ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені В.Н.КАРАЗІНА

ШЕСТОПАЛОВА Ганна Вікторівна

УДК 577.32

Молекулярні механізми гідратації та комплексоутворення нуклеїнових
кислот з біологічно активними речовинами

03.00.02 – біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора фізико-математичних наук

Харків – 2007

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Інституті радіофізики та електроніки ім. О.Я.Усикова
НАН України,

м. Харків.

Офіційні опоненти:

член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук, професор Говорун
Дмитро Миколайович, Інститут молекулярної біології та генетики НАН
України, заступник директора з наукової роботи, завідувач відділу
молекулярної та квантової біофізики, (м. Київ);

доктор фізико-математичних наук, професор Сорокін Віктор Олександрович,
Фізико-технічний інститут низьких температур ім. Б.І. Вєркіна НАН
України, провідний науковий співробітник відділу молекулярної біофізики,
(м.Харків);

доктор фізико-математичних наук, старший науковий співробітник Волков
Сергій Наумович, Інститут теоретичної фізики ім. М.М.Боголюбова НАН
України, провідний науковий співробітник, (м.Київ).

Провідна установа

Інститут фізики НАН України, відділ фізики біологічних систем, м. Київ.

Захист відбудеться 08.06.2007 р. о 15 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському національному
університеті імені В.Н.Каразіна, 61077, м.Харків, пл.Свободи, 4,
ауд.7-4.

З дисертацією можна ознайомитися в Центральній науковій бібліотеці
Харківського національного університету імені В.Н.Каразіна за адресою:

61077, м .Харків, пл.Свободи, 4.

Автореферат рoзіслано 26.04.2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Гаташ
С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Встановлення молекулярних механізмів взаємодії
нуклеїнових кислот (НК) з водним оточенням та біологічно активними
речовинами (БАР) є однією з найважливіших задач молекулярної біофізики.
Опис молекулярних механізмів включає в себе детальну інформацію стосовно
структурних та термодинамічних параметрів систем, які містять НК і БАР,
з урахуванням впливу оточуючого середовища і, насамперед, розчинника та
іонів. Кількісний вміст води, тип і концентрація іонів можуть причиняти
структурні переходи НК. Такі переходи, у свою чергу, безпосередньо
пов’язані з перебудовою гідратного оточення, яке формується молекулами
води, сорбованими на матрицях НК у процесі гідратації. Для різних
структурних форм характерними є специфічні гідратні оболонки, що
відрізняються структурно та енергетично. Молекули води, що беруть участь
у формуванні просторової структури ДНК — найбільш рухливі елементи
системи НК-вода-іони: це відбивається на локальних конформаційних
перебудовах ДНК і, відповідно, на її функціонуванні. Очевидно,
іон-гідратне оточення ДНК впливає і на процеси міжмолекулярних
взаємодій, що відбуваються за участю ДНК, наприклад, утворення
комплексів НК з БАР.

Незважаючи на велику кількість отриманих дотепер результатів, що
описують структурні та енергетичні параметри перелічених вище процесів,
в сучасній молекулярній біофізиці недостатньо даних, необхідних для
розуміння усіх аспектів взаємодії НК з гідратним оточенням і молекулами
БАР. У зв’язку з цим дослідження молекулярних механізмів гідратації та
комплексоутворення НК з БАР є актуальними, оскільки новітні
експериментальні та комп’ютерні методи дослідження нині дають можливість
отримати детальнішу та достовірнішу інформацію про процеси, що
протікають у живих системах на молекулярному рівні.

Перспективними при вивченні молекулярних механізмів взаємодії НК з
водним оточенням і БАР є методи комп’ютерного експерименту, а саме,
методи Монте Карло та молекулярної динаміки. Сучасний рівень розвитку
комп’ютерної техніки дозволяє проводити обчислення різних
фізико-хімічних характеристик досить складних молекулярних систем,
максимально наближених до реальних, у тому числі з безпосереднім
урахуванням впливу розчинника – води. За допомогою комп’ютерного
моделювання можна отримати найбільш ймовірні моделі молекулярних
комплексів мішень-ліганд та внески різних взаємодій у стабільність
досліджуваних комплексів: це суттєво полегшує тлумачення
експериментальних даних. Але у методах комп’ютерного моделювання для
обчислення енергетичних характеристик використовуються емпірічні
потенціали, які апроксимують різні види взаємодій в досліджуваних
системах. Тому адекватніше описання молекулярних механізмів формування
стабільних структур НК, а також комплексів НК з малими біологічно
активними молекулами потребує комплексного підходу, тобто поєднання як
експериментальних, так і комп’ютерних методів молекулярної фізики. В
результаті можна отримувати фізичні параметри, що дозволяють оцінювати
специфічність зв’язування БАР з молекулою мішенню – НК (або ступінь
спорідненості у молекулярній системі мішень-БАР), яка є проявом
біологічної активності потенційного фармакологічного препарату на
молекулярному рівні. Оскільки процеси взаємодії відбуваються у водному
середовищі, необхідно досліджувати структурну та енергетичну роль
розчинника при утворюванні комплексів за допомогою кількісних
характеристик гідратації окремих компонентів комплексів (молекули-мішені
– НК і молекули-ліганду – БАР) при утворенні різних типів комплексів.

Одна з загальних проблем сучасної фармакології та медицини –
прогнозування ефективності дії лікарських препаратів за умов, що у
організмі вже присутні біологічно активні малі молекули, наприклад, ті,
що містяться у продуктах харчування, або ті, що вводяться при
комбінованій хіміотерапії. У цьому випадку лікарські препарати, діючи на
клітинному і молекулярному рівні, конкурують з іншими БАР при
зв’язуванні з молекулами-мішенями. Тому актуальним є дослідження
молекулярних механізмів конкурентного зв’язування за допомогою методів,
що дозволяють оцінити структурну відповідність можливого сайту
зв’язування молекули-мішені та молекули БАР, а також енергетичні
параметри комплексоутворення.

Зв’язок дисертації з науковими програмами, планами, темами. Роботу
виконано у відповідності з планами науково-дослідних робіт відділу
біологічної фізики Інституту радіофізики і електроніки ім. О.Я.Усикова
НАН України у межах держбюджетних тем “Структура і стабільність системи
біополімер-вода – біологічно активна речовина при впливі температури та
випромінювання” (№ держ.реєстрації 01.92U027978, 1991-1995),
“Дослідження фізичних властивостей гідратованих біополімерів з
урахуванням дії радіації” (№ держ.реєстрації 01.96U006110, 1996-2000),
«Фізичні механізми взаємодії новосинтезованих біологічно активних
речовин з гідратованою ДНК» (№ держ.реєстрації 0100U006336, 2001-2003);
«Дослідження взаємодії електромагнітних та акустичних полів, а також
електронних пучків з твердотільними та біологічними структурами» (№
держ.реєстрації 0102U003139, 2002-2006); «Дослідження енергетичних та
гідратаційних характеристик взаємодії біологічно активних речовин з
полінуклеотидними та колагеновими матрицями» (№ держ.реєстрації
0103U002268, 2004-2006), проекту Державного фонду фундаментальних
досліджень «Експериментальні та теоретичні дослідження гідратно-залежних
процесів в стабілізації структури природних та модельних нуклеїнових
кислот» (Проект 02.04/00759,2000-2002) та частково у рамках Міжнародного
гранту INTAS-97 31753: “Design, synthesis and testing of novel
biologically-active molecules as potential drugs with sequence-speсific
binding to nucleic acids”, 1999-2002).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи — з’ясувати основні
закономірності формування структури і гідратного оточення (1) НК різного
рівня структурної організації, (2) ароматичних БАР та (3) їх комплексів
з НК.

Для досягнення поставленої мети вирішувалися наступні задачі:

1. Комп’ютерне моделювання систем, що містять воду і: (1) структурні
компоненти НК з наростаючим рівнем складності; (2) ароматичні БАР –
аналоги протипухлинних антибіотиків (похідні актиноцину ActII-V) та їх
асоціати; (3) комплекси різних фрагментів НК з ароматичними БАР.

2. Визначення залежності енергетичних, структурних та динамічних
параметрів гідратного оточення динуклеозидмонофосфатів (ДМФ) від
нуклеотидного складу та конформації. Опис на атомному рівні формування
гідратного оточення

3. Отримання і опис за допомогою методу Монте Карло гідратних оболонок
похідних актиноцину, що відрізняються структурою бокових радикалів
(ActII-V), і визначення залежності їх гідратних властивостей від
розмірів бокових радикалів. Дослідження методом молекулярної динаміки
процесів гомо- і гетероасоціації кофеїну (Сf) та похідної актиноцину
ActII у воді і водно-сольових розчинах. Визначення енергетичних вкладів
різних міжмолекулярних взаємодій у стабільність гомо- і гетероасоціатів.

4. Отримання методом Монте Карло найбільш ймовірних молекулярних моделей
комплексів фрагментів НК з ароматичними БАР. Опис на атомному рівні
процесів формування гідратних оболонок досліджених комплексів та
вивчення змін гідратного оточення компонентів НК та лігандів при
комплексоутворенні.

5. Отримання методом молекулярної динаміки структурних та енергетичних
характеристик комплексів фрагментів ДНК з похідним актиноцину ActII і
кофеїном та визначення енергетичних вкладів різних міжмолекулярних
взаємодій у стабільність комплексів, що утворюються; детальний аналіз
формування їх гідратних оболонок.

Об’єкти дослідження – структура та гідратне оточення нуклеїнових кислот
різного рівня структурної організації та нуклеотидного складу,
ароматичних біологічно активних речовин та комплексів фрагментів НК з
біологічно активними речовинами.

Предмет дослідження – молекулярні механізми взаємодії нуклеїнових кислот
з гідратним оточенням і ароматичними біологічно активними речовинами.

Методи дослідження: методи комп’ютерного моделювання – метод Монте
Карло, молекулярної динаміки і молекулярного докінгу; експериментальні
методи – ІЧ- спектроскопія, п’єзогравіметрія.

Наукова новизна. В цій роботі за допомогою комплексного підходу
(комп’ютерне моделювання та використання великого обсягу
експериментальних даних) вперше проведено систематичне дослідження
гідратації і комплексоутворення фрагментів нуклеїнових кислот різного
рівня структурної організації з ароматичними біологічно активними
речовинами, отримано та візуалізовано просторові структури, гідратні
оболонки, обчислено різні складові енергій взаємодії для систем, що
містять воду та (1) фрагменти НК різного нуклеотидного складу і
структурної організації; (2) ароматичні БАР – аналоги протипухлинних
антибіотиків та їх асоціати; (3) комплекси різних фрагментів НК з
ароматичними БАР.

Показано, що стабільність структури ДМФ у водному оточенні визначається
декількома типами конкурентних взаємодій, значення яких та відносний
внесок у повну потенціальну енергію залежать від нуклеотидного складу і
вмісту води у системах. Вперше на атомному рівні описано формування
гідратного оточення ДМФ, що відрізняються нуклеотидним складом та
конформацією.

Вперше на підставі енергетичних характеристик систем ДМФ-вода, отриманих
методом Монте Карло, визначено надлишкові енергії гідратації ДМФ, часи
дипольної релаксації води у зв’язаному стані і проаналізовано залежність
цих параметрів від нуклеотидного складу ДМФ та вмісту води у системах.

Методом Монте Карло детально описано гідратне оточення одно- та
двоспіральних форм полірибоцитидилової (poly(rC)) та полірибоаденілової
(poly(rA)) кислот. Показано, що з ускладненням структурних елементів цих
полінуклеотидів роль гідратного оточення у стабілізації одно- та
двоспіральних форм зростає.

Методом Монте Карло отримано рівноважні молекулярні структури та
гідратні оболонки похідних актиноцину, що відрізняються структурою
бокових радикалів (ActII-V), і визначено залежність гідратних
властивостей ActII-V від числа метиленових груп у бокових ланцюгах.

