.

Молекулярні механізми перенесення сигналів регуляторів функції кори надниркових залоз (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 5515
Скачать документ

ІНСТИТУТ ЕНДОКРИНОЛОГІЇ ТА ОБМІНУ РЕЧОВИН

ІМ. В.П.КОМІСАРЕНКА АМН УКРАЇНИ

КОВЗУН Олена Ігорівна

УДК 612.453-092.9:576.32/.36

Молекулярні механізми перенесення сигналів регуляторів функції кори
надниркових залоз

14.01.14 – ендокринологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора

біологічних наук

Київ – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі патофізіології ендокринної системи Інституту

ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України

Науковий консультант – доктор медичних наук, професор,

член-кореспондент НАН та АМН України

ТРОНЬКО Микола Дмитрович, Інститут ендокринології та

обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України,

завідувач відділу патофізіології ендокринної системи

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор,

член-кореспондент НАН та АМН України

РЕЗНІКОВ Олександр Григорович, Інститут ендокринології та

обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України,

завідувач відділу ендокринології репродукції та адаптації

доктор біологічних наук, професор

ДРОБОТ Людмила Борисівна, Інститут біохімії

ім. О.В. Палладіна НАН України,

завідувач лабораторії сигнальних механізмів клітини

доктор медичних наук, старший науковий співробітник

ХИЖНЯК Оксана Олегівна, Державна установа Інститут проблем ендокринної
патології ім. В.Я. Данилевського АМН України,

завідувач відділу клінічної ендокринології

Захист відбудеться 25.03. 2008 р. о 13_ год. на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 26.558.01 з ендокринології в Інституті

ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України

(04114, м. Київ-114, вул. Вишгородська, 69).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту ендокринології
та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України (04114, м. Київ-114,
вул. Вишгородська, 69).

Автореферат розісланий 21.02.2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук
Калинська Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. При розгляді дистантних хімічних сигналів, що
сприймаються клітиною, віднесення гормонів до особливої категорії
поступово втрачає сенс. По-перше, встановлено, що деякі класичні
гормони, можливо значна їх частина, продукуються в багатьох тканинах
організму, а не тільки в спеціалізованих залозах. По-друге, з’ясувалося,
що низка біорегуляторів не мають різниці за механізмами дії на клітину
порівняно з гормонами і навіть володіють еволюційною спорідненістю з
ними. Мова йде в першу чергу про ростові чинники, цитокіни і
нейропептиди, що також здійснюють свою дію через специфічні клітинні
рецептори. Базисна парадигма клітинної ендокринології у зв’язку з цим
істотно розширилася. Так, зараз вважається, що класична ендокринна
регуляція клітинних функцій є лише одним з її різновидів. Існують також,
як мінімум, паракринний і аутокринний типи регуляції. Перегляд
зазначених теоретичних постулатів, з одного боку, привів базисні
уявлення в більшу відповідність з реальністю, з іншого боку, розділи,
присвячені молекулярній біології клітини, ендокринології, імунології,
нейробіології і експериментальній онкології, зараз важко відокремити. Ще
більшу спільність процесів, що вивчаються цими розділами науки, виявлено
завдяки бурхливому прогресу в з’ясуванні внутрішньоклітинних механізмів
дії біорегуляторів. Спільність ця базується на тому, що процес
перенесення інформації від рецепторів на внутрішньоклітинні ланки не
залежить від того, чи йде мова про рецептор гормону або іншого
біорегулятора. Всі вони використовують спільні сигнальні каскади шляхом
активації одного або декількох з безлічі неймовірно складних
внутрішньоклітинних механізмів обробки і перенесення регуляторної
інформації.

