В?14-25?знаходиться один із центрів латеральної асоціації протофібрил. Цей центр для свого функціонування не вимагає відщеплення фібринопептиду В та бере участь у латеральній асоціації протофібрил фібрину дезАА разом з центрами в (С-доменах ((350-360 та (370-380). Після відщеплення фібринопептиду В (В(1-14) частина виявленого нами центру В?14-25, що розташована праворуч від зв’язку В?14-15 (ймовірніше за все В?20-25), можливо, залишається зв’язаною з комплементарним йому центром у (С-домені фібрину (який на сьогоднішній день невідомий), а центр “В” (В?15-17), що експонується при цьому, взаємодіє з комплементарним йому відомим “b” центром також у (С-домені (рис. 10). Можна припустити, що тільки після таких взаємодій (С-домени??кожної молекули фібрину відходять від суперспіральних регіонів молекули. При цьому в (С-доменах експонуються вторинні центри латеральної асоціації протофібрил (у фрагменті В(330-375 згідно з припущенням Р. Дулитла), а в суперспіральному регіоні експонується плазміноген-зв’язуючий сайт, який розташований у фрагменті А(148-160 [R. Doolittle et al, 2000]. Таким чином, наші результати та дані інших дослідників поясняють висновок про те, що для розходження (С-домену та суперспірального регіону молекули фібрину, окрім взаємодії центрів “А”- “а” та “В”- b”, необхідна взаємодія, принаймні, ще однієї пари комплементарних центрів [L. Medved et al, 2002]. Цікавим є також і інше питання: взаємодія центрів “В”-“b” відбувається всередині протофібрили чи між протофібрилами. Проведене нами комп’ютерне моделювання, засноване на даних рентгеноструктурного аналізу, свідчить про те, що можливі обидва варіанти взаємодії (рис. 10). Проте необхідно пам’ятати, що обидва варіанти взаємодії реалізуються на рівні вже сформованої протофібрили, тобто не беруть участі в побудові протофібрил. При цьому в обох випадках (С-домени?віддаляються від суперспіральних регіонів молекули фібрину та експонуються вторинні центри латеральної асоціації. Дані, одержані раніше Д. Вейзелем та Ю. Веклічем, підтверджують цю гіпотезу [Weisel J.W. et al, 1993]. Ними було показано, що товщина фібрил фібрину, утворених при дії тромбіну на фібриноген, була завжди більшою за товщину фібрил, сформованих у результаті полімеризації фібрину дезААВВ. При розгляді механізмів латеральної асоціації протофібрил неминуче виникає питання: яким чином досягається зростання фібрили в довжину, враховуючи те, що її довжина в середньому в 5-6 разів більша за довжину протофібрили. Деякі автори пояснюють це за допомогою гіпотези, згідно якої протофібрили взаємодіють не всією своєю довжиною, а з певним зсувом одна відносно одної. Ми не виключаємо цей механізм зростання фібрили в довжину. Проте відомо, що при формуванні сітки фібрину спочатку утворюється тривимірний каркас, що складається з тонких і довгих фібрил. Ми пояснюємо цей факт таким чином: на кінцях кожної протофібрили та фібрили, виходячи з механізму утворення протофібрили, мають бути присутніми “липкі” кінці, які є напівмолекулами фібрину з невикористаним набором усіх центрів, що беруть участь у побудові протофібрили. За рахунок взаємодії таких “липких” кінців протофібрили та тонкі фібрили подовжуються до точки галуження. Локалізація неоантигенної детермінанти в D-димері фібрину людини. Руйнування фібринової сітки відбувається за рахунок ферментативної дії плазміну. Вже на протофібрилах відбувається активація плазміногену під дією t-РА і перетворення його в плазмін. Полімерний фібрин гідролізується плазміном до розчинних фрагментів. Серед кінцевих продуктів гідролізу фібрину особливе місце займає D-димер. Кількісне визначення D-димеру в плазмі крові має велике діагностичне значення при захворюваннях, за яких відбувається активація системи зсідання крові та фібринолізу. Якщо концентрація D-димеру в плазмі крові не перевищує верхньої межі норми (0,5 мкг/мл), то це на 98-100% дозволяє виключити такі діагнози, як тромбоз глибоких вен і тромбоемболію легеневих артерій. Це економить час