Методом Монте Карло отримано найімовірніші молекулярні моделі двох типів
комплексів фрагментів ДНК з похідними актиноцину ActII-V. Встановлено,
що додаткова стабілізація комплексів здійснюється за рахунок водних
містків, що утворюються у сайтах зв’язування лігандів.

На основі аналізу результатів експериментальних досліджень
(ІЧ-спектроскопія і п’єзогравіметрія) та комп’ютерного моделювання
(метод Монте Карло) взаємодії двох структурних форм poly(rA) з Сf
запропоновано найімовірніші молекулярні моделі комплексів.

Методами молекулярного докінгу і Монте Карло визначено структури
найімовірніших молекулярних моделей комплексів похідного актиноцину
ActIII і фрагменту двоспіральної poly(rC) за типом зовнішнього
зв’язування.

Методом молекулярної динаміки детально вивчено процеси гомо- і
гетероасоціації кофеїну і похідного актиноцину ActII у воді та
водно-сольових розчинах; вперше отримано структурні та енергетичні
характеристики двох типів комплексів фрагментів ДНК з похідною
актиноцину ActII і кофеїном.

За результатами молекулярно-динамічного моделювання процесів само- і
гетероасоціації ActII та Сf у розчинах і комплексоутворення ActII та Сf
з фрагментами ДНК вперше встановлено, що Сf може проявляти як
інтерцепторний, так і протекторний механізми модифікації біологічної
активності ActII.

Практичне значення отриманих результатів. Застосований в роботі
комплексний підхід до з’ясування формування структури та гідратного
оточення НК різного рівня структурної організації, ароматичних БАР та їх
комплексів з НК, що поєднує результати сучасних комп’ютерних методів
молекулярного моделювання та дані експериментальних досліджень, надає
найбільш детальну, на атомному рівні інформацію щодо структурних та
енергетичних параметрів систем НК-вода и НК-БАР-вода. За його допомогою
відбираються найбільш ймовірні моделі комплексів НК-БАР та
встановлюється кореляція між фізичними параметрами таких комплексів,
структурою БАР і їх біологічною активністю. Результати можуть бути
використані в галузі біотехнології при створенні та тестуванні нових
фармакологічних препаратів ген-спрямованої дії для відносно швидкого
відбору сполук, що на молекулярному рівні проявляють максимальну
спорідненість до молекул НК.

Особистий внесок здобувача. У роботах [1,6,7,11-13,24-29,31,32,34,39,41]
– комп’ютерне моделювання методом Монте Карло, аналіз його результатів,
спільне обговорення та інтерпретація експериментальних даних і
результатів моделювання, підбір літератури, участь у написанні статей
або підготовці доповідей. У роботах [2-4,9-11,14-17,35-37,42,43] –
постановка задачі дослідження, виконання етапів комп’ютерного
моделювання, підбір літератури, аналіз і обговорення отриманих
результатів, написання статей. У роботах [22,38,40] – постановка задачі
і участь у виконанні експериментальних досліджень методами
ІЧ-спектроскопії і п’єзогравіметрії, виконання комп’ютерного моделювання
методом Монте Карло, аналіз результатів, написання статей і підготовка
доповідей. У роботі [18] – аналіз і підбір літератури, обговорення
результатів, написання огляду.

Апробація роботи. Основні результати досліджень доповідалися на XVI
Міжнародному конгресі “Біохімія і молекулярна біологія”, Індія,
Н’ю-Делі, вересень 1994; 3-й та 5-й Міжнародній конференції “Фізичні
явища у твердих тілах”, Україна, Харків, 1997, 2001; Міжнародній
конференції “Фізика біологічних систем”, Україина, Київ, вересень 1998;
II з’їзді біофізиків Росії, Росія, Москва, серпень 1999; Міжнародній
конференції “Теоретична фізика і біологія”, Україна, Київ, листопад
1999; VIII Європейській конференції по спектроскопії біомолекул,
Нідерланди, Энсхенде, серпень-вересень 1999; XXV Європейському конгресі
по молекулярній спектроскопії, Португалія, Коімбра, серпень-вересень
2000; III Європейському біофізичному конгресі, Германія, Мюнхен,
вересень 2000; IX Європейській конференції по спектроскопії біомолекул,
Чеська республіка, Прага, вересень 2001; науково-практичній конференції
“Сучасні технології органиічного синтезу та медичної хімії”, Харків,
квітень 2003; 16-й Міжнародній школі-семінарі “Спектроскопія молекул та
кристалів”, Севастополь, травень 2003; III Міжнародній конференції
“Фізика рідких станів: сучасні проблеми”, Україна, Київ, травень 2005;
1-ому, 2-ому, 3-ому і 4-ому з’їздах Українського біофізичного
товариства, Україна, Київ, липень 1994; Харків, липень 1998; Львів,
жовтень 2002; Донецьк, грудень 2006.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 46 наукових робіт, у
тому числі 23 статті у наукових журналах і 23 тез доповідей на
національних та міжнародних конференціях.

Структура дисертації. Дисертація складається з вступу, семи розділів і
висновків. Повний об’єм дисертації складається з 370 с., перліку
використаних літературних джерел – 556 назв – 31 с. Дисертація містить
140 рис. і 53 табл., в тому числі на 14 окремих сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність теми, зв’язок дисертації з науковими
програмами і темами, сформульовано мету і задачі дослідження, показано
новизну і практичну значимість отриманих результатів, вказано особистий
внесок здобувача у опублікованих із співавторами роботах.

Розділ 1 присвячено аналізу результатів дослідження гідратації НК і їх
комплексів з БАР. Особливу увагу приділено постановці задачі дослідження
і можливості методів комп’ютерного моделювання при вивченні таких систем

Аналіз літературних даних дозволяє зробити висновок про значну роль
водного оточення різних форм подвійної спіралі НК, оскільки зв’язана
вода формує специфічне гідратне оточення НК (водні містки, водні
ланцюжки, водні “хребти” тощо) і вносить суттєвий енергетичний внесок у
стабілізацію їх спіральної структури та конформаційну рухливість. У той
же час аналіз результатів різних експериментальних методів показує, що
отримати пряму інформацію стосовно структурних та енергетичних
параметрів систем НК-вода-іони, описати на атомному рівні формування
гідратного оточення НК, візуалізувати моделі їх гідратних оболонок і
визначити енергетичні внески внутрішньо- та міжмолекулярних взаємодій
водночас у межах одного-двох методів неможливо. Аналогічний висновок
можна зробити при розгляді сучасних уяв щодо молекулярних механізмів
комплексоутворення НК і різних лігандів. Безсумнівним є висновок про
суттєву, якщо не вирішальну, роль гідратного оточення у формуванні
стабільних комплексів та специфічності зв’язування. Але, як правило,
такі висновки роблять на основі непрямих даних, і у межах одного
дослідження не завжди вдається отримати надійну інформацію про
структурні та енергетичні параметри комплексів, що утворюються, та їх
гідратне оточення. Водночас підкреслюється, що такі параметри можуть
бути фізичними критеріями прояву біологічної активності багатьох
лігандів, у тому числі і лікарських препаратів, мішенню для яких є
молекули НК. На основі аналізу літературних даних показано, що
структурні модифікації лігандів призводять як до зміни біологічної
активності лігандів на клітинному рівні, так і до зміни стабільності
комплексів з молекулами НК, тобто фізичні параметри комплексоутворення
та біологічна активність in vitro, як правило, корелюють. За підсумками
аналізу літератури зроблено висновок про те, що, не дивлячись на
величезний об’єм інформації, отриманої за попередні роки при дослідженні
молекулярних механізмів структурної організації і функціонування НК,
багато важливих питань залишилися нез’ясованими. До таких проблем
відноситься взаємозв’язок між формуванням стабільних форм просторових
структур НК, комплексів НК з БАР і утворенням їх специфічного гідратного
оточення, а також з енергетичними і динамічними параметрами цих
процесів. Аналіз результатів експериментальних досліджень і
комп’ютерного моделювання свідчить про необхідність використовувати як
найбільш ефективний комплексний підхід при вивченні молекулярних
принципів організації і функціонування НК, тобто поєднання
експериментальних та комп’ютерних методів дослідження. Саме такий підхід
використано в даній роботі для дослідження молекулярних механізмів
взаємодії фрагментів НК різного рівня структурної організації з водним
оточенням і молекулами ароматичних біологічно активних речовин.

У розділі 2 коротко розглянуто основи використаних у роботі комп’ютерних
методів моделювання. Це методи Монте Карло, молекулярної динаміки і
молекулярного докінгу. Описано фізичні основи методу Монте Карло:
представлено схему алгоритму Метрополіса, стисло проаналізовано
потенціали взаємодії, вибір граничних умов, засоби оцінки похибок
обчислень, що використовуються у роботі. Наведено загальний протокол
моделювання і параметри атом-атомних потенціальних функцій для
розрахунку міжмолекулярних взаємодій. Вказано, що для кожної певної
системи уточнення протоколу моделювання надано у відповідних розділах.

У розділі також наведено фізичні основи методу молекулярної динаміки
(МД). Суть методу полягає у побудові траєкторії руху атомів, що
взаємодіють, у силовому полі емпіричного атом-атомного потенціалу на
основі класичних рівнянь руху Ньютона. Для чисельного інтегрування
рівнянь руху у роботі використовується алгоритм Верлє. Алгоритм
грунтується на тому, що відстані, швидкості та прискорення можуть бути
знайдені розкладанням у ряд Тейлора. Якщо координати атому у момент часу
t відомі, можна виразити стани атомів у момент часу t + (t розкладанням
у ряд Тейлора за ступенем (t. При цьому повинні зберігатися енергія і
момент системи з припущенням достатньо великих кроків інтегрування (t.
Основна ідея алгоритму Верлє — записати два ряди Тейлора для двох
моментів часу: (t — ( t) і (t + ( t):

r(t + (t) = r(t) + v(t)(t + 1/2a(t)(t,
r(t — (t) = r(t) — v(t)(t + 1/2a(t)(t (1)

Далі виконують додавання двох рядів і отримують основну формулу
алгоритму Верлє:

r(t + (t) =
2r(t) + r(t-(t) + a(t)(t2. (2)

Сили, які діють на атом, знаходять як похідні потенціальної енергії:

. (3)

Далі розраховують нові координати атомів, з яких визначають сили
рівнодії:

ri(t+(t) =
ri(t) + vi(t)(t + Ѕ ai(t) (t2, (4)

де a – прискорення, a(t + ( t) = F(t + ( t)/m.

Потім визначають швидкості атомів:

v(t+(t) = v(t) +
(a(t+(t)+ Ѕ a(t)) (t. (5)

У алгоритмі Верлє оптимальним вважається крок інтегрування ( t =
1–2.10-15с, що становить приблизно десяту частину періоду найшвидших
молекулярних коливань. Моделювання проводилося з використанням
періодичних граничних умов.

Розрахунки енергії взаємодії виконуються за допомогою емпіричної функції
потенціальної енергії (силового поля), яка залежить тільки від координат
ядер атомів, що входять до системи.

Потенціальна енергія молекули задається у вигляді:

U(r) = Ub + U( +Utor +UW +Uel ,
(6)

де доданки відповідають величинам Ub – енергія деформації хімічних
зв’язків і U( — валентних кутів, Utor — енергія обертання навколо
зв’язків, UW — ван-дер-Ваальсовим взаємодії, Uel — електростатичним
взаємодії, Uhb — водневі зв’язки.

Енергію деформації валентних зв’язків і кутів розраховують у
гармонійному наближенні:

Ub = Ѕ ( Kb (r — b0)2 , U( =
Ѕ ( K( (( — (0)2 , (7)

де b0 — рівноважні значення довжин валентних зв’язків, r — поточні
довжини зв’язків, (0 — рівноважні значення кутів, ( — їх поточні
значення, Kb і K( — відповідні силові константи. Додавання ведеться за
усіма валентними зв’язками і кутами.

Енергію торсійних взаємодій задають у вигляді періодичної функції
(зрізаного розкладання у ряд Фур’є):

Utor = (
KФ[cos(nФ-() +1] , (8)

де n — кратність торсійного бар’єру, ( — зсув фази, K( — константи, що
визначають висоти потенціальних бар’єрів двогранних кутів (.