Протягом багатьох років вважалося, що регуляція функції надниркових
залоз здійснюється за допомогою двох факторів: АКТГ, який головним чином
контролює глюкокортикоїдну функцію, та ангіотензину II, який є основним
регулятором мінералокортикоїдної функції. Але функція надниркових залоз
може регулюватися не тільки через вплив на швидкість стероїдогенезу, але
й шляхом зміни маси функціонуючої залози. У зв’язку з цим регуляція
мітогенезу та апоптозу також може робити свій внесок до загальної
функціональної відповіді надниркових залоз. Цей аспект привернув увагу
дослідників лише в останні роки. Тривалий час внутрішньоклітинний
механізм дії основних стероїдогенних регуляторів здавався досить чітким:
ефекти АКТГ опосередковуються через cAMP-залежний каскад протеїнкінази
А, а ангіотензину ІІ – через фосфоінозитидний цикл із залученням
протеїнкінази С, а також шляхом регуляції транспорту Са2+[Gallo-Payet et
al., 2003; Vinson et al., 1992]. Проте дослідження останніх років
показали, що cAMP-залежна система перенесення сигналу АКТГ взаємно
регулюється сигнальним каскадом, залежним від протеїнкінази С. В той же
час зміни активності протеїнкінази С при різних патологіях надниркових
залоз, участь окремих ізоформ протеїнкінази С у перенесенні сигналу
АКТГ, їх розподіл у різних клітинних компартментах залишаються
нез’ясованими.

До факторів регуляції адренокортикальної функції відносяться також
естрогени. Естрогени здатні безпосередньо впливати на кору надниркових
залоз, а також змінювати чутливість гіпофіза до КРФ та інших
нейропептидів гіпоталамуса. Про прямий вплив естрогенів на кору
надниркових залоз свідчить наявність рецепторів естрогенів у клітинах
кори надниркових залоз щурів, а також стимуляція секреції кортизолу
адренокортикоцитами людини за умов відсутності АКТГ [Caticha et al.,
1993]. До останнього часу аналіз механізмів впливу естрогенів на клітини
різних типів здебільшого був сконцентрований на геномних ефектах. Між
тим, участь систем вторинних месенджерів у цих процесах не
аналізувалась. Зараз розглядається можливість участі як cAMP-залежної
системи перенесення сигналу естрогенними гормонами, так і МАР-кіназної в
різних типах клітин, зокрема тих, що не відносяться до репродуктивної
сфери [Aronica et al., 1994; Vivacqua et al., 2006; Ronda et al.,
2007]. Водночас месенджерні механізми, що опосередковують дію естрогенів
у надниркових залозах, залишаються невідомими.

Як ймовірні модулятори адренокортикальної функції зараз привертають
увагу N-ацильовані похідні етаноламіну (NАЕ) [Гула та ін., 2000; Pagotto
et al., 2006]. Дослідження розподілу мічених [14C]-NAE в організмі
експериментальних тварин продемонструвало переважне включення мітки до
надниркових залоз. Оскільки в мозку виявлено незначну кількість міченого
N-пальмітоїлетаноламіну, малоймовірно, щоб ця сполука впливала на
стимуляцію утворення АКТГ. Внутрішньоклітинні механізми впливу NАЕ на
кору надниркових залоз потребують подальшого дослідження. З’ясування
основних етапів перенесення сигналу похідних етаноламінів є важливим для
визначення їх місця та значення в системі регуляції функції кори
надниркових залоз.

В регуляції адренокортикальної функції значну роль відіграють іони
калію. Відомо, що К+ здатний активувати гормонопоез при підвищенні його
вмісту в крові або інкубаційному середовищі. Крім того, він є необхідним
компонентом модулювання ефектів інших регуляторів, в першу чергу
ангіотензину II та кортикотропіну. Основною ланкою в опосередкуванні
ефектів калію в клітинах клубочкової зони кори надниркових залоз
вважається каскад, пов’язаний з Са2+/кальмодулін-залежною
протеїнкіназою [Ganguly et al., 1992; Condon et al., 2002]. Проте
істотна кількість накопичених фактів не відповідає класичній схемі
регуляції кортикостероїдогенезу, що свідчить про необхідність
поглибленого дослідження регуляції стероїдогенних процесів в
адренокортикоцитах, зокрема іонами калію.