та матеріальні витрати, скорочуючи складні діагностичні процедури. Навпаки, підвищена концентрація D-димеру може свідчити про вищезазначені діагнози, а також про ДВС-синдром, ішемічний інсульт головного мозку, інфаркт міокарду, онкологічні захворювання та інші патології. Серед 16 гібридом, одержаних після імунізації мишей ізольованим нами D-димером, була знайдена тільки одна гібридома, яка продукувала монАТ, специфічні до D-димеру без перехресної реакції з фібриногеном і фібрином. Ми назвали їх III-3b. МонАТ III-3b реагували з D-димером із КD = 1,43•10-10 М. За допомогою непрямого конкурентного імуноферментного аналізу була показана відсутність перехресної реакції монАТ III-3b із фібриногеном (рис. 11). Це означало, що епітоп для монАТ III-3b є неоантигенною детермінантою, яка експонується в D-димері в процесі фібринолізу. Для локалізації епітопу для монАТ III-3b у молекулі D-димеру нами були одержані й використані поліпептидні ланцюги ???та ?, що входять до складу?D-димеру, субфрагмент D46, що включає NH2-кінцеві ділянки ланцюгів D-димеру та бромціанові субфрагменти D-фрагмента. Дані іммуноферментного аналізу дозволили зробити попередній висновок, що епітоп для монАТ III-3b знаходиться в NH2-кінцевій частині (-ланцюга D-димеру. Імуноблотаналіз підтвердив, що монАТ III-3b реагують із (-ланцюгом??D-димеру. Для точнішої локалізації епітопу для монАТ III-3b ми провели імуноблотаналіз бромціанового гідролізату D-фрагмента фібриногену. Аналіз одержаних нами даних та відомої первинної структури бромціанових субфрагментів D-фрагмента показав, що епітоп для монАТ III-3b знаходиться у фрагменті B?134-190?D-димеру та, найімовірніше, розташований у фрагменті B?155-160. Використовуючи дані рентгеноструктурних аналізів фібриногену та D-димеру, ми визначили, що фрагмент В?155-160 у молекулі фібриногену прихований у суперспіральній області, а у випадку D-димеру знаходиться в неструктурованій ділянці (рис. 12). На основі антитіла III-3b ми розробили перший варіант імуноферментного методу кількісного визначення концентрації D-димеру в плазмі крові людини. У даному методі на планшеті імобілізуються антитіла III-3b, а визначення кількості D-димеру, що зв’язався з ними, проводять із використанням біотинильованих монАТ II-4d. Розроблений нами метод дозволяє визначати D-димер у плазмі крові в діапазоні концентрацій 0,15 мкг/мл – 10 мкг/мл, який достатній для діагностичного визначення D-димеру при різних захворюваннях. ВИСНОВКИ Відкрито невідомі раніше центри полімеризації фібрину, які функціонують на різних етапах полімеризаційного процесу. Створено нову модель формування тривимірної сітки фібрину, яка є каркасом будь-якого тромбу. Виявлено невідому раніше антигенну детермінанту в D-димері фібрину, яка експонується в процесі фібринолізу. Розроблено метод кількісного аналізу NH2-кінцевих амінокислот фібриногену та фібрину, який дозволив ідентифікувати форми фібрину дезАА та дезААВВ. Показано, що полімеризація фібрину дезАА здійснюється, головним чином, за рахунок електростатичних і водневих взаємодій, а при полімеризації фібрину дезААВВ додатково включаються й гідрофобні взаємодії. Виявлено здатність до димеризації комплексів D-фрагмента з фрагментом В(15-118?фібрину. Зроблено висновок про існування нековалентних взаємодій між D-доменами при побудові протофібрил фібрину. Показано існування центру латеральної асоціації протофібрил фібрину в NH2-кінцевій частині В(-ланцюга?фібриногену, який для свого функціонування не потребує відщеплення фібринопептиду В. Встановлено існування невідомого раніше центру полімеризації фібрину, який необхідний для побудови протофібрил. Цей центр знаходиться у NH2-кінцевій частині ??