Ван-дер-Ваальсові взаємодії атомів, розділених трьома і більше
валентними зв’язками, описують за допомогою потенціалу Леннард-Джонса:

UW =( [A/
rij12 – B/ rij6]. (9)

Параметри потенціалу А і В залежать від типу атомів i і j, що беруть
участь у взаємодії; rij — відстань між цими атомами.

Електростатичні взаємодії задаються кулонівським потенціалом

Uel
= ( qiqj /(rij, (10)

де qi, qj — парціальні заряди на атомах, ( — діелектрична проникність
середовища.

Надано загальний протокол виконання молекулярно-динамічного моделювання
і вказано, що конкретні умови виконання комп’ютерного експерименту
методом МД описано у відповідних розділах.

У розділі наведено моделі молекул води, використані у розрахунках: у
методі Монте Карло — модель Малєнкова-Полтєва, у методі МД — модель
TIP3P.

Коротко представлено фізичну суть методу молекулярного докінгу. Він
полягає у побудові такого комплексу ліганду з біомолекулою-мішенню, у
якому ліганд стерично відповідає передбачуваному місцю зв’язування на
макромолекулі з максимальною енергією міжмолекулярних взаємодій. Для
отримання коректного результату при моделюванні необхідно дотримуватися
двох умов: мати ефективний алгоритм, здатний побудувати комплекс,
близький за структурою до реального, та надійну функцію оцінки енергії,
яка може виділити цей комплекс як найбільш ймовірний. У нашому
моделюванні використовувався програмний пакет AutoDock 3.05. Результатом
розрахунків є найімовірніші з енергетичної та стеричної точок зору
структури комплексів макромолекула-мішень і ліганд.

У розділі також наведено стислі характеристики методів ІЧ-спектроскопії
та п’єзогравіметрії, якими користувалася авторка для вивчення взаємодій
двох структурних форм poly(rA) з Cf.

У розділі 3 представлено результати дослідження гідратації ДМФ різного
нуклеотидного складу, виконані методом Монте Карло. У комп’ютерному
експерименті досліджуються модельні системи, що містять ДМФ (шість
дезокси-ДМФ та чотири рибо-ДМФ) і водні кластери різних розмірів. Така
постановка задачі дозволяє відтворити взаємодію ДМФ з водою при різних
рівнях відносної вологості (ВВ) і порівняти результати моделювання з
даними експериментальних досліджень. При вивченні гідратації необхідно
коректно враховувати взаємодію між розчиненою речовиною — ДМФ — і
молекулами води та обчислювати взаємодію вода-вода, вода-розчинена
речовина, а також конформаційні взаємодії у молекулі розчиненої
речовини. Для ДМФ розрахунок конформаційних взаємодій базувався на
декількох наближеннях. В результаті число зв’язків, навколо яких можливі
обертання у ДМФ, зменшилося до 10. Довжини валентних зв’язків і
валентних кутів ДМФ у процесі розрахунків не змінювалися. Урахування
протиіонів проводилося у неявному вигляді. Заряди на фосфатних групах
обчислювалися так, щоб забезпечити електронейтральність ДМФ.

Для моделювання систем ДМФ-вода необхідно вибрати розміри водних
кластерів, які б відповідали зразкам НК-вода з різною ВВ, раніше
дослідженим експериментально. Тому спочатку було змодельовано водні
кластери таких розмірів, щоб число молекул води у них узгоджувалося з
уявленнями про формування декількох шарів гідратного оточення НК. За
результатами було обрано кластери, що містять 20, 40, 80, 100 молекул
води, які відповідають системам НК-вода з різними значеннями ВВ, та 200,
400 і 800 молекул води, структура води у яких близька до стану рідкої
води або розчинів.

Результатами моделювання систем ДМФ-вода є їх найбільш ймовірні стани,
для яких розраховано середні значення повної потенціальної енергії
систем UTOT; енергії конформаційних взаємодій UCONF; енергії взаємодії
вода-ДМФ UWD; енергії взаємодії вода-вода UWW та структурні
характеристики: середнє число молекул води, що утворюють водневі зв’язки
вода-вода; число водневих зв’язків, що припадають на 1 молекулу води;
число молекул води, які утворюють водневі зв’язки з ДМФ.

На основі аналізу енергетичних параметрів було зроблено висновок про
енергетичну перевагу систем, що містять ДМФ, до складу яких входять
гуанін та/чи цитозин. Така перевага найбільш виражена у кластерах з
малою кількістю молекул води. З ростом розміру водних кластерів (чи ВВ
систем) до значень, що відповідають стану розчину (водні кластери з 200
і 400 молекул води), відмінності між ДМФ, що містять G,C та/чи А,Т (U),
практично зникають. Ці результати узгоджуються з даними про стабільність
НК, що мають різний нуклеотидний склад у плівках чи концентрованих
розчинах, отриманими експериментально.

Результати розрахунків дозволяють розглянути внески кожного з трьох
видів взаємодій до повної енергії систем ДМФ-вода у залежності від
вмісту води і типу ДМФ та зробити висновок: енергетичну стабільність
ДМФ, що містять GC, визначають конформаційні взаємодії і взаємодії
ДМФ-вода, тоді як для ДМФ, що містять АТ, більший енергетичний внесок
вносять взаємодії вода-вода. Для детальнішого опису ролі різних
взаємодій розглянуто відносні внески у повну потенціальну енергію UTOT
систем ДМФ-вода кожного з трьох типів взаємодій UCONF, UWD, UWW (рис.1)
і показано, що стабільність компонентів НК у водному оточенні
визначається декількома типами конкурентних взаємодій (конформаційні,
ДМФ-вода, вода-вода), значення яких та відносний внесок у повну
потенціальну енергію залежать від нуклеотидного складу та вмісту води у
системах. Отримані результати узгоджуються з експериментальними даними з
вивчення зразків НК, що відрізняються за нуклеотидним складом і вмістом
води.

Рис.1. Відносні внески різних видів взаємодій у повну потенціальну
енергію систем ДМФ-вода (у %).

У розділі також подано результати аналізу залежності енергетичних
параметрів гідратації від нуклеотидного складу. Експериментально така
залежність вивчалася за допомогою надлишкової енергії гідратації. За
результатами моделювання було обчислено надлишкову енергію гідратації з
використанням енергетичних характеристик систем ДМФ-вода:

(Uhyd = USUM/1–UWW/1(pure water),
(11)

де USUM/1=UWW/1+UWD/1, а UWW/1(pure water) — це середні енергії
взаємодії вода-вода (на 1 молекулу води) для водних кластерів різних
розмірів. Аналіз розрахованих (Uhyd показав, що GC-послідовності
зв(язують молекули води з більшими енергіями, особливо в системах з
малим вмістом води (рис.2). В системах, що модулюють розчини, взаємодія
усіх вивчених ДМФ з водою відрізняється несуттєво.

Надлишкова енергія гідратації дозволяє оцінити динамічні характеристики
системи ДНК-вода — час дипольної релаксації гідратної води (d.
Залежність (d від вмісту води у зразках (n) отримано з рівняння, що
зв(язує (d з надлишковою енергією гідратації ? Uhyd (n):

(d = (d0exp[(Uhyd (n)/RT],
(12)

де (d0 = 0,9.10-11с – значння часу релаксації для об(ємної води; R –
універсальна газова константа; Т – абсолютна температура.

Як видно з наведених залежностей (рис.3), для кожного типу ДМФ криві
(d(n) мають якісно подібний вигляд. На початкових стадіях гідратації
значення (d зменшуються на порядок (і більше для ДМФ GрG). З ростом
числа молекул води в системі рухливість молекул води зростає для усіх
досліджених систем.

Рис. 2. Залежності надлишкової енергії гідратації (Uhyd від числа
молекул води N в системах ДМФ-вода для ДМФ різного нуклеотидного складу.

Рис.3. Залежності часу диелектричної релаксації молекул води (d, що
зв(язані з ДМФ різного нуклеотидного складу, від числа молекул води N.

Отримані результати узгоджуються з експериментальними даними про
залежність енергетики гідратації НК та динамічних властивостей їх
гідратних оболонок від нуклеотидного складу.

Результати моделювання дозволяють докладно уявити розподіл молекул води
біля різних структурних блоків ДМФ, використовуючи значення енергії
взаємодії молекул води з окремими атомними групами. Найменша різниця
спостерігається для гідратації фосфатних груп усіх ДМФ у кластерах, що
відповідають стану розчина, а найбільша різниця зафіксована для
гідратації основ. Проаналізовано миттєві конфігурації усіх досліджених
ДМФ та візуалізовано структури ДМФ у водних кластерах з розподілом
молекул води між різними гідратно-активними центрами ДМФ. Аналіз змін
структури водного оточення докладно наведено на прикладі ДМФ ТрТ
(рис.4).

Рис.4. TpT у водних кластерах різних розмірів: а) TpT+20 Н2О. Виділено 6
Н2О, що утворюють водневі зв(язки з TpT; б) TpT+400 Н2О. Виділено 17
Н2О, що утворюють водневі зв(язки з TpT.

При малому вмісті води (рис.4а) 6 молекул води утворюють водневі зв(язки
з фосфатною групою (W1 і W2), з вільними O3’-H3’ та O5’-H5’ групами
кістяка (W3 и W4), з атомом О4’ (W5) і з атомною групою N3H тиміну (W6).
При зростанні вмісту води (стан розчину) заповнюються усі можливі центри
гідратації ТрТ (рис.4б). При цьому частина молекул води займає місткові
положення між двома гідратно-активними центрами та формують сітку
молекул, які зв(язані водневими зв(язками як з ТрТ, так і між собою.

Аналогічний аналіз було проведено для усіх досліджених систем ДМФ-вода і
зроблено висновок про те, що залежності гідратації НК від їх
нуклеотидного складу, які спостерігаються в експериментальних та
комп(ютерних дослідженнях, визначаються фізико-хімічними особливостями
структурних елементів НК, і, передусім, здатністю азотистих основ
утворювати різну кількість водневих зв(язків з молекулами води.

У розділі також наведено результати моделювання ДМФ різного
нуклеотидного складу, структура яких відповідає А-, В- та Z-
конформаціям ДНК. Аналіз енергетичних і структурних характеристик цих
систем показав, що при будь-якому вмісті води для ДМФ GрC А-форма
енергетично більш вигідна, ніж В-форма. Ця перевага визначається
конформаційними взаємодіями і взаємодіями вода-вода в системах, а в
системах з більшим вмістом води і взаємодіями ДМФ-вода. Для ДМФ АрТ при
більшому вмісті води енергетично переважною є В-конформація, вигідність
якої визначається структурою розчинника (взаємодія вода-вода). Отримані
результати узгоджуються з уявленнями про більшу А-фільність
GC-фрагментів порівняно до В-фільності АТ-послідовностей НК.

У розділі проаналізовано миттєві конфігурації усіх досліджених систем:
це також дозволило визначити місткові положення молекул води, які є
основними структурними елементами при формуванні впорядкованної
структури гідратного оточення НК. Відносний внесок водних містків у
енергію взаємодії вода-ДМФ достатньо великий, і в системах, що
відповідають стану розчину, сягає 35%, у середньому дорівнюючи (20%.

У розділі 4 наведено результати моделювання методом Монте Карло
гідратації різних структурних форм poly(rC) і poly(rА) та їх
компонентів. Відомо, що впорядковані спіральні форми poly(rC) і poly(rА)
утворюють: односпіральні форми у нейтральних та слаболужних розчинах,
двоспіральні — в області 3.7( рН ( 5.5. Стабілізація таких спіральних
структур згідно експериментальним даним визначається міжмолекулярними
взаємодіями (стекінг та водневі зв(язки) і, можливо, водним оточенням.
Для уточнення ролі води в стабілізації спіральних структур poly(rC) і
poly(rА) методом Монте Карло досліджено гідратацію усіх структурних
компонентів poly(rC) і poly(rA) при зростанні їх складності: від основ
до олігонуклеотидів одно- і двоспіральної форм. Їх стартові конформації
побудовано на основі даних рентгеноструктурного аналізу.