Таким чином, перелік модуляторів адренокортикальної функції постійно
зростає і регуляція функції кори надниркових залоз в організмі на
сьогодні виглядає значно складнішою, ніж це уявлялося раніше.
Поліморфність протеїнкіназних каскадів, їх взаємодія, включення
внутрішньоядерних механізмів забезпечують адекватну регуляцію функції
адренокортикоцитів. У зв’язку з цим стає зрозумілим, що з’ясування місця
кожного з регуляторів адренокортикальної функції у комплексному
механізмі регуляції функції надниркових залоз та простеження поетапної
передачі сигналу первинних месенджерів за участю клітинних протеїнкіназ
є важливим питанням молекулярної ендокринології.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота
проводилась в рамках наукової тематики лабораторії гормональної
регуляції обміну речовин відділу патофізіології Інституту
ендокринології ім. В.П. Комісаренка АМН України (№
держреєстрації UА 01003067 Р, тема “Розробка підходів до підвищення
ефективності лікування хвороби Іценка-Кушинга, пухлин надниркових залоз
людини, а також раку молочної залози та простати” 1992-1994 рр.; №
держреєстрації 0198U001283, тема “Роль метаболізму фосфоліпідів в
перенесенні сигналів агоністів та модуляторів в клітинах кори
надниркових залоз” 1998-2000 рр.; № держреєстрації 0101U000618, тема
“Аналіз біохімічних механізмів перенесення регуляторних сигналів у
клітинах кори надниркових залоз тварин та пухлин надниркових залоз
людини” 2001-2004 рр.; № держреєстрації 0105U000732, тема
“Пострецепторна регуляція функції надниркових залоз різними модуляторами
в умовах норми та патології” 2005-2007 рр.).

Мета дослідження. З’ясувати основні етапи внутрішньоклітинного
перенесення сигналів регуляторів та модуляторів адренокортикальної
функції – АКТГ, естрадіолу, іонів калію, N-ацильованих похідних
етаноламіну для визначення їх впливу на систему функціональної відповіді
кори надниркових залоз.

Для реалізації поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

Вивчити внутрішньоклітинні механізми передачі сигналу АКТГ у
адренокортикоцитах:

– шлях, пов’язаний з активацією cAMP-залежної протеїнкінази А в тканинах
кори надниркових залоз людини;

– процеси активації протеїнкінази С в різних клітинних компартментах
адренокортикоцитів та розподіл різних ізоформ протеїнкінази С за
субклітинними фракціями у клітинах пухлин надниркових залоз людини;

– рівень експресії рецепторних тирозинкіназ у пухлинах надниркових
залоз людини;

можливість реалізації ефектів кортикотропіну через МАР-кіназний
сигнальний каскад;

значення ядерних факторів транскрипції jun та fos в реалізації ефектів
АКТГ;

– участь АКТГ в реалізації апоптичної відповіді в адренокортикальній
тканині.

З’ясувати можливість перенесення сигналу естрадіолу негеномним шляхом:

– участь циклічних нуклеотидів, протеїнкіназ А та С, МАР-кіназ та
ядерних факторів транскрипції в перенесенні сигналу естрадіолу в
клітинах кори надниркових залоз;

– зміни рівня нуклеїнових кислот в основних ланках
гіпоталамо-гіпофізарно-адренокортикальної системи – гіпоталамусі,
гіпофізі та корі надниркових залоз.

Дослідити участь в регуляції стероїдогенезу N-ацильованих похідних
етаноламіну (NAE) як активаторів внутрішньоклітинних систем перенесення
сигналу у корі надниркових залоз:

– вплив NAE на включення міченого холестерину до de novo синтезованих
адренокортикоцитами кортикостероїдів;

– вплив різних NAE на процеси стероїдогенезу в корі надниркових залоз за
присутності дофаміну;

– роль циклічних нуклеотидів у внутрішньоклітинному перенесенні сигналу
NAE;

– зміни активності протеїнкіназ А та С у корі надниркових залоз під
впливом NAE;

– участь NAE у регуляції апоптозу в адренокортикальній тканині.

Охарактеризувати сигнальні механізми, які можуть відігравати суттєву
роль в опосередкуванні ефектів іонів калію:

– участь циклічних нуклеотидів в перенесенні сигналу K+;

зміни активності протеїнкіназ A та С у корі надниркових залоз під
впливом іонів калію.

Об’єкт дослідження. Внутрішньоклітинні сигнальні системи, залучені до
перенесення сигналів регуляторів та модуляторів функції кори надниркових
залоз. Регуляція синтезу кортикостероїдів в корі надниркових залоз
модуляторами адренокортикальної функції: кортикотропіном, естрогенами,
дофаміном, N-ацильованими похідними етаноламінів, іонами калію.