ланцюга?D-домену фібрину. Зроблено висновок, що побудова протофібріл фібрину здійснюється не тільки за рахунок міжмолекулярної взаємодії відомої пари центрів "A"-"a", але й за рахунок, як мінімум, ще однієї пари комплементарних центрів. Одержано монАТ (III-3b), яке специфічно реагує з D-димером фібрину людини без перехресної реакції з фібриногеном і фібрином. Епітоп для монАТ III-3b знаходиться у фрагменті В(????????D-димеру, ймовірно, в В(155-160. Таким чином, цей фрагмент є антигенною детермінантою, яка експонується в процесі гідролізу фібрину плазміном. Показано, що монАТ III-3b може бути використане для кількісного визначення D-димеру в плазмі крові людини з діагностичною метою. список опублікованих праць за темою дисертації. Луговской Э.В., Белицер В.А. Исследование механизма полимеризации фибрина с помощью нейтральных солей // Биохимия. – 1971. – 36, №1. – С. 129-137. Луговськой Е.В., Дерзська С.Г., Гоголінська Г.К., Литвинова Л.М. Кількісне визначення NH2-кінцевих амінокислот фібрину за методом Едмана з застосуванням тонко-шарової хроматографії // Укр. біохім. журн. – 1975. – 47, №6. – С. 760-768. Позднякова Т.М., Луговской Э.В., Мусялковская А.А., Демченко А.П. Новые данные относительно структуры фибриногена. Обзор // Укр. биохим. журн. – 1975. – 47, №2. – С. 247-261. Луговской Э.В., Гоголинская Г.К., Дерзская С.Г. Роль отщепления фибринопептида В в активации фибриногена тромбином // ДАН УРСР. – 1977. – №8. – С. 732-735. Луговской Э.В., Белицер В.А., Гоголинская Г.К., Дерзская С.Г. Свойства двух форм мономерного фибрина, различающегося по степени активации тромбином. Характеристика последовательно образующихся активных центров // Биохимия. – 1978. – 43, №6. – С. 1045-1053. Луговской Э.В., Белицер В.А., Гоголинская Г.К., Дерзская С.Г. Царюк Л.А. Свойства двух форм мономерного фибрина, различающегося по степени активации тромбином. ІІ. Отношение полимеризации этих форм фибрина к специфическим ингибиторам // Биохимия. – 1978. – 43, №7. – С. 1056-1061. Зима В.Л., Луговской Э.В., Медведь Л.В., Гоголинская Г.К., Привалов П.Л. Структурная организация и локализация С-концевых участков (-цепей в молекуле фибриногена // ДАН СССР. – 1981. – 256, №2. – С. 480- 482. Луговской Э.В. Первичная структура фибриногена и ее связь с конформацией и биологической функцией белка молекулы. Обзор // Укр. биохим. журн. – 1982. – 54, №5. – С. 578-594. Belitser V.A., Lugovskoi E.V., Musjalkovskaja A.А., Gogolinskaja G.K. Quantitation of the inhibitory effect of fibrinogen and its degradation products on fibrin polymerization // Throm. Res. – 1982. – 27, N3. – Р. 261-269. Угарова Т.П., Луговской Э.В., Горкун О.В., Дерзская С.Г. Исследование стабильности промежуточных полимеров фибрина, образующихся в системе фибриноген-фибрин // Укр. биохим. журн. – 1983. – 55, №3. – С. 254-260. Луговской Э.В., Гоголинская Г.К., Дерзская С.Г. Исследование криокомплексов фибриногена и фибрина методом количественного анализа N-концевых аминокислот // Укр. биохим. журн. – 1983. – 55, №3. – С. 250-253. Белицер В.А., Луговской Э.В., Угарова Т.П. Взаимодействие фибриногена с двумя формами фибрина, различающимися по степени активации тромбином // Биохимия. – 1985. – 50, №8. – С. 1336-1341. Чудновец В.С., Луговской Э.В., Гоголинская Г.К., Дерзская С.Г., Назимов И.В., Комисаренко С.В. Выделение NH2-концевых дисульфидных узлов фибриногена и фибрина человека и фрагментов полипептидных цепей, входящих в их состав // Доклады АН СССР. – 1991.– 317, №6. – С.1496-1499. Луговской Э.В., Макогоненко Е.М., Чудновец В.С., Дерзская С.Г., Гоголинская Г.К., Колесникова И.Н., Буханевич А.М., Ситак И.Н., Ляшко Е.Д., Комисаренко С.В. Применение моноклональных антител для исследования процессов полимеризации фибрина // Доклады АН СССР. – 1991.– 318, №1. – С. 224-227. Lugovskoi E.V., Makogonenko E.M., Chudnovets V.S., Derzskaya S.G., Gogolinsikaja G.K., Kolesnikova I.N., Bukhanevich A.M., Komisarenko S.V. The study of fibrin polymerization with monoclonal antibodies // Biomedical science. – 1991. – 2. – Р. 249-296. Макогоненко Е.М., Луговской Э.В., Колесник Л.А., Кудинов С.А. О функциональном и диагностическом значеии А-, ВВ1-42, ВВ 15-42 пептидных фрагментов фибрин(оген)а // Укр. биохим. журн. – 1992.– 64, №4. – С. 78-82. Луговской Э.В., Позднякова Т.