В таблиці 1 наведено середні значення: повної енергії систем UTOT,
енергії взаємодії вода-вода UWW, енергії взаємодії вода-фрагменти
полінуклеотидів UWB, та структурні характеристики: NHb – число молекул
води, що утворюють водневі зв(язки з дослідженими молекулами. NWbr –
число водних містків в системах; в дужках наведено енергії взаємодії
молекул води в місткових положеннях.

Таблиця 1

Енергетичні та структурні характеристики односпірального
тетрануклео-тиду poly(rC), двоспірального тетрануклеотиду polyr(C-C+),
односпірального гексануклеотиду poly(rA) і двоспірального
гексануклеотиду polyr(АН-АН) у кластері з 800 молекул води та кластеру
чистої води (дані надано у ккал/моль: * — на одну молекулу води, ** — в
цілому на систему).

Система *UTOT/1 **U TOT *UWW/1 **UWB NHb NWbr

poly(rC) -8,952 ( 0,005 -7161,6 -8,143 -647,4 41 10 (-135,4)

polyr(C-C+) -9,426 ( 0,004 -7540,8 -7,851 -1247,3: (-579,0) +
(-667,9) 65 8 (-95,9)

рoly(rА) -8,765 ( 0,005 -7020,0 -8,070 -556,1 70 9
(-105,6)

polyr(АН-АН) -8,930( 0,005 -7143,8 -7,888 -788,8:
(-389,7) + (-399,1) 98 7 (-86,5)

H2O -8,530 ( 0,005 -6824,1 -8,530

Енергії взаємодії між ланцюгами дуплексів UBB дорівнюють: UBB [polyr
(C-C+)] = -79.6 ккал/моль; UBB [polyr (АН-АН)] = -44.6 ккал/моль. Аналіз
даних таблиці 1 та вивчення миттєвих конфігурацій систем дозволили
визначити найбільш вигідні місця зв(язування молекул води з фрагментом
односпіральної poly(rC) та знайти 10 молекул води, що займають місткові
положення між двома гідрофільними центрами poly(rС) (рис.5а). Всього з
фрагментом водневі зв(язки утворюють до 40 молекул води, або, (10
молекул води на нуклеотид. Стабільність системи, що містить
тетрануклеотид polyr(C-C+), визначається як взаємодіями між ланцюгами у
подвійній спіралі (UBB ( -20 ккал/моль на пару основ), так і взаємодією
з розчинником. Найбільший внесок у взаємодію polyr(C-C+) з водою дають
65 молекули води, з яких 8 молекул є спільними для обох ланцюгів. Вони
утворюють водні містки та ланцюжки (рис.5б). Тобто, на один нуклеотид
припадає близько 8 молекул води.

Рис.5. Фрагменти одно- (а) и двоспіральної (б) форм poly(rC). Показано
молекули води, що утворюють водні містки та ланцюжки між цитозинами
вздовж спіралі та між цитозинами і цукровофосфатним кістяком.

Аналогічні дослідження виконано для poly(rА) (таблиця 1). Аналіз
миттєвих конфігурацій дозволяє встановити, що з односпіральним
фрагментом водневі зв(язки утворюють (70 молекул води, або 11-12 молекул
води на нуклеотид (рис.6а), що узгоджується з експериментальними даними.
Можна виділити 48 молекул води, які утворюють систему водних містків і
ланцюжків між донорно-акцепторними групами гексануклеотиду.

Стабільність системи polyr(АН-АН)-вода визначається як взаємодіями між
ланцюгами у подвійній спіралі (UBB (-7 ккал/моль на пару основ), так і
взаємодією з розчинником. Найбільший внесок у взаємодію polyr(АН-АН) з
водою вносять 98 молекул води, з кожним з ланцюгів водневі зв(язки
утворє приблизно однакове число молекул води: (48 молекул води або 8
молекул води на нуклеотид.

Аналіз миттєвих конфігурацій гексануклеотиду двоспіральної polyr(АН-АН)
у водному кластері (рис.6б) дозволив визначити три типи впорядкованих
фрагментів молекул води, які можуть давати додатковий внесок у
стабілізацію подвійної спіралі polyr(АН-АН). Це водні містки, молекули
води W1 і W2, та водні ланцюжки, молекули води W3.

Рис.6. Фрагменти впорядкованої структури води навколо гексануклеотиду
(а) односпіральної і (б) двоспіральної рoly(rА).

Таким чином, результати моделювання узгоджуються з експериментальними
даними для усіх досліджених систем, суттєво уточнюючи та доповнюючи їх.
Показано, що додаткова стабільність одно- і двоспіральних
олігонуклеотидів poly(rC) и poly(rА) визначаєтьтся (разом з стекінгом
основ вздовж спіралі і водневими зв(язками у двоспіральних фрагментах)
формуванням специфічної структури води — водних містків і ланцюжків.

У розділі 5 викладено результати дослідження гідратації похідних
актиноцину з різною довжиною бокових радикалів, їх комплексоутворення з
фрагментами ДНК за двома типами зв(язування та гідратації таких
комплексів. Першим етапом було комп(ютерне моделювання методом Монте
Карло гідратації похідних актиноцину ActII – V, які мають різні розміри
бокових замісників — аміноалкильних ланцюжків (рис.7).

Рис.7. Структурна формула похідних актиноцину АctII n=2, ActIII n=3,
ActIV n=4, ActV n=5.

У результаті було отримано дані, що свідчать про залежність гідратних
властивостей похідних актиноцину від числа метиленових груп у бокових
ланцюжках. Показано, що зростання довжини бокових замісників призводить
до руйнації структури розчинника та зростання гідратної оболонки усіх
вивчених лігандів. При цьому гідратна оболонка, або число молекул води,
що утворюють водневі зв(язки з молекулами лігандів, зростає з зростанням
числа метиленових групп у бокових радикалах з 2 до 3 та несуттєво
змінюється для ActIII — V.

Методом Монте Карло проведено комп(ютерне моделювання взаємодії
фрагментів ДНК та ActII — V з урахуванням водного оточення. Розглянуто
два типа комплексів, які можуть утворювати похідні актиноцину за
отриманими експериментальними даними. Перший тип комплексу –
інтеркаляція ліганду між площинами GC-пар подвійної спіралі ДНК; другий
тип – зовнішнє зв(язування молекули ліганду у малому жолобі подвійної
спіралі. Стартові конфігурації для комплексів побудовано за допомогою
даних рентгеноструктурного дослідження кристалів комплексів фрагментів
ДНК.

У таблиці 2 наведено результати моделювання комплексоутворення фрагменту
ДНК (5′-d(GAAGCTTC)-3′)2, (Оліг.1) з ActII – V за типом інтеркаляції та
при вбудові у малий жолоб фрагменту (5′-d(CGCGTTAACGCG)-3′)2, (Оліг.2).
Використано такі позначення: UTOT/1 (( 0.005) – повна енергія взаємодії
у системах, UWW/1 – енергія взаємодії вода-вода (величини надані у
перерахунку на молекулу води), UWО — енергія взаємодії
олігонуклеотид-вода, UWL – енергія взаємодії вода-ліганд, UOL – енергия
взаємодії олігонуклеотид-ліганд. Останні три величини надано для повної
системи.

Таблиця 2

Енергетичні (у ккал/моль) та структурні характеристики систем

ДНК — вода, ДНК – ліганд – вода.

Система UTOT/1 UWW/1 UWО UWL UOL NHbO NHbL

Оліг.1 -9,519 -7,448 -1671,2 — — 148 —

ActII + Oліг.1 -9,800 -7,423 -1528,8 -131,9 -241,2 141 (6) 7 (10)

ActIII + Oліг.1 -9,743 -7,343 -1539,3 -149,6 -231,3 146 (2) 11 (20)

ActIV + Oліг.1 -9,815 -7,341 -1.590,3 -194,9 -193,7 148 (2) 16 (19)

ActV + Oліг.1 -9,842 -7,356 -1588,6 -203,8 -195,8 148 (2) 12 (16)

Оліг.2 -9,934 -7,177 -2206,0 — — 201 —

ActII+ Oліг.2 -10,187 -7,117 -2125,2 -117,5 -213,0 192 (2) 7 (10)

ActIII + Oліг.2 -10,157 -7,025 -2140,4 -193,1 -172,1 196 (1) 17 (20)

ActIV + Oліг.2 -10,176 -7,070 -2142,3 -168,3 -173,3 198 (2) 15 (19)

ActV + Oліг.2 -10,188 -7,045 -2193,9 -162,3 -158,3 200 (1) 14 (16)

NHbо – число молекул води, що утворюють водневі зв(язки з
олігонуклеотидами; у дужках наведено число молекул води, що займають
місткові положення між олігонуклеотидом та лігандом. NHbL — число
молекул води, що утворюють водневі зв(язки тільки з лігандами; у дужках
наведено число молекул води, що утворюють водневі зв(язки з ізольованим
лігандом. Порівняння величин повних енергій взаємодії (UTOT/1) та
енергій взаємодії олігонуклеотид — ліганд (UOL) дозволяє зробити
висновок про те, що вбудова ліганду ActII енергетично найбільш вигідна.
Аналіз миттєвих конфігурацій усіх комплексів дає можливість описати їх
структуру та гідратне оточення більш детально.

У випадку інтеркаляційних комплексів олігонуклеотиду з ActII і ActIII
хромофорні кільця вбудовуються між GC-парами, а метиленові ланцюжки
розташовуються вздовж цукровофосфатного кістяка (рис.8).

Рис.8. Комплекси фрагменту Оліг.1 з лігандами: (а) ActII; (б) ActIII;
(в) ActIV; (г) ActV за типом інтеркаляції.

У комплексі фрагменту ДНК з ActIV і ActV хромофорні кільця лігандів
«виштовхуються» з подвійної спіралі олігонуклеотиду, довгі метиленові
ланцюжки відштовхуються від цукровофосфатного кістяка. Комплекс
олігонуклеотид-ActII додатково стабілізується утворенням двох водневих
зв(язків між атомами O4′ дезоксирибоз обох ланцюжків олігонуклеотиду з
NH2-групою хромофорного кільця ліганду і NH-групою одного з
аміноалкильних ланцюжків.

Гідратація комплексу олігонуклеотид-ActII (141 молекула води) нижче
сумарної гідратації ізольованих олігонуклеотиду (148 молекул води) і
ліганду (10 молекул води). Тобто при утворенні комплексу має місце
суттєва перебудова гідратного оточення фрагменту ДНК і ліганду. Шість
молекул води займають місткові положення між гідратно-активними групами
олігонуклеотиду і ліганду та додатково стабілізують комплекс. Для
комплексів з ActIII — V міжмолекулярних водневих зв(язків між групами
лігандів і цукровофосфатним кістяком олігонуклеотиду не знайдено.
Утворення водневих зв(язків між метиленовими ланцюжками бокових
замісників ActII, що інтеркалює у GC-сайт, та цукровофосфатним кістяком
фрагменту ДНК може пояснити вищу термостабільність комплексу ActII-ДНК,
яка зафіксована у калориметричних та спектрофотометричних дослідженнях.

&

(

*

0

2

8

:

@

B

J

L

P

R

\

`

b

d

r

t

z

|

?

 

?

¬

®

°

t

I

I

?

O

O

Oe

O

U

th

&

F

&

F

°

?

1/4

Ae

AE

I

O

TH

a

a

ae

e

e

u

ue

O

O

AE

O

AE

&

AE

&

(

,

@

D

F

H

`

d

f

r

t

v

x

z

|

?

?

?

?

?

AE

E

O

Oe

Ue

TH

ae

i

?