Предмет дослідження. Системи пострецепторного перенесення сигналів в
адренокортикоциті: cAMP-залежної протеїнкінази А, протеїнкінази С,
протеїнкіназ, що активуються мітогенами, тирозинкіназ, ядерні
транскрипційні фактори.

Методи дослідження. Для досягнення мети та виконання завдань,
поставлених у роботі, було використано такі методи: тонкошарову
хроматографію, визначення активності ферментів із використанням
специфічних субстратів, електрофорез білків у поліакриламідному гелі,
імуноблот-аналіз, екстракцію нуклеїнових кислот, полімеразну ланцюгову
реакцію, електpофорез ДНК та білків в агарозному гелі, радіоізотопні
методи, статистичні методи аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. В дисертації досліджені
молекулярні механізми залучення месенджерних каскадів різних
протеїнкіназ, їх ізоформ у мультифакторному контролі функції кори
надниркових за участю кортикотропіну, естрадіолу, іонів калію та
N-ацильованих похідних етаноламіну.

Показано, що регуляторна дія АКТГ в корі надниркових залоз людини
забезпечується, крім cAMP-залежної протеїнкінази А, месенджерним
каскадом протеїнкінази С. Важливою ефекторною ланкою перенесення сигналу
кортикотропіну є ядерна протеїнкіназа С, вміст ?-ізоформи якої значно
збільшується внаслідок дії АКТГ in vitro. Встановлено суттєву роль у
трансдукції сигналу АКТГ в адренокортикоцитах сигнального каскаду
протеїнкіназ, що активуються мітогенами, а саме кінази JNK, та ядерного
фактора транскрипції с-jun, що активується цією кіназою. Під впливом
АКТГ виявлені антиапоптичні зміни в клітинах надниркових залоз, на що
вказує зниження вмісту каспази-3 і ступеня фрагментації ДНК, значною
мірою обумовлені активацією протеїнкінази С.

Доведено можливість прямої дії естрадіолу на функцію кори надниркових
залоз. Встановлено факт участі cAMP-залежної протеїнкінази А,
протеїнкінази С, протеїнкіназ, що активуються мітогенами (ERK1/2), та
ядерного фактора транскрипції с-fos у внутрішньоклітинному перенесенні
регуляторного сигналу естрадіолу в адренокортикоцитах.

Встановлено стероїдогенний ефект N-ацильованих етаноламінів у корі
надниркових залоз, що дозволяє віднести їх до нового класу
адреномодуляторів.

Підтверджена участь протеїнкінази С у К+-залежній стимуляції
стероїдогенезу в адренокортикоцитах.

Встановлено, що процес транслокації основної ізоформи протеїнкінази С,
?-ізоформи, з цитозольної до мікросомної фракції адренокортикоцитів
значно посилюється в пухлинах кори надниркових залоз. Вперше встановлено
особливості експресії всіх відомих Са2+-незалежних ізоформ протеїнкінази
С в субклітинних фракціях адренокортикоцитів людини, а також експресію
рецепторної тирозинкінази RET в карциномах кори надниркових залоз
людини.

Практичне значення одержаних результатів. Результати проведеної роботи
доводять участь низки первинних месенджерів в регуляції стероїдогенезу,
процесів росту та трансформації в клітинах кори надниркових залоз.
Отримані дані можуть бути використані в розробці нових підходів до
корекції трофічних та функціональних процесів в надниркових залозах за
умов патології. Встановлене посилення апоптозу в адренокортикальній
тканині під впливом інгібітору протеїнкінази С – хелеритрину, відкриває
нові можливості пошуку і розробки засобів для лікування новоутворень
надниркових залоз, скеровані на конкретні сигнальні мішені. Встановлене
посилення транслокації ?-ізоформи протеїнкінази С до мікросомної фракції
адренокортикальних клітин пухлин та надекспресія рецепторних
тирозинкіназ в карциномах кори надниркових залоз може використовуватись
для розробки додаткових методів діагностики та прогнозування перебігу
патологічних станів кори надниркових залоз людини.