М., Макогоненко Е.М., Степанова Л.Л., Дерзская С.Г., Гоголинская Г.К., Михаловская Л.И., Мороз. Е.Д., Комисаренко С.В. Комплексообразование димерного Д-фрагмента с NH2-концевым дисульфидным узлом фибрина // ДAН України. – 1994. – №6.– С. 146-150. Луговской Э.В., Макогоненко Е.М., Чудновец В.С., Дерзская С.Г., Гоголинская Г.К., Колесникова И.Н., Михаловская Л.И., Комисаренко С.В. Исследование полимеризации фибрина с помощью моноклональных антител 2d-2a и их Fab-фрагментов // Укр. биохим. журн. – 1995. – 67, №1. – С. 64-71. Луговской Э.В., Макогоненко Е.М.,Чудновец В.С., Дерзская С.Г., Гоголинская Г.К., Михаловская Л.И., Комисаренко С.В. Фибриновый фрагмент (15-118. Ингибиторные и комплексообразующие свойства // Укр. биохим. журн. – 1995. – 67, №4. – С. 57-64. Луговской Э.В., Позднякова Т.М., Sederholm-Willams, Комисаренко С.В. Структура и механизм функционирования центров полимеризации фибрина // Укр. биохим. журнал. – 1996. – 68, №6. – С. 3-17. Lougovskoi E.V., Gogolinskaya G.K., Preparation of fibrin des-AA by thrombin // Укр. біохім. журн. – 1999. – 71, №4. – P.107-108. Lugovskoi E.V., Komisarenko S.V. The use of monoclonal antibodies for studying the fibrin polymerization // Russian Journal of Bioorganik Chemistry. – 2000. –26, N12. – Р.791-798. Луговской Э.В., Чудновец В.С., Гоголинская Г.К., Колесникова И.Н., Ляшко Е.Д., Литвинова Л.М., Матсуэда Г.Р., Комисаренко С.В. Влияние моноклональных антител к N-концевому фрагмента В(-цепи фибриногена на полимеризацию фибрина // ДАН України. – 2001. – №10. – C. 190-194. Луговской Э.В., Колесникова И.Н., Золотарева Э.Н., Чернишов В.И., Гриценко П.Г., Гоголинская Г.К., Веселовская Л.Д., Ляшко Е.Д., Литвинова Л.М., Костюченко Е.П., Петрова Ю.И., Комиссаренко С.В. Новый сайт полимеризации фибрина // ДАН України. – 2001. – №11. – С. 167-170. Lugovskoy E.V., Zolotareva E.N., Gogolinskaya G.K., Gritsenko P.G., Moroz E.D., Komisarenko S.V. Polymerization Sites in the D-Domain of Human Fibrin(ogen) // Biochemistry. – 2002. – 67, N4. – P. 446-450. Луговской Э.В., Гриценко П.Г., Скурский С.И., Комисаренко С.В. Роль ионов Са в полимеризации фибрина // Укр. биохим. журн. – 2002. – 74, №3. – С. 5-9. Lugovskoi E.V., Gritsenko P.G., Kolesnikova I.N., Zolotareva E.N., Gogolinskaya G.K., Lyashko E.D., Litvinova L.M., Petrova J.I., Kostuchenko E.P., Komisarenko S.V. Neoantigenic determinant in the D-dimer fragment of fibrin // Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine. – 2002. – N 2. – P. 188-191. Lugovskoi E.V., Kolesnikova I.N., Gritsenko P.G., Zolotareva E.N., Gaffney P., Nieuwenhuizen W., Komisarenko S.V. A neoantigenic determinant in the D-dimer fragment of fibrin // Throm. Res. – 2002. – 107, N 3-4. – P. 151-156. Луговской Э.В. Молекулярные механизмы образования фибрина и фибринолиза. Физико-химический и иммунохимический анализ (монография) // Наукова думка, Київ. – 2003 р. – 224 с. Луговськой Е.В., Гриценко П.Г., Колеснікова І.М., Золотарьова Е.М., Чернишов В.І., Гоголінська Г.К., Ляшко Є.Д., Литвинова Л.М., Костюченко О.П., Петрова Ю.І., Комісаренко С.В. Новий центр полімеризації фібрину у його D-домені, який необхідний для побудови протофібрил // ДАН України. - 2004. - №1.– С.171-176. Lugovskoy E.V., Gritsenko P.G., Kolesnikova I.N., Zolotareva E.N., Chernishov V.I., Nieuwenhuizen W., Komisarenko S.V. Two monoclonal antibodies to D-dimer – specific inhibitors of fibrin polymerization // Thromb. Res. – 2004. – 113, N 3-4, P. 251-259. АНОТАЦІЯ Луговськой Е.В. “Молекулярні механізми утворення фібрину та фібринолізу” – Монографія. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2004. Дисертація присвячена пошуку раніше невідомих центрів полімеризації фібрину та створенню нової моделі формування тривимірної сітки фібрину – каркаса тромбу, а також одержанню моноклональних антитіл (монАТ), специфічних до головного продукту фібринолізу – D-димеру, для дослідження його антигенної структури та використання цих монАТ для кількісного визначення D-димеру в плазмі крові людини. Головна концепція даної роботи, яка сформувалася після аналізу літературних даних, полягає в тому, що кожна стадія полімеризації фібрину здійснюється не однією парою комплементарних центрів, як вважали раніше, а як мінімум двома парами. Для пошуку нових центрів полімеризації в цій роботі були використані монАТ як молекулярні зонди. З їх допомогою було показано існування невідомого раніше центру латеральної асоціації протофібрил фібрину в NH2-кінцевій частині В(-ланцюга фібриногену, який для свого функціонування не вимагає відщеплення фібринопептиду В. Показано існування нового центру полімеризації фібрину, який необхідний для побудови протофібрил. Цей центр локалізований в NH2-кінцевій частині (-ланцюга D-домену фібрину і не співпадає з відомим центром “а”, який розташований в СООН-кінцевому фрагменті (-ланцюга D-домену. Зроблено висновок, що побудова протофібрил фібрину здійснюється не тільки за рахунок міжмолекулярної взаємодії відомої пари центрів “A”-“a”, але й за рахунок, як мінімум, ще однієї пари комплементарних центрів. Одержано монАТ III-3b проти D-димеру людини, епітопу для якого співпадає з невідомою раніше антигенною детермінантою, що формується в процесі гідролізу фібрину плазміном. Показано, що монАТ III-3b може бути використано для кількісного визначення D-димеру в плазмі крові людини з діагностичною метою. Ключові слова: фібрин, центри полімеризації, D-димер фібрину, моноклональні антитіла, епітопи, неоантигенна детермінанта. АННОТАЦИЯ Луговской Э.В. “Молекулярные механизмы образования фибрина и фибринолиза.” – Монография. Диссертация на соискание учёной степени доктора биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Институт биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины, Киев, 2004. Диссертационная работа посвящена поиску ранее неизвестных центров полимеризации фибрина и созданию новой модели формирования трёхмерной сети фибрина – каркаса тромба, а также получению монАТ, специфических к главному продукту фибринолиза – D-димеру для исследования его антигенной структуры и использования этих монАТ для количественного определения D-димера в плазме крови человека. В работе представлены результаты физико-химических исследований известных центров полимеризации фибрина и описаны открытые нами ранее неизвестные центры полимеризации в Е- и D-доменах фибрина. Полученные результаты позволили создать новую модель процесса самосборки трёхмерной сети фибрина – яркого примера полимеризации биологических макромолекул. В крови человека существуют две антагонистичные системы – свёртывания крови и фибринолиза. Первая приводит к образованию растворимого фибрина и/или формированию тромба, вторая – к их расщеплению. В результате активации системы свёртывания крови образуется тромбин, который отщепляет от фибриногена два фибринопептида А, и образуется фибрин дезАА. Фибрин дезАА способен к спонтанной полимеризации, которая осуществляется в несколько стадий. На первой стадии из мономерных молекул фибрина формируются протофибриллы, а на второй стадии протофибриллы после достижения критической длины ассоциируют латерально с образованием фибрилл. Фибриллы также ассоциируют латерально, ветвятся и образуют трёхмерную сеть фибрина. Фактор XIIIa стабилизирует протофибриллы и фибриллы путём соединения соседних молекул фибрина ковалентными связями. На уровне протофибрилл резко ускоряется отщепление фибринопептидов В и молекулы фибрина дезАА в составе полимерного фибрина превращаются в фибрин дезААВВ. В настоящее время общепринятым является то, что самосборка мономеров фибрина дезАА осуществляется только одной парой комплементарных центров “А”-“а”, а после образования фибрина дезААВВ в построении фибриновой сети принимает участие и пара центров “B”-“b”. Однако, существует целый ряд данных, которые позволяют предположить, что в полимеризации фибрина принимают участие и другие пары комплементарных центров. Известно, что уже на уровне протофибрилл происходит