< F ^ f h | ~ ? ’ ” ? ? ¬ ° Ae AE E I Ue TH ae ae u ue ¤ ¤ aekdE ¤ ¤ aekd? ¤ ¤ ¤ ¤ ¤ ¤ ¤ Fменші геометричні розміри з чотирьох досліджених лігандів, викликає найбільше зміщення води, яка звя(зана з фрагментом ДНК. Аналіз миттєвих конфігурацій (рис.9) вказує, що молекула ActII “занурена” у малий жолоб глибше, ніж молекули трьох інших лігандів. Таким чином, аналіз наданих у розділі 5 результатів не тільки підтверджує експериментальні дані щодо утворення комплексів ActII – V і фрагментів ДНК за двома типами зв(язування, але й суттєвоо доповнює їх. Рис.9. Комплекси за типом зовнішнього зв(язування у малому жолобі ДНК: Оліг.2 + (а) ActII; (б) ActIII; (в) ActIV; (г) ActV. Показано, що утворення кожного комплексу супроводжується перебудовою гідратного оточення лігандів і фрагментів ДНК, а формування водних містків між гідратно-активними центрами ДНК та інтеркальованими лігандами додатково стабілізує цей тип комплексів. У розділі 6 наведено результати дослідження комплексів модельних НК з ароматичними БАР. Експериментально процес комплексоутворення кофеїну (Cf) і різних структурних форм рoly(rA) з урахуванням гідратного оточення досліджено методами п’єзогравіметрії та ІЧ-спектроскопії. За аналізом ізотерм гідратації і ІЧ-спектрів плівок комплексів одно- та двоспіральної рoly(rA) з Cf при зростанні вологості зразків пропонуються такі механізми взаємодії. Присутність Cf у системі не змінює процес формування обох впорядкованих спіральних структур poly(rА). Cf та односпіральна рoly(rA) утворюють комплекс в результаті зовнішнього зв(язування молекул Cf, що призводить до зменшення гідратації фосфатних груп. Не виключена можливість утворення водневих зв(язків між карбонільними групами Cf і NH2-групами аденину. Порівняльний аналіз гідратації вільної протонованої двоспіральної polyr(АН-АН) та її комплексу з Cf дозволяє зробити висновок, що polyr(АН-АН) - достатньо стабільна і компактна структура, тому Cf зв(язується з нею тільки на зовнішній поверхні полінуклеотидної матриці. Молекули води у комплексах можуть безпосередньо зв(язуватися з гідратно-активними групами Cf та полінуклеотидною матрицею і/або утворювати містки між донорно-акцепторними групами poly(rА) і Cf. Уточнення цих припущень зроблено за допомогою комп(ютерного моделювання методом Монте Карло. Для комплексу односпіральної форми poly(rА) з Cf можливі два типу зв(язування – зовнішнє зв(язування молекули Cf (комплекси 1, 2, рис.10а,б) і часткова інтеркаляція (припущення, що висловлювалося в літературі) молекули Cf між площинами сусідніх аденинів (комплекс 3, рис.10в). Рис. 10. Комплекси фрагменту односпіральної poly(rА) і Cf: (а) комплекс 1; (б) комплекс 2; (в) комплекс 3 і молекули води, що займають місткові положення між групами аденинів (W1) та між групами цукровофосфатного кістяка (W2). Для комплексу двоспіральної структури polyr(AН-АН) и Cf можливо тільки зовнішнє зв(язування молекули Cf біля цукровофосфатного кістяка полінуклеотидної матриці (рис.11). Навколо комплексів утворюються водні містки і ланцюжки, які формують безперервну сітку молекул води і додатково стабілізують обидва комплекси. З комплексом гексануклеотиду рoly(rA) 6rA і Cf зв(язуються (9 молекул води на нуклеотид, з них з фрагментом односпіральної poly(rА) – 7-8 молекул води на нуклеотид, а з молекулою Cf - 3-4 молекули води. З фрагментом 6r(AН-АН) водневі зв(язки утворюють 76-78 молекул води, або 6-7 молекул води на нуклеотид, а з молекулою Cf зв(язуються 3-4 молекули води. Таким чином, усі отримані результати узгоджуються з експериментальними даними і суттєво їх доповнюють. Рис. 11. Комплекси двоспіральної poly(rА) і Cf: (а) комплекс 1; (б) комплекс 2. Показано молекули води, що утворюють водневі зв(язки з 6rA та Cf. Виділено молекули води, які займають місткові положення. У розділі 6 наведено молекулярні моделі комплексів двоспіральної poly(rC) і АctIII. Утворення такого комплексу зареєстровано у розчинах методами УФ- і ВО-спектрофотометрії, Раман спектроскопії, мікрокалориметрії і у плівках методами ІЧ-спектроскопії та п(єзогравіметрії. У експериментах було показано, що феноксазоновий хромофор ліганду не вбудовується між площинами сусідніх пар основ poly(rC). Комплекс двоспіральної poly(rC) с АctIII, можливо, утворюється за типом зовнішнього зв(язування та стабілізується кількома міжмолекулярними водневими зв(язками. Аналізуючи ІЧ-спектроскопічні дані зроблено висновок, що при зв(язуванні АctIII з двоспіральною poly(rC) можуть утворюватися водневі зв(язки між донорно-акцепторними групами АctIII і фосфатними групами двоспіральної poly(rC). За даними Раман спектроскопії можливо утворення водневих зв(язків між NH2-групою феноксазонового хромофору АctIII і матрицею двоспіральної poly(rC). Ймовірні моделі комплексу двоспіральна poly(rC)-ActIII  побудовано на основі експериментальних даних за допомогою двох методів – молекулярного докінгу і Монте Карло. За результатами моделювання методом молекулярного докінгу було відібрано п(ять найбільш ймовірних комплексів, які задовольняють експериментальним даним і критеріям відбору за значеннями енергій, які отримано у молекулярному докінгу. Ці структури є стартовими конфігураціями для моделювання методом Монте Карло у кластері з 800 молекул води. Результати моделювання наведено у таблиці 3. Це середні повні потенціальні енергії систем (UTOT ( 4.0), що представляють суму енергій взаємодії молекул води (UWW), енергій взаємодії молекул води з poly(rC) (UWrC) і АctIII (UWAct), енергій взаємодії у комплексі АctIII-poly(rC) (UAct-rC). Процес комплексоутворення оцінювали і за гідрофобними взаємодіями, для розрахунків яких застосовували лінійну залежність енергії Eph від зміни площі поверхні, що доступна розчиннику, (SASph, Е2: Eph =( SASph x 0.024 ккал/моль(Е2. (13) Як видно з наведених у таблиці 3 результатів, середні значення повних потенціальних енергій усіх досліджених комплексів відрізняються несуттєво - менш, ніж на 1%. Таблиця 3 Енергетичні (у ккал/моль) характеристики комплексів фрагменту двоспіральної poly(rC) з АctIII у кластері, що містить 800 молекул води. Система UTOT UWW UWrC UWAct UrC-Act (SASph Eph Комплекс 1 -9181,4 -5576,1 -2877,1 -210,7 -517,5 631,7 -15,16 Комплекс 2 -9247,2 -5489,2 -3137,3 -252,5 -368,2 597,2 -14,34 Комплекс 3 -9211,8 -5597,8 -2904,1 -229,3 -479,9 608,7 -14,61 Комплекс 4 -9178,9 -5509,6 -3000,8 -228,9 -439,2 472,4 -11,34 Комплекс 5 -9258,2 -5514,1 -3051,2 -226,9 -465,9 520,4 -12,49 У таблиці 4 наведено структурні характеристики систем: міжмолекулярні водневі зв(язки - НВ (АctIII – poly(rC)) з переліченням атомів, що беруть участь в утворенні таких зв(язків, та водні містки. Вказано атоми АctIII та фрагменту poly(rC), з якими молекули води у місткових положеннях утворюють водневі зв(язки. Використовуючи усі дані, що отримано при моделюванні та з експериментальних досліджень, можна запропонувати структуру, яка відповідає комплексу 3 (рис.12), як найбільш ймовірну молекулярну модель комплексу АctIII і фрагменту двоспіральної poly(rC). Таблиця 4 Структурні характеристики комплексів фрагменту двоспіральної poly(rC) з АctIII у кластері, що містить 800 молекул води. Система НВ (АctIII – poly(rC)) Водні містки Комплекс 1 N18Н2 … OP; N21H...O2’ C=O21(Н2О)Н2N(С) Комплекс 2 N21H...O2’; N24Н … O3’ Ні Комплекс 3 N18Н2…NH2(С); О17…NH2(С) N31Н…O2’ C=O17(Н2О)Н2N(С) Комплекс 4 Ні C=O17(Н2О)O2’; C=O17(Н2О)H2N(С) N31H (Н2О)C=O (С) Комплекс 5 N21H...O2’; N34H…O3’ CO20 (Н2О) OP Рис. 12. Комплекс 3. а) загальний вигляд; б) сайт зв(язування. Вказано міжмолекулярні водневі зв(язки: N18 - NH2-Cyt1 і CО17 - NH2-Cyt2 (1 ланцюжок фрагменту poly(rC)); N31H…O2’ рибози (2 ланцюжок фрагменту polyrC) і водний місток: CO17...H2O...NH2-Cyt2. Для цього комплексу виконується більшість критеріїв, необхідних для утворення стабільного комплексу. Молекула ліганду розташовується у жолобі двоспірального полінуклеотиду. Комплекс стабілізовано міжмолекулярними водневими зв(язками, гідрофобними взаємодіями і взаємодіями з молекулами розчинника. Разом з тим, у розчині можливо існування декількох типів комплексів, близьких за структурою до комплексів 1, 3, 5, що були отримані за допомогою комп(ютерного моделювання методами молекулярного докінгу і Монте Карло. Стійкість цих комплексів у водному розчині визначається і формуванням міжмолекулярних водневих зв(язків, і специфічною взаємодією з молекулами розчинника. Утворення комплексів супроводжується перебудовою гідратного оточення фрагменту двоспіральної poly(rC) і АctIII, особливо у сайті зв(язування ліганду. У розділі 7 наведено результати дослідження молекулярних механизмів впливу кофеїну (Cf) на біологічну активність ActII, який проявив максимум активності у ряду ActII-V. Методом молекулярної динаміки виконано (1) моделювання процесів само- і гетероасоціації Cf та похідних актиноцину ActII у водних розчинах і (2) комплексоутворення Cf і ActII з різними фрагментами ДНК. Дослідження цих двох процесів методом молекулярного моделювання дозволять детально описати здатність Cf впливати на взаємодію аналогу протипухлинного антибіотику з мішенню – молекулою ДНК за рахунок інтерцепторного (гетероасоціація) і протекторного (конкуренція) механизмів. У сухому стані ліганд ActII - це сіль ActII(Cl)2. Нами розглянуто катіон ActII з загальним зарядом +1 (ActII+) при зв(язуванні одного з іонів Cl- і катіон з загальним зарядом +2 (ActII++), який утворюється при повній дисоціації іонів Cl- у безсольових розчинах. Енергію асоціації ((G) розраховували за формулою: (G = (U + (Gsolv, (14) де (U – молекулярно-механічна енергія взаємодії, яка складається з ван-дер-Ваальсових (vdw) та електростатичних (elst) взаємодій; (Gsolv – зміна енергії гідратації при утворенні асоціату: (Gsolv=Gdim – Gmon1 – Gmon2. (15) Енергія гідратації обчислювалась за формулою: Gsolv = ((wi ( Si), (16) де Si – площа поверхні i-го атому, wi – ваговий коефіцієнт. Гідрофобні взаємодії при утворенні асоціатів розраховували за формулою 13. Першим етапом було моделювання мономерів Cf і ActII у воді і у розчинах, які містили іони Na+ і Cl-. Отримано: структури гідратних оболонок; радиальні функції розподілу; площі поверхні, що доступні розчиннику; різні види енергій взаємодії у системах. Ці параметри необхідні для подальшого вивчення процесів гомо- і гетероасоціації, а також для порівняння з результатами експериментів з вивчення агрегації та взаємодії досліджених сполук з водним оточенням. Наступним етапом було моделювання стекінг-димерів гомо- та гетероасоціатів Cf і ActII у воді та у водно-сольових розчинах. Всього вивчено 14 різних асоціаітов. Аналізували структури асоціатів, їх гідратне оточення, можливість утворення внутрішньо- та міжмолекулярних водневих зв(язків у асоціатах, внески міжмолекулярних взаємодій у стабільність асоціатів. Показано, що усі вивчені асоціати (окрім одного з гетероасоціатів) - стабільні (рис.13, (G). Рис.13. Енергія асоціації (G Cf і ActII у воді та водно-сольових розчинах. Рис. 14. (U, (vdw і (elst процесів асоціації Cf та ActII у воді та водно-сольових розчинах. Це визначається, перш за все, внеском молекулярно-механічної енергії (рис.14, (U) і, зокрема, її ван-дер-Ваальсовими компонентами ((vdw), які відповідають дисперсійним взаємодіям. Гідрофобні взаємодії стабілізують усі асоціати (рис.15, Eph). Аналіз значень енергії гідратації (Gsolv