Особистий внесок здобувача. Всі результати отримано здобувачем особисто
або за безпосередньої участі. Робота виконана автором відповідно до
програми наукових досліджень, спланованих, проведених і узагальнених
протягом 1991-2007 рр. в лабораторії гормональної регуляції обміну
речовин Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка
АМН України. Дисертантом особисто обґрунтовано концепцію роботи,
здійснено пошук та аналіз літературних джерел, розроблено методичні
підходи. Текст дисертаційної роботи написано здобувачем особисто.
Головні завдання роботи, а також основні наукові положення дисертації і
висновки сформульовано разом з науковим консультантом –
членом-кореспондентом НАН та АМН України, д.мед.н., проф. М.Д. Троньком.
Співучасть співробітників відділу патофізіології у виконанні роботи
відображено у спільних публікаціях.

Апробація результатів дисертації. Головні положення дисертаційної роботи
було представлено на І науково-практичній конференції молодих
вчених-ендокринологів в Інституті ендокринології та обміну речовин ім.
В.П. Комісаренка АМН України (Київ, 2001), VI, VIІ З’їздах
ендокринологів України (Київ, 2001; 2007), VIІ, VIІІ, IX Українських
біохімічних з’їздах (Київ, 1997; Чернівці, 2002; Харків, 2006), V, VI
конференціях імені Я. Парнаса (Київ, 2005; Краків, Польща, 2007), ІV
Національному конгресі патофізіологів України (Чернівці, 2004),
міжнародній науково-практичній конференції “Сучасний стан і проблеми
експериментальної і клінічної медицини” (Тернопіль, 2004), V
Всеросійському конгресі ендокринологів (Москва, Російська Федерація,
2006), 2-му з’їзді Українського товариства клітинної біології (Київ,
2007), засіданні Наукової ради з теоретичної та профілактичної медицини
при Президії АМН України (Київ, 27 вересня 2007).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 36 робіт, з яких 1
колективна монографія, 21 стаття у фахових наукових журналах, 14 тез
доповідей у матеріалах наукових з’їздів та конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 299 сторінках
друкованого тексту. Робота складається із вступу, аналітичного огляду
літератури, опису матеріалів та методів досліджень, 4 розділів
результатів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів
досліджень, висновків, списку використаних джерел, який налічує 534
посилання. Текст дисертації проілюстровано 51 рисунком та 13 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури висвітлено і проаналізовано
сучасні дані стосовно механізмів регуляції стероїдогенезу
кортикотропіном та ангіотензином II, іншими потенційними модуляторами
адренокортикальної функції. Зроблено акцент на фактах, які свідчать про
існування нових механізмів контролю гормонопоезу агоністами, таких що
доповнюють загальноприйняту схему регуляції або суперечать їй.

Матеріали і методи досліджень. Більшість досліджень проведено на
тканинах пухлин надниркових залоз хворих з такою патологією: аденома
кори надниркових залоз (гормонально-неактивна (28 зразків),
гормонально-активна: кортикостерома (29 зразків), альдостерома (12
зразків), андростерома (3 зразки)), карцинома кори надниркових залоз
(11 зразків), хвороба Іценка-Кушинга (24 зразки). Були досліджені також
ділянки візуально незміненої тканини кори надниркових залоз (умовно
нормальна тканина), всього 71 зразок. В дослідах використовували
післяопераційні тканини надниркових залоз хворих, прооперованих у
клініці Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка
АМН України. В роботі також були використані експериментальні тварини
(всього 305) – самки та самці (інтактні та орхіектомовані) щурів лінії
Вістар масою 200-250 г, самці морських свинок масою 350-550 г, тканина
надниркових залоз новонароджених поросят.

Для вивчення стероїдогенезу зрізи кори надниркових залоз щурів
інкубували з 3Н-холестерином (“Ізотоп”, Російська Федерація).
Екстраговані стероїди розділяли методом двомірної тонкошарової
хроматографії на силікагелі КСК [Челнакова и др., 1990], визначали
радіоактивність продуктів мічення.