превращение плазминогена в плазмин, который расщепляет фибрин с образованием различных растворимых фрагментов. Главным из этих фрагментов является D-димер, имеющий большое диагностическое значение. В диссертационной работе впервые показано, что полимеризация фибрина дезАА осуществляется главным образом за счёт электростатических и водородных взаимодействий, а после образования фибрина дезААВВ дополнительно включаются и гидрофобные взаимодействия. Для идентификации фибринов дезАА и дезААВВ, которые получались при действии на фибриноген тромбина, автором впервые был разработан метод количественного анализа NH2-концевых аминокислот фибриногена и двух форм фибрина. Ранее в течение долгого времени обсуждался вопрос о возможном межмолекулярном взаимодействии периферических D-доменов фибрина в процессе его полимеризации. В данной работе была открыта способность к димеризации комплексов D-фрагмента с фрагментом В(15-118 фибрина, что явилось первым прямым экспериментальным доказательством существования нековалентных взаимодействий между D-доменами при полимеризации фибрина. Основная концепция данной работы, которая сформировалась после анализа литературных данных, заключается в том, что каждая стадия полимеризации фибрина осуществляется не одной парой комплементарных центров, как полагали ранее, а как минимум двумя парами. Для поиска новых центров полимеризации в этой работе были использованы моноклональные антитела в качестве молекулярных зондов. С их помощью было показано существование неизвестного ранее центра латеральной ассоциации протофибрилл фибрина в NH2-концевой части В(-цепи фибриногена, который для своего функционирования не требует отщепления фибринопептида В. Показано существование нового центра полимеризации фибрина, который необходим для построения протофибрилл. Этот центр локализован в NH2-концевой части ?-цепи D-домена фибрина и не совпадает с известным центром “а”, который расположен в СООН-концевом фрагменте ?-цепи D-домена. Сделан вывод, что построение протофибрилл фибрина осуществляется не только за счет межмолекулярного взаимодействия известной пары центров “A”-“a”, но и за счёт, как минимум, еще одной пары комплементарных центров. В диагностике таких заболеваний человека как тромбоз глубоких вен и тромбоэмболия лёгочных артерий огромную роль играет количественное определение D-димера в плазме крови. Против выделенного нами D-димера фибрина человека было получено моноклональное антитело (III-3b), которое специфически реагирует с D-димером без перекрестной реакции с фибриногеном и мономерным фибрином. Эпитоп для антитела III-3b находится во фрагменте В(134-190 D-димера, вероятнее всего, в В(155-160. Таким образом, была обнаружена неоантигенная детерминанта в D-домене фибрина, которая экспонируется в процессе гидролиза фибрина плазмином. В модельных опытах с применением донорских плазм и полученного нами D-димера было показано, что моноклональное антитело III-3b может быть использовано для количественного определения D-димера в плазме крови человека в диагностических целях. Ключевые слова: фибрин, центры полимеризации, D-димер фибрина, моноклональные антитела, эпитопы, неоантигенная детерминанта. SUMMARY Lugovskoy E.V. “Molecular mechanisms of fibrin formation and fibrinolysis”. – Monograph. Thesis for a degree of Doctor of biological sciences on speciality 03.00.04 – Biochemistry. – Palladin Institute of Biochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2004. The dissertation is devoted to the search of unknown fibrin polymerization sites and to the creation of a new model of the formation of fibrin three-dimensional network – framework for thrombus. The dissertation is also devoted to production of mAb, specific to the main fibrinolysis product – fibrin D-dimer for the investigation of its antigen structure and for the usage of these mAb for quantification of D-dimer in human blood plasma. The known fibrin polymerization sites have been characterized and unknown