вказує, що у воді перебудова гідратної оболонки мономерів при їх асоціації енергетично невигідна і дестабілізує усі досліджені асоціати. У водно-сольових розчинах зміна гідратного оточення енергетично вигідна для систем, що містять асоціати ActII+ або гетеродимери Cf - ActII+, але невигідна для самоасоціатів Cf. Рис.15. Енергії гідрофобних взаємодій Eph утворення асоціатів Cf і ActII у водних та водно-сольових розчинах. Рис.16. Внутрішньо- та міжмолекулярні водневі зв(язки у структурі самоасоціату ActII+ у розчині з іонами Na+ і Cl-. Зафіксовано утворення водних містків у самоасоціатах ActII+, які вносять додатковий внесок у їх стабілізацію. Утворення внутрішньо- та міжмолекулярних водневих зв(язків показано на прикладі самоасоціата ActII+ (рис.16). Розраховані значення енергії взаємодії молекул в асоціатах свідчать про те, що утворення димерів Cf-ActII енергетично вигідніше, ніж утворення самоасоціатів Cf. Тому Cf може зменшувати концентрацію ароматичного ліганду у розчині за рахунок утворення гетероасоціатів і, як наслідок, знижувати його біологічну активність (інтерцепторний механізм). Другий механізм впливу Cf на біологічну активність ActII+ є протекторна дія, або конкуренція за місця зв(язування з ДНК. При моделюванні комплексів фрагменту ДНК з Cf або ActII+ енергію взаємодії ліганду (?G) з фрагментом ДНК розраховували за формулою: ?G = ?U + ?Gsolv + ?Gc, (17) де ?U – молекулярно-механична енергія взаємодії, яка складається з ван-дер-Ваальсових (vdw) та електростатичних (elst) взаємодій; ?Gsolv – зміна енергії гідратації при утворенні комплексу, або сума змін енергії гідратації ліганду (lig) та подвійної спіралі (hel); ?Gc – енергія конформаційної перебудови подвійної спіралі при зв(язуванні ліганду, що дорівнює різниці між енергією недеформованої та деформованої спіралі та складається з зміни молекулярно-механічної енергії (mm) і енергії гідратації (формула 16). Також визначали гідрофобні взаємодії при комплексоутворенні лігандів і фрагментів ДНК у воді (формула 13), де ( SASph розраховувалася як: (S = SAScompl – (SASDNA+SASlig). (18) Першим етапом було моделювання фрагментів ДНК, які обрані мішенями (5’-d(ApGpCpT)2 і 5’-d(GpApTpApC)2) для взаємодії з лігандами (ActII+ і Cf). Збереження структури подвійної спіралі оцінювалося за динамікою змін відстані і направленності водневих зв(язків у парах основ, за відстанями між атомами Р фосфатних груп кожного з ланцюжків фрагменту і конформаціями вуглеводних залишків. На основі аналізу молекулярно-динамічної траєкторії зроблено висновок, що обидва досліджених фрагмента ДНК залишаються стабільними та зберігають структури, які відносяться до В-форми подвійної спіралі ДНК. Наступним етапом було моделювання чотирьох комплексів фрагментів ДНК з Cf і ActII+: за типом інтеркаляції у GC-сайт фрагменту та при зв(язуванні у малому жолобі. У таблиці 5 наведено повну енергію взаємодії ?G та її складові для вивчених комплексів. Таблиця 5 Повна енергія взаємодії ?G, її складові та енергія гідрофобних взаємодій Eph (у ккал/моль) для комплексів (C) за типом інтеркаляції: d(AGCT)2+ActII+ – I1, d(AGCT)2+Cf – I2; і за типом зовнішнього звя(зування у малому жолобі: (d(GATAC)2) +ActII+ – G1; d(GATAC)2+ Cf – G2. C (G (U vdw elst (Gsolv hel lig (Gс solv mm Eph I1 -23,95 -86,93 -55,59 -31,34 20,35 9,73 10,62 42,63 8,30 34,33 -11,25 I2 -5,14 -36,24 -35,91 -0,33 13,12 3,44 9,68 17,98 -7,76 25,74 -6,17 G1 -72,77 -78,25 -33,23 -45,02 10,97 7,02 3,95 -5,49 -6,14 0,65 -11,88 G2 -12,80 -29,08 -21,43 -7,64 10,48 1,36 9,12 5,80 2,19 3,61 -8,59 Аналіз результатів моделювання свідчить, що всі комплекси стабільні. Енергетична вигідність комплексів за типом інтеркаляції зумовлена внесками молекулярно-механічної складової (?U): її ван-дер-Ваальсовими компонентами для обох лігандів та електростатичною – для ActII+, який має загальний позитивний заряд. Позитивні внески конформаційної складової ?Gc у загальне значення ?G пояснюються енергетичними витратами при утворенні інтеркаляційного сайту (розкручування подвійної спіралі, розтягнення її вздовж вісі, зміщення пар основ). Стабільність комплексу, що спостерігається при зв(язуванні ActII+ у малому жолобі, визначається негативними значеннями ?U і ?Gc. Тобто при вбудові ActII+ у малий жолоб не відбувається суттєвої деформації подвійної спіралі. Дестабілізуючий внесок має зміна енергії гідратації комплексу ДНК-ліганд. Гідрофобні взаємодії стабілізують усі досліджені комплекси, і їх внесок у стабільність комплексів фрагментів ДНК з ActII+ більший, ніж у стабільність комплексів фрагментів ДНК з Cf. Утворення комплексу ДНК-ліганд супроводжується перебудовою гідратних оболонок ДНК і частковою або повною дегідратацією ліганду. Число молекул води, що утворюють водневі зв(язків з комплексами (n), та зміни у моногідратному шарі фрагменту ДНК при утворенні комплексів ((n) наведено на рис.17. Інтеркаляція ActII+ і Cf викликає однакове зменшення молекул води, що зв(язуються з ДНК, але по-різному змінє гідратацію основ и цукровофосфатного кістяка. Зв(язування ActII+ у малому жолобі викликає менше змін у гідратації фрагменту d(GATAC)2, ніж зв(язування Cf. ActII+ більше впливає на гідратацію основ, тоді як Cf змінює гідратацію цукровофосфатного кістяка. У комплексі за типом інтеркаляції ліганд ActII+ фіксується у GC-сайті кількома водневими зв(язками (рис.18), утворення яких може пояснити специфічність взаємодії ActII+ з GC-сайтом фрагменту ДНК. При вбудові лігандів у малий жолоб не було зафіксовано водневих зв(язків між атомними групами лігандів і фрагментів ДНК. Рис. 17. Зміна середнього числа молекул води у моногідратному шарі, в перерахунку на пару основ ((n) для інтеркаляції (а) і при зв(язуванні у малому жолобі (б) Cf і ActII+. Рис.18. GC-сайт комплексу 5’-d(AGCT)2 з ActII+ за типом інтеркаляції. Водневі зв(язки показано пунктиром. Таким чином, узагальнюючи результати молекулярно-динамічного моделювання процесів само- та гетероассоціації ActII і Cf у розчинах та комплексоутворення ActII і Cf з фрагментами ДНК, можна зробити висновок про те, що Cf здатен змінювати біологічну активність похідного актиноцину ActII на молекулярному рівні і як інтерцептор з утворенням стабільних гетероассоціатів, і як протектор за результатом конкуренції за місця зв(язування на ДНК. ВИСНОВКИ В дисертаційній роботі вперше використано комплексний підхід при дослідженнях молекулярних механізмів взаємодії у системах НК – вода та НК – БАР – вода, що поєднує сучасні комп(ютерні методи моделювання і дані експериментальних методів. Таких підхід дозволяє запропонувати найбільш ймовірні моделі комплексів, оцінити внески різних видів міжмолекулярних взаємодій, урахувати у явному вигляді вплив розчинника на формування стабільних комплексів НК – ліганд. Він може бути використаний у біотехнології при створенні та тестуванні нових фармакологічних препаратів ген-спрямованної дії для відносно швидкого відбору сполук, що на молекулярному рівні проявляють максимальну спорідненість до молекул НК. Основні результати дисертації сформульовано наступним чином: У роботі за допомогою комплексного підходу (комп(ютерне моделювання і використання експериментальних даних) вперше проведено систематичне комплексне дослідження гідратації та комплексоутворення фрагментів нуклеїнових кислот різного рівня структурної організації з ароматичними БАР, отримано і візуалізовано просторові структури, гідратні оболонки і різні складові енергій взаємодій для систем, що містять воду і (1) ДМФ різного нуклеотидного складу і конформацій; (2) фрагменти одно- і двоспіральних полірибонуклеотидів; (3) ароматичні БАР – аналоги протипухлинних антибіотиків; (4) само- і гетероасоціати ароматичних БАР; (5) комплекси різних фрагментів НК з ароматичними БАР. Показано, що стабільність структури ДМФ в водному оточенні визначається кількома типами конкурентних взаємодій, величини яких і відносний внесок у повну енергію систем ДМФ-вода залежать від нуклеотидного складу та вмісту води у системах. Вперше на атомному рівні описано формування гідратного оточення ДМФ, що відрізняються нуклеотидним складом і конформацією. Показано, що формування гідратної оболонки ДМФ залежить від нуклеотидного складу і визначається особливостями структурних елементів, передусім, азотистих основ, які відрізняються здатністю зв(язувати різну кількість молекул води. Вперше на основі енергетичних характеристик систем ДМФ-вода, отриманих методом Монте Карло, визначено надлишкові енергії гідратації ДМФ та часи дипольної релаксації молекул води у зв(язаному стані. Зафіксовано залежність цих параметрів від нуклеотидного складу ДМФ і вмісту води у системах. Методами комп(ютерного моделювання отримано детальний опис гідратного оточення одно- і двоспіральних форм poly(rС) і poly(rА). Показано, що при ускладненні структурних елементів цих полінуклеотидів, роль гідратного оточення у стабілизації спіральних форм зростає. Методами комп(ютерного моделювання отримано рівноважні молекулярні структури і гідратні оболонки похідних актиноцину, що відрізняються структурою бокових радикалів (ActII-V). Показано, що зростання розмірів бокових замісників приводить до руйнації структури розчинника і зростання гідратної оболонки усіх досліджених лігандів. Методом Монте Карло отримано найбільш ймовірні молекулярні моделі двох типів комплексів фрагментів ДНК з похідними актиноцину ActII-V: інтеркаляція молекул ActII-V між GC-парами подвійної спіралі ДНК і зв(язування молекул ActII-V у малому жолобі ДНК. Встановлено, що додатково комплекси стабілізуються водними містками, які утворюються у сайтах зв(язування лігандів. На основі аналізу результатів експериментальних досліджень (ІЧ-спектроскопія і п(єзогравіметрія) і комп(ютерного моделювання (метод Монте Карло) комплексів двох структурних форм poly(rА) з кофеїном показано, що кофеїн не змінює процес формування спіральних структур poly(rА). Запропоновано найбільш ймовірні молекулярні моделі комплексів. Показано, що для комплексу односпіральна poly(rА)-кофеїн можливі два типа зв(язування, а для комплексу двоспіральної polyr(AН-АН)-кофеїн - тільки один тип зв(язування. Комплекси стабілізуються ван-дер-Ваальсовими та електростатичними взаємодіями і утворенням водних містків та ланцюжків, що зв(язують донорно-акцепторні групи фрагментів полінуклеотидів і кофеїну. Методами молекулярного докінгу і Монте Карло визначено структури найбільш ймовірних молекулярних моделей комплексів похідної актиноцину АctIII і фрагменту двоспіральної poly(rC) за типом зовнішнього зв(язувания. Показано, що комплекси додатково стабілізуються міжмолекулярними водневими зв(язками, гідрофобними взаємодіями та взаємодіями з молекулами розчинника. Методом молекулярної динаміки детально вивчено процеси гомо- і гетероасоціації кофеїну та похідної актиноцину ActII у воді і водно-сольових розчинах та взаємодію їх мономерів і асоціатів з іон-гідратним оточенням. Показано, що гомо- і гетероасоціати стабілізуються ван-дер-Ваальсовими, гідрофобними взаємодіями і міжмолекулярними водневими зв(язками. Методом молекулярної динаміки вперше отримано структурні та енергетичні характеристики комплексів фрагментів ДНК з похідною актиноцину ActII і кофеїном. Показано, що комплекси ActII-ДНК енергетично вигідніші, ніж комплекси кофеїн-ДНК, причому енергії взаємодії обох лігандів з фрагментами ДНК мають близькі значення. Це свідчить про можливість конкуренції кофеїну і похідної актиноцину ActII за місця зв(язувания на молекулі – мішені – ДНК. Показано, що ступінь руйнації моногідратного шару подвійної спіралі при утворенні комплексу ДНК-ліганд визначається способом зв(язувания ліганду та його можливістю утворювати водневі зв(язки з молекулами води. За результатами молекулярно-динамічного моделювання процесів само- і гетероасоціації ActII та кофеїну у розчинах і комплексоутворення ActII та кофеїну з фрагментами ДНК, показано, що кофеїн може проявляти як інтерцепторний, так і протекторний механізми модифікації біологічної активності потенційного протипухлинного антибіотика - похідного актиноцину ActII. СПИСОК ОПУБЛІКОВАННИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ Вирник К.