Для характеристики метаболізму фосфатидилхоліну до контрольних та
дослідних суспензій клітин кори надниркових залоз морських свинок
додавали 3Н-холін (“Amersham”, Велика Британія). Екстракцію ліпідів
проводили за методом [Bligh, Dyer, 1959]. Фосфоліпіди розділяли
мікротонкошаровоїю хроматографією в системі розчинників: хлороформ :
метанол : 28 % аміак (65 : 35 : 5) (1-й напрямок) та хлороформ : ацетон
: метанол : оцтова кислота : вода (30 : 40 : 10 : 10 : 5) (2-й
напрямок). Водорозчинні метаболіти фосфатидилхоліну розділяли
тонкошаровою хроматографією на силікагелі Н (“Merck”, Німеччина) в
системі розчинників: метанол : 2,4 % NaCl : вода : 28 % аміак (50 : 12,5
: 37,5 : 5). Перед хроматографією до проб додавали аутентичні немічені
свідки (“Sigma”, США).

АКТГ та пролактин йодували хлораміновим методом [Чард, 1981]. Як ліганд
для вивчення зв’язування АКТГ використовували також
(3-[125I]йодотирозил23)АКТГ(1-39) (“Amersham”, Велика Британія).
Стандартна проба для вивчення рецепції містила мічений гормон (100 000
імп./хв), 50-100 мкг білка мікросом або 105-106 клітин. Для визначення
неспецифічного зв’язування до проби додатково вносили по 10 мкг/мл
неміченого АКТГ або пролактину, а для визначення загального зв’язування
– тільки мічений гормон.

Субклітинні фракції адренокортикоцитів отримували методом диференційного
ультрацентрифугування з додатковою очисткою ядерної фракції у градієнті
щільності сахарози [Buckley et al., 1988].

Визначення активності протеїнкінази С (ПКС) у субклітинних фракціях
клітин кори надниркових залоз людини або щурів проводили з використанням
нейрограніну – високоспецифічного лужного пептидного субстрату ПКС, який
внаслідок фосфорилювання ПКС змінює заряд та рухається в агарозному гелі
до аноду [Uchida et al., 2000], а нефосфорильований нейрогранін,
використаний як негативний контроль, мігрує до катоду. Інкубаційне
середовище для визначення активності ПКС містило трис-HCl буфер,
Mg-ацетат, АТР, а також специфічні активатори ферменту (Са2+,
фосфатидилсерин), нейрогранін та білки досліджуваних субклітинних
фракцій.

Специфічну активність протеїнкінази А (ПКА) визначали за методикою, що
базується на зміні напрямку руху в агарозному гелі пептидного субстрату
кемптиду внаслідок його фосфорилювання ПКА [Kemp et al., 1977].
Інкубаційне середовище для визначення активності ПКА містило трис-HCl
буфер, АТР, активатори ферменту (Mg2+, cAMP), кемптид та білки
субклітинних фракцій.

Рівень cAMP та cGMP визначали, використовуючи радіоімунологічні набори
TRK-432 та -500 відповідно (“Amersham”, Велика Британія).

Детекцію ізоформ ПКС, каспази-3, протеїнкіназ, що активуються
мітогенами, факторів транскрипції проводили імуноблот-аналізом із
використанням моноклональних антитіл [Kurien, Scofield, 2006]. Розділені
методом електрофорезу у поліакриламідному гелі за присутності
додецилсульфату натрію білки [Laemmli, 1970] переносили на
нітроцелюлозну мембрану напівсухим способом. Після інкубації з
первинними і вторинними антитілами імунні комплекси візуалізували за
допомогою реагенту ECL. Після денситометричного визначення інтенсивності
засвічення плівки Hyperfilm ECL результати обробляли у програмі
“PhotoCaptMw”.

Екстракцію ДНК із зрізів проводили, послідовно інкубуючи
адренокортикальну тканину з протеїназою К та рибонуклеазою А
[Kostyuchenko et al., 2005]. Депротеїнізацію проводили сумішшю хлороформ
: ізоаміловий спирт (24 : 1). ДНК осаджували з водної фази етанолом.
Екстракцію РНК проводили, використовуючи реагент TRIzol LS
(“Invitrogen”, США).

Реакцію зворотної транскрипції проводили в реакційній суміші, що
містила: стандартний буфер для полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР),
хлористий магній, суміш дНТФ, а саме АТФ, ТТФ, ГТФ, ЦТФ, інгібітор
РНКази, зворотну транскриптазу, суміш випадкових гексамерів та 1 мкг
екстрагованої РНК. Інкубація в термоциклері проводилась за таких умов:
22 0С – 10 хв, 42 0С – 15 хв, 99 0С – 5 хв, 4 0С – 5 хв.

Реакцію ПЛР проводили в суміші, що містила: стандартний буфер для ПЛР,
хлористий магній, дНТФ, полімеразу red hot taq, прямий та зворотній
праймери до RET тирозинкінази (РТК), комплементарну ДНК, одержану в
результаті реакції зворотної транскрипції. Умови інкубації: 95 оС – 30
сек, 50 оС – 30 сек, 72 оС – 1 хв, а потім температуру знижували до 4
оС. Кількість циклів становила 30. Продукти ПЛР аналізували в 1,7 %
агарозному гелі.

Впродовж всієї роботи використовували кортикотропін А (“Sigma”,
США),17(-естрадіол, естрадіол бензоат (“Кoch-Ligth”, Велика Британія),
пролактин великої рогатої худоби (Каунаський завод ендокринних
препаратів, Литва). NAE (суміш N-ацилетаноламінів, N-стеароїлетаноламін)
було синтезовано в Інституті біології моря (Владивосток, Російська
Федерація). о,п’-ДДД було синтезовано в лабораторії оргсинтезу та
хімреактивів Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П.
Комісаренка АМН України.

У роботі були використані моноклональні антитіла до ізоформ
протеїнкінази С-?, -?1, -?2, -?, -?, -?, -?, -?, -µ -?; ?ротеїнкіназ, що
активуються мітогенами – ERK1/2, JNK, p38; факторів транскрипції –
с-jun, с-fos; каспази-3 (“Cell Signaling Technology” або “Sigma”, США);
IgG, кон’юговані з пероксидазою хрону (“Sigma”, США), субстрати
нейрогранін та кемптид
(Ala-Ala-Lys-Ile-Gln-Ala-Ser-Phe-Arg-Gly-His-Met-Ala-Arg-Lys-Lys та
Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly відповідно, “Sigma”, США) нітроцелюлозна
мембрана Hybond C та реагенти для посиленої хемілюмінесценції (“Amersham
Life Science”, Велика Британія), набори для проведення полімеразної
ланцюгової реакції (“Roche”, Франція), агароза, трис, протеїназа К,
рибонуклеаза А (“Sigma”, США), колагеназа (“Fluka”, Швейцарія), усі
солі, NaOH, HCl (“Merck”, Німеччина).

Для характеристики генеральної сукупності вираховували середнє значення
М та середню похибку m, які представлено у ілюстративному матеріалі.
Різницю між двома вибірками визначали за параметричним t-критерієм
Стьюдента, непараметричним U-критерієм Вілкоксона-Манна-Уїтні та
дисперсійним аналізом за F-критерієм Фішера.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

ДОСЛІДЖЕННЯ МЕСЕНДЖЕРНИХ СИСТЕМ, ЩО ОПОСЕРЕДКОВУЮТЬ СИГНАЛИ АКТГ В
АДРЕНОКОРТИКАЛЬНИХ КЛІТИНАХ. Регуляція кортикотропіном
адренокортикальної функції забезпечується здебільшого за рахунок прямого
фосфорилювання cAMP-залежною ПКА специфічних білків, а також
стероїдогенних факторів, що беруть участь в реакціях стероїдогенезу,
змінюючи його швидкість. Не викликає сумнівів, що cAMP/ПКА-залежна
месенджерна система не є єдиною системою опосередкування дії АКТГ в
клітині. Гормон здатний активувати різні протеїнкінази, проте інші
сигнальні каскади, залучені до перенесення сигналів АКТГ, досліджені
значно менше, ніж cAMP/ПКА-залежний. Особливу увагу дослідників в цьому
аспекті привернула протеїнкіназа С. Відомо, що деякі протеїни можуть
одночасно бути субстратами для кількох кіназ, що є важливим загальним
принципом інтеграції пострецепторних сигналів в клітині. Це істотно
ускладнює розуміння механізмів опосередкування регуляторних сигналів
АКТГ та можливої взаємодії між різними месенджерними системами. Потрібно
також зазначити, що механізми дії АКТГ досліджувались раніше здебільшого
на лініях пухлинних клітин надниркових залоз, спробу оцінки дії гормону
на умовно нормальних тканинах надниркових залоз людини ми провели
вперше.

Участь цAMФ-залежної ПКА та серин/треонінової протеїнкінази С в
реалізації ефектів АКТГ. На початку досліджень необхідним було
з’ясування специфіки механізмів перенесення регуляторного сигналу АКТГ в
корі надниркових залоз людини із залученням цAMФ-залежної ПКА та
серин/треонінової ПКС. В дослідах використовували післяопераційні умовно
нормальні тканини надниркових залоз хворих, прооперованих у клініці
Інституту. АКТГ in vitro у концентрації 0,2 од./100 мг тканини не
призводить до активації ПКА та ПКС ні в мембранній, ні в цитозольній
фракціях. При збільшенні концентрації кортикотропіну до 2 од./100 мг
тканини протеїнкіназна активність у мікросомній фракції зростає у 4,5
рази порівняно з контрольними пробами у випадку ПКА та у 1,4 рази у
випадку ПКС. Визначення розподілу ізоформи ПКС-( в субклітинних фракціях
клітин після інкубації у середовищі з різним вмістом АКТГ за допомогою
імуноблот-аналізу показало, що із збільшенням концентрації
кортикотропіну кількість ферменту зростала в ядерній фракції (рис. 1),
не змінюючись ні в мікросомній, ні в цитозольній фракціях
адренокортикоцитів. Отже, суттєва роль у трансдукції сигналу
кортикотропіну в адренокортикальних клітинах людини може належати не
тільки мембранозв’язаній формі ПКС, але і ядерній ПКС.

Рис. 1. Вміст (-ізоформи ПКС в ядерній фракції адренокортикоцитів умовно
нормальної тканини кори надниркових залоз людини при різних
концентраціях АКТГ.

А ( Вестерн-блот аналіз. Б ( сканограма плівки. В ( узагальнені
результати п’яти дослідів. 1 – контроль, 2 – АКТГ 0,2 од./100 мг
тканини, 3 – АКТГ 2 од./100 мг тканини.** ( вірогідний вплив АКТГ, p (?eo x th p?$ † ? o „$ ¤?]„Gy^„?th`„$ „$ ]„Gy^„?th`„$ ? $ ниркових залоз людини залишають відкритим питання щодо тотожності цих шляхів на рівні цілісного організму. Відомо, що природні та синтетичні естрогени активно використовуються для лікування раку простати у чоловіків [Tammela, 2004], тому дослідження ефектів естрадіолу на інтактних та кастрованих експериментальних тваринах можуть дозволити певну екстраполяцію на зміни функції надниркових залоз у людини. Після 3 днів введення естрадіолу спостерігалось істотне зростання рівня сумарних 11-ОКС у плазмі крові як інтактних, так і орхіектомованих щурів (табл. 4). Показано, що введення 50 мкг естрадіолу інтактним тваринам призводить до збільшення рівня кортикостероїдів у 1,5 рази порівняно з інтактними тваринами, що отримували ін’єкції олії. При введенні 100 мкг естрадіолу цей показник зростає більш ніж у 2 рази. Подібний ефект естрадіолу спостерігався і у кастрованих тварин. У контрольних орхіектомованих щурів рівень 11-ОКС був нижчим, ніж у інтактних (яким вводили сливову олію). Збільшення концентрації кортикостероїдних гормонів під впливом естрадіолу було подібним в обох експериментальних групах. Виходячи з цих даних можна стверджувати, що рівень тестостерону в організмі не має помітного впливу на зміни функції адренокортикальних клітин під впливом естрадіолу. Ні орхіектомія, ні замісне введення тестостерону щурам не призводили до змін концентрації вільного холестерину або його ефірів, які є попередниками синтезу кортикостероїдів [Duda et al., 1985]. Таблиця 4 Вплив естрадіолу бензоату (Е2) in vivo на вміст сумарних 11-гідроксикортикостероїдів у плазмі крові самців щурів (нмоль/л) Групи тварин Е2, мкг Контроль 50 100 Інтактні 1132 ( 140 n = 14 1756 ( 171* n = 16 2351 ( 230** n = 17 Орхіектомовані 781 ( 55+ n = 9 1235 ( 96*, + n = 8 1848 ( 190** n = 8 Примітки: *, ** – різниця з контролем є вірогідною, відповідно р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020