polymerization sites in E- and D- domains of human fibrin molecule have been discovered using monoclonal antibodies. The localization of the new neoantigenic determinant in fibrin D-dimer has been found. It has been shown that fibrin desAA polymerization is carried out mainly by electrostatic and hydrogen bonds and hydrophobic interactions are additionally involved in polymerization process in the case of fibrin desAABB. The tendency for dimerization of the complexes of D-dimer with fibrin fragment B(15-118 was discovered. The conclusion was drawn about the existence of noncovalent intermolecular interactions of fibrin D-domains during fibrin polymerization. The site of protofibril lateral association was found in NH2-terminal fragment of fibrinogen B(-chain. This site can function without splitting off the fibrinopeptide B. The unknown site of fibrin polymerization, which takes part in protofibril formation, was discovered. This site proved to be localized in NH2-terminal part of (-chain of fibrin D-domain to the contrary of the known site “a”, which is situated at COOH-terminal fragment of (-chain of D-domain. We suggest that protofibril formation is carried out not only by the known pair of sites “A”-“a” but also by another pair of unknown polymerization sites one of which being discovered in this work. Monoclonal antibody III-3b has been obtained, which reacts specifically with D-dimer of human fibrin without cross-reaction with fibrinogen and fibrin. Epitope for monoclonal antibody III-3b was localized in D-dimer fragment B(134-190, most probably – in B(155-160. Thus this fragment is the neoantigenic determinant, which is exposed during fibrin hydrolysis by plasmin. It has been also shown that monoclonal antibody III-3b can be successfully used for quantification of D-dimer in human blood plasma for diagnostic aims. Key words: fibrin, polymerization sites, fibrin D-dimer, monoclonal antibodies, epitopes, neoantigenic determinant. PAGE 1 доктор біологічних наук, академік НАН України Комісаренко Сергій Васильович, завідувач відділу молекулярної імунології, директор Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України. доктор біологічних наук, академік НАН України Єльська Ганна Валентинівна, завідувач відділу механізмів трансляції генетичної інформації, директор Інституту молекулярної біології та генетики НАН України; доктор біологічних наук, професор Кібірєв Володимир Костянтинович, завідувач відділу хімії білка Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України; доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Літошенко Олександр Якович, керівник лабораторії молекулярної генетики Інституту геронтології АМН України. Київський національний університет імені Тараса Шевченка, кафедра біохімії. Рис. 6. Амінокислотна послідовність фрагмента В(15-53?фібрину людини, в якій представлена можлива локалізація центру полімеризації “С”. Рис. 7. Профіль елюції гель-фільтраційного розділення суміші D-фрагмента та В?15-118 при температурі 12° С. Рис. 8. Амінокислотна послідовність NH2-кінцевої частини (-ланцюга фібрину людини. Епітоп для монАТ 2d-2а включає амінокислотні залишки, розташовані ліворуч та праворуч від зв’язку В(14Арг - В(15 Глі, який розщеплюється тромбіном. Рис. 9. Залежність швидкості латеральної асоціації протофібрил фібрину desAA (V) від молярного співвідношення монАТ 2d-2a чи їх Fab- фрагментів до фібрину. b D D Рис. 10. Модель взаємодії молекули фібрину зі спареними D-доменами інших молекул фібрину, що належать двом різним протофібрилам. Модель створена на основі даних рентгеноструктурного аналізу [Yang Z., et al, 2001; Everse S.J., et al, 1998] та комп’ютерного моделювання, що було проведене нами. (С-(С – міждоменні взаємодії центрів первинної латеральної асоціації протофібрил, що розташовані у фрагментах (350-360 та (370-380; (С-(С – міждоменні взаємодії центрів вторинної латеральної асоціації протофібрил, що розташовані у фрагментах В(330-375.

Похожие записи