М., Гасан А.И., Малеев В.Я., Шестопалова А.В. Энергетические и динамические свойства воды в гидратной оболочке ДНК // Вісник ХДУ № 410. - Біофізичний вісник. - 1998. - вип.1. - С.41-49. Шестопалова А.В., Анищенко Д.Б., Малеев В.Я. Изучение гидратации различных структурных форм полирибоцитидиловой кислоты и ее компонентов методом Монте Карло. 1. Влияние протонирования на гидратацию цитозина // Вісник ХДУ № 450. - Біофізичний вісник. - 1999. - вип.4. - C.17-22. Шестопалова А.В., Анищенко Д.Б., Малеев В.Я. Изучение гидратации различных структурных форм полирибоцитидиловой кислоты и ее компонентов методом Монте Карло. 2. Влияние протонирования на гидратацию ассоциатов цитозина. // Вісник ХДУ № 466. - Біофізичний вісник. – 1999. - вип.5. - C. 15-21. Шестопалова А.В., Анищенко Д.Б., Малеев В.Я. Изучение гидратации различных структурных форм полирибоцитидиловой кислоты и ее компонентов методом Монте Карло. 3. Роль воды в стабилизации спиральных форм полирибоцитидиловой кислоты // Вісник ХДУ № 488. - Біофізичний вісник. - 2000. - вип.6. - C. 26-32. Шестопалова А.В. Компьютерное моделирование гидратации динуклеозидмонофосфатов // Вісник ХДУ № 528. - Біофізичний вісник. - 2001. - вип.10. - C. 17-23. Вирник К.М., Гасан А.И., Малеев В.Я., Шестопалова А.В. Динамические свойства воды, связанной на матрицах природной ДНК и модельных комплексов // Биофизика. – 2002. - T.47. - C.245-252 Вирник К.М., Гасан А.И., Малеев В.Я., Шестопалова А.В. Энергетика гидратации нуклеиновых кислот различного нуклеотидного состава // Биофизика. – 2002. - T.47. - C.420-426 Shestopalova A.V. Hydration of nucleic acids components in dependence of nucleotide composition and relative humidity: a Monte Carlo simulation // European Phys. J. D. – 2002. - Vol.20. - P.331-337 Анищенко Д.Б., Березняк Е.Г., Шестопалова А.В., Малеев В.Я. Изучение молекулярных механизмов взаимодействия кофеина и производных актиноцина с ДНК методом молекулярной динамики. 1. Исследование структуры мономерных и димерных форм производного актиноцина в ион-гидратном окружении. // Вісник ХДУ, №560. - Біофізичний вісник. - 2002. - вип.1(10). - С.36-41. Maleev V.Ya., Semenov M.A., Kashpur V.A., Bolbukh T.V, Anischenko D.B., Shestopalova A.V. Structure and hydration of polyribocytidylic acid from the data of infrared spectrostroscopy, EHF dielectrometry and computer modeling // J. Mol. Structure. – 2002. - Vol.605. - P.51-61. Анищенко Д.Б., Березняк Е.Г., Шестопалова А.В., Малеев В.Я. Физические механизмы взаимодействия производных актиноцина с ДНК. 8. Моделирование структуры и гидратации производных актиноцина с различной длиной аминоалкильных цепочек // Вісник ХДУ №568. - Біофізичний вісник. - 2002. - вип.2 (11). - С.25-29. Березняк Е.Г., Семенов М.А., Больбух Т.В., Духопельников Е.В., Шестопалова А.В., Малеев В.Я. Исследование влияния воды на взаимодействие ДНК и производных актиноцина с различной длиной аминоалкильных цепочек методами ИК-спектроскопии и компьютерного моделирования // Биофизика. - 2002. - T.47. - C.1005-1014. Maleev V.Ya., Semenov M.A., Kruglova E.B., Bolbukh T.V., Gasan A.I., Bereznyak E.G., Shestopalova A.V. Spectroscopic and calorimetric study of DNA interaction with a new series of actinocin derivatives // J. Mol. Struct. - 2003. - Vol.645. - P.145-158. Анищенко Д.Б., Березняк Е.Г., Шестопалова А.В., Малеев В.Я. Изучение молекулярных механизмов взаимодействия кофеина и производных актиноцина с ДНК методом молекулярной динамики. II. Роль различных факторов при образовании комплекса ДНК-лиганд // Вісник ХДУ №593. - Біофізичний вісник. - 2003. - вип.1 (12). - С. 13-19. Мирошниченко Е.В., Шестопалова А.В. Молекулярный докинг производных актиноцина и фрагментов ДНК // Вісник ХНУ № 637. - Біофізичний вісник. - 2004. - вип.1 (14). – С.48-55. Miroshnychenko K.V., Shestopalova A.V. Flexible docking of DNA fragments and actinocin derivatives // J. Mol. Simulation. – 2005. - Vol. 31. - N. 8. - P. 567–574. Мирошниченко Е.В., Шестопалова А.В. Компьютерное моделирование комплексообразования производной актиноцина и двуспиральной полирибоцитидиловой кислоты // Вісник ХНУ № 665. - Біофізичний вісник. - 2005. - вип.1(15). - С.62-67. Малеев В.Я., Шестопалова А.В. Физические принципы молекулярной организации биополимеров // Радиофизика и электроника. - 2005. – Т.10. - С.677-699. Shestopalova A.V. The investigation of the association of caffeine and actinocin derivatives in aqueous solution: A molecular dynamics simulation // J.Mol. Liquids. - 2006. - Vol.137. - Р.113-117. Шестопалова А.В. Компьютерное моделирование ассоциации кофеина и произ-водных актиноцина в водных растворах // Биофизика. - 2006. - T.51. - С.389-401. Шестопалова А.В. Компьютерное моделирование гидратации фрагментов различных структурных форм полирибоадениловой кислоты // Вісник ХНУ. - Біофізичний вісник. - 2006. - Вып.1(17). - С.5-14. Шестопалова А.В., Больбух Т.В., Семенов М.А. Молекулярные механизмы взаимодействия кофеина с различными структурными формами полирибоадениловой кислоты: эксперимент и компьютерное моделирование // Вісник ХНУ. - Біофізичний вісник. - 2006. - Вып.1(17). - С.24-35. Шестопалова А.В. Связывание производного актиноцина c фрагментами ДНК: моделирование методом Монте Карло // Биополимеры и клетка. - 2007. - Т.23. - С.35-44. Гасан А.І., Малєєв В.Я., Шестопалова А.В. Енергетика зв’язування та динамічна рухливість води у гідратній оболонці ДНК // Тези доп. І з’їзду Українського біофізичного товариства, 1994, с.60-61. Shestopalova A.V., Gasan A.I. Energetic characteristics and dynamical properties of the bond water on the DNA hydration shell XVI Int.Cong. Biochem Mol.Biol.. India,New Dethy, 19-22 September 1994, A.6004. Вирник К.М., Гасан А.И., Малеев В.Я., Шестопалова А.В. Динамические свойства молекул воды гидратной оболочки биспиральных полинуклеотидных комплексов и ДНК // 3 Международная конф. “Физические явления в твердых телах”, Харьков, 1997,сб.трудов, С.119. Вірник К.М., Гасан А. І., Малєєв В.Я., Шестопалова А.В. Енергетичні та динамічні характеристики води в гідратних оболонках природних ДНК// ІІ з’їзд Українського біофізичного товариства, Харків, 1998, тези доповідей, С.17. Шестопалова А.В., Данилов В.І. Вивчення взаємодії динуклеотидів з водним оточенням за допомогою методу Монте Карло // ІІ з’їзд Українського біофізичного товариства, Харків, 1998, тези доповідей, С.36. Вирник К.М., Гасан А.И., Малеев В.Я., Шестопалова А.В. Энергетика гидратации нуклеиновых кислот и динамика связанной воды. // Int.Conf.on Physics of biological systems, Kiyv,1998,Abs.,P.42. Шестопалова А.В. Гидратация динуклеотидов в водных кластерах различных размеров: моделирование методом Монте Карло // Int. Conf. on Physics of biological systems, Kiyv,1998,Abs.,P.131 Bolbukh T.V., Kashpur V.A., Semenov M.A., Shestopalova A.V. Hydration and structure transisions of polyribocytidilic acid // Int.Conf.on Physics of biological systems, Kiyv,1998,Abs.,P.97. Maleev V.Ya., Semenov M.A., Kashpur V.A., Bolbukh T.V., Shestopalova A.V. Hydration and conformations of polycytidylic acid from the data of infrared spectroscopy, EHF dielectrometry and Monte Carlo simulation // Spectroscopy of biological molecules: new diractions: 8th Europ. Conf. on the Spectr. Biol.Mol., 29 Aug. - 2 Sep 1999, Enschenede, The Netherlands, Books of abs., P.227-228. Шестопалова А.В. Взаимодействие динуклеотидов с водным окружением: моделирование методом Монте Карло // II съезд биофизиков России, 23-27 авг. уста 1999г, Москва, Россия, Тезисы, T.1. - C. 984-985 Вирник К.М., Гасан А.И., Малеев В.Я., Шестопалова А.В. Энергетические и динамические свойства гидратного окружения природных ДНК и модельных соединений // II съезд биофизиков России, 23-27 августа 1999г, Москва, Россия, Тезисы, T.1. - C. 104-105. Shestopalova A.V., Anischenko D.B. Theoretical analysis of influence the cytosine protonation on hydration of polycytidilic acids in different structural forms: a Monte Carlo simulation. // Physics of the alive (Abs. Symp. “Theoretical Physics and biology”, Kiev, 1999). - 1999. - V.7. - Р.95. Shestopalova A.V., Anischenko D.B., Maleev V.Ya. Hydration of different structural forms of polyrC: a Monte Carlo simulation // European Biophys.J. - 2000. - V.29. - N.5-6. - P. 253, abs. of the 3d Europ. Biophys.Congress, Munchen, 9-13 Sept. 2000. Maleev V.Ya., Semenov M.A., Kashpur V.A., Bolbukh T.V, Anischenko D.B., Shestopalova A.V. Structure and hydration of polyribocytidylic acid from the data of infrared spectrosopy, EHF dielectrometry and computer modeling // XXV European Congress on Molecular Spectroscopy, 27 Aug.-1 Sept. 2000, Coimbra, Portugal, Abs., P.66. Bolbukh T.V., Shestopalova A.V., Anischenko D.B. Spectroscopic investigation of hydration complexes of polyriboadenylic acids with caffeine in films // IX ECSBM, Prague, Czech Republic, September 8-13, 2001, Book of Abstracts, P.120. Семенов М.А., Малеев В.Я., Глибин Е.Н., Круглова Е.Б., Гасан А.И., Больбух Т.В., Березняк Е.Г., Шестопалова А.В. Влияние воды на взаимодействие ДНК с производными актиноцина // 5 Международная конф. “Физические явления в твердых телах”, Харьков, 2001,сб.трудов, С.74. Anischenko D.B., Bolbukh T.V., Shestopalova A.V. Hydration of polyriboadenylic acid - caffeine complexes in films // Тези доповідей III з'їзду Українського біофізичного товариства, Львів, 8-11 жовтня 2002, С.24. Березняк К.Г., Шестопалова А.В. Комп'ютерне моделювання гідратованих комплексів похідних актиноцину та фрагментів ДНК // Тези доповідей III з'їзду Українського біофізичного товариства, Львів, 8-11 жовтня 2002, С.25. Аніщенко Д.Б., Березняк К.Г., Малєєв В.Я., Шестопалова А.В. Вивчення молекулярних механізмів взаємодії похідного актиноцину з кофеїном методом молекулярної динаміки. // Тези доповідей III з'їзду Українського біофізичного товариства, Львів, 8-11 жовтня 2002, С.34. Анищенко Д.Б., Березняк Е.Г., Шестопалова А.В. Компьютерное моделирование процессов комплексообразования противоопухолевых антибиотиков и фрагментов ДНК // Сучасні технології органиічного синтезу та медичної хімії. // Тези доповідей всеукраїнської науково-практичної конференції, Харків. - 2003. - С.115. Anischenko D.B., Bereznyak E.G., Shestopalova A.V., Maleev V.Ya. Molecular mechanism of caffeine and actinocin derivatives interaction with DNA fragments // Proceedings of the XVI Intern. School-Seminar "Spectroscopy of molecules and crystals", Sevastopol, Ukraine, 25.05-1.06.2003. Р.192. Shestopalova A.V. The investigation of the molecular mechanisms of the association of actinocin derivative and caffeine in aqueous solution: the molecular dynamics simulation // III Int.Conf. “Physics of Liquid Matter: Modern Problems”, May 27-31, 2005, Kyiv, Ukraine, Р.178. Шестопалова А.В. О двух возможных механизмах влияния кофеина на биологическую активность производных актиноцина – аналогов противоопухолевых антибиотиков // Тези доповідей IV з'їзду Українського біофізичного товариства, Донецьк, 19-21 грудня 2006, С.332-333. АНОТАЦІЯ Шестопалова Г.В. Молекулярні механізми гідратації та комплексоутворення нуклеїнових кислот з біологічно активними речовинами. – Рукопис. Дисертація на здобуття вченого ступеня доктора фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика. - Харківський національний університет ім.В.Н.Каразіна, м. Харків, 2007. Використовуючи комплексний підхід, що поєднує сучасні методи комп’ютерного моделювання та великий обсяг експериментальних даних, вперше проведено систематичне дослідження гідратації і комплексоутворення фрагментів нуклеїнових кислот різного рівня структурної організації з ароматичними біологічно активними речовинами, отримано та візуалізовано просторові структури, гідратні оболонки, обчислено різні складові енергій взаємодії для систем, що містять воду та (1) фрагменти НК різного нуклеотидного складу і структурної організації; (2) ароматичні БАР – аналоги протипухлинних антибіотиків та їх асоціати; (3) комплекси різних фрагментів НК з ароматичними БАР. За допомогою такого підходу встановлено молекулярні механізми формування гідратних оболонок динуклеозидмонофосфатів та олігонуклеотидів в залежності від їх нуклеотидного складу та конформації. На підставі сумісного аналізу результатів експериментальних досліджень та комп(ютерного моделювання запропоновано найбільш ймовірні моделі комплексів фрагментів НК та досліджених ароматичних БАР і встановлено роль водного оточення (упорядкованих елементів гідратних оболонок – водних містків та ланцюжків) у стабілізації таких комплексів. Ключові слова: нуклеїнові кислоти, гідратація, комплексоутворення, біологічно активні речовини, комп(ютерне моделювання. АННОТАЦИЯ Шестопалова А.В. Молекулярные механизмы гидратации и комплексо-образования нуклеиновых кислот и биологически активных веществ. – Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени доктора физико-математичеких наук по специальности 03.00.02 – биофизика. – Харьковский национальный университет им.В.Н Каразина, Харьков, 2007. C помощью комплексного подхода, который объединяет современные методы компьютерного моделирования и большой объем экспериментальных данных, впервые проведено систематическое исследование гидратации и комплексообразования фрагментов нуклеиновых кислот разного уровня структурной организации с ароматическими биологически активными веществами, получены и визуализированы пространственные структуры, гидратные оболочки, вычислены различные составляющие энергии взаимодействия для систем, содержащих воду и (1) фрагменты НК разного нуклеотидного состава и структурной организации; (2) ароматические БАВ – аналоги противоопухолевых антибиотиков и их ассоциаты; (3) комплексы различных фрагментов НК с ароматическими БАВ. С помощью такого подхода установлены молекулярные механизмы формирования гидратных оболочек динуклеозидмонофосфатов и олигонуклеотидов в зависимости от их нуклеотидного состава и конформации. На основе совместного анализа результатов экспериментальных исследований и компьютерного моделирования предложены наиболее вероятные модели комплексов фрагментов НК с исследованными ароматическими БАВ и определена роль водного окружения (упорядоченных элементов гидратных оболочек – водных мостиков и цепочек) в стабилизации таких комплексов. Ключевые слова: нуклеиновые кислоты, гидратация, комплексообразование, биологически активные вещества, компьютерное моделирование. SUMMARY Shestopalova A.V. Molecular mechanisms of hydration and complex formation of nucleic acids with biological active compounds. – Manuscript. Thesis for Doctor’s degree of Physical and Mathematical Sciences in Biophysics – Speciality 03.00.02, Kharkiv National University, Kharkiv, 2007. An extensive systematic investigation using complex approach (computer simulation methods: a Monte Carlo method, molecular dynamics, molecular docking) and the large value of experimental results of hydration and complexation of nucleic acid (NA) with aromatic biological active compounds (BAC) has been carried out. The structures and hydration shells of all investigated systems were obtained and visualizated. The energetic characteristics and contributions of different intermolecular interactions for systems containing water and NA fragments with different nucleotide composition and conformations; aromatic BAC (analogues of anticancer antibiotic actinomycin D – actinocyn derivatives, ActII-V and caffeine, Cf) in monomer and dimer forms; complexes of NA fragments with aromatic BAC were calculated. The results of Monte Carlo simulations and their analysis demonstrate that deoxynucleoside monophosphates (DMP) containing guanine and/or cytosine hydrated more strongly because of formation of more numerous hydrogen bonds with water molecules in small water clusters, i.e. at low relative humidity. With increasing of number of water molecules the energetic preference of GC-containing DMP decreases, and for water clusters corresponding to a state of a dilute aqueous solution, the AT-sequences become energetically more preferable. The energetically more preferential forms of GC-containing DMP are A- or Z-form of DNA, and for AT- containing DMP is B-form of DNA. The models of hydration of single-stranded and double-stranded forms of poly(rC) and poly(rA) based on the results of Monte Carlo simulations and experimental data have been proposed. The obtain results suggest that the stabilization of these helical forms of poly(rC) and poly(rA) occurs due to intra- and interchain water bridges together with hydrogen bonds between bases in pairs and stacking interactions along the chains. The investigations of the interaction with DNA of a new series of biologically-active actinocin derivatives with side chains of different length ActII-V were carried out. Experimental data and results of Monte Carlo simulation confirm that two types of drug-DNA complexes may exist: (1) intercalation of the planar phenoxazone chromophore of the drugs into the GC-sites of DNA and (2) binding of the drugs in the minor groove of DNA. The results confirm that the intercalated complex is energetically more favourable than groove binding. Additional stabilization of the intercalation complex may be due both to specific interactions between the aminoalkyl side chains of ActII-V and the sugar-phosphate backbone of DNA and to formation of a specific water structure around these complexes. Water molecules occupying bridging positions between the hydration-active centers of the drugs and the DNA fragments provide additional stabilization of the intercalated complexes. The investigation of interaction of Cf with neutral single-stranded poly(rA) and protonated double-helical form of рolyr(A) has been carried out by IR-spectroscopy, piezogravimetry and Monte Carlo methods. It was shown that Cf does not influence on formation of the ordered forms of poly(rA), but Cf changes the hydration properties of polynucleotide matrixes. The data obtained by computer modeling allows us to suggest the molecular models of investigated complexes. In Cf - single-helical poly(rA) complex two types of Cf binding are possible. The first type is the external binding of Cf molecules and the second type is the partial intercalation of Cf molecule between planes of adjacent adenines. In the complex of Cf with double-stranded helical poly(rA) only one type of Cf binding near sugar-phosphate backbone of polynucleotide matrix is realized. Water molecules make bridges and chaines and contribute the additional stabilizations of the all types of complexes. Relying on the results of molecular docking and on the known experimental data regarding complexation of actinocin derivative АctIII and double-helical poly(rC), five most probable АctIII – poly(rC) complexes are obtained. In these complexes target-ligand interactions are minimal and intermolecular hydrogen bonds are formed between donor-acceptor groups of АctIII and poly(rC). The influence of water molecules on the structure of complexes obtained using molecular docking is determined by Monte Carlo method. It is shown, that water molecules can in addition stabilize АctIII - poly(rC) complexes forming bridges between their donor-acceptor groups. Based on the analysis of simulation and experimental results, one of the АctIII – poly(rC) complexes is selected as the most probable one. The process of association of Cf and actinocin derivatives ActII was studied by molecular dynamics simulation. The information describing in detail the association of Cf and ActII in water and aqueous-salt solutions and interaction of monomers and dimers with water-ion environment was received. The hydration scheme of monomer and associated forms of Cf and ActII were determined. The calculated values of interaction energies of monomers in associates were shown that the self- and heteroassociates were stabilized by van-der-waals, electrostatic and hydrophobic interactions and also due to formation of intramolecular hydrogen bonds and water bridges. The formation of heterodimers Cf-ActII was energetically more favorable then formation of self-associates of Cf. Therefore Cf can decrease the concentration of ActII in solution by the way of formation of heteroassociates and hence lead to the decrease of the pharmacological activity of the analogues of anticancer antibiotic acting as interceptor. Two complexes formed between ligands (Cf, ActII) and DNA fragments: intercalation of the ligands into GC-sites of d(AGCT)2 duplex and insertion of the ligands into minor groove of d(GATAC)2 duplex have been studied by the molecular dynamics simulation. It was shown that all investigated complexes of Cf and ActII with DNA fragments are stable. Thus the modulated action of Cf on the ActII binding affinity to DNA may be realized due to protector action of Cf or its ability to form stable complexes with different DNA fragments. It is shown that the intercalation of ActII into GC-site is connected with forming of specific hydrogen bonds with polar groups of DNA fragment. Binding of both ligands in minor groove is determined by nonspecific and hydrophobic interactions. The changing of hydration both ligands and DNA fragments under complexation was described in detail. These data allows us to make conclusion about the essential role of water environment in the formation of stable DNA-ligand complexes. Hence the complex approach allow to obtain the physical parameters of hydration of NA and binding of analogues of anticancer antibiotics to NA in order to predict on the molecular level the biological activity of a anticancer antibiotics and the role of water environment in stability of NA-drugs complexes. Key words: nucleic acids, hydration, complexation, biological active compounds, computer simulation. PAGE